KR890016176A - Hsa 생성방법, 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터, 및 이로써 형질전환된 메틸요구 효모 - Google Patents

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내용 없음

Description

HSA 생성방법, 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터, 및 이로써 형질전환된 메틸요구 효모
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

Claims (32)

  1. a)임의로 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연결된, HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의 발현 카세트를 갖는 적어도 하나의 벡터로 메틸 요구 효모(methylotropic yeast)를 형질 전환 시킨후, b) 적당한 조건하에서, 결과 형성된 형질전환된 효모균주를 배양하는 것을 포함하는, HSA의 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 또는 선형 통합 부위 특이 벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 벡터가 선형 통합 부위-특이 벡터인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 선형 통합 부위-특이 벡터가 하기 a)-c)의 연속 배열을 함유하는 방법 : a) 첫번째 삽입성 DNA 단편, b) 적어도 하나의 마아커(merker) 유전자, 및 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연쇄된, HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의 발현 카세트(casette), (이때, 성분(b)dml 마아커 유전자와 카세트의 순서는 바뀔수 있다) 및, c) 두번째 삽입성 DNA 단편,
  5. 제 4 항에 있어서, 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 삽입성 DNA 단편이피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)로부터 분리된 유전자의 DNA 서열로부터 유도되고,AOX1, p40,DHAS및HIS4로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 하기 실시가능하게 연쇄된 a)-c)를 포함하는 방법 : a)피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1, p40,DHAS,사카로마이시스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 분리된 산 포스파타제, 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C(cytochrome C),알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절 영역, b) HSA에 대한 구조 유전자 및 c) [AOX1유전자, P40 유전자, DHAS 유전자 및 HIS4 유전자로부터 분리된 3' 종결 서열로 구성되는 군으로부터 선택된피치아 파스토리스로부터 3' 종결 서열.
  7. 제 4 항, 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 마아커 유전자가피치아 파스토리스로부터 분리된ARG4, 및 HIS4,사카로마이시스 세레비시에로부터 분리된 suc2, 및Th 601및Tn 903의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제 5 항, 제 6 항, 또는 제 7 항에 있어서, 상기 벡터가, a) b)에 실시가능하게 연쇄된,피치아 파스토리스로부터 분리된 5'AOX1조절 영역 약 1Kb인 첫번째 삽입성 DNA 단편, b) c)에 실시가능하게 연쇄된 HAS에 대한 구조 유전자, c) d)에 연결된,피치아 파스토리스로부터 분리된AOX13' 종결 서열, d) e)에 연결된,피치아 파스토리스로부터 분리된HIS4인 적어도 하나의 마아커 유전자, e) 3'AOX1종결 서열의 약 0.65Kb인 두번째 삽입성 DNA를 포함하는 방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 플라스미드가 자발적으로 복제되는 DNA 서열 및 마아커 유전자를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 발현카세트가, 하기 실시가능하게 연쇄된 a)-c)를 포함하는 방법 : a)피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1, P40DHAS,시카로마이시스 세레비시에로부터 분리된 산 포스타파제; 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3- 포스페이트 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절 영역. b) HAS에 대한 구조 유전자, c)AOX1유전자, P40 유전자,DHAS유전자 및HIS4유전자로부터 분리된 3' 종결 서열로 구성되는 군으로부터 선택된피치아 파스토리스로 부터의 3'종결 서얼.
  11. 제 9 항 또는 제10항에 있어서, 상기 마아커 유전자가피치아 파스토리스로부터 분리된ARG4및HIS4,사카로마이시스 세레비시에로부터 분리된,suc2, 및Tn601 및Tn 903의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 9 항 또는 제10항, 또는 제11항에 있어서, 상기 플라스미드가 a) d)에 실시가능하게 연쇄된,피치아 파스토리스로부터 분리된 5'AOX1조절 영역, b) c)에 실시가능하게 연쇄된, HSA에 대한 구조 유전자, c) d)에 연결되,피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1의 3' 종결 서열, d) 적어도 하나의 마아커 유전자, e) 자발적으로 복제되는 DNA 서열인, 약 0.19Kb 서열의 두버째 DNA 단편을 포함하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 마아커 유전자가HIS4인 방법.
  14. (a) 첫번째 삽입성 DNA 단편, (b) 적어도 하나의 마아커 유전자, 및 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연결된, HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의 발현 카세트(이때, 성분(b)의 마아커 유전자와 카세트의 순서는 바뀔수 있다) 및, c) 두번째 삽입성 DNA 단편의 연속 배열을 포함하는 선형 통합 부위- 특이 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 첫번째 삽입성 DNA 단편 및 두번째 성형 삽입성 DNA 단편이피치아 파스토리스로 부터 분리되 유전자의 DNA 서열로부터 유도되고,AOX1, P40,DHAS및HIS4로 구성되는 군으로부터 선택되는 벡터.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 발현 카세트가 하기 실시가능하게 연쇄된 a)-c)를 포함하는 벡터 ; a) 피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1, p40,DHAS및HIS4,사카로마이시스 세리비시에로부터 분리
    된 산 포스파트제. 갈락토시다제. 알코올 탈수소효소, 시토크롬C, 알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이타 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절영역, b) HSA에 대한 구조 유전자, c)피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1유전자, p40 유전자,DHAS유전자 및HIS4유전자로부터 분리된 3' 종결 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 3' 종결 서열.
  17. 제14항, 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 마아커 유전자가피치아 파스토리스로부터 분리된ARG4및HIS4,사카로마이시스 세레비시에로부터 분리된 suc2 및Tn 601및Tn 903의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 벡터.
  18. 제14항에 있어서, a) b)에 실시가능하게 연쇄된,피치아 파스토리스로부터 분리된 길이내 약 1Kb인 5'AOX1의 실시가능한 조절 영역인 첫번째 삽입성 DNA 단편, b) c)에 실시가능하게 연쇄된, HSA에 대한 구조 유전자, c) d)에 연결된피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1의 3' 종결 서열, d) e)에 연결된,피치아 파스토리스로부터 분리된HIS4인 적어도 하나의 마아커 유전자, e) 3'AOX1종결 서열의 약 0.65Kb인 두번째 삽입성 DNA를 포함하는 벡터.
  19. a) 메틸 요구 효모 내에서 복제할 수 있는, 자발적으로 복제되는 서열, b) 적어도 하나의 마아커 유전자, c) 3' 종결 서열 및 조절영역에 실시가능하게 연쇄된 HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 발현 카세트가 하기 실시가능하게 연쇄된 a)-c)를 포함하는 벡터 ; a)피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1, p40,DHAS및His4,사카로마이시스 세레비시에로부터 분리된 산포스파타제, 갈락토시다제, 알코올 탈수소효소, 시토크롬 C, 알파 교배 인자 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 조절 영역, b) HSA에 대한 구조 유전자, c)피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1유전자, p40 유전자,DHAS유전자 및 HIS4유전자로부터 분리된 3' 종결 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 3' 종결 서열.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 마아커 유전자가피치아 파스토리스로부터 분리된ARG4, 및HIS4사카로마이시스 세리비시에로부터 분리된 SUC2, 및 박테리아성Tn 601, 및Tn 903의 G418R유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 벡터.
  22. 벡터 P HSA 13.
  23. 3' 종결 서열에 실시가능하게 연쇄된 HSA에 대한 구조 유전자에 실시가능하게 연결된 조절영역을 포함하는 적어도 하나의 발현 카제트를 함유하는 적어도 하나의 벡터로 형질 전환된 메틸요구 효모.
  24. 제23항에 있어서, 효모가피치아 파스토리스인 메틸요구 효모.
  25. 제23항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스 균주 GS115인 메틸요구 효모.
  26. 제25항에 있어서, a)-d)의 연속 배열인 적어도 하나의 선형 통합 부위 특이 벡터로 형질 전환되는피치아 파스토리스GS115; a) 첫번째 삽입성 DNA 단편, b) c)에 실시가능하게 연쇄된, 적어도 하나의 마아커 유전자, 및 HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의피치아화합(和合)성 발현 카세트(casette)(이때 성분(b)의 마아커 유전자와 카세트의 순서는 바뀔수 있다), c)피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1유전자, p40 유전자,DHAS유전자 및HIS4유전자로부터 분리된 3' 종결 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 3' 종결 서열, d) 두번째 삽입성 DNA 단편.
  27. 제17항에 있어서, a) b)에 실시가능하게 연쇄된,피치아 파스토리스로부터 분리된 5'AOX1 조절 영역인 약 1kb인 첫번째 삽입성 DNA 단편, b) c)에 실시가능하게 연쇄된, HSA에 대한 구조 유전자, c) d)에 연결된,피치아 파스토리스로부터 분리된AOX1의 3' 종결 서열, d) e)에 연결된,피치아 파스토리스로부터 분리된HIS4인 마아커 유전자, e)3'AOX1종결 서열이 약 0.65kb인 두번째 삽입성 DNA를 포함하는 선형 부위 특이 통합 벡터
  28. 피치아 파스토리스GS115/pHSA113
  29. 제17항에 있어서, 상기 같은 선형 통합 부위 특이 벡터의 1회 이상 복사로여 형질 전환되는피치아 파스토리스GS115
  30. a)피치아 파스토리스내에서 복제할 수 있는 자발적으로 복제되는 서열, b) 적어도 하나의 마아커 유전자,c) 3' 종결 서열 및 조절 영역에 실시가능하게 연쇄된 HSA에 대한 구조 유전자를 함유하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드로써 형질 전환된 피치아 파스토리스 GS115
  31. 피치아 파스토리스GS115/pHSA113
  32. 서열이 하기와 같은 HSA를 암호화하는 서열 ;
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