JP2580036B2 - メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現 - Google Patents
メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現Info
- Publication number
- JP2580036B2 JP2580036B2 JP1105730A JP10573089A JP2580036B2 JP 2580036 B2 JP2580036 B2 JP 2580036B2 JP 1105730 A JP1105730 A JP 1105730A JP 10573089 A JP10573089 A JP 10573089A JP 2580036 B2 JP2580036 B2 JP 2580036B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pichia
- hsa
- vector
- yeast
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えDNA遺伝子工学の分野に関する。本発
明の１つの面はC1資化性酵母におけるヒト血清アルブミ
ン（HSA）の発現のための方法に関する。本発明の他の
面は新規DNA分子およびそれにより形質転換された新規
酵母株に関する。
明の１つの面はC1資化性酵母におけるヒト血清アルブミ
ン（HSA）の発現のための方法に関する。本発明の他の
面は新規DNA分子およびそれにより形質転換された新規
酵母株に関する。
（従来技術） ヒト血清アルブミンは成人で最も量の多い血漿タンパ
ク質である。アルブミンの濃度は40mg/mlであり、70kg
の成人男性では160gのアルブミンがヒトの体を循環して
いる。このタンパク質は浸透圧を維持し、銅、ニツケ
ル、カルシウム（弱く、２−３の結合部位で）、ビリル
ビンおよびプロトポルフイリン、長鎖脂肪酸、プロスタ
グランジン、ステロイドホルモン（これらのホルモンと
弱く結合し、膜を越えてのその移動を促進する）、チロ
キシン、トリヨードチロニン、シスチンおよびグルタチ
オンの結合および輸送に機能する。Petersらによると、
米国のみで毎年10,000キログラム以上の精製アルブミン
が循環障害またはアルブミン欠乏の患者に投与されてい
る。
ク質である。アルブミンの濃度は40mg/mlであり、70kg
の成人男性では160gのアルブミンがヒトの体を循環して
いる。このタンパク質は浸透圧を維持し、銅、ニツケ
ル、カルシウム（弱く、２−３の結合部位で）、ビリル
ビンおよびプロトポルフイリン、長鎖脂肪酸、プロスタ
グランジン、ステロイドホルモン（これらのホルモンと
弱く結合し、膜を越えてのその移動を促進する）、チロ
キシン、トリヨードチロニン、シスチンおよびグルタチ
オンの結合および輸送に機能する。Petersらによると、
米国のみで毎年10,000キログラム以上の精製アルブミン
が循環障害またはアルブミン欠乏の患者に投与されてい
る。
発明が解決しようとする課題 現在HSAの唯一の市販源は分画された血液からのもの
である。血液が運ぶ夾雑物および病原体により起こりう
る危険性を考えると、HSAを製造する別の方法を発展す
ることは、HSAの商業生産に対して著しい貢献となるで
あろう。組換えDNA遺伝子工学の出現により、別の方法
でHSAを製造する事が現在可能になつた。
である。血液が運ぶ夾雑物および病原体により起こりう
る危険性を考えると、HSAを製造する別の方法を発展す
ることは、HSAの商業生産に対して著しい貢献となるで
あろう。組換えDNA遺伝子工学の出現により、別の方法
でHSAを製造する事が現在可能になつた。
HSAは大腸菌中で製造されてきたが、残念ながらこの
宿主中でHSAを製造するにはかなりの欠点がある。例え
ば、大腸菌は費用がかかる精製工程により除去しなけれ
ばならない内毒素を産生する。
宿主中でHSAを製造するにはかなりの欠点がある。例え
ば、大腸菌は費用がかかる精製工程により除去しなけれ
ばならない内毒素を産生する。
このように、HSAの産生のための方法を発展すること
はこの分野に著しい貢献となるであろう。
はこの分野に著しい貢献となるであろう。
それ故、本発明の目的はHSAの増大された製造のため
の方法を提供することである。
の方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的はHSAをコードしているDNA配
列を含む新規ベクターを提供することである。
列を含む新規ベクターを提供することである。
本発明の更なる目的は、HSAの増大された製造が可能
なベクターまたはベクター類による形質転換された新規
C1資化性酵母を提供することである。
なベクターまたはベクター類による形質転換された新規
C1資化性酵母を提供することである。
本発明のなお更なる目的は、HSAをコードしている新
規ヌクレオチド配列である。
規ヌクレオチド配列である。
課題を解決するための手段 本発明に従うと、HSAのための構造遺伝子を含む適合
性発現カセツトを持つ少なくとも一つのベクターでC1資
化性酵母を形質転換し、得られる形質転換体をHSAおよ
びHSAをコードしている新規ヌクレオチド配列の産生を
得るのに適した条件下培養することから成るHSA産生の
方法が発現される。
性発現カセツトを持つ少なくとも一つのベクターでC1資
化性酵母を形質転換し、得られる形質転換体をHSAおよ
びHSAをコードしている新規ヌクレオチド配列の産生を
得るのに適した条件下培養することから成るHSA産生の
方法が発現される。
第１図はBglIIからBglIIへ時計回りのフラグメント中
に線状組込み部位−特異的ベクターを含むプラスミドpA
0804を示している。構造遺伝子は本プラスミドの特異的
なEcoRI部位に挿入されるであろう。本プラスミドはNRR
L B−18114のプラスミドDNAからEcoRI消化および第１図
に対応する線状〜7.4KbEcoRIフラグメント回収のための
ゲル電気泳動により回収されるであろう。
に線状組込み部位−特異的ベクターを含むプラスミドpA
0804を示している。構造遺伝子は本プラスミドの特異的
なEcoRI部位に挿入されるであろう。本プラスミドはNRR
L B−18114のプラスミドDNAからEcoRI消化および第１図
に対応する線状〜7.4KbEcoRIフラグメント回収のための
ゲル電気泳動により回収されるであろう。
第２図（ａ）はpA0804の直線地図を提供している。
第２図（ｂ）は約458塩基対のf1−oriを含むpA0804の誘
導体pA0807の直線地図を提供している。
導体pA0807の直線地図を提供している。
第２図（ｃ）はpA0807のBglII部位の代わりにNotＩ部
位を持つpA0807Nの直線地図を提供している。
位を持つpA0807Nの直線地図を提供している。
第２図（ｄ）は特異的EcoRI部位にHSA遺伝子が挿入さ
れたpA0807Nの直線地図であるpHSA113の直線地図を提供
している。
れたpA0807Nの直線地図であるpHSA113の直線地図を提供
している。
第３図はpA0807Nを円形型で示している。
第４図はNRRL B−18115の自律性酵母プラスミドDNAの
EcoRI消化、ゲル電気泳動および6.2KbEcoRIフラグメン
ト回収によるプラスミドpTHFKΔを示している。
EcoRI消化、ゲル電気泳動および6.2KbEcoRIフラグメン
ト回収によるプラスミドpTHFKΔを示している。
第５図はpTHFKΔの特異的EcoRI部位に挿入されたHSA
遺伝子を含むpTHFKΔの誘導体であるpHSA13を示してい
る。
遺伝子を含むpTHFKΔの誘導体であるpHSA13を示してい
る。
HSA構造遺伝子はLawnら、Nuc.Asids.Res.,9:6105（19
81）、およびDugaiczykら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
9:71（1982）、により配列決定されている。
81）、およびDugaiczykら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
9:71（1982）、により配列決定されている。
本遺伝子はLawnら、Dugaiczykらまたは実施例１に記
載された技術による遺伝子の再単離またはブリテイツシ
ユ バイオテクノロジー社（British Biotechnology,L
td）のごとき注文遺伝子製造業者によるインビトロでの
合成により得ることができるであろう。HSA遺伝子を得
る一つの可能な方法はオリゴヌクレオチドプローブでお
よび随意にHSA構造遺伝子のための免疫スクリーニング
陽性プラークで肝臓cDNAライブラリーをスクリーニング
することであろう。この型の単離スキームの実行により
HSA遺伝子が単離され、表Ｉに示したヌクレオチド配列
を持つていた。
載された技術による遺伝子の再単離またはブリテイツシ
ユ バイオテクノロジー社（British Biotechnology,L
td）のごとき注文遺伝子製造業者によるインビトロでの
合成により得ることができるであろう。HSA遺伝子を得
る一つの可能な方法はオリゴヌクレオチドプローブでお
よび随意にHSA構造遺伝子のための免疫スクリーニング
陽性プラークで肝臓cDNAライブラリーをスクリーニング
することであろう。この型の単離スキームの実行により
HSA遺伝子が単離され、表Ｉに示したヌクレオチド配列
を持つていた。
表１に示されたヌクレオチド配列は単離されたHSA DN
Aの配列決定により得られ、それは、Sangerら、PNAS 7
4、5463（1977）、のジデオキシヌクレオチド鎖終止法
またはSangerら、J.Mol,Biol.142、1617（1980）により
記載されているようなM13誘導体を用いるサブクロニン
グ配列決定法などのごとき任意の適した技術により実行
される。
Aの配列決定により得られ、それは、Sangerら、PNAS 7
4、5463（1977）、のジデオキシヌクレオチド鎖終止法
またはSangerら、J.Mol,Biol.142、1617（1980）により
記載されているようなM13誘導体を用いるサブクロニン
グ配列決定法などのごとき任意の適した技術により実行
される。
LawnらおよびDugaiczykらにより発表された配列と比
較すると本配列は新規ヌクレオチド配列であることがわ
かる。ヌクレオチド配列の比較を表２に示した。
較すると本配列は新規ヌクレオチド配列であることがわ
かる。ヌクレオチド配列の比較を表２に示した。
HSAの構造遺伝子が回収されたら、遺伝子を増殖させ
る、または遺伝子および類似物を更に適合するように調
整するため、最初に構造遺伝子をベクターおよび適合宿
主細胞株内へ挿入することが必要であろう。
る、または遺伝子および類似物を更に適合するように調
整するため、最初に構造遺伝子をベクターおよび適合宿
主細胞株内へ挿入することが必要であろう。
宿主の培養は任意の適した手段により達成されるであ
ろう。宿主培養の一般的技術はこの分野ではすでに知ら
れており、ここで使用された株の特定の要求に対するこ
れらの方法のどんな適応も当業者にとつては可能であろ
う。
ろう。宿主培養の一般的技術はこの分野ではすでに知ら
れており、ここで使用された株の特定の要求に対するこ
れらの方法のどんな適応も当業者にとつては可能であろ
う。
宿主からのプラスミドDNAの回収はその密な小ささお
よじ閉じた環状超らせん形のためいくつかの技術により
達成できる。例えば、宿主細胞の採取に続いて遠心分離
によりペレツト化し、その後再懸濁して溶菌する。溶菌
物は細胞砕片を除去するため遠心分離にかけねばなら
ず、DNAを含む上澄液を保持する。DNAからほとんどの他
の夾雑物を除去するためフエノール抽出が実施される。
フエノール抽出DNAは次に密度勾配遠心分離またはゲル
過技術を用いて更に処理して細菌DNAからプラスミドD
NAを分離する。前にそれとなく示した分離を達成するた
めの技術はこの分野では良く知られており、これらの技
術を実施する多くの方法が知られている。
よじ閉じた環状超らせん形のためいくつかの技術により
達成できる。例えば、宿主細胞の採取に続いて遠心分離
によりペレツト化し、その後再懸濁して溶菌する。溶菌
物は細胞砕片を除去するため遠心分離にかけねばなら
ず、DNAを含む上澄液を保持する。DNAからほとんどの他
の夾雑物を除去するためフエノール抽出が実施される。
フエノール抽出DNAは次に密度勾配遠心分離またはゲル
過技術を用いて更に処理して細菌DNAからプラスミドD
NAを分離する。前にそれとなく示した分離を達成するた
めの技術はこの分野では良く知られており、これらの技
術を実施する多くの方法が知られている。
このプラスミドのヌクレアーゼ消化は適当なエンドヌ
クレアーゼを選択することにより達成され、それはHSA
構造遺伝子の回収を容易にするような様式で選択された
プラスミドを切断するであろう。使用されるエンドヌク
レアーゼは切り出されるべきHSA遺伝子があるプラスミ
ドに依存するであろう。
クレアーゼを選択することにより達成され、それはHSA
構造遺伝子の回収を容易にするような様式で選択された
プラスミドを切断するであろう。使用されるエンドヌク
レアーゼは切り出されるべきHSA遺伝子があるプラスミ
ドに依存するであろう。
DNAのゲル電気泳動は多くの技術を用いて達成される
であろう。P.G.SealyおよびE.M.Southern、核酸のゲル
電気泳動−その実際（D.RickwoodおよびB.D.Hames編
集）p39（1982）を参照されたい。電気的溶出、拡散、
ゲル溶解（アガロースゲル）または物理的押し出し（ア
ガロースゲル）のごとく使用したゲルについて適当な多
くの技術を用いて溶出が達成されるであろう。高品質、
低融点アガロースのごときいくつかのゲルについては溶
出が必要でないことがさらに認められる。
であろう。P.G.SealyおよびE.M.Southern、核酸のゲル
電気泳動−その実際（D.RickwoodおよびB.D.Hames編
集）p39（1982）を参照されたい。電気的溶出、拡散、
ゲル溶解（アガロースゲル）または物理的押し出し（ア
ガロースゲル）のごとく使用したゲルについて適当な多
くの技術を用いて溶出が達成されるであろう。高品質、
低融点アガロースのごときいくつかのゲルについては溶
出が必要でないことがさらに認められる。
HSA構造遺伝子またはそのフラグメントを含むフラグ
メントが単離されても、ベクターへ挿入される前に追加
の操作が必要とされるであろう。これらの操作にはリン
カーの添加またはフラグメントの平滑端化が含まれるが
それに限定されるわけではない。
メントが単離されても、ベクターへ挿入される前に追加
の操作が必要とされるであろう。これらの操作にはリン
カーの添加またはフラグメントの平滑端化が含まれるが
それに限定されるわけではない。
HSA構造遺伝子の単離に続いて、遺伝子はプラスミド
または直線状部位特異的組込みベクターのごとき適した
C1資化性酵母ベクター内へ挿入される。本発明の実施に
好適なベクターはピキア（Pichia）属と一致するもので
最も好適にはピキア パストリス（Pichia pastoris）
である。
または直線状部位特異的組込みベクターのごとき適した
C1資化性酵母ベクター内へ挿入される。本発明の実施に
好適なベクターはピキア（Pichia）属と一致するもので
最も好適にはピキア パストリス（Pichia pastoris）
である。
プラスミドは長い間組換えDNA遺伝子工学で用いられ
てきた基本的要素の一つである。プラスミドは微生物中
に観察される環状の染色体外二重鎖DNAである。プラス
ミドは細胞当り１−または多数のコピーで存在すること
が観察されてきた。プラスミドDNAに含まれているもの
はプラスミド生殖に必要な情報である（即ち1986年５月
14日に公開されたヨーロツパ特許出願第0180899号にCre
ggにより記載されているごとき自律性複製配列）。形質
転換体細胞中のプラスミドを表現型により選択する１つ
またはそれ以上の手段はまたプラスミド中にコードされ
ている情報からも得られる。抗生物質抵抗性遺伝子また
は宿主の生化学的経路の欠陥を補う遺伝子のごとき表現
型またはけ選択標識は形質転換した宿主細胞のクローン
の認識、選択および維持を可能にする。
てきた基本的要素の一つである。プラスミドは微生物中
に観察される環状の染色体外二重鎖DNAである。プラス
ミドは細胞当り１−または多数のコピーで存在すること
が観察されてきた。プラスミドDNAに含まれているもの
はプラスミド生殖に必要な情報である（即ち1986年５月
14日に公開されたヨーロツパ特許出願第0180899号にCre
ggにより記載されているごとき自律性複製配列）。形質
転換体細胞中のプラスミドを表現型により選択する１つ
またはそれ以上の手段はまたプラスミド中にコードされ
ている情報からも得られる。抗生物質抵抗性遺伝子また
は宿主の生化学的経路の欠陥を補う遺伝子のごとき表現
型またはけ選択標識は形質転換した宿主細胞のクローン
の認識、選択および維持を可能にする。
HSA構造遺伝子をC1資化性酵母で表現するには、遺伝
子は５′制御領域および３′終止配列に作動可能なごと
く結合していなければならず、そうすることにより表現
カセツトを形成し、それはベクターを通じて宿主に挿入
されるであろう。
子は５′制御領域および３′終止配列に作動可能なごと
く結合していなければならず、そうすることにより表現
カセツトを形成し、それはベクターを通じて宿主に挿入
されるであろう。
以上の述語をはつきりさせる目的でここで定義する。
作動可能なごとく結合する……それらの機能を実行す
るように各成分が配置されている並置を意味する。
るように各成分が配置されている並置を意味する。
制御領域……種々の刺激に反応し、mRNA転写の速度に
影響を及ぼすDNA配列。
影響を及ぼすDNA配列。
３′終止配列……ポリアデニル化をきたす配列のごと
きmRNAを安定化する機能を持つ終止コドンに対し３′側
の配列。
きmRNAを安定化する機能を持つ終止コドンに対し３′側
の配列。
“ピキア適合性”とはピキアから誘導された制御領域
および３′終止配列のごときピキアにおいてその正常な
機能を実行するであろうDNA配列を意味する。
および３′終止配列のごときピキアにおいてその正常な
機能を実行するであろうDNA配列を意味する。
組込み（インテグレイテイブ）ベクターとは、現在ヨ
ーロツパ特許出願226752号として公開されているヨーロ
ツパ特許出願第86114700.7号に記載されているCreggの
直線状部位−特異的組込みベクターのごときものであ
る。そのようなベクターは少くとも連続的に配置された
１）第１の挿入可能なDNAフラグメント;2）選択された
マーカー遺伝子の配列を含んでおり；および本発明の実
施のためには３）第２の挿入可能なDNAフラグメントも
また使用されるであろう。
ーロツパ特許出願226752号として公開されているヨーロ
ツパ特許出願第86114700.7号に記載されているCreggの
直線状部位−特異的組込みベクターのごときものであ
る。そのようなベクターは少くとも連続的に配置された
１）第１の挿入可能なDNAフラグメント;2）選択された
マーカー遺伝子の配列を含んでおり；および本発明の実
施のためには３）第２の挿入可能なDNAフラグメントも
また使用されるであろう。
第１および第２の挿入可能DNAフラグメントは各々少
くとも200ヌクレオチドの長さであり、形質転換される
べき種のゲノムDNAの一部と相同的なヌクレオチドを持
つている。発現カセツトおよび選択マーカー遺伝子が第
１の挿入可能DNAフラグメントの３′末端と第２の挿入
可能DNAフラグメントの５′末端の間に位置するように
組込みベクターの種々の成分が連続的に配置されDNAの
直線状フラグメントを形成している。第１および第２の
挿入可能DNAはそれらが親ゲノム中で配向されているご
とく連続的に配置された線状フラグメント中でも互いに
関して同じ様に配向されている。
くとも200ヌクレオチドの長さであり、形質転換される
べき種のゲノムDNAの一部と相同的なヌクレオチドを持
つている。発現カセツトおよび選択マーカー遺伝子が第
１の挿入可能DNAフラグメントの３′末端と第２の挿入
可能DNAフラグメントの５′末端の間に位置するように
組込みベクターの種々の成分が連続的に配置されDNAの
直線状フラグメントを形成している。第１および第２の
挿入可能DNAはそれらが親ゲノム中で配向されているご
とく連続的に配置された線状フラグメント中でも互いに
関して同じ様に配向されている。
第１および第２の挿入可能DNAフラグメントとして有
用なヌクレオチド配列はゲノムの一時変異が起こるはず
の未変性ゲノム部位の別々の部分と相同的なヌクレオチ
ド配列である。それゆえ例えばゲノム変異がアルコール
酸化酵素遺伝子の座位で起こるとすると、使用される第
１および第２の挿入可能DNAフラグメントはアルコール
酸化酵素遺伝子座位の別々の部分と相同的なものであ
る。本発明に従うゲノム変異のためには２つの挿入可能
DNAフラグメントはそれらが親ゲノム中で存在するのと
同じ相対的配向で線状フラグメンにおいても互いについ
て配向されていなければならない。第１および第２の挿
入可能DNAフラグメントとして使用できるヌクレオチド
配列の例としてはアルコール酸化酵素（AOX1）遺伝子、
ジヒドロキシアセトン合成酵素（DHAS）遺伝子、p40遺
伝子およびHIS4遺伝子から成る群より選択されるヌクレ
オチド配列が挙げられる。AOX1遺伝子、DHAS遺伝子、p4
0遺伝子およびHIS4遺伝子は同時係属中の出願番号第78
0,102号の出願およびそれに対応するヨーロツパ特許出
願第0183070号に含まれている。
用なヌクレオチド配列はゲノムの一時変異が起こるはず
の未変性ゲノム部位の別々の部分と相同的なヌクレオチ
ド配列である。それゆえ例えばゲノム変異がアルコール
酸化酵素遺伝子の座位で起こるとすると、使用される第
１および第２の挿入可能DNAフラグメントはアルコール
酸化酵素遺伝子座位の別々の部分と相同的なものであ
る。本発明に従うゲノム変異のためには２つの挿入可能
DNAフラグメントはそれらが親ゲノム中で存在するのと
同じ相対的配向で線状フラグメンにおいても互いについ
て配向されていなければならない。第１および第２の挿
入可能DNAフラグメントとして使用できるヌクレオチド
配列の例としてはアルコール酸化酵素（AOX1）遺伝子、
ジヒドロキシアセトン合成酵素（DHAS）遺伝子、p40遺
伝子およびHIS4遺伝子から成る群より選択されるヌクレ
オチド配列が挙げられる。AOX1遺伝子、DHAS遺伝子、p4
0遺伝子およびHIS4遺伝子は同時係属中の出願番号第78
0,102号の出願およびそれに対応するヨーロツパ特許出
願第0183070号に含まれている。
第１の挿入可能DNAフラグメントは発現カセツトで使
用される制御領域からなる作動可能な制御領域を含んで
いてもよい。発現カセツトのための制御領域としての第
１の挿入可能DNAフラグメントの使用は本発明の良好な
実施態様である。第１図はカセツトのための制御領域と
して第１の挿入可能DNAフラグメントを利用しているベ
クターの図を提供している。
用される制御領域からなる作動可能な制御領域を含んで
いてもよい。発現カセツトのための制御領域としての第
１の挿入可能DNAフラグメントの使用は本発明の良好な
実施態様である。第１図はカセツトのための制御領域と
して第１の挿入可能DNAフラグメントを利用しているベ
クターの図を提供している。
第１図に示したごとく、随意に挿入部位および３′終
止配列を第１の挿入可能DNAフラグメントの３′側にす
ぐ置いてもよい。この線状部位−特異的組込みベクター
のコンホメーシヨンは適合性３′終止配列を添加する必
要もなく構造遺伝子の挿入部位が準備されているという
更なる利点を持つことになる。
止配列を第１の挿入可能DNAフラグメントの３′側にす
ぐ置いてもよい。この線状部位−特異的組込みベクター
のコンホメーシヨンは適合性３′終止配列を添加する必
要もなく構造遺伝子の挿入部位が準備されているという
更なる利点を持つことになる。
さらに、本発明の実施に使用される発現ベクターは第
１の挿入可能DNAフラグメントと第２の挿入可能フラグ
メントの間または第４図に示されているごとく制御領域
と終止配列の間に構造遺伝子またはカセツトまたはその
類似物の挿入を容易にするためにポリリンカー部位を含
むことができる。
１の挿入可能DNAフラグメントと第２の挿入可能フラグ
メントの間または第４図に示されているごとく制御領域
と終止配列の間に構造遺伝子またはカセツトまたはその
類似物の挿入を容易にするためにポリリンカー部位を含
むことができる。
宿主株の形質転換に使用されるDNA中に少なくとも１
つの選択可能マーカー遺伝子が含まれていることも必要
である。この事により、形質転換DNAを取り込んだ微生
物の選択および単離が容易になる。マーカー遺伝子は宿
主が持つていなかつた表現型特性を形質転換微生物に与
える。例えば非形質転換宿主株では特定のアミノ酸生合
成経路が欠損していたものが特定のアミノ酸を産生する
能力が回復したり、または抗生物質および類似物に抵抗
性となる。
つの選択可能マーカー遺伝子が含まれていることも必要
である。この事により、形質転換DNAを取り込んだ微生
物の選択および単離が容易になる。マーカー遺伝子は宿
主が持つていなかつた表現型特性を形質転換微生物に与
える。例えば非形質転換宿主株では特定のアミノ酸生合
成経路が欠損していたものが特定のアミノ酸を産生する
能力が回復したり、または抗生物質および類似物に抵抗
性となる。
典型的な選択可能マーカー遺伝子はピキア パストリス
（Pichia pastoris）およびサツカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）からのHIS4遺伝子およ
びARG4遺伝子、サツカロミセス セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）からの転化酵素遺伝子（SUC2）、ま
たは大腸菌転置因子Tn601またはTn903からのG418R／カ
ナマイシン抵抗性遺伝子からなる群より選択されるであ
ろう。
（Pichia pastoris）およびサツカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）からのHIS4遺伝子およ
びARG4遺伝子、サツカロミセス セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）からの転化酵素遺伝子（SUC2）、ま
たは大腸菌転置因子Tn601またはTn903からのG418R／カ
ナマイシン抵抗性遺伝子からなる群より選択されるであ
ろう。
当業者は例えば細菌性プラスミドDNA、バクテリオフ
アージDNAおよび類似物のごとき付加的DNA配列もまた本
発明の実施に用いられるベクター中に取り込ませること
ができることを認めるであろう。そのような配列は細菌
性宿主中のこれらのベクターの増殖および維持を可能に
する。
アージDNAおよび類似物のごとき付加的DNA配列もまた本
発明の実施に用いられるベクター中に取り込ませること
ができることを認めるであろう。そのような配列は細菌
性宿主中のこれらのベクターの増殖および維持を可能に
する。
もし、第１の挿入可能DNAフラグメントが制御領域を
含んでいないなら、作動可能発現カセツトを提供するた
めには適した制御領域を構造遺伝子に作動可能な状態で
挿入する必要があろう。同様に、発現カセツトを完成す
るための３′終止配列が挿入部位にない場合は３′終止
配列が挿入されるべき構造遺伝子に作動可能なごとく結
合されなければならないであろう。
含んでいないなら、作動可能発現カセツトを提供するた
めには適した制御領域を構造遺伝子に作動可能な状態で
挿入する必要があろう。同様に、発現カセツトを完成す
るための３′終止配列が挿入部位にない場合は３′終止
配列が挿入されるべき構造遺伝子に作動可能なごとく結
合されなければならないであろう。
当業者はすでに特徴付けられ、C1資化性酵母と連結し
て用いられる多くの制御領域に気がつくであろう。典型
的制御領域はサツカロミセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）から単離される酸性ホスフアターゼ、
ガラクロキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チト
クロームＣ、アルフアー交配因子およびグリセルアルデ
ヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ制御領域；ピキア パ
ストリス（Pichia pastoris）から誘導される一次アル
コール酸化酵素（AOX1）、ジヒドロキシアセトン合成酵
素（DHAS）、p40制御領域およびHIS4制御領域およびそ
れらの類似物から成る群より選択されるものが挙げられ
るが酵母制御領域に限定されるものではない。現在、本
発明の実施に用いられる好適な制御領域はメタノール−
含有培地で反応する能力により特徴づけられるもので、
そのような制御領域はAOX1、DHAS、p40から成る群より
選択され、特許公開番号0183070として1986年６月４日
に公開されたヨーロツパ特許出願85113737.2に記載され
ている。
て用いられる多くの制御領域に気がつくであろう。典型
的制御領域はサツカロミセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）から単離される酸性ホスフアターゼ、
ガラクロキナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チト
クロームＣ、アルフアー交配因子およびグリセルアルデ
ヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ制御領域；ピキア パ
ストリス（Pichia pastoris）から誘導される一次アル
コール酸化酵素（AOX1）、ジヒドロキシアセトン合成酵
素（DHAS）、p40制御領域およびHIS4制御領域およびそ
れらの類似物から成る群より選択されるものが挙げられ
るが酵母制御領域に限定されるものではない。現在、本
発明の実施に用いられる好適な制御領域はメタノール−
含有培地で反応する能力により特徴づけられるもので、
そのような制御領域はAOX1、DHAS、p40から成る群より
選択され、特許公開番号0183070として1986年６月４日
に公開されたヨーロツパ特許出願85113737.2に記載され
ている。
本発明の実施に最も好適な制御領域はAOX1制御領域で
ある。
ある。
３′終止配列は発現カセツト中で利用され、前記のご
とくベクターの一部であろう。３′終止配列は遺伝子に
作働可能な状態で結合されている場合構造遺伝子により
コードされているメツセンジヤーRNAを終結（ポリアデ
ニル化）および／または安定化する作用がある。本発明
の実施のための３′終止配列の実施となる源のいくつか
の例を挙げるがサツカロミセス セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）、ハンセヌラ ポリモルフア（Hansenu
la polymorpha）およびピキア（Pichia）３′終止配列
に限定されるわけではない。好適であるのはピキア パス
トリス（Pichia pastoris）から誘導されるものでAOX1
遺伝子、DHAS遺伝子およびHIS4遺伝子の３′終止配列か
らなる群より選択されるもののごときものである。特に
好適であるのはAOX1遺伝子の３′終止配列である。
とくベクターの一部であろう。３′終止配列は遺伝子に
作働可能な状態で結合されている場合構造遺伝子により
コードされているメツセンジヤーRNAを終結（ポリアデ
ニル化）および／または安定化する作用がある。本発明
の実施のための３′終止配列の実施となる源のいくつか
の例を挙げるがサツカロミセス セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）、ハンセヌラ ポリモルフア（Hansenu
la polymorpha）およびピキア（Pichia）３′終止配列
に限定されるわけではない。好適であるのはピキア パス
トリス（Pichia pastoris）から誘導されるものでAOX1
遺伝子、DHAS遺伝子およびHIS4遺伝子の３′終止配列か
らなる群より選択されるもののごときものである。特に
好適であるのはAOX1遺伝子の３′終止配列である。
本発明の実施には第１図および２に示した構成物のBg
lIIフラグメントのごとき線状部位−特異性組込みベク
ターかまたは第４図に示したごときプラスミドが使用さ
れる。
lIIフラグメントのごとき線状部位−特異性組込みベク
ターかまたは第４図に示したごときプラスミドが使用さ
れる。
適したベクターへのHSA構造遺伝子の挿入は選択され
たベクターを適当な部位または複数の部位で切断し、HS
A構造遺伝子を含む少くとも１つの作動可能発現カセツ
トがベクター中に存在する結果を生む任意の適した技術
により達成される。
たベクターを適当な部位または複数の部位で切断し、HS
A構造遺伝子を含む少くとも１つの作動可能発現カセツ
トがベクター中に存在する結果を生む任意の適した技術
により達成される。
HSA構造遺伝子の結合は、T4DNAリガーゼを利用するご
とき任意の適当な結合技術により達成されるであろう。
とき任意の適当な結合技術により達成されるであろう。
HSA構造遺伝子およびベクターの結合混合物の最初の
選択、繁殖および至適な増幅は、大腸菌のごとき細菌性
宿主内へ混合物を形質転換する事により（結合混合物は
酵母宿主内へ直接形質転換する事ができるけれど）好適
に実施される。大腸菌のための適した形質転換技術はこ
の分野ではよく知られている。さらに、選択マーカーお
よびベクターの維持のために必要な細菌複製開始点が細
菌性宿主であることもこの分野ではよく知られている。
選択、繁殖および至適な増幅は、大腸菌のごとき細菌性
宿主内へ混合物を形質転換する事により（結合混合物は
酵母宿主内へ直接形質転換する事ができるけれど）好適
に実施される。大腸菌のための適した形質転換技術はこ
の分野ではよく知られている。さらに、選択マーカーお
よびベクターの維持のために必要な細菌複製開始点が細
菌性宿主であることもこの分野ではよく知られている。
発現系においてのHSA構造遺伝子を含む所望のプラス
ミドの単離および／または精製は宿主DNAからプラスミ
ドDNAを分離するための任意の適当な手段により達成さ
れるであろう。
ミドの単離および／または精製は宿主DNAからプラスミ
ドDNAを分離するための任意の適当な手段により達成さ
れるであろう。
同様に結合により形成されたベクターは、HSA遺伝子
の存在および制御領域および３′終止配列へのその作動
可能な結合を実証するための繁殖後に好適に試験される
であろう。このことは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル
電気泳動またはエンドヌクレアーゼ消化−サザン ハイ
ブリダイゼーシヨンなどを含む種々の技術により達成さ
れるであろうが、それに限定されるわけではない。
の存在および制御領域および３′終止配列へのその作動
可能な結合を実証するための繁殖後に好適に試験される
であろう。このことは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル
電気泳動またはエンドヌクレアーゼ消化−サザン ハイ
ブリダイゼーシヨンなどを含む種々の技術により達成さ
れるであろうが、それに限定されるわけではない。
酵母宿主へのプラスミドまたは線状ベクターの形質転
換はHinnenら、Proc,Natl.Acad.Sci.75,（1978）1929;I
toら、J.Bacteriol.153,（1983）163;XreggらMol. Cel
l Biol.５（1985）pg3376;またはSreekrishnaら、Gen
e.59（1987）pg115らにより示された技術を含む適当な
形質転換技術により達成されるがそれらに限定されるわ
けではない。本発明の実施に好適なものはCreggの形質
転換技術である。過剰の線状ベクターを利用し、サザン
ハイブリダイゼーシヨンにより多挿入物を選択するのが
本発明の実施に望ましい。
換はHinnenら、Proc,Natl.Acad.Sci.75,（1978）1929;I
toら、J.Bacteriol.153,（1983）163;XreggらMol. Cel
l Biol.５（1985）pg3376;またはSreekrishnaら、Gen
e.59（1987）pg115らにより示された技術を含む適当な
形質転換技術により達成されるがそれらに限定されるわ
けではない。本発明の実施に好適なものはCreggの形質
転換技術である。過剰の線状ベクターを利用し、サザン
ハイブリダイゼーシヨンにより多挿入物を選択するのが
本発明の実施に望ましい。
形質転換のための酵母宿主は任意の適当なC1資化性酵
母である。C1資化性酵母にはハンセヌラ（Hansenul
a）、カンジダ（Candida）、クロエツケラ（Kloecker
a）、ピキア（Pichia）、サツカロミセス（Saccharomyc
es）、トルロプシス（Torulopsis）およびロドトルラ
（Rhodotorula）から成る属から選択されるメタノール
上で増殖できる酵母が挙げられるがそれに限定されるわ
けではない。この種類の酵母の典型的な特定の種の一覧
はC.AnthonyによるC1 資化性酵母の生化学、269（1982）
に見ることができるであろう。現在好適なのは栄養素要
求性ピキア パストリス（Pichia pastoris）GS115（NRRL
Y−15851）のごときピキア（Pichia）属のC1資化性酵母
である。栄養素要求性C1資化性酵母は本発明の実施の際
その選択が容易であるという利点もある。ピキア パスト
リス（Pichia pastoris）をシヨ糖上で増殖できる株へ形
質転換するSUC2の使用、またはG418のごとき抗生物質低
抵抗マーカーを用いるといつたように、もし適当な形質
転換マーカー遺伝子が選択されたら野生株C1資化性酵母
株が同程度の成功度で使用できる事が認められる。
母である。C1資化性酵母にはハンセヌラ（Hansenul
a）、カンジダ（Candida）、クロエツケラ（Kloecker
a）、ピキア（Pichia）、サツカロミセス（Saccharomyc
es）、トルロプシス（Torulopsis）およびロドトルラ
（Rhodotorula）から成る属から選択されるメタノール
上で増殖できる酵母が挙げられるがそれに限定されるわ
けではない。この種類の酵母の典型的な特定の種の一覧
はC.AnthonyによるC1 資化性酵母の生化学、269（1982）
に見ることができるであろう。現在好適なのは栄養素要
求性ピキア パストリス（Pichia pastoris）GS115（NRRL
Y−15851）のごときピキア（Pichia）属のC1資化性酵母
である。栄養素要求性C1資化性酵母は本発明の実施の際
その選択が容易であるという利点もある。ピキア パスト
リス（Pichia pastoris）をシヨ糖上で増殖できる株へ形
質転換するSUC2の使用、またはG418のごとき抗生物質低
抵抗マーカーを用いるといつたように、もし適当な形質
転換マーカー遺伝子が選択されたら野生株C1資化性酵母
株が同程度の成功度で使用できる事が認められる。
元々は栄養素要求性細胞を形質転換後必要とする生化
学生成物（細胞の栄養素要求性のための）不在下で培養
し、新規表現型（“メタノールに鈍い”）を選択および
検出すること、または形質転換体に含まれている低抵抗
遺伝子の不在下では酵母に対しては有毒な抗生物質存在
下で培養することなどの適当な技術を使用して（しかし
それらに限定されるわけではない）形質転換体C1資化性
酵母細胞を選択できる。
学生成物（細胞の栄養素要求性のための）不在下で培養
し、新規表現型（“メタノールに鈍い”）を選択および
検出すること、または形質転換体に含まれている低抵抗
遺伝子の不在下では酵母に対しては有毒な抗生物質存在
下で培養することなどの適当な技術を使用して（しかし
それらに限定されるわけではない）形質転換体C1資化性
酵母細胞を選択できる。
単離された形質転換C1資化性酵母細胞はフラスコ振と
う発酵、高密度発酵またはCreggらにより記載された技
術、C1資化性酵母、ピキア パストリス（Pichia pastori
s）におけるＢ型肝炎表面抗原の高水準発現および効率
的構築5Bio/Technolog.,479（1987）、のごとき適当な
発酵技術により培養する。
う発酵、高密度発酵またはCreggらにより記載された技
術、C1資化性酵母、ピキア パストリス（Pichia pastori
s）におけるＢ型肝炎表面抗原の高水準発現および効率
的構築5Bio/Technolog.,479（1987）、のごとき適当な
発酵技術により培養する。
実施例 実施例に関する一般的情報： 株 ピキア パストリス（Pichia pastoris）GS115（his
４）〔NRRL Y−15851〕ピキア パストリス（Pichia past
oris）KM71（his 4 aoxl ： ARG4） 大腸菌YMC9（F-λ- endo A1 hsds17 SUPE44 thi1） すべてのプラスミド構成および調製に使用される。
４）〔NRRL Y−15851〕ピキア パストリス（Pichia past
oris）KM71（his 4 aoxl ： ARG4） 大腸菌YMC9（F-λ- endo A1 hsds17 SUPE44 thi1） すべてのプラスミド構成および調製に使用される。
大腸菌DH5∝Ｆ′〔（Ｆ′，endA1 hsdR17（r-k，m
-k）SupE44,thi−1,λ- recA1,gyrA96,relA1,080dlac Z
−ΔM15,Δ（lac ZYAarg F）U169〕 大腸菌JM107 endA1 gyrA96,thi，hsdR17 supE44,re
lA1,traD36（r-k，m+k）Δ（lac proA,B）/F′，proA,
B,lacIq ZΔM15。
-k）SupE44,thi−1,λ- recA1,gyrA96,relA1,080dlac Z
−ΔM15,Δ（lac ZYAarg F）U169〕 大腸菌JM107 endA1 gyrA96,thi，hsdR17 supE44,re
lA1,traD36（r-k，m+k）Δ（lac proA,B）/F′，proA,
B,lacIq ZΔM15。
大腸菌Y1088〔（ATCC第37195号）；Δ lacU169 supE sup
F hsdR- hsdM metB trpR tonA21 proC::Tn5（pMC9）。pMC9
＝pBR322−lacIQ 〕はDNA単離を目的とするライブラリー
の増加およびブラーク糖製フアージ貯蔵物の調製のため
に使用された。
F hsdR- hsdM metB trpR tonA21 proC::Tn5（pMC9）。pMC9
＝pBR322−lacIQ 〕はDNA単離を目的とするライブラリー
の増加およびブラーク糖製フアージ貯蔵物の調製のため
に使用された。
大腸菌Y1090〔ATCC第37197号）；Δ lac169,proA± Δ l
on araD139 strA supF，trpC22::Tn（pMC9）〕は全ての免
疫学的ブラークスクリーニングおよび続いての種々のオ
リゴヌクレオチドプローブのスクリーニングのための宿
主として使用される。
on araD139 strA supF，trpC22::Tn（pMC9）〕は全ての免
疫学的ブラークスクリーニングおよび続いての種々のオ
リゴヌクレオチドプローブのスクリーニングのための宿
主として使用される。
緩衝液、溶液および培地 以下の実施例で使用される緩衝液、溶液および培地は
下記の組成を持つ： 培地、リツトル当り LB＋amp 10g 酵母抽出物 20g トリプトン 10g NaCl 5M NaOHにてpH7.5に調整 100mg アムピシリン LB 10g 酵母抽出物 20g トリプトン 10g NaCl 5M NaOHにてpH7.5に調整 MGY 13.4g アミノ酸を含まないYNB 400μｇ ビオチン 10g グルコース 10ml グリセロール MM 13.4g アミノ酸を含まないYNB 400μｇ ビオチン 5ml メタノール LB寒天プレート LB中１−２％寒天 LB上層寒天 LB中 0.8％寒天 上層アガロース LB中 0.8％アガロース LBM LB＋10mMMgSO4 LBM/AMP LBM＋50μg/mlアムピシン Ｈ−上層寒天 16gバクトートリブトン 10gバクトー酵母抽出物 １リツトルのH2Oに5gのNaCl SM 5.8g NaCl 2g MgSO4・7H2O 50ml １MトリスHCl pH7.5 5ml ２％ ゼラチン SDR,1リツトル 13.4g YNB 400μｇ ビオチン 182g ソルビトール 10g デキストロース 10g 寒天 50mgづつのグルタミン、メチオニン、リジン、ロイシン
およびイソロイシン2gヒスチジン検定混合物 SDHR,1リツトル SDR＋40mgヒスチジン 緩衝液および溶液 TE緩衝液： 10mMトリス・HCl（pH8.0） 1mM EDTA（pH8.0） 高塩緩衝液： 50mM トリス・HCl,pH8.0 10mM MgCl2 100mM NaCl 制限消化緩衝液： HS 緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,100mM
NaClおよび1mMジチオスレイトール MS緩衝液： 10mM トリス・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,50mM N
aClおよび1mMジチオスレイトール LS緩衝液： 10mM トリス・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2および1mM
ジチオスレイトール 結合緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.4） 10mM MgCl2 10mM ジチオスレイトール 1mM ATPおよび 100μg/ml BSA ニツクトランスレーシヨン（NT）緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.2） 10mM MgSO4 0.1mM ジチオスレイトール および 1mM EDTA ホスフアターゼ緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH9.0） 1mM MgCl2 1mM ZnCl2 および 1mM スペルミジン キナーゼ緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.6） 10mM MgCl2 5mM ジチオスレイトール 0.1mM EDTA および 0.1mM スペルミジン Na2CO3／NaHCO3緩衝液： 0.15M Na2CO3 0.035M NaHCO3 ブロツト緩衝液： 50g 無脂肪乾燥ミルク 1g チメロサール 100μｌ 抗あわ剤Ａ（シグマ） 1X Ｄ−PBS（１）（ダルベツコ リン酸緩衝塩溶
液、ギブコ）に0.5ml ツイーン20 TBS,1X 150mM NaCl 10mM トリス・HCl,pH7.5 TBST 1X TBS 0.05％ ツイーン20 CaS 1M ソルビトール 10mM CaCl2 10mM トリス・HCl,pH7.5 無菌フイルター 実施例Ｉ HSA−cDNAの単離 ヒト肝臓λgt II−cDNA 発現ライブラリー（ロツト
番号2102）はクロンテク ラボラトリー社（Clontech L
aboratories,Inc）から購入された。このライブラリー
はml当り９×109フアージの力価を持つており、0.15か
ら1.8キロ塩基対の範囲の推定挿入サイズの5.5×105の
独立な透明なプラークフアージ分離物から成つている。
下記の組成を持つ： 培地、リツトル当り LB＋amp 10g 酵母抽出物 20g トリプトン 10g NaCl 5M NaOHにてpH7.5に調整 100mg アムピシリン LB 10g 酵母抽出物 20g トリプトン 10g NaCl 5M NaOHにてpH7.5に調整 MGY 13.4g アミノ酸を含まないYNB 400μｇ ビオチン 10g グルコース 10ml グリセロール MM 13.4g アミノ酸を含まないYNB 400μｇ ビオチン 5ml メタノール LB寒天プレート LB中１−２％寒天 LB上層寒天 LB中 0.8％寒天 上層アガロース LB中 0.8％アガロース LBM LB＋10mMMgSO4 LBM/AMP LBM＋50μg/mlアムピシン Ｈ−上層寒天 16gバクトートリブトン 10gバクトー酵母抽出物 １リツトルのH2Oに5gのNaCl SM 5.8g NaCl 2g MgSO4・7H2O 50ml １MトリスHCl pH7.5 5ml ２％ ゼラチン SDR,1リツトル 13.4g YNB 400μｇ ビオチン 182g ソルビトール 10g デキストロース 10g 寒天 50mgづつのグルタミン、メチオニン、リジン、ロイシン
およびイソロイシン2gヒスチジン検定混合物 SDHR,1リツトル SDR＋40mgヒスチジン 緩衝液および溶液 TE緩衝液： 10mMトリス・HCl（pH8.0） 1mM EDTA（pH8.0） 高塩緩衝液： 50mM トリス・HCl,pH8.0 10mM MgCl2 100mM NaCl 制限消化緩衝液： HS 緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,100mM
NaClおよび1mMジチオスレイトール MS緩衝液： 10mM トリス・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,50mM N
aClおよび1mMジチオスレイトール LS緩衝液： 10mM トリス・HCl（pH7.5）,10mM MgCl2および1mM
ジチオスレイトール 結合緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.4） 10mM MgCl2 10mM ジチオスレイトール 1mM ATPおよび 100μg/ml BSA ニツクトランスレーシヨン（NT）緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.2） 10mM MgSO4 0.1mM ジチオスレイトール および 1mM EDTA ホスフアターゼ緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH9.0） 1mM MgCl2 1mM ZnCl2 および 1mM スペルミジン キナーゼ緩衝液： 50mM トリス・HCl（pH7.6） 10mM MgCl2 5mM ジチオスレイトール 0.1mM EDTA および 0.1mM スペルミジン Na2CO3／NaHCO3緩衝液： 0.15M Na2CO3 0.035M NaHCO3 ブロツト緩衝液： 50g 無脂肪乾燥ミルク 1g チメロサール 100μｌ 抗あわ剤Ａ（シグマ） 1X Ｄ−PBS（１）（ダルベツコ リン酸緩衝塩溶
液、ギブコ）に0.5ml ツイーン20 TBS,1X 150mM NaCl 10mM トリス・HCl,pH7.5 TBST 1X TBS 0.05％ ツイーン20 CaS 1M ソルビトール 10mM CaCl2 10mM トリス・HCl,pH7.5 無菌フイルター 実施例Ｉ HSA−cDNAの単離 ヒト肝臓λgt II−cDNA 発現ライブラリー（ロツト
番号2102）はクロンテク ラボラトリー社（Clontech L
aboratories,Inc）から購入された。このライブラリー
はml当り９×109フアージの力価を持つており、0.15か
ら1.8キロ塩基対の範囲の推定挿入サイズの5.5×105の
独立な透明なプラークフアージ分離物から成つている。
４×105の独立なフアージ単離物に相当する一部を取
り、プローブ＃１と相補的なヌクレオチド配列を含むも
のをスクリーニングする。プローブ＃１は19bpのオリゴ
ヌクレオチド（下記工程５で示す）であり、ヒト血清ア
ルブミンの成熟分泌型の最初のアミノ酸のためのコドン
を含んでいる。スクリーニングは以下のごとく実施す
る。
り、プローブ＃１と相補的なヌクレオチド配列を含むも
のをスクリーニングする。プローブ＃１は19bpのオリゴ
ヌクレオチド（下記工程５で示す）であり、ヒト血清ア
ルブミンの成熟分泌型の最初のアミノ酸のためのコドン
を含んでいる。スクリーニングは以下のごとく実施す
る。
工程1.大腸菌トランスフエクシヨン 大腸菌Y1088（ATCC番号37197）を0.2％Ｄ−グルコー
スを補充したLBブロス〔5.0g/l酵母抽出物（デイフコ
（Difco））,10.0g/lトリブトン（デイフコ）、5.0g/l
塩化ナトリウム〕からなるLBD液体培地に懸濁する。こ
の懸濁液の50μｌを50μg/mlのアムピシリンを含むLB
（LB＋Amp）に1.2％寒天ノーブル（デイフコ）を加えた
固型増殖培地上に拡げる。37℃にて一夜放置し細菌コロ
ニーを増殖せしめる。いくつかのコロニーを10mlのLB−
ABmp培地に移し、ライブラリーのスクリーニングに使用
される終夜培養物を得るため250rpmにセツトした回転振
とう機中30℃でインキユベートする。
スを補充したLBブロス〔5.0g/l酵母抽出物（デイフコ
（Difco））,10.0g/lトリブトン（デイフコ）、5.0g/l
塩化ナトリウム〕からなるLBD液体培地に懸濁する。こ
の懸濁液の50μｌを50μg/mlのアムピシリンを含むLB
（LB＋Amp）に1.2％寒天ノーブル（デイフコ）を加えた
固型増殖培地上に拡げる。37℃にて一夜放置し細菌コロ
ニーを増殖せしめる。いくつかのコロニーを10mlのLB−
ABmp培地に移し、ライブラリーのスクリーニングに使用
される終夜培養物を得るため250rpmにセツトした回転振
とう機中30℃でインキユベートする。
λgt11−cDNA発現ライブラリーの一部をSM緩衝液
〔（50mM トリス・HCl,pH7.5,0.1M NaCl,8.1mM MgSO4,
0.01％（W/V）ゼラチン〕で100倍に希釈する。4.4μｌ
を4.0mlの大腸菌Y1088の終夜培養物と混合し、混合物を
30℃にて20分間インキユベートする。0.2mlを55℃に維
持されている2.5mlの軟寒天培地〔（LBに0.7％寒天ノー
ブル（デイフコ）を添加〕に添加し、それを90mmの直径
のペトリ皿中の底寒天（1.2％寒天ノーブルを含むLB）
上に均等に拡げる。室温で10分後、プレートを43℃にセ
ツトしたインキユベーターに置く。フアージプラークが
放置すると現れるがコンフルエントにはならない（通常
４から６時間）。
〔（50mM トリス・HCl,pH7.5,0.1M NaCl,8.1mM MgSO4,
0.01％（W/V）ゼラチン〕で100倍に希釈する。4.4μｌ
を4.0mlの大腸菌Y1088の終夜培養物と混合し、混合物を
30℃にて20分間インキユベートする。0.2mlを55℃に維
持されている2.5mlの軟寒天培地〔（LBに0.7％寒天ノー
ブル（デイフコ）を添加〕に添加し、それを90mmの直径
のペトリ皿中の底寒天（1.2％寒天ノーブルを含むLB）
上に均等に拡げる。室温で10分後、プレートを43℃にセ
ツトしたインキユベーターに置く。フアージプラークが
放置すると現れるがコンフルエントにはならない（通常
４から６時間）。
工程２ フイルターリフト プラークを含む上層寒天にＳ＆Ｓニトロセルロースフ
イルター（0.45μ孔径および82mm直径）を重積する。最
終段階でのフイルターの配向付けを助けるためインデイ
アンインクを含む18ゲージ針を付けた注射筒で寒天上の
フイルターを５点刺し通す。１分後プラーク側を上にし
てフイルターを1.5M NaCl/0.5M NaOHで飽和した3MMワツ
トマン紙上に移す。２分後フイルターは底側からプロ
ツトされるので中和溶液（1.0Mトリス・HCl,pH8.0,1.5M
NaCl）で飽和した第２の3MMワツトマン紙上に移
す。８分間中和した後、フイルターを6XSSC（0.9M NaC
l,90mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）にて洗浄する。プ
ロツトされたフイルターを乾燥し、真空オーブン中で80
℃にて２時間焼く。
イルター（0.45μ孔径および82mm直径）を重積する。最
終段階でのフイルターの配向付けを助けるためインデイ
アンインクを含む18ゲージ針を付けた注射筒で寒天上の
フイルターを５点刺し通す。１分後プラーク側を上にし
てフイルターを1.5M NaCl/0.5M NaOHで飽和した3MMワツ
トマン紙上に移す。２分後フイルターは底側からプロ
ツトされるので中和溶液（1.0Mトリス・HCl,pH8.0,1.5M
NaCl）で飽和した第２の3MMワツトマン紙上に移
す。８分間中和した後、フイルターを6XSSC（0.9M NaC
l,90mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）にて洗浄する。プ
ロツトされたフイルターを乾燥し、真空オーブン中で80
℃にて２時間焼く。
工程３ プリハイブリダイゼーシヨンおよび＃１プロー
ブとのハイブリダイゼーシヨンおよびオートラジオグラ
フイー ヒト血清アルブミンのcDNAを含むプラークはそのDNA
を細菌または形質転換ベクターDNAと相捕的ではなくし
かしヒト血清アルブミンcDNAと相補的なヌクレオチド配
列として選択された放射活性標識オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーシヨンすることにより同定される。
ブとのハイブリダイゼーシヨンおよびオートラジオグラ
フイー ヒト血清アルブミンのcDNAを含むプラークはそのDNA
を細菌または形質転換ベクターDNAと相捕的ではなくし
かしヒト血清アルブミンcDNAと相補的なヌクレオチド配
列として選択された放射活性標識オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーシヨンすることにより同定される。
A.標識オリゴヌクレオチドプローブの調製 放射活性オリゴヌクレオチドプローブは70mMトリス・
HCl（pH7.6）,10mM MgCl21.0mM KCl,5.0mM ジチオスレ
イトール,1.0mMスペルミジンを含む10μｌの緩衝液中約
100mgの与えられたオリゴヌクレオチドを100μCiの〔32
P〕ATPと混合することにより調製される。10単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを添加し、混合物は37℃にて30
分間インキユベートする。65℃で５分間インキユベート
して酵素を不活性化し、反応混合物を精製することなく
ハイブリダイゼーシヨン溶液に標識オリゴヌクレオチド
を添加する。
HCl（pH7.6）,10mM MgCl21.0mM KCl,5.0mM ジチオスレ
イトール,1.0mMスペルミジンを含む10μｌの緩衝液中約
100mgの与えられたオリゴヌクレオチドを100μCiの〔32
P〕ATPと混合することにより調製される。10単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを添加し、混合物は37℃にて30
分間インキユベートする。65℃で５分間インキユベート
して酵素を不活性化し、反応混合物を精製することなく
ハイブリダイゼーシヨン溶液に標識オリゴヌクレオチド
を添加する。
B.プリハイブリダイゼーシヨン フアージDNAを含むフイルターリフトを0.9M NaCl,6.0
mM Na2EDTA,19.8mM トリス・HCl（pH8.0）,0.1％ フ
イコール,0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清
アルブミン、0.1％SDSおよび10％硫酸デキストランを含
む溶液中で３−16時間インキユベートする。
mM Na2EDTA,19.8mM トリス・HCl（pH8.0）,0.1％ フ
イコール,0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清
アルブミン、0.1％SDSおよび10％硫酸デキストランを含
む溶液中で３−16時間インキユベートする。
C.ハイブリダイゼーシヨン プリハイブリダイズしたフイルターをプリハイブリダ
イゼーシヨンと同一の、しかし放射活性−標識オリゴヌ
クレオチド＃１を2mg/mlの濃度で含む溶液中でハイブリ
ダイズする。フイルター当り2mlの溶液を用い、37℃に
て20−48時間インキユベートする。
イゼーシヨンと同一の、しかし放射活性−標識オリゴヌ
クレオチド＃１を2mg/mlの濃度で含む溶液中でハイブリ
ダイズする。フイルター当り2mlの溶液を用い、37℃に
て20−48時間インキユベートする。
D.洗浄 フイルターは0.9M NaCl,90mM クエン酸ナトリウム
（pH7.0）緩衝液中室温で４回（１回の洗浄当り20
分）、0.1％SDSを含む同じ緩衝液中45℃にて１回（１時
間）洗浄する。各々のフイルター洗浄に10ml容量の溶液
を使用する。
（pH7.0）緩衝液中室温で４回（１回の洗浄当り20
分）、0.1％SDSを含む同じ緩衝液中45℃にて１回（１時
間）洗浄する。各々のフイルター洗浄に10ml容量の溶液
を使用する。
E.オートラジオグラフイー フイルターを風乾し、Ｘ−線フイルム露光カセツト中
Ｘ−線フイルム（コダツクXAR−２またはXAR−５）と合
わせて置く。カセツトを−80℃にて20−48時間インキユ
ベートする。
Ｘ−線フイルム（コダツクXAR−２またはXAR−５）と合
わせて置く。カセツトを−80℃にて20−48時間インキユ
ベートする。
工程４ HSAタンパク質陽性プラークの免疫スクリーニ
ング λgt11ベクター中のクローニング部位はβ−ガラクト
シダーゼコード領域内にある。IPTG（イソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトシド）はλgt11ベクター中のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の発現を誘導するので、それはまた
β−ガラクトシダーゼに関して読みわく内にクローニン
グされた遺伝子の発現も誘導し、β−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質を産生する。それ故、正しい配向をした
読みわく内の全または部分HSA遺伝子からは免疫活性物
質が得られねばならない。大腸菌株Y1090（ATCC番号371
97）がHSA発現陽性プラークの検出に用いられる。フア
ージの感染および塗布法は大腸菌Y1088のために前に記
載した方法と同じである。プラークが約1mmの直径にな
つた後、前もつて10mM（IPTG）に浸漬し乾燥させてある
ニトロセルロースフイルターを上層寒天上に置く。プレ
ートを43℃にて４−６時間インキユベートする。その後
フイルターをプレートから除き、１％ゼラチン、0.05％
Brij58を含むTBSTからなる阻害溶液に浸す。フイルター
は室温にてゆるやかに揺り動かしながら0.5−16時間イ
ンキユベートする。もしオリゴヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーシヨンと同一のプレートからプラークリフト
が必要とされる場合は、ニトロセルロースフイルターの
重層に先立ちプレートを43℃インキユベーターに２時間
戻す。
ング λgt11ベクター中のクローニング部位はβ−ガラクト
シダーゼコード領域内にある。IPTG（イソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトシド）はλgt11ベクター中のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子の発現を誘導するので、それはまた
β−ガラクトシダーゼに関して読みわく内にクローニン
グされた遺伝子の発現も誘導し、β−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質を産生する。それ故、正しい配向をした
読みわく内の全または部分HSA遺伝子からは免疫活性物
質が得られねばならない。大腸菌株Y1090（ATCC番号371
97）がHSA発現陽性プラークの検出に用いられる。フア
ージの感染および塗布法は大腸菌Y1088のために前に記
載した方法と同じである。プラークが約1mmの直径にな
つた後、前もつて10mM（IPTG）に浸漬し乾燥させてある
ニトロセルロースフイルターを上層寒天上に置く。プレ
ートを43℃にて４−６時間インキユベートする。その後
フイルターをプレートから除き、１％ゼラチン、0.05％
Brij58を含むTBSTからなる阻害溶液に浸す。フイルター
は室温にてゆるやかに揺り動かしながら0.5−16時間イ
ンキユベートする。もしオリゴヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーシヨンと同一のプレートからプラークリフト
が必要とされる場合は、ニトロセルロースフイルターの
重層に先立ちプレートを43℃インキユベーターに２時間
戻す。
IPTGフイルターを阻害溶液から除き、阻害溶液で1:10
00に希釈したヤギ抗−HSA〔比濁計用等級、アトランチ
ツク アンチボデイズ（Atlantic Antibodies）、カタ
ログ番号001−11、スカルポロフ、ME〕を使用してプラ
ーク発現免疫活性HSAが同定される。１時間室温でイン
キユベートし、フイルターをTBST中５回洗浄する（１回
の洗浄当り10分）。すべてのインキユベーシヨンおよび
洗浄はゆるやかに揺り動かしながら実行する。抗−HSA
抗体の結合は室温で１時間阻害溶液中1:1000に希釈した
アルカリホスフアターゼー結合ウサギ抗ヤギIgG〔キル
ケガードアンドペリーラボラトリー（Kirkegaard and P
erry Laboratories）、ガイセルベルグ、MD〕とインキ
ユベートすることにより検出される。前記のごとく洗浄
した後フイルターをニトロブルーテトラゾリウムおよび
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフアート
（キルケガードアンドペリーラボラトリー）を含む0.1M
トリス緩衝液からなるホスフアターゼ基質系中室温で10
−30分間インキユベートする。安定な紫色の沈澱が膜の
反応部位に析出する。水中でフイルターを洗浄すること
により反応が停止され、フイルターは風乾する。
00に希釈したヤギ抗−HSA〔比濁計用等級、アトランチ
ツク アンチボデイズ（Atlantic Antibodies）、カタ
ログ番号001−11、スカルポロフ、ME〕を使用してプラ
ーク発現免疫活性HSAが同定される。１時間室温でイン
キユベートし、フイルターをTBST中５回洗浄する（１回
の洗浄当り10分）。すべてのインキユベーシヨンおよび
洗浄はゆるやかに揺り動かしながら実行する。抗−HSA
抗体の結合は室温で１時間阻害溶液中1:1000に希釈した
アルカリホスフアターゼー結合ウサギ抗ヤギIgG〔キル
ケガードアンドペリーラボラトリー（Kirkegaard and P
erry Laboratories）、ガイセルベルグ、MD〕とインキ
ユベートすることにより検出される。前記のごとく洗浄
した後フイルターをニトロブルーテトラゾリウムおよび
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフアート
（キルケガードアンドペリーラボラトリー）を含む0.1M
トリス緩衝液からなるホスフアターゼ基質系中室温で10
−30分間インキユベートする。安定な紫色の沈澱が膜の
反応部位に析出する。水中でフイルターを洗浄すること
により反応が停止され、フイルターは風乾する。
いくつかの実験においては陽性プラークの同定に125I
−タンパク質Ｇが使用された。この場合、フイルターは
前に記載したごとき抗−HSA抗体とのインキユベーヨン
および続いての洗浄後ml当り0.3μCiの125I−タンパク
質Ｇを含むTBS（ツイーン20を含まないTBST）溶液中で
４時間インキユベートする。フイルターはBTBS（0.05％
Brij58を含むTBS）で２回洗浄し、続いて更にTBS中で
２回洗浄する。すべての洗浄は室温でゆるやかに揺り動
かしながら10分間隔で実施する。オートラジオグラフイ
ーは前記のごとく実施する。
−タンパク質Ｇが使用された。この場合、フイルターは
前に記載したごとき抗−HSA抗体とのインキユベーヨン
および続いての洗浄後ml当り0.3μCiの125I−タンパク
質Ｇを含むTBS（ツイーン20を含まないTBST）溶液中で
４時間インキユベートする。フイルターはBTBS（0.05％
Brij58を含むTBS）で２回洗浄し、続いて更にTBS中で
２回洗浄する。すべての洗浄は室温でゆるやかに揺り動
かしながら10分間隔で実施する。オートラジオグラフイ
ーは前記のごとく実施する。
工程５ オリゴヌクレオチド＃2,＃3,M1およびM2とのプ
ラークハイブリダイゼーシヨン精製プラークは下記のオ
リゴヌクレオチドでスクリーニングされた。
ラークハイブリダイゼーシヨン精製プラークは下記のオ
リゴヌクレオチドでスクリーニングされた。
＃1:5′−CCTCACTCTTGTGTGCATC−３′ ＃2:5′−CCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTTTTCCAACAGAGG−３ ＃3:5′−CCCTCCTCGGCAAAGCAGG−３ M1:5′−GAAATAAAGGTTACCCACTTCAT−３′ M2:5′−CCCACTTCATTGTGCCAAAG−３′ ＃１プローブは成熟HSAタンパク質の最初の６つのア
ミノ酸に対応する19のヌクレオチドにハイブリダイズす
る。＃２プローブは成熟HSAタンパク質の＃281から＃29
2のアミノ酸に対応するヌクレオチドと相捕的でHSA−cD
NA配列内の単−PstＩ制限エンドヌクレアーゼ部位から
上流にある。＃３のプローブは成熟HSAタンパク質の＃5
65から＃571のアミノ酸のためのヌクレオチドを含むク
ローンの検出に使用できる。上記３つのオリゴヌクレオ
チドは公表されたHSA cDNA配列のこれらの領域内ではヌ
クレオチド変異がなかつたため選択された。
ミノ酸に対応する19のヌクレオチドにハイブリダイズす
る。＃２プローブは成熟HSAタンパク質の＃281から＃29
2のアミノ酸に対応するヌクレオチドと相捕的でHSA−cD
NA配列内の単−PstＩ制限エンドヌクレアーゼ部位から
上流にある。＃３のプローブは成熟HSAタンパク質の＃5
65から＃571のアミノ酸のためのヌクレオチドを含むク
ローンの検出に使用できる。上記３つのオリゴヌクレオ
チドは公表されたHSA cDNA配列のこれらの領域内ではヌ
クレオチド変異がなかつたため選択された。
潜在的プローブはλgt11 ベクターおよび大腸菌DNA
に既知の配列に相同的な配列が無いことをみるためスク
リーニングされた。このスクリーニングはハイブリダイ
ゼーションの非特異的部位を減少させるために必要であ
る。この分析に基づくと、プローブM2はベクター配列へ
の低い水準の結合を示すことが期待できる。M2プローブ
はATG開始コドンから上流の10塩基と相捕的なヌクレオ
チドを含んでいるので、厳密な条件下ハイブリダイズす
るクローンは10塩基のすべてまたはほとんどおよびそれ
ゆえ完全なHSAコード配列を含んでいることが期待され
るであろう。
に既知の配列に相同的な配列が無いことをみるためスク
リーニングされた。このスクリーニングはハイブリダイ
ゼーションの非特異的部位を減少させるために必要であ
る。この分析に基づくと、プローブM2はベクター配列へ
の低い水準の結合を示すことが期待できる。M2プローブ
はATG開始コドンから上流の10塩基と相捕的なヌクレオ
チドを含んでいるので、厳密な条件下ハイブリダイズす
るクローンは10塩基のすべてまたはほとんどおよびそれ
ゆえ完全なHSAコード配列を含んでいることが期待され
るであろう。
実施例II 配列分析のためのM13mp18へのヒト血清アルブミン cDNAのクローニング 工程１ M13mp18クローニングベクターの調製 M13mp18〔ニユーイングランドバイオラボ（New Engla
nd Biolabs）〕複製型DNA（４μｇ）を50μｌの高塩緩
衝液中37℃にて１時間40単位のEcoRIで完全に消化す
る。消化試料を70℃にて５分間加熱し、酵素を不活性化
する。子ウシ腸アルカリホスフアターゼ（CIAP,1単位）
を添加し、混合物は50℃にて１時間インキユベートす
る。1/10容量の500mM EGAT（pH8）の添加により反応を
終結させる。65℃にて45分間加熱してCIAPを不活性化す
る。反応混合物は等容量のTE−飽和フエノールにて抽出
し、続いてクロロホルム抽出を行う。水相中の線状化し
たM13mp18を３容量の3M酢酸ナトリウムおよび無水エタ
ノール混合物（1:30,V/V）の添加により沈澱せしめる。
混合物は−20℃にて一夜放置する。４℃にて、14,000xg
で15分遠心分離をしてDNAを回収する。ペレツトを真空
乾燥し、100μｌのTEに再溶解する。
nd Biolabs）〕複製型DNA（４μｇ）を50μｌの高塩緩
衝液中37℃にて１時間40単位のEcoRIで完全に消化す
る。消化試料を70℃にて５分間加熱し、酵素を不活性化
する。子ウシ腸アルカリホスフアターゼ（CIAP,1単位）
を添加し、混合物は50℃にて１時間インキユベートす
る。1/10容量の500mM EGAT（pH8）の添加により反応を
終結させる。65℃にて45分間加熱してCIAPを不活性化す
る。反応混合物は等容量のTE−飽和フエノールにて抽出
し、続いてクロロホルム抽出を行う。水相中の線状化し
たM13mp18を３容量の3M酢酸ナトリウムおよび無水エタ
ノール混合物（1:30,V/V）の添加により沈澱せしめる。
混合物は−20℃にて一夜放置する。４℃にて、14,000xg
で15分遠心分離をしてDNAを回収する。ペレツトを真空
乾燥し、100μｌのTEに再溶解する。
工程２ HSA cDNA挿入物の調製およびM13mp18ベクター
との結合 A.高力価プレート溶菌物の調製 抗体に陽性の組換え体フアージおよび実施例Ｉで記載
したオリゴヌクレオチドスクリーニング剤をフアージDN
Aの調製のため増殖させる。塗布用細胞は大腸菌Y1088を
40mlのLBM＋AMP中一夜培養して調製する。3,000xgで15
分間室温にて遠心分離して細胞を採取し、ペレツトは15
−16mlの10mM MgSO4に再懸濁する。寒天栓の形をしたLB
プレートからの個々のプラーク（実施例Ｉに記載したご
とくして調製）を0.1mlの大腸菌を塗布細胞に懸濁す
る。室温にて10分間放置した後、2.5mlのLBMおよび2.5m
lのLB上層寒天を55℃にて添加する。混合物を前もつて
暖めておいた（42℃）LB寒天プレート上に注ぐ。室温に
て約10分後、プレートをさかさにし、42℃にて一夜イン
キユベートする。次の日、3mlのSMをプレートにどつと
注いでフアージ粒子を回収する。１滴のクロロホルムを
添加し、チユーブで渦巻き状にかきまぜる。内容物を4,
000xgで10分間遠心分離して細胞破片を除去する。上澄
み液（高力価溶菌物）を４℃にて貯蔵する。
との結合 A.高力価プレート溶菌物の調製 抗体に陽性の組換え体フアージおよび実施例Ｉで記載
したオリゴヌクレオチドスクリーニング剤をフアージDN
Aの調製のため増殖させる。塗布用細胞は大腸菌Y1088を
40mlのLBM＋AMP中一夜培養して調製する。3,000xgで15
分間室温にて遠心分離して細胞を採取し、ペレツトは15
−16mlの10mM MgSO4に再懸濁する。寒天栓の形をしたLB
プレートからの個々のプラーク（実施例Ｉに記載したご
とくして調製）を0.1mlの大腸菌を塗布細胞に懸濁す
る。室温にて10分間放置した後、2.5mlのLBMおよび2.5m
lのLB上層寒天を55℃にて添加する。混合物を前もつて
暖めておいた（42℃）LB寒天プレート上に注ぐ。室温に
て約10分後、プレートをさかさにし、42℃にて一夜イン
キユベートする。次の日、3mlのSMをプレートにどつと
注いでフアージ粒子を回収する。１滴のクロロホルムを
添加し、チユーブで渦巻き状にかきまぜる。内容物を4,
000xgで10分間遠心分離して細胞破片を除去する。上澄
み液（高力価溶菌物）を４℃にて貯蔵する。
B.高力価溶菌物の力価検定 高力価溶菌物の10-4希釈SM溶液から１μｌおよび10μ
ｌを取り、0.3mlの大腸菌Y1088プレーテイング細胞と混
合する。37℃にて10分間インキユベート後55℃に前もつ
て暖めた3mlのLB上層寒天を加える。混合物をLBプレー
ト上に注ぎ42℃にて一夜インキユベートする。溶菌物ml
当りのプラーク形成単位（pfu）の数を記録する。
ｌを取り、0.3mlの大腸菌Y1088プレーテイング細胞と混
合する。37℃にて10分間インキユベート後55℃に前もつ
て暖めた3mlのLB上層寒天を加える。混合物をLBプレー
ト上に注ぎ42℃にて一夜インキユベートする。溶菌物ml
当りのプラーク形成単位（pfu）の数を記録する。
C.溶菌物塗布法によるフアージDNAの調製 150mmの直径のペトリ皿中6mlの上層アガロースを使用
することを除いて力価検定のため前に記録したごとく約
106pfuを塗布する。塗布細菌の融合性溶菌後フアージを
上層アガロースからSM内へ抽出する。フアージDNAは次
にラムダソープフアージアドソーバント（Lambdasorb P
hage Adsorbant）〔プロメガバイオテツク（Promega Bi
otec）、マジソン、WI〕を用い製造元の示唆に従うと上
澄み液から単離される。
することを除いて力価検定のため前に記録したごとく約
106pfuを塗布する。塗布細菌の融合性溶菌後フアージを
上層アガロースからSM内へ抽出する。フアージDNAは次
にラムダソープフアージアドソーバント（Lambdasorb P
hage Adsorbant）〔プロメガバイオテツク（Promega Bi
otec）、マジソン、WI〕を用い製造元の示唆に従うと上
澄み液から単離される。
D.M13mp18との結合反応 HSA−λgt11組換え体DNA（４−５μｇ）を30μｌの高
塩緩衝液中37℃にて３時間20単位のEcoRIで消化する。
消化後反応混合物をEcoRI−CIAP処理M13mp18とT4リガー
ゼを用いて結合せしめる。典型的結合反応では（最終容
量10μｌ）４−５μｇの全DNAおよび0.8μｇのM13mp18
が1x結合緩衝液（50mMトリス・HCl,pH7.6,10mM MgCl2,1
mM ATP,1mM DTT,5％（W/V）ポリエチレングリコール−8
000）に含まれている。結合反応は１−２単位のT4DNAリ
ガーゼを用い15℃で一夜実施する。
塩緩衝液中37℃にて３時間20単位のEcoRIで消化する。
消化後反応混合物をEcoRI−CIAP処理M13mp18とT4リガー
ゼを用いて結合せしめる。典型的結合反応では（最終容
量10μｌ）４−５μｇの全DNAおよび0.8μｇのM13mp18
が1x結合緩衝液（50mMトリス・HCl,pH7.6,10mM MgCl2,1
mM ATP,1mM DTT,5％（W/V）ポリエチレングリコール−8
000）に含まれている。結合反応は１−２単位のT4DNAリ
ガーゼを用い15℃で一夜実施する。
工程３ 受容性細胞の形質転換 結合混合物の一部（１−５μｌ）を300μｌの大腸菌J
M107受容性細胞〔Mandelら、J.Mol.Biol.53,154（197
0）〕または100μｌの大腸菌DH5∝Ｆ′凍結受容性細胞
（BRL）と混合し、氷上に40分間保つ。DNAの取り込みは
42℃、２分間の熱刺激により誘導する。形質転換細胞を
氷に戻す。200μｌの新しく調製した対数増殖期の大腸
菌JM107、40μｌのＸ−galの２％ジメチルホルムアミド
溶液、100μｌの10mM IPTGおよび3mlのＨ−上層寒天（5
5℃）からなる塗布混合物を添加する。形質転換混合物
をLB寒天プレート上に注ぐ。プレートはプラーク形成の
ため37℃にて終夜インキユベートする。
M107受容性細胞〔Mandelら、J.Mol.Biol.53,154（197
0）〕または100μｌの大腸菌DH5∝Ｆ′凍結受容性細胞
（BRL）と混合し、氷上に40分間保つ。DNAの取り込みは
42℃、２分間の熱刺激により誘導する。形質転換細胞を
氷に戻す。200μｌの新しく調製した対数増殖期の大腸
菌JM107、40μｌのＸ−galの２％ジメチルホルムアミド
溶液、100μｌの10mM IPTGおよび3mlのＨ−上層寒天（5
5℃）からなる塗布混合物を添加する。形質転換混合物
をLB寒天プレート上に注ぐ。プレートはプラーク形成の
ため37℃にて終夜インキユベートする。
工程４ M13ssDNA鋳型の調製とDNA配列分析 組換え体M13フアージを含む無色プラークを取り、1.5
mlの2XYT中37℃にて５−６時間激しく振とうしながら大
腸菌JM107中で増殖せしめる。増殖後、培養物を14,000g
で１分間遠心分離して上澄み液から細胞を分離する。細
胞ペレツトはM13の複製型二重鎖の調製に使用し、一方
上澄み液は単鎖DNA鋳型の分離に使用する。M13dsRFはBi
rnboimおよびDoilyのアルカリ溶菌法〔Nucl.Acids Rese
arch 7;1513（1979）〕を使用して単離される。M13ssDN
A鋳型は培養上澄み液からポリエチレングリコール沈澱
およびフエノール抽出により分離される。簡単に記す
と、1mlの培養上澄み液を200μｌの20％ポリエチレング
リコール−6000を加えた2.5M NaCl溶液に混合する。混
合物を室温にて15分間放置後、14,000xgで５分間遠心分
離するとM13フアージ顆粒が回収される。フアージペレ
ツトを100μｌのTEに再懸濁し、緩衝液−緩和フエノー
ルで抽出する。M13ssDNAを含む水相に３容量の酢酸ナト
リウム−エタノール混合物を混和する。−20℃にて一夜
冷却後、14,000xgで10分間４℃にて遠心分離することに
よりDNA沈澱物が回収される。乾燥DNAを50μｌのTEに溶
解し、その５μｌを配列決定反応に使用する。DNA配列
決定はSangerらによるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
〔Proc.Natl.Acd.Sci.,74:5463（1977）〕により実施さ
れた。HSA13の全配列は表１に示されている。
mlの2XYT中37℃にて５−６時間激しく振とうしながら大
腸菌JM107中で増殖せしめる。増殖後、培養物を14,000g
で１分間遠心分離して上澄み液から細胞を分離する。細
胞ペレツトはM13の複製型二重鎖の調製に使用し、一方
上澄み液は単鎖DNA鋳型の分離に使用する。M13dsRFはBi
rnboimおよびDoilyのアルカリ溶菌法〔Nucl.Acids Rese
arch 7;1513（1979）〕を使用して単離される。M13ssDN
A鋳型は培養上澄み液からポリエチレングリコール沈澱
およびフエノール抽出により分離される。簡単に記す
と、1mlの培養上澄み液を200μｌの20％ポリエチレング
リコール−6000を加えた2.5M NaCl溶液に混合する。混
合物を室温にて15分間放置後、14,000xgで５分間遠心分
離するとM13フアージ顆粒が回収される。フアージペレ
ツトを100μｌのTEに再懸濁し、緩衝液−緩和フエノー
ルで抽出する。M13ssDNAを含む水相に３容量の酢酸ナト
リウム−エタノール混合物を混和する。−20℃にて一夜
冷却後、14,000xgで10分間４℃にて遠心分離することに
よりDNA沈澱物が回収される。乾燥DNAを50μｌのTEに溶
解し、その５μｌを配列決定反応に使用する。DNA配列
決定はSangerらによるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
〔Proc.Natl.Acd.Sci.,74:5463（1977）〕により実施さ
れた。HSA13の全配列は表１に示されている。
実施例III pA0807Nの生成 pA0804プラスミドは大腸菌宿主に含まれた形で米国農
務省の北部地域研究センター、ペオリア、イリノイ、か
ら入手可能である（受付番号NRRL Ｂ−18114）。pA080
4はプラスミドDNAをEcoRIで消化し、その特異的EcoRI部
位で切断された線状pA0804である〜7.5kbフラグメント
を回収するためのゲル電気泳動をつて回収的に単離され
る。プラスミドpA0807NはpA0804,pBR322およびパクテリ
オフアージf1 DNAから出発して下記のごとく構成され
る。
務省の北部地域研究センター、ペオリア、イリノイ、か
ら入手可能である（受付番号NRRL Ｂ−18114）。pA080
4はプラスミドDNAをEcoRIで消化し、その特異的EcoRI部
位で切断された線状pA0804である〜7.5kbフラグメント
を回収するためのゲル電気泳動をつて回収的に単離され
る。プラスミドpA0807NはpA0804,pBR322およびパクテリ
オフアージf1 DNAから出発して下記のごとく構成され
る。
工程１ f1−ori DNAの調製 f1バクテリオフアージDNA（50μｇ）を200μｌのMS緩
衝液中37℃にて４時間50単位のRsaＩおよびDraＩで消化
し、f1複製開始点（ori）を含む〜458bpのDNAフラグメ
ントを放出せしめる。消化混合物を等容量のフエノー
ル：クロロホルム（V/V）混合物で抽出し、続いて水相
を等容量のクロロホルムで抽出する。最後にNaClの濃度
を0.2Mに調整し、2.5容量の無水エタノールを添加して
水相中のDNAを沈澱せしめる。混合物は氷上（４℃）で1
0分間放置し、DNA沈澱物はマイクロフユージ中10,000xg
で４℃にて30分間遠心分離して集める。DNAペレツトは
２度70％水性エタノールで洗浄する。洗浄されたペレツ
トは真空下乾燥し、25μｌのTE緩衝液に溶解する。この
DNAは1.5％アガロースゲル上電気泳動を行い〜458bpのf
1−oriフラグメントを含むゲル部分を切り出し、ゲル中
のDNAは500μｌの5mM EDTA（pH8.0）内へ電気的溶出せ
しめる。DNA溶液は前に記載したごときフエノール：ク
ロロホルム抽出を行い、DNA沈澱は25μｌのTE緩衝液に
溶解する（f1−oriフラグメント）。
衝液中37℃にて４時間50単位のRsaＩおよびDraＩで消化
し、f1複製開始点（ori）を含む〜458bpのDNAフラグメ
ントを放出せしめる。消化混合物を等容量のフエノー
ル：クロロホルム（V/V）混合物で抽出し、続いて水相
を等容量のクロロホルムで抽出する。最後にNaClの濃度
を0.2Mに調整し、2.5容量の無水エタノールを添加して
水相中のDNAを沈澱せしめる。混合物は氷上（４℃）で1
0分間放置し、DNA沈澱物はマイクロフユージ中10,000xg
で４℃にて30分間遠心分離して集める。DNAペレツトは
２度70％水性エタノールで洗浄する。洗浄されたペレツ
トは真空下乾燥し、25μｌのTE緩衝液に溶解する。この
DNAは1.5％アガロースゲル上電気泳動を行い〜458bpのf
1−oriフラグメントを含むゲル部分を切り出し、ゲル中
のDNAは500μｌの5mM EDTA（pH8.0）内へ電気的溶出せ
しめる。DNA溶液は前に記載したごときフエノール：ク
ロロホルム抽出を行い、DNA沈澱は25μｌのTE緩衝液に
溶解する（f1−oriフラグメント）。
工程２ f1−oriのpBR322DraＩ部位へのクローニング pBR322（２μｇ）を20μｌのMS緩衝液中37℃にて10分
間２単位のDraＩで部分消化する。反応は前記工程Ｉに
記載したごとくフエノール：クロロホルム抽出、続いて
のDNA沈澱により終結せしめる。DNAペレツトを20μｌの
TE緩衝液に溶解する。20μｌの結合緩衝液中１単位のT4
DNAリガーゼと14℃にて一夜インキユベートすることに
より、約100ηｇのこのDNAと100ηｇのf1−oriフラグメ
ント（工程１）を結合せしめる。70℃にて10分間加熱し
て結合反応を終結せしめ、pBR322のDraＩ部位（ヌクレ
オチド位置3232および3251）へクローン化されたf1−or
iを含むpBRf1−oriを得るため大腸菌株YMC9（Maniatis
ら）を形質転換するのに使用する。
間２単位のDraＩで部分消化する。反応は前記工程Ｉに
記載したごとくフエノール：クロロホルム抽出、続いて
のDNA沈澱により終結せしめる。DNAペレツトを20μｌの
TE緩衝液に溶解する。20μｌの結合緩衝液中１単位のT4
DNAリガーゼと14℃にて一夜インキユベートすることに
より、約100ηｇのこのDNAと100ηｇのf1−oriフラグメ
ント（工程１）を結合せしめる。70℃にて10分間加熱し
て結合反応を終結せしめ、pBR322のDraＩ部位（ヌクレ
オチド位置3232および3251）へクローン化されたf1−or
iを含むpBRf1−oriを得るため大腸菌株YMC9（Maniatis
ら）を形質転換するのに使用する。
工程３ pA0807の生成 pBRf1−ori（10μｇ）を37℃にて各々10単位のPstＩ
およびNdeＩで４時間消化する。消化されたDNAは前記工
程１で詳述したごとくフエノール：クロロホルム抽出を
行い、沈澱物は25μｌのTE緩衝液に溶解する。この物質
は1.2％アガロースゲル上電気泳動を行い、f1−oriを含
むNdeＩ−PstＩフラグメント（約0.8kb）を単離して前
記工程１で詳述したごとく20μｌのTE緩衝液に溶解す
る。約100ngのこのDNAを前もつてPstＩおよびNdeＩで消
化し、ホスフアターゼ処理をしてある100ngのpA0804と
混合する。この混合物は20μｌの結合緩衝液中１単位の
T4DNAリガーゼと14℃にて一夜インキユベートして結合
せしめる。結合反応は70℃にて10分間加熱することによ
り終結せしめる。このDNAはpA0807を得るため、大腸菌
株YMC9の形質転換に使用される。
およびNdeＩで４時間消化する。消化されたDNAは前記工
程１で詳述したごとくフエノール：クロロホルム抽出を
行い、沈澱物は25μｌのTE緩衝液に溶解する。この物質
は1.2％アガロースゲル上電気泳動を行い、f1−oriを含
むNdeＩ−PstＩフラグメント（約0.8kb）を単離して前
記工程１で詳述したごとく20μｌのTE緩衝液に溶解す
る。約100ngのこのDNAを前もつてPstＩおよびNdeＩで消
化し、ホスフアターゼ処理をしてある100ngのpA0804と
混合する。この混合物は20μｌの結合緩衝液中１単位の
T4DNAリガーゼと14℃にて一夜インキユベートして結合
せしめる。結合反応は70℃にて10分間加熱することによ
り終結せしめる。このDNAはpA0807を得るため、大腸菌
株YMC9の形質転換に使用される。
工程４ pA0807N生成のためのpA0807中の２つのBglII部
位のNotＩ部位への変換 pA0807（10μｇ）を50μｌのHS緩衝液中10単位のBglI
Iで37℃にて４時間消化する。BglII切断DNA（10μｇ）
を50μｌのNT緩衝液中５単位のDNAポリメラーゼのクレ
ノー断片と室温にて30分インキユベートすることにより
BglII付着末端を満たす。この混合物から前記工程１に
記載したごとく、フエノール：クロロホルム抽出し、DN
Aを回収する。DNAペレツトは25μｌのTE緩衝液に溶解す
る。このDNAにニユーイングランドバイオラボから得ら
れた50ng（１μｌ）のリン酸化されたNotＩリンカー（p
GCGGCCGC）、40μｌの5x結合緩衝液、129μｌの水およ
び５単位のT4 DNAリガーゼを混合する。この混合物は1
4℃にて一夜インキユベートする。70℃にて10分加熱し
て結合反応を終結せしめる。続いて結合混合物はHS緩衝
液条件に調整した後10単位のNotＩで消化する。前記工
程１で詳述したごとく、フエノール：クロロホルム抽出
後DNAを沈澱せしめる。沈澱物を50μｌのTE緩衝液に溶
解し、0.9％アガロースゲル上電気泳動する。DNAフラグ
メント（より下のバンドはpBR322部分およびf1−oriを
含有するフラグメントの移動位置に対応し、より上のバ
ンドはpA0807の残つた部分に対応する、即ち５′AOX1，
３′AOX1およびHIS4）を前記工程１に記載したプロトコ
ールを用いてゲルから単離する。ゲル精製DNAフラグメ
ントを10μｌのTE緩衝液に溶解する。線状部位特異的組
込みベクターを表わすDNAフラグメントは200μｌのホス
フアターゼ緩衝液中37℃にて２単位のCIAPと30分間イン
キユベートしてリン酸エステルを加水分解する。加水分
解されたDNAは工程１に記載したごとく、フエノール：
クロロホルム抽出し、沈澱せしめる。このDNAをpA0807
プラスミドの残り（前記参照）を表わすより上のバンド
のDNAと混合し、30μｌの結合緩衝液中５単位のT4DNAリ
ガーゼと４℃にて一夜結合反応を実施する。結合混合物
は70℃にて10分間加熱後氷上で冷却し、pA0807Nを得る
ためその10μｌを大腸菌YMC9の形質転換に使用する。pA
0807Nの構造は図３に示してある。
位のNotＩ部位への変換 pA0807（10μｇ）を50μｌのHS緩衝液中10単位のBglI
Iで37℃にて４時間消化する。BglII切断DNA（10μｇ）
を50μｌのNT緩衝液中５単位のDNAポリメラーゼのクレ
ノー断片と室温にて30分インキユベートすることにより
BglII付着末端を満たす。この混合物から前記工程１に
記載したごとく、フエノール：クロロホルム抽出し、DN
Aを回収する。DNAペレツトは25μｌのTE緩衝液に溶解す
る。このDNAにニユーイングランドバイオラボから得ら
れた50ng（１μｌ）のリン酸化されたNotＩリンカー（p
GCGGCCGC）、40μｌの5x結合緩衝液、129μｌの水およ
び５単位のT4 DNAリガーゼを混合する。この混合物は1
4℃にて一夜インキユベートする。70℃にて10分加熱し
て結合反応を終結せしめる。続いて結合混合物はHS緩衝
液条件に調整した後10単位のNotＩで消化する。前記工
程１で詳述したごとく、フエノール：クロロホルム抽出
後DNAを沈澱せしめる。沈澱物を50μｌのTE緩衝液に溶
解し、0.9％アガロースゲル上電気泳動する。DNAフラグ
メント（より下のバンドはpBR322部分およびf1−oriを
含有するフラグメントの移動位置に対応し、より上のバ
ンドはpA0807の残つた部分に対応する、即ち５′AOX1，
３′AOX1およびHIS4）を前記工程１に記載したプロトコ
ールを用いてゲルから単離する。ゲル精製DNAフラグメ
ントを10μｌのTE緩衝液に溶解する。線状部位特異的組
込みベクターを表わすDNAフラグメントは200μｌのホス
フアターゼ緩衝液中37℃にて２単位のCIAPと30分間イン
キユベートしてリン酸エステルを加水分解する。加水分
解されたDNAは工程１に記載したごとく、フエノール：
クロロホルム抽出し、沈澱せしめる。このDNAをpA0807
プラスミドの残り（前記参照）を表わすより上のバンド
のDNAと混合し、30μｌの結合緩衝液中５単位のT4DNAリ
ガーゼと４℃にて一夜結合反応を実施する。結合混合物
は70℃にて10分間加熱後氷上で冷却し、pA0807Nを得る
ためその10μｌを大腸菌YMC9の形質転換に使用する。pA
0807Nの構造は図３に示してある。
実施例IVピキア パストリス （Pichia pastoris）HSA発現ベクタ
ーの構成 工程１ HSAフラグメントの回収 約2.0kbに対応するHSA遺伝子はmp18−HSA13複製型DNA
（実施例IIを参照されたい）のEcoRI消化により放出さ
れる。約１μｇのプラスミドmp18−HSA13を20μｌのHS
緩衝液中37℃にて２時間５単位のEcoRIで消化する。50
μｌのH2Oを希釈する事により反応を終結せしめ、実施
例IIIの工程１に詳述したごとく、直ちにフエノール：
クロロホルムでの抽出、および沈澱化を行う。DNA沈澱
物は10μｌの水に溶解し、後での使用のため−20℃で貯
蔵する。ピキア パストリス（Pichia pastoris）HSA発現
プラスミドpHSA13およびpHSA113を得るため、ベクターp
THFKΔおよびpA0807NのEcoRI部位へHSA遺伝子を挿入す
る。
ーの構成 工程１ HSAフラグメントの回収 約2.0kbに対応するHSA遺伝子はmp18−HSA13複製型DNA
（実施例IIを参照されたい）のEcoRI消化により放出さ
れる。約１μｇのプラスミドmp18−HSA13を20μｌのHS
緩衝液中37℃にて２時間５単位のEcoRIで消化する。50
μｌのH2Oを希釈する事により反応を終結せしめ、実施
例IIIの工程１に詳述したごとく、直ちにフエノール：
クロロホルムでの抽出、および沈澱化を行う。DNA沈澱
物は10μｌの水に溶解し、後での使用のため−20℃で貯
蔵する。ピキア パストリス（Pichia pastoris）HSA発現
プラスミドpHSA13およびpHSA113を得るため、ベクターp
THFKΔおよびpA0807NのEcoRI部位へHSA遺伝子を挿入す
る。
工程２ HSA遺伝子の挿入のためのベクター操作 各々約10μｇのpTHFKΔ（図４）およびpA0807Nを100
μｌのHS緩衝液中37℃にて16時間10単位のEcoRIで消化
する。反応混合物をアルカリホスフアターゼ緩衝液条件
に調整し、200μｌの反応液容量中37℃にて30分間10単
位のCIAPで処理する。実施例IIIの工程１に詳述したご
とくホスフアターゼ処理をフエノール：クロロホルム抽
出により終結せしめ、DNAを沈澱化させた後100μg/mlの
最終濃度でTE緩衝液に溶解する。
μｌのHS緩衝液中37℃にて16時間10単位のEcoRIで消化
する。反応混合物をアルカリホスフアターゼ緩衝液条件
に調整し、200μｌの反応液容量中37℃にて30分間10単
位のCIAPで処理する。実施例IIIの工程１に詳述したご
とくホスフアターゼ処理をフエノール：クロロホルム抽
出により終結せしめ、DNAを沈澱化させた後100μg/mlの
最終濃度でTE緩衝液に溶解する。
工程３ HSA遺伝子の発現ベクターへの挿入 各々100ngのEcoRI切断、CIAP処理ベクターpTHFKΔお
よびpA0807N（実施例IV、工程２）を各々100ngのEcoRI
消化mp18−HSA13（実施例IV、工程１）と20μｌの結合
緩衝液中で混合し、４℃にて16時間２単位のT4DNAリガ
ーゼで結合せしめる。70℃にて10分間加熱して結合反応
を終結せしめ、プラスミドpHSA13およびpHSA113を得る
ための大腸菌株DG75′の形質転換に使用する。
よびpA0807N（実施例IV、工程２）を各々100ngのEcoRI
消化mp18−HSA13（実施例IV、工程１）と20μｌの結合
緩衝液中で混合し、４℃にて16時間２単位のT4DNAリガ
ーゼで結合せしめる。70℃にて10分間加熱して結合反応
を終結せしめ、プラスミドpHSA13およびpHSA113を得る
ための大腸菌株DG75′の形質転換に使用する。
実施例Ｖ pHSA113およびpHSA13によるピキア パストリス（Pichia p
astoris）の形質転換 工程１ pHSA113ベクターの調製 20μｇのpHASA113を200μｌのHS緩衝液中37℃にて18
時間50単位のNotＩで消化する。約20μｌのこの混合物
をピキア パストリス（Pichia pastoris）GS115（his
4）（米国農務省の北部地区研究センターに受付番号NRR
L Y−15851として供託されている）の形質転換に直接使
用する。残りの約180μｌのNotＩ切断pHSA113は実施例I
IIの工程１に詳述したごとく、フエノール：クロロホル
ム抽出および沈澱化を行う。DNA沈澱物は20μｌのCaS溶
液に溶解し、GS115の形質転換にも使用される。NotＩ切
断pHSA113はピキア（Pichia）座位に組込める。pHSA113
からのNotＩフラグメントもまたピキア（Pichia）のヒ
スチジノールデヒドロゲナーゼの遺伝子を運んでいるの
で得られる形質転換体は直ちにHis+表現型に基づいて容
易に選択できる。
astoris）の形質転換 工程１ pHSA113ベクターの調製 20μｇのpHASA113を200μｌのHS緩衝液中37℃にて18
時間50単位のNotＩで消化する。約20μｌのこの混合物
をピキア パストリス（Pichia pastoris）GS115（his
4）（米国農務省の北部地区研究センターに受付番号NRR
L Y−15851として供託されている）の形質転換に直接使
用する。残りの約180μｌのNotＩ切断pHSA113は実施例I
IIの工程１に詳述したごとく、フエノール：クロロホル
ム抽出および沈澱化を行う。DNA沈澱物は20μｌのCaS溶
液に溶解し、GS115の形質転換にも使用される。NotＩ切
断pHSA113はピキア（Pichia）座位に組込める。pHSA113
からのNotＩフラグメントもまたピキア（Pichia）のヒ
スチジノールデヒドロゲナーゼの遺伝子を運んでいるの
で得られる形質転換体は直ちにHis+表現型に基づいて容
易に選択できる。
ピキア（Pichia）株KM71（his4,aox1:ARG4）を10μｇ
のpHSA13でHis+のため形質転換する。HIS4に加えてこの
プラスミドは自律性複製配列ARS1を運んでいる。それは
ピキア（Pichia）内で自律性様式で複製できる。そのよ
うな形質転換体は“自律性形質転換体”と称されてい
る。この株を用いる理由は、KM71ではARG4によりAOX1が
破壊さて“メタノールに鈍く”なるためおよびメタノー
ルに対して正常株GS115に比べIacＺがAox１プロモータ
ーの制御下に置かれている場合はβ−ガラクトシダーゼ
を高水準で発現することが示されているためである。負
の対照としてKM71もまたpYJ30で形質転換され（NRRLB−
15890）、プラスミドはまたHis4を含んでいる。
のpHSA13でHis+のため形質転換する。HIS4に加えてこの
プラスミドは自律性複製配列ARS1を運んでいる。それは
ピキア（Pichia）内で自律性様式で複製できる。そのよ
うな形質転換体は“自律性形質転換体”と称されてい
る。この株を用いる理由は、KM71ではARG4によりAOX1が
破壊さて“メタノールに鈍く”なるためおよびメタノー
ルに対して正常株GS115に比べIacＺがAox１プロモータ
ーの制御下に置かれている場合はβ−ガラクトシダーゼ
を高水準で発現することが示されているためである。負
の対照としてKM71もまたpYJ30で形質転換され（NRRLB−
15890）、プラスミドはまたHis4を含んでいる。
工程２ 細胞増殖 ピキア パストリス（Pichia pastoris） GS115（NRRLY−15851）を約10mlのYPD培地に接種し、
30℃にて12−20時間振とう培養する。100mlのYPDに種培
養物を接種するとOD600は約0.001を与える。培地を振と
うフラスコ中30℃にて約12−20時間培養する。OD600が
約0.2−0.3（約16−20時間後）に達した時、ソーバル
（Sorvall）RC5Cを用い、1500gにて５分間遠心分離して
培養物を採取する。
30℃にて12−20時間振とう培養する。100mlのYPDに種培
養物を接種するとOD600は約0.001を与える。培地を振と
うフラスコ中30℃にて約12−20時間培養する。OD600が
約0.2−0.3（約16−20時間後）に達した時、ソーバル
（Sorvall）RC5Cを用い、1500gにて５分間遠心分離して
培養物を採取する。
工程３ スフエロプラストの調製 細胞を１度10mlの無菌水で洗浄した後1500gで５分間
遠心分離する（特にことわらない限り各細胞洗浄後ソー
バル RT6000Bを用い1500gで５分間遠心分離を行う）。次
に細胞を１度10mlの新しく調製したSED、１度10mlの無
菌1Mソルビトール溶液で洗浄し、最後に10mlのSCE緩衝
液に再懸濁する。7.5μｌの3mg/mlチモリアーゼ〔100,0
00単位/g、マイルズラボラトリー（Milles Laboratorie
s）から入手〕溶液を細胞溶液に添加する。細胞を30℃
にて約10分間インキユベートする。（OD600の60％の減
少が正確な時間および濃度のマーカーとして利用でき
る）。スフエロプラストを１度10mlの無菌1Mソルビトー
ル溶液で洗浄し、700gで５−10分遠心分離する。（遠心
分離の時間および速度は変更してもよい；スフエロプラ
ストをペレツト化するのに十分な程度遠心分離し、やり
過ぎるとその力で破壊される）。最終的な細胞洗浄を10
mlの無菌CaSで行い、細胞を再び700gで５−10分遠心分
離し0.6mlのCaSに再懸濁する。
遠心分離する（特にことわらない限り各細胞洗浄後ソー
バル RT6000Bを用い1500gで５分間遠心分離を行う）。次
に細胞を１度10mlの新しく調製したSED、１度10mlの無
菌1Mソルビトール溶液で洗浄し、最後に10mlのSCE緩衝
液に再懸濁する。7.5μｌの3mg/mlチモリアーゼ〔100,0
00単位/g、マイルズラボラトリー（Milles Laboratorie
s）から入手〕溶液を細胞溶液に添加する。細胞を30℃
にて約10分間インキユベートする。（OD600の60％の減
少が正確な時間および濃度のマーカーとして利用でき
る）。スフエロプラストを１度10mlの無菌1Mソルビトー
ル溶液で洗浄し、700gで５−10分遠心分離する。（遠心
分離の時間および速度は変更してもよい；スフエロプラ
ストをペレツト化するのに十分な程度遠心分離し、やり
過ぎるとその力で破壊される）。最終的な細胞洗浄を10
mlの無菌CaSで行い、細胞を再び700gで５−10分遠心分
離し0.6mlのCaSに再懸濁する。
工程４ 形質転換 Sreekrishnaらのスフエロプラスト形質転換技術、Gen
e59,115−125（1987）、を用い10μｇの線状HSAベクタ
ーでGS115細胞を形質転換する。12×75mm無菌ポリプロ
ピレンチユーブにDNA試料を添加する（20μｌの容量ま
で）。（DNAはTE緩衝液のごとき適した緩衝液に溶解し
ていなければならない）。各々のDNA試料に100μｌのス
フエロプラストを添加し、室温にて約20分インキユベー
トする。各々の試料に1mlのPEG溶液を加え、室温にて約
15分インキユベートした後700gで５−10分間遠心分離す
る。ペレツトにSOS（150μｌ）を加え室温で30分インキ
ユベートする。最後に850μｌの1Mソルビトールを添加
する。
e59,115−125（1987）、を用い10μｇの線状HSAベクタ
ーでGS115細胞を形質転換する。12×75mm無菌ポリプロ
ピレンチユーブにDNA試料を添加する（20μｌの容量ま
で）。（DNAはTE緩衝液のごとき適した緩衝液に溶解し
ていなければならない）。各々のDNA試料に100μｌのス
フエロプラストを添加し、室温にて約20分インキユベー
トする。各々の試料に1mlのPEG溶液を加え、室温にて約
15分インキユベートした後700gで５−10分間遠心分離す
る。ペレツトにSOS（150μｌ）を加え室温で30分インキ
ユベートする。最後に850μｌの1Mソルビトールを添加
する。
工程５ スフエロプラストの再生 20mlの再生寒天SDRの底寒天層を形質転換試料が準備
できる少くとも30分前にプレートに注ぐ。さらにSOS中
に形質転換試料がある期間に45℃浴中の15mlの円錐形の
底を持つコーニングチユーブに再生寒天を8mlづつ移
す。45℃に保たれた溶融再生寒天8mlに50,250または800
μｌの形質転換試料を添加し、固体20ml底寒天層を含む
プレート上に注ぐ。プレートを30℃にて３−５日間イン
キユベートする。
できる少くとも30分前にプレートに注ぐ。さらにSOS中
に形質転換試料がある期間に45℃浴中の15mlの円錐形の
底を持つコーニングチユーブに再生寒天を8mlづつ移
す。45℃に保たれた溶融再生寒天8mlに50,250または800
μｌの形質転換試料を添加し、固体20ml底寒天層を含む
プレート上に注ぐ。プレートを30℃にて３−５日間イン
キユベートする。
工程６ 形質転換体の選択 形質転換体はヒスチジンを欠く培地、SDR上で培養し
て選択する。ヒスチジン無しでも増殖する培養物は更に
“メタノールに鈍い”表現型でスクリーニングする（部
位選択的組込みを示す）。両方の表現型の証拠を示す形
質転換体GS115細胞を培養し、HSAの産生を検定する。
て選択する。ヒスチジン無しでも増殖する培養物は更に
“メタノールに鈍い”表現型でスクリーニングする（部
位選択的組込みを示す）。両方の表現型の証拠を示す形
質転換体GS115細胞を培養し、HSAの産生を検定する。
実施例VI GS115/pHSA13 自律性形質転換体のメタノール誘導発現 プラスミドpHSA13で形質転換したKM71株および負の対
照のpYJ30形質転換体KM71を10mlのMGY培地で600nmでの
光学密度が800になるまで増殖せしめ、その後MM培地に
移す。MM上で３日間インキユベートした後遠心分離によ
り細胞を採取し、培地上澄み液を1mMフエニルメチルス
ルホニルフルオリド（PMSF）に調整し、HSA分析のため
に凍結保存する（上澄み液Ｍ）。細胞は1mMPMSFを含む5
00μｌの切断緩衝液に懸濁し、氷上で断続的に総計で４
分間ガラスビーズと伴に激しく渦巻状に攪拌する。続い
て試料はマイクロフージ中10,000xgで10分間４℃にて遠
心分離するとペレツトから透明な上澄み液が分離され、
上澄み液Ｉと称する。ペレツトを6M尿素を含む500μｌ
の切断緩衝液で抽出し、この抽出液を上澄み液IIと称す
る。定量的HSA−ELISAだけでなくMethods in Enzymolog
y;152巻、（1987）“モレキユラークローニング技術へ
の手引き”に記載されているごときPAGEイムノブロツト
法により種々の上澄み液のHSAを分析する。この目的の
ために開発したHSA−ELISA法を実施例VIIIに示した。HS
A−ELISAにより決定されたごとく上澄み液Ｉが他の分画
に比べて最も高い水準でHSAを含んでいた（表３）（PAG
E−エレクトロイムノブロツテイングによる算定でもHSA
は主として溶解分画に存在していた）。
照のpYJ30形質転換体KM71を10mlのMGY培地で600nmでの
光学密度が800になるまで増殖せしめ、その後MM培地に
移す。MM上で３日間インキユベートした後遠心分離によ
り細胞を採取し、培地上澄み液を1mMフエニルメチルス
ルホニルフルオリド（PMSF）に調整し、HSA分析のため
に凍結保存する（上澄み液Ｍ）。細胞は1mMPMSFを含む5
00μｌの切断緩衝液に懸濁し、氷上で断続的に総計で４
分間ガラスビーズと伴に激しく渦巻状に攪拌する。続い
て試料はマイクロフージ中10,000xgで10分間４℃にて遠
心分離するとペレツトから透明な上澄み液が分離され、
上澄み液Ｉと称する。ペレツトを6M尿素を含む500μｌ
の切断緩衝液で抽出し、この抽出液を上澄み液IIと称す
る。定量的HSA−ELISAだけでなくMethods in Enzymolog
y;152巻、（1987）“モレキユラークローニング技術へ
の手引き”に記載されているごときPAGEイムノブロツト
法により種々の上澄み液のHSAを分析する。この目的の
ために開発したHSA−ELISA法を実施例VIIIに示した。HS
A−ELISAにより決定されたごとく上澄み液Ｉが他の分画
に比べて最も高い水準でHSAを含んでいた（表３）（PAG
E−エレクトロイムノブロツテイングによる算定でもHSA
は主として溶解分画に存在していた）。
実施例VII GS115/pHSA113 組込み形質転換体におけるHSAのメタノ
ール制御発現 NotＩ切断pHSA113を用いて得られた数千のGS115His+
形質転換体をプールしておき、その一部を10mlのMGYに
接種し、飽和するまで増殖せしめる。この時点で細胞を
MMに移し、振とう機上30℃にてインキユベートする。MM
上にして２日後細胞を採取し実施例VIで記載したごとく
上澄み液Ｉを調製しHSA発現を分析する。HSA発現率は可
溶性タンパク質の〜0.1％であつた。
ール制御発現 NotＩ切断pHSA113を用いて得られた数千のGS115His+
形質転換体をプールしておき、その一部を10mlのMGYに
接種し、飽和するまで増殖せしめる。この時点で細胞を
MMに移し、振とう機上30℃にてインキユベートする。MM
上にして２日後細胞を採取し実施例VIで記載したごとく
上澄み液Ｉを調製しHSA発現を分析する。HSA発現率は可
溶性タンパク質の〜0.1％であつた。
MDプレート上のレプリカ平板コロニーをMMプレート上
へ複製することによりHis+形質転換体プールをまたスク
リーニングする。いくつかのHis+−メタノールに対して
鈍い形質転換体がMGY上で増殖し、MMへ移された。実施
例VIに記載したごとく細胞抽出物を調製しHSA発現率を
分析した。HSAの水準は20mg/lまたは全可溶性細胞タン
パク質の２％まで上昇している事が検出された。
へ複製することによりHis+形質転換体プールをまたスク
リーニングする。いくつかのHis+−メタノールに対して
鈍い形質転換体がMGY上で増殖し、MMへ移された。実施
例VIに記載したごとく細胞抽出物を調製しHSA発現率を
分析した。HSAの水準は20mg/lまたは全可溶性細胞タン
パク質の２％まで上昇している事が検出された。
実施例VIIIHSA ELISA Na2CO3／NaHCO3緩衝液（pH9.5）に溶解した50μｌの
1:500ヤギー抗−HSA抗体を90穴ELISAプレート（コーニ
ング）の穴に置き37℃にて１時間インキユベートする。
２度TBST、２度dH2Oで洗浄し、各々に200μｌのブロツ
ト緩衝液を添加し、その後37℃にて一夜インキユベート
する。インキユベーシヨン後、再びTBSTで３度、dH2Oで
２度洗浄し、各々に50μｌの試料を加える（保存HSA溶
液＝５×107ng/ml;標準溶液＝２〜14ng/ml）。試料は室
温にて２時間回転し、その後TBSTで５度、dH2Oで２度洗
浄し、50μｌの1:2000希釈の西洋ワサビペルオキシダー
ゼ−結合ヤギ抗−HSA抗体〔クーパーバイオメデカル社
（Cooper Biomedical,Inc.）〕のブロツト緩衝液溶液
（５μm/10ml）を添加する。プレートを再び室温で１時
間振とうした後TBSTで３度、dH2Oで３度洗浄し、100μ
ｌのABTS（ABTS ペルオキシダーゼ基質溶液、キルケガ
ードアンドペリーラボラトリー社）を室温に暖めて添加
する。最後に、室温で試料を20分間振とうし、反応を停
止するために各々に100μｌの２％シユウ酸を添加し、4
05nmの吸光度を記録する。
1:500ヤギー抗−HSA抗体を90穴ELISAプレート（コーニ
ング）の穴に置き37℃にて１時間インキユベートする。
２度TBST、２度dH2Oで洗浄し、各々に200μｌのブロツ
ト緩衝液を添加し、その後37℃にて一夜インキユベート
する。インキユベーシヨン後、再びTBSTで３度、dH2Oで
２度洗浄し、各々に50μｌの試料を加える（保存HSA溶
液＝５×107ng/ml;標準溶液＝２〜14ng/ml）。試料は室
温にて２時間回転し、その後TBSTで５度、dH2Oで２度洗
浄し、50μｌの1:2000希釈の西洋ワサビペルオキシダー
ゼ−結合ヤギ抗−HSA抗体〔クーパーバイオメデカル社
（Cooper Biomedical,Inc.）〕のブロツト緩衝液溶液
（５μm/10ml）を添加する。プレートを再び室温で１時
間振とうした後TBSTで３度、dH2Oで３度洗浄し、100μ
ｌのABTS（ABTS ペルオキシダーゼ基質溶液、キルケガ
ードアンドペリーラボラトリー社）を室温に暖めて添加
する。最後に、室温で試料を20分間振とうし、反応を停
止するために各々に100μｌの２％シユウ酸を添加し、4
05nmの吸光度を記録する。
【図面の簡単な説明】 第１図は、プラスミドpA0804の図解である。 第２図（ａ）はpA0804の直線地図を提供している。 第２図（ｂ）は約458塩基対のf1−oriを含むpA0804の誘
導体pA0807の直線地図を提供している。 第２図（ｃ）はpA0807のBglII部位の代わりにNotＩ部位
を持つpA0807Nの直線地図を提示している。 第２図（ｄ）は特異的EcoRI部位にHSA遺伝子が挿入され
たpA0807Nの直線地図であるpHSA113の直線地図を提供し
ている。 第３図はpA0807Nを円形型で示している。 第４図はNRRLB−18115の自律性酵母プラスミドDNAのEco
RI消化、ゲル電気泳動および6.2kbEcoRIフラグメント固
収によるプラスミドpTHFKΔを示している。 第５図はpTHFKΔの特異的EcoRI部位に挿入されたHSA遺
伝子を含むpTHFKΔの誘導体であるpHSA13を示してい
る。
導体pA0807の直線地図を提供している。 第２図（ｃ）はpA0807のBglII部位の代わりにNotＩ部位
を持つpA0807Nの直線地図を提示している。 第２図（ｄ）は特異的EcoRI部位にHSA遺伝子が挿入され
たpA0807Nの直線地図であるpHSA113の直線地図を提供し
ている。 第３図はpA0807Nを円形型で示している。 第４図はNRRLB−18115の自律性酵母プラスミドDNAのEco
RI消化、ゲル電気泳動および6.2kbEcoRIフラグメント固
収によるプラスミドpTHFKΔを示している。 第５図はpTHFKΔの特異的EcoRI部位に挿入されたHSA遺
伝子を含むpTHFKΔの誘導体であるpHSA13を示してい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 リッキー・ノック―シュン・ウォング アメリカ合衆国テキサス州プラノ，スプ リング・クリーク・パークウェイ・ユニ ット 1805 (72)発明者 モトヒロ・フケ アメリカ合衆国オクラホマ州タルサ，イ ースト・ワンハンドレッドアンドサー ド・ストリート 4522 (72)発明者 フランセス・マリア・デイビス アメリカ合衆国テキサス州 ヒュースト ン，ステラ・リンク 10301 (72)発明者 ウィリアム・リチャード・マコンビー アメリカ合衆国オクラホマ州バートルズ ヴィル，キングス・ドライブ 1561，ナ ンバー 1217 (72)発明者 カレン・マリー・バインヤード アメリカ合衆国オクラホア州バートルズ ヴィル，クレッセント・ドライブ 1715 (72)発明者 ロバート・ディーン・バー アメリカ合衆国オクラホマ州バートルズ ヴィル，マルベリー・レーン・ 121 (72)発明者 キャサリン・アン・パーカー アメリカ合衆国オクラホマ州バートルズ ヴィル，サウス・ディウェイ 2025 (72)発明者 コティカニアダナム・スリークリシュナ アメリカ合衆国オクラホマ州バートルズ ヴィル，ローリング・メドウズ・コート 1060 (56)参考文献 特開 昭63−74493（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−190085（ＪＰ，Ａ)
Claims (25)
- 【請求項１】（ａ）ピキア（Pichia）属のC1資化性酵母
中で複製可能な自律性複製配列；および （ｂ）ピキア（Pichia）属に適合性の制御領域および
３′終止配列に作動可能なごとく結合された、リーダー
配列を有するHSAの構造遺伝子を含む少なくとも１つの
発現カセット； を含むベクター。 - 【請求項２】制御領域がピキア・パストリス（Pichia
pastoris）から単離されたAOX1、p40、DHASおよびHIS
4；サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae）から単離された酸性ホスファターゼ、ガラクト
シダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロム
Ｃ、アルファー交配因子およびグリセルアルデヒド３−
リン酸デヒドロゲナーゼから成る群より選択されるもの
に由来し、且つ、３′終止配列がピキア・パストリス
（Pichia pastoris）由来のAOX1、p40、DHASおよびHIS
4から単離された３′終止配列からなる群より選択され
るものである、特許請求の範囲第１項記載のベクター。 - 【請求項３】さらに、ピキア・パストリス（Pichia pa
storis）から単離されたHIS4およびARG4；サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から単
離されたSUC2およびTn903およびTn601のG418R遺伝子か
らなる群より選択されるマーカー遺伝子を含む、特許請
求の範囲第１または第２項記載のベクター。 - 【請求項４】リーダー配列を有するHSA構造遺伝子を含
むDNA;該HSA構造遺伝子DNAの５′上流に連結したピキア
・パストリス（Pichia pastoris）のAOX1由来の制御領
域をコードするDNAおよび３′下流に連結したピキア・
パストリス（Pichia pastoris）のAOX1由来の３′終止
配列をコードするDNA;ピキア・パストリス（Pichia pa
storis）から単離されたマーカー遺伝子HIS4を含むDNA;
ピキア（Pichia）属の自律性複製配列（PARS）をコード
するDNA;および、大腸菌内で複製可能なプラスミド由来
の複製開始領域（ori）を含むDNA;からなる約8.2kbのDN
Aからなる、図５の制限酵素切断地図により示されるベ
クターpHSA13。 - 【請求項５】下記の連続的配置： （ａ）第１の挿入可能なDNAフラグメント； （ｂ）ピキア（Pichia）属に適合性の制御領域および
３′終止配列と作動可能なごとく結合した、リーダー配
列を有するHSAの構造遺伝子を含む少なくとも１つの発
現カセット；および （ｃ）第２の挿入可能なDNAフラグメント； を有する、線状組込み部位−特異的ベクター。 - 【請求項６】第１の挿入可能なDNAフラグメントおよび
第２の挿入可能なDNAフラグメントがピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）から単離された遺伝子のDNA配
列に由来し、かつ、AOX1、p40、DHASおよびHIS4から成
る群より選択される、特許請求の範囲第５項記載のベク
ター。 - 【請求項７】制御領域がピキア・パストリス（Pichia
pastoris）から単離されたAOX1、p40、DHASおよびHIS
4；サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae）から単離された酸性ホスファターゼ、ガラクト
シダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、チトクロム
Ｃ、アルファー交配因子およびグリセルアルデヒド３−
リン酸デヒドロゲナーゼから成る群より選択されるもの
に由来し、且つ、３′終止配列がピキア・パストリス
（Pichia pastoris）由来のAOX1、p40、DHASおよびHIS
4から単離された３′終止配列からなる群より選択され
るものである、特許請求の範囲第５または６項記載のベ
クター。 - 【請求項８】さらに、ピキア・パストリス（Pichia pa
storis）から単離されたHIS4およびARG4；サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から単
離されたSUC2、およびTn903およびTn601のG418R遺伝子
からなる群より選択されるマーカー遺伝子を、成分
（ａ）と（ｂ）の間または（ｂ）と（ｃ）の間に含む、
特許請求の範囲第５項ないし第７項のいずれか１項に記
載のベクター。 - 【請求項９】（ａ）ピキア・パストリス（Pichia past
oris）から単離された約１キロベースの５′AOX1制御領
域からなる、下記成分（ｂ）に作動可能なごとく結合さ
れている第１の挿入可能なDNAフラグメント； （ｂ）下記成分（ｃ）に作動可能なごとく結合されてい
る、リーダー配列を有するHSAの構造遺伝子； （ｃ）下記成分（ｄ）に結合されている、ピキア・パス
トリス（Pichia pastoris）から単離されたAOX1の３′
終止配列； （ｄ）下記成分（ｅ）に結合されている、ピキア・パス
トリス（Pichia pastoris）から単離されたHIS4である
少なくとも１つのマーカー遺伝子；および （ｅ）約0.65キロベースの３′AOX1終止配列である第２
の挿入可能なフラグメント； を含む、線状組込み部位−特異的ベクター。 - 【請求項１０】（ｉ）特許請求の範囲第１項記載のベク
ター少なくとも１つでピキア（Pichia）属のC1資化性酵
母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１１】（ｉ）特許請求の範囲第２項記載のベク
ター少なくとも１つでピキア（Pichia）属のC1資化性酵
母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１２】（ｉ）特許請求の範囲第３項記載のベク
ター少なくとも１つでピキア（Pichia）属のC1資化性酵
母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１３】（ｉ）特許請求の範囲第１項記載のベク
ター少なくとも１つでピキア（Pichia）属のC1資化性酵
母を形質転換するが、但し、ベクターの制御領域がピキ
ア・パストリス（Pichia pastoris）から単離されたAO
X1制御領域であり、３′終止配列がピキア・パストリス
（Pichia pastoris）由来のAOX1の３′終止配列であ
り、且つ、自律性複製配列が約0.19キロベースの長さで
あり、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１４】（ｉ）特許請求の範囲第３項記載のベク
ター少なくとも１つでピキア（Pichia）属のC1資化性酵
母を形質転換するが、但し、ベクターのマーカー遺伝子
がHIS4遺伝子であり、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１５】（ｉ）特許請求の範囲第５項記載の線状
組込み部位−特異的ベクター少なくとも１つでピキア
（Pichia）属のC1資化性酵母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１６】（ｉ）特許請求の範囲第６項記載の線状
組込み部位−特異的ベクター少なくとも１つでピキア
（Pichia）属のC1資化性酵母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１７】（ｉ）特許請求の範囲第７項記載の線状
組込み部位−特異的ベクター少なくとも１つでピキア
（Pichia）属のC1資化性酵母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１８】（ｉ）特許請求の範囲第８項記載の線状
組込み部位−特異的ベクター少なくとも１つでピキア
（Pichia）属のC1資化性酵母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項１９】（ｉ）特許請求の範囲第９項記載の線状
組込み部位−特異的ベクター少なくとも１つでピキア
（Pichia）属のC1資化性酵母を形質転換し、そして （ii）得られた形質転換体酵母を適切な条件下で培養し
てHSAタンパク質の生成物を得る； 工程からなる、HSAの生産方法。 - 【請求項２０】特許請求の範囲第１項記載のベクター少
なくとも１つで形質転換されている、ピキア（Pichia）
属のC1資化性酵母。 - 【請求項２１】酵母がピキア・パストリス（Pichia pa
storis）である、特許請求の範囲第20項記載のC1資化性
酵母。 - 【請求項２２】酵母がピキア・パストリス（Pichia pa
storis）株GS115である、特許請求の範囲第20項記載のC
1資化性酵母。 - 【請求項２３】特許請求の範囲第５項記載のベクター少
なくとも１つで形質転換されている、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）GS115株。 - 【請求項２４】特許請求の範囲第８項記載のベクター少
なくとも１つで形質転換されている、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）GS115株。 - 【請求項２５】特許請求の範囲第９項記載のベクター少
なくとも１つで形質転換されている、ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）GS115株。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18642088A | 1988-04-25 | 1988-04-25 | |
| US186420 | 1988-04-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02104290A JPH02104290A (ja) | 1990-04-17 |
| JP2580036B2 true JP2580036B2 (ja) | 1997-02-12 |
Family
ID=22684887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1105730A Expired - Lifetime JP2580036B2 (ja) | 1988-04-25 | 1989-04-25 | メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0771871A3 (ja) |
| JP (1) | JP2580036B2 (ja) |
| KR (1) | KR970002914B1 (ja) |
| AT (1) | ATE159297T1 (ja) |
| AU (1) | AU605691B2 (ja) |
| CA (1) | CA1328838C (ja) |
| DE (1) | DE68928380T2 (ja) |
| DK (1) | DK175792B1 (ja) |
| ES (1) | ES2108681T3 (ja) |
| GR (1) | GR3025382T3 (ja) |
| IE (2) | IE81153B1 (ja) |
| IL (1) | IL89992A0 (ja) |
| MX (1) | MX26714A (ja) |
| NO (1) | NO302301B1 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2649991B2 (fr) * | 1988-08-05 | 1994-03-04 | Rhone Poulenc Sante | Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces |
| JPH0669365B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1994-09-07 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| JPH0671432B2 (ja) * | 1991-03-20 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| FR2686620B1 (fr) * | 1992-01-27 | 1995-06-23 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Serum-albumine humaine, preparation et utilisation. |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| FR2693207B1 (fr) * | 1992-07-03 | 1994-09-30 | Orsan | Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 hétérologue et d'une NADPH-cytochrome P450-réductase endogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion. |
| JPH06209763A (ja) * | 1993-01-13 | 1994-08-02 | Green Cross Corp:The | 変異株 |
| JPH07308199A (ja) | 1994-05-18 | 1995-11-28 | Green Cross Corp:The | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| FR2746109B1 (fr) | 1996-03-12 | 1998-04-17 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Milieu pour la conservation de materiel biologique |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| CN1105727C (zh) * | 1998-06-17 | 2003-04-16 | 上海海济医药生物工程有限公司 | 重组人血清白蛋白的生产方法 |
| IL128757A0 (en) * | 1999-02-28 | 2000-01-31 | Yissum Res Dev Co | GCN4-derived expression of heterologous coding sequences and different uses thereof |
| CN1103373C (zh) * | 1999-03-04 | 2003-03-19 | 上海贸基生物工程科技有限公司 | 人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿主 |
| CN1103374C (zh) * | 1999-03-04 | 2003-03-19 | 上海贸基生物工程科技有限公司 | 重组dna技术生产人血清白蛋白的方法 |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1276849A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
| EP2277889B1 (en) | 2001-12-21 | 2014-07-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Fusion proteins of albumin and interferon beta |
| GB0217033D0 (en) | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene and polypeptide sequences |
| RU2010151453A (ru) | 2008-05-15 | 2012-06-20 | Р-Тек Уено, Лтд. (Jp) | Фармацевтическая композиция для лечения сухости глаз и/или повреждения конъюнктивы и роговицы |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4885242A (en) * | 1984-10-30 | 1989-12-05 | Phillips Petroleum Company | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| EP0206733A1 (en) * | 1985-06-17 | 1986-12-30 | Genex Corporation | Cloned human serum albumin gene |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| FI870103A (fi) * | 1986-01-13 | 1987-07-14 | Genex Corp | Producering av humanserum albumin i en bacillus-stam. |
| GB8613388D0 (en) * | 1986-06-03 | 1986-07-09 | Delta Biotechnology Ltd | Induction of galactose regulated gene expression in yeast |
| GB8615701D0 (en) * | 1986-06-27 | 1986-08-06 | Delta Biotechnology Ltd | Stable gene integration vector |
| IL82935A0 (en) * | 1986-08-12 | 1987-12-20 | Phillips Petroleum Co | Secretion of heterologous proteins from yeast |
| GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
-
1989
- 1989-04-17 IL IL89992A patent/IL89992A0/xx unknown
- 1989-04-21 AU AU33279/89A patent/AU605691B2/en not_active Expired
- 1989-04-25 KR KR1019890005444A patent/KR970002914B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-04-25 EP EP97101044A patent/EP0771871A3/en not_active Withdrawn
- 1989-04-25 EP EP89107459A patent/EP0344459B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-25 IE IE134889A patent/IE81153B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-04-25 MX MX2671489A patent/MX26714A/es unknown
- 1989-04-25 AT AT89107459T patent/ATE159297T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-25 NO NO891716A patent/NO302301B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-04-25 IE IE19980173A patent/IE980173A1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-04-25 ES ES89107459T patent/ES2108681T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-25 DE DE68928380T patent/DE68928380T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-25 CA CA000597721A patent/CA1328838C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-25 JP JP1105730A patent/JP2580036B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-25 DK DK198901995A patent/DK175792B1/da not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-11-13 GR GR970403026T patent/GR3025382T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE81153B1 (en) | 2000-05-03 |
| EP0344459A2 (en) | 1989-12-06 |
| DE68928380D1 (de) | 1997-11-20 |
| JPH02104290A (ja) | 1990-04-17 |
| ES2108681T3 (es) | 1998-01-01 |
| DK199589A (da) | 1989-10-26 |
| AU3327989A (en) | 1989-10-26 |
| ATE159297T1 (de) | 1997-11-15 |
| DE68928380T2 (de) | 1998-02-26 |
| EP0771871A3 (en) | 1997-05-28 |
| AU605691B2 (en) | 1991-01-17 |
| IL89992A0 (en) | 1989-12-15 |
| NO891716D0 (no) | 1989-04-25 |
| KR970002914B1 (ko) | 1997-03-12 |
| IE980173A1 (en) | 2000-02-23 |
| IE891348L (en) | 1989-10-25 |
| DK199589D0 (da) | 1989-04-25 |
| NO891716L (no) | 1989-10-26 |
| DK175792B1 (da) | 2005-02-21 |
| NO302301B1 (no) | 1998-02-16 |
| KR890016176A (ko) | 1989-11-28 |
| EP0344459A3 (en) | 1989-12-27 |
| CA1328838C (en) | 1994-04-26 |
| MX26714A (es) | 1993-10-01 |
| GR3025382T3 (en) | 1998-02-27 |
| EP0771871A2 (en) | 1997-05-07 |
| EP0344459B1 (en) | 1997-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2580036B2 (ja) | メチロトローフ酵母におけるヒト血清アルブミンの発現 | |
| JP3786662B2 (ja) | ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現 | |
| US5665543A (en) | Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators | |
| US5863733A (en) | Methods of transcriptionally modulating gene expression and of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators | |
| JP2552807B2 (ja) | アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子 | |
| US5139936A (en) | Use of the GAL1 yeast promoter | |
| JPH09182585A (ja) | 酵母中でのポリペプチドの発現 | |
| JPH08228790A (ja) | ヒト血清アルブミンの変異体をコードするｄｎａ | |
| CA1340617C (en) | Expression of hepatitis b s and pres2 protiens in methylotrophic yeasts | |
| JP2002514049A (ja) | ピヒア・メタノリカの栄養要求性突然変異体の製造 | |
| JPS62502660A (ja) | 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター | |
| EP0339568A1 (en) | Expression of Human Interleukin-2 in Methylotrophic Yeasts | |
| EP0339567A1 (en) | Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts | |
| EP0590721B1 (en) | Method for expressing receptors of the human nervous system in the yeast Schizosaccharomyces pombe | |
| EP0339569A2 (en) | Expression of the HIV 24 KDA GAG protein in methylotrophic yeasts | |
| GB2217332A (en) | Expression of salmon growth hormone in methylotrophic yeast of genus pichia | |
| Garcia-Ojeda | Revertants that suppress mating-type regulation of CYC7-H2 and analysis of a site-directed mutant STE7-VAL (372) gene in a STE7 (+) background | |
| JPH02303497A (ja) | サケ成長ホルモンのピキア属メチロトローフ酵母での発現 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071107 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081107 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081107 Year of fee payment: 12 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081107 Year of fee payment: 12 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091107 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091107 Year of fee payment: 13 |