DK175792B1 - Vektoren pHSA13 og Pichia pastoris-stamme GS115 transformeret dermed samt vektoren pHSA113 og Pichia pastoris-stamme GS115 transformeret dermed - Google Patents

Description

DK 175792 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår vektoren pHSAii (fig. 5) som angivet i krav 1, Pichia pastoris-stamme GS115 (NRRL Y-15851) transformeret med denne vektor, jf. krav 2, vektoren pHSAH3 (fig. 2) som angivet i krav 3 og Pichia 5 pastoris-stamme GS115 (NRRL Y-15851) transformeret med denne vektor, jf. krav 4.

Humant serumalbumin er det mest rigelige plasmaprotein | hos voksne. Albuminkoncentrationen er 40 mg/ml eller 160 g i

albumin, der cirkulerer i det menneskelige legeme hos en I

10 voksen mand på 70 kg. Dette protein opretholder osmotisk tryk og fungerer ved bindingen og transporten af kobber, nikkel, calcium (svagt i 2-3 bindingssteder), bilirubin og protoporphyrin, langkædede fedtsyrer, prostaglandiner, ste- i roide hormoner (svag binding med disse hormoner fremmer i 15 deres overføring gennem membranerne) , thyroxin, triiodthyro-nin, cystin og glutathion. Ifølge Peters m.fl. indgives der mere end 10.000 kg renset albumin hver år i USA blot til patienter med kredsløbssvigt eller albuminmangel.

For øjeblikket er den eneste kommercielle HSA-kilde 20 fraktioneret blod. I betragtning af de eventuelle risici, der er forbundet med forureninger og patogener, som føres med blodet, ville udviklingen af alternative metoder til fremstilling af HSA være af stor betydning for den kommercielle HSA-fremstilling. Ved fremkomsten af den rekombinante DNA-25 bioteknologi er det nu blevet muligt at fremstille HSA ved alternative metoder.

Desværre er der, selv om man har fremstillet HSA i E.coli-celler, betydelige ulemper ved fremstillingen af HSA i denne vært. Således producerer E.coli endotoksiner, som 30 nødvendigvis skal fjernes ved kostbare rensningstrin.

Det er således den foreliggende opfindelses formål at tilvejebringe hidtil ukendte methylotrophe gærstammer, der er transformeret med en vektor eller vektorer, der er i stand til forøget KSA-produktion. j i 35 Opfindelsen angår også hidtil ukendte vektorer in- i deholdende DNA-sekvenser, der koder for HSA.

I DK 175792 B1 I

I 2 I

I Opfindelsen beskrives i forbindelse med tegningen, I

I på hvilken I

fig. 1 er en gengivelse af plasmid pAO804, som in- I

deholder en lineær integrativ stedsspecifik vektor i frag- I

5 mentet i urets retning fra Bglll til Bglll. Det strukturelle I

gen kan indsættes i dette plasmids unike EcoRI-sted. Dette

I plasmid kan udvindes fra plasmid-DNA'en i NRRL B-18114 ved I

hjælp af en EcoRI-fordøj else og gelelektrophorese til udvin- I

I ding af et lineært EcoRI-fragment på ca. 7,4 Kb svarende til I

I 10 fig. 1, I

I fig. 2(a) er et lineært kort over pA0804, I

I fig. 2(b) er et lineært kort over pA0807, et derivat I

H af pA0804 indeholdende en fl-ori på ca. 458 bp, I

fig. 2(c) er et lineært kort over pA0807N, som har H

I 15 Notl-steder indsat i Bglll-stedernes plads i pA0807, I fig. 2(d) er et lineært kort over pHSA113, som er et

I lineært kort over pA0807N med et HSA-gen indsat i det unike I

I EcoRI-sted,

fig. 3 er en gengivelse af pA0807N i cirkulær form, I

20 fig. 4 er en gengivelse af plasmid pTHFKA, en selv- I

stændig gærpiasmid-DNA i NRRL B-18115 ved hjælp af en EcoRI- I

I fordøjelse, gelelektrophorese og udvinding af EcoRI-fragmen- I

tet på 6,2 Kb, og I

fig. 5 er en gengivelse af pHSA13, som er et derivat I

I 25 af pTHFKA, der indeholder et HSA-gen indsat i pTHFKA's unike I

I EcoRI-sted.

I Strukturelle HSA-gener er blevet sekvensbestemt af

I Lawn m.fl., Nuc. Acids. Res. 9, 6105 (1981); og Dugaiczyk I

I m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 71 (1982). I

30 Dette gen kan fås ved resiolering af genet ved hjælp I

af metoder ifølge Lawn m.fl., og Dugaiczyk m.fl., eller som I

beskrevet i eksempel 1 eller syntetiseret in vitro ved hjælp I

af en almindelig genproducent, såsom British Biotechnolgy,

Ltd. En fremgangsmåde til opnåelse af HSA-genet ville være I

35 at screene et lever-cDNA-bibliotek med oligonucleotid-sonder I

og eventuelt immunscreene positive plaquer for det struk- DK 175792 B1 3 tureile HSA-gen. Ved udførelsen af denne type isolering har man isoleret et HSA-gen med den i tabel I viste nucleotid-sekvens.

I DK 175792 B1 I

4 I

I c »i s' e* p £ ? r-rNCrl'J‘^0'~<ie0>

I i6S8Ei8?S‘SSSpsy|i I

<H<3H<bir5n53<o<<C!

I s?gs3§|ligSeSE|3g I

I sscsssiuililssissi: I

I f s 5 H E 1 Π s s § t s s f * I

I ^ 1 I I ϊ H s H S s ί I

I S h M 6 5 h S g s s s t i t I

I S<ebii5S35S|§3<g5g I

I § ^ t Η Π Π 5 8 i : ^ “ 5 I

I s 2 5 J S i S S 8 5 8 S : i f ί ? I

I i I s 11 i 8 s i! ill

I i II 111 i i i i Μ I

I S! S111ΪI!! 1111! s I I

I t ^ ^ ^ 2 π π § o ? h ? b μ I

I 5gsEgggggS8|||gggs I

H o ii<<oouuoi-o<5yfT^j53

H <U i—f P 5 ^ ti 5 ^ 3 U O Η 5 u <-> <<<<-> I

-«υ-ο5δ<<ί^Ηρ3υοο2υΗ

I Si g I μ g E ! S s g i ! i ! 5 ! s I

I " o § i Π § s § § < Η Π 12 π I

Η m uouo<r’<|J3ySi<Sis<o‘-t3' I

I S £ E I t § S i s S i s C t § § a s I

I = § 5 s Π s U 2 s H U f I

I Η ^ Μ Η N Π ^ 5 < π ^ I

gs-3 555HGSgP8Pbi-H^ I

< S 2 3 3 t: g I 2 5 F C ξ o § ζ »3 I

I ΗΠΗ « ί I

GgS <o<|p|hS<oo<c>5 I

ο<Η|555Ρο<ϋΗο^<όυ I

sgss'ibblÉg^sIsIsi I

I ii§^$<§i-<5oo<p|g I

I Π S E Π Π E π Π Γί I

I i u< i: i: U Si H 5 ii < o ^ Π I

I “§§§§§§§§®§ο§§οοο I

O O ^ W * r μ — m ».*f irs %0 H

— CN ριη ^ cTlO Γ"— 00 O' O “* wj ^ H

DK 175792 B1 5 & O' O' O' O' r*-. αο O' *-< I—· E ‘3 8

U Ο ίο < H

Η Ο ¢-

8. 3 S

< Η υ o < f- < < < o u < O < f-

3 S E

H < <-> < U H*

O U ίο < H

< H < o t-> H <->

cj ο H

O -* < o u o 3 & 3 t_> f~ < o < < H U -5 Ο Ο < U < r- >» t- < «-: Ό

Ο < Η O

< <£ O CM

<! H t— o e- c; e> < i- o o o < t_> <: < 5J < < r- < t-> «£ — O i- < ^ • r- U < < cn h f— cj < 4J f- < ο ·ί tj ~ U U < Ο a < < < < r- < < "" -.2 — b 2 O 5- c- < M r- ’-J O < f- C3 O < rH t- O c- < m < < t~ 5 S O r- O < *9 P— r- w < ro < — t-

Eh ο υ t- o s- i- f- < < Ο H <

j- 'J U O

G 3 P 3 r- U r- <

•J 5- r- O

'J ^ W O

< < r- f- < < a < < <^ ·- < e: p c_> <

b U < <J

<c o o < C-ί f— r~ < Ο Ό < < < r- r- r- O r- r- r· < '-> < 3 3 < 5 < < < t-

< 3 < G

< < W O

o b < b

o o c; H

3 3 3 £

Ο Ό O U

Ο Ο Η Η-

Ο < < K

O O < H

< U < H

< o < o

u Ο ο H

< *- < CJ

o o c o o o c ©

r~ QC Ο O

I DK 175792 B1 I

I 6 I

H Den i tabel I anførte nucleotidsekvens er opnået ved I

at sekvensbestemme den isolerede HSA-DNA, hvilket kan ske I

H ved hjælp af en hvilken som helst passende metode, såsom I

Sanger m.fl.s dideoxynucleotid-kædetermineringsmetode [PNAS I

5 74, 5463 (1977)], eller ved subcloning ved hjælp af M13- I

derivater, idet der sekvensbestemmes som beskrevet af Sanger I

I m.fl., J. Mol. Biol. 142, 1617 (1980). I

Denne sekvens er en hidtil ukendt nucleotid-sekvens I

sammenlignet med de sekvenser, der er offentliggjort af I

10 Lawn m.fl. og Duagiczyk m.fl. En sammenligning af nucleotid- I

sekvenserne ses i tabel II I

I TABEL II I

I HSA-Sekvenssammenligning I

I 15 HSA NR. 54 97 191 199 216 268 327 391 396 407 474 479 532 552 I

I AAS VAL GLU ALA LYS VAL GLN LEU ASN GLU LEU THR GLU LEU ALA I

I LYS I

1. LAWN GTA GAG GCT AAA GTG CAG CTG AAC AAG CTA ACA GAG CTT GCA I

I 20 GLY I

I 2. DUGA I GTT GGG GCT AAG GTA CAA TTG AAT GAG CTG ACC GAA CTC GCT I

I 3 . DUGAII GTT GAG GCT AAG GTA CAA CTG AAT GAG CTA ACC GAA CTC GCA I

I VAL I

I 25 4. HSA13 GTT GAG GTT AAG GTA CAA TTG AAT GAG CTA ACC GAA CTT GCA I

Kilder: 1) Lawn m.fl., 2) Dugaiczyk m.fl., cDNA, 3) Dugai^ I

H czyk m.fl., genom DNA, 4) Eksempel 1. I

I 30 Når det strukturelle gen for HSA er udvundet, kan I

I det først være nødvendigt at indsætte det strukturelle gen I

I i en vektor og en forligelig værtscellelinie for at formere I

I genet eller yderligere at tilpasse genet el.lign. I

I Dyrkning af værten kan ske på en hvilken som helst I

35 egnet måde. Almene metoder til dyrkning af værter er kendt, I

I og en eventuel tilpasning af disse metoder til de særlige I

I behov hos de her anvendte stammer ligger inden for fagfolks I

kunnen. I

I Udvinding af plasmid-DNA fra værter kan ske ved hjælp I

I 4 0 af flere metoder på grund af dets kompakte størrelse og ! I

DK 175792 B1 7 lukkede cirkulære superspiralform. Således kan værtscellerne efter høst pelleteres ved centrifugering og derefter resu-spenderes og lyses. Lysatet bør centrifugeres for at fjerne cellerester, og overfasen indeholdende DNA beholdes. Derefter 5 kan der foretages en phenolekstraktion for at fjerne de fleste andre forureninger fra DNA'en. Den phenolekstraherede DNA kan derpå behandles yderligere ved hjælp af densitetsgradient-centrifugering eller en gelfiltreringsteknik for at adskille plasmid-DNA'en fra den bakterielle DNA. De me-10 toder, der anvendes ved den ovennævnte adskillelse, er velkendte, ligesom der kendes talrige metoder til udførelse af disse metoder.

Nucleasefordøjelse af plasmiderne kan ske ved at vælge passende endonucleaser, som kan skære det valgte plas-15 mid på en sådan måde, at udvindeisen af det strukturelle HSA-gen lettes. De endonucleaser, der benyttes, afhænger af det plasmid, hvorfra HSA-genet skal udskæres.

Gelelektrophorese af DNA kan ske ved hjælp af forskellige metoder, jfr. P.G. Sealy og E.M. Southern, Gel 20 Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach, udg. D. Rickwood og B.D. Hames, 39 (1982) . Eluering kan ligeledes finde sted ved hjælp af mange metoder, der er egnede til den pågældende gel, såsom elektroeluering, diffusion, gelopløsning (agarosegeler) eller fysisk ekstrusion 25 (agarosegeler). Det skal desuden bemærkes, at eluering måske ikke er nødvendig med visse geler, såsom lavtsmeltende kvalitetsagarose .

Når fragmentet, der indeholder det strukturelle HSA-gen eller fragmenter deraf, er isoleret, kan yderligere 30 manipulationer være påkrævede, før det indsættes i vektoren.

Disse manipulationer kan omfatte, men er ikke begrænset til tilføjelse af forbindelsesstykker eller fragmentets forsyning med stumpe ender.

Efter isolering af det strukturelle HSA-gen indsættes 35 dette i en passende methylotroph gærvektor, såsom et plasmid eller en lineær stedsspecifik integrativ vektor. Fortrinsvis

I DK 175792 B1 I

I I

er vektorer til udøvelse af den foreliggende opfindelse I

I sådanne, der er forligelige med Pichia-arten, og især Pichia I

I pastoris. I

Plasmider har længe været et af de grundlæggende H

5 elementer, der anvendes inden for rekombinant DNA-teknologi. H

I Plasmider er cirkulær ekstrachromosomal dobbeltstrenget DNA, I

der findes i mikroorganismer. Plasmider har vist sig at H

forekomme i en enkelt eller flere kopier pr. celle. I plas- I

mid-DNA findes den information, der er nødvendig for plasmid- I

I 10 reproduktion, dvs. en autonom replikationssekvens som dem, I

I der er omtalt i Europa-patentansøgning nr. 0.180.899. Der I

I kan også i den information, der er indkodet^ i plasmidet, I

findes et eller flere midler til phænotypisk at udvælge I

plasmidet i transformerede celler. Phænotypiske eller ud- I

15 vælgelsesmarkører, såsom antibiotiske resistensgener eller I

gener, der komplementerer defekter i værtens biokemiske I

veje, gør, at kloner af de værtsceller, som er blevet trans- I

I formerede, kan genkendes, udvælges og bibeholdes. I

I For at udtrykke det strukturelle HSA-gen i methylo- I

I 20 trophe gærarter, skal genet nødvendigvis være operabelt I

I forbundét med en 51-reguleringsregion og 3'-termineringsse- I

I kvens, hvilket udgør ekspressionskassetten, som skal indsæt- I

tes i værten via en vektor.

For tydeligheds skyld defineres følgende'udtryk. H

I 25 "Operabelt forbundet" - refererer til en sammenstil- H

I ling, hvor komponenterne udformes, så at de udfører deres H

H funktion. H

I "Reguleringsregion" - DNA-sekvenser, som reagerer på H

I forskellige stimuli og påvirker mRNA-transcriptionshastig- I

I 30 heden. I

I "31-Termineringssekvens" - sekvenser 3’ i forhold I

I til stopcodonet, og som fungerer således, at de stabiliserer I

I mRNA'en, f.eks. sekvenser, der fremkalder polyadenylering. H

I "Pichia-forligelig" - refererer til DNA-sekvenser, I

I 35 som vil udføre deres normale funktioner i Pichia, såsom I

I reguleringsregioner og 3'-termineringssekvenser afledt fra I

DK 175792 B1 9

Pichia.

"Integrative vektorer" - såsom Cregg's lineære stedsspecifikke integrative vektor som beskrevet i Europa-patentansøgning nr. 86-114.700.7 beskrevne. Sådanne vektorer om-5 fatter en i serie arrangeret sekvens af mindst 1) et første indsætteligt DNA-fragment; 2) et udvælgeligt markørgen; og 3) et andet indsætteligt DNA-fragment og kan også anvendes til udøvelse af den foreliggende opfindelse.

Det første og det andet indsættellge DNA-fragment er 10 hver på mindst ca. 200 nucleotider i længden og har nucleotidsekvenser, som er homologe med dele af genom-DNA'en i de arter, der skal transformeres. De forskellige komponenter i den integrative vektor er ordnet i serie og udgør et lineært . DNA-fragment, således at ekspressionskassetten og det udvæl-15 gelige markørgen er anbragt mellem det første indsættelige DNA-fragments 3 '-ende og det andet indsættelige DNA-fragments 5'-ende. Det første og det andet indsættelige DNA-fragment er i det i rækkefølge ordnede lineære fragment orienteret i forhold til hinanden som i det oprindelige genom.

20 Nucleotidsekvenser, der kan anvendes i det første og det andet DNA-fragment, er nucleotidsekvenser, som er homologe med separate dele af det naturlige genome sted, hvori der skal ske genom modificering. Hvis der således skal ske genom-modifikation i alkohol-oxidase-genstedet, er det første 25 og det andet indsættelige DNA-fragment, der anvendes, homologe med separate dele af alkohol-oxidase-genstedet. Med henblik på genom-modifikation ifølge den foreliggende opfindelse skal de indsættelige DNA-fragmenter nødvendigvis være orienteret i forhold til hinanden i det lineære fragment i 30 samme relative orientering, som forekommer i det oprindelige genom. Eksempler på nucleotidsekvenser, der kan anvendes som første og andet indsætteligt DNA-fragment, er nucleotidsekvenser valgt blandt alkoholoxidase-(AOX1)-genet, dihy-droxyacetone-synthase-(DHAS)-genet, p40-genet og HIS4-genet.

35 AOXl-genet, DHAS-genet, p40-genet og HIS4-genet er omhandlet i EP-A-0.183.071.

I DK 175792 B1 I

I 10 I

I Det første indsættelige DNA-fragment kan indeholde H

I en operabel reguleringsregion, som kan omfatte den regule- I

I ringsregion, der benyttes i ekspressionskassetten. Anvendel- I

I sen af det første indsættelige DNA-fragment som regulerings- H

I 5 region til en ekspressionskassette udgør en foretrukket I

I udførelsesform for opfindelsen. Fig. 1 er et diagram af en I

I vektor, hvor det første indsættelige DNA-fragment anvendes I

I som reguleringsregion til en kassette. I

I Som vist i fig. 1 kan et indsættelsessted eller- I

I 10 steder og en 3’-termineringssekvens eventuelt anbringes H

I umiddelbart 3' for det første indsættelige DNA-fragment. I

I Denne udformning af den lineære stedsspecifikke integrative H

I vektor har yderligere den fordel, at der tilvejebringes et H

I nemt sted til indsættelse af et strukturelt gen, uden at H

I 15 man behøver at tilføje en forligelig 31 -termineringssekvens. H

I Yderligere kan de ekspressionsvektorer, der anvendes H

ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse, indeholde et H

I polyforbindelsesstykke-sted for at lette indsættelsen af H

I strukturelle gener eller kassetter el.lign. mellem det første H

I 20 indsættelige DNA-fragment og det andet indsættelige DNA- H

I fragment eller reguleringsregionen og termineringssekvensen H

I som vist i fig. 4. H

I Det er ligeledes nødvendigt at medtage mindst ét H

I udvælgeligt markørgen i den DNA, der anvendes til at trans- H

25 formere værtsstammen. Dette letter udvælgelse og isolering H

I af de organismer, hvori den transformerende DNA er inkor- H

I poreret. Markørgenet bibringer den transformerede organisme H

I et phænotypisk træk,» som værten ikke havde, f .eks. genopret- H

I telse af evnen til at fremstille en bestemt aminosyre, hvor H

I 30 den utransformerede værtsstamme har en defekt i den bestemte H

I syres biosyntetiske vej, eller resistens over for antibiotica H

I el.lign. H

I Eksempler på udvælgelige markørgener er HIS4-genet

I og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevi- H

I 35 siae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae H

I eller G418R/kanamycin-resistensgenet fra de E.coli-ombyt- H

DK 175792 B1 11 telige elementer Tn601 eller Tn903.

Fagfolk ved, at yderligere DNA-sekvenser kan inkorporeres i de vektorer, der anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse, f.eks. bakteriel plasmid-DNA, bak- i 5 teriofag-DNA o.lign. Sådanne sekvenser muliggør formeringen og opretholdelsen af disse vektorer i bakterielle værter.

Hvis det første indsættelige DNA-fragment ikke indeholder en reguleringsregion, er det nødvendigt, at der indsættes en passende reguleringsretion operabelt forbundet ! 10 med det strukturelle gen for at tilvejebringe en operabel i ekspressionskassette. Hvis der ligeledes ikke findes nogen ! i 31-termineringssekvens i indsættelsesstedet, der kan kom- 1 plettere ekspressionskassetten, må en 3'-termineringssekvens i forbindes operabelt med det strukturelle gen, der skal ind- j 15 sættes. :

Fagfolk kender, talrige reguleringsregioner, som er blevet karakteriseret og kan anvendes i forbindelse med methylotrophe gærarter. Eksempler på reguleringsregioner omfatter, men er ikke begrænset til gær-reguleringsregioner 20 valgt blandt syrephosphatase, galactokinase, alkoholdehydro-genase, cytochrom c, a-tilpassende faktor og glyceraldehyd- 3-phosphatase-dehydrogenase-reguleringsregioner isolerede fra Saccharomyces cerevisiae; den primære alkoholoxidase (A0X1), dihydroxyacetone-synthase DHAS, po4-reguleringsregi-25 onerne og HIS4-reguleringsregionen afledt fra Pichia pastoris o.lign. De reguleringsregioner, der fortrinsvis anvendes ved udøvelse af den foreliggende opfindelse, er dem, der er karakteriseret ved deres evne til at reagere på methanol-holdige medier, f.eks. reguleringsregioner valgt blandt 30 AOX1, DHAS, p40 og omtalt i EP-A-0.183.071.

Den særlig foretrukne reguleringsregion til udøvelse af den foreliggende opfindelse er A0X1-reguleringsregionen.

31-Termineringssekvenser kan anvendes i ekspressionskassetten eller udgøre en del af vektoren, som omtalt oven-35 for. 3'-Termineringssekvenser kan fungere således, at de afslutter, polyadenylerer og/eller stabiliserer budbringer-

I DK 175792 B1 I

I 12 I

RNA, som det strukturelle gen koder for, når det bindes I

I operabelt til et gen. Nogle få eksempler på illustrerende I

kilder til 31-termineringssekvenser til udøvelse af opfin- I

H delsen omfatter, men er ikke begrænset til Saccharomyces I

H 5 cerevisiae-, Hansenula polymorpha- og Pichia 3'-termine- I

ringssekvenserne. Foretrukne er de, der afledes fra Pichia I

I pastoris, såsom dem, der vælges blandet 3'-termineringsse- I

I kvenserne i AOXl-genet, DHAS-genet, p40-genet og HIS4-genet. I

I Særlig foretrukket er 3’-termineringssekvensen i AOXl-genet. I

10 Til udøvelse af opfindelsen kan der anvendes enten I

lineære stedsspecifikke integrative vektorer, såsom Bglll- I

fragmenter konstrueret som vist i fig. 1 og 2 eller plasmider I

som vist i fig. 4. I

I Indsættelsen af det strukturelle HSA-gen i passende I

15 vektorer kan ske ved enhver passende metode, som spalter I

den valgte vektor på et passende sted eller steder og resul- I

H terer i mindst én operabel ekspressionskassette, der in- I

H deholder det strukturelle HSA-gen, der er til stede i vek- I

toren. I

20 Ligatering af strukturelt HSA-gen kan ske ved hjælp I

af enhver passende ligateringsmetode, såsom anvendelse af I

T4-DNA-ligase. I

Den indledende udvælgelse, forplantning og eventuel I

formering af ligateringsblandingen til det strukturelle I

25. HSA-gen og en vektor foretages fortrinsvis ved at trans- I

formere blandingen ind i en bakterievært, såsom E.coli. I

{Ligateringsblandingen kan dog transformeres direkte ind i I

en gærvært). Egnede transformationsmetoder til E.coli er I

velkendte. Desuden er udvælgelsesmarkører og bakterielle I

30 formeringsoriginaler, der er nødvendige for opretholdelsen I

af en vektor i en bakterievært, ligeledes velkendte. I

Isoleringen og/eller rensningen af det ønskede plas- I

mid, der indeholder det strukturelle HSA-gen i et ekspres- I

sionssystem, kan ske ved hjælp af hvilke som helst egnede I

H 35 midler til adskillelse af plasmid-DNA fra værts-DNA'en. I

På lignende måde kan vektorerne, der er dannet ved I

DK 175792 B1 13 ligatering, afprøves efter forplantning for at konstatere tilstedeværelsen af HSA-genet og dets operable binding til reguleringsregionen og en 3-termineringssekvens. Dette kan ske ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder, 5 men ikke begrænset til endonucleasefordøj else, gelelektro-phorese eller enconuclease-fordøjelse/Southern-hybridisering.

Transformering af plasmider eller lineære vektorer ind i gærværter kan ske ved hjælp af passende transformationsmetoder, herunder, men ikke begrænset til Hinnen m.fl., 10 Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1929 (1978); ItO m.fl., J. Bac-teriol. 153, 163 (1983); Cregg m.fl., Mol. Cell Biol. 5, 3376 (1985); eller Sreekrishna m.fl., Gene 59, 115 (1987). Fortrukket til udøvelsen af den foreliggende opfindelse er Cregg1s transformationsmetode. Det er ønskeligt for udøvelsen 15 af opfindelsen at anvende et overskud af lineære vektorer og udvælge til flere indsættelser ved hjælp af Southern hybridisering.

Gærværten til transformation kan være en hvilken som helst passende methylotroph gærart. Methylotroph gær 20 omfatter, men er ikke begrænset til gær, der kan vokse på methanol og er udvalgt blandt slægterne Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis og Rhodotorula.

En fortegnelse over særlige arter, som er eksempler på denne klasse gær, findes hos C. Anthony, The Biochemistry of Me-25 thylotrophs, 269 (1982). For tiden foretrækkes methylotrophe gærarter af slægten Pichia, såsom den auxotrophe Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) . Auxotrophe methylotrophe gærarter er også foretrukne til udøvelsen af den foreliggende opfindelse på grund af deres nemme udvælgelse. Man ved, at 30 vilde typer methylotrophe gærstammer kan anvendes med samme held, hvis der vælges et passende transformeringsmarkørgen, såsom anvendelsen af SUC2, til transformering af Pichia pastoris til en stamme, der kan vokse på saccharose, eller der anvendes en antibiotisk resistensmarkør, såsom G418.

35 Transformerede methylotrophe gærceller kan udvælges ved hjælp af passende metoder, herunder, men ikke begrænset

I DK 175792 B1 I

I 14 I

H til dyrkning af tidligere auxotrophe celler efter trans- I

formering uden tilstedeværelse af et påkrævet biokemisk I

produkt (på grund af cellens auxotrophi), udvælgelse ved I

H påvisning af en ny phænotype ("methanol slow") eller dyrkning I

5 i nærvær af et antibioticum, som er toksisk for gæren, når I

der mangler et resistensgen indeholdt i transformanten. I

Isolerede transformerede methylotrophe gærceller I

dyrkes ved hjælp af passende fermenteringsmetoder, såsom I

rystekolbefermentering, høj-densitetsfermentering eller de I

10 metoder, der er omtalt af Cregg m.fl., High-Level Expression I

and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in I

the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, 5 Bio/Technology I

I 479 (1987). I

I Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst I

15 ved hjælp af eksempler. I

Eksempler I

Generelle oplysning vedrørende eksemplerne. I

Stammer I

I 20 Pichia pastoris GS115 (his4) [NRRL Y-15851]; Pichia I

pastoris KM71 (his4 aoxl:ARG4) I

I E.coli YMC9 (F“ λ” endo Al hsds 17 I

I SUPE4 4 thi 1) I

anvendes til alle plasmidkonstruktion og -fremstillinger. I

I 25 E.coli DHS^F’ [ (F’, endAl hsd R17 (r'k, mk+) I

I Sup E 44, thi-1, λ" recAl, I

I gyr A96, rel Al, a80dlac Ζ-ΔΜ15, I

I Δ(lacZYAargF)U169] I

I E.coli JN107. endAl, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, I

I 30 relAl, traD36 (rK“, mK+) A(lac proA,B)/ I

F\ proA,B, lacl^ ΖΔΜ15. I

i

E.coli Y1088 ((ATCC nr. 37195); AlacU169 supE supF

hsdR' hsdM+ metB trpR tonA21 proC::Tn5 I

I (pMC9). pMC9 = pBR322-lacI^] anvendes I

3 5 til formering af biblioteket med henblik I

I på DNA-isolering og fremstilling af I

15 DK 175792 B1 j i plaque-rensede phag-lagre.

E.coli Y1090 [ATCC nr. 37197; AlacU169 proA± Alon araD139 strA supF trpC22::TnlO (pMC9)] anvendes som vært til alle immunologiske plaque-screeninger, 5 og efterfølgende screening med forskellige oligonucleotidsonder .

Puffere, opløsninger og medier

Pufferne, opløsningerne og medierne, der anvendes i de følgende eksempler, har den nedenfor anførte sammensæt -10 ning:

Medier, pr. liter LB + amp 10 g gærekstrakt 20 g trypton 10 g NaCl

15 juster til pH 7,5 med 5 M NaOH

100 mg ampicillin LB 10 g gærekstrakt 20 g trypton 10 g NaCl

20 juster til pH 7,5 med 5 M NaOH

MGY 13,4 g YNB uden aminosyrer 400 μg biotin 10 g glucose 10 ml glycerol 25 MM 13,4 g YNB uden aminosyrer 400 /xg biotin 5 ml methanol LB agarplade 1-2% agar i LB LB topagar 0,8% agar i LB 30 Top-agarose 0,8% agarose i LB LBM LB + 10 mM MgS04 LBM/AMP LBM + 50 μg/ml ampicillin H-topagar 16 g Bacto-trypton 10 g Bacto-gærekstrakt 35 5 g NaCl i 1 liter H20 SM 5,8 g NaCl

DK 175792 B1 I

2 g MgS04-7H20 I

20 ml 1 M Tris.HCl, pH 7,5

5 ml 2% gelatine I

SDR, 11 13,4 g YNB I

5 400 μg biotin

182 g sorbitol H

10 g dekstrose I

10 g agar H

50 mg af hver af følgende: glutamin, methionin, I

10 lysin, leucin og isoleucin I

2 g histinprøveblanding H

SDHR, I· 1 SDR + 40 mg histidin I

Puffere og opløsninger I

15 TE-puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) I

1 mM EDTA (pH 8,0) I

Højt-saltpuffer: '50 mM Tris-HCl, pH 8,0 I

10 mM MgCl2 I

100 mM NaCl I

20 Restriktionsfordøjelses- H

puffere:

HS-puffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM I

MgCl2 I

100 mM NaCl og 1 mM dithiohreitol I

25 MS-puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM I

MgCl2 I

50 mM NaCl og 1 mM dithiothreitol I

LS-puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM I

MgCl2 og 1 mM dithiothreitol I

30 Ligateringspuffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) I

10 mM MgCl2 I

10 mM dithiothreitol H

1 mM ATP og H

100 μg/τal BSA I

35 Nicktranslations(NT)- 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) I

puffer: 10 mM MgS04 I

DK 175792 B1 17

0,1 mM dithiothreitol og 1 mM EDTA

Phosphatasepuffer: 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) 1 mM MgCl2 5 1 mM ZnCl2 og 1 mM spermidin

Kinasepuffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM MgCl2 5 mM dithiothreitol 10 0,1 mM EDTA og 0,1 mM spermidin

Na2C03/NaHC03-puffer: 0,015 M Na2C03 0,035 M NaHC03

Blotto-puffer: 50 g tørmælk uden fedt 15 1 g thimerosal 100 μΐ antiskum A (Sigma) 0,5 ml Tween 20 i IX D-PBS (1 1) (Dulbecco's phosphatpufrede saltvand, Gibco) 20 TBS, IX 150 mM NaCl 10 mM, Tris-HCl, pH 7,5

TBST 1 x TBS

0,5% Tween 20

CaS 1 M sorbitol 25 10 mM CaCl2 10 mM Tris-HCl. pH 7,5 filtersteriliseres

Eksempel 1

30 Isolering af HSA-cDNA

Et humant lever Xgtll-cDNA-ekspressionsbibliotek (portion nr. 2102) købes hos Clontech Laboratories, Inc.

Dette bibliotek har en titer på 9 x 10^ phag pr. mol og er sammensat af 5,5 x 105 uafhængige, klare plaque-phag-isolater 35 med en skønnet indsaettelsesstørrelse fra 0,15 til 1,9 kB par.

En alikvot, der repræsenterer 4 x 105 uafhængige phag-

I DK 175792 B1 I

I I

isolater, screenes for dem, som indeholder nucleotid-sekven- I

ser, der er komplementære med sonde nr. 1. Sonde nr. 1 er I

et oligonucleotid på 19 bp (vist i trin 5 nedenfor) , som I

H omfatter codonerne for de første seks aminosyrer i den modne I

H 5 form, der udskilles af humant serumalbumin. Screening udføres I

på følgende måde: I

Trin 1. E.coli-transfektion I

E.coli Y1088, ATCC nr. 37195 suspenderes i flydende I

H LDB-medium sammensat af LB-næringsvæske [5,0 g/1 gæreks- I

10 trakt (Difco), 10,0 g/1 trypton (Difco) og 5,0 g/1 natrium- I

chlorid] suppleret med 0,2% D-glucose. 50 μΐ alikvot af I

denne suspension spredes over et fast vækstmedium sammensat I

af 1,2% Agar Noble (Difco) i LB indeholdende 50 Mg/ml am- I

I picillin (LB+Amp). Bakteriekolonier får lov at vokse natten I

I 15 over ved 37°C. Nogle få kolonier overføres til 10 ml LB- I

I Amp-medium og inkuberes ved 30°C i en roterende ryster ind- I

stillet på 250 o/m, så at der fås en natgammel kultur, der I

anvendes til screening af biblioteket. I

I En alikvot af Agt-ll-cDNA-ekspressionsbiblioteket I

I 20 fortyndes 100 gange i SM-puffer [(50 mM Tris-HCl, pH 7,5, I

I 0,5 M NaCl, 8,1 mM MgS04 og 0,01% (væ/vo) gelatine]. 4,4 μΐ I

blandes med 4,0 ml af den natgamle kultur af E.coli Y1088, I

og blandingen inkuberes ved 30°C i 20 min. 0,2 ml alikvoter I

sættes til 2,5 ml blødt agarmedium, der holdes ved 55°C I

25 [(0,7% Agar Noble (Difco) i LB] og spredes jævnt over agar- I

I bunden (LB indeholdende 1,2% Agar Noble) i en petriskål med I

I en diameter på 90 mm. Efter 10 min. ved stuetemp. anbringes I

pladerne i en inkubator indstillet på 43°C. Phagplaquerne I

I får lov at komme frem, men ikke at flyde sammen (i reglen I

I 30 4-6 timer). I

I Trin 2. Filterhævninq I

I Topagar indeholdende plaquer overlejres med S&S Ni- I

trocellulose-filtre (porestørrelse 0,45 μτα og diameter 82 I

I mm). Filtrene på agaren gennemhulles 5 steder med en nr. 18 I

I 35 nål på en sprøjte indeholdende India-blæk for at lette ori- I

entering af filtrene på et senere trin. Efter l min.'s forløb I

19 DK 175792 B1 overføres filtrene med plaque-siden op til 3MM Whatmann filtrerpapir mættet med 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH. Efter 2 min. aftrykkes filtrene fra bundsiden og overføres til et andet 3MM Whatman filtrerpapir mættet med neutraliserende opløsning i 5 (1,0 M Tris-HCl, pH 8,0, og 1,5 M NaCl). Efter 8 min. neu tralisering skylles filtrene i 6 x SSC (0,9 M NaCl og 90 mM natriumcitrat, pH 7,0). Filtrene trykkes tørre og bages i 2 timer ved 80°C i en vakuumovn.

Trin 3. Præhvbridisering oa hvbridiserinq med nr. 1-sonde 10 og autoradioorafi

Plaquer, som indeholder cDNA for humant serum albumin, identificeres ved hybridisering af deres DNA med radioaktivt mærkede oligonucleotider, som udvælges for deres nucleotid-sekvens, der er komplementær med humant serumalbumin-cDNA, 15 men ikke med hverken bakteriel eller transformerende vektor-DNA.

A. Fremstilling af mærkede oligonucleotidsonder

Der fremstilles radioaktive oligonucleotidsonder ved at blande ca. 100 ng af et givet oligonucleotid med 100 μΟϊ 20 [~32p]ATP i 10 μΐ af en puffer, der indeholder 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1,0 mM KCl, 5,0 mM dithiothreitol og 1,0 mM spermidin. Der tilsættes 10 enh. T4 polynucleotid-kinase, og blandingen inkuberes ved 37°C i 30 min. Enzymet inaktiveres ved 5 min. inkubation ved 65°C, og det mærkede 25 oligonucleotid sættes til hybridiseringsopløsningen uden rensning fra reaktionsblandingen.

B. Præhvbridisering

Filterhævningerne, der indeholder phag-DNA, inkuberes i 3-16 timer i en opløsning sammensat af 0,9 M NaCl, 6,0 mM 30 NaEDTA, 19,8 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% Ficoll, 0,1% polyvi-nylpyrrolidon, 0,1% okseserumalbumin, 0,1% SDS og 10% dek-stransulfat. Inkubationstemperaturen er 37°C. Der anvendes 10 ml opløsning pr. filter.

C. Hvbridiserinq 35 De præhybridiserede filtre hybridiseres i den samme opløsning som ved præhybridisering, men indeholdende radioak-

I DK 175792 B1 I

I 20 I

fl tivt mærket oligonucleotid nr. 1 i en koncentration på 2 I

fl ng/ml. Inkubationen varer i 20-48 timer ved 37°C, idet der I

anvendes 2 ml opløsning pr. filter. I

D. Vask I

5 Filtrene vaskes fire gange (20 min. pr. vask) ved fl I ' stuetemperatur i 0,9 M NaCl og 90 mM natriumcitrat (pH 7,0), fl og én gang ved 45°C (1 time) i den samme puffer, men indehol- fl dende 0,1% SDS. 10 ml-Voluminer af opløsningerne anvendes fl til vask af hvert filter. fl

fl 10 E. Autoradioqrafi I

B Filtre lufttørres og anbringes i en røntgenfilm-eks- I

poneringskassette ved siden af en røntgenfilm (Kodak XAR-2 ! fl fl eller XAR-5). Kassetterne inkuberes ved -80°C i 20-48 timer. fl

Trin 4. Immunscreeninq for HSA-protein-positive placuer H

15 Kloningsstedet i Xgtll-vektoren ligger i β-galac- H

tosidase-kodningsregionen. Eftersom IPTG (isopropyl-S-D- H

thiogalactosid) igangsætter ekspression af β-galactosidase- I

genet i Xgtll-vektoren, kan det også anvendes til -at igang- H

sætte ekspression af gener, som klones i aflæsningsramme H

I 20 med hensyn til β-galactosidase, og producere β-galactosidase- H

I fusionsproteiner. Derfor bør hele eller partielle HSA-gener I

H i aflæsningsramme og i korrekt orientering give immunreaktivt H

H materiale. E.coli-stammen Y1090 ATCC nr. 37197 anvendes til fl

I påvisning af HSA-ekspressions-positive plaquer. Infektion H

I 25 med phag og udstrygningsmetoder er som beskrevet ovenfor H

B for E.coli stamme Y1088. Når plaquerne er ca. 1 mm i diame- B

B ter, anbringes nitrocellulosefiltre, som i forvejen er ud- B

B blødt i 10 mM (IPTG) og tørret, oven på agaren. Pladerne B

B inkuberes ved 43°C i 4-6 timer. Filtrene fjernes derpå fra fl

B 30 pladerne og dyppes i en blokeringsopløsning sammensat af 1% B

B gelatine og 0,05% Brij 58 i TBST. Filtrene inkuberes ved B

B stuetemperatur under forsigtig vugning i 0,5-16 timer. Når B

B plaquehævninger ønskes fra de samme plader med henblik på B

B hybridisering med oligonucleotider, anbringes pladerne igen B

B 35 i 43°C-inkubatoren i 2 timer før overlejring med nitrocel- B

B lulosefiltrene. fl

^B

DK 175792 B1 21 IPTG-Filtrene fjernes fra blokeringsopløsningen, og plaquer, der udtrykker immunreaktivt HSA, identificeres ved hjælp af en 1:1000 fortynding af gede-anti-HSA (nephelome-trisk kvalitet, Atlantic Antibodies, katalog nr. 001-11, 5 Scarborough, ME) i blokeringsopløsning. Efter inkubation i én time ved stuetemperatur vaskes filtrene 5 gange i TBST, 10 minutter pr. vask. Hver inkubation og vask udføres under blid vugning. Binding af anti-HSA-antistoffer påvises ved inkubation med en 1:1000 fortynding (0,5 /zg/ml) alkalisk 10 phosphatase-konjugeret kanin-antigede-IgG (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) i blokeringsopløsning i én time ved stuetemperatur. Efter' vask som ovenfor inkuberes der i et phosphase-substrat-system sammensat af nitroblåt-tetrazolium og 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat 15 (Kirkegaard og Perry Laboratories) i 0,1 M Tris-puffer i 10-30 min. ved stuetemperatur. Der afsættes en stabil rødviolet udfældning på reaktionsstedet i membranen. Reaktionen afbrydes ved at vaske filtrene i vand, hvorefter de lufttørres .

20 Til visse forsøg anvendes 125I-protein G til iden tificering af positive plaquer. I så tilfælde inkuberes filtrene i 4 timer i en opløsning af TBS (TBST uden Tween-20) indeholdende 0,3 μΟϊ 12^I-protein G pr. ml efterfulgt af inkubation med anti-HSA-antistof og efterfølgende vask 25 som beskrevet ovenfor. Filtrene vaskes to gange i BTBS (TBS indeholdende 0,05% Brij 58) efterfulgt af to yderligere gange vask i TBS. Vask foretages med 10 minutters mellemrum under blid vugning ved stuetemperatur. Autoradiografi udføres som beskrevet ovenfor.

3 0 Trin 5. Plaoue-hvbridisering med oligonucleotiderne nr. 2. nr. 3. Ml οα M2

Rensede plaquer screenes med følgende oligonucleoti- der .*

Nr. 1: 5'-CCTCACTCTTGTGTGCATC-3' 35 Nr. 2: 5 ' -CCACTTCGGCAATGCAGTGGGATTTTTCCAACAGAGG-3 '

Nr. 3: 5'-CCCTCCTCGGCAAAGCAGG-3'

DK 175792 B1 I

Ml: 51 -GAAATAAAGGTTACCCACTTCAT-31 I

M2: 5'-CCCACTTCATTGTGCCAAAG-3' I

Sonde nr. 1 hybridiserer til 19 nucleotider svarende I

5 til de første seks aminosyrer i det modne HSA-protein. Sonde I

nr. 2 er komplementær med de nucleotider, der svarer til I

aminosyrerne nr. 281-292 i det modne HSA-protein, og ligger I

længere tilbage fra et enkelt Pstl-restriktionsendonuclease.- H

sted i HSA-cDNA-sekvensen. Sonde nr. 3 kan anvendes til I

10 påvisning af kloner, som omfatter nucleotider for aminosy- I

rerne nr. 565-571 i det modne HSA-protein. De ovennævnte H

tre oligonucleotider vælges, fordi der i disse regioner H

ikke findes nogen nucleotidvariationer i de offentliggjorte H

HSA-cDNA-sekvenser. I

15 Potentielle sonder screenes for mangel på sekvens- I

homologi med kendte sekvenser i Agtll-vektoren, og E.coli- H

DNA. Denne screening er nødvendig for at nedsætte antallet I

af uspecifikke hybridiseringssteder. På basis af denne ana- I

lyse må det forventes, at sonden M2 udviser et lavt bin- H

20 dingsniveau med vektorsekvenser. Eftersom M2-sonden omfatter H

nucleotider, der er komplementære med 10 baser længere til- H

bage fra ATG-startcodonet, må det forventes, at en hvilken H

som helst klon, der hybridiserer under yderst strenge betin- H

gelser, indeholder alle eller de fleste af de 10 baser og H

25 således hele HSA-kodningssekvensen. H

Eksempel 2 H

Kloning af humant serumalbumin-cDNA i M13mpl8 med henblik H

på sekvensanalvse H

30 Trin 1. Fremstilling af M13mpl8-kloningsvektor H

4 μg M13mpl8 (New England Bilolabs) replikativ form- H

DNA fordøjes fuldstændig med 40 enh. EcoRI i 50 μΐ højsalt- H

puffer ved 37°C i én time. Den fordøjede prøve opvarmes ved H

70°C i 5 min. for at inaktivere enzymet. Alkalisk kalveind- H

35 volds-phosphatase (CIAP, 1 enh.) tilsættes, og blandingen H

inkuberes ved 50°C i én time. Reaktionen afbrydes ved til- H

DK 175792 B1 23 sætning af 1/10 volumen 500 mM EGTA (pH 8) . CIAP inaktiveres ved opvarmning til 65°C i 45 min. Reaktionsblandingen eks-traheres med et lige så stort volumen TE-mættet phenol efterfulgt af ekstraktion med chloroform. Den lineariserede 5 M13mpl8 i den vandige fase fældes ved tilsætning af 3 voluminer 3 M natriumacetat/absolut ethanol-blanding = 1:30, vo/vo. Blandingen henstår ved -20°C natten over. DNA'en udvindes ved centrifugering i 15 min. ved 14.000 x G ved 4°C. Pelleten vakuumtørres og opløses atter i 100 μΐ TE.

10 Trin 2, Fremstilling af HSÅ-cDNA-indsats og liaaterino med M13mpl8-vektor A. Fremstilling af høi-titerpladelvsater

Rekombinante phager, der er positive over for antistofferne og oligonucleotid-screeninger som beskrevet i 15 eksempel 1, formeres til fremstilling af phag-DNA. Udstryg-ningsceller fremstilles fra en natgammel kultur af E.coli Y1088 i 40 ml LBM+AMP. Celler høstes ved centrifugering ved 3000 x G i 15 min. ved stuetemperatur, og pelleten suspenderes atter i 15-16 ml 10 mM MgSO^. Individuelle plaquer 20 fra LB-plader (fremstillet som beskrevet i eksempel 1) i form af agarpropper suspenderes i 0,1 ml E.coli Y1088-ud-strygningsceller. Efter henstand ved stuetemperatur i 10 min. tilsættes 2,5 ml LBM og 2,5 ml LB topagar ved 55°C. Blandingen holdes på forvarmede (42°C) LB-agarpiader. Efter 25 ca. 10 min. ved stuetemperatur vendes pladerne om og inkuberes ved 42°C natten over. Næste dag udvindes phagpartik-lerne ved at oversvømme pladerne med 3 ml SM. Der tilsættes én dråbe chloroform, og glasset omhvirvles. Indholdet centrifugeres ved 4000 x G i 10 min. for at fjerne cellerester.

30 Overfasen (høj-titerlysat) opbevares ved 4°C.

B. Titrering af høi-titerlvsat 1 μΐ og 10 μΐ alikvoter fra en 10"4-fortynding af høj-titerlysatet i SM blandes med 0,3 ml E.coli Y1088-ud-strygningsceller. Efter inkubation ved 37°C i 10 min. til-35 sættes 3 ml LB-topagar forvarmet ved 55°C. Blandingen hældes på LB-plader og inkuberes ved 42°C natten over. Antallet af

I DK 175792 B1 I

I I

I plaque-dannende enheder <pfu) pr. ml lysat noteres som titer. I

I C. Fremstilling af phag-DNA ved Piadelvsatmetoden I

Ca. 106 pfu udstryges som beskrevet ovenfor til ti- I

I trering med undtagelse af, at der anvendes 6 ml topagarose I

5 i en petriskål med diameter på 150 mm. Efter sammenflydende I

I lyse af udstrygningsbakterierne ekstraheres phagen fra top- I

I agarosen over i SM. Phag-DNA'en isoleres derpå fra overfasen I

I ved hjælp af Lambdasorb Phage Adsorbant (Promega Biotec, I

I Madison, WI) således som angivet af fabrikanten. I

I 10 D. Ligateringsreaktion med M13mpl8 I

I 4-5 jig HSA-Xgtll-rekombinant DNA fordøjes med 10 I

I enh. EcoRI i 30 μΐ højsaltpuffer i 3 timer ved 37°C. Efter I

I fordøjelse bearbejdes reaktionsblandingen yderligere som I

I beskrevet i trin 1. Hele blandingen ligateres ved hjælp af I

I 15 T4-ligase med det med EcoRI-CIAP behandlede M13mpl8. En I

H typisk ligateringsreaktionsblandingen (slutvolumen 10 μΐ) I

I indeholder 4-5 μg total DNA og 0,8 ^g M13mpl8 i 1 x ligate- I

I ringspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP I

I og 1 mM DTT, 5% (væ/vo) polyethylenglycol-8000) . Ligateringen I

20 udføres ved 15°C natten over ved anvendelse af 1-2 enh. T4- I

I DNA-ligase. I

I Trin 3. Transformering af kompetente celler I

I Alikvoter af ligateringsblandingen (1-5 μΐ) blandes I

I med 300 μΐ E.coli JM107-kompetente celler [Mandel m.fl., J. I

I 25 Mol. Biol. 53, 154 (1970)] eller 100 μΐ frosne E.coli ϋΗδαΡ'- I

I . kompetente celler (BRL) og holdes på is i 4 0 min. DNA-Ορ- I

I tagelsen igangsættes ved varmechok ved 42°C i 2 min. De I

I transformerede celler bringes derpå tilbage på is. En ud- I

I strygningsblanding indeholdende 200 μΐ frisk fremstillet I

I 30 E.coli JM107 i eksponentiel fase, 40 μΐ X-gal i 2% dimethyl- I

I formamid, 100 μΐ 10 mM IPTG og 3 ml H-topagar tilsættes ved I

55°C. Transformationsblandingen hældes på LB-agarplader. I

I Pladerne inkuberes natten over ved 37°C med henblik på I

H plaque-dannelse. I

i I

DK 175792 B1 25

Trin 4. Fremstilling af M13 ssDNA-skabeloner og DNA-sekvens-analvse

Farveløse plaquer indeholdende rekombinant M13-phag udtages og formeres i E.coli JM107 i 1,5 ml 2XYT ved 37°C i 5 5-6 timer under kraftig rystning. Efter formering centri fugeres kulturerne ved 14.000 x G i 1 min. for at skille cellerne fra overfasen. Cellepelleterne anvendes til fremstilling af den replikative dobbeltstrengede form af M13, medens overfaserne anvendes til isolering af enkeltstrengede 10 DNA-skabeloner. M13 ds RF isoleres ved hjælp af Birnboim og Doily's alkaliske^ lysemetode [Nuel. Acids Research 7, 1515 (1979)]. M13-ssDNA-skabeloner isoleres fra kulturoverfaserne ved hjælp af polyethylenglyeol-fældning og phenolekstrak-tion. Kort fortalt blandes 1 ml kulturoverfase med 200 μΐ 15 20%'s polyethylenglyeol-6000 i 2,5 M NaCl. Blandingen henstår ved stuetemperatur i 15 min., hvorefter M13-phag-partiklerne udvindes ved centrifugering ved 14.000 x G i 5 min. Phag-pel-leten resuspenderes i 100 μΐ TE efterfulgt af ekstraktion med puffermættet phenol. Den vandige fase, der indeholder 20 M13 ssDNA'en, blandes med 3 voluminer natriumacetat/ethanol- blanding. Efter afkøling ved -20°C natten over, udvindes DNA-udfældningen ved centrifugering ved 14.000 x G i 10 min. ved 4°C. Den tørrede DNA opløses i 50 μΐ TE, og 5 μΐ anvendes til sekvensbestemmelsesreaktion. DNA-sekvensbestem-25 melse udføres ved hjælp af dideoxynucleotid-kædeterminerings-metoden ifølge Sanger m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977). HSA 13's komplette sekvens er vist i tabel I.

Eksempel 3

30 Dannelse af PA0807N

pA0804-Plasmidet fås i en E.coli-vært fra Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, (deponeringsnr. NRRL B-18114) .

. pA0804 udvindes ved at isolere plasmid-DNA'en, fordøje med 35 EcoRI, gel-elektrophoresere for at udvinde fragmentet på ca. 7,5 Kb, som er lineært pA0804 skåret i det eneste EcoRI-

I DK 175792 B1 I

I I

I I

I sted. Plasmid pA0807N konstrueres, idet man går ud fra I

I pA0804, pBR322 og bakteriophag fl-DNA, på følgende måde. I

I Trin 1. Fremstilling af fl-ori-DNA I

I 50 μg f 1-bacteriophag-DNA fordøjes med 50 enh. Rsal I

I 5 og Dral ved 37°C i 4 timer i 200 μΐ MS-puffer for at frigøres I

I det ca. 458 bp store DNA-fragment, der indeholder fl-repli- I

I kationsudgangspunktet (ori). Fordøjelsesblandingen ekstra- I

I heres med et lige stort volumen phenol/chloroform (vo/vo) I

I efterfulgt af ekstraktion af det vandige lag med et lige så I

10 stort volumen chloroform, og endelig fældes DNA'en i den I

I vandige fase ved at justere NaCl-koncentrationen til 0,2 Μ I

og tilsætte 2,5 voluminer absolut ethanol. Blandingen henstår I

I på is (4°C) i 10 minutter, og den udfældede DNA opsamles I

ved centrifugering i 30 min. ved 10.000 x G i en mikrocen- I

I 15 trifuge ved 4°C. I

I DNA-pelleten vaskes 2 gange med 70% vandig ethanol. H

I Den vaskede pellet vakuumtørres og opløses i 25 μΐ TE-puffer. I

I Denne DNA elektrophoreseres på 1,5% agarosegel, og geldelen, H

I der indeholder det ca. 458 bp store fl-ori-fragment', udskæ- I

I 20 res, og DNA'en i gelen elektroelueres fra papiret i 500 μΐ I

I EDTA (pH 8,0). DNA-opløsningen ekstraheres med phenol/chlo- I

I roform som beskrevet detaljeret ovenfor, og DNA-udfældningen I

I opløses i 25 μΐ TE-puffer (fl-ori-fragment). I

I Trin 2. Cloning af fl-ori ind i oBR322's Dra I-steder I

I 25 2 /zg pBR322 fordøjes delvis med 2 enh. Dra I i 20 μΐ I

I MS-puffer ved 37°C i 10 min. Reaktionen afsluttes ved phe- I

nol/chloroform-ekstraktion efterfulgt af fældning af DNA I

I som forklaret detaljeret i trin 1 ovenfor. DNA-pelleten I

opløses i 20 μΐ TE-puffer. Ca. 100 ng af denne DNA ligeres I

I 30 med 100 ng fl-ori-fragment (trin 1) i 20 μΐ ligateringspuffer I

ved inkubering ved 14°C natten over med 1 enh. T4-DNA-ligase. I

I Ligateringen afsluttes ved opvarmning til 70°C i 10 minutter, I

I og produktet anvendes til at transformere E.coli-stammen I

I YMC9 (Maniatis m.fl.) for at opnå pBRfl-ori, som indeholder H

35 fl-ori klonet ind i Dra I-stederne (nucleotidstillinger H

I 3232 og 3251) i pBR322. I

DK 175792 B1 27

Trin 3. Dannelse a£ t>AQ807.

10 /xg pBRfl-ori fordøjes i 4 timer ved 37°C med 10 enh. Pst I og 10 enh. Nde I. Den fordøjede DNA ekstraheres med phenol/chloroform, fældes og opløses i 25 μΐ TE-puffer 5 som beskrevet i trin 1 ovenfor. Dette materiale elektropho-reseres på en 1,2% agarose-gel, og Nde I - Pst I-fragmentet (ca. 0,8 kb) indeholdende fl-ori isoleres og opløses i 20 μΐ TE-puffer som beskrevet i trin 1 ovenfor. Ca. 100 ng af denne DNA blandes med 100 ng pAO804, som er blevet fordøjet 10 med Pst I og Nde I og phosphatase-behandlet. Denne blanding ligeres i 20 , μΐ ligateringspuffer ved inkubation natten over ved 14 °C med 1 enh. T4-DNA-ligase. Ligateringsreaktionen afsluttes ved opvarmning ved 70°C i 10 min. Denne DNA anvendes til at transformere E.coli-stammen YMC9, så at der fås 15 pAO807.

Trin 4, Omdannelse af de to BolII-steder i pAo807 til

NotI-steder til dannelse af PA08Q7N

10 μg pAO807 fordøjes med 10 enh. Bglll i 4 timer ved 37°C i 50 μΐ HS-puffer. De klæbrige BGlII-ender udfyldes 2 0 ved at inkubere 10 μg med Bglll spaltet DNA i 50 μΐ NT-puffer med 5 enh. Klenow-fragment af DNA-polymerase ved stuetemperatur i 30 min. Denne blanding ekstraheres med phenol/chlo-roform, og DNA'en udvindes som beskrevet i trin 1 ovenfor. DNA-pelleten opløses i 25 μΐ TE-puffer. Denne DNA blandes 25 med 50 ng (1 μΐ) phosphoryleret Notl-forbindelsesstykke (pGCGGCCGC) , der fås hos New England Biolabs, 40 μΐ 5 x ligateringspuffer, . 129 μΐ vand og 5 enh. T4 DNA-ligase.

Denne blanding inkuberes natten over ved 14°C. Ligateringen afsluttes ved opvarmning til 70°C i 10 min. Herefter fordøjes 30 ligateringsblandingen med 10 enh. NotI, efter at opløsningen er justeret til HS-puffer-betingelser. DNA'en fældes efter phenol/chloroform-ekstraktion som beskrevet i trin 1 ovenfor. Bundfaldet opløses i 50 μΐ TE-puffer og elektrophoreseres på en 0,9% agarosegel. DNA-fragmenterne (nederste bånd svarer 35 til migreringsstillingen af det fragment, der indeholder pBR322-delen og fl-ori, og det øverste bånd svarer til den

I DK 175792 B1 I

I 28 I

I øvrige del af pAO807, dvs. 5Ά0Χ1, 3 Ά0Χ1 og HIS4) isoleres I

I fra gelen ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i I

trin 1 ovenfor. De gel-rensede DNA-fragmenter opløses i 10 I

μΐ TE-puffer. DNA-fragmentet, der repræsenterer den lineære I

I 5 stedsspecifikke integrative vektor, phosphatasebehandles I

I ved inkubation i 30 min. med 2 enh. CIAP ved 37°C i 200 μΐ I

I phosphatase-puffer. Den phosphasebehandlede DNA ekstraheres I

I med phenol/chloroform og fældes som beskrevet i trin 1. I

I Denne DNA blandes med det øverste bånd-DNA, der repræsenterer I

I 10 resten af pAO807-plasmidet (se ovenfor) , og ligeres natten I

I over ved 4°C med 5 enh. T4 DNA-ligase i 30 μΐ ligaterings- I

I puffer. Ligateringsblandingen opvarmes i 10 min. ved 70°C, I

I afkøles på is, og der anvendes en 10 μΐ alikvot til at trans- I

I formere E.coli YMC9, så at der fås pA0807N. pAO807N’s struk- I

15 tur ses i fig. 3. I

I Eksempel 4 I

I Konstruktion af Pichia pastoris HSA-ekspressionsvektorer I

I Trin l. Udvinding af HSA-fragment I

I 20 HSA-genet svarende til ca. 2,0 kb frigøres fra den I

H mpl8-HSA13 replikative form af DNA (jfr. eksempel 2) ved I

I EcoRI-fordøj else. Ca. 1 jig plasmid mpl8-HSA13 fordøjes ved I

H ; 37°C i 2 timer med 5 enh. EcoRI i 20 μΐ HS-puffer. Reaktionen I

I afsluttes ved at fortynde til 50 μΐ med d^O, og reaktions- I

25 blandingen ekstraheres straks med phenol/chloroform og fældes I

som forklaret i eksempel 3's trin 1. DNA-bundfaldet opløses I

i 10μ1 vand og opbevares ved -20°C til senere brug. HSA- I

genet indsættes i vektorerne pTHFKA og pAO807N i deres EcoRI- I

steder, så at der fås Pichia pastoris HSA ekspressionspias- I

I 30 miderne pHSA13 og pHSA113 I

I Trin 2. Vektormanipulationer til indsættelse i HSA- I

gen I

I Ca. 10 μg af hver af pTHFKA (fig. 4) og pAO807N for- I

I døjes med 10 enh. EcoRI i 100 μΐ HS-puffer i 16 timer ved I

I 35 37°ΰ. Reaktionsblandingen justeres til alkaliske phosphatase- I

pufferbetingelser og behandles med 10 enh. CIAP i 200 μΐ I

DK 175792 B1 29 reaktionsvolumen i 30 min. ved 37 °C. Phosphatasebehandlingen afsluttes ved phenol/chloroform-ekstraktion, og DNAerne fældes og opløses i TE-puffer ved en slutkoncentration på 100 ^g/ml som forklaret i eksempel 3's trin 1.

5 Trin 3. Indsættelse af HSA-gen i ekspressionsvektorer

Ca. 100 ng af hver af de med EcoRI skårne og CIAP behandlede vektorer pTHFKA og pAO807N (eksempel 4's trin 2) blandes med ca. 100 ng hver af med EcoRI fordøjet mpl8-HSA13 (eksempel 4's trin 1) i 20 μΐ ligateringspuffer og ligeres 10 med 2 enh. T4 DNA-ligase ved 4° C i IS timer. Liga teringen afsluttes .ved opvarmning til 70°C i 10 min. og anvendes.til at transformere E.coli stamme DG75' til opnåelse af plas-miderne pHSA13 og pHSA113.

15 Eksempel 5

Transformering af Pichia pastoris med PHSA113 oa PHSA13 Trin 1. pHSA113-vektorfremstillina

Ca. 20 μg pHSA113 fordøjes i 18 timer ved 37°C i 200 μΐ HS-puffer med 50 enh. Notl. Ca. 20μ1 af denne blanding 20 anvendes direkte til transformering af Pichia pastoris GS115 (his4), der er deponeret hos Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, de-poneringsnr. NRRL Y-15851. De øvrige ca. 180 μΐ af det med Notl spaltede pHSA113 ekstraheres med phenol/chloroform og 25 fældes som beskrevet i eksempel 3's trin 1. DNA-bundfaldet opløses i 20 μΐ CaS-opløsning og anvendes ligeledes til transformering af GS115. Det med Notl spaltede pHSA113 kan integrere i et Pichia-sted. Da Notl-fragmentformen af pHSA113 også bærer Pichias histidinol-dehydrogenase-gen, kan de 30 opnåede transformanter let udvælges på basis af His+-phæno-typen.

Pichia-stamme KM71 (his4, aoxl:ARG4) transformeres til His+ med 10 μg pHSA13. Foruden HIS4 bærer dette plasmid en autonomt replikerende sekvens ARSI. Den kan replikere i 35 Pichia i den autonome form. Sådanne transformanter vil blive omtalt som "autonome transformanter". Grunden til anvendelse I DK 175792 B1

I 30 I

B af denne stamme er, at KM71 er "methanol-slow" på grund af I

I afbrydelsen i AOX1 af ARG4 og har vist sig at udtrykke højere I

I niveauer af β-galactosidase, når lacZ anbringes under kontrol I

I af AOXl-promotoren, end den methanol-normale stamme GS115. I

B 5 Af hensyn til negativ kontrol transformeres KM71 også med I

B pYJ30, NRRL B-15890, et plasmid, der også indeholder His4. I

B Trin 2. Celledvrkninq I

B Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inokuleres i I

B ca. 10 ml YPD-medium og rystedyrkes ved 30°C i 12-20 timer. I

B 10 100 ml YPD-medium inokuleres med podekultur, så at der fås I

B en ODgoo ca· °»°01· Mediet dyrkes i en rystekolbe ved I

B : 30°C i ca. 12-20 timer. Kulturen høstes, når OD6qq er ca. I

B 0,2-0,3 (efter ca. 16-20 timer) ved centrifugering ved 1500 I

B x G i 5 min. ved hjælp af en Sorvall RC5C. I

B 15 Trin 3. Fremstilling af sfæroblaster I

I Cellerne vaskes én gang i 10 ml sterilt vand og een- I

I trifugeres derpå ved 1500 x G i 5 min. (Centrifugering fo- I

I retages efter hver cellevask ved 1500 x G i 5 min. ved hjælp I

af en Sorvall RT6000B, medmindre andet er anført). Cellerne I

20 vaskes derpå én gang i 10 ml frisk fremstillet SED, én gang I

i 10 ml steril 1 M sorbitol og resuspenderes til sidst i 10 I

I ml SCE-puffer. 7,5 μΐ 3 mg/ml Zymolyse-opløsning (100.000 I

enh./g fra Miles Laboratories) sættes til celleopløsningen. I

Derpå inkuberes cellerne ved 30°C i ca. 10 min. (En reduktion I

25 på 60% i ODgoo kan anvendes som markør for korrekt tid og I

koncentration). Sfæroblasterne vaskes én gang i 10 ml steril I

Η 1 M sorbitol ved .centrifugering ved 700 x G i 5-10 min. I

; (Tidsrummet og hastigheden for centrifugeringen kan variere; I

H der skal centrifugeres tilstrækkeligt til, at sfærebiasterne I

30 pelleteres, men ikke så meget, at de itubrydes på grund af I

H kraften). 10 ml sterilt CaS anvendes til en endelig cel- I

levask, og cellerne centrifugeres igen ved 700 x G i 5-10 I

min. og resuspenderes i 0,6 ml CaS. I

Trin 4. Transformation I

35 GS115-celler transformeres med 10 /^g af de lineære I

H HSA-vektorer ved hjælp af Sreekrishna m.fl.'s sfæroblast- I

DK 175792 B1 31 transformationsteknik [Gene 59, 115-125 (1987)]. Der tilsættes DNA-prøver op til et volumen på 20 μΐ) til 12 x 75 mm sterile polypropylenglas. (DNA bør befinde sig i en passende puffer, såsom TE-puffer). Der sættes 100 μΐ sfæroblaster 5 til hver DNA-prøve, og der inkuberes ved stuetemperatur i ca. 20 min. Der sættes 1 ml PEG-opløsning til hver prøve og inkuberes ved stuetemperatur i ca. 15 min. og centrifugeres ved 700 x G i 5-10 min. 150 μΐ SOS sættes til pelleten, og der inkuberes i 30 min. ved stuetemperatur. Endelig tilsættes 10 850 μΐ 1 M sorbitol.

Trin 5. Regenerering af sfæroblaster Et bundlag agar på 20 ml regenereringsagar SDR udhældes pr. plade mindst 30 min., før transformationsprøver er parate. Desuden fordeles 8 ml alikvoter regenerationsagar 15 i 15 ml Corning-glas med konisk bund i et bad på 45°C i det tidsrum, hvor transformationsprøver er i SOS. Alikvoter på 50, 250 eller 800 μΐ af den transformerede prøve sættes til 8 ml-alikvoter af smeltet regenerationsagar, der holdes ved 45°C, og hældes på plader, der indeholder det faste 20 ml 20 agarbundlag. Pladerne inkuberes ved 30°C i 3-5 dage.

Trin 6. Udvælgelse af transformanter Transformanter udvælges til et medium uden histidin ved dyrkning på SDR. Kulturer, der vokser uden histidin, screenes yderligere for "methanol slow"-phænotypen (der 25 viser stedselektiv integration). De transformerede GS115-celler, der viser tegn på begge phænotyper, dyrkes og afprøves for produktion af HSA.

Eksempel 6 30 Methanolinduceret ekspression af HSA i autonome GS115/-PHSA13-transformanter KM71-stammer transformeret med plasmid pHSA13 og KM71 transformeret med pYJ30 som negativ kontrol dyrkes i 10 ml-kulturer på MGY til. en optisk densitet på 8,00 ved 600 nm 35 og skiftes derpå til MM-medium. Efter inkubation på MM i 3 dage høstes cellerne ved centifugering, og mediets overfase

I DK 175792 B1 I

I I

justeres til 1 mM phenylmethylsulf onylf luorid (PMSF) og I

opbevares frosset til HSA-analyse (overfase M) . Cellerne I

suspenderes i 500 μΐ itubrydningspuffer indeholdende 1 mM I

PMSF og omhvirvles kraftigt med glasperler i ialt 4 min. I

5 med mellemrum på is. Herefter centrifugeres prøverne i en I

mikrocentrifuge ved 10.000 x G i 10 min. ved 4°C, og den

klare overfase-opløsning adskilles fra pelleten og betegnes I

I overfase I. Pelleten ekstraheres med 500 μΐ itubrydningspuf- I

fer indeholdende 6 M urinstof, og denne ekstrakt betegnes I

10 overfase II. De forskellige overfaser analyseres for HSA I

ved hjælp af PAGE-immunaftryk som beskrevet i Methods in I

Enzymology, bd. 152 (1987), "Guide to Molecular Cloning I

Techniques", samt ved kvantitativ HSA-ELISA. HSA-ELISA-me- I

toden, der er udviklet til dette formål, er anført i eksempel I

I 15 8. Overfase I indeholder det højeste HSA-niveau i sammenlig- I

ning med andre fraktioner bestemt ved HSA-ELISA (tabel III) I

H (HSA forekommer overvejende i den opløselige fraktion bestemt I

ved PAGE-elektroimmunaftryk). I

I 20 TABEL III I

I HSA-Koncentration i overfase I fremstillet af KM71-transfor- I

I manter H

I ' Transformant nq HSA/ma protein HSA % I

I KM7l/pYJ30-l <1 <0,0001 I

25 KM71/pHSAl3-1 8914 .0,89 I

I KM7l/pHSA13-2 15777 1,6 I

I . KM7l/pHSA13-4 5648 0,56 I

KM71/pHSAl3-6 88885 8,9 I

I Eksempel 7 I

I 30 Methanol-reguleret ekspression af HSA i integrative GS115/- I

I PHSA113-transformanter I

I Flere tusinde His+-transformanter af GS115, der fås I

I ved hjælp af med NotI spaltet pHSAl13, kombineres, og en I

I alikvot inokuleres i 10 ml MGY og dyrkes til mætning. På I

I ’ 35 dette tidspunkt skiftes cellerne til MM og inkuberes ved I

I 30°C i en ryster. Efter 2 dage på MM høstes cellerne, og 33 DK 175792 B1 overfase I fremstilles og analyseres for HSA-ekspression som beskrevet i eksempel 6. HSA's ekspressionsniveau er ca. 0,1% opløseligt protein.

Den kombinerede His+-transformant screenes ligeledes 5 for "methanol slow"-transformanter ved dobbelt udstrygning af kolonier på MD-plader over på MM-plader. Flere "methanol slow" His+-transformanter dyrkes på MGY og skiftes til MM.

Der fremstilles celleekstrakter, der analyseres for HSA-ekspressionsniveauer som beskrevet i eksempel 6. Der påvises 10 HSA-niveauer op til 20 mg/1 eller 2% af totalt opløseligt cellulært protein.

Eksempel 8 HSA-ELISA

15 50 μΐ 1:500 gede-anti-HSA-antistoffer i Na2CC>3/NaC03- puffer, pH 9,5, anbringes i fordybningerne i ELISA-plader med 96 fordybninger (Corning) og inkuberes i én time ved 37°C. De vaskes to gange med.TBST, to gange med dH20, 200 μΐ blotto-puffer sættes til hver, og de inkuberes derpå 20 natten over ved 37°C. Efter inkubation vaskes de igen tre gange med TBST og to gange med dH20, og der sættes 50 μΐ prøve til hver (HSA-stamopløsning = 5 x 107 ng/ml; standardopløsninger = 2-14 ng/ml) . Prøverne roteres i 2 timer ved stuetemperatur, vaskes derpå 5 gange med TBST og to gange 25 med dH20, og der tilsættes 50 μΐ af en 1:2000-fortynding af peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-HSA-antistof fer (Cooper Biomedical, Inc.) i blotto-puffer (5 μ1/10 ml). Pladerne rystes igen i én time ved stuetemperatur, vaskes derpå tre gange med TBST og tre gange med dH20, og der til-30 sættes 100 μΐ ABTS (ABTS-peroxidase-substrat-opløsning, Kirkegaard and Perry Labs., Inc.) opvarmet til stuetemperatur. Endelig rystes prøverne i 20 min. ved stuetemperatur, der sættes 100 μΐ 2% oxalsyre til hver for at afbryde reaktionen, og absorbansen aflæses ved 405 nm.

35

Claims (4)

1. Vektoren pHSA13 (fig. 5), der omfatter: I (a) en ekspressionskassette indeholdende strukturelt I 5 gen for HSA operationsmæssigt forbundet til 5'-AOXl-regule- I ringsregionen og 3’-termineringssekvensen af A0X1 isoleret I I fra Pichia pastoris, I I (b) HIS4-genet isoleret fra Pichia pastoris og I I (c) et DNA-fragment, som er en ca. 0,190 kilobase I I 10 sekvens af en autonomt replikerende DNA-sekvens. I

2. Pichia pastoris-stamme GS115 (NRRL Y-15851) trans- I formeret med vektoren ifølge krav 1 (pHSA13). I

3. Vektoren pHSAH3 (fig. 2), der omfatter: I I (a) et første indsætteligt DNA-fragment, som er en I 15 operationsmæssig 5'-regulerende region af AOXl-genet med en I længde på ca. 1 kilobase isoleret fra Pichia pastoris opera- I tionsmæssigt forbundet til I (b) et strukturelt gen for HSA operationsmæssigt I I forbundet til H I 20 (c) 3'-termineringssekvensen af AOX1 isoleret fra I Pichia pastoris forbundet til I (d) et markørgen, som er HIS4-genet isoleret fra I I Pichia pastoris forbundet til I (e) et andet indsætteligt DNA-fragment, som er ca. I I 25 0,65 kilobaser af 3'-A0X1-termineringssekvensen isoleret I I fra Pichia pastoris. I

4. Pichia pastoris-stamme GS115 (NRRL Y-15851) trans- I I formeret med vektoren ifølge krav 3. I I H