JPS60155128A - 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 - Google Patents
膜結合性タンパク質を含有するワクチン類Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は膜結合型タンパク質とその誘導体、およびそれ
らから得られるワクチン類に関する。
らから得られるワクチン類に関する。
発明の背景
種々の感染源に対する免疫応答の解析は、重要な細胞表
面抗原を分離できるに足る充分量の病原体を培養するこ
とがしばしば困難である事実から限度があった。分子ク
ローニング法の出現によって、病原体からの遺伝子生成
物を非病原型で事実上量的に無限齋こ発現できる手段が
提供され、これらの限界が克服されるようになった。現
在ではインフルエンザ（１）、口締病（２）、肝炎（３
）、小水電性口内炎ウィルス（４）、狂犬病（５）、お
よび単純ヘルペスウィルス（６）のようなウィルスから
の表面抗原がＥ、ｃｏｌｉおよびＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅにおいて発現され、将来、改良されたサブユニット
ワクチンの提供を約束している。然し、下等微生物にお
ける表面抗原の発現は、不完全なプロセシングのために
（例えば、タンパク質分解、糖付加）、またはクローン
した遺伝子産物を精製する間の変性により、恐らく重要
な意味のある抗原決定基を失うかも知れないという理由
で満足すべきものであるとは言い難いことは明らかであ
る。
面抗原を分離できるに足る充分量の病原体を培養するこ
とがしばしば困難である事実から限度があった。分子ク
ローニング法の出現によって、病原体からの遺伝子生成
物を非病原型で事実上量的に無限齋こ発現できる手段が
提供され、これらの限界が克服されるようになった。現
在ではインフルエンザ（１）、口締病（２）、肝炎（３
）、小水電性口内炎ウィルス（４）、狂犬病（５）、お
よび単純ヘルペスウィルス（６）のようなウィルスから
の表面抗原がＥ、ｃｏｌｉおよびＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅにおいて発現され、将来、改良されたサブユニット
ワクチンの提供を約束している。然し、下等微生物にお
ける表面抗原の発現は、不完全なプロセシングのために
（例えば、タンパク質分解、糖付加）、またはクローン
した遺伝子産物を精製する間の変性により、恐らく重要
な意味のある抗原決定基を失うかも知れないという理由
で満足すべきものであるとは言い難いことは明らかであ
る。
このことは、膜タンパク質の場合は、Ｅ−ｃｏｌｉ中で
発現された時に、それが疎水性の膜透過領域のだめに、
凝集し、不溶性となり勝ちであるので特にそうである。
発現された時に、それが疎水性の膜透過領域のだめに、
凝集し、不溶性となり勝ちであるので特にそうである。
膜タンパク質を暗号化したクローン遺伝子は、哺乳動物
細胞中で発現させることができ、この場合、この宿主細
胞が適宜プロセスし、ポリペプチドを組み合わせ、細胞
膜内に取り込むのに必要な因子を提供する（７．８）。
細胞中で発現させることができ、この場合、この宿主細
胞が適宜プロセスし、ポリペプチドを組み合わせ、細胞
膜内に取り込むのに必要な因子を提供する（７．８）。
これらの研究により、膜タンパク質を組み換え宿主細胞
表面で発現できることがわかったし、また例えば先端を
切り取られたカルボキシル末端領域を欠く膜タンパク質
は宿主細胞と結合するより、むしろ徐々にそこから分泌
されることが報告されているが（８）、このように発現
される膜結合タンパク質や、このように分泌される先端
を切り取られたタンパク質が、該タンパク質のソースと
なった病原体に対して有効な抗体を実際に生成せしめる
働きがあるのかは明らかにされていない。
表面で発現できることがわかったし、また例えば先端を
切り取られたカルボキシル末端領域を欠く膜タンパク質
は宿主細胞と結合するより、むしろ徐々にそこから分泌
されることが報告されているが（８）、このように発現
される膜結合タンパク質や、このように分泌される先端
を切り取られたタンパク質が、該タンパク質のソースと
なった病原体に対して有効な抗体を実際に生成せしめる
働きがあるのかは明らかにされていない。
単純ヘルペスウィルス（Ｈ８Ｖ）は、関連性ハあるが区
別できる二つの型でヒト感染症に見出される巨大ＤＮＡ
ウィルスである。ウィルスが暗号化している多数のタン
パク質のうちの少なくとも４個が、グリコジル化した形
で発見され、それらがウィルス粒子（ピリオン）および
感染細胞の両表面に存在していることが明らかにされた
（９）。
別できる二つの型でヒト感染症に見出される巨大ＤＮＡ
ウィルスである。ウィルスが暗号化している多数のタン
パク質のうちの少なくとも４個が、グリコジル化した形
で発見され、それらがウィルス粒子（ピリオン）および
感染細胞の両表面に存在していることが明らかにされた
（９）。
ｇｌＶＢ、 ｇ（：、 ｇＤ、およびｇＥ と呼ばれる
これらの糖タンパク質はＨ５ＶＩ型（ｔｔｓｖ−１）お
よびＨ８Ｖ２型（Ｈ８Ｖ−２）の双方に見出されるが、
Ｈ５Ｖ−２の場合は、更にもう１個の糖タンパク質（ｇ
Ｆ）が発見されたと報告されていル（１０１゜それらの
機能についてはな詔幾つか不明の点が残されているが、
それらの糖タンパク質が、ウィルスの細胞への付着、細
胞融合、およびウィルス感染に対する宿主の免疫学的応
答に関与していることは間違いなイ（１１）。１１ Ｓ
Ｖ −１トＨＳ Ｖ −２ｉｎｋ ５０％までのＤＮ
Ａ配列相同性しか示さないがａｚ５それらの糖タンパク
質の大部分は両型に共通しているようである。このよう
に、ｇＡ／Ｂ、ｇＤ、およびｇＥは型に共通した多くの
抗原決定基を示すが（１３〜１６つ、以前には完全に型
特異性がある・と思われていたｇＧ（１７，１８）も幾
つかの型共通性の決定基を有することが明らかになって
来た。然しなから、幾つかの糖タンパク質に対する単ク
ローン性抗体を使用して、型特異性のある抗原決定基を
証明でき（１０，１９）、Ｈ５Ｖ−１と）ＩＳＶ−２に
分れて以来、ある種のアミノ酸変化が起こったことを物
語っている。
これらの糖タンパク質はＨ５ＶＩ型（ｔｔｓｖ−１）お
よびＨ８Ｖ２型（Ｈ８Ｖ−２）の双方に見出されるが、
Ｈ５Ｖ−２の場合は、更にもう１個の糖タンパク質（ｇ
Ｆ）が発見されたと報告されていル（１０１゜それらの
機能についてはな詔幾つか不明の点が残されているが、
それらの糖タンパク質が、ウィルスの細胞への付着、細
胞融合、およびウィルス感染に対する宿主の免疫学的応
答に関与していることは間違いなイ（１１）。１１ Ｓ
Ｖ −１トＨＳ Ｖ −２ｉｎｋ ５０％までのＤＮ
Ａ配列相同性しか示さないがａｚ５それらの糖タンパク
質の大部分は両型に共通しているようである。このよう
に、ｇＡ／Ｂ、ｇＤ、およびｇＥは型に共通した多くの
抗原決定基を示すが（１３〜１６つ、以前には完全に型
特異性がある・と思われていたｇＧ（１７，１８）も幾
つかの型共通性の決定基を有することが明らかになって
来た。然しなから、幾つかの糖タンパク質に対する単ク
ローン性抗体を使用して、型特異性のある抗原決定基を
証明でき（１０，１９）、Ｈ５Ｖ−１と）ＩＳＶ−２に
分れて以来、ある種のアミノ酸変化が起こったことを物
語っている。
ウィルス中和に関して最も重要な糖タンパク質の一つは
ｇＤであるＱｌ）。Ｈ５Ｖ−１とＨＳ Ｖ’ −２のそ
れぞれのｇＤタンパク質が近縁であることを強く示唆す
る注目すべき証櫨が提示されている。
ｇＤであるＱｌ）。Ｈ５Ｖ−１とＨＳ Ｖ’ −２のそ
れぞれのｇＤタンパク質が近縁であることを強く示唆す
る注目すべき証櫨が提示されている。
例えば、遺伝子組み換え地図を作ると、対応する遺伝子
が二つのウィルスのゲノムの共直線領域ニつきとめられ
る。アミノ酸分析の結果は二つのタンパク質問に総体的
な相同性が有ることを示した。
が二つのウィルスのゲノムの共直線領域ニつきとめられ
る。アミノ酸分析の結果は二つのタンパク質問に総体的
な相同性が有ることを示した。
ｇＤタンパク質は１型および２型の両ウィルスに対し型
共通性の型式・で中和抗体を誘導する（１９−２１）。
共通性の型式・で中和抗体を誘導する（１９−２１）。
更に、これらの糖タンパク質に対して生じるモノクロー
ナル抗体の大部分は型共通性゛であり、同様に二つの糖
タンパク質の型の間の高度な構造的相関性を示している
■。然し、幾つかの単クローン性（モノクローナル）抗
体は型特異的に反応することが知られており、両タンノ
４り質の間に有意の差のあることを示したＥｌ！、同様
に、タンパク質のペプチド地図も不明瞭ではあ□る力≦
そのような違いを示した（２２ａ）。これらの結果は、
これらのポリペプチドが相関していることを示唆しそい
るが、その関係がどの程度近縁であるかを正確に示すに
は不充分である。
ナル抗体の大部分は型共通性゛であり、同様に二つの糖
タンパク質の型の間の高度な構造的相関性を示している
■。然し、幾つかの単クローン性（モノクローナル）抗
体は型特異的に反応することが知られており、両タンノ
４り質の間に有意の差のあることを示したＥｌ！、同様
に、タンパク質のペプチド地図も不明瞭ではあ□る力≦
そのような違いを示した（２２ａ）。これらの結果は、
これらのポリペプチドが相関していることを示唆しそい
るが、その関係がどの程度近縁であるかを正確に示すに
は不充分である。
）１’５Ｖ−１とＨ５Ｖ−２のｇＩ）’タフバク質０型
共通性の特徴を検討するため、Ｈ５Ｖ−１とＨ５Ｖ−′
２のｇＤ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。誘導されたア
ミノ酸配列は近似性を示した。また、その結果生じたタ
ンパク質配列についても、タンパク値の疎水性領域と親
水性領域を測定すべく設計されたプログラムを使用する
ことにより、構造的な相違を解析した。この解析の結果
からシ総体的構造水準は高度に維持されていること力Ｓ
明ら力）にされた。二つの糖タンパク質の藺に□数ケ所
のす□ミノ置換が見られた□が、これらの置換のＧｉと
んど大部分はコンサーパテイブであり、この糖タンノく
り質がウィルスの構造上重要な必要条件であることを示
していた。
共通性の特徴を検討するため、Ｈ５Ｖ−１とＨ５Ｖ−′
２のｇＤ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。誘導されたア
ミノ酸配列は近似性を示した。また、その結果生じたタ
ンパク質配列についても、タンパク値の疎水性領域と親
水性領域を測定すべく設計されたプログラムを使用する
ことにより、構造的な相違を解析した。この解析の結果
からシ総体的構造水準は高度に維持されていること力Ｓ
明ら力）にされた。二つの糖タンパク質の藺に□数ケ所
のす□ミノ置換が見られた□が、これらの置換のＧｉと
んど大部分はコンサーパテイブであり、この糖タンノく
り質がウィルスの構造上重要な必要条件であることを示
していた。
Ｈ８Ｖ−１と対照的に、ＨＳ Ｖ −２ハｇ Ｆと呼ば
れるも□う１個の糖タンパク質を暗号化しているようで
ある（２２ｂ、１０．２２Ｃ１２２ｄ）、Ｈ３Ｖ−２ｇ
Ｆは電気泳動によってＨ３Ｖ−１ｇＧよりはるかに速く
移動するが、組み換え体ウィルスのマツピング研究にエ
リ、このタンパク質はＨＳ Ｖ −２ゲノムのＨ５Ｖ−
１８Ｇのための遺伝子吉はぼ共直線的な領域で暗号化さ
れていることが明らかになった（２２Ｃ１２２ｄ）。更
に最近、ＩＩＳ Ｖ −２ｇＦの単゛クローン性抗体が
弱いながらもＨＳ Ｖ −１ｇＣと交叉反応するらしい
ということ（２２す、およびｔ−ｔｓｖ−１ウィルス粒
子のエンベローブタ ゛タンパク質の間に構造上の相同
性の可能性があることが示唆された。このように、Ｈ５
Ｖ−１ｇＣ：との相同性（４Ｈ５Ｖ ’−□２タンパク
質である可能性がある。この関係は本発明において検討
された。
れるも□う１個の糖タンパク質を暗号化しているようで
ある（２２ｂ、１０．２２Ｃ１２２ｄ）、Ｈ３Ｖ−２ｇ
Ｆは電気泳動によってＨ３Ｖ−１ｇＧよりはるかに速く
移動するが、組み換え体ウィルスのマツピング研究にエ
リ、このタンパク質はＨＳ Ｖ −２ゲノムのＨ５Ｖ−
１８Ｇのための遺伝子吉はぼ共直線的な領域で暗号化さ
れていることが明らかになった（２２Ｃ１２２ｄ）。更
に最近、ＩＩＳ Ｖ −２ｇＦの単゛クローン性抗体が
弱いながらもＨＳ Ｖ −１ｇＣと交叉反応するらしい
ということ（２２す、およびｔ−ｔｓｖ−１ウィルス粒
子のエンベローブタ ゛タンパク質の間に構造上の相同
性の可能性があることが示唆された。このように、Ｈ５
Ｖ−１ｇＣ：との相同性（４Ｈ５Ｖ ’−□２タンパク
質である可能性がある。この関係は本発明において検討
された。
’Ｈ８Ｖ−１とＨ８Ｖ−２の間の相関性を検討すルタメ
、ＨＳ Ｖ ２ ’ｆ ／ ム（Ｄ ２．２９ ｋ ｂ
（４Ｃ１ヘース）領域のＤＮＡ配列が１−１−１ｓＶ
−１：遺伝子と共直線的であることを測定した。この領
域の犬−オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒ
ｅａｄｉ −ｎｇ ｆｒａｍｅ）の翻訳により、Ｉ−Ｉ
Ｓ Ｖ −１ｇＧと有意な相同性を有するタンパク質
がこの領域に暗号化されていることがわかる。この領域
がＨ３Ｖ−２ｇ Ｆ遺伝子を暗号化していること、およ
びｇＦタンパク質はＩ−Ｉ Ｓ Ｖ −１糖タンパク質
ＣのＩ−Ｉ Ｓ Ｖ −２相同体であることが示唆され
る。
、ＨＳ Ｖ ２ ’ｆ ／ ム（Ｄ ２．２９ ｋ ｂ
（４Ｃ１ヘース）領域のＤＮＡ配列が１−１−１ｓＶ
−１：遺伝子と共直線的であることを測定した。この領
域の犬−オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒ
ｅａｄｉ −ｎｇ ｆｒａｍｅ）の翻訳により、Ｉ−Ｉ
Ｓ Ｖ −１ｇＧと有意な相同性を有するタンパク質
がこの領域に暗号化されていることがわかる。この領域
がＨ３Ｖ−２ｇ Ｆ遺伝子を暗号化していること、およ
びｇＦタンパク質はＩ−Ｉ Ｓ Ｖ −１糖タンパク質
ＣのＩ−Ｉ Ｓ Ｖ −２相同体であることが示唆され
る。
発明の要旨
本発明は、ｇＤタンパク質に基づくワクチンに細
関する。本命開戸において更に詳細に記載するように、
ｇＤタンパク質の構造に関するこの知見に照らして、に
Ｄタンパク質ＤＮＡを哺乳動物細胞に発現させることが
可能であるかどうか、またもし可能とすれば発現された
タンパク質が宿主の細胞膜に結合するのかどうか、また
先端を切り取られ膜結合領域を欠いた形のタンパク質が
宿主細胞から分泌されるのかどうか、またその場合、発
現した生成体タンパク質がＨ５Ｖ−１および／またはＩ
（Ｓ Ｖ −２に対する抗体を生成するかどうかを調べ
ることにした。本発明で検討の結果、これらの目標は達
成された。特に、本発明は組み換えＤＮＡ操作によって
得られたこれらのタンパク質を、Ｈ８Ｖ−１およびＨＳ
Ｖ −２ウイルスに有効なワクチンの構成成分として
使用する方法を提供するものである。このようにして製
造されたワクチンはヘルペス（＠疹）感染の発生を予防
し、また既に感染した患者のヘルペス感染の再発の頻度
と重篤度を低下させる防御ワクチンである。
ｇＤタンパク質の構造に関するこの知見に照らして、に
Ｄタンパク質ＤＮＡを哺乳動物細胞に発現させることが
可能であるかどうか、またもし可能とすれば発現された
タンパク質が宿主の細胞膜に結合するのかどうか、また
先端を切り取られ膜結合領域を欠いた形のタンパク質が
宿主細胞から分泌されるのかどうか、またその場合、発
現した生成体タンパク質がＨ５Ｖ−１および／またはＩ
（Ｓ Ｖ −２に対する抗体を生成するかどうかを調べ
ることにした。本発明で検討の結果、これらの目標は達
成された。特に、本発明は組み換えＤＮＡ操作によって
得られたこれらのタンパク質を、Ｈ８Ｖ−１およびＨＳ
Ｖ −２ウイルスに有効なワクチンの構成成分として
使用する方法を提供するものである。このようにして製
造されたワクチンはヘルペス（＠疹）感染の発生を予防
し、また既に感染した患者のヘルペス感染の再発の頻度
と重篤度を低下させる防御ワクチンである。
もう一つの本発明の目的は、Ｈ５Ｖ−１および／または
Ｈ５Ｖ−２ウイルスに対するワクチンの構成成分として
有用な、組み換えＤＮＡ操作によって得られる他の一組
の糖タンパク質を提供することにある。具体的には、そ
のような糖タンパク質は、Ｈ５Ｖ−１ｇＣ（Ｈ５Ｖ−１
に有効）、Ｈ８ｖ ２＋Ｃ有効なＨ５Ｖ−２ｇＦ （Ｈ
５Ｖ−２ｇＧと表現する方がより適切）、または両ウィ
ルに有効なこの二つのタンパク質の組み合わせ物である
。またそのような糖タンパク質として、そのほかｇＡ、
ｇＢおよびｇＥが含まれる。ｇＣおよび°ｇＤ糖タンパ
ク質の組み合わせに基づくワクチンは、個々の糖タンパ
ク質単独よりもワクチンとして著しく有効であろうと考
えられる。
Ｈ５Ｖ−２ウイルスに対するワクチンの構成成分として
有用な、組み換えＤＮＡ操作によって得られる他の一組
の糖タンパク質を提供することにある。具体的には、そ
のような糖タンパク質は、Ｈ５Ｖ−１ｇＣ（Ｈ５Ｖ−１
に有効）、Ｈ８ｖ ２＋Ｃ有効なＨ５Ｖ−２ｇＦ （Ｈ
５Ｖ−２ｇＧと表現する方がより適切）、または両ウィ
ルに有効なこの二つのタンパク質の組み合わせ物である
。またそのような糖タンパク質として、そのほかｇＡ、
ｇＢおよびｇＥが含まれる。ｇＣおよび°ｇＤ糖タンパ
ク質の組み合わせに基づくワクチンは、個々の糖タンパ
ク質単独よりもワクチンとして著しく有効であろうと考
えられる。
更に要約すると、本発明はＨＳ Ｖ −１およびＨｓ
ｖ −２ウイルスに対する相補的抗体を特異的に生成せ
しめ得る抗原決定基を有す・るポリペプチドを含有する
ワクチンに関する。その一つの態様として、そのポリペ
プチドは、それを産生じ得る組み換え体宿主細胞の表面
膜と機能的に連合している。典型的な例では、そのよう
な機能的連合性は、ポリペプチドが膜を通じて突出する
ように、表面膜とポリペプチドが結合することである。
ｖ −２ウイルスに対する相補的抗体を特異的に生成せ
しめ得る抗原決定基を有す・るポリペプチドを含有する
ワクチンに関する。その一つの態様として、そのポリペ
プチドは、それを産生じ得る組み換え体宿主細胞の表面
膜と機能的に連合している。典型的な例では、そのよう
な機能的連合性は、ポリペプチドが膜を通じて突出する
ように、表面膜とポリペプチドが結合することである。
組み換え体細胞系（セルライン）は、安定で、連続した
系から誘導される。
系から誘導される。
他の一実施態様としてのワクチンは、同じ抗原決定基を
持っているが、膜表面と機能的に連合しない抗原決定基
を有するポリペプチドを含んでいる。詳細については後
述するが、そのようなポリペプチドは、膜結合ポリペプ
チドの、先端を切り取られた膜不含誘導体である。該誘
導体はポリペプチドから膜結合領域が脱落することによ
って形成され、それを産生じた組換え体宿主細胞系から
分泌され得る。
持っているが、膜表面と機能的に連合しない抗原決定基
を有するポリペプチドを含んでいる。詳細については後
述するが、そのようなポリペプチドは、膜結合ポリペプ
チドの、先端を切り取られた膜不含誘導体である。該誘
導体はポリペプチドから膜結合領域が脱落することによ
って形成され、それを産生じた組換え体宿主細胞系から
分泌され得る。
他の一実施態様では、ポリペプチドは最初膜表面と機能
的に連合して形成され、その後、望ましくは非イオン界
面活剤に溶解して、膜を含まないポリペプチドとする。
的に連合して形成され、その後、望ましくは非イオン界
面活剤に溶解して、膜を含まないポリペプチドとする。
本明細書で使用する“組み換え体“なる用語は、組み換
えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベクターでトラン
スフェクトされ、ポリペプチドを生産する能力を形質導
入された細胞を意味する。〃機能的連合“とは、膜に結
合することであり、典型的には、天然の病原体によって
誘発された抗体によって認識され得る天然の立体配座に
含まれている抗原決定基を露出する様に、膜の両側へ突
出して膜と結合することを意味する。′膜結合“ポリペ
プチドとは、通常真核細胞で生産され、それが種々の細
胞膜を通って分泌されるのを助けると考えられているシ
グナル配列、詔よび細胞膜からの完全な分泌を妨げると
考えられる膜結合領域（通常、疎水性であり、Ｃ−末端
に存在する）を有していることにより特徴づけられるポ
リペプチドの一群を言う。従って、それは機能的に膜に
連合または結合した状態のままでいる。本発明では、特
に病原微生物、例えばヘルペスウィルスに関する膜結合
ポリペプチドを開発しようとするものである。
えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベクターでトラン
スフェクトされ、ポリペプチドを生産する能力を形質導
入された細胞を意味する。〃機能的連合“とは、膜に結
合することであり、典型的には、天然の病原体によって
誘発された抗体によって認識され得る天然の立体配座に
含まれている抗原決定基を露出する様に、膜の両側へ突
出して膜と結合することを意味する。′膜結合“ポリペ
プチドとは、通常真核細胞で生産され、それが種々の細
胞膜を通って分泌されるのを助けると考えられているシ
グナル配列、詔よび細胞膜からの完全な分泌を妨げると
考えられる膜結合領域（通常、疎水性であり、Ｃ−末端
に存在する）を有していることにより特徴づけられるポ
リペプチドの一群を言う。従って、それは機能的に膜に
連合または結合した状態のままでいる。本発明では、特
に病原微生物、例えばヘルペスウィルスに関する膜結合
ポリペプチドを開発しようとするものである。
本明細書で使用している＃Ｈ８Ｖ−２ｇＦ’、・Ｈ３Ｖ
−２ｇＧ・および”ｇＣ−２’なる用語は、Ｈ８Ｖ−１
ｇＧと高度の相同性を有し、ワクチンとして有用な充分
な量の抗体を生成せしめることができるＨ８Ｖ−２の糖
タンパク質部分を指す用語として、交換可能に使用され
る。
−２ｇＧ・および”ｇＣ−２’なる用語は、Ｈ８Ｖ−１
ｇＧと高度の相同性を有し、ワクチンとして有用な充分
な量の抗体を生成せしめることができるＨ８Ｖ−２の糖
タンパク質部分を指す用語として、交換可能に使用され
る。
表面膜と機能的に連合した形で本発明のポリペプチドの
抗原決定基が得られれば、この膜は、ポリペプチドから
、抗原性を破壊することな（除去することができる。例
えば、この膜結合ポリペプチドを好適な溶液、望ましく
は非イオン界面活性剤を含有する溶液に溶解することに
より、ポリペプチドを膜から除去することができる。こ
れを行なうことの利点は、無関係な細胞性物質からポリ
ペプチドを分離し、ワクチンに使用する際の、その潜在
的活性を充分に高めることである。ポリペプチドから膜
を除去する技術は後述する。
抗原決定基が得られれば、この膜は、ポリペプチドから
、抗原性を破壊することな（除去することができる。例
えば、この膜結合ポリペプチドを好適な溶液、望ましく
は非イオン界面活性剤を含有する溶液に溶解することに
より、ポリペプチドを膜から除去することができる。こ
れを行なうことの利点は、無関係な細胞性物質からポリ
ペプチドを分離し、ワクチンに使用する際の、その潜在
的活性を充分に高めることである。ポリペプチドから膜
を除去する技術は後述する。
もう一つの実施態様としては、分泌系を創製することに
よって、膜を含有しない標品を得ることである。後段で
更に詳細に記述するように、そのように分泌されたポリ
ペプチドは少なくとも抗体産生を刺激するのに必要な幾
つかの抗原部位を持っている。
よって、膜を含有しない標品を得ることである。後段で
更に詳細に記述するように、そのように分泌されたポリ
ペプチドは少なくとも抗体産生を刺激するのに必要な幾
つかの抗原部位を持っている。
以下、図面について説明する。
第１図は、ｕｓｖ−１およびＨ３Ｖ−２ｇＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列と、推定されたア
ミノ酸配列を示す。
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列と、推定されたア
ミノ酸配列を示す。
第２図はｔｉｓｖ−１とＨ５Ｖ−２タンパク質からのｇ
Ｄタンパク質のヒトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ
）解析を示す。
Ｄタンパク質のヒトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ
）解析を示す。
第３図は、膜結合型のＨ５Ｖ−１糖タンパク質りの発現
のために組み立てられた、ｐｇＤ−ｄｈｆｒプ、ラスミ
ドの模式図である。
のために組み立てられた、ｐｇＤ−ｄｈｆｒプ、ラスミ
ドの模式図である。
第４図はヒトＨ５■抗体でｇ’Ｄ１２細胞を標識した結
果を示し、（ハ）は位相差顕微鏡像、（均は同じ細胞の
螢光顕微鏡像Ｖある。 ・ 第５図は、ｇＤｌ ２細胞系からクローンしたｇＤおよ
びヒトの細胞に感染させたＨ８Ｖ−１から得うｔした天
然のｇＤの放射免疫沈降を示すグラフである。
果を示し、（ハ）は位相差顕微鏡像、（均は同じ細胞の
螢光顕微鏡像Ｖある。 ・ 第５図は、ｇＤｌ ２細胞系からクローンしたｇＤおよ
びヒトの細胞に感染させたＨ８Ｖ−１から得うｔした天
然のｇＤの放射免疫沈降を示すグラフである。
第６図は、ｇＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞細胞対す
るヒト抗Ｈ３Ｖ抗体の結合度を示す。横軸に血清希釈度
の逆数、縦軸に４９２ ｎｍにおける吸光度を示す。
るヒト抗Ｈ３Ｖ抗体の結合度を示す。横軸に血清希釈度
の逆数、縦軸に４９２ ｎｍにおける吸光度を示す。
第７図はＨ８Ｖ−１ｇＤタンパク質を模式的に表わした
もので、シグナル配列および膜結合領域の位置を示す。
もので、シグナル配列および膜結合領域の位置を示す。
第８図は分泌型のＨ５Ｖ−１ｇＤタンパク質のための発
現プラスミドｐｇＤ ｔｒｕｎｃ−ｄｈｆｒの組立て模
式図である。
現プラスミドｐｇＤ ｔｒｕｎｃ−ｄｈｆｒの組立て模
式図である。
第９図はｇＤｌｏ、２細胞系からの放射免疫沈降線を示
す。
す。
第１０図は増幅前および増幅を行なったｇＤｌｏ、２細
胞系か□らの放射免疫沈降線を示す。
胞系か□らの放射免疫沈降線を示す。
第１１図はＭｔｘ で増幅したｇＤｌｏ、２細胞系で達
成された増幅度を示す。 □ 第１２図はＤＮＡ配列解析を行なったｐｇＣ：２Ｓａ１
２、会 の断片を示す。
成された増幅度を示す。 □ 第１２図はＤＮＡ配列解析を行なったｐｇＣ：２Ｓａ１
２、会 の断片を示す。
第１３図はｐ ｇ Ｃ２Ｓ ａ ｌ 、’ ２−９から
誘導されたＤＮＡ配列とＨ８Ｖ−１ｇＧ領領域ＤＮＡ配
列の比較を示す。
誘導されたＤＮＡ配列とＨ８Ｖ−１ｇＧ領領域ＤＮＡ配
列の比較を示す。
第１４図はＨ５Ｖ−２ゲノムＤＮＡとｐ ｇ Ｃ２５ａ
′１２．９ＤＮＡのサザーンブロッティング解析を示す
。 □ 第１５図はＨ５Ｖ−２のラージオープンリーデイングラ
レームの翻訳とＨ５Ｖ−１ｇＧのアミノ酸配列め屁較を
示す。
′１２．９ＤＮＡのサザーンブロッティング解析を示す
。 □ 第１５図はＨ５Ｖ−２のラージオープンリーデイングラ
レームの翻訳とＨ５Ｖ−１ｇＧのアミノ酸配列め屁較を
示す。
第１６図はＨ３Ｖ−１ｇＧタンパク質とＨＳ Ｖ−２′
のメジャ」オープンリーディングフレームタンパク質め
ヒドロバレー解析結果を示す。
のメジャ」オープンリーディングフレームタンパク質め
ヒドロバレー解析結果を示す。
実施例 １
実施例１はｇＤタンパク質に関する。
ウィルスの増殖とウィルス性ＤＮＡの分離１−１ ｅ
ｐ ２細胞でＩ（ＳＶ−１（ｌｌｚｔ株）およびＨ８Ｖ
−２（Ｇ株）をそれぞれ３７℃および３３℃で増殖させ
た。ウィルス性ＤＮＡを、感染細胞培養からタンパク分
解酵素Ｋによる消化とｃｓ ｃｚ勾配により分離した（
２）。
ｐ ２細胞でＩ（ＳＶ−１（ｌｌｚｔ株）およびＨ８Ｖ
−２（Ｇ株）をそれぞれ３７℃および３３℃で増殖させ
た。ウィルス性ＤＮＡを、感染細胞培養からタンパク分
解酵素Ｋによる消化とｃｓ ｃｚ勾配により分離した（
２）。
ｆｌ Ｓ Ｖ −１およびＨ５Ｖ−２のｇＤ遺伝子のク
ローニング 先のマツピングおよびクローニング研究で）ＩｓＶ−１
ｇＤ遺伝子は〜５，５ ｋ ｂのＢａｍ１−１１断片に
つきとめられた（６．２４）。１−Ｉ Ｓ Ｖ −１を
ＢａｍＨｌで切断し、アガロースゲル電気泳動により６
〜７ｋｂ領域を分離した。この断片をＢａｍＨＩで消化
したｐＢＲ３２２に連結（リゲーション）し、得られた
混合物をＥ、ＣＯＩ ｉ ２９４株（ＡＴＣＣＡ、３１
４４６）に導入した。制限酵素消化により、好適なＨ８
Ｖ−１断片をめてアンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性のプラスミドをスクリーニングした。
ローニング 先のマツピングおよびクローニング研究で）ＩｓＶ−１
ｇＤ遺伝子は〜５，５ ｋ ｂのＢａｍ１−１１断片に
つきとめられた（６．２４）。１−Ｉ Ｓ Ｖ −１を
ＢａｍＨｌで切断し、アガロースゲル電気泳動により６
〜７ｋｂ領域を分離した。この断片をＢａｍＨＩで消化
したｐＢＲ３２２に連結（リゲーション）し、得られた
混合物をＥ、ＣＯＩ ｉ ２９４株（ＡＴＣＣＡ、３１
４４６）に導入した。制限酵素消化により、好適なＨ８
Ｖ−１断片をめてアンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性のプラスミドをスクリーニングした。
正確なｇＤを含有するＳ８を断片を、５ｓｔ−１で消化
したプラスミドｐ ＦＭ３にサブクローンした（ヨーロ
ッパ特許公報、第００６８６９３号：１９８３年１月５
日）。
したプラスミドｐ ＦＭ３にサブクローンした（ヨーロ
ッパ特許公報、第００６８６９３号：１９８３年１月５
日）。
ｉ（Ｓ Ｖ −２のｇＤ遺伝子は先にＨ３Ｖ−Ｉｆこよ
る組み換えによりマツピングが行なわれているが、この
遺伝子の正確な位置はまだ判っていない。そこでＨ５■
−２ゲノムの短かい単一領域（４）からの〜１Ｑｋｂ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 断片を、バクテリオファージスクロ
ーニングベクター５９０（２５＋のＨｉｎｃｌ Ｉ１１
部位へ連結した。インビトロ（試験管内）でパッケージ
ングしたファージを低密度でプレートに撤き、Ｈ５Ｖ−
１から得たｇＤ遺伝子の３２ｐ−標識サブクローンとＢ
ｅｎｔｏｎ−Ｄａｖｉ ｓ法によりスクリーニングした
（イ）。陽性のハイブリダイゼーションを示したプラー
クを発育させ、ＤＮＡを分離し、サザーン・プロツテイ
グおよび３２ｐ −標識ｔ−ｔｓｙ−１ｇＤ遺伝子との
ハイブリダイゼーション法によりｇＤ遺伝子の位置をつ
きとめた（イ）。ハイブリダイゼーシン陽性のＨ８Ｖ−
２ｇＤ含有断片をプラスミドｐ Ｕ Ｃ９へサブクロー
ンした（支）。
る組み換えによりマツピングが行なわれているが、この
遺伝子の正確な位置はまだ判っていない。そこでＨ５■
−２ゲノムの短かい単一領域（４）からの〜１Ｑｋｂ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 断片を、バクテリオファージスクロ
ーニングベクター５９０（２５＋のＨｉｎｃｌ Ｉ１１
部位へ連結した。インビトロ（試験管内）でパッケージ
ングしたファージを低密度でプレートに撤き、Ｈ５Ｖ−
１から得たｇＤ遺伝子の３２ｐ−標識サブクローンとＢ
ｅｎｔｏｎ−Ｄａｖｉ ｓ法によりスクリーニングした
（イ）。陽性のハイブリダイゼーションを示したプラー
クを発育させ、ＤＮＡを分離し、サザーン・プロツテイ
グおよび３２ｐ −標識ｔ−ｔｓｙ−１ｇＤ遺伝子との
ハイブリダイゼーション法によりｇＤ遺伝子の位置をつ
きとめた（イ）。ハイブリダイゼーシン陽性のＨ８Ｖ−
２ｇＤ含有断片をプラスミドｐ Ｕ Ｃ９へサブクロー
ンした（支）。
ＤＮＡ配列決定とコンピューター解析
ＨＳ Ｖ −１および）ＩＳＶ−２ｇＤ遺伝子から得た
種々の断片をｍ１３フア一ジベクターｍ ｐ ９へサブ
クローンし囚、Ｓａｎｇｅｔのジデオキシヌクレオチド
法により配列決定した（至）。
種々の断片をｍ１３フア一ジベクターｍ ｐ ９へサブ
クローンし囚、Ｓａｎｇｅｔのジデオキシヌクレオチド
法により配列決定した（至）。
ヌクレオチド配列は）Ｉ ＯＭプログラムを使用して解
析した＋３１１０推定したタンパク質配列のヒトロバシ
ーは１２幅（ｗｉｄｔｈ） および１ジヤンプ（ｊ ｕ
ｍｐ ）を使用して解析した（３１ａ）。
析した＋３１１０推定したタンパク質配列のヒトロバシ
ーは１２幅（ｗｉｄｔｈ） および１ジヤンプ（ｊ ｕ
ｍｐ ）を使用して解析した（３１ａ）。
ＨＳ Ｖ １ オヨヒＨＳ Ｖ ２ カラ得たｇＤ領領
域クローニング 他の研究でＨ５Ｖ−１ｇＤ遺伝子はＲｏ ｉ ｙ、ｍａ
ｎの命名法に従い、６，６ ｋｂ ＢａｍＨＩ Ｊ断
片につきとめられた（６．１２．２４）。この断片部分
を分離して配列決定を行ない、この断片がｔｉ ｓ ｖ
−１ｇＤ遺伝子を含有することがわかった。Ｈ５ｖ−
１ｇＤ遺伝子＋７）ＤＮＡ配列ハＨｓｖ−２ｇＤ遺伝子
と比較的相同的であると予想されるので、この断片をＨ
８Ｖ−２ゲノムからのｇＤ遺伝子の分離のためのプロー
ブとして使用した。
域クローニング 他の研究でＨ５Ｖ−１ｇＤ遺伝子はＲｏ ｉ ｙ、ｍａ
ｎの命名法に従い、６，６ ｋｂ ＢａｍＨＩ Ｊ断
片につきとめられた（６．１２．２４）。この断片部分
を分離して配列決定を行ない、この断片がｔｉ ｓ ｖ
−１ｇＤ遺伝子を含有することがわかった。Ｈ５ｖ−
１ｇＤ遺伝子＋７）ＤＮＡ配列ハＨｓｖ−２ｇＤ遺伝子
と比較的相同的であると予想されるので、この断片をＨ
８Ｖ−２ゲノムからのｇＤ遺伝子の分離のためのプロー
ブとして使用した。
Ｈ８Ｖ−１およびＨ３Ｖ−２ゲノムからの遺伝子の大部
分は共直線的に配列していると思われるので關、Ｈ５Ｖ
−１ｇＤ領域に対応するＨ Ｓ Ｖ −２のゲノムの短
かい単一の領域からの領域（Ｈｉ ｎｄ” Ｌ断片（１
２１）をλファージベクターヘクローンした。得られた
プラークを３２ｐ−標識ＨＳ Ｖ−１ｇＤ遺伝子サブク
ローンでスクリーニングすると陽性のハイブリダイゼー
ションを示したプラークの存在することがわかった。こ
のことは、二つのウィルスゲノムのこの領域に、事実上
核酸配列の相同性が存在することを示唆している。ファ
ージＤＮＡを分離し、次いでサザーンブロッティング解
析を行なうことにより、ｇＤ遺伝子に対応するこの断片
の領域が明らかにされた。この領域を１〕ＮＡ配列解析
のためサブクローンした。
分は共直線的に配列していると思われるので關、Ｈ５Ｖ
−１ｇＤ領域に対応するＨ Ｓ Ｖ −２のゲノムの短
かい単一の領域からの領域（Ｈｉ ｎｄ” Ｌ断片（１
２１）をλファージベクターヘクローンした。得られた
プラークを３２ｐ−標識ＨＳ Ｖ−１ｇＤ遺伝子サブク
ローンでスクリーニングすると陽性のハイブリダイゼー
ションを示したプラークの存在することがわかった。こ
のことは、二つのウィルスゲノムのこの領域に、事実上
核酸配列の相同性が存在することを示唆している。ファ
ージＤＮＡを分離し、次いでサザーンブロッティング解
析を行なうことにより、ｇＤ遺伝子に対応するこの断片
の領域が明らかにされた。この領域を１〕ＮＡ配列解析
のためサブクローンした。
暗号化領域
第１図は二つのｇＤ ＤＮＡ配列をＨＯＭプログラム（
３１１と比較したものを示している。ヌクレオチド番号
の１番は、イニシェーターメチオニンのＡＴＧのＡから
始めた。ギャップは、配列相同性を最大にするためにＲ
ＯＭコンピュータープログラムにより導入したＧ１）。
３１１と比較したものを示している。ヌクレオチド番号
の１番は、イニシェーターメチオニンのＡＴＧのＡから
始めた。ギャップは、配列相同性を最大にするためにＲ
ＯＭコンピュータープログラムにより導入したＧ１）。
ヌクレオチドの相違は米印で示し、アミノ酸の相違は枠
で囲んで示しである。ここに報告するｔｔｓｖ−１のＨ
ｚｔ株で測定したＨ５Ｖ−１ｇＤ配列と、Ｗａｔｓｏｎ
ら（６）によりＰａｔｔｏｎ株について報告された配列
との間のアミノ酸の相違は十印で示した。矢印で示した
ｆ（ＳＶ−ＩｇＤ遺伝子の転写開始はＷａ Ｌｓ ｏ
ｎらによる■。
で囲んで示しである。ここに報告するｔｔｓｖ−１のＨ
ｚｔ株で測定したＨ５Ｖ−１ｇＤ配列と、Ｗａｔｓｏｎ
ら（６）によりＰａｔｔｏｎ株について報告された配列
との間のアミノ酸の相違は十印で示した。矢印で示した
ｆ（ＳＶ−ＩｇＤ遺伝子の転写開始はＷａ Ｌｓ ｏ
ｎらによる■。
Ｎ−結合筒付加（グリコジル化）部位は陰影をつけて示
しである。二つの可能性のある’ ＴＡＴＡ”配列はｇ
Ｄ転写開始への５′で余されるが、第３の’ＴＡＴＡ’
配列はＨ５Ｖ−２配列の３′終末における２番目のオ
ープンリーディングフレームへの５′で示される。非暗
号化配列の２つの相同領域はｇＤ遺伝子への５′−位と
、Ｈ５Ｖ−２配列からの２番目のオープンリーディング
フレームへの５′−位に記録されるべきである。
しである。二つの可能性のある’ ＴＡＴＡ”配列はｇ
Ｄ転写開始への５′で余されるが、第３の’ＴＡＴＡ’
配列はＨ５Ｖ−２配列の３′終末における２番目のオ
ープンリーディングフレームへの５′で示される。非暗
号化配列の２つの相同領域はｇＤ遺伝子への５′−位と
、Ｈ５Ｖ−２配列からの２番目のオープンリーディング
フレームへの５′−位に記録されるべきである。
ｇＤタンパク質のヒトロバシー
各糖タンパク質のヒトロバシーをＨｏｐｐら（３１荀に
よって開発されたプログラムを使用して解析した。第２
図に示したように、疎水性の膜透過性領域は遺伝子の３
′−末端に存在する。１２個の長さのアミノ酸鎖を解析
し、平均ヒトロバシーを計算した。二つの糖タンパク質
問の残基の相違のうち、コンサーバティブな変化を米印
、ノンコズーサーバティブの変化を十印で示す。〜はＨ
Ｓ Ｖ −１ｇＤタンパク質のヒトロバシーを、Ｂ）！
；！Ｈ５Ｖ−２ｇＤタンパク質のヒトロバシーヲ示す。
よって開発されたプログラムを使用して解析した。第２
図に示したように、疎水性の膜透過性領域は遺伝子の３
′−末端に存在する。１２個の長さのアミノ酸鎖を解析
し、平均ヒトロバシーを計算した。二つの糖タンパク質
問の残基の相違のうち、コンサーバティブな変化を米印
、ノンコズーサーバティブの変化を十印で示す。〜はＨ
Ｓ Ｖ −１ｇＤタンパク質のヒトロバシーを、Ｂ）！
；！Ｈ５Ｖ−２ｇＤタンパク質のヒトロバシーヲ示す。
ＤＮＡ配列分析の結果、ＨＳ Ｖ −１およびＨ５ｖ−
２のｇＤタンパク質は８０％の相同性があることが明ら
かにされた。これらの２個のタンパク質問で見出された
相違点の大部分はアミノ末端およびカルボキシル末端領
域にあった。これらのタンパク質のアミノ末端領域は、
アミノ末端メチオニンの近くにアルギニン残基を含有す
る高度に疎水性の領域を含んでいる。この疎水性領域は
、分泌され、そして、膜と結合する蛋白質に特徴的なシ
グナル配列であり、また多分、少なくとも一部のタンパ
ク質を小胞体の内腔へ誘導すべく機能するシグナル配列
である（至）。最初の２０個のアミノ末端アミノ酸の比
較から、１型と２型との遺伝子間には、総計で１２ケ所
の差違があることが示された。然し実質的には、すべて
の差異は、それらが他の疎水性アミノ酸を暗号化してい
るので、コンサーバテイブである。例外は、３番目の残
基めｇｌｙ−ａｒｇ 置換と、７番目の残基’（Ｄ ｎ
ｒ ｇ−ｇ ｌ ｙ 置換である。これらの置換はコ
ンサーバテイブではないが、これらはシグナル領域の本
質的な構造を変化させるものではない。両遺伝子とも最
初の１０個のアミノ酸の中Ｇこプラスの電荷を有する残
基を保有している。
２のｇＤタンパク質は８０％の相同性があることが明ら
かにされた。これらの２個のタンパク質問で見出された
相違点の大部分はアミノ末端およびカルボキシル末端領
域にあった。これらのタンパク質のアミノ末端領域は、
アミノ末端メチオニンの近くにアルギニン残基を含有す
る高度に疎水性の領域を含んでいる。この疎水性領域は
、分泌され、そして、膜と結合する蛋白質に特徴的なシ
グナル配列であり、また多分、少なくとも一部のタンパ
ク質を小胞体の内腔へ誘導すべく機能するシグナル配列
である（至）。最初の２０個のアミノ末端アミノ酸の比
較から、１型と２型との遺伝子間には、総計で１２ケ所
の差違があることが示された。然し実質的には、すべて
の差異は、それらが他の疎水性アミノ酸を暗号化してい
るので、コンサーバテイブである。例外は、３番目の残
基めｇｌｙ−ａｒｇ 置換と、７番目の残基’（Ｄ ｎ
ｒ ｇ−ｇ ｌ ｙ 置換である。これらの置換はコ
ンサーバテイブではないが、これらはシグナル領域の本
質的な構造を変化させるものではない。両遺伝子とも最
初の１０個のアミノ酸の中Ｇこプラスの電荷を有する残
基を保有している。
ヒトロバシーの結果を図示した第２図では、疎水性の領
域に引き続いて親水性のカルボキシル末端領域が見られ
る。この構造は膜結合□型糖タンパク質の特徴であって
、以前にも他のウィル表面抗原で発見された（５．３４
）。その働きは細胞膜およびウィルス膜にタンパク質を
固定することにあり、そのことからウィルス感染に一部
な役割りを果たす。ｇＤタンパク質のこの領域に詔ける
１２ケ所のアミノ酸変化は３３３番目〜３６２番目の残
基に見られ、それらの大部分はコンサーバテイブである
。こあことは、この領域のアミノ酸としての唯一条件が
、脂質二重層に架橋するために著しく無−性であるとい
□うことであ颯ことを示唆している。更に、恐ら＜ Ｉ
：／ｚ’ｆり質を膜に固定させる働きをしていると考
えられる膜領域に続く領域（３６３〜３７５残基）（３
３１は、最初の１３個の一基に５ケ所の変化を示し、ｌ
め後；こ長い相同鎖を有する。この結果から、カルボキ
シル末端親水性領域の最初の１０〜１５残基は固定機能
を果すだけであって、従って荷電されることだけが必要
で ４あるが、一方、それに続く２３残基はｇ Ｉ）タ
ンパク質に特異的に重要な何か他の機能を果しているの
かｉ知れなＧ１ととが示唆される。
域に引き続いて親水性のカルボキシル末端領域が見られ
る。この構造は膜結合□型糖タンパク質の特徴であって
、以前にも他のウィル表面抗原で発見された（５．３４
）。その働きは細胞膜およびウィルス膜にタンパク質を
固定することにあり、そのことからウィルス感染に一部
な役割りを果たす。ｇＤタンパク質のこの領域に詔ける
１２ケ所のアミノ酸変化は３３３番目〜３６２番目の残
基に見られ、それらの大部分はコンサーバテイブである
。こあことは、この領域のアミノ酸としての唯一条件が
、脂質二重層に架橋するために著しく無−性であるとい
□うことであ颯ことを示唆している。更に、恐ら＜ Ｉ
：／ｚ’ｆり質を膜に固定させる働きをしていると考
えられる膜領域に続く領域（３６３〜３７５残基）（３
３１は、最初の１３個の一基に５ケ所の変化を示し、ｌ
め後；こ長い相同鎖を有する。この結果から、カルボキ
シル末端親水性領域の最初の１０〜１５残基は固定機能
を果すだけであって、従って荷電されることだけが必要
で ４あるが、一方、それに続く２３残基はｇ Ｉ）タ
ンパク質に特異的に重要な何か他の機能を果しているの
かｉ知れなＧ１ととが示唆される。
この二つのタンパ多−の全体にわたり、他の多くのアミ
ノ酸変花が見られるが、その変化の大部分はコンサニバ
ティブでふる。この事実は、第２図１２示したヒトロバ
ジ−プログラムによって現わされた一部によって強−さ
れる。この′比較で見られるように、二つの糖タンパク
質は非常に近似した図形を示す。コンサーバテイブでな
いアミノ酸変化はタンパク質のヒトロバシーを変化させ
ないようである。
ノ酸変花が見られるが、その変化の大部分はコンサニバ
ティブでふる。この事実は、第２図１２示したヒトロバ
ジ−プログラムによって現わされた一部によって強−さ
れる。この′比較で見られるように、二つの糖タンパク
質は非常に近似した図形を示す。コンサーバテイブでな
いアミノ酸変化はタンパク質のヒトロバシーを変化させ
ないようである。
）１ｓＶ−１ｇＤの発現
恒久的に膜結合したｇＤを生産する細胞系を確立するた
めに、選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈ
ｆｒ） 、を含有しているヒト発現ベクター（至）へｇ
＋）を含有する断片を連結した（第３図）。第３図は
、ｉ−ｉ ｓ ｖ −を糖タンパク質りの発現のために
組み立てられたプラスミドｐｇＤ−ｄｈ ｆｒの図式を
示す。この発現プラスミドは、ｌ、ｃｏｌｉプラスミド
ｐＢＲ３２２から誘導された複製超厚とβ−ラクタマー
ゼ遺伝子（ａｍｐ ｒ）国、５Ｖ−４０の初期（第一）
プロモーターのコントロール下にマウスのｄｈｆｒを暗
号化したｃＤＮＡ 挿入体（３６，３８）、および同じ
（ＳＶ−４０初期プロ″モーターのコントロール下にｇ
Ｄ遺伝子を含有シているＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ
の４．６ｋｂ断片から成っていた。この断片のＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉ終末は、イニシエーターメチオニンのコドンの
５′−側へ７４ ｂｐ テ位置しており、ｍＲＮ Ａの
キャップ部位を含有している。Ｈｉｎｄ Ｉ１１部位は
、５ｖ−４０プロモーターのＧｏｌｄｂｅｒｇ−１−１
ｏｇｎｅｓｓ ボックスの３’−１則へ２５０ｂｐで位
置している。ｇＤを含有する断片の暗号化領域は１１７
９ｂｐの長さを有し、少なくとも翻訳停止コドン、ポリ
アデニル化部位および糖タンパク質Ｅ遺伝子（２４，３
２）の一部を含んでいる巨大（１，９ｋｂ）な３′−領
域に隣接している。
めに、選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈ
ｆｒ） 、を含有しているヒト発現ベクター（至）へｇ
＋）を含有する断片を連結した（第３図）。第３図は
、ｉ−ｉ ｓ ｖ −を糖タンパク質りの発現のために
組み立てられたプラスミドｐｇＤ−ｄｈ ｆｒの図式を
示す。この発現プラスミドは、ｌ、ｃｏｌｉプラスミド
ｐＢＲ３２２から誘導された複製超厚とβ−ラクタマー
ゼ遺伝子（ａｍｐ ｒ）国、５Ｖ−４０の初期（第一）
プロモーターのコントロール下にマウスのｄｈｆｒを暗
号化したｃＤＮＡ 挿入体（３６，３８）、および同じ
（ＳＶ−４０初期プロ″モーターのコントロール下にｇ
Ｄ遺伝子を含有シているＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ
の４．６ｋｂ断片から成っていた。この断片のＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉ終末は、イニシエーターメチオニンのコドンの
５′−側へ７４ ｂｐ テ位置しており、ｍＲＮ Ａの
キャップ部位を含有している。Ｈｉｎｄ Ｉ１１部位は
、５ｖ−４０プロモーターのＧｏｌｄｂｅｒｇ−１−１
ｏｇｎｅｓｓ ボックスの３’−１則へ２５０ｂｐで位
置している。ｇＤを含有する断片の暗号化領域は１１７
９ｂｐの長さを有し、少なくとも翻訳停止コドン、ポリ
アデニル化部位および糖タンパク質Ｅ遺伝子（２４，３
２）の一部を含んでいる巨大（１，９ｋｂ）な３′−領
域に隣接している。
プラスミドｐｇＤ、ｄｈｆｒは次のように組み立てられ
た： Ｉ−Ｉ Ｓ Ｖ −１ゲノムからクローンしたＢ
ａｍＨＩ断片から、全ｇＤ暗号配列を含有する４、５ｋ
ｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ −Ｂａｍ ＨＩ 断片を分離し
た（上記参照）。
た： Ｉ−Ｉ Ｓ Ｖ −１ゲノムからクローンしたＢ
ａｍＨＩ断片から、全ｇＤ暗号配列を含有する４、５ｋ
ｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ −Ｂａｍ ＨＩ 断片を分離し
た（上記参照）。
ＳＶ４ Ｑに由来する初期プロモータおよびｐＢＲ３２
２アンピシリン耐性遺伝子から成る２、８ｋｂのＨｉ
ｎｄ ｍ−５ａＩ！１断片おＪ：びＤＮＡ複製起原超厚
ラスミドｐＥＨＢａＪ１４から分離した。第２のＳ■４
０由来の初期プロモーターのコントロール下にあるマウ
スのジヒドロ葉酸レダクターゼｃ ＤＮＡクローンを含
有しティる２４ｋｂの５ａｌｌ −ＢａｍＨ１断片をプ
ラスミドｐＥ３４８ＨＢＶ Ｅ４ＱＱＤ２２Ｃ１ｅｌか
ら分離した。これら３個の断片はＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
を使用する三重連結法（トリプルリケーション）によっ
て互いに連結し、得られた混合物をＥ、ｃｏｌ ｉ ２
９４菌株への導入に使用した。
２アンピシリン耐性遺伝子から成る２、８ｋｂのＨｉ
ｎｄ ｍ−５ａＩ！１断片おＪ：びＤＮＡ複製起原超厚
ラスミドｐＥＨＢａＪ１４から分離した。第２のＳ■４
０由来の初期プロモーターのコントロール下にあるマウ
スのジヒドロ葉酸レダクターゼｃ ＤＮＡクローンを含
有しティる２４ｋｂの５ａｌｌ −ＢａｍＨ１断片をプ
ラスミドｐＥ３４８ＨＢＶ Ｅ４ＱＱＤ２２Ｃ１ｅｌか
ら分離した。これら３個の断片はＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
を使用する三重連結法（トリプルリケーション）によっ
て互いに連結し、得られた混合物をＥ、ｃｏｌ ｉ ２
９４菌株への導入に使用した。
生成したコロニーを増殖させ、プラスミドＤＮＡを５ａ
Ｃ２で消化することによりスクリーニングした。正シい
ＤＮＡコンストラクションｐｇＩ） −ｄｈ ｆ ｒ
（’？４３ 図）を次のトランスフェクション研究に使
用した。
Ｃ２で消化することによりスクリーニングした。正シい
ＤＮＡコンストラクションｐｇＩ） −ｄｈ ｆ ｒ
（’？４３ 図）を次のトランスフェクション研究に使
用した。
リン酸カルシウム沈澱法ｌ〔を使用して、このプラスミ
ドをｄｈｆｒ生産欠乏のチャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）＠へ導入した。ヒボキサンチン、グリシン
、およびチミジンを含まない培地で発育し得るコロニー
を採り、９個のｄｈ［ｒ＋クローンを分析した。これら
のうち、５個のコロニーに、抗Ｈ５Ｖ−１抗体を使用す
る放射免疫沈降法および免疫螢光検定で、ｇＤが検出で
きた。
ドをｄｈｆｒ生産欠乏のチャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）＠へ導入した。ヒボキサンチン、グリシン
、およびチミジンを含まない培地で発育し得るコロニー
を採り、９個のｄｈ［ｒ＋クローンを分析した。これら
のうち、５個のコロニーに、抗Ｈ５Ｖ−１抗体を使用す
る放射免疫沈降法および免疫螢光検定で、ｇＤが検出で
きた。
この５個の系列のうちの１個（ｇＤｉ２）を更に次の研
究用にあてた。クローンしたｇＤ遺伝子生産物を特徴づ
けるために、ｇＤ１２細胞を３５５−メチオニンまたは
３Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識し、放射免疫沈澱法
により分析した。使用した方法は次の通りである： 市販の７％のウシ胎児透析血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシ
リン（１００ｕ／Ｆｎｌ）、およびストレプトマイシン
（１００ｕ／ｍ／）を添加したＨａｍのＦ１２培地テ細
胞を発育させた。培養が約８０％まで密集した状態（ｃ
ｏｎ［１ｕｅｎｔ）になったら、培地を除き、細胞をリ
ン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回洗滌した後、標識培地
（１／１０規定濃度のメチオニンまたはグルコースを含
有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ の培地）を
最終濃度０．０６４ ｉ／ｃｄ となるまで添加５ した。 Ｓ−メチオニン（ＳＪ 、 ２０４ 、Ａｍｅ
ｒｓｈｌｍｌｎＬ、）（５０〜７５／ｊｃ１／ｍ／りま
たは３ Ｈ−グルコサミン（１００μＣｉ／、６）を加
え、更に細胞を１８〜２０時間発育させた。標識終了後
、培地を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗滌し、０．０２
俤のＥＤＴＡを含有するＰＢＳで処理することによって
培養皿から除いた。次いで細胞を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−
４０，０，１％ウシ血清アルブミン、５Ｘ１０−”Ｍフ
ェニルメチルスルホニルブルオリド、０．０１７Ｔ Ｉ
Ｕ／ｍ／のアポプロチニ・ンから成る溶菌緩衝液に溶
解し、得られた溶解物を１２．Ｏｏｏｘｇで遠心分離に
より透明にした。免疫沈降反応のために、細胞溶解液を
ＰＢＳで３倍に希釈し、検波（典型的には１８０μｌ）
を２〜５μでの抗血清と温容し、４℃で３０分間インキ
ュベートした。免疫複合体をＫｅｓｓｌｅｒ 法（４０
ａ）ｊｃ、！：す、固定したＳ。
究用にあてた。クローンしたｇＤ遺伝子生産物を特徴づ
けるために、ｇＤ１２細胞を３５５−メチオニンまたは
３Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識し、放射免疫沈澱法
により分析した。使用した方法は次の通りである： 市販の７％のウシ胎児透析血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシ
リン（１００ｕ／Ｆｎｌ）、およびストレプトマイシン
（１００ｕ／ｍ／）を添加したＨａｍのＦ１２培地テ細
胞を発育させた。培養が約８０％まで密集した状態（ｃ
ｏｎ［１ｕｅｎｔ）になったら、培地を除き、細胞をリ
ン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回洗滌した後、標識培地
（１／１０規定濃度のメチオニンまたはグルコースを含
有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ の培地）を
最終濃度０．０６４ ｉ／ｃｄ となるまで添加５ した。 Ｓ−メチオニン（ＳＪ 、 ２０４ 、Ａｍｅ
ｒｓｈｌｍｌｎＬ、）（５０〜７５／ｊｃ１／ｍ／りま
たは３ Ｈ−グルコサミン（１００μＣｉ／、６）を加
え、更に細胞を１８〜２０時間発育させた。標識終了後
、培地を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗滌し、０．０２
俤のＥＤＴＡを含有するＰＢＳで処理することによって
培養皿から除いた。次いで細胞を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−
４０，０，１％ウシ血清アルブミン、５Ｘ１０−”Ｍフ
ェニルメチルスルホニルブルオリド、０．０１７Ｔ Ｉ
Ｕ／ｍ／のアポプロチニ・ンから成る溶菌緩衝液に溶
解し、得られた溶解物を１２．Ｏｏｏｘｇで遠心分離に
より透明にした。免疫沈降反応のために、細胞溶解液を
ＰＢＳで３倍に希釈し、検波（典型的には１８０μｌ）
を２〜５μでの抗血清と温容し、４℃で３０分間インキ
ュベートした。免疫複合体をＫｅｓｓｌｅｒ 法（４０
ａ）ｊｃ、！：す、固定したＳ。
ａｕｒｅｕｓ細胞に吸着させ、１２．０００Ｘｇ で３
０分間遠心分離して沈澱させた。次に、Ｓ、ａｕｒｅｕ
ｓ細胞を洗滌緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ−４Ｑ、０．３
チドデシル硫酸ナトリウム）で３回洗滌後、免疫複合体
を２０μｌのポリアクリルアミドゲル検体緩衝液（１０
チグリセロール、５％２−メルカプトエタノール、０．
０１％ブロモフェノールブルーを含有する６２．５ｍＭ
トリス−Ｉ−Ｉ ＣＩ！バッファー−ＰＨ６，８）で
９０℃で３分間溶出した。３０秒間遠心分離後、上清を
Ｌａ ｅ向紹ｉ の方法四に従い１０悌ポリアクリルア
ミドスラブゲルにかけ゛た。
０分間遠心分離して沈澱させた。次に、Ｓ、ａｕｒｅｕ
ｓ細胞を洗滌緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ−４Ｑ、０．３
チドデシル硫酸ナトリウム）で３回洗滌後、免疫複合体
を２０μｌのポリアクリルアミドゲル検体緩衝液（１０
チグリセロール、５％２−メルカプトエタノール、０．
０１％ブロモフェノールブルーを含有する６２．５ｍＭ
トリス−Ｉ−Ｉ ＣＩ！バッファー−ＰＨ６，８）で
９０℃で３分間溶出した。３０秒間遠心分離後、上清を
Ｌａ ｅ向紹ｉ の方法四に従い１０悌ポリアクリルア
ミドスラブゲルにかけ゛た。
胞で得られたオートラジオグラフを比較したものである
： ｇＤｌ ２細胞溶菌液と正常家兎血清から得た対照
免疫沈降（１列目）；ＨＥＬ細胞で発育させた野性（天
然）のｇＤと単クローン性（モノクローナル）抗ｇＤ抗
体、５５−５１４Ｉ）との免疫沈降（２列目）、および
Ａ３４９細胞と５５−５の免疫沈降（３列目）；ｇＤ１
２細胞の溶解液からのクローンしたｇＤと、多クローン
性ＨＳ Ｖ −１家兎抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ、）の
免疫沈降（４列目）、および単クローン性抗体５５−５
との免疫沈降（５列目）；３Ｈ−グルコサミンで代謝的
に標識したｇＤ１２細胞からの□クローンしたｇＤと多
クローン性家兎抗Ｈ８Ｖ−１抗体の免疫沈降（６列目）
。 １ ｇＤ１２＠胞系から、Ｈ８Ｖ−１タンパクにｉ異的な（
４１１、単りローン性抗−ｇＤ抗体、５５−５または家
兎抗Ｈｓｖ−１抗体を使用して、５９〜６０ｋｄ（７）
拡散バンドが特異的ｉこ沈澱したことが見られる（４詔
よび５列目）。２の分子量は、Ｈｓｖ、−１に感染させ
たＫＢ細胞（転）から分離されたｇＤ４Ｇ関して報告さ
れた値とよ（一致する。同じ単クローン性抗体が、ｔｔ
ｓｖ−１に感染させたヒト細胞系からの類似の、しかし
分子量の異なるタンパク質を沈降させるのが見られる。
： ｇＤｌ ２細胞溶菌液と正常家兎血清から得た対照
免疫沈降（１列目）；ＨＥＬ細胞で発育させた野性（天
然）のｇＤと単クローン性（モノクローナル）抗ｇＤ抗
体、５５−５１４Ｉ）との免疫沈降（２列目）、および
Ａ３４９細胞と５５−５の免疫沈降（３列目）；ｇＤ１
２細胞の溶解液からのクローンしたｇＤと、多クローン
性ＨＳ Ｖ −１家兎抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ、）の
免疫沈降（４列目）、および単クローン性抗体５５−５
との免疫沈降（５列目）；３Ｈ−グルコサミンで代謝的
に標識したｇＤ１２細胞からの□クローンしたｇＤと多
クローン性家兎抗Ｈ８Ｖ−１抗体の免疫沈降（６列目）
。 １ ｇＤ１２＠胞系から、Ｈ８Ｖ−１タンパクにｉ異的な（
４１１、単りローン性抗−ｇＤ抗体、５５−５または家
兎抗Ｈｓｖ−１抗体を使用して、５９〜６０ｋｄ（７）
拡散バンドが特異的ｉこ沈澱したことが見られる（４詔
よび５列目）。２の分子量は、Ｈｓｖ、−１に感染させ
たＫＢ細胞（転）から分離されたｇＤ４Ｇ関して報告さ
れた値とよ（一致する。同じ単クローン性抗体が、ｔｔ
ｓｖ−１に感染させたヒト細胞系からの類似の、しかし
分子量の異なるタンパク質を沈降させるのが見られる。
Ａ３４９ヒト肺癌細胞系から沈降させた主生成物は５３
ｋｄであり（２列目）、ヒト胎児肺細胞系（ＨＥＬ）か
ら居降させた生成物は５５に４であった（３列目）、以
前の研究關で、Ｈ５Ｖ糖タンパク質の分子量は宿主によ
って変化し、この相違は糖付加反応の相違に起因すやこ
とが示されている。ＣＨＯ細胞で生産されたｇＤタンパ
ク質が実際に糖付加されているかどうかを調べるために
、細胞を Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識した。３５
５ ＋ ） チオニンまたは Ｈ−グルコサミンで代謝
的に標識した後に、同一分子量のバンドが沈降したこと
か、ら（５および６列目）、ＣＨＯ細胞で生産されたｇ
Ｄタンパク質は糖付加されている。と結論した。
ｋｄであり（２列目）、ヒト胎児肺細胞系（ＨＥＬ）か
ら居降させた生成物は５５に４であった（３列目）、以
前の研究關で、Ｈ５Ｖ糖タンパク質の分子量は宿主によ
って変化し、この相違は糖付加反応の相違に起因すやこ
とが示されている。ＣＨＯ細胞で生産されたｇＤタンパ
ク質が実際に糖付加されているかどうかを調べるために
、細胞を Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識した。３５
５ ＋ ） チオニンまたは Ｈ−グルコサミンで代謝
的に標識した後に、同一分子量のバンドが沈降したこと
か、ら（５および６列目）、ＣＨＯ細胞で生産されたｇ
Ｄタンパク質は糖付加されている。と結論した。
・ 、ヒト細胞系Ａ５４ ｇ （ＡＴＣＣＣＣＬ １８
５ルよびＨＥ ５２ｇ ９ （ＡＴＣＣｃＣｔ １３７
）を、３．５ｃｓの組織培養皿で密に発育させ、Ｈ５Ｖ
−１を細胞当たりＩＱｐｆｕ の多軍度で感染させた。
５ルよびＨＥ ５２ｇ ９ （ＡＴＣＣｃＣｔ １３７
）を、３．５ｃｓの組織培養皿で密に発育させ、Ｈ５Ｖ
−１を細胞当たりＩＱｐｆｕ の多軍度で感染させた。
ウィルス感染細胞はＣ０ｈｅｎら（財）の記載、した方
法と同様の方法で標識し声。感染させてｆ？）ら４吟間
後に、培地を除未、シ、細胞を新しい培養液（Ｄｐｌｂ
ｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地）で１回、更にリン酸緩
！食塩液（ＰＢＳ ）で１回洗滌した。１／ｌＯ規定濃
度のイチオニンを含有する新しい培地を、ａｓ５−メチ
オニ７ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、 Ｉｎｔｅｒｎａｔ １
ｏｎａｌ ）と共に、最終泳射活性が培地−当たり７シ
μＣｉとなるまで細胞に加えた。細胞を更に２０時間発
育させ、次にＥＤＴＡを含有する（０．０２％）ＰＢＳ
で洗滌処理した細胞を回収した。ウィルス性タンパク質
を、ＰＨ５，３％ＮＰ−４０，１％ウシ血清アルブミン
、５Ｘ１０ Ｍフ干二ルメチルスルホニルフルオリド、
および０．０！７ＴＩＵ／−のアポプロチ二ンから成る
溶菌緩衝液に溶解した。得うれた細胞溶解物を小型遠心
機で１２．０００Ｘｇの回転数で遠沈することにより透
明にした。免疫沈降反応を行なうため、細胞またはウィ
ルスの溶解液をリン酸緩衝液で３倍に希釈し、２〜５μ
ｌの好適な抗血清と混合し、４℃で３０分間インキュベ
ートした。抗原−抗体複合物を、固定した１０％Ｓ、ａ
ｕ−ｒｅｕｓ溶液（Ｋｅｓｓｌｅｒ（４０ａ）） の２
５−を加えることによって反応培地から除き、１２，０
００Ｘｇ で３０秒間遠心分離して沈澱させた。欠に、
Ｓ、ａｕ−ｒｅｕ ｓ細胞を洗滌用緩衝液（１） Ｂ
Ｓ、１％ＮＰ−４０，０，３％ドデシル硫酸ナトリウム
）で３回洗滌し、細胞を２０μｌのポリアクリルアミド
ゲルサンプル緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メ
ルカプトエタノール、０．０６２５ＭＩＪスバツファ一
（ｐＨ６，８）、０．０１％ブロモフェノールブルー）
に懸濁させ、９０℃で３分間インキュベートした。３０
秒間遠心分離（ＩＺＯＯＯＸｇ ）した後、上清を１０
％ポリアクリルアミドスラブゲルけ５１にかけた。
法と同様の方法で標識し声。感染させてｆ？）ら４吟間
後に、培地を除未、シ、細胞を新しい培養液（Ｄｐｌｂ
ｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地）で１回、更にリン酸緩
！食塩液（ＰＢＳ ）で１回洗滌した。１／ｌＯ規定濃
度のイチオニンを含有する新しい培地を、ａｓ５−メチ
オニ７ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、 Ｉｎｔｅｒｎａｔ １
ｏｎａｌ ）と共に、最終泳射活性が培地−当たり７シ
μＣｉとなるまで細胞に加えた。細胞を更に２０時間発
育させ、次にＥＤＴＡを含有する（０．０２％）ＰＢＳ
で洗滌処理した細胞を回収した。ウィルス性タンパク質
を、ＰＨ５，３％ＮＰ−４０，１％ウシ血清アルブミン
、５Ｘ１０ Ｍフ干二ルメチルスルホニルフルオリド、
および０．０！７ＴＩＵ／−のアポプロチ二ンから成る
溶菌緩衝液に溶解した。得うれた細胞溶解物を小型遠心
機で１２．０００Ｘｇの回転数で遠沈することにより透
明にした。免疫沈降反応を行なうため、細胞またはウィ
ルスの溶解液をリン酸緩衝液で３倍に希釈し、２〜５μ
ｌの好適な抗血清と混合し、４℃で３０分間インキュベ
ートした。抗原−抗体複合物を、固定した１０％Ｓ、ａ
ｕ−ｒｅｕｓ溶液（Ｋｅｓｓｌｅｒ（４０ａ）） の２
５−を加えることによって反応培地から除き、１２，０
００Ｘｇ で３０秒間遠心分離して沈澱させた。欠に、
Ｓ、ａｕ−ｒｅｕ ｓ細胞を洗滌用緩衝液（１） Ｂ
Ｓ、１％ＮＰ−４０，０，３％ドデシル硫酸ナトリウム
）で３回洗滌し、細胞を２０μｌのポリアクリルアミド
ゲルサンプル緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メ
ルカプトエタノール、０．０６２５ＭＩＪスバツファ一
（ｐＨ６，８）、０．０１％ブロモフェノールブルー）
に懸濁させ、９０℃で３分間インキュベートした。３０
秒間遠心分離（ＩＺＯＯＯＸｇ ）した後、上清を１０
％ポリアクリルアミドスラブゲルけ５１にかけた。
クローンしたｇＤの翻訳後修飾（プロセシング）を更に
調べるために、パルスチェイス実験を行なった。第５Ｂ
図は３５Ｓ−メチオニンでパルス標識した種々の時間後
の、ｇＤ−１２細胞からのクローン化したｇＤと家兎抗
Ｈ５Ｖ−１抗体（１ｋＯＣｏｒｐ、）との免疫沈降線を
示している。第５Ｂ図はｇＤ１２細胞のパルス標識を示
す。これらの研究では、細胞は１００Ｉの組織培養皿で
密集して発育させ、前記と同様にして３５５−メチオニ
ンで標識されるが、標識化反応は氷上で１５分間行ない
、細胞は新しい培養液で３回洗滌した後、恒温器に戻し
、３７℃で種々の時間インキュベートした。
調べるために、パルスチェイス実験を行なった。第５Ｂ
図は３５Ｓ−メチオニンでパルス標識した種々の時間後
の、ｇＤ−１２細胞からのクローン化したｇＤと家兎抗
Ｈ５Ｖ−１抗体（１ｋＯＣｏｒｐ、）との免疫沈降線を
示している。第５Ｂ図はｇＤ１２細胞のパルス標識を示
す。これらの研究では、細胞は１００Ｉの組織培養皿で
密集して発育させ、前記と同様にして３５５−メチオニ
ンで標識されるが、標識化反応は氷上で１５分間行ない
、細胞は新しい培養液で３回洗滌した後、恒温器に戻し
、３７℃で種々の時間インキュベートした。
冷リン酸緩衝食塩液中で細胞を洗滌することによって反
応を停止させ、前記と同様にして細胞を溶解した。タン
パク質はパルス標識後、次の時間で免疫沈降させた＝１
列目、５分後；２列［］、１５分後；分列；、３０分後
；４列目、６０分後；５列目、１２０分後。５ ｌ ｋ
ｄの分子量を有するρの前駆体型は、ｇＤ１２細胞系か
ら、３５Ｓ−メチオニンでパルス標識後、５分後から特
異的に沈降し、この前駆体は約６０分後により高い分子
量型（５９ｋｄ）の所に追跡された。これらの検討から
、本発明者らは、この翻訳後エベントのハーフタイムは
約４５分と推定した。５１ｋｄバンドと５ｇｋｄバンド
との間の前駆体−生成物の関係は、ウィルスが生産した
ｇＤに関する報告（１４，４２，４６，４７）と非常に
よく似ており、またこのプロセスの反応速度はＣｏｈｅ
ｎらの記載（転）とよく類似している。ウィルス感染細
胞における前駆体と生成物の分子量の相違は、Ｎ−結合
および〇−結合オリゴサツカライドの双方に起因してい
る＋４８１０ｇＤが細胞表面へ輸送されるかどうか調べ
るためｆこ、間接免疫螢光実験を行なった。これらの検
討では、細胞膜を透過せしめないような条件下（４９１
で、固定していない細胞を、家兎、マウスおよびヒト抗
Ｈ５Ｖ−１抗体と反応させた。ｇＤ細胞と成体（親）Ｃ
ＨＯ細胞（１：１の比）をカッく一グラス（２，２Ｘ２
．２ｃＩｍ）に載せ、細胞が約６０％密集（ｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ）するまで発育させた。ＨＳ Ｖ −１の抗体
を含有することが判っているヒト血清ωをリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）で４０倍に希釈して、洗滌した細胞にそ
の１００μｌをピペットで滴下し、増湿箱の中で室温で
３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳに３回浸漬
して、結合していない抗体を洗い去り、次に２０倍希釈
のテトラメチルロダミンインチオシアネートー標識ヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ ）ＩＱＯμｌと更に３０分間インキュベートし
た。結合しなかった標識抗体をＰＢＳで洗い去り、細胞
を氷冷した、５０％エタノールおよび１００チエタノー
ル中で脱水し、顕微鏡のスライドグラス上でグリセロー
ルで再水和した（４ｇ１０次に細胞を螢光顕微鏡（Ｚｅ
ｉｓｓ）で位相差および螢光光学下に検鏡した。
応を停止させ、前記と同様にして細胞を溶解した。タン
パク質はパルス標識後、次の時間で免疫沈降させた＝１
列目、５分後；２列［］、１５分後；分列；、３０分後
；４列目、６０分後；５列目、１２０分後。５ ｌ ｋ
ｄの分子量を有するρの前駆体型は、ｇＤ１２細胞系か
ら、３５Ｓ−メチオニンでパルス標識後、５分後から特
異的に沈降し、この前駆体は約６０分後により高い分子
量型（５９ｋｄ）の所に追跡された。これらの検討から
、本発明者らは、この翻訳後エベントのハーフタイムは
約４５分と推定した。５１ｋｄバンドと５ｇｋｄバンド
との間の前駆体−生成物の関係は、ウィルスが生産した
ｇＤに関する報告（１４，４２，４６，４７）と非常に
よく似ており、またこのプロセスの反応速度はＣｏｈｅ
ｎらの記載（転）とよく類似している。ウィルス感染細
胞における前駆体と生成物の分子量の相違は、Ｎ−結合
および〇−結合オリゴサツカライドの双方に起因してい
る＋４８１０ｇＤが細胞表面へ輸送されるかどうか調べ
るためｆこ、間接免疫螢光実験を行なった。これらの検
討では、細胞膜を透過せしめないような条件下（４９１
で、固定していない細胞を、家兎、マウスおよびヒト抗
Ｈ５Ｖ−１抗体と反応させた。ｇＤ細胞と成体（親）Ｃ
ＨＯ細胞（１：１の比）をカッく一グラス（２，２Ｘ２
．２ｃＩｍ）に載せ、細胞が約６０％密集（ｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ）するまで発育させた。ＨＳ Ｖ −１の抗体
を含有することが判っているヒト血清ωをリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）で４０倍に希釈して、洗滌した細胞にそ
の１００μｌをピペットで滴下し、増湿箱の中で室温で
３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳに３回浸漬
して、結合していない抗体を洗い去り、次に２０倍希釈
のテトラメチルロダミンインチオシアネートー標識ヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ ）ＩＱＯμｌと更に３０分間インキュベートし
た。結合しなかった標識抗体をＰＢＳで洗い去り、細胞
を氷冷した、５０％エタノールおよび１００チエタノー
ル中で脱水し、顕微鏡のスライドグラス上でグリセロー
ルで再水和した（４ｇ１０次に細胞を螢光顕微鏡（Ｚｅ
ｉｓｓ）で位相差および螢光光学下に検鏡した。
第４図のＡは、ｇＤｌ ２およびＣＨＯ細胞の位相差光
学的顕微鏡像であり、Ｂは、Ａと同じ細胞を螢光像で把
えたものである。位相差顕微鏡像と螢光顕微鏡像を比較
すると（第４図）、ｇＤｌ ２細胞は強く標識されてい
るのに対し、成体（親）ＣＨＯ細胞は標識抗体とほとん
どまたは全く結合しなかったことがわかる。Ｉ（ＳＶ抗
体に対してネガティブであることが知られている正常マ
ウス血清、正常家兎血清、またはヒト血清で行なった対
照実験では、何ら特異的な細胞の標識は検出できなかっ
た。これらの検討からｇＤは細胞表面へ輸送されること
が示唆された。細胞膜を透過させ得ることが知られてい
る薬剤（メタノールまたはアセトン）で標識する前に固
定したＧ）ＩＯおよびｇＤ細胞での実験では、異なった
標識パターンが得られた。これらの検討で、抗Ｈ５Ｖ−
１抗体によるｇＤ１２細胞の強い核周囲標識が観察され
たが、Ｃ）１０細胞では伺ら特異的な標識化が見られな
かった。
学的顕微鏡像であり、Ｂは、Ａと同じ細胞を螢光像で把
えたものである。位相差顕微鏡像と螢光顕微鏡像を比較
すると（第４図）、ｇＤｌ ２細胞は強く標識されてい
るのに対し、成体（親）ＣＨＯ細胞は標識抗体とほとん
どまたは全く結合しなかったことがわかる。Ｉ（ＳＶ抗
体に対してネガティブであることが知られている正常マ
ウス血清、正常家兎血清、またはヒト血清で行なった対
照実験では、何ら特異的な細胞の標識は検出できなかっ
た。これらの検討からｇＤは細胞表面へ輸送されること
が示唆された。細胞膜を透過させ得ることが知られてい
る薬剤（メタノールまたはアセトン）で標識する前に固
定したＧ）ＩＯおよびｇＤ細胞での実験では、異なった
標識パターンが得られた。これらの検討で、抗Ｈ５Ｖ−
１抗体によるｇＤ１２細胞の強い核周囲標識が観察され
たが、Ｃ）１０細胞では伺ら特異的な標識化が見られな
かった。
ｇＤｌ ２細胞がヒトのｎ５ｖ−１およびＨ５Ｖ−２感
染に対し適切な抗原決定基を発現するかどうか決定する
ために、抗Ｈ５Ｖ−１抗体または抗ＨＳ Ｖ −２抗体
を有することが判っている個体■から得た抗体の結合性
を検討した。代謝的に標識したｇＤｌ ２細胞から得ら
れた細胞溶解物の放射免疫沈降反応では、けつ菌類の抗
Ｈ８Ｖ血清で得られた結果に匹敵し得る結果を得た（第
５図）。
染に対し適切な抗原決定基を発現するかどうか決定する
ために、抗Ｈ５Ｖ−１抗体または抗ＨＳ Ｖ −２抗体
を有することが判っている個体■から得た抗体の結合性
を検討した。代謝的に標識したｇＤｌ ２細胞から得ら
れた細胞溶解物の放射免疫沈降反応では、けつ菌類の抗
Ｈ８Ｖ血清で得られた結果に匹敵し得る結果を得た（第
５図）。
同様に、ヒト抗Ｈ５Ｖ−１血清は、間接的免疫螢光測定
法により、特異的なｇＤｌ ２細胞の標識化を示す（第
４図）が、成体ＣＨＯ細胞系を標識化しなかった。これ
らから、種々のけつ菌類の抗Ｈ８Ｖ−１および抗Ｈ３Ｖ
−２抗血清、単りローン得られた結果は、ｇＤ１２細胞
表面に発現されたｇＤは、野性の該ウィルスと共通した
多くの抗原決定基を有しており、しかもこれらの決定基
の構造は他のＨ５Ｖ−１タンパク質との相互反応に依存
していないという証櫨を提供している。試験しり単クロ
ーン性抗体の一つ（１−８）がインビトロ（４１１およ
びインビボ６１）でＨ８Ｖ−１を中和することが知られ
ている事実は、ＣＨＯ細胞で生産されるｇＤが野性のウ
ィルスと共通した中和抗原決定基を少な（とも１個は有
していることを示している。
法により、特異的なｇＤｌ ２細胞の標識化を示す（第
４図）が、成体ＣＨＯ細胞系を標識化しなかった。これ
らから、種々のけつ菌類の抗Ｈ８Ｖ−１および抗Ｈ３Ｖ
−２抗血清、単りローン得られた結果は、ｇＤ１２細胞
表面に発現されたｇＤは、野性の該ウィルスと共通した
多くの抗原決定基を有しており、しかもこれらの決定基
の構造は他のＨ５Ｖ−１タンパク質との相互反応に依存
していないという証櫨を提供している。試験しり単クロ
ーン性抗体の一つ（１−８）がインビトロ（４１１およ
びインビボ６１）でＨ８Ｖ−１を中和することが知られ
ている事実は、ＣＨＯ細胞で生産されるｇＤが野性のウ
ィルスと共通した中和抗原決定基を少な（とも１個は有
していることを示している。
ｇＤ１２細胞に対する抗Ｈ５Ｖ抗体の結合を定量的に測
定するために酵素標識イムノンープションアツセイ（ｅ
ｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ １ｎｒｎｕｎｏｓｏｒｂｔ
ｉｏｎａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）が開発されたー。今
回の研究では、９６大のマイクロタイター組織培養平板
を使用し、ｇＤ１２細胞とＣＨＯ細胞を交互の穴に加え
、化学的Ｇ、こ固定しな。冬にＨ８Ｖに対する抗体を有
することが判っている種ケの抗血清牽連続的に逐次希釈
して加え、固定した細胞と反応させた。□測定の終末点
で、各穴の吸光度を測定し、正常な結合曲線を作成した
。ｇＤ１２細胞に対する抗体の特異的な結合は、ｇＤ１
２細胞で得られた値から成体ＣＨＯ細胞で得られた値を
減ゼることによって決定した。高い力価の血清による特
異な結合は１：１α０００に希釈して検出すること力≦
できた。
定するために酵素標識イムノンープションアツセイ（ｅ
ｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ １ｎｒｎｕｎｏｓｏｒｂｔ
ｉｏｎａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）が開発されたー。今
回の研究では、９６大のマイクロタイター組織培養平板
を使用し、ｇＤ１２細胞とＣＨＯ細胞を交互の穴に加え
、化学的Ｇ、こ固定しな。冬にＨ８Ｖに対する抗体を有
することが判っている種ケの抗血清牽連続的に逐次希釈
して加え、固定した細胞と反応させた。□測定の終末点
で、各穴の吸光度を測定し、正常な結合曲線を作成した
。ｇＤ１２細胞に対する抗体の特異的な結合は、ｇＤ１
２細胞で得られた値から成体ＣＨＯ細胞で得られた値を
減ゼることによって決定した。高い力価の血清による特
異な結合は１：１α０００に希釈して検出すること力≦
できた。
ｇＤｌ ２細胞ＥＬＩＳＡ測定法を使用して測定した血
清力価を、通常の方法にエリ決定した抗Ｈｓｖ−１と抗
ＨＳ Ｖ −２力価と比較した。予じめ通常の方法、即
ち、血液凝集阻止反応（ＩＨＦ）または補体結合反応Ｃ
ＣＦ ）で■ｓＶに対する力価測定を行なったヒト血消
■を逐次希釈し、ｇＤ１２細胞系または成体Ｃ１（Ｏ細
胞系を含有するマイク自タイター板の孔に加え、抗ｇＤ
抗体の結合をＥＬＩＳＡ測定法で調べた。ｇＤｌ ２細
胞とＣＨＯ細胞は９６穴のマイクロタイター組織培養平
板（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）の穴に交互Ｇこ植
え、１０嗟ウシ胎児血清を加えたＦ１２培地（Ｇ・ＩＢ
ＧＯ）中で、密集して発育させた。細胞をリン酸緩衝食
塩液（Ｐ Ｂ Ｓ ’）で３回□洗滌し、次に０．０６
２５％ゲルタールアルデヒドを加えたＰＢＳで化学的に
固定した。細胞は再度ＰＢＳで３回洗滌し、所望の時期
まで、１チウシ血清アルブミン、１００ｍＭグリシン、
１ｍＭ・Ｎ□ａ Ｎ ａ□を含有するＰＢＳ中で４℃で
貯蔵した。抗ｇＤ抗体力価を測定するには、細胞をＩ’
Ｂ□Ｓで洗滌し、逐次希釈□した抗血清を固定した細胞
と室温で１時間反応させた（最終容量５０μｌり。結合
しない・抗体を洗い去り、細胞を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（Ｔａｇｏ Ｉｎｃ、）とカップリングさせたヤ
ギの抗ヒトＩ ｇＧ （１： ２０００希釈）５０μｌ
とインキュベートした。酵素を結合した抗体を室温で１
時間反応させ、次に細胞をＰＢＳで３回洗”滌した。イ
ンキュベーションの後、ペルオキシダーゼの基質、０−
フェニレンジアミンを加え（２００μｌ）、更に１０分
間反応を進行させた。２．５ Ｍ Ｈ２’Ｓ ０４ （
５０μｌりを加えて反応を停止し、各穴の反応・液の吸
光度を自動プレートリーディングスペクトロフォトメー
ターσ”ｔｔｅｒｔｅｋ）で測定した。第６図において
、白丸および黒丸で表わした血清は、１２８のＨ５Ｖ−
ＩＣＦ力価、および４０９６（７）Ｈ５Ｖ−１お！びＨ
８Ｖ−２のＩＨＦ力価を示している。白の四角および黒
の四角で表わした血清は、８以下のＨ５Ｖ−１ｃＦ力価
、８以下のＨＳ Ｖ −１およびＨ５Ｖ−２ＩＨＦ力価
を示している。Ａ図の黒丸および黒の四角はｇＤｌ ２
細胞との結合を示し、白丸および白の四角はＣＨＯ細胞
との結合を示す。Ｂ図の黒丸および黒の四角は、Ａにお
ける値を差引いて算出したｇＤ１２細胞への特異的な結
合を示す。第６図から、通常の方法による測定で高い抗
Ｈ８Ｖ力価を示した血清は、ＥＬＩＳＡ法でも高い力価
が得られるが、一方、低い抗Ｈ５Ｖ力価の別の血清では
ｇＤ１２ＥＬＩｓＡで検出し得る結合が得られないこと
が判る。
清力価を、通常の方法にエリ決定した抗Ｈｓｖ−１と抗
ＨＳ Ｖ −２力価と比較した。予じめ通常の方法、即
ち、血液凝集阻止反応（ＩＨＦ）または補体結合反応Ｃ
ＣＦ ）で■ｓＶに対する力価測定を行なったヒト血消
■を逐次希釈し、ｇＤ１２細胞系または成体Ｃ１（Ｏ細
胞系を含有するマイク自タイター板の孔に加え、抗ｇＤ
抗体の結合をＥＬＩＳＡ測定法で調べた。ｇＤｌ ２細
胞とＣＨＯ細胞は９６穴のマイクロタイター組織培養平
板（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）の穴に交互Ｇこ植
え、１０嗟ウシ胎児血清を加えたＦ１２培地（Ｇ・ＩＢ
ＧＯ）中で、密集して発育させた。細胞をリン酸緩衝食
塩液（Ｐ Ｂ Ｓ ’）で３回□洗滌し、次に０．０６
２５％ゲルタールアルデヒドを加えたＰＢＳで化学的に
固定した。細胞は再度ＰＢＳで３回洗滌し、所望の時期
まで、１チウシ血清アルブミン、１００ｍＭグリシン、
１ｍＭ・Ｎ□ａ Ｎ ａ□を含有するＰＢＳ中で４℃で
貯蔵した。抗ｇＤ抗体力価を測定するには、細胞をＩ’
Ｂ□Ｓで洗滌し、逐次希釈□した抗血清を固定した細胞
と室温で１時間反応させた（最終容量５０μｌり。結合
しない・抗体を洗い去り、細胞を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（Ｔａｇｏ Ｉｎｃ、）とカップリングさせたヤ
ギの抗ヒトＩ ｇＧ （１： ２０００希釈）５０μｌ
とインキュベートした。酵素を結合した抗体を室温で１
時間反応させ、次に細胞をＰＢＳで３回洗”滌した。イ
ンキュベーションの後、ペルオキシダーゼの基質、０−
フェニレンジアミンを加え（２００μｌ）、更に１０分
間反応を進行させた。２．５ Ｍ Ｈ２’Ｓ ０４ （
５０μｌりを加えて反応を停止し、各穴の反応・液の吸
光度を自動プレートリーディングスペクトロフォトメー
ターσ”ｔｔｅｒｔｅｋ）で測定した。第６図において
、白丸および黒丸で表わした血清は、１２８のＨ５Ｖ−
ＩＣＦ力価、および４０９６（７）Ｈ５Ｖ−１お！びＨ
８Ｖ−２のＩＨＦ力価を示している。白の四角および黒
の四角で表わした血清は、８以下のＨ５Ｖ−１ｃＦ力価
、８以下のＨＳ Ｖ −１およびＨ５Ｖ−２ＩＨＦ力価
を示している。Ａ図の黒丸および黒の四角はｇＤｌ ２
細胞との結合を示し、白丸および白の四角はＣＨＯ細胞
との結合を示す。Ｂ図の黒丸および黒の四角は、Ａにお
ける値を差引いて算出したｇＤ１２細胞への特異的な結
合を示す。第６図から、通常の方法による測定で高い抗
Ｈ８Ｖ力価を示した血清は、ＥＬＩＳＡ法でも高い力価
が得られるが、一方、低い抗Ｈ５Ｖ力価の別の血清では
ｇＤ１２ＥＬＩｓＡで検出し得る結合が得られないこと
が判る。
記載した検討から、安定した細胞系列は、ヘルペスウィ
ルス感染によって生じる抗体と結合するトランスフェク
ト遺伝子産物を、細胞表面に構成的に発現することが証
明された。
ルス感染によって生じる抗体と結合するトランスフェク
ト遺伝子産物を、細胞表面に構成的に発現することが証
明された。
ｇＤ１２細胞によるマウスの免疫感作
雌性Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系？’７ス（５週令）２０
匹をＳｉ−ｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（
Ｇｉｌｒｏｙ％Ｃａｌ ｉ ｆｏｒ −ｎｉａ）から入
手した。マウスを各１０匹づつの“実騨群と“対照８群
の２群に分けた。実験群の各マウスには、細胞表面にＨ
Ｓ Ｖ −１糖タンパク質りを発現することが知られて
いるｇＤｌ ２細胞を注射した。対照群の各マウスには
、ｇＤｌ２［ｉｌが誘導さ、れた成体（親）チャイニー
ズハムスターの卵巣細胞系（ＣＨＯ細胞）を注射した。
匹をＳｉ−ｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（
Ｇｉｌｒｏｙ％Ｃａｌ ｉ ｆｏｒ −ｎｉａ）から入
手した。マウスを各１０匹づつの“実騨群と“対照８群
の２群に分けた。実験群の各マウスには、細胞表面にＨ
Ｓ Ｖ −１糖タンパク質りを発現することが知られて
いるｇＤｌ ２細胞を注射した。対照群の各マウスには
、ｇＤｌ２［ｉｌが誘導さ、れた成体（親）チャイニー
ズハムスターの卵巣細胞系（ＣＨＯ細胞）を注射した。
マウスを免疫感作するために、この２つのタイプの細胞
を１５ｃｍの組織培養皿に密集して増殖させた。ＣＨＯ
細胞は、市販の透析した７％ウシ胎児血清（Ｇ Ｉ Ｂ
ＣＯ）、ヘニシリン（１ｏｏｕ／ｒｎ！、）、およびス
トレプトマイシン（１００ｕ／ｍ／）を添加したＨａｍ
ｓ Ｆ１２培地（ＧＩＢＧＯ）で発育さセｆ、ニーｏｇ
Ｄ１２細胞はグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン
を欠いた同じ培地に発育させた。細胞を回収するため、
６皿を１５ｒｎｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回
洗滌し、次に０，０２チＥＤＴＡを加えた１５−のＰＢ
Ｓで処理した。１５〜２０分後に細胞を皿から除き、臨
床検査用遠心機（ＩＥＣモデルＣＬ臨床用遠心機、ロー
ターモデル２２１ンを用い、全速回転で５分間遠心分離
することによりペレット化した。上清を廃棄し、各１５
ｃＩＫの皿上の細胞当たりＰＢＳの最終濃度が１４とな
るよう、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。各マウス１匹当
たり０．５−の細胞浮遊液（〜５Ｘ１０６細胞）を、そ
の０．２５４を腹腔内に、０．２５４を頚背部のたるん
だ皮膚に皮下注射するやり方で注入した。
を１５ｃｍの組織培養皿に密集して増殖させた。ＣＨＯ
細胞は、市販の透析した７％ウシ胎児血清（Ｇ Ｉ Ｂ
ＣＯ）、ヘニシリン（１ｏｏｕ／ｒｎ！、）、およびス
トレプトマイシン（１００ｕ／ｍ／）を添加したＨａｍ
ｓ Ｆ１２培地（ＧＩＢＧＯ）で発育さセｆ、ニーｏｇ
Ｄ１２細胞はグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン
を欠いた同じ培地に発育させた。細胞を回収するため、
６皿を１５ｒｎｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回
洗滌し、次に０，０２チＥＤＴＡを加えた１５−のＰＢ
Ｓで処理した。１５〜２０分後に細胞を皿から除き、臨
床検査用遠心機（ＩＥＣモデルＣＬ臨床用遠心機、ロー
ターモデル２２１ンを用い、全速回転で５分間遠心分離
することによりペレット化した。上清を廃棄し、各１５
ｃＩＫの皿上の細胞当たりＰＢＳの最終濃度が１４とな
るよう、細胞をＰＢＳに再懸濁させた。各マウス１匹当
たり０．５−の細胞浮遊液（〜５Ｘ１０６細胞）を、そ
の０．２５４を腹腔内に、０．２５４を頚背部のたるん
だ皮膚に皮下注射するやり方で注入した。
次いでマウスに、−次免疫感作後３８日目および５５日
目の２回、新しい細胞（前記と同様にして調製する）で
追加免疫した。６８日目に、マウスの尾静脈から採血し
、インビトロの中和試験用の血清を得た。７０日目にマ
ウスに）ＩＳｖ−１（Ｍａｃ Ｉｎｔｙｒｅ株）をチャ
レンジ（抗原刺激）した。
目の２回、新しい細胞（前記と同様にして調製する）で
追加免疫した。６８日目に、マウスの尾静脈から採血し
、インビトロの中和試験用の血清を得た。７０日目にマ
ウスに）ＩＳｖ−１（Ｍａｃ Ｉｎｔｙｒｅ株）をチャ
レンジ（抗原刺激）した。
ウィルスのチャレンジは、各マウス当たり２×１０７ｐ
ｆｕ のウィルスの腹腔内注射によって行なった。
ｆｕ のウィルスの腹腔内注射によって行なった。
マウスの死亡率、１日おきの体重変化および麻痺の出現
を毎日記録した。対照群のマウスは、ウィルスチャレン
ジ後７日以内に金側死亡したのに対し、実験群マウスは
金側防御され、何ら感染の徴候を示さなかった。この研
究によって、ｇＤ１２細胞による免疫感作は致死量のＨ
Ｓ Ｖ −１ウイルスのチャレンジを防御することが結
論された。
を毎日記録した。対照群のマウスは、ウィルスチャレン
ジ後７日以内に金側死亡したのに対し、実験群マウスは
金側防御され、何ら感染の徴候を示さなかった。この研
究によって、ｇＤ１２細胞による免疫感作は致死量のＨ
Ｓ Ｖ −１ウイルスのチャレンジを防御することが結
論された。
種々の選択マーカーを使用して、種々のトランスフェク
ション計画が可能である。例えば、マウスＬ細胞は変異
体ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用して、有効
にトランスフェクションされる。ｇＤ遺伝子を、そのよ
うなマーカーを包含するベクターを介してそのような細
胞にトランスフェクトした。原則として、本発明者らが
記載した方法は、膜タンパク質の発現が所望される如何
なる状況においても適用が可能である。
ション計画が可能である。例えば、マウスＬ細胞は変異
体ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用して、有効
にトランスフェクションされる。ｇＤ遺伝子を、そのよ
うなマーカーを包含するベクターを介してそのような細
胞にトランスフェクトした。原則として、本発明者らが
記載した方法は、膜タンパク質の発現が所望される如何
なる状況においても適用が可能である。
先端切断型ｇＤ遺伝子の発現
これまでの記述は膜結合型ｇＤ膜タンパク質生産に関す
る。然しなから、第２図に関連して先に論じたように、
Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２のｇＤ膜タンパク質アミノ酸配
列の解析から、いずれの場合も疎水性／親水性カルボキ
シル末端の膜結合領域の存在することが確かめられた（
第７図）。
る。然しなから、第２図に関連して先に論じたように、
Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２のｇＤ膜タンパク質アミノ酸配
列の解析から、いずれの場合も疎水性／親水性カルボキ
シル末端の膜結合領域の存在することが確かめられた（
第７図）。
Ｈ８Ｖ−１糖タンパク質（ｇＤ）の模式図遺伝子配列か
ら導かれたｇＤ遺伝子配列のヒトロバシー解析（３１ａ
）から、タンパク質の疎水性領域（陰影部分）および親
水性領域（＋印）が決定された。膜に局在し、結合する
のに重要であると思われる領域だけを示した。機能的領
域は、ａ）シグナル配列（至）、ｂ）疎水性の膜透過領
域、Ｃ）荷電している膜固定領域である。推定される３
ケ所のＮ一連結糖付加部位はＧの文字で示す。発現プラ
スミドは、ｐ Ｂ Ｒ３２２の細菌性複製起源とアンピ
シリン耐性遺伝子、ＳＶ４０初期（第一）プロモーター
の転写コントロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダク
ターゼ遺伝子を暗号化しているｃＤＮＡ挿入体Ｑ、およ
び第２のｓｖ４ Ｑ初期プロモーターの転写コントロー
ル下にあるｇＤの最初の３００アミノ酸を暗号化してい
るＨｉｎｄ ｌｌｌ−Ｈ１ｎｔ１断片から成る。この断
片のＨｉｎｄｕ 部位は、ｇＤ遺伝子のイニシエーター
メチオニンの５′−位側へ７４ｂＰに位置している。５
Ｖ−４０の初期領域ベクターのＨｉｎｄ Ｉ１１部位（
至）はＳＶ４ ＱプロモーターのＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈ
ｏｇｎｅｓｓ ボックスの３′−位側へ２５０ｂＰｉＣ
位置しティる。Ｈｉｎｆ１部位（Ｋｌ ｅｎｏｗＤＮＡ
ポリメラーゼと４デオキシヌクレオチド−３リン酸で平
滑化した）を、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子の３
′非翻訳領域のＨｐａ １部位０６）へ連結（リケーシ
ョン）する。この方法は先端切断Ｈ５Ｖ−２遺伝子を生
産するのにも有用である。
ら導かれたｇＤ遺伝子配列のヒトロバシー解析（３１ａ
）から、タンパク質の疎水性領域（陰影部分）および親
水性領域（＋印）が決定された。膜に局在し、結合する
のに重要であると思われる領域だけを示した。機能的領
域は、ａ）シグナル配列（至）、ｂ）疎水性の膜透過領
域、Ｃ）荷電している膜固定領域である。推定される３
ケ所のＮ一連結糖付加部位はＧの文字で示す。発現プラ
スミドは、ｐ Ｂ Ｒ３２２の細菌性複製起源とアンピ
シリン耐性遺伝子、ＳＶ４０初期（第一）プロモーター
の転写コントロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダク
ターゼ遺伝子を暗号化しているｃＤＮＡ挿入体Ｑ、およ
び第２のｓｖ４ Ｑ初期プロモーターの転写コントロー
ル下にあるｇＤの最初の３００アミノ酸を暗号化してい
るＨｉｎｄ ｌｌｌ−Ｈ１ｎｔ１断片から成る。この断
片のＨｉｎｄｕ 部位は、ｇＤ遺伝子のイニシエーター
メチオニンの５′−位側へ７４ｂＰに位置している。５
Ｖ−４０の初期領域ベクターのＨｉｎｄ Ｉ１１部位（
至）はＳＶ４ ＱプロモーターのＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈ
ｏｇｎｅｓｓ ボックスの３′−位側へ２５０ｂＰｉＣ
位置しティる。Ｈｉｎｆ１部位（Ｋｌ ｅｎｏｗＤＮＡ
ポリメラーゼと４デオキシヌクレオチド−３リン酸で平
滑化した）を、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原遺伝子の３
′非翻訳領域のＨｐａ １部位０６）へ連結（リケーシ
ョン）する。この方法は先端切断Ｈ５Ｖ−２遺伝子を生
産するのにも有用である。
得られた配列は、ｇＤ遺伝子のアミノ酸３００のすぐ後
に停止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端切断ｇＤ遺伝
子転写のための転写停止およびポリアデニル化部位は、
Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の３′非翻訳領域（至）により
暗号化されている。
に停止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端切断ｇＤ遺伝
子転写のための転写停止およびポリアデニル化部位は、
Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の３′非翻訳領域（至）により
暗号化されている。
プラスミドｐ ｇ Ｄ ｔｒｕｎｃ、ｄｈｆｒは次（Ｄ
ｊうにして組み立てられた。ｇＤを含有している２、９
キロベースのＳａｃ ｌ 断片を、５ａｃｌで切断した
プラスミドｐＦＭ３（前述）中でＨＳ Ｖ −１ゲノム
（前述）からクローンしたＢａｍＨ１断片から分離した
。完全なｇＤ遺伝子を含有する１、６ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ｍ−ＢｓｔＮｌ断片を、Ｈｉｎｄ ＩＩ−ＢｓｔＮｌで
消化したＰＦＭ４２ （ＥＰＯ特許出願第６８６９３号
）へサブクローンした。次に、このプラスミドをＨｉｎ
Ｅｌで切断し、Ｋｌ ｅｎｏｗ Ｄ Ｎ Ａポリメラー
ゼと４個のデオキシヌクレオチド−３リン、酸で平滑化
し、次いでＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した。先端を切断し
たｇＤ遺伝子を含有する９６０塩基対（ｂｐ）のＢｉｎ
ｄ ｍ−プラント（平滑化）Ｈｉｎｆｌ断片を分離し、
Ｈｉｎｄ ＩＩ −Ｈｐａ １ テ消化したｐ、ＥＨＢ
ａｌ１４へ連結した。得られた組み立て体（ｐｇＤｃｏ
ｓ −ｔ ｒｕｎｃ）は、その３プライム末端にＢ型
肝炎ワイルスの表面抗原遺伝子を持った先端切断ｇＤ遺
伝子を含有し・でいた。先端を切断されたｇＤ遺伝子を
含有する。２．３ 、ｋ ｂ Ｈｉｎｄ ＩＩ−Ｂａｍ
Ｈ１断片をｐｇＤＣｏｓ −・ｔｒｕｎｃから分離した
。５Ｖ−４９由来の初期プロモーターおよびｐＢＲ３，
２２アンピシリン耐性遺伝子・および細菌性複製起源を
含有する２、Ｂｋｂ断片をプラスミドｐＥＨＢａｌ１４
から分離した。
ｊうにして組み立てられた。ｇＤを含有している２、９
キロベースのＳａｃ ｌ 断片を、５ａｃｌで切断した
プラスミドｐＦＭ３（前述）中でＨＳ Ｖ −１ゲノム
（前述）からクローンしたＢａｍＨ１断片から分離した
。完全なｇＤ遺伝子を含有する１、６ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ｍ−ＢｓｔＮｌ断片を、Ｈｉｎｄ ＩＩ−ＢｓｔＮｌで
消化したＰＦＭ４２ （ＥＰＯ特許出願第６８６９３号
）へサブクローンした。次に、このプラスミドをＨｉｎ
Ｅｌで切断し、Ｋｌ ｅｎｏｗ Ｄ Ｎ Ａポリメラー
ゼと４個のデオキシヌクレオチド−３リン、酸で平滑化
し、次いでＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した。先端を切断し
たｇＤ遺伝子を含有する９６０塩基対（ｂｐ）のＢｉｎ
ｄ ｍ−プラント（平滑化）Ｈｉｎｆｌ断片を分離し、
Ｈｉｎｄ ＩＩ −Ｈｐａ １ テ消化したｐ、ＥＨＢ
ａｌ１４へ連結した。得られた組み立て体（ｐｇＤｃｏ
ｓ −ｔ ｒｕｎｃ）は、その３プライム末端にＢ型
肝炎ワイルスの表面抗原遺伝子を持った先端切断ｇＤ遺
伝子を含有し・でいた。先端を切断されたｇＤ遺伝子を
含有する。２．３ 、ｋ ｂ Ｈｉｎｄ ＩＩ−Ｂａｍ
Ｈ１断片をｐｇＤＣｏｓ −・ｔｒｕｎｃから分離した
。５Ｖ−４９由来の初期プロモーターおよびｐＢＲ３，
２２アンピシリン耐性遺伝子・および細菌性複製起源を
含有する２、Ｂｋｂ断片をプラスミドｐＥＨＢａｌ１４
から分離した。
第２（７）ＳＶ−４（１３期プロモーターの転写コント
ロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼＣＩ）
ＮＡ り・ローンを含有する２、１・ｋｂ断片をプラ、
ｃ ｉ ＦｐＥ３４８ ＨＢＶＥ４００Ｄ２２Ｃ３６）
から分離した。これら３個の断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガー
ゼで連結し、得られた混合物をＥ、ｃｏ自自画菌株２９
４の導入に使用した。得られたコロニーから得たプラス
ミドＤＮＡを５ａｃ２でスクリーニングし、正確に組み
立てられたｐｇＤＬｒｕｎｃ、ｄｈｆｒ （第８図）を
更にトランスフェクション研究に使用した。
ロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼＣＩ）
ＮＡ り・ローンを含有する２、１・ｋｂ断片をプラ、
ｃ ｉ ＦｐＥ３４８ ＨＢＶＥ４００Ｄ２２Ｃ３６）
から分離した。これら３個の断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガー
ゼで連結し、得られた混合物をＥ、ｃｏ自自画菌株２９
４の導入に使用した。得られたコロニーから得たプラス
ミドＤＮＡを５ａｃ２でスクリーニングし、正確に組み
立てられたｐｇＤＬｒｕｎｃ、ｄｈｆｒ （第８図）を
更にトランスフェクション研究に使用した。
プラスミドｐＥＨＢ’ａｌ１４は、５Ｖ−４０＝肝炎ウ
イルスのキメラ遺伝学であるＰＥ３４２△ｋｌ（後述）
をＸｂａＩで開裂することにより、一度ＨＢＶ表面抗原
の暗号化領域において開裂し、引続キコノＸｂａ■部位
の周囲の配列をヌクレアーゼＢａｌ’３１を使用して除
去することにより組み立てた。このプラスミドを合成オ
リゴヌクレオチド５′−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣの存在下
でライゲート尤だ。
イルスのキメラ遺伝学であるＰＥ３４２△ｋｌ（後述）
をＸｂａＩで開裂することにより、一度ＨＢＶ表面抗原
の暗号化領域において開裂し、引続キコノＸｂａ■部位
の周囲の配列をヌクレアーゼＢａｌ’３１を使用して除
去することにより組み立てた。このプラスミドを合成オ
リゴヌクレオチド５′−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣの存在下
でライゲート尤だ。
これによ□す、ＨＢＶ％ＤＮＡに川ｎｄ ＩＩＩ制限部
位が加わる。
位が加わる。
得られたプラスミドを、〜１５０ｂｐのＥｃｏＲ１７Ｈ
ｉｎｄｕ断片にづいてスクリーニングした。ｐＥＨＢａ
ｌ １４ の配列決定をし、Ｈｉｎｄ １１部位はＨＢ
ｓＡ ｇ開始コドンが標準的に見出される場所のすぐ
上流の位置に存在することが確かめられた。このように
、この組み立てにより、クローンするのに好適な独特の
１ｌｉｎｄ Ｉ１１部位が、高度に発現されるタンパク
質（ＨＢｓＡｇ）の翻訳開始位置に置かれる。タンパク
質を高度に発現するのに必要ななんらかの推定されるシ
グナルが、この５′−リーダー配列上に存在するはずで
ある。
ｉｎｄｕ断片にづいてスクリーニングした。ｐＥＨＢａ
ｌ １４ の配列決定をし、Ｈｉｎｄ １１部位はＨＢ
ｓＡ ｇ開始コドンが標準的に見出される場所のすぐ
上流の位置に存在することが確かめられた。このように
、この組み立てにより、クローンするのに好適な独特の
１ｌｉｎｄ Ｉ１１部位が、高度に発現されるタンパク
質（ＨＢｓＡｇ）の翻訳開始位置に置かれる。タンパク
質を高度に発現するのに必要ななんらかの推定されるシ
グナルが、この５′−リーダー配列上に存在するはずで
ある。
１−Ｉ Ｂ Ｖ表面抗原を発現するプラスミドＰＥ３４
２（Ｐ）ＩＢＳ３４８−Ｅ とも呼ばれる）は、ＥＰＯ
公報第００７３６５６号（１９８３年３月９日）ｌこＬ
ｅｖｉｎｓｏｎらにより記載されている（簡単に説明す
ると、５１ｍ１ａｎウイルスＳＶ４０の起源は、５Ｖ４
ＱＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、コンバーター（
ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ）を加えることに、ｃすＨｉｎｄ
ｍ末端をＥ ｃ ｏ Ｒ１末端へ変換することによっ
て分離した。）。このＤＮＡをＰｖｕ ＩＩで切断し、
ＲＩ ＩＪンカーを加えた。次いでＥ ｃ ｏ ＲＩで
消化した後、起源にまで及ぶ３４８塩基対（ｂｐ）の断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法および電気溶出
法により分離し、ｐＢＲ３２２にクローンした。ＨＢＶ
をＥｃｏＲＩおよびＢｇ■で消化して得られた１ ９８
６ ｂｐ断片（Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ。
２（Ｐ）ＩＢＳ３４８−Ｅ とも呼ばれる）は、ＥＰＯ
公報第００７３６５６号（１９８３年３月９日）ｌこＬ
ｅｖｉｎｓｏｎらにより記載されている（簡単に説明す
ると、５１ｍ１ａｎウイルスＳＶ４０の起源は、５Ｖ４
ＱＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、コンバーター（
ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ）を加えることに、ｃすＨｉｎｄ
ｍ末端をＥ ｃ ｏ Ｒ１末端へ変換することによっ
て分離した。）。このＤＮＡをＰｖｕ ＩＩで切断し、
ＲＩ ＩＪンカーを加えた。次いでＥ ｃ ｏ ＲＩで
消化した後、起源にまで及ぶ３４８塩基対（ｂｐ）の断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法および電気溶出
法により分離し、ｐＢＲ３２２にクローンした。ＨＢＶ
をＥｃｏＲＩおよびＢｇ■で消化して得られた１ ９８
６ ｂｐ断片（Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ。
（Ｃ１１，５）Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９
８０）） （これはＨＢｓＡｇを暗号化している遺伝子
にまで及ぶ）をプラスミドｐ Ｍ Ｌ （Ｌｕｓｋｙら
、 Ｎａｔｕｒｅ、２９３ニア９（１９８１） ）のＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位にクローンスることによって
、発現プラスミドｐＨＢ Ｓ ３４２−Ｅを組み立てた
。（ｐＭＬは、サル細胞におけるプラスミド複製を抑制
する配列を欠失したｐＢＲ３２２の誘導体である）。次
に、得られたプラスミド（ｐ ＲＩ −Ｂｇｌ ）をＥ
ｃｏＲｌとつなぎ、ＳＶ４ Ｑの起源領域を表わす３４
８ ｂｐの断片をｐＲｌ −Ｂ ｇ １のＥｃｏＲ１部
位へ導入した。起源断片はどちらの方向からでも挿入で
きる。この断片は複製起源だけではなく、初期および後
期ＳＶ４ Ｑプロモータの両方を暗号化しているので、
ＨＢ Ｖ遺伝子はこの方向によってどちらかのプロモー
ターのコントロール下に発現されることができる（１−
（Ｂｓ を表わすｐＨＢｓ−３４７３−Ｅ は初期プロ
モーターのコントロール下に発現される）。ｐＥ３４２
は、Ｅｃ。
８０）） （これはＨＢｓＡｇを暗号化している遺伝子
にまで及ぶ）をプラスミドｐ Ｍ Ｌ （Ｌｕｓｋｙら
、 Ｎａｔｕｒｅ、２９３ニア９（１９８１） ）のＥ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位にクローンスることによって
、発現プラスミドｐＨＢ Ｓ ３４２−Ｅを組み立てた
。（ｐＭＬは、サル細胞におけるプラスミド複製を抑制
する配列を欠失したｐＢＲ３２２の誘導体である）。次
に、得られたプラスミド（ｐ ＲＩ −Ｂｇｌ ）をＥ
ｃｏＲｌとつなぎ、ＳＶ４ Ｑの起源領域を表わす３４
８ ｂｐの断片をｐＲｌ −Ｂ ｇ １のＥｃｏＲ１部
位へ導入した。起源断片はどちらの方向からでも挿入で
きる。この断片は複製起源だけではなく、初期および後
期ＳＶ４ Ｑプロモータの両方を暗号化しているので、
ＨＢ Ｖ遺伝子はこの方向によってどちらかのプロモー
ターのコントロール下に発現されることができる（１−
（Ｂｓ を表わすｐＨＢｓ−３４７３−Ｅ は初期プロ
モーターのコントロール下に発現される）。ｐＥ３４２
は、Ｅｃ。
Ｒ１で部分消化し、Ｋｌ ｅｎｏｗ Ｄ Ｎ Ａポリメ
ラーゼＩを使用して切断部位を充填し、プラスミドの背
後同志を連結（リゲーション）し、ＰＥ３４２のＳＶ４
Ｑ起源に先行するＥｃｏＲＩ部位を除くことにより修
飾された。得られたプラスミドはＰＥ３４２△ｋｌ と
命名した。
ラーゼＩを使用して切断部位を充填し、プラスミドの背
後同志を連結（リゲーション）し、ＰＥ３４２のＳＶ４
Ｑ起源に先行するＥｃｏＲＩ部位を除くことにより修
飾された。得られたプラスミドはＰＥ３４２△ｋｌ と
命名した。
得られた配列はｇＤ遺伝子のアミノ酸３００のすぐ列に
停止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端を切り取ったｇ
Ｄ遺伝子転写の転写停止部位とポリアデニル化部位は、
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原の非翻訳３′領域伽）によっ
て暗号化されている。
停止コドン（ＴＡＡ）を作り出す。先端を切り取ったｇ
Ｄ遺伝子転写の転写停止部位とポリアデニル化部位は、
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原の非翻訳３′領域伽）によっ
て暗号化されている。
生成したベクターをｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞系６９ヘトラ
ンスフエクション（ＤＮＡ感染）させ、先端を切り取っ
たｇＤタンパク質を生産し７、それを周囲の媒質へ分泌
する好適なりローンｇＧ１０．２を選択した。タンパク
質を媒質から抽出し、細胞の免疫原性活性を試験した。
ンスフエクション（ＤＮＡ感染）させ、先端を切り取っ
たｇＤタンパク質を生産し７、それを周囲の媒質へ分泌
する好適なりローンｇＧ１０．２を選択した。タンパク
質を媒質から抽出し、細胞の免疫原性活性を試験した。
第９図に、細胞内および細胞外の３５５−メチオニン標
識抽出物の免疫沈降試験の成績を示す。
識抽出物の免疫沈降試験の成績を示す。
細胞連合型および分泌型ｇＤの放射免疫沈降試験市販の
透析した７％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリ
ン（１００ｕ／ｆｎｌ）、およびストレプトマイシン（
１００ｕ／ｒｎｌ）を添加したＨａｍ（７） Ｆ ］
２ 培地（Ｇｉｂｃｏ） に細胞を発育させた。培養が
約８０％に密集した時に、培地を除去し、細胞をリン酸
緩衝食塩液（ＰＨ１）で２回洗滌し、標識培地（昇〇規
定濃度のメチオニンを含有する１）ｕｌｂｅｃｃｏ ＋
こより改良されたＥａｇｌｅ培地）を最終濃度０．０５
．ｄ／ｄとなるまで加えた。３５Ｓ−メチオニン（ＳＪ
。
透析した７％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリ
ン（１００ｕ／ｆｎｌ）、およびストレプトマイシン（
１００ｕ／ｒｎｌ）を添加したＨａｍ（７） Ｆ ］
２ 培地（Ｇｉｂｃｏ） に細胞を発育させた。培養が
約８０％に密集した時に、培地を除去し、細胞をリン酸
緩衝食塩液（ＰＨ１）で２回洗滌し、標識培地（昇〇規
定濃度のメチオニンを含有する１）ｕｌｂｅｃｃｏ ＋
こより改良されたＥａｇｌｅ培地）を最終濃度０．０５
．ｄ／ｄとなるまで加えた。３５Ｓ−メチオニン（ＳＪ
。
２０４、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ、）を最終濃度５０
−１７５ｕｃｉ／−となるまで加え、細胞を１８〜２０
時間発育させた。標識後、培地を回収し、細胞をＰＢＳ
で２回洗滌し、０．０２％ＥＤＴＡを加えたＰＢＳで処
理することにより培養皿から除いた。次に細胞を、ＰＢ
Ｓ、３％ＮＰ−４０．０．１％ウシ血清アルフミン、５
Ｘ１０ ”Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、お
よび０．０１７ ＴＩＵ／ｒｎｌのアボプロチニンから
成る細胞溶解緩衝液に溶解し、得られた溶解液を１２．
０００Ｘｇで遠心分離することにより透明にした。免疫
沈降反応に使用するため、細胞溶解液をＰＢＳで３倍に
希釈し、検波（標準的には１８０μｌ）を２〜５μｌの
抗血清と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。
−１７５ｕｃｉ／−となるまで加え、細胞を１８〜２０
時間発育させた。標識後、培地を回収し、細胞をＰＢＳ
で２回洗滌し、０．０２％ＥＤＴＡを加えたＰＢＳで処
理することにより培養皿から除いた。次に細胞を、ＰＢ
Ｓ、３％ＮＰ−４０．０．１％ウシ血清アルフミン、５
Ｘ１０ ”Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、お
よび０．０１７ ＴＩＵ／ｒｎｌのアボプロチニンから
成る細胞溶解緩衝液に溶解し、得られた溶解液を１２．
０００Ｘｇで遠心分離することにより透明にした。免疫
沈降反応に使用するため、細胞溶解液をＰＢＳで３倍に
希釈し、検波（標準的には１８０μｌ）を２〜５μｌの
抗血清と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。
分泌型のｇＤを免疫沈降するため、５００μｌの条件培
地を２μｌの抗血清と３０分間、４℃でインキュベート
した。免疫複合体はＫｅｓｓｌｅｒ（Ｄ方法（４０ａ）
により固定したＳ、ａｕｒｅｕｓ細胞に吸着させ、１２
、ＯＯＯＸｇで３０分間遠心分離して沈降させた。次に
□、Ｓ、ａｕｒｅｕｓ細胞を洗滌緩衝液（ＰＢＳ、１％
ＮＰ−４Ｑ、０．３０％ドデシル硫酸ナトリウム）で３
回洗滌し、免疫複合体を２０μｌのポリアクリルアミド
ゲルサンプル緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メ
ルカプトエタノール、０．０１チブロモフエノールブル
ーを含有する６ ２．５ ｍＭトリス−ＨＣ１！ 緩衝
液（ｐＨ６，８） ）で、９０℃で３分間溶出した。３
０秒間遠心後、Ｌａ ｅｍｍｉ ｌ ｉの方法（４！９
に従い、上清を１０％ポリアクリルアミド平板（スラブ
）ゲルに掛けた。Ａ：ｇＤ１２細胞系から得た全膜結合
型ｇＤの免疫沈降反応９日２個の別個に誘導した細胞系
（１および２）の溶解液から得た先端切断ｇＤの細胞連
合型の免疫沈降線。Ｃ：Ｂに示した２個の細胞系の培養
上清から得られた先端切断ｇＤの免疫沈降線。（−）は
、対照家兎抗血清を示し、（＋）は、家兎抗ＨＳ Ｖ
−１抗血清を示す（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ、 ）。
地を２μｌの抗血清と３０分間、４℃でインキュベート
した。免疫複合体はＫｅｓｓｌｅｒ（Ｄ方法（４０ａ）
により固定したＳ、ａｕｒｅｕｓ細胞に吸着させ、１２
、ＯＯＯＸｇで３０分間遠心分離して沈降させた。次に
□、Ｓ、ａｕｒｅｕｓ細胞を洗滌緩衝液（ＰＢＳ、１％
ＮＰ−４Ｑ、０．３０％ドデシル硫酸ナトリウム）で３
回洗滌し、免疫複合体を２０μｌのポリアクリルアミド
ゲルサンプル緩衝液（１０％グリセロール、５％２−メ
ルカプトエタノール、０．０１チブロモフエノールブル
ーを含有する６ ２．５ ｍＭトリス−ＨＣ１！ 緩衝
液（ｐＨ６，８） ）で、９０℃で３分間溶出した。３
０秒間遠心後、Ｌａ ｅｍｍｉ ｌ ｉの方法（４！９
に従い、上清を１０％ポリアクリルアミド平板（スラブ
）ゲルに掛けた。Ａ：ｇＤ１２細胞系から得た全膜結合
型ｇＤの免疫沈降反応９日２個の別個に誘導した細胞系
（１および２）の溶解液から得た先端切断ｇＤの細胞連
合型の免疫沈降線。Ｃ：Ｂに示した２個の細胞系の培養
上清から得られた先端切断ｇＤの免疫沈降線。（−）は
、対照家兎抗血清を示し、（＋）は、家兎抗ＨＳ Ｖ
−１抗血清を示す（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ、 ）。
図に見られるように、３５．０００ダルトンの細胞内型
、および分泌され、明らかに糖付加されている細胞外ｇ
Ｄタンパク質が明瞭である。
、および分泌され、明らかに糖付加されている細胞外ｇ
Ｄタンパク質が明瞭である。
免疫感作に使用する先端切断ｇＤ製剤
ｇＤ１０．２細胞を、ポリスチレン製回転組織培養瓶（
Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５１４０）で、市販の透析した７％
ウシ胎児血清、５０μ９／−のストレプトマイシン、お
よび０，３μｇのグルタミンを添加したＦ１２培地中で
密に発育させた。密生後、培地を除き、ウシ胎児血清を
含まない同じ培養液で３回洗滌し、２η／−のＨｅｐｅ
ｓ緩衝液（血清を含まぬ培地）を添加した。細胞を血清
を含まぬ培地中で３〜４日発育させ、次に条件付き培地
を回収して、−２０℃で貯蔵した。培地を３７℃で融解
し、５ｏｒｖａｌ ｌＧ Ｓ −３ｏ−ターで２０分間
５００ｒｐｍ で遠心した。遠心後、ペレットは破棄し
、ｊ清はＹＭ−５−外濾過膜を備えた限外ｐ過装置（Ａ
ｍｉｃｏｎ）で濃縮した。得られた標品を出発物質と比
較して約１５０倍に濃縮したところ、ｘｔ画たり約８Ｗ
９のタンノ七夕質を含有していた。灰にこの標品をリン
酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）でよく透析し、それ以上精−す
ることなく免疫感作に使用した。
Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５１４０）で、市販の透析した７％
ウシ胎児血清、５０μ９／−のストレプトマイシン、お
よび０，３μｇのグルタミンを添加したＦ１２培地中で
密に発育させた。密生後、培地を除き、ウシ胎児血清を
含まない同じ培養液で３回洗滌し、２η／−のＨｅｐｅ
ｓ緩衝液（血清を含まぬ培地）を添加した。細胞を血清
を含まぬ培地中で３〜４日発育させ、次に条件付き培地
を回収して、−２０℃で貯蔵した。培地を３７℃で融解
し、５ｏｒｖａｌ ｌＧ Ｓ −３ｏ−ターで２０分間
５００ｒｐｍ で遠心した。遠心後、ペレットは破棄し
、ｊ清はＹＭ−５−外濾過膜を備えた限外ｐ過装置（Ａ
ｍｉｃｏｎ）で濃縮した。得られた標品を出発物質と比
較して約１５０倍に濃縮したところ、ｘｔ画たり約８Ｗ
９のタンノ七夕質を含有していた。灰にこの標品をリン
酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）でよく透析し、それ以上精−す
ることなく免疫感作に使用した。
マウスの免疫感作
各８週令のＢＡＬＢ／Ｃ系マウ□スｅ、５０％の水性抗
原と５０チ完全フロインドア□シユバントからなる２′
００μｌの乳液に含有される３′６μｇのタン／ｆり質
で免疫感作した。それｉれのマウスは次のような皮内お
よび皮下部位の客所に免疫した：６後脚部に２５μｌず
つ、一番と５０μｌ、およびｆｌｒｌ＝ｔ）：に沿って
３〜５ケ所の皮内部位に１００μｌを芥布させた一最初
の免疫感作から４週間後に、上記と同様の３６μｆのタ
ンパン１質を、今度は不完全フロインドアジュバント番
使用して調製した乳液で追加免疫した。追加免ｉでは、
各マウスは２００μｌめ抗原乳液を次のように分布して
投与された：尾に５０μ１１背中に溢って５ケ所の皮内
部位に１５０μｌを分布さ騒た。追加免疫から１９日後
に、各マウス毎に尾蔀採血により約５００μｌの血液を
採取した。この血液から得られた血清は、インビトロの
中和実験に使用した（下記参照）。追加免疫から３７日
後に、マウスをウィルスチャレンジ試験に使用した。実
験マウス群と年□令、性およ令巣統を二数させた対照マ
ウス群は、実ｉ群と高−のプロトコールでヒ１ｌｆｆア
ルブミン（１匹当□たり１５μｙ＞を用いて免疫した。
原と５０チ完全フロインドア□シユバントからなる２′
００μｌの乳液に含有される３′６μｇのタン／ｆり質
で免疫感作した。それｉれのマウスは次のような皮内お
よび皮下部位の客所に免疫した：６後脚部に２５μｌず
つ、一番と５０μｌ、およびｆｌｒｌ＝ｔ）：に沿って
３〜５ケ所の皮内部位に１００μｌを芥布させた一最初
の免疫感作から４週間後に、上記と同様の３６μｆのタ
ンパン１質を、今度は不完全フロインドアジュバント番
使用して調製した乳液で追加免疫した。追加免ｉでは、
各マウスは２００μｌめ抗原乳液を次のように分布して
投与された：尾に５０μ１１背中に溢って５ケ所の皮内
部位に１５０μｌを分布さ騒た。追加免疫から１９日後
に、各マウス毎に尾蔀採血により約５００μｌの血液を
採取した。この血液から得られた血清は、インビトロの
中和実験に使用した（下記参照）。追加免疫から３７日
後に、マウスをウィルスチャレンジ試験に使用した。実
験マウス群と年□令、性およ令巣統を二数させた対照マ
ウス群は、実ｉ群と高−のプロトコールでヒ１ｌｆｆア
ルブミン（１匹当□たり１５μｙ＞を用いて免疫した。
インビトロの中和試験
ｇＤｌｏ、２培養上清濃縮物で免疫した１１匹のマウス
から得られた血清を用い、インビトロにお４．６ｉ−ｉ
ｓｖ−１゜中和能、Ｃよ１、試験い。逐ヶ希釈したマウ
ス血清（倍数希釈法＝ １＝８〜１： １６３８４）′
を約４ Ｑ ｐｆｕのＨ３ＶとＤｕｌｂｅｃ。
から得られた血清を用い、インビトロにお４．６ｉ−ｉ
ｓｖ−１゜中和能、Ｃよ１、試験い。逐ヶ希釈したマウ
ス血清（倍数希釈法＝ １＝８〜１： １６３８４）′
を約４ Ｑ ｐｆｕのＨ３ＶとＤｕｌｂｅｃ。
が改良したＥ門ｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中セ１時間、３
７℃で４７キユベートした。血清インキュベーションの
門、９６大の組織培養板の各穴に含有される約４０，０
００ ｖｅｒｏ細胞に各希釈液を適用した。
７℃で４７キユベートした。血清インキュベーションの
門、９６大の組織培養板の各穴に含有される約４０，０
００ ｖｅｒｏ細胞に各希釈液を適用した。
３〜４日後、各穴を０．５％クリスタルバイオレットで
染色して、ウィルスの増殖を測定した。ウィルスの増殖
が起こった穴は染色を示さなかった。
染色して、ウィルスの増殖を測定した。ウィルスの増殖
が起こった穴は染色を示さなかった。
ウィルスによる細胞死を防御した最高血清希釈度を測定
し、中和力価を算出した。ｇＤｌｏ、２の上清物質で免
疫したマウスから得られた試験血清（ｎ＝１０ ）は、
すヘテＨＳ Ｖ−１中和活性（１：１６〜に５１２）お
よびＨＳ Ｖ −２中和活性（１：８〜１：１６）を示
した。対照マウス血清（ｎ−８）からは何ら中和反応を
提供できなかった。
し、中和力価を算出した。ｇＤｌｏ、２の上清物質で免
疫したマウスから得られた試験血清（ｎ＝１０ ）は、
すヘテＨＳ Ｖ−１中和活性（１：１６〜に５１２）お
よびＨＳ Ｖ −２中和活性（１：８〜１：１６）を示
した。対照マウス血清（ｎ−８）からは何ら中和反応を
提供できなかった。
Ｉｆ Ｓ Ｖ −１で免疫したマウスから得られた血清
では１：３２の中和力価が得られた。
では１：３２の中和力価が得られた。
ｇＤｌｏ、２上清濃縮物で免疫した１１匹のマウスとヒ
ト血清アルブミンで免疫した１３匹の対照マウスに、１
０，０００．０ＯＯｐｆｕ のＩ（ＳＶ−１（Ｍａｃ
Ｉｎｔｙｒｅ株）を腹腔内注射することによりチャレン
ジした。ｇＤｌ ２で免疫したマウスでは、ウィルス注
射から１４日間、何らウィルス感染の徴候を示さなかっ
た。対照群では、１３匹のマウス中の７匹が１４日まで
に死亡し、３匹は重篤な衰弱と麻痺を示し、３匹は健康
に見えた。統計的解析（Ｆｉｓｈｅｒの直接検定法、両
側検定）で、免疫群と対照群の間の差はＰ＝０．００２
の水準で有意であった（第１表）。
ト血清アルブミンで免疫した１３匹の対照マウスに、１
０，０００．０ＯＯｐｆｕ のＩ（ＳＶ−１（Ｍａｃ
Ｉｎｔｙｒｅ株）を腹腔内注射することによりチャレン
ジした。ｇＤｌ ２で免疫したマウスでは、ウィルス注
射から１４日間、何らウィルス感染の徴候を示さなかっ
た。対照群では、１３匹のマウス中の７匹が１４日まで
に死亡し、３匹は重篤な衰弱と麻痺を示し、３匹は健康
に見えた。統計的解析（Ｆｉｓｈｅｒの直接検定法、両
側検定）で、免疫群と対照群の間の差はＰ＝０．００２
の水準で有意であった（第１表）。
１、分泌型ｇＤの追加免疫を接種してから１９日後に、
マウス血清のＨ５Ｖ−１およびＩ−Ｉ Ｓ Ｖ−２ウイ
ルス中和活性を試験した。マウス血清を倍数希釈（１：
８〜１ ： １６３８４Ｌ、これを）Ｉｓｖ−１また
はＨ８Ｖ−２の４０プラ一ク形成単位（ｐ Ｅｕ）と３
７℃で１時間インキュベートした。各希釈液を、９６大
のマイクロタイターの各穴に含まれている４αＱＱＱ
ｖｅｒｏ細胞に適用した。４日後、０．５％クリスタル
バイオレットで細胞を染色した。
マウス血清のＨ５Ｖ−１およびＩ−Ｉ Ｓ Ｖ−２ウイ
ルス中和活性を試験した。マウス血清を倍数希釈（１：
８〜１ ： １６３８４Ｌ、これを）Ｉｓｖ−１また
はＨ８Ｖ−２の４０プラ一ク形成単位（ｐ Ｅｕ）と３
７℃で１時間インキュベートした。各希釈液を、９６大
のマイクロタイターの各穴に含まれている４αＱＱＱ
ｖｅｒｏ細胞に適用した。４日後、０．５％クリスタル
バイオレットで細胞を染色した。
中和力価は、ウィルスの増殖を防御する最高血清希釈度
を測定することにより算出した。
を測定することにより算出した。
２．７’７スはＨＳ Ｖ −１（Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ株
）の１×１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）を腹腔内注
射することによりチャレンジした。チャレンジしたマウ
スは、ＨＳ Ｖ −１感染番ごついて３週間観察した。
）の１×１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）を腹腔内注
射することによりチャレンジした。チャレンジしたマウ
スは、ＨＳ Ｖ −１感染番ごついて３週間観察した。
３、各マウスは、それぞれ約３μｇの分泌型ｇＤの５０
％水と５０％フロインドアジュバント溶液で免疫した。
％水と５０％フロインドアジュバント溶液で免疫した。
マウスは皮肉および皮下部位の各所に免疫した。最初の
免疫から４週間後に、マウスは追加免疫をした。追加免
疫して１９日後にマウスはチャレンジを受けた。対照マ
ウスは等量のヒト血清アルブミン（Ｕ Ｓ Ａ ）で免
疫された。
免疫から４週間後に、マウスは追加免疫をした。追加免
疫して１９日後にマウスはチャレンジを受けた。対照マ
ウスは等量のヒト血清アルブミン（Ｕ Ｓ Ａ ）で免
疫された。
４、Ｐ＝０．００２水準で有意。
ｇＤ１２細胞から培地中へ遊離された、先端を切断した
タンパク質は、マウスのＨＳ Ｖ −１の致死量感染を
防御することが明らかになった。
タンパク質は、マウスのＨＳ Ｖ −１の致死量感染を
防御することが明らかになった。
Ｈ５Ｖ−２ウイルスチヤレンジのための抗原製剤２５０
ｎＭメントレキセートの存在で発育させ、増幅させた
ｇＤｌｏ、２．２細胞を回転培養瓶（８５０Ｃ１＃）に
植え、７％のウシ胎児血清を添加したＨａｍ’ ｓ Ｆ
１２培地（ＧＩＢＣＯ）で培養した。細胞が密に繁殖し
た後（約３日後）、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）で３回洗滌して血清タンパク質を除去し
、新たに”血清を含まない“培養液を加えた。血清を含
まない培地は、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液を含有する
Ｈａｍ’ ｓ Ｆ １２培地から成っていた。細胞を３
日間培養し、生成した条件付き培地（調整培地）を回収
し、抗原調製に使用した。次に、血清を含まない培地を
細胞に加え、３日毎に条件付き培地を回収する繰り返し
を、細胞が死ぬか、または培養表面にも（′Ａや何着し
なくなるまで、更に１〜２回行なった。次に血清を含ま
ないｇＤｌｏ、２．２の条件付き培地（調整培地）を、
濾過し、低速度で遠心して細胞残渣を除き、得られた材
料を限外濾過装置（ＹＭ−ＩＱメンプラン、Ａｍ１ｃｏ
ｎ）を用いて１０〜２０倍に濃縮した。次いで濃縮した
培地をＰＢＳに対して一夜透析した（ＰＢＳを３回交換
、交換当たり１すットル）０次に、得られた材料を測定
してタンパク質濃度を決定し、タンパク質組成を決定し
標品の純度を調べるため、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により分析した。この方法により調製した材料は
、下記のように動物のＨ８Ｖ−２感染に対して免疫する
のに使用した。
ｎＭメントレキセートの存在で発育させ、増幅させた
ｇＤｌｏ、２．２細胞を回転培養瓶（８５０Ｃ１＃）に
植え、７％のウシ胎児血清を添加したＨａｍ’ ｓ Ｆ
１２培地（ＧＩＢＣＯ）で培養した。細胞が密に繁殖し
た後（約３日後）、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）で３回洗滌して血清タンパク質を除去し
、新たに”血清を含まない“培養液を加えた。血清を含
まない培地は、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液を含有する
Ｈａｍ’ ｓ Ｆ １２培地から成っていた。細胞を３
日間培養し、生成した条件付き培地（調整培地）を回収
し、抗原調製に使用した。次に、血清を含まない培地を
細胞に加え、３日毎に条件付き培地を回収する繰り返し
を、細胞が死ぬか、または培養表面にも（′Ａや何着し
なくなるまで、更に１〜２回行なった。次に血清を含ま
ないｇＤｌｏ、２．２の条件付き培地（調整培地）を、
濾過し、低速度で遠心して細胞残渣を除き、得られた材
料を限外濾過装置（ＹＭ−ＩＱメンプラン、Ａｍ１ｃｏ
ｎ）を用いて１０〜２０倍に濃縮した。次いで濃縮した
培地をＰＢＳに対して一夜透析した（ＰＢＳを３回交換
、交換当たり１すットル）０次に、得られた材料を測定
してタンパク質濃度を決定し、タンパク質組成を決定し
標品の純度を調べるため、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により分析した。この方法により調製した材料は
、下記のように動物のＨ８Ｖ−２感染に対して免疫する
のに使用した。
Ｈ５Ｖ−２感染に対するマウスの免疫感作４０匹の雌性
ＢＡＬＢ／ｃ系？ ウ７．をＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、 ＭＡ）
から入手し、１２週今時に、分泌型ｇＤタンパク質（ｇ
Ｄｔｒｕｎｃ）またはヒト血清アルブミン（Ｕ Ｓ Ａ
）で免疫した。分泌型ｇＤタンパク質に対する初回免
疫では、抗原をリン酸緩衝食塩液で約７０μＩＡＩの濃
度となるように調節し、等量の完全フロインドアジュバ
ントを加えて乳化した。各マウスはそれぞれこの懸濁液
の２００μｌで、次のような分布で免疫した二足の付は
根から約１ｃｌＩの部位に５０μｌを皮下注、後方の各
脚部にそれぞれ２５μｌを皮下注、背中務こ沿って１０
０μ、１！を３〜５ケ所に分けて、皮肉注射。次にマウ
スは初回免疫から１ケ月後に同じ抗原で追加免疫した。
ＢＡＬＢ／ｃ系？ ウ７．をＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、 ＭＡ）
から入手し、１２週今時に、分泌型ｇＤタンパク質（ｇ
Ｄｔｒｕｎｃ）またはヒト血清アルブミン（Ｕ Ｓ Ａ
）で免疫した。分泌型ｇＤタンパク質に対する初回免
疫では、抗原をリン酸緩衝食塩液で約７０μＩＡＩの濃
度となるように調節し、等量の完全フロインドアジュバ
ントを加えて乳化した。各マウスはそれぞれこの懸濁液
の２００μｌで、次のような分布で免疫した二足の付は
根から約１ｃｌＩの部位に５０μｌを皮下注、後方の各
脚部にそれぞれ２５μｌを皮下注、背中務こ沿って１０
０μ、１！を３〜５ケ所に分けて、皮肉注射。次にマウ
スは初回免疫から１ケ月後に同じ抗原で追加免疫した。
追加免疫の場合は、抗原は初回免疫の場合と同じ方法で
調製するが、但し、完全フロインドアジュバントの代ワ
リに、不完全フロインドアジュバントを使用した。追加
免疫では、各マウスにそれぞれ２００μｒの抗原乳液を
次のような分布で注射した二足部に５０μ１１各太腿上
のたるんだ皮膚にそれぞれ２５μｌずつ皮下注、背中に
沿って１００μｌを３〜５ケ所に分けて皮肉注射。対照
マウス群は、実験マウス群と同じプロトコールに従い、
免疫原として分泌ｇＤタンパク質の代わりにヒト血清ア
ルブミンで免疫した。インビトロの中和試験に使用する
ため、追加免疫から２４日後にマウスから血清を採取し
た。
調製するが、但し、完全フロインドアジュバントの代ワ
リに、不完全フロインドアジュバントを使用した。追加
免疫では、各マウスにそれぞれ２００μｒの抗原乳液を
次のような分布で注射した二足部に５０μ１１各太腿上
のたるんだ皮膚にそれぞれ２５μｌずつ皮下注、背中に
沿って１００μｌを３〜５ケ所に分けて皮肉注射。対照
マウス群は、実験マウス群と同じプロトコールに従い、
免疫原として分泌ｇＤタンパク質の代わりにヒト血清ア
ルブミンで免疫した。インビトロの中和試験に使用する
ため、追加免疫から２４日後にマウスから血清を採取し
た。
Ｈ３Ｖ−２ウイルスチヤレンジ
実験群（、分泌型ｇＤ注射群）および対照群（Ｈ５Ａ注
射群）のマウスを、いずれも追加免疫をしてから３０日
後にＨ３Ｖ−２（ＭＳ株）を腹腔内注射してチャレンジ
した。各マウスは、１０俤のウシ胎児血清を含有するＤ
ｕｌｂｅｃｃｏの改良したＥａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
１００μｌ中の２×１０５ｐｆｕの・ウィルスを投与し
た。ＬＤ５ｏ実験の結果、この量は正常（注射していな
い）ＢＡＬＢ／ｃ マウス借集・団め′５０％致死に要
するウィルス量の１００〜５′００倍に相当することが
明らかになった。ウィルスを注射したマウスは３週間観
察した。対照マ・ウス（Ｕ Ｓ Ａを注射）はウィルス
チャレンジ後９日以内に金側死亡した。分泌型ｇＤタン
パク質のワクチン投与を受けたマウスは、金側とも３週
間完全に生存し、正常に見えた（即ち、衰弱または麻痺
を示さなかった）。
射群）のマウスを、いずれも追加免疫をしてから３０日
後にＨ３Ｖ−２（ＭＳ株）を腹腔内注射してチャレンジ
した。各マウスは、１０俤のウシ胎児血清を含有するＤ
ｕｌｂｅｃｃｏの改良したＥａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）
１００μｌ中の２×１０５ｐｆｕの・ウィルスを投与し
た。ＬＤ５ｏ実験の結果、この量は正常（注射していな
い）ＢＡＬＢ／ｃ マウス借集・団め′５０％致死に要
するウィルス量の１００〜５′００倍に相当することが
明らかになった。ウィルスを注射したマウスは３週間観
察した。対照マ・ウス（Ｕ Ｓ Ａを注射）はウィルス
チャレンジ後９日以内に金側死亡した。分泌型ｇＤタン
パク質のワクチン投与を受けたマウスは、金側とも３週
間完全に生存し、正常に見えた（即ち、衰弱または麻痺
を示さなかった）。
第 ２ 表□
１、マウス血清は、分泌型ｇＤ追加免疫を行なってから
１９日後に、ｔｉｓｖ−１およびＨ５Ｖ−２中和活性に
ついて試験した。倍数希釈したマウス血清（１：８−１
＝１６３８４ ）を４０プラ一ク形成単位のｔｉｓｖ−
１ま？、ｊｔＨ５Ｖ−２と３７℃で１時間インキュベー
トした。各希釈液は９６穴のマイクロタイターの各穴に
含有する４０１０００ＶｅｒＯ細胞に適用した。４日後
細胞は０．５％クリスタルバイオレーットで染色した。
１９日後に、ｔｉｓｖ−１およびＨ５Ｖ−２中和活性に
ついて試験した。倍数希釈したマウス血清（１：８−１
＝１６３８４ ）を４０プラ一ク形成単位のｔｉｓｖ−
１ま？、ｊｔＨ５Ｖ−２と３７℃で１時間インキュベー
トした。各希釈液は９６穴のマイクロタイターの各穴に
含有する４０１０００ＶｅｒＯ細胞に適用した。４日後
細胞は０．５％クリスタルバイオレーットで染色した。
中和力価はウィルス増殖を防御する最・高血清希釈度を
測定することにより算出した。示した値は中和力価の平
均値で表わしである。
測定することにより算出した。示した値は中和力価の平
均値で表わしである。
２、ｔｔｓｖ−２チヤレンジの詳細については本文参照
。
。
先端を切断□した糖タンパク質りは、先述したようにｇ
Ｄｌｏ、２細胞系の発育により条件付けられた培養基か
ら精製した。培養液は限外濾過によって濃縮し、先端切
断ｇＤはセファロース４Ｂにカップリングさせた抗ｇ
Ｄ −１単クロ一ン性抗体を使用する免疫アフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製した。先端を切断し
たＨ５Ｖ−１糖タンパク質Ｄ（ｇＤ−１）は、先述のよ
うに、ｇＤｌＯ０２細胞の発育によって条件付けられた
血清を含まない培地から分離した。細胞培養液は、市販
のメンプラン（Ａｍｉｃｏ Ｃｏｒｐ、）を使用する限
外沖過と硫酸アンモニウム沈澱法により濃縮した。次い
で免疫アフィニティークロマトグラフィーによりｇｌ）
−１を精製し、均質に近づけた。免疫アフィニティー用
カラムは、Ｈ５Ｖ−１に対して産生せしめた単クローン
性抗体と交差結合したセファロース（Ｐｂａｒｍａｃｉ
ａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をカップリングす
ることにより調製し、Ａｘｅｎら（ＮａＬｕｒｅ２１４
： １３０２〜１３０４（１９６７） ）が記載してい
るのと同様の方法により溶出した。ｇＤｌｏ、２細胞系
によって条件付けられた未分画の培養液の主な生成物は
、成熟した先端切断型のｇＤ−１（〜４３−４５ ｋｄ
）とｇＤの前駆型（〜３８−４０ｋｄ）である。ｇＤ
タンパク質は、増殖調整培地に存在するタンパク質の、
平均２０〜２５％を占めている。この物質を免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーで分画することによりｇＤ
はかなり豊富化された。溶出した物質は釧染色により検
出し得る汚染したタンパク質を全く含んでいないことが
判つた。このプロトコールに基づくタンパク質の精製に
よってタンパク質の変性や、分子の抗原性構造の破壊が
起こるかどうか調べるために、種々の単クローン性抗体
による抗原性の試験を行なった。
Ｄｌｏ、２細胞系の発育により条件付けられた培養基か
ら精製した。培養液は限外濾過によって濃縮し、先端切
断ｇＤはセファロース４Ｂにカップリングさせた抗ｇ
Ｄ −１単クロ一ン性抗体を使用する免疫アフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製した。先端を切断し
たＨ５Ｖ−１糖タンパク質Ｄ（ｇＤ−１）は、先述のよ
うに、ｇＤｌＯ０２細胞の発育によって条件付けられた
血清を含まない培地から分離した。細胞培養液は、市販
のメンプラン（Ａｍｉｃｏ Ｃｏｒｐ、）を使用する限
外沖過と硫酸アンモニウム沈澱法により濃縮した。次い
で免疫アフィニティークロマトグラフィーによりｇｌ）
−１を精製し、均質に近づけた。免疫アフィニティー用
カラムは、Ｈ５Ｖ−１に対して産生せしめた単クローン
性抗体と交差結合したセファロース（Ｐｂａｒｍａｃｉ
ａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をカップリングす
ることにより調製し、Ａｘｅｎら（ＮａＬｕｒｅ２１４
： １３０２〜１３０４（１９６７） ）が記載してい
るのと同様の方法により溶出した。ｇＤｌｏ、２細胞系
によって条件付けられた未分画の培養液の主な生成物は
、成熟した先端切断型のｇＤ−１（〜４３−４５ ｋｄ
）とｇＤの前駆型（〜３８−４０ｋｄ）である。ｇＤ
タンパク質は、増殖調整培地に存在するタンパク質の、
平均２０〜２５％を占めている。この物質を免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーで分画することによりｇＤ
はかなり豊富化された。溶出した物質は釧染色により検
出し得る汚染したタンパク質を全く含んでいないことが
判つた。このプロトコールに基づくタンパク質の精製に
よってタンパク質の変性や、分子の抗原性構造の破壊が
起こるかどうか調べるために、種々の単クローン性抗体
による抗原性の試験を行なった。
この試験において、カルボキシル末端基と反応するもの
以外のすべての抗体が、精製した製剤と反応することが
判った。未分画の培養上清に存在する物質と比較して、
精製した製剤の抗体結合の挙動には何らの差違も検出で
きなかった。
以外のすべての抗体が、精製した製剤と反応することが
判った。未分画の培養上清に存在する物質と比較して、
精製した製剤の抗体結合の挙動には何らの差違も検出で
きなかった。
精製したｇＤタンパク質が、ｌ−ｌ５Ｖ−３１こよる外
陰部感染を防御するサブユニットワクチンの主成分とし
て効果的に使用できるかどうかを調べるために、種々の
アジュバントで調製したｇＤをモルモットに接種した。
陰部感染を防御するサブユニットワクチンの主成分とし
て効果的に使用できるかどうかを調べるために、種々の
アジュバントで調製したｇＤをモルモットに接種した。
第一の試験では、精製ｇＤを完全フロインドアジュバン
トに混合し、雌性Ｈａ ｒ ｔ Ｉ ｅ ｙモルモット
の筋肉内および皮下部位に注射した。２月令で体重約２
５０ｇの雌性Ｈａｒｔｌｅｙモルモットを（：ｈａｒｌ
ｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｏｒ
ｔｇａｎ、Ｍ Ｉ）から購入した。フロインドアジュバ
ントを使用した試験では、５０チの完全フロインドアジ
ュバントに乳化した３０μｇのｇＤ−１を注射した。こ
の初回免疫感作は次のような分布で行なった’０．５ｒ
ｎｌを頚背部の軟かい皮膚へ皮下注射、０．５ｍ！、を
大腿筋肉内に注射した。３１日後、動物は不完全フロイ
ンドアジュバントに混合した同量の抗原で追加免疫した
。対照動物は実験群と同じプロトコールに従い、アジュ
ノくントだけを注射した。実験動物と対照動物は、追加
免疫を行なってから１９日後にＩ−Ｉ Ｓ Ｖ −２を
膣内に感染させてチャレンジした。ｇ Ｄ −１のアル
ムーアジュバントを使用する試験では、３０μｇのｇＤ
−１をリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムの
いずれか（０，１５ｒｎｔ）のゲルに混合し、初回およ
び追加免疫の両方に使用した。アルムーアジュバントは
後肢へ筋肉内注射した。動物は初回免゛１ 疫から５１
日後に追加免疫し、更に２７日後をこ生菌ウィルスでチ
ャレンジした。各動物は、完全フロインドアジュバント
に混合した３０μｇの精製したタンパク質による１回の
初回免疫と、不完全フロインドアジュバントに混合した
同量の抗原による１回の追加免疫（３１日後）を受けた
。すべての動物は、追加免疫から１９日後にＨ５Ｖ −
２の膣内接種によりチャレンジされた。第３表にこれら
の試験から得られた成績を示した。ｇＤの接種を受けた
動物は、インビトロのウィルス中和測定でＨ５Ｖ−、お
よびＨ５Ｖ−２の双方の感染を防御し得る高濃度の抗体
を生産することが判る。
トに混合し、雌性Ｈａ ｒ ｔ Ｉ ｅ ｙモルモット
の筋肉内および皮下部位に注射した。２月令で体重約２
５０ｇの雌性Ｈａｒｔｌｅｙモルモットを（：ｈａｒｌ
ｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｏｒ
ｔｇａｎ、Ｍ Ｉ）から購入した。フロインドアジュバ
ントを使用した試験では、５０チの完全フロインドアジ
ュバントに乳化した３０μｇのｇＤ−１を注射した。こ
の初回免疫感作は次のような分布で行なった’０．５ｒ
ｎｌを頚背部の軟かい皮膚へ皮下注射、０．５ｍ！、を
大腿筋肉内に注射した。３１日後、動物は不完全フロイ
ンドアジュバントに混合した同量の抗原で追加免疫した
。対照動物は実験群と同じプロトコールに従い、アジュ
ノくントだけを注射した。実験動物と対照動物は、追加
免疫を行なってから１９日後にＩ−Ｉ Ｓ Ｖ −２を
膣内に感染させてチャレンジした。ｇ Ｄ −１のアル
ムーアジュバントを使用する試験では、３０μｇのｇＤ
−１をリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムの
いずれか（０，１５ｒｎｔ）のゲルに混合し、初回およ
び追加免疫の両方に使用した。アルムーアジュバントは
後肢へ筋肉内注射した。動物は初回免゛１ 疫から５１
日後に追加免疫し、更に２７日後をこ生菌ウィルスでチ
ャレンジした。各動物は、完全フロインドアジュバント
に混合した３０μｇの精製したタンパク質による１回の
初回免疫と、不完全フロインドアジュバントに混合した
同量の抗原による１回の追加免疫（３１日後）を受けた
。すべての動物は、追加免疫から１９日後にＨ５Ｖ −
２の膣内接種によりチャレンジされた。第３表にこれら
の試験から得られた成績を示した。ｇＤの接種を受けた
動物は、インビトロのウィルス中和測定でＨ５Ｖ−、お
よびＨ５Ｖ−２の双方の感染を防御し得る高濃度の抗体
を生産することが判る。
これらの動物から得られた血清は、Ｉ−Ｉ Ｓ Ｖ −
２よりもＨＳ Ｖ −１の方を僅かにより効果的に中和
することが判った。この結果は、免疫原がＨＳ Ｖ −
１から誘導されたものであり、ｇ Ｄ −１の抗原決定
基には型特異性のある事実から考えて当然のことである
（Ｅｉ ５ｅｎｂｅ ｒｇ 、Ｒ，Ｊ 、ら、Ｊ 、Ｖ
ｉｒｏｌ 、３５ ’４２８ （１９８０）； Ｐｅｒ
ｅｉｒａ、Ｌ、ら、１ｎｆｅｃＬ ａｎｄＩＩＴｒｎｕ
ｎ、２９ ： ７２４（１９８０）： ＳｈｏｗａｌＬ
ｅｒ、Ｊ、Ｄ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎ、３４： ６８４（１９８１） ）。一層印象的なこ
とは、ｇＤ−１の接種を受けたすべての動物がウィルス
感染による臨床的徴候から完全に防御された事実であっ
た（即ち、発赤、腫脹、小水庖形成、潰瘍形成、尿貯留
の減少、および致死的な脳炎）。アジュバント単独を注
射した１４匹の動物のうちの１３匹は、重篤な原発性の
感染を起こした。典型的な癒着を起こして急性の潰瘍を
形成する多数の小水胞が見られた。これに反して、ｇＤ
−１を接種した動物ではウィルス感染の前兆が伺ら表れ
なかった。これらの結果は明らかに、完全フロインドア
ジュバントに混合したｇＤ−１が、Ｈ８Ｖ−２の外陰部
感染に対し効果的な防御作用を有することを示している
。
２よりもＨＳ Ｖ −１の方を僅かにより効果的に中和
することが判った。この結果は、免疫原がＨＳ Ｖ −
１から誘導されたものであり、ｇ Ｄ −１の抗原決定
基には型特異性のある事実から考えて当然のことである
（Ｅｉ ５ｅｎｂｅ ｒｇ 、Ｒ，Ｊ 、ら、Ｊ 、Ｖ
ｉｒｏｌ 、３５ ’４２８ （１９８０）； Ｐｅｒ
ｅｉｒａ、Ｌ、ら、１ｎｆｅｃＬ ａｎｄＩＩＴｒｎｕ
ｎ、２９ ： ７２４（１９８０）： ＳｈｏｗａｌＬ
ｅｒ、Ｊ、Ｄ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎ、３４： ６８４（１９８１） ）。一層印象的なこ
とは、ｇＤ−１の接種を受けたすべての動物がウィルス
感染による臨床的徴候から完全に防御された事実であっ
た（即ち、発赤、腫脹、小水庖形成、潰瘍形成、尿貯留
の減少、および致死的な脳炎）。アジュバント単独を注
射した１４匹の動物のうちの１３匹は、重篤な原発性の
感染を起こした。典型的な癒着を起こして急性の潰瘍を
形成する多数の小水胞が見られた。これに反して、ｇＤ
−１を接種した動物ではウィルス感染の前兆が伺ら表れ
なかった。これらの結果は明らかに、完全フロインドア
ジュバントに混合したｇＤ−１が、Ｈ８Ｖ−２の外陰部
感染に対し効果的な防御作用を有することを示している
。
完全フロインドアジュバントはヒトの使用に適さないの
で、次にヒトの使用に好適なアジュバントで処方した時
、ｇＤ−１がＨＳ Ｖ −２感染に対して防御効果を示
すかどうか決定することが望まれた。この目的のために
、みょうばん沈澱タンパク質複合体（Ｊ、Ｓ、ＧＨｒｖ
ｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｌｒｒｍ−ｕｎｏｌｏ
ｇ７（１９７７） １８５頁（１７） ）の研究が開始
された。第３表には、ｇ Ｄ −１を水酸化アルミニウ
ムおよびリン酸アルミニウムゲルに混合して使用して得
られた成績を比較している。対照試験では、動物はアジ
ュバント単独を接種された。アルミニウムによる両製剤
とも１１；Ｖｌに対する高濃度の中和抗体を誘発し、ま
たＨ５Ｖ−１に対する中和力価は、完全フロインドアジ
ュバントに混合したｇＤ−１に対し誘発される力価に匹
敵し得るものであることが認められた。然しなから、Ｈ
ｓｖ−２を中和し得る抗体の力価は、完全フロインドア
ジュバントに混合したｇＤｌに比べて、アルミニウム製
剤のいずれかに混合したｇＤ−１の場合の方が有意に低
かった。この結果は、アルミニウムに混合したｇＤ−１
は、ＨＳ Ｖ −ｉとＨ５ｖ−２に共通した１個または
それ以上の抗原決定基の消失を生じるか、またはタンパ
ク質をフロインドアジュバントに混合した場合の方が、
交差反応性抗原の認識がより一層効果的であることを示
唆している。この成績はまた、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２
に対する中和力価が水酸化アルミニウムの場合の方が、
リン酸アルミニウムの場合よりも有意に高いことから、
前者の方が後者より効果的なアジュバントであることを
示唆している。
で、次にヒトの使用に好適なアジュバントで処方した時
、ｇＤ−１がＨＳ Ｖ −２感染に対して防御効果を示
すかどうか決定することが望まれた。この目的のために
、みょうばん沈澱タンパク質複合体（Ｊ、Ｓ、ＧＨｒｖ
ｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｌｒｒｍ−ｕｎｏｌｏ
ｇ７（１９７７） １８５頁（１７） ）の研究が開始
された。第３表には、ｇ Ｄ −１を水酸化アルミニウ
ムおよびリン酸アルミニウムゲルに混合して使用して得
られた成績を比較している。対照試験では、動物はアジ
ュバント単独を接種された。アルミニウムによる両製剤
とも１１；Ｖｌに対する高濃度の中和抗体を誘発し、ま
たＨ５Ｖ−１に対する中和力価は、完全フロインドアジ
ュバントに混合したｇＤ−１に対し誘発される力価に匹
敵し得るものであることが認められた。然しなから、Ｈ
ｓｖ−２を中和し得る抗体の力価は、完全フロインドア
ジュバントに混合したｇＤｌに比べて、アルミニウム製
剤のいずれかに混合したｇＤ−１の場合の方が有意に低
かった。この結果は、アルミニウムに混合したｇＤ−１
は、ＨＳ Ｖ −ｉとＨ５ｖ−２に共通した１個または
それ以上の抗原決定基の消失を生じるか、またはタンパ
ク質をフロインドアジュバントに混合した場合の方が、
交差反応性抗原の認識がより一層効果的であることを示
唆している。この成績はまた、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２
に対する中和力価が水酸化アルミニウムの場合の方が、
リン酸アルミニウムの場合よりも有意に高いことから、
前者の方が後者より効果的なアジュバントであることを
示唆している。
アルミニウムアジュバント製剤によって得られた防御効
果は、フロインドアジュバント製剤で得られたものエリ
低いが、それでも・−なお有意である。
果は、フロインドアジュバント製剤で得られたものエリ
低いが、それでも・−なお有意である。
多くの動物がウィルス感染の徴候を示すが、感染の重篤
度はアジュバント単独を注射した対照動物の場合に比較
してかなり軽い。部名、障害度の平均点数は、アジュバ
ントを注射した対照動物の障害度の平均点数が３，２で
あるのに比較して、リン酸アルミニウムワクチン製剤を
接種した動物では０．９、水酸化アルミニウムに基づ１
く製剤の場合では０．７であった。障害の重篤度の□採
点に使用した４＋評価法に従えば、平均障害点１数３．
２から０．÷へ門下することは、臨床症状６とお□いて
、数個の大水＠（３点）から軽度の発赤１よび腫脹（０
，５点）へ門下するのに対応する。興味深いことは、こ
レラの試験を通じて、インビトロ、でのＨ５Ｖ−２に対
する平均中和力価が臨床疾警の重篤度と良（相興してい
た。
度はアジュバント単独を注射した対照動物の場合に比較
してかなり軽い。部名、障害度の平均点数は、アジュバ
ントを注射した対照動物の障害度の平均点数が３，２で
あるのに比較して、リン酸アルミニウムワクチン製剤を
接種した動物では０．９、水酸化アルミニウムに基づ１
く製剤の場合では０．７であった。障害の重篤度の□採
点に使用した４＋評価法に従えば、平均障害点１数３．
２から０．÷へ門下することは、臨床症状６とお□いて
、数個の大水＠（３点）から軽度の発赤１よび腫脹（０
，５点）へ門下するのに対応する。興味深いことは、こ
レラの試験を通じて、インビトロ、でのＨ５Ｖ−２に対
する平均中和力価が臨床疾警の重篤度と良（相興してい
た。
よ記の結果は、Ｈ５Ｖ−２に杢４．る外陰部の原発性感
染の臨床的発現が、組み換え体ｇＤ−１のワクチン接種
によって低下することを証明している。
染の臨床的発現が、組み換え体ｇＤ−１のワクチン接種
によって低下することを証明している。
得られた結果は、Ｈ５Ｖ−１から誘導された単一の糖タ
ンパク質が強力なアジュバントと組み合わせて投与する
と、外陰部のＨ３Ｖ−２感染を完全に防御できることを
示している。
ンパク質が強力なアジュバントと組み合わせて投与する
と、外陰部のＨ３Ｖ−２感染を完全に防御できることを
示している。
先端切断タンパク質を診断およびワクチン適用に使用す
ることの進歩性は、それが細胞外媒質へ分泌されるので
、全細胞製剤で見られるより、汚染タンパク質の夾雑が
はるかに少ないということである。
ることの進歩性は、それが細胞外媒質へ分泌されるので
、全細胞製剤で見られるより、汚染タンパク質の夾雑が
はるかに少ないということである。
本発明においては、タンパク質の生産に永久細胞系を使
用していることがわかるであろう。トラスフエクション
によって、ベクターは細胞系のゲノムに取り込まれ、細
胞溶解を起こすことなくタンパク質を生産できる。従っ
て細胞系は、タンパク質の連続的生産に使用でき、特に
先端を切り取られた形で細胞から分泌して来る。例えは
、先端を切り取ったタンパク質を発現する細胞は、抗原
に富んだ培地を細胞から絶えず除去し、新鮮な培地と置
き換えることにより、潅流系の中で連続的に使用できる
。
用していることがわかるであろう。トラスフエクション
によって、ベクターは細胞系のゲノムに取り込まれ、細
胞溶解を起こすことなくタンパク質を生産できる。従っ
て細胞系は、タンパク質の連続的生産に使用でき、特に
先端を切り取られた形で細胞から分泌して来る。例えは
、先端を切り取ったタンパク質を発現する細胞は、抗原
に富んだ培地を細胞から絶えず除去し、新鮮な培地と置
き換えることにより、潅流系の中で連続的に使用できる
。
ここに使用した特殊な細胞系はｄｈｆｒ生産を欠くＣｕ
Ｏ系に、ｄｈｆｒマーカーを含有するベクターを導入し
たものであった。該細胞系を好適な条件下にメントレキ
セート（ＭＴＳ）と接触させることにより（５４） 、
ｄｈｆｒ生産と、従って連結したｇＤタンパク質の生産
が増幅される。先端を切断したｇＤ遺伝子をｄｈｆｒ
ＣＨＯ細胞にトランスフェクトさせることにより誘導さ
れた３種の細胞系５ を並列してプレートに並べ、Ｓ−メチオニンで標識し、
先に第２図で記載したように免疫沈降させた。１タリ目
および２タリ目は、メントレキセートで選択する前に独
立して分離された２個の細胞系によって条件付けられた
培養液５００μｌから免疫沈降させた分泌型ｇＤの量を
示す。３列目は２５０ ｎＭのメントレキセート中にお
ける発育で選択された細胞系（ｇ ｌ） １０．２．２
）から同量の培養基へ免疫沈降された先端切断ｇＤの量
を示す。１〜３列目に示した免疫沈降には家兎の抗ＨＳ
Ｖ −１抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ、）を使用した。
Ｏ系に、ｄｈｆｒマーカーを含有するベクターを導入し
たものであった。該細胞系を好適な条件下にメントレキ
セート（ＭＴＳ）と接触させることにより（５４） 、
ｄｈｆｒ生産と、従って連結したｇＤタンパク質の生産
が増幅される。先端を切断したｇＤ遺伝子をｄｈｆｒ
ＣＨＯ細胞にトランスフェクトさせることにより誘導さ
れた３種の細胞系５ を並列してプレートに並べ、Ｓ−メチオニンで標識し、
先に第２図で記載したように免疫沈降させた。１タリ目
および２タリ目は、メントレキセートで選択する前に独
立して分離された２個の細胞系によって条件付けられた
培養液５００μｌから免疫沈降させた分泌型ｇＤの量を
示す。３列目は２５０ ｎＭのメントレキセート中にお
ける発育で選択された細胞系（ｇ ｌ） １０．２．２
）から同量の培養基へ免疫沈降された先端切断ｇＤの量
を示す。１〜３列目に示した免疫沈降には家兎の抗ＨＳ
Ｖ −１抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ、）を使用した。
４列目は、ｇＤｌ ０、２．２細胞系により条件づけた
５００μｌ培地疫 と正常家兎血清の対照り件降を表わす。
５００μｌ培地疫 と正常家兎血清の対照り件降を表わす。
メントレキセートにおける選択前と選択後の細胞系によ
って培地中に分泌される先端切断ｇＤの相対量を定量す
るため、コンペテイテイブＥＬＩＳＡアッセイを実施し
た。膜結合型ｇＤを発現するｇＤ１２細胞を平板から採
り、先に記載した９６穴のマイクロタイター平板の表面
にゲルタールアルデヒドで固定した。先端を切断された
ｇＤを生産することが知られている種々の細胞系からの
調整培地を、マイクロタイター平板上に連続的に逐次希
釈し、一定量（２μｌ）の家兎抗１−Ｉ Ｓ Ｖ −１
抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ）と１時間２０℃でインキュ
ベートした。各穴をＰＢＳで３回洗滌することにより、
未結合の抗体と易溶性の先端を切断したｇＤ−抗体複合
体を除去した。次にヤギ抗家兎１ｇＧ とカップリング
させた西洋ワサビのペルオキシダーゼを固定した細胞と
１時間２０℃で反応させ、未結合の抗体をＰＢＳで３回
洗滌することにより除去した。次に比色用基質、ＯＰ
Ｄ （ｏ−フェニレンジアミン）を各穴に加え、結合し
ている西洋ワサビのペルオキシダーゼ−抗体複合体と１
５分間反応させた。次いて、硫酸を最終濃度０．２５Ｎ
となるまで加えて反応を停止した。各穴のＯＰＤの吸光
度を自動マイクロタイタースキャナー（Ｔｉｔｅｒｔｅ
ｋｍｕｌｔｉｓｋａｎ）、ＩＢ使用して測定し、希釈曲
線を作成した。成体（親）ＣＨＯ細胞系と抗ｎ５ｖ−１
抗体の結合は、各希釈度における非特異的結合の程度を
測定するのに使用した。各培養の上清に含有される先端
切断ｇＤの量は各穴の吸光度量と逆比例した。白丸は、
メントレキセートで増幅する前の、先端切断ｇＤを分泌
する細胞によって条件付けされた培地の存在下における
、抗Ｈ５Ｖ−１抗体のｇＤ１２細胞への結合を表わす。
って培地中に分泌される先端切断ｇＤの相対量を定量す
るため、コンペテイテイブＥＬＩＳＡアッセイを実施し
た。膜結合型ｇＤを発現するｇＤ１２細胞を平板から採
り、先に記載した９６穴のマイクロタイター平板の表面
にゲルタールアルデヒドで固定した。先端を切断された
ｇＤを生産することが知られている種々の細胞系からの
調整培地を、マイクロタイター平板上に連続的に逐次希
釈し、一定量（２μｌ）の家兎抗１−Ｉ Ｓ Ｖ −１
抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ）と１時間２０℃でインキュ
ベートした。各穴をＰＢＳで３回洗滌することにより、
未結合の抗体と易溶性の先端を切断したｇＤ−抗体複合
体を除去した。次にヤギ抗家兎１ｇＧ とカップリング
させた西洋ワサビのペルオキシダーゼを固定した細胞と
１時間２０℃で反応させ、未結合の抗体をＰＢＳで３回
洗滌することにより除去した。次に比色用基質、ＯＰ
Ｄ （ｏ−フェニレンジアミン）を各穴に加え、結合し
ている西洋ワサビのペルオキシダーゼ−抗体複合体と１
５分間反応させた。次いて、硫酸を最終濃度０．２５Ｎ
となるまで加えて反応を停止した。各穴のＯＰＤの吸光
度を自動マイクロタイタースキャナー（Ｔｉｔｅｒｔｅ
ｋｍｕｌｔｉｓｋａｎ）、ＩＢ使用して測定し、希釈曲
線を作成した。成体（親）ＣＨＯ細胞系と抗ｎ５ｖ−１
抗体の結合は、各希釈度における非特異的結合の程度を
測定するのに使用した。各培養の上清に含有される先端
切断ｇＤの量は各穴の吸光度量と逆比例した。白丸は、
メントレキセートで増幅する前の、先端切断ｇＤを分泌
する細胞によって条件付けされた培地の存在下における
、抗Ｈ５Ｖ−１抗体のｇＤ１２細胞への結合を表わす。
黒丸は、２５０ｎＭメソトレキセート中の発育で選択さ
れたｇＤｌｏ、 ２．２細胞から得た培地の存在下にお
ける抗Ｈｓｖ−１抗体のｇＤ１２細胞への結合を表わす
。
れたｇＤｌｏ、 ２．２細胞から得た培地の存在下にお
ける抗Ｈｓｖ−１抗体のｇＤ１２細胞への結合を表わす
。
白の四角は、先端切断したｇＤを分泌する増幅していな
い細胞から得た１００倍濃度の培地の存在下に、抗Ｈ５
Ｖ−１抗体％Ｄ１２細胞の結合を表わす。この方法はｇ
Ｄ １０．２ 細胞系に詔いて、２５０ｎＭＭｔｘ
で発育でき、もとのｇ Ｄ １０．２ 細胞系より約２
０倍多量の先端切断ｇＤを培養液中に分泌する増幅細胞
系ｇＤ１０．２．２を生産するために打すわれる（第１
０およびｌ１図参照）。
い細胞から得た１００倍濃度の培地の存在下に、抗Ｈ５
Ｖ−１抗体％Ｄ１２細胞の結合を表わす。この方法はｇ
Ｄ １０．２ 細胞系に詔いて、２５０ｎＭＭｔｘ
で発育でき、もとのｇ Ｄ １０．２ 細胞系より約２
０倍多量の先端切断ｇＤを培養液中に分泌する増幅細胞
系ｇＤ１０．２．２を生産するために打すわれる（第１
０およびｌ１図参照）。
ｄｈｆｒマーカー／増幅系は、外来性ＤＮＡを獲得し、
それを安定に組み込むことができる他の細胞とも使用で
きる。
それを安定に組み込むことができる他の細胞とも使用で
きる。
本発明において、−（合させる働きを有する疎水性−親
水性カルボキシル末端領域を欠いている膜結合性タンパ
ク質の先端切断体がなお免疫原となり得ることを証明し
得たことは、他の膜結合型免疫原タンパク質でも同様の
結果を期待し得ることを示しており、ウィルス、寄生虫
または他の病原微生物に対する改良されたワクチン源が
提供されることが期待できる。
水性カルボキシル末端領域を欠いている膜結合性タンパ
ク質の先端切断体がなお免疫原となり得ることを証明し
得たことは、他の膜結合型免疫原タンパク質でも同様の
結果を期待し得ることを示しており、ウィルス、寄生虫
または他の病原微生物に対する改良されたワクチン源が
提供されることが期待できる。
これまでの実施例では、ｇＤタンパク質のＤＮＡは、そ
こに都合の良い制限部位があるので残基３００の位置で
切断された。このこと□から、第２図のヒトロバシー図
に見られるように、カルボキシル末端疎水性／親水性領
域を完全に除く結果となった。
こに都合の良い制限部位があるので残基３００の位置で
切断された。このこと□から、第２図のヒトロバシー図
に見られるように、カルボキシル末端疎水性／親水性領
域を完全に除く結果となった。
実際、それより先の領域の残基３０１〜３３２の範囲を
越えて除去されると、タンパク質の免疫原性は明らかに
破壊された。従って、このタンパク質の場合、詔よび恐
らく他の免疫原性の膜結合屋舎タンパク質の場合も、先
端切断の程度は、膜に結合するという性質が除かれ、タ
ンパク質が周囲の媒質に分泌される効果が得られる限り
、かなり少なくし得るということが、そこから結論され
る。
越えて除去されると、タンパク質の免疫原性は明らかに
破壊された。従って、このタンパク質の場合、詔よび恐
らく他の免疫原性の膜結合屋舎タンパク質の場合も、先
端切断の程度は、膜に結合するという性質が除かれ、タ
ンパク質が周囲の媒質に分泌される効果が得られる限り
、かなり少なくし得るということが、そこから結論され
る。
実−例 ２
実施例２はＨ５Ｖ−２ｇＣタンパク質（以前はｇＦタン
パク質と命名されていた）に関する。
パク質と命名されていた）に関する。
’ Ｈ８Ｖ−２（Ｇ株）を０．１のイレプット多重度Ｈ
ＥＰ’２細胞に感染させた後この細胞培養を、１０％の
ウシ胎児血清および抗生物質を含有するＤｕ １ｂｅｃ
ｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地で３日間、３３℃で増□殖さ
せた。Ｈ５Ｖ−’２ ＤＮＡは、前述のようにプロテイ
デーゼにで消化し、ＣＳ Ｃ４超遠心により分離した（
２３）。
ＥＰ’２細胞に感染させた後この細胞培養を、１０％の
ウシ胎児血清および抗生物質を含有するＤｕ １ｂｅｃ
ｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地で３日間、３３℃で増□殖さ
せた。Ｈ５Ｖ−’２ ＤＮＡは、前述のようにプロテイ
デーゼにで消化し、ＣＳ Ｃ４超遠心により分離した（
２３）。
’Ｄ’ Ｎ Ａ操作
゛□制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ 断片
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ポリ″ヌクレオチド
キナ□−ゼはＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｓから購入し、提供者の指示に従って使用した〇 Ｈ８Ｖ−２ＤＮＡ制限断片の分子クローニングＥｃｏｊ
ｌで消化したＨ５Ｖ−２ＤＮＡを５％ポリアクリルアミ
ドゲルで処理することにより、Ｈ５Ｖ−２ゲノムの地図
でほぼ０．６５０の位置に相当するＥｃｏＲｌ”Ｐ”断
片を分離した。分離した断片を、ＥｃｏＲｌで消化した
ｐＵｃ９ （２８）ヘクローンした。このプラスミドは
ｐＵｃ−ＲＩＰと呼ばれた。
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ポリ″ヌクレオチド
キナ□−ゼはＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｓから購入し、提供者の指示に従って使用した〇 Ｈ８Ｖ−２ＤＮＡ制限断片の分子クローニングＥｃｏｊ
ｌで消化したＨ５Ｖ−２ＤＮＡを５％ポリアクリルアミ
ドゲルで処理することにより、Ｈ５Ｖ−２ゲノムの地図
でほぼ０．６５０の位置に相当するＥｃｏＲｌ”Ｐ”断
片を分離した。分離した断片を、ＥｃｏＲｌで消化した
ｐＵｃ９ （２８）ヘクローンした。このプラスミドは
ｐＵｃ−ＲＩＰと呼ばれた。
次に、ｐＵｃ−ＲＩＰサブクローンを、ＥｃｏＲ１１Ｐ
＠断片を含有するＨ５Ｖ−２ゲノムのＳａｃ １断片の
位置を突き止めるのに使用した。サザーンブロツテイン
グ実験（２７）によって、Ｈ８Ｖ−２の４，９ ｋｂ
Ｓａｃ １フラグメントがＥｃｏＲｌ ”Ｐ”断片を含
有してい、ることがわかった。この断片を０．７％アガ
ロースゲルで分離し、独特のＳａｃ １部位（５５）を
含有しているｐＢＲ３２２誘導プラスミドヘクローンし
た。。このプラスミドは’ｐＢＲ８ａｃｌＥｌ と呼ば
れた。、更に、ｐＢ竺５ａｃｌ−“Ｅ”の制限酵素分析
によりＥｃｏＲｌ”Ｐ”断片と配列相同性を有する２、
９ｋｂのＳａｌ ｌ断片ゲ証明され、前述と同様にして
Ｓａｌ ｌで消化されたｐＵＣ９ヘサブクローンした。
＠断片を含有するＨ５Ｖ−２ゲノムのＳａｃ １断片の
位置を突き止めるのに使用した。サザーンブロツテイン
グ実験（２７）によって、Ｈ８Ｖ−２の４，９ ｋｂ
Ｓａｃ １フラグメントがＥｃｏＲｌ ”Ｐ”断片を含
有してい、ることがわかった。この断片を０．７％アガ
ロースゲルで分離し、独特のＳａｃ １部位（５５）を
含有しているｐＢＲ３２２誘導プラスミドヘクローンし
た。。このプラスミドは’ｐＢＲ８ａｃｌＥｌ と呼ば
れた。、更に、ｐＢ竺５ａｃｌ−“Ｅ”の制限酵素分析
によりＥｃｏＲｌ”Ｐ”断片と配列相同性を有する２、
９ｋｂのＳａｌ ｌ断片ゲ証明され、前述と同様にして
Ｓａｌ ｌで消化されたｐＵＣ９ヘサブクローンした。
このプラスミドはｐｇＣ２Ｓａ１２．９と呼ばれた。
１） Ｎ Ａ配列の大部分はジデオキシヌクレオチドチ
ェーンターミネーション法を使用して決定した。種々の
断片を複製型のｍ１３フアージベクター、ｍｐ７．ｍｐ
８、およびｍｐ９ にサブクローンし、前述したように
ＤＮＡ配列を決定した（２９）。幾３２ つかの場合には、断片を、ｒＰ−ＡＴＬ’とＴ４ポリヌ
クレアーゼを用いてその５′−位を３２ｐで標識し、断
片のＤＮＡ配列を化学的分解法を使用して決定した（５
６）。ＤＮＡおよびタンパク質配列のコンピューターを
使用する解析はＲＯＭプログラムを用いて実施した（５
７）。推定したアミノ酸配列のヒトロバシーは１２アミ
ノ酸幅、ｌジャンプ法を使用して解析した（３１ａ）。
ェーンターミネーション法を使用して決定した。種々の
断片を複製型のｍ１３フアージベクター、ｍｐ７．ｍｐ
８、およびｍｐ９ にサブクローンし、前述したように
ＤＮＡ配列を決定した（２９）。幾３２ つかの場合には、断片を、ｒＰ−ＡＴＬ’とＴ４ポリヌ
クレアーゼを用いてその５′−位を３２ｐで標識し、断
片のＤＮＡ配列を化学的分解法を使用して決定した（５
６）。ＤＮＡおよびタンパク質配列のコンピューターを
使用する解析はＲＯＭプログラムを用いて実施した（５
７）。推定したアミノ酸配列のヒトロバシーは１２アミ
ノ酸幅、ｌジャンプ法を使用して解析した（３１ａ）。
制限エンドヌクレアーゼでＨＳ Ｖ −２ＤＮＡ ｌｉ
−消化し、プラスミドＤＮＡを１．５％アガロースゲル
上で分画し、標準的な方法でニトロセルロース上にプロ
ット（移し換え）した。第１２図で星印を付したＳａｃ
２断片の一本鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫ １
ｅｎｏ ｗ 断片で充填し、得られた平滑末端断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、Ｓｍａ ｌで消化され
たｍ１３ｍ７複製型（２９）に連結（ライゲーション）
した。このライゲーションおよびトランスフェクション
により調製された一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ
エのＫｌｅｎｏｗ 断片を使用し、高い特異的活性（１
×１１０９ＣＰ／μｇ）を有する３２Ｐ−標識一本鎖プ
ローブＤＮＡの合成の鋳型として使用した。ハイブリダ
イゼーションは標準的な方法を使用して実施した（２７
．５８）。
−消化し、プラスミドＤＮＡを１．５％アガロースゲル
上で分画し、標準的な方法でニトロセルロース上にプロ
ット（移し換え）した。第１２図で星印を付したＳａｃ
２断片の一本鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫ １
ｅｎｏ ｗ 断片で充填し、得られた平滑末端断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、Ｓｍａ ｌで消化され
たｍ１３ｍ７複製型（２９）に連結（ライゲーション）
した。このライゲーションおよびトランスフェクション
により調製された一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ
エのＫｌｅｎｏｗ 断片を使用し、高い特異的活性（１
×１１０９ＣＰ／μｇ）を有する３２Ｐ−標識一本鎖プ
ローブＤＮＡの合成の鋳型として使用した。ハイブリダ
イゼーションは標準的な方法を使用して実施した（２７
．５８）。
結果
ニング
Ｈ５Ｖ−２のｇＦＦ遺伝子分離するのに採られた方針は
、この遺伝子がＨ５Ｖ−１ｇｃ 遺伝子と共直線的（コ
リニア−）であるという仮定に基づいていた。この仮定
は、Ｈ５Ｖ−１の糖タンパク質Ｃと抗原的に相関性のあ
る７ ５，０００ダルトンの糖タンパク質ｇＦがＨ８Ｖ
−２中に発見されたこと、およびこのタンパク質のため
の遺伝子がＨ５Ｖ−１ｇＧ遺伝子とほぼ共直線的である
と言う最近の知見によって支持されていた（２２ｄ、５
９）。また、Ｈ３Ｖ−１ｇＣおよびＨ８Ｖ−２ｇＦの双
方に結合する単クローン性抗体が分離されたことは、こ
の二つのタンパク質が相互に相同的であるかも知れない
ことを更に示唆している（２２ｆ）。従って、Ｈ５Ｖ−
ｇｃ遺伝子と共直線的であるＨ５Ｖ−２ゲノム領域のＤ
ＮＡ配列を解析すれば、ＨＳ Ｖ −２ｇ Ｆ遺伝子の
配置を突き止めるタンパク質配列情報の手懸りが得られ
るであろうと考えられた。
、この遺伝子がＨ５Ｖ−１ｇｃ 遺伝子と共直線的（コ
リニア−）であるという仮定に基づいていた。この仮定
は、Ｈ５Ｖ−１の糖タンパク質Ｃと抗原的に相関性のあ
る７ ５，０００ダルトンの糖タンパク質ｇＦがＨ８Ｖ
−２中に発見されたこと、およびこのタンパク質のため
の遺伝子がＨ５Ｖ−１ｇＧ遺伝子とほぼ共直線的である
と言う最近の知見によって支持されていた（２２ｄ、５
９）。また、Ｈ３Ｖ−１ｇＣおよびＨ８Ｖ−２ｇＦの双
方に結合する単クローン性抗体が分離されたことは、こ
の二つのタンパク質が相互に相同的であるかも知れない
ことを更に示唆している（２２ｆ）。従って、Ｈ５Ｖ−
ｇｃ遺伝子と共直線的であるＨ５Ｖ−２ゲノム領域のＤ
ＮＡ配列を解析すれば、ＨＳ Ｖ −２ｇ Ｆ遺伝子の
配置を突き止めるタンパク質配列情報の手懸りが得られ
るであろうと考えられた。
１（ＳＶ−２ゲノムの６００塩基対のＥｃｏＲｌ”Ｐ’
断片は〜０．６５０の位置に存在することがわかった（
１２）。この領域は、Ｈ８Ｖ−１ゲノムの約０．６３０
〜０．６４０に位置するＨ８Ｖ−１ｇｃ遺伝子の既知の
暗号化領域（５９）とほぼ共直線的である。この断片は
１−ｉＳｖ−２ＤＮＡのＥｃｏ Ｒｌ消化物から分離さ
れ、プラスミドｐＵＣ９（２８）にクローンされ、その
ＤＮＡ配列が決定された（２９．５６）。得られた配列
をＨ５Ｖ−１ｇＧ配列と比較すると（５９）、ＥｃｏＲ
ｌ ” Ｐ ”断片（！：Ｈ５Ｖ−１ ｇＧ暗号化領域
の３’−末端の間に高度の、配列相同性が見られた。そ
れ故、Ｈ５Ｖ−１ｇＧ遺伝子と相同性であるｉＳｖ−２
遺伝子の残りの部分も十分に含んでいるＥｃｏＲＩＩ
ｐ １断片と重複しているＨ５Ｖ−２ゲノムＤＮＡから
、Ｓａｃ ｌ制限エンドヌクレアーゼ断片を分離するプ
ローブとして、このＥｃｏＲｌ ’Ｐ’を使用した。第
１２図には、Ｅｃｏ Ｒ１” Ｐ ’断片を含んでおり
、ＤＮＡ配列解析に使用り、、り２．９ ｋｂ （７）
Ｓａｌ １ 断片をＨ８Ｖ−２ゲノムから分離するの
に要した手順を図示した。
断片は〜０．６５０の位置に存在することがわかった（
１２）。この領域は、Ｈ８Ｖ−１ゲノムの約０．６３０
〜０．６４０に位置するＨ８Ｖ−１ｇｃ遺伝子の既知の
暗号化領域（５９）とほぼ共直線的である。この断片は
１−ｉＳｖ−２ＤＮＡのＥｃｏ Ｒｌ消化物から分離さ
れ、プラスミドｐＵＣ９（２８）にクローンされ、その
ＤＮＡ配列が決定された（２９．５６）。得られた配列
をＨ５Ｖ−１ｇＧ配列と比較すると（５９）、ＥｃｏＲ
ｌ ” Ｐ ”断片（！：Ｈ５Ｖ−１ ｇＧ暗号化領域
の３’−末端の間に高度の、配列相同性が見られた。そ
れ故、Ｈ５Ｖ−１ｇＧ遺伝子と相同性であるｉＳｖ−２
遺伝子の残りの部分も十分に含んでいるＥｃｏＲＩＩ
ｐ １断片と重複しているＨ５Ｖ−２ゲノムＤＮＡから
、Ｓａｃ ｌ制限エンドヌクレアーゼ断片を分離するプ
ローブとして、このＥｃｏＲｌ ’Ｐ’を使用した。第
１２図には、Ｅｃｏ Ｒ１” Ｐ ’断片を含んでおり
、ＤＮＡ配列解析に使用り、、り２．９ ｋｂ （７）
Ｓａｌ １ 断片をＨ８Ｖ−２ゲノムから分離するの
に要した手順を図示した。
解析
ＥｃｏＲｌ”Ｐ“断片との配列相同性に基づき、Ｈ３Ｖ
−２ゲノムから分離した４、３ｋｂの５ａｃｌ”Ｅ’断
片を更に消化して、２，９ｋｂのＳａｌ ｌ断片を得て
、これをｐ ｇ Ｃ２Ｓ ａ ｌ ２．９と命名した。
−２ゲノムから分離した４、３ｋｂの５ａｃｌ”Ｅ’断
片を更に消化して、２，９ｋｂのＳａｌ ｌ断片を得て
、これをｐ ｇ Ｃ２Ｓ ａ ｌ ２．９と命名した。
第１２図は、ジデオキシヌクレオチド配列決定法（２９
）または化学的分解法（５６）のいずれかによりＤＮＡ
配列解析が行なわれたｐ ｇ Ｃ２Ｓ ａ ｌ ２．９
からの断片を示している。更にこの図は、ｐｇＣ２Ｓａ
ｌ ２，９の中のＥｃｏＲｌ“ＰＩｌ断片位置と同時に
、Ｈ８Ｖ−２ゲノムの〜０．６２８の位置のＢｇｌｌＩ
”Ｎｌ断片の右側末端に相当するＢｇｌ［部位の位置を
示している（１２）。
）または化学的分解法（５６）のいずれかによりＤＮＡ
配列解析が行なわれたｐ ｇ Ｃ２Ｓ ａ ｌ ２．９
からの断片を示している。更にこの図は、ｐｇＣ２Ｓａ
ｌ ２，９の中のＥｃｏＲｌ“ＰＩｌ断片位置と同時に
、Ｈ８Ｖ−２ゲノムの〜０．６２８の位置のＢｇｌｌＩ
”Ｎｌ断片の右側末端に相当するＢｇｌ［部位の位置を
示している（１２）。
更に詳細に述べると、第１２図は、Ｈ５Ｖ−１ｇＧと共
直線的に配置しているＨＶＳ−２領域、ＰｇＣ２Ｓａ１
２．９のクローニングを示している。〜０，６１〜０．
６６ に配置しているＨ８Ｖ−ゲノムの領域は、６００
塩基対のＥｃｏＲｌ ”Ｐ”断片をプローブとして使用
し、Ｓａｃ ｌ断片（ｐＢＲ５ａｃ″Ｅｌ）としてクロ
ーンした。ｐＢＲ８ａｃ ”Ｅ“のサブクローン、ｐ
ｇ Ｃ２Ｓａ １２．９はＤＮＡ配列解析に使用した。
直線的に配置しているＨＶＳ−２領域、ＰｇＣ２Ｓａ１
２．９のクローニングを示している。〜０，６１〜０．
６６ に配置しているＨ８Ｖ−ゲノムの領域は、６００
塩基対のＥｃｏＲｌ ”Ｐ”断片をプローブとして使用
し、Ｓａｃ ｌ断片（ｐＢＲ５ａｃ″Ｅｌ）としてクロ
ーンした。ｐＢＲ８ａｃ ”Ｅ“のサブクローン、ｐ
ｇ Ｃ２Ｓａ １２．９はＤＮＡ配列解析に使用した。
矢印は配列化された領域を表わし、その配列から誘導さ
れた主な４７９アミノ酸のオープンリーディングフレー
ムの位置が図示されている。Ｅｃｏ Ｒ１” Ｐ ”断
片を略本するＥｃｏ Ｒ１部位、およびＢｇｌ ２ ”
Ｎ”断片の右端にあるＢｇｌ ２部位（地図の〜０．６
２８の位置）（２６）を含む種々の制限部位が示育れて
いる。星（＊）印で示しであるＳａｃ ２断片は、この
領域に出現する欠失を調べるために行なったサザーンブ
ロッテイン実験に使用した（結果参照）。Ｓｍ；Ｓｍａ
ｌ、Ｓａ纂５ａｃ２．Ｒｓ：Ｒｓａｌ、Ｂｇ；８ｇ１２
．Ｐｖ；Ｐｖｕ ２ 、 Ｒ１； ＥｃｏＲｌなどの他
の部位はＤＮＡ配列決定実験に使用した。
れた主な４７９アミノ酸のオープンリーディングフレー
ムの位置が図示されている。Ｅｃｏ Ｒ１” Ｐ ”断
片を略本するＥｃｏ Ｒ１部位、およびＢｇｌ ２ ”
Ｎ”断片の右端にあるＢｇｌ ２部位（地図の〜０．６
２８の位置）（２６）を含む種々の制限部位が示育れて
いる。星（＊）印で示しであるＳａｃ ２断片は、この
領域に出現する欠失を調べるために行なったサザーンブ
ロッテイン実験に使用した（結果参照）。Ｓｍ；Ｓｍａ
ｌ、Ｓａ纂５ａｃ２．Ｒｓ：Ｒｓａｌ、Ｂｇ；８ｇ１２
．Ｐｖ；Ｐｖｕ ２ 、 Ｒ１； ＥｃｏＲｌなどの他
の部位はＤＮＡ配列決定実験に使用した。
第１３図はｐ ｇ Ｃ２Ｓ ａ １ 、２．９から得ら
れたＤＮＡ配列をＨ５Ｖ−１ｇｃ領域のＤＮＡ配列（５
９）と比較して示している。Ｈ５Ｖ−１ｇＣ領域（Ｈ５
Ｖ−１）とｐｇＣ２Ｓａｌ ２，９から得た配列（Ｈ５
Ｖ−２）はＲＯＭプログラム（５７）を用いて比較した
。種々の欠失は配列の重複を最大化するのｌと使用され
たから、わかり易くするためにスペースを含むすべての
位置に番号を付けた。星印は一致しないヌクレオチドの
上に付けた。Ｈ５Ｖ−１配列の４３位にある下線を引い
た１Ａ１残基は、ｇＣｍＲＮＡのほぼ転写開始部位であ
る（５９）。”ＴＡＴＡ“１、およびＴＡＴＡ ２は、
それぞれＨＳ Ｖ−１ｇ ＣｍＲＮＡと７３０塩基ｍ
ＲＮ Ａの転写コントロール領域と推定される（５９．
６０）。Ｈ８Ｖ−１配列の１７２８の位置に挿入された
Ｔ残基はこ９領域の配列再決定により発見され（Ｍ、
Ｊａｃｋｓｏｎ末、−表）、それはＨ８Ｖ−２の主オー
プンリーディングフレームの停止コドンと相同である１
７３５〜１７３７の位置にインフェース停止コドンを導
入するものであることが明らかにされた。第２Ｈ５Ｖ−
２開始コドンの位置が１９７５〜１９７７であるように
、Ｈ５Ｖ−１の７３０塩基ｍ ＲＮ Ａ開始コドンの位
置は２０３２〜２０３４に示されている。
れたＤＮＡ配列をＨ５Ｖ−１ｇｃ領域のＤＮＡ配列（５
９）と比較して示している。Ｈ５Ｖ−１ｇＣ領域（Ｈ５
Ｖ−１）とｐｇＣ２Ｓａｌ ２，９から得た配列（Ｈ５
Ｖ−２）はＲＯＭプログラム（５７）を用いて比較した
。種々の欠失は配列の重複を最大化するのｌと使用され
たから、わかり易くするためにスペースを含むすべての
位置に番号を付けた。星印は一致しないヌクレオチドの
上に付けた。Ｈ５Ｖ−１配列の４３位にある下線を引い
た１Ａ１残基は、ｇＣｍＲＮＡのほぼ転写開始部位であ
る（５９）。”ＴＡＴＡ“１、およびＴＡＴＡ ２は、
それぞれＨＳ Ｖ−１ｇ ＣｍＲＮＡと７３０塩基ｍ
ＲＮ Ａの転写コントロール領域と推定される（５９．
６０）。Ｈ８Ｖ−１配列の１７２８の位置に挿入された
Ｔ残基はこ９領域の配列再決定により発見され（Ｍ、
Ｊａｃｋｓｏｎ末、−表）、それはＨ８Ｖ−２の主オー
プンリーディングフレームの停止コドンと相同である１
７３５〜１７３７の位置にインフェース停止コドンを導
入するものであることが明らかにされた。第２Ｈ５Ｖ−
２開始コドンの位置が１９７５〜１９７７であるように
、Ｈ５Ｖ−１の７３０塩基ｍ ＲＮ Ａ開始コドンの位
置は２０３２〜２０３４に示されている。
再び第１３図において、Ｈ８Ｖ−，２の図示された誘導
配列をＨ８Ｖ−１のｇＣ遺伝子、声域のＤＮＡ配列（５
９）と比較すると、これｔ二つ、の断片間の全体的な配
列相同性は約６８％であった。然しなが□ ら配列のある一定の領域を見る牛、配列相同性の程度は
他に比較してはるかに高いか、または低かった。例えば
、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖその０〜５７０位の配列は僅かに
５１％の相同、性しか示さないが、５７０〜１７４０位
の領域は、堺か、、ｉこ高い配列相同性を示した（８０
１゜もう−？の相同性の高い領域（７０％）は二つの配
列の終りの１９７５位〜２４１９位に見出された。ヌク
レオチド配列の変化に加えて、二つのゲノムを相互に比
較すると、種々の欠失または挿入が見、られた。最も顕
著なのはＨ８Ｖ−１ｇｃ配列の３４６〜４２６の位置に
見られる８１塩基対の領域が、Ｈ５Ｖ−２ゲノムでは失
われていることであった。、この全体的な配列比較から
、ここに配列決定を行、なったＨ８Ｖ−１ｇＣ領域とＨ
８Ｖ−２領域との間には高度の配列相同性があることが
示された。
配列をＨ８Ｖ−１のｇＣ遺伝子、声域のＤＮＡ配列（５
９）と比較すると、これｔ二つ、の断片間の全体的な配
列相同性は約６８％であった。然しなが□ ら配列のある一定の領域を見る牛、配列相同性の程度は
他に比較してはるかに高いか、または低かった。例えば
、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖその０〜５７０位の配列は僅かに
５１％の相同、性しか示さないが、５７０〜１７４０位
の領域は、堺か、、ｉこ高い配列相同性を示した（８０
１゜もう−？の相同性の高い領域（７０％）は二つの配
列の終りの１９７５位〜２４１９位に見出された。ヌク
レオチド配列の変化に加えて、二つのゲノムを相互に比
較すると、種々の欠失または挿入が見、られた。最も顕
著なのはＨ８Ｖ−１ｇｃ配列の３４６〜４２６の位置に
見られる８１塩基対の領域が、Ｈ５Ｖ−２ゲノムでは失
われていることであった。、この全体的な配列比較から
、ここに配列決定を行、なったＨ８Ｖ−１ｇＣ領域とＨ
８Ｖ−２領域との間には高度の配列相同性があることが
示された。
Ｆｒ１ｎｋら（５９）は、Ｈ８Ｖ−１ｇＣを暗号化して
いる２、５２０塩基ｍ ＲＮ Ａの５′−末端が、第１
３図の４３位の下線を引いたＡ残基にマツプ（配置）す
ることを発見した。更に、彼らは、この残基の約２２塩
基対（５′）にＡＴに富んだ”ＴＡＴＡ”ボックス（６
０）を指摘している。第１３図に示した二つの配列を比
較すると、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２の配列は共にこの領
域に同一の配列、ＣＧＧＧＴＡＴＡＡＡを含んでいるこ
とを示している。この配列は、これまで決定された多く
の１ｉｓｖ−１およびＨ５Ｖ−２配列中の”ＴＡＴＡ”
ポックろ領域に存在することが見い出されている先のＷ
ｈ ｉ ｔ ｔｏｎらの報告（６１）の配列と一致する
。この保存配列に続いて、両ウィルスゲノムともＧに富
んだ領域がある。この推定上の転写コントロール領域の
ほかに、第２の”ＴＡＴＡ’ボックスが第１３図の二つ
の配列の１８４５〜１８４９の位置に見出された。この
第２の’ＴＡＴＡ”ボックスはＨＳ Ｖ−１ゲノムにお
いて７３０塩基ｍ ＲＮ Ａの転写をコントロールする
ものと推定されている（５９）。Ｈ５Ｖ−１とＩ（ＳＶ
−２は共にこの配列を含んでおり、それは第一の１ＴＡ
ＴＡ”、ｊ′５ツクスの前にあるＣＧＧＧ配列と類似し
たＣＧＧＧＣＧ 配列を含むＧＯに富んだフランキング
配列に囲まれている。更に両ゲノムとも、この第２の”
ＴＡＴ’Ａ”ボックスの３′にオープンリーディングフ
レームを暗号化しており、これ番ごつシＡでは後に論じ
る。
いる２、５２０塩基ｍ ＲＮ Ａの５′−末端が、第１
３図の４３位の下線を引いたＡ残基にマツプ（配置）す
ることを発見した。更に、彼らは、この残基の約２２塩
基対（５′）にＡＴに富んだ”ＴＡＴＡ”ボックス（６
０）を指摘している。第１３図に示した二つの配列を比
較すると、Ｈ８Ｖ−１とＨ５Ｖ−２の配列は共にこの領
域に同一の配列、ＣＧＧＧＴＡＴＡＡＡを含んでいるこ
とを示している。この配列は、これまで決定された多く
の１ｉｓｖ−１およびＨ５Ｖ−２配列中の”ＴＡＴＡ”
ポックろ領域に存在することが見い出されている先のＷ
ｈ ｉ ｔ ｔｏｎらの報告（６１）の配列と一致する
。この保存配列に続いて、両ウィルスゲノムともＧに富
んだ領域がある。この推定上の転写コントロール領域の
ほかに、第２の”ＴＡＴＡ’ボックスが第１３図の二つ
の配列の１８４５〜１８４９の位置に見出された。この
第２の’ＴＡＴＡ”ボックスはＨＳ Ｖ−１ゲノムにお
いて７３０塩基ｍ ＲＮ Ａの転写をコントロールする
ものと推定されている（５９）。Ｈ５Ｖ−１とＩ（ＳＶ
−２は共にこの配列を含んでおり、それは第一の１ＴＡ
ＴＡ”、ｊ′５ツクスの前にあるＣＧＧＧ配列と類似し
たＣＧＧＧＣＧ 配列を含むＧＯに富んだフランキング
配列に囲まれている。更に両ゲノムとも、この第２の”
ＴＡＴ’Ａ”ボックスの３′にオープンリーディングフ
レームを暗号化しており、これ番ごつシＡでは後に論じ
る。
前述した８１塩基対の欠失がＩ（ＳＶ−２ゲノムに実際
に見出されるのか、或いはクローニングまたは配列決定
の実験中に起こる人為的なものなのかどうかを決定する
ために、Ｈ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨ
５Ｖ−２ＤＮＡのサザーンブロツテイング解析を実施し
た。失われた８１塩基対の領域にまたがるＳａｃ ２断
片（第１２図の断片参照）から３２Ｐ−標識プローブを
調製した。もしＨ５Ｖ−２ゲノムＤＮＡが８１塩基対の
領域を欠失しているならば、この領域にまたがるＳｍａ
ｌ−Ｂ ｇ■断片は５７６塩基対となり、Ｓｍａ ｌ
断片は６６２塩基となり、Ｓａｃ ２断片は１９５塩基
対となるであろう。
に見出されるのか、或いはクローニングまたは配列決定
の実験中に起こる人為的なものなのかどうかを決定する
ために、Ｈ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨ
５Ｖ−２ＤＮＡのサザーンブロツテイング解析を実施し
た。失われた８１塩基対の領域にまたがるＳａｃ ２断
片（第１２図の断片参照）から３２Ｐ−標識プローブを
調製した。もしＨ５Ｖ−２ゲノムＤＮＡが８１塩基対の
領域を欠失しているならば、この領域にまたがるＳｍａ
ｌ−Ｂ ｇ■断片は５７６塩基対となり、Ｓｍａ ｌ
断片は６６２塩基となり、Ｓａｃ ２断片は１９５塩基
対となるであろう。
第１４図は、１（ＳＶ−２ゲ／ ムＤ Ｎ ＡとｐｇＣ
２Ｓａ１２．９１）ＮＡのサザーンブロツテイング解析
を示す。第１３図に示したＨ５Ｖ−２配列中、脱落して
いる８１塩基対領域にまたがる領域（ｊ−（ＳＶ−２の
３４６〜４２６の位置）を、欠失領域に重なり合う第１
２図の星印で示したＳａｃ ２断片を使用（−で解析し
た。１〜３列はＨ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡの制限消化物で
あり、４〜６列はｐｇＣ２Ｓａ１２．９の制限酵素消化
物である。消化されたＤＮＡは１．５；／アガロースゲ
ルで電気泳動し、変性し、ニトロセルロースにプロット
し、３２Ｐ−標識Ｓａｃ ２断片でプローブした。（矢
印は、ファージλＤＮＡの５６４塩基対のＨｉｎｄｌｌ
Ｉ断片の位置を示す）。１列および６タリ目；Ｓｍａｌ
斗Ｂｇｌ ２ ： ２列および５列目逼Ｓｍａ ｌ ：
３列および４列目；５ａｃ２゜第１４図に示された結
果から、予測した制限部位が）■５Ｖ−２ゲ／ムＤＮＡ
およびクローンした１（ＳＶ−２ＤＮＡの双方において
、８１塩基対を欠失している領域を囲んでいることが明
らかになった。更に、ｌ−ｌ５Ｖ−２ゲノム断片および
クローンした断片は正確に伴移動（コマイブレート）シ
ており、欠失がクローニングまたは配列決定における手
技によって人為的に起こったものでないことがわかった
。
２Ｓａ１２．９１）ＮＡのサザーンブロツテイング解析
を示す。第１３図に示したＨ５Ｖ−２配列中、脱落して
いる８１塩基対領域にまたがる領域（ｊ−（ＳＶ−２の
３４６〜４２６の位置）を、欠失領域に重なり合う第１
２図の星印で示したＳａｃ ２断片を使用（−で解析し
た。１〜３列はＨ８Ｖ−２ゲノムＤＮＡの制限消化物で
あり、４〜６列はｐｇＣ２Ｓａ１２．９の制限酵素消化
物である。消化されたＤＮＡは１．５；／アガロースゲ
ルで電気泳動し、変性し、ニトロセルロースにプロット
し、３２Ｐ−標識Ｓａｃ ２断片でプローブした。（矢
印は、ファージλＤＮＡの５６４塩基対のＨｉｎｄｌｌ
Ｉ断片の位置を示す）。１列および６タリ目；Ｓｍａｌ
斗Ｂｇｌ ２ ： ２列および５列目逼Ｓｍａ ｌ ：
３列および４列目；５ａｃ２゜第１４図に示された結
果から、予測した制限部位が）■５Ｖ−２ゲ／ムＤＮＡ
およびクローンした１（ＳＶ−２ＤＮＡの双方において
、８１塩基対を欠失している領域を囲んでいることが明
らかになった。更に、ｌ−ｌ５Ｖ−２ゲノム断片および
クローンした断片は正確に伴移動（コマイブレート）シ
ており、欠失がクローニングまたは配列決定における手
技によって人為的に起こったものでないことがわかった
。
Ｈ５Ｖ−２の２．９ ｋｂ Ｓａｌ ｌ断片に含まれて
いる潜在的暗号化配列を解析し、第１３図に示したＨ８
Ｖ−２配列の１９９〜２０１の位置に暗号化されている
メチオニンから始まり、この図のｌ−ｌ５Ｖ−２配列の
１７３５〜１７３７の位置のＴＡＡ停止停止トドるΔ ４７９個のアミノ酸から成るオープンリーディングフレ
ームを明らかにした。第１３図から判るように、Ｉ（Ｓ
Ｖ−１ｇｃタンパク質とｏｓｖ−２オープンリーデイン
グフレームは、共に二つの配列の、”ＴＡＴＡ’ボック
ス相同に対してほぼ同じ位置から開始する。更に、最初
この領域に存在するＨ３Ｖ−２オープンリーデイングフ
レームはＨ８Ｖ−１ｇｃ遺伝子の前の１２コドンで終る
と考えられていたが、）ＩｓＶ−ＩＦ株のｇＣ遺伝子配
列のカルボキシル末端領域の配列を再決定することによ
り（ｈｉ・Ｊａｃｋｓｏｎ、未発表）、Ｆｒ１ｎｋら（
５９）によって報告された配列は１７２７の位置の後の
チミジンヌクレオチドを見落としていたこと、およびこ
の残基を挿入すると、翻訳したＨ５Ｖ−１ｇＧタンパク
質は）（ＳＶ−２オープンリーデイングフレームと同じ
場所（第１３図の１７３５〜１７３７）で終了する翻訳
された１４ＳＶ−１ｇＧ蛋白質となることが明らかにな
った。このようにして、種々の欠失および挿入を考慮す
ると、第１３図に示したように、ｌ−ｌ５Ｖ−１ｇＧ遺
伝子とＨ５Ｖ−２のオープンリーディングフレームは非
常に高度の重なりを示す。
いる潜在的暗号化配列を解析し、第１３図に示したＨ８
Ｖ−２配列の１９９〜２０１の位置に暗号化されている
メチオニンから始まり、この図のｌ−ｌ５Ｖ−２配列の
１７３５〜１７３７の位置のＴＡＡ停止停止トドるΔ ４７９個のアミノ酸から成るオープンリーディングフレ
ームを明らかにした。第１３図から判るように、Ｉ（Ｓ
Ｖ−１ｇｃタンパク質とｏｓｖ−２オープンリーデイン
グフレームは、共に二つの配列の、”ＴＡＴＡ’ボック
ス相同に対してほぼ同じ位置から開始する。更に、最初
この領域に存在するＨ３Ｖ−２オープンリーデイングフ
レームはＨ８Ｖ−１ｇｃ遺伝子の前の１２コドンで終る
と考えられていたが、）ＩｓＶ−ＩＦ株のｇＣ遺伝子配
列のカルボキシル末端領域の配列を再決定することによ
り（ｈｉ・Ｊａｃｋｓｏｎ、未発表）、Ｆｒ１ｎｋら（
５９）によって報告された配列は１７２７の位置の後の
チミジンヌクレオチドを見落としていたこと、およびこ
の残基を挿入すると、翻訳したＨ５Ｖ−１ｇＧタンパク
質は）（ＳＶ−２オープンリーデイングフレームと同じ
場所（第１３図の１７３５〜１７３７）で終了する翻訳
された１４ＳＶ−１ｇＧ蛋白質となることが明らかにな
った。このようにして、種々の欠失および挿入を考慮す
ると、第１３図に示したように、ｌ−ｌ５Ｖ−１ｇＧ遺
伝子とＨ５Ｖ−２のオープンリーディングフレームは非
常に高度の重なりを示す。
第１５図は、ｔｉｓｖ−２の大−オープンリーディング
フレームの翻訳と、Ｈ・ＳＶ−１ｇｃアミノ酸配列との
比較を示す。アミノ酸は１文字略号法を使用して表わし
た。Ｈ５Ｖ−１ｇＣはＨ８Ｖ−１ｇｃ配列を意味し、Ｈ
５Ｖ−２ｇＦはＨ８Ｖ−２オ一プンリーデイングフレー
ム配列を意味する。タンパク質はＲＯＭプログラムを使
用して比較し、間隙の場所は、所望により相同体を最大
化して挿入した。
フレームの翻訳と、Ｈ・ＳＶ−１ｇｃアミノ酸配列との
比較を示す。アミノ酸は１文字略号法を使用して表わし
た。Ｈ５Ｖ−１ｇＣはＨ８Ｖ−１ｇｃ配列を意味し、Ｈ
５Ｖ−２ｇＦはＨ８Ｖ−２オ一プンリーデイングフレー
ム配列を意味する。タンパク質はＲＯＭプログラムを使
用して比較し、間隙の場所は、所望により相同体を最大
化して挿入した。
相同でないアミノ酸の上に星印を付した。Ｎ−結合糖タ
ンパク質と推定される部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ）（６
２）には陰影を付け、システィン残基（Ｃ）は枠で囲ん
だ。空間部分（スペース）を除き、アミノ酸だけに番号
を付けた。図１５Ｂは、２番目のＨ８Ｖ−２オープンリ
ーデイングフレームの翻訳およびＨ８Ｖ−１７３０塩基
ｍ ＲＮ Ａタンパク質との比較を示す。７３００ＲＦ
Ｈ８Ｖ−２は、第１３図に示したＨ５Ｖ−２配列の１
９７５〜２４０６の位置から誘導された第２のＨ５Ｖ−
２オープンリーデイングフレームの不完全アミノ酸配列
である、７３００ＲＦ Ｈ８Ｖ−１は、Ｈ８Ｖ−１（７
） ７３０塩基ｍＲＮＡ（５９） によって暗号化され
たタンパク質へ誘導するアミノ酸配列である。第４．Ａ
図および第４Ｂ図のいずれにおいても、電荷に関して保
守（コンサーブ）されているアミノ酸変化には（Ｃ）印
を、電荷に関して保守（コンサーブ）されていない変化
には（Ｎ） 印を付けた。
ンパク質と推定される部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ）（６
２）には陰影を付け、システィン残基（Ｃ）は枠で囲ん
だ。空間部分（スペース）を除き、アミノ酸だけに番号
を付けた。図１５Ｂは、２番目のＨ８Ｖ−２オープンリ
ーデイングフレームの翻訳およびＨ８Ｖ−１７３０塩基
ｍ ＲＮ Ａタンパク質との比較を示す。７３００ＲＦ
Ｈ８Ｖ−２は、第１３図に示したＨ５Ｖ−２配列の１
９７５〜２４０６の位置から誘導された第２のＨ５Ｖ−
２オープンリーデイングフレームの不完全アミノ酸配列
である、７３００ＲＦ Ｈ８Ｖ−１は、Ｈ８Ｖ−１（７
） ７３０塩基ｍＲＮＡ（５９） によって暗号化され
たタンパク質へ誘導するアミノ酸配列である。第４．Ａ
図および第４Ｂ図のいずれにおいても、電荷に関して保
守（コンサーブ）されているアミノ酸変化には（Ｃ）印
を、電荷に関して保守（コンサーブ）されていない変化
には（Ｎ） 印を付けた。
第１５図には、Ｈ８Ｖ−１ｇｃ遺伝子と４７９アミノ酸
Ｈ８Ｖ−２オ一プンリーデイングフレーム間の高度の配
列相同性を図示している。最初の１９個のアミノ酸は、
電荷に関してすべて保守的コンサーバティブ）である最
初の２５個のアミノ酸の変化を伴ない、約８０％の配列
相同性を含んでいる。Ｈ８Ｖ−１ｇＣ（７） １２４番
目ノ残基（Ｈ８Ｖ−２配列の９００番目残基）から両タ
ンパク質の末端 ゛までは、電荷に関して保守的（コン
サーバティブ）である７５％のアミノ酸変化を伴なう約
７４％の配列相同性がある。Ｎ一連結糖付加が推定され
る５ケ所の部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ（６２）） は、
両タンパク質問で保守（コンサーブ）され、７個のシス
ティン残基はすべてＣ末雫に対し相同的な位置に局在し
ている。タンパク質のカルボキシ１し末端基の３／４
における全般的な配列の保守性、（コンサーベーション
）に加えて、２０残基の長さにわたる大きい領域のアミ
ノ酸配タリの偶発的な相同性もある（即ち、ＨＳ Ｖ−
１の３８５〜４０５の位置の配列とＨ５Ｖ−２の３５２
〜３７２の位置の配列）。この配列の比較から、Ｈ５Ｖ
−２ゲノムのこの領域のオープンリーディングフレーム
は、Ｈ５Ｖ−１ｇＧと相同なタンパク質を暗号化さ些て
いると結論して良い。
Ｈ８Ｖ−２オ一プンリーデイングフレーム間の高度の配
列相同性を図示している。最初の１９個のアミノ酸は、
電荷に関してすべて保守的コンサーバティブ）である最
初の２５個のアミノ酸の変化を伴ない、約８０％の配列
相同性を含んでいる。Ｈ８Ｖ−１ｇＣ（７） １２４番
目ノ残基（Ｈ８Ｖ−２配列の９００番目残基）から両タ
ンパク質の末端 ゛までは、電荷に関して保守的（コン
サーバティブ）である７５％のアミノ酸変化を伴なう約
７４％の配列相同性がある。Ｎ一連結糖付加が推定され
る５ケ所の部位（ＮＸＳまたはＮＸＴ（６２）） は、
両タンパク質問で保守（コンサーブ）され、７個のシス
ティン残基はすべてＣ末雫に対し相同的な位置に局在し
ている。タンパク質のカルボキシ１し末端基の３／４
における全般的な配列の保守性、（コンサーベーション
）に加えて、２０残基の長さにわたる大きい領域のアミ
ノ酸配タリの偶発的な相同性もある（即ち、ＨＳ Ｖ−
１の３８５〜４０５の位置の配列とＨ５Ｖ−２の３５２
〜３７２の位置の配列）。この配列の比較から、Ｈ５Ｖ
−２ゲノムのこの領域のオープンリーディングフレーム
は、Ｈ５Ｖ−１ｇＧと相同なタンパク質を暗号化さ些て
いると結論して良い。
この領域に暗号化されているｌ−１ｓＶ−２タンパク質
はＨ８Ｖ−１ｇＧ配列と著しい配列相同性を示している
が、一方、二つの配列間には数ケ所の注目すべき差異が
ある。最も際立った差異は、Ｈ８Ｖ−１ｇＣ配列におけ
る５０〜７６残基から見出される２７個のアミノ酸がＨ
８Ｖ−２配７すに欠失している（第１５図）ことであり
、これは先に記述した８１塩基対の欠失に対応する。こ
の大きい欠失のほかに、両配列には１個または２個のア
ミノ酸から成る短か、い欠失が見られる。これらの欠失
のすべてはタンパク質のアミノ末端領域に見出される。
はＨ８Ｖ−１ｇＧ配列と著しい配列相同性を示している
が、一方、二つの配列間には数ケ所の注目すべき差異が
ある。最も際立った差異は、Ｈ８Ｖ−１ｇＣ配列におけ
る５０〜７６残基から見出される２７個のアミノ酸がＨ
８Ｖ−２配７すに欠失している（第１５図）ことであり
、これは先に記述した８１塩基対の欠失に対応する。こ
の大きい欠失のほかに、両配列には１個または２個のア
ミノ酸から成る短か、い欠失が見られる。これらの欠失
のすべてはタンパク質のアミノ末端領域に見出される。
これらの欠失のほかに、Ｈ８Ｖ−１ｇＧ配列の２９〜１
２３残基の間（Ｈ５Ｖ−２配列の３１〜９０残基）に頻
発するタンパク質のアミノ末端領域には多くのアミノ酸
の変異がある。この領域ではアミノ酸の３０％だけが相
同性であり、この相同の多くは保守（コンサーブ）され
たプロリン残基に起因している。この領域に見出される
アミノ酸置換の４３％は電荷に関して非保守的（ノンコ
ンサーバテイブ）である。そのような多数の変異を示す
唯一の他の領域はカルボキシル末端疎水性領域（Ｈ５Ｖ
−１配列（７）４７６〜４９６残基およびＨ５■−２配
列の４４３〜４６３残基）であり、そこではタンパク質
の５５哄が相同性であるが、すべての変化が保守（コン
サーブ）され、荷電されず、疎水性のアミノ酸であり、
また該タンパク質のカルボキシル末端では配列の僅か２
５％、だけが相同であるが、全般的なアミノ酸の構成は
相似している（）ＩＳＶ−１のＳＯＯ〜５１２残基およ
びＨ５Ｖ−２の４６７〜４７９残基）。二つのタンパク
質問には５ケ所のＮ−結合糖付加推定部位が保守（コン
サーブ）されているが、一方Ｈ５Ｖ−ｇＣ配列はＨ８Ｖ
−２配列より２ケ所含んでいる部位が多い（総計９＝７
）。
２３残基の間（Ｈ５Ｖ−２配列の３１〜９０残基）に頻
発するタンパク質のアミノ末端領域には多くのアミノ酸
の変異がある。この領域ではアミノ酸の３０％だけが相
同性であり、この相同の多くは保守（コンサーブ）され
たプロリン残基に起因している。この領域に見出される
アミノ酸置換の４３％は電荷に関して非保守的（ノンコ
ンサーバテイブ）である。そのような多数の変異を示す
唯一の他の領域はカルボキシル末端疎水性領域（Ｈ５Ｖ
−１配列（７）４７６〜４９６残基およびＨ５■−２配
列の４４３〜４６３残基）であり、そこではタンパク質
の５５哄が相同性であるが、すべての変化が保守（コン
サーブ）され、荷電されず、疎水性のアミノ酸であり、
また該タンパク質のカルボキシル末端では配列の僅か２
５％、だけが相同であるが、全般的なアミノ酸の構成は
相似している（）ＩＳＶ−１のＳＯＯ〜５１２残基およ
びＨ５Ｖ−２の４６７〜４７９残基）。二つのタンパク
質問には５ケ所のＮ−結合糖付加推定部位が保守（コン
サーブ）されているが、一方Ｈ５Ｖ−ｇＣ配列はＨ８Ｖ
−２配列より２ケ所含んでいる部位が多い（総計９＝７
）。
Ｉ−ＩＳＶ−１ｇＧ配列には、Ｈ８Ｖ−２部位からは欠
失している２７個のアミノ酸中に２ケ所のＮ−結合糖付
加部位と、第１５図の１０９〜１１２残基間に１対の重
複している部位が含まれている。Ｈ５Ｖ−２配列はＨ５
Ｖ−１配列には見られない２ケ所のＮ−結合糖付加部位
を含んでおり、その１個はアミノ末端領域の近くにある
。
失している２７個のアミノ酸中に２ケ所のＮ−結合糖付
加部位と、第１５図の１０９〜１１２残基間に１対の重
複している部位が含まれている。Ｈ５Ｖ−２配列はＨ５
Ｖ−１配列には見られない２ケ所のＮ−結合糖付加部位
を含んでおり、その１個はアミノ末端領域の近くにある
。
Ｈ５Ｖ−１配列とＨ５Ｖ−２配列間に起こり得る構造上
の相同性を一層充分に吟味するために、ヒトロバシー解
析を実施した（３１ａ）。第６図に、１（ＳＶ−１ｇｃ
タンパク質とＨ５Ｖ−２主−オープンリーディングタン
パク質のヒトロバシー解析を図示する。各タンパク質の
ヒトロバシーはＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ （３１ａ
）のプログラムを使用して測定した。中央線より上方は
疎水性領域、中央線より下方は親水性領域である。１２
個ずつのアミノ酸を解析し、その平均ヒトロバシー値を
計算した。
の相同性を一層充分に吟味するために、ヒトロバシー解
析を実施した（３１ａ）。第６図に、１（ＳＶ−１ｇｃ
タンパク質とＨ５Ｖ−２主−オープンリーディングタン
パク質のヒトロバシー解析を図示する。各タンパク質の
ヒトロバシーはＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ （３１ａ
）のプログラムを使用して測定した。中央線より上方は
疎水性領域、中央線より下方は親水性領域である。１２
個ずつのアミノ酸を解析し、その平均ヒトロバシー値を
計算した。
アスパラギン一連結糖付加推定部位（６２）を（０）印
で示した。ｇＣ−１： ＨＳ Ｖ−１ｇＧタンパク質ヒ
トロバシー。ｇＣ−２（ｇＦ ） ： ＨＳ Ｖ−２主
−オープンリーディングフレームヒドロパシー。
で示した。ｇＣ−１： ＨＳ Ｖ−１ｇＧタンパク質ヒ
トロバシー。ｇＣ−２（ｇＦ ） ： ＨＳ Ｖ−２主
−オープンリーディングフレームヒドロパシー。
両タンパク質が、アミノ酸配列の親水性と疎水性の性質
に基づいた極度の構造上の相同性を示すことを第１６図
に示す。各図において、Ｎ−末端疎水性領域の後には親
水性のアミノ酸鎖が続いており、それぞれ総計９個のう
ち６個（ｉ−ｉｓｖ−１）または総計７個のうち３個（
Ｈ５Ｖ−２）のＮ一連結糖付加推定部位を含んでいるこ
とを示している。この親水性領域に続くピークと谷は、
最後のＮ−結合糖付加部位を含む親水性領域を含めて両
タンパク質とも非常に相似している。両タンパク質のカ
ルボキシル末端領域は非常に疎水性の２０残基領域を示
し、その後゛にカルボキシル末端領域が続いている。Ｈ
８Ｖ−１ｇｃにだけ見出される２７個の近接するアミノ
酸は５０〜７６残基間に比較的親水性の領域を暗号化さ
れているようである（第１６図）。以上結論すると、こ
の解析によってＨ５Ｖ−１ｇｃとＨ８Ｖ−２タンパク質
の両者のヒトロバシー像は非常に相似しており、これら
タンパク質の最低に保守（コンサーブ）されたアミン末
端側域は高度に糖付加を受ける電位を有する親水性領域
に見出されることが明らかにされた。
に基づいた極度の構造上の相同性を示すことを第１６図
に示す。各図において、Ｎ−末端疎水性領域の後には親
水性のアミノ酸鎖が続いており、それぞれ総計９個のう
ち６個（ｉ−ｉｓｖ−１）または総計７個のうち３個（
Ｈ５Ｖ−２）のＮ一連結糖付加推定部位を含んでいるこ
とを示している。この親水性領域に続くピークと谷は、
最後のＮ−結合糖付加部位を含む親水性領域を含めて両
タンパク質とも非常に相似している。両タンパク質のカ
ルボキシル末端領域は非常に疎水性の２０残基領域を示
し、その後゛にカルボキシル末端領域が続いている。Ｈ
８Ｖ−１ｇｃにだけ見出される２７個の近接するアミノ
酸は５０〜７６残基間に比較的親水性の領域を暗号化さ
れているようである（第１６図）。以上結論すると、こ
の解析によってＨ５Ｖ−１ｇｃとＨ８Ｖ−２タンパク質
の両者のヒトロバシー像は非常に相似しており、これら
タンパク質の最低に保守（コンサーブ）されたアミン末
端側域は高度に糖付加を受ける電位を有する親水性領域
に見出されることが明らかにされた。
第２Ｈ３Ｖ−２オープンリーデイングフレームの解析
第２図に示したＨ５Ｖ−２配列の最終４３１塩基対（１
９７５〜２４０６残基）の翻訳によって１０５アミノ酸
から成る第２オープンリーデイングフレームが明らかに
成った。ここに報告する配列情報は、Ｈ３Ｖ−２第２オ
ープンリーデイングフレームの全部を十分に把握してい
るわけではないが、乙の配列をＦｒ１ｎｋら（１０）が
報告したＨ５Ｖ−１の７３０塩基ｍ ＲＮ Ａにより暗
号化されたオープンリーディングフレームと比較すると
、この場合もまた高度の相同性を示している。第４Ｂ図
で明らかなように、二つの配列は重なり合う領域では７
５％の配列相同性を示し、またそのアミノ酸変異の約９
０％は電荷に関して保守的（コンサーバティブ）である
。二つの配列の主な差異は、Ｈ３Ｖ−２に見られる１９
アミノ酸Ｎ−末端領域がＨ３Ｖ−１配列には見出されな
い点である。従ってこの領域に暗号化されている機能は
不明であるが、Ｈ５Ｖ−１とＨ５Ｖ−１から得られるタ
ンパ°り質はかなりの配列相同性を示している。
９７５〜２４０６残基）の翻訳によって１０５アミノ酸
から成る第２オープンリーデイングフレームが明らかに
成った。ここに報告する配列情報は、Ｈ３Ｖ−２第２オ
ープンリーデイングフレームの全部を十分に把握してい
るわけではないが、乙の配列をＦｒ１ｎｋら（１０）が
報告したＨ５Ｖ−１の７３０塩基ｍ ＲＮ Ａにより暗
号化されたオープンリーディングフレームと比較すると
、この場合もまた高度の相同性を示している。第４Ｂ図
で明らかなように、二つの配列は重なり合う領域では７
５％の配列相同性を示し、またそのアミノ酸変異の約９
０％は電荷に関して保守的（コンサーバティブ）である
。二つの配列の主な差異は、Ｈ３Ｖ−２に見られる１９
アミノ酸Ｎ−末端領域がＨ３Ｖ−１配列には見出されな
い点である。従ってこの領域に暗号化されている機能は
不明であるが、Ｈ５Ｖ−１とＨ５Ｖ−１から得られるタ
ンパ°り質はかなりの配列相同性を示している。
考察
上記の結果は、Ｉ（ＳＶ−２ゲノムが共直線的に配置し
ているＨ８Ｖ−１糖タンパク質Ｃの同族体を暗号化され
ていることを証明している。ここに見出された配列の共
直線性は、Ｈ５Ｖ−１の７３０塩基対ｍ ＲＮ Ａの同
族体（１０）を明らかに暗号化されているＨ５Ｖ−２の
主−オープンリーディングフレームの３１配列の発見に
よって強化される。Ｈ５Ｖ−２ｇＦ遺伝子の以前の地図
作成（３３）は、ここに記載した数ケ所の潜在性のＮ−
結合糖付加部位と、明らかなアミノ末端シグナル配列（
５）、および推定カルボキシル末端膜透過領域（２８）
を包含するＨ８Ｖ−２ゲノムの主−オープンリーディン
グフレームの性□質の双方によって、ここに記載したＨ
５Ｖ−２タンパク質は糖タンパク質ｇＦであると結論さ
れる。更に、翻訳されたＨ５Ｖ−２タンパク質の大きさ
く〜５２，０００ ダルトン）は、エンドグリコシダー
ゼＨで処理したＨ５Ｖ−２ｇＦの天然の大きさとして報
告されている値（５４，０００ダルトン）と近似してい
る。最後に、広範囲にわたるアミノ酸配列の相同性と、
数ケ所の潜在性Ｎ−結合糖付加部位および７個のシステ
ィン残基スベテノコンサーベーション（保存性）はＨ５
Ｖ−１ｇｃとＨ８Ｖ−２ｇＦ間の構造的相動性を示して
いる。
ているＨ８Ｖ−１糖タンパク質Ｃの同族体を暗号化され
ていることを証明している。ここに見出された配列の共
直線性は、Ｈ５Ｖ−１の７３０塩基対ｍ ＲＮ Ａの同
族体（１０）を明らかに暗号化されているＨ５Ｖ−２の
主−オープンリーディングフレームの３１配列の発見に
よって強化される。Ｈ５Ｖ−２ｇＦ遺伝子の以前の地図
作成（３３）は、ここに記載した数ケ所の潜在性のＮ−
結合糖付加部位と、明らかなアミノ末端シグナル配列（
５）、および推定カルボキシル末端膜透過領域（２８）
を包含するＨ８Ｖ−２ゲノムの主−オープンリーディン
グフレームの性□質の双方によって、ここに記載したＨ
５Ｖ−２タンパク質は糖タンパク質ｇＦであると結論さ
れる。更に、翻訳されたＨ５Ｖ−２タンパク質の大きさ
く〜５２，０００ ダルトン）は、エンドグリコシダー
ゼＨで処理したＨ５Ｖ−２ｇＦの天然の大きさとして報
告されている値（５４，０００ダルトン）と近似してい
る。最後に、広範囲にわたるアミノ酸配列の相同性と、
数ケ所の潜在性Ｎ−結合糖付加部位および７個のシステ
ィン残基スベテノコンサーベーション（保存性）はＨ５
Ｖ−１ｇｃとＨ８Ｖ−２ｇＦ間の構造的相動性を示して
いる。
これらの結果は、Ｈ８Ｖ−２ｇＦとＨ５Ｖ−１ｇｃは主
として型特異性であるが、それらは型共通性の決定基を
有していることを証明した以前の成績（１７，２２ｄ、
２２ｆ、４３ ）を説明することを助ける。２．３の以
前の研究（１７，１８，４３）で、これらのタンパク質
が型特異性抗体を優勢に誘導することを証明しているの
で、大部分のタンパク質抗原領域が推定疎水性シグナル
配列に続く、より分岐したＮ−末端配列の中に見□出漬
れるのは理屈にあっている。分岐領域の潜在性のＮ−結
合糖負荷部位の高い含量と共に、その親水性の性質（６
２）から、これらの領域がタンパク質表面に位置するこ
とが示唆される。これらの分岐配列がタンパク質の外側
へ暴露していることは、これらの分岐抗原決定基（エピ
トープ）に対する型特異性抗体の生成に対する役割りを
果しているのかも知れない。然し、ｇＣとｇＦの間で保
守（コンサーブ）されている親水性領域がタンパク質の
外側へ暴露することができ、１例において糖付加されて
いる（Ｈ８Ｖ−１ｇＧの３６３〜３６６残基およびＨ８
Ｖ−２ｇＦの３３０〜３３２残基）ことがあり得るので
、型共通性決定基もタンパク質の：）／４のより高度に
保守（コンサーブ）されているカルボキシル末端によっ
て生成される可能性がある。このように、Ｈ８Ｖ−１ｇ
ＣとＨ５Ｖ−２りは型特異性および型共通性決定基の双
方を共有しているか、型特異性決定基の方がより抗原性
であるようで６６・ 、。
として型特異性であるが、それらは型共通性の決定基を
有していることを証明した以前の成績（１７，２２ｄ、
２２ｆ、４３ ）を説明することを助ける。２．３の以
前の研究（１７，１８，４３）で、これらのタンパク質
が型特異性抗体を優勢に誘導することを証明しているの
で、大部分のタンパク質抗原領域が推定疎水性シグナル
配列に続く、より分岐したＮ−末端配列の中に見□出漬
れるのは理屈にあっている。分岐領域の潜在性のＮ−結
合糖負荷部位の高い含量と共に、その親水性の性質（６
２）から、これらの領域がタンパク質表面に位置するこ
とが示唆される。これらの分岐配列がタンパク質の外側
へ暴露していることは、これらの分岐抗原決定基（エピ
トープ）に対する型特異性抗体の生成に対する役割りを
果しているのかも知れない。然し、ｇＣとｇＦの間で保
守（コンサーブ）されている親水性領域がタンパク質の
外側へ暴露することができ、１例において糖付加されて
いる（Ｈ８Ｖ−１ｇＧの３６３〜３６６残基およびＨ８
Ｖ−２ｇＦの３３０〜３３２残基）ことがあり得るので
、型共通性決定基もタンパク質の：）／４のより高度に
保守（コンサーブ）されているカルボキシル末端によっ
て生成される可能性がある。このように、Ｈ８Ｖ−１ｇ
ＣとＨ５Ｖ−２りは型特異性および型共通性決定基の双
方を共有しているか、型特異性決定基の方がより抗原性
であるようで６６・ 、。
ｇＣとｇＦ、の型特異性お、よび型共通決定基の説明は
知られていないが、タンパク、質には少なくとも二つの
機能、即ち、その一つは両つィルスの生存率に重要であ
る型共通性領域、ま元来の一つは各ウィルスの型に特異
的である型特異性領域である。ｇＣおよびｇＦの機能は
現在のところ不明でアリ、生存し得るｇＣマイナスのｆ
（ＳＶ−１突然変異株がインビトロで分離されてい、る
が（６５）、ヒト宿主のインビボ感染期間ａよび潜伏確
立期間において、ｇＣまたはｇＦのいずれが必要不可欠
であるめかは明らかでない。Ｈ５Ｖ＝１および）ＩＳＶ
−２の間で、感染部位の偏好性と毒性の強さを含む生物
学的な差異の少なくとも幾つかは・ｇＣとｇＦのアミノ
末端領域間の著しい構造的差暴に由来するであろうこと
は考えられる。例えこれらタンノ櫂り質の機能的な知識
が全°くなく′Ｃ’Ｃ，異なった選択圧がｇＣおよびｇ
Ｆの分岐領域と保守□（コンサーブ）領域に作用するに
違いないと結論１しても良かろう。
知られていないが、タンパク、質には少なくとも二つの
機能、即ち、その一つは両つィルスの生存率に重要であ
る型共通性領域、ま元来の一つは各ウィルスの型に特異
的である型特異性領域である。ｇＣおよびｇＦの機能は
現在のところ不明でアリ、生存し得るｇＣマイナスのｆ
（ＳＶ−１突然変異株がインビトロで分離されてい、る
が（６５）、ヒト宿主のインビボ感染期間ａよび潜伏確
立期間において、ｇＣまたはｇＦのいずれが必要不可欠
であるめかは明らかでない。Ｈ５Ｖ＝１および）ＩＳＶ
−２の間で、感染部位の偏好性と毒性の強さを含む生物
学的な差異の少なくとも幾つかは・ｇＣとｇＦのアミノ
末端領域間の著しい構造的差暴に由来するであろうこと
は考えられる。例えこれらタンノ櫂り質の機能的な知識
が全°くなく′Ｃ’Ｃ，異なった選択圧がｇＣおよびｇ
Ｆの分岐領域と保守□（コンサーブ）領域に作用するに
違いないと結論１しても良かろう。
Ｈ５Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２のｇＤ遺伝子の配置列に関
する以、前の比較（５Ｂ）で、アミノ末端シグナル配列
（６３）とカルボキシル末端膜透過領域（６４）は、置
換アミノ酸が疎水性である限り多数の突然変異に耐容、
シ、、得るこ、とを証明した。ｇＣおよびｇＦの配列比
較により、ｇＣの４７９〜４９６残基とｇＦの４４３〜
４．６３４基からカルボキシル末端、推定膜透過領域（
６４）で同様の知鯵が示された。この領域における多く
の非対応性疎水性置換体は、ｇＩ）の、場合のように、
脂溶性である。アミノ酸ならばこの領域に耐容できるこ
とが示唆される。
する以、前の比較（５Ｂ）で、アミノ末端シグナル配列
（６３）とカルボキシル末端膜透過領域（６４）は、置
換アミノ酸が疎水性である限り多数の突然変異に耐容、
シ、、得るこ、とを証明した。ｇＣおよびｇＦの配列比
較により、ｇＣの４７９〜４９６残基とｇＦの４４３〜
４．６３４基からカルボキシル末端、推定膜透過領域（
６４）で同様の知鯵が示された。この領域における多く
の非対応性疎水性置換体は、ｇＩ）の、場合のように、
脂溶性である。アミノ酸ならばこの領域に耐容できるこ
とが示唆される。
然しなから、ｇＤとは対照的にｇＣとｇＦのアミノ末端
シグナル配列は最初の１９残基で高度に相同である。こ
の占つにこの領域は、糖タン／ ＮＩＬり質を粗面小胞
体へ指向させる以外に重要な保守（コンサーブ）された
機能を持？か（５）、或いは保守されねばならないゲノ
ムのこの領域に、重複する遺伝子または他の機能的な配
列がある（６６）かである。
シグナル配列は最初の１９残基で高度に相同である。こ
の占つにこの領域は、糖タン／ ＮＩＬり質を粗面小胞
体へ指向させる以外に重要な保守（コンサーブ）された
機能を持？か（５）、或いは保守されねばならないゲノ
ムのこの領域に、重複する遺伝子または他の機能的な配
列がある（６６）かである。
完全な比較をするにはＨＳ Ｖ−２配列が不充分である
が、８８・Ｖ−１ｇＣｍＲＮＡ転写開始への５′領域は
、Ｈ３Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２ゲノムの双方とも同じＣ
ＧＧＧＴＡＴＡＡ配列を示す。更に、両配列とも、それ
に続いて転写開始の直前のＧに富んだ領域がある。この
ように、Ｈ５Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２のｇＤ遺伝子で以
前に発見されたように、二つのウィルス型間の−Ｌ流配
列に相同性が存在しており、このことはこれらの領域が
これら遺伝子の転写調節に関与している可能性を示唆し
ている。両ウィルスゲノムに見出され、多分７３０塩基
ｍＲＮＡの転写をコントロールしていると思われる（５
９゜６０）”’ｒＡＴＡ”ボックス相同性も、Ｈ５Ｖ−
１とＨ８Ｖ−２における比較的高度な配列相同性を示し
ているのは興味深い。第１３図に示したように、この’
ＴＡＴＡ”ボックスの前にあるＣＧに富んだ配列が来る
が、これは第一の’ＴＡＴＡ’領域の前にある配列と相
似しているが、全く同一ではなく、それらの後にいずれ
も〜８０％の配列相同性を示す１４塩基対の領域が続く
。全般的な配列相同性は〜７５％であるのに対し、この
領域を囲む全領域の相同性は僅かに３３塩基対である。
が、８８・Ｖ−１ｇＣｍＲＮＡ転写開始への５′領域は
、Ｈ３Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２ゲノムの双方とも同じＣ
ＧＧＧＴＡＴＡＡ配列を示す。更に、両配列とも、それ
に続いて転写開始の直前のＧに富んだ領域がある。この
ように、Ｈ５Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２のｇＤ遺伝子で以
前に発見されたように、二つのウィルス型間の−Ｌ流配
列に相同性が存在しており、このことはこれらの領域が
これら遺伝子の転写調節に関与している可能性を示唆し
ている。両ウィルスゲノムに見出され、多分７３０塩基
ｍＲＮＡの転写をコントロールしていると思われる（５
９゜６０）”’ｒＡＴＡ”ボックス相同性も、Ｈ５Ｖ−
１とＨ８Ｖ−２における比較的高度な配列相同性を示し
ているのは興味深い。第１３図に示したように、この’
ＴＡＴＡ”ボックスの前にあるＣＧに富んだ配列が来る
が、これは第一の’ＴＡＴＡ’領域の前にある配列と相
似しているが、全く同一ではなく、それらの後にいずれ
も〜８０％の配列相同性を示す１４塩基対の領域が続く
。全般的な配列相同性は〜７５％であるのに対し、この
領域を囲む全領域の相同性は僅かに３３塩基対である。
もしこの領域が７３０塩基ｍ ＲＮ Ａの転写調節に関
与するならば、転写調節因子による認識には比較的短か
い配列で充分であるようである。
与するならば、転写調節因子による認識には比較的短か
い配列で充分であるようである。
結果かうＨＳ Ｖ−１ｇＣとＨ８Ｖ−２ｇＦ糖タンパク
質は高度に相同的であり、それらが型共通性および型特
異性領域を暗号化されていることを証明した。二つのタ
ンパク質が有意な配列相同性を示し、また明らかに共直
線的に配置されているので、本発明人らはＨ５Ｖ−２ｇ
ＦをＨ５Ｖ−２ｇＧまたはｇＣ−２と命名し直すという
Ｚｅｚｎｌａｋ および５ｐｅａｒ （２２ｄ ）の提
案を支持する。また、ここに報告した配列決定データは
、インビトロでｇＣ−１とｇＣ−２タンパク質間の種々
の型特異性領域を交換スることによる二つのタンパク質
の機能的解析と、キメラ様配列をヒト細胞に発現するこ
と（６７）またはこれらの領域をウィルスへ再編入する
（６８）道を開いた。
質は高度に相同的であり、それらが型共通性および型特
異性領域を暗号化されていることを証明した。二つのタ
ンパク質が有意な配列相同性を示し、また明らかに共直
線的に配置されているので、本発明人らはＨ５Ｖ−２ｇ
ＦをＨ５Ｖ−２ｇＧまたはｇＣ−２と命名し直すという
Ｚｅｚｎｌａｋ および５ｐｅａｒ （２２ｄ ）の提
案を支持する。また、ここに報告した配列決定データは
、インビトロでｇＣ−１とｇＣ−２タンパク質間の種々
の型特異性領域を交換スることによる二つのタンパク質
の機能的解析と、キメラ様配列をヒト細胞に発現するこ
と（６７）またはこれらの領域をウィルスへ再編入する
（６８）道を開いた。
クローンしたｇＣ−２糖タンパク質は実施例１に開示し
たのと同様の方法で発現し、ワクチンに形成されると確
信する。
たのと同様の方法で発現し、ワクチンに形成されると確
信する。
更に、そのような組み換えｇＣおよびｇＤ糖タンパク質
の混合物から成るワクチンは、いずれの糖タンパク質単
独から成るワクチンより、Ｈ８Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２
に対して有意に一層効果的であることを確信する。
の混合物から成るワクチンは、いずれの糖タンパク質単
独から成るワクチンより、Ｈ８Ｖ−１およびＨ５Ｖ−２
に対して有意に一層効果的であることを確信する。
以下に参考図書、および本明細書中に、その都度文字お
よび数字でそれぞれ付加的に引用した参考文献を挙げる
。
よび数字でそれぞれ付加的に引用した参考文献を挙げる
。
１、Ｅｍｔａｇｅ、 ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ２
８３，１７１（１９８０）；Ｄａｖｉｓ、 ｅｔ ａｌ
、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
（ＵＳＡ）７８．５３７６（１９８１） ； Ｗｅｉｌ
ａｎｄ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９２゜８
５１（１９８１） 。
８３，１７１（１９８０）；Ｄａｖｉｓ、 ｅｔ ａｌ
、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
（ＵＳＡ）７８．５３７６（１９８１） ； Ｗｅｉｌ
ａｎｄ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９２゜８
５１（１９８１） 。
２、Ｋｕｐｐｅｒ、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ２８９，
５５５（１９８１）；Ｋｌｅｉｄ、 ｅＬ ａｌ、、
５ｃｉｅｎｃｅ ２１４．１１２５（１９８１） 。
５５５（１９８１）；Ｋｌｅｉｄ、 ｅＬ ａｌ、、
５ｃｉｅｎｃｅ ２１４．１１２５（１９８１） 。
３、Ｃｈａｒｎａｙ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ 。
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７ 。
３３５（１９７９） ；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９８ 。
ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９８ 。
３４７（１９８２） 。
４、Ｒｏｓｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）ヨ、６６７０（１
９８１） 。
、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）ヨ、６６７０（１
９８１） 。
５、ＹｅＩｖｅｒｔｏｎ、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ
２１９，６１４（１９８３）。
２１９，６１４（１９８３）。
５、Ｗａｔｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ
２１８，３８１（１９８２） 。
２１８，３８１（１９８２） 。
７、ＧＣｔｈｉｎｇ、ｅｔａｌ、、ＮａＬｕｒｅ２９３
，６２０（１９８１）ｉａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃ、 ａｎ
ｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ３．４４（１９１３３）
。
，６２０（１９８１）ｉａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃ、 ａｎ
ｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ３．４４（１９１３３）
。
８、Ｒｏｓｅ、ｅｔａ１１Ｃｅ１１３０，７５３（１９
８２）。
８２）。
Ｃｅｌ ｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ
Ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ 、 Ｖｏｌ 、 ２． 。
Ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ 、 Ｖｏｌ 、 ２． 。
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ Ｙ
ｏ−！−１ＩＱ、Ｂａ１ａｃｈａｎｄｒａｎ、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ４４，３４４（１９８
２）。
ｏ−！−１ＩＱ、Ｂａ１ａｃｈａｎｄｒａｎ、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ４４，３４４（１９８
２）。
１１、 Ｎｏｒｒｉｌｄ、 Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ、 Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ 、 ９Ｑ 。
ｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ 、 ９Ｑ 。
６７（１９８０）。
１２、Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｃｅ１ｌ １６，４８１（１９
７９）。
７９）。
１３、 Ｂａｕｃｋｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉ
ｒｏｌ、 ３２，７７９（１９７９） −１４、Ｃｏｈ
ｅｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ２７．
１７２゜１５、 Ｅｂｅｒｌｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ
、 Ｖｉｒｏｌ、 ３６，６６５（１９８０） 。
ｒｏｌ、 ３２，７７９（１９７９） −１４、Ｃｏｈ
ｅｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ２７．
１７２゜１５、 Ｅｂｅｒｌｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ
、 Ｖｉｒｏｌ、 ３６，６６５（１９８０） 。
１６、 Ｎｏｒｒｉｌｄ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖ
ｉｒｏｌ、 ２６，７１２（１９７８）。
ｉｒｏｌ、 ２６，７１２（１９７８）。
１７、Ｐｏｗｅｌｌ、ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ２
４９，３６０（１９７４） 。
４９，３６０（１９７４） 。
１８、Ｅｂｅｒｌｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｉｎｆｅｃｔ
、 Ｉｍｍｕｎ、 ３１ 、 １０６２（１９８１）。
、 Ｉｍｍｕｎ、 ３１ 、 １０６２（１９８１）。
１９、Ｐｅｒｅｉｒａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｉｎｆｅｃ
ｔ、 Ｉｍｍｕｎ、２ｇ、７２４゜２０、Ｓｉｍ、 Ｃ
，、ｅＬ ａｌ、、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、
１９，２１７（１９７３）。
ｔ、 Ｉｍｍｕｎ、２ｇ、７２４゜２０、Ｓｉｍ、 Ｃ
，、ｅＬ ａｌ、、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、
１９，２１７（１９７３）。
２１、Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ、 ｅｔ ａｌ、、 １ｎｆ
ｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、 ３４．５８４（１９８１）。
ｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、 ３４．５８４（１９８１）。
２２ａ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、 ｅＬ ａｌ、、 Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ、 ４１，１０９９゜２２ｂ、Ｂａ１ａｃ
ｈａｎｄｒａｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、
３９，４３８（１９８１）。
Ｖｉｒｏｌ、 ４１，１０９９゜２２ｂ、Ｂａ１ａｃ
ｈａｎｄｒａｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、
３９，４３８（１９８１）。
２２ｃ、Ｐａｒａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏ
ｌ、 ４１，１３７（１９８２）。
ｌ、 ４１，１３７（１９８２）。
２２ｄ、Ｚｅｚｕｌａｋ、 ｅＬ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖ
ｉｒｏｌ、 ４７．５５３（１９８３）。
ｉｒｏｌ、 ４７．５５３（１９８３）。
２２ｆ、Ｚｗｅｉｇ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 ４Ｌ１８５（１９８３）。
ｏｌ、 ４Ｌ１８５（１９８３）。
２３、 Ａｎｄｅｒｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖ
ｉｒｏｌ、 ３０．８０５（１９７９） 。
ｉｒｏｌ、 ３０．８０５（１９７９） 。
２４、’ Ｌｅｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏ
ｌ、 ４３．４１（１９８’２） 。
ｌ、 ４３．４１（１９８’２） 。
２５、 Ｍｕｒｒａｙ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏｌ、
Ｇｅｎｅｔ、 １５０，５３（１９７７） 。
Ｇｅｎｅｔ、 １５０，５３（１９７７） 。
′２６． Ｂｅｎｔｏｎ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ １９６，１８０（１９７７） 。
ｎｃｅ １９６，１８０（１９７７） 。
２７、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏ
ｌ、 ９８．５０３（１９７５） 。
ｌ、 ９８．５０３（１９７５） 。
２８、Ｖｉｅｉｒａ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ １
９．２５９（１９８２） 。
９．２５９（１９８２） 。
２９、Ｍｅｓｓｉｎｇ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃ、
Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、 ９，３Ｑ９（１９８１） 、
− ３Ｑ、Ｓａｎｇｅｒ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７４．５４３
６（１９７７）。
Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、 ９，３Ｑ９（１９８１） 、
− ３Ｑ、Ｓａｎｇｅｒ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７４．５４３
６（１９７７）。
１ａｎｄ、 ｐ、 ３１１ 。
３１ａ、Ｈｏｐｐ、 ｅＬ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）７８．３８
２４（１９８１）。
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）７８．３８
２４（１９８１）。
３２、 Ｗａｔｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ｎｕｃｌ
＋ Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、 １１ 、１５Ｑ７（ｉ９
ｓａ）。
＋ Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｓ、 １１ 、１５Ｑ７（ｉ９
ｓａ）。
３３、 Ｂｌｏｂｅｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ） ７７゜１７４６（１
９８０）。
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ） ７７゜１７４６（１
９８０）。
３４、 Ｒｏｓｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）７７．３８
８４（１９８０）。
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）７７．３８
８４（１９８０）。
３５、Ｒｕｙｅｃｈａｎ、 ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、Ｖｉ
ｒｏｌ 、 ２９，６７７（１９７９） ；Ｒｏｉｉｍ
ａｎ、 Ｃｅ１ｌ ２６ 、４８１（１９７９） −３
５、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、、 Ｓｃｉ。
ｒｏｌ 、 ２９，６７７（１９７９） ；Ｒｏｉｉｍ
ａｎ、 Ｃｅ１ｌ ２６ 、４８１（１９７９） −３
５、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、、 Ｓｃｉ。
（ＵＳＡ） ８０．２４９５（１９８３）。
３７、 Ｌｕ５ｋｙ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ
２９３，７９（１９８１） 。
２９３，７９（１９８１） 。
３８、 Ｎｕｎｂｅｒｇ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ
１９．３５５（１９８０） 。
１９．３５５（１９８０） 。
３９、 Ｕｒｌａｕｂ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７７．４
２１６（１９８０）。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７７．４
２１６（１９８０）。
４０、 Ｇｒａｈａｍ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｖｉｒｏｌ
、 ５２，４５６ （１９７３） 。
、 ５２，４５６ （１９７３） 。
４Ｑａ、Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、１１５．
１６１７（１９７５）。
１６１７（１９７５）。
４２、 Ｃｏｈｅｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 ３６，４２９（１９８０） 。
ｏｌ、 ３６，４２９（１９８０） 。
４３、Ｐｅｒｅｉｒａ、 、ｅｔ、 ａｌ、、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ＋Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
、Ｎａｔｌ＋Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
（ＵＳＡ）７８．５２０２（１９８１）。
４４、Ｃｏｈｅｎ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ
、 ２７，１７２（１９７８） 。
、 ２７，１７２（１９７８） 。
４５、 Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６
８０（１９７０） 。
８０（１９７０） 。
４６゜Ｈｏｎｅｓｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 １ｍ１３０８（１９７５） 。
ｏｌ、 １ｍ１３０８（１９７５） 。
４７゜５ｐｅａｒ、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、１７．９９１
（１９７６） 。
（１９７６） 。
４ｇ、 Ｃａｍｐａｄｅｌｌｉ−Ｆｉｕｍｅ、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、４３゜１０６１（１９８
２） ；Ｊｏｈｎｓｏｎ、′ｅｔ ａｌ 、、 Ｃｅ１
ｌ ３２，９８７（１９８３） ；Ｃｏｈｅｎ、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ４６，６７９（１９８
３）。
ａｌ、、 Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、４３゜１０６１（１９８
２） ；Ｊｏｈｎｓｏｎ、′ｅｔ ａｌ 、、 Ｃｅ１
ｌ ３２，９８７（１９８３） ；Ｃｏｈｅｎ、 ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ４６，６７９（１９８
３）。
４９、 Ｂｌｏｃｈ、 Ｊ、 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、
８２，６２９（１９７９） −Ａｔｌａｎｔａ、 Ｇｅ
ｏｒｇｉａから提供された。
８２，６２９（１９７９） −Ａｔｌａｎｔａ、 Ｇｅ
ｏｒｇｉａから提供された。
’ ５１． Ｒｅｃｔｏｒ、 ｅｔ ’ａ１．． Ｉｎ
ｆｅｃｔ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ、 ３８，１６８（ｉ
９８２）。
ｆｅｃｔ、 ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ、 ３８，１６８（ｉ
９８２）。
５２、Ｋｅｎｎｅｔｔ、 ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｋ、 Ｋｅｒｒｅｔｔ。
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｋ、 Ｋｅｒｒｅｔｔ。
Ｔ、 Ｍｃｋｅａｒｎ、 ａＭ Ｂ、Ｂｅｃｈｔｅｌ
、 ｅｄｓ、 （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ 。
、 ｅｄｓ、 （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ 。
Ｎ、Ｙ、、１９８０）、ＰＰ、３７６−３７７゜５４、
Ｌｅｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９４ｓ２
２８（１９８１） ；ＫａｕＥｍａｎ。
Ｌｅｅ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ ２９４ｓ２
２８（１９８１） ；ＫａｕＥｍａｎ。
ｅｔ ａｌ、、Ｍｏ１． ａｎｄ Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏ
ｌ、 ２．１３０４（１９８３） ｉＫ＠ｕｆｍａｎ、
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、１５Ｌ
６０１（１９８２） 。
ｌ、 ２．１３０４（１９８３） ｉＫ＠ｕｆｍａｎ、
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、１５Ｌ
６０１（１９８２） 。
５５、 Ｋｌｅｉｄ、 ｅｔ ａｔ、、 ５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２１４．１１２５（１９８１） 。
ｅ ２１４．１１２５（１９８１） 。
５６．Ｍａｘａ＋ｎ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ 、 ６５ 、４ｇｇ（１９８０
）。
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ 、 ６５ 、４ｇｇ（１９８０
）。
Ｍａｒｙｌａｎｄ、 ｐ、 ３１１（１９７６） −５
８゜Ｉ、ａｓｋｙ、 ｅＬ ａｌ、、 ＤＮＡ、印刷中
（１９８４） 。
８゜Ｉ、ａｓｋｙ、 ｅＬ ａｌ、、 ＤＮＡ、印刷中
（１９８４） 。
５９、Ｆｒ１ｎｋ、Ｃｔ ａｌ、、Ｊ 、 Ｖｉｒｏｌ
、４５，６３４（１９８３） 。
、４５，６３４（１９８３） 。
６０、 Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２１７，３１６（１９８２） 。
ｅｎｃｅ ２１７，３１６（１９８２） 。
５１、 Ｗｂｉｔｔｏｎ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ｎｕｃ
ｌ 、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １８．６２７１（１９
８３）。
ｌ 、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １８．６２７１（１９
８３）。
６２、Ｅ（ｕｂｂａｒｄ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ａｎｎ
、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５Ｑ 、５５５（１，
９８１）。
、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５Ｑ 、５５５（１，
９８１）。
５３、Ｂｌｏｂｅｌ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ ７７ 。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ ７７ 。
１４９１（１９８０）。
６４、５ａｂａｔｉｎｉ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｃ
ｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、 ９２．１（１９８２）。
ｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、 ９２．１（１９８２）。
６５、Ｃａ５ｓａｉ、 ｅｔ ａｔ、、 Ｉｎｔｅｒｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ６，２１２（１９７５）。
ｉｒｏｌｏｇｙ ６，２１２（１９７５）。
６６、 Ｈａｌｌ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ
、 ４３，５９４（１９８２）−
、 ４３，５９４（１９８２）−
第１図はＨ８Ｖ−１およびＩ（ＳＶ−２ｇＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図、第２図はＨ５Ｖ−１および
Ｈ５Ｖ−２タンパク質からのｇＤタンパク質のヒトロバ
シー解析を示すグラフ、第３図は膜結合型のＨ５Ｖ−１
糖タンパク質りの発現のために組立てられたｐｇＤ−ｄ
１１ｆｒプラスミドの模式図、第４図はＨＳ Ｖに対す
るヒト抗体でｇＤ１２細胞を標識した結果を示す位相差
顕微鏡図（Ａ）および螢光顕微鏡？）＄５図はｇＤ１２
細胞系からの△ クローンされたｇＤおよびＨ５Ｖ−１に感染させたヒト
の細胞から得られた天然のｇＤの放射免疫沈降を示すグ
ラフ、第６図はｇＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞系に
対するヒト抗Ｈ５Ｖ抗体の結谷度を示すグラフ、第７図
はＨ５Ｖ−１ｇＤタンパク質の模式図、第８図は分泌型
のＨ５Ｖ−１ｇｌ）タンパク質のための発現プラスミド
ｐｇＤｔ ｒｕｎｃｄｈｆｒの組立てを示す模式図、第
９図はｇＤｌｏ、２細胞系からの放射免疫沈降を示すグ
ラフ、第１０図は増幅前後のｇＤｌｏ、２細胞系からの
放射免疫沈降を示すグラフ、第１１図はＭｔｘで増幅し
たｇＤｌｏ、２細胞系で達成された増幅度を示すグラフ
、第１２図はＤＮＡ配列解析を行なったｐｇＣ２Ｓａ１
２．９の断片を示す模式図、第１３図はＰｇＣ２Ｓａ
１２．９カラ誘導すしたＤＮＡ配列とＨ５Ｖ−ｉｇｃ領
域のＤＮＡ配列の比較を示す模式図、第１４図はＨ５Ｖ
−２ゲノムＤＮＡとｐｇｃ２ｓａｌ ２．９ Ｄ Ｎ
Ａ （７） サザーンブロツテイング解析を示すグラフ
、第１５図はＨ５Ｖ−２のラージオープンリーディング
フレームの翻訳とＨ５Ｖ−１ｇｃのアミノ酸配列の比較
を示す模式図、第１６図はＨ５Ｖ−１ｇＣタフハク質ト
Ｈ５Ｖ−２のメジャー・オープンリーディングフレーム
タンパク質のヒトロバシー解析結果を示すグラフである
。 特許出願人 ジェネンテク、インコーポレイテッド代理
人 弁理士青白 葆番勤）１名 −画の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、５ Ａ Ｂ −面の浄書（内容に変更なし） ｇＤ１２ １ ２ １ ２ −＋−＋−十＋−＋ − ｇ面の浄書ぐ内容に変更なし） １２３４ ■関の浄（■内８＆：＊−なＬ″〉 □ ＝ １ ．２ ３ ４．、．５ ６．、、。 −５６４−・ｐ・ 手続補正盲動式） 昭和６０年 ２月２６日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第 １８３６２３ 万３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国カリ７オルニア９４０８０、サウ
ス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブルーノ・
ブールバード４６０番 名称 ジェネンテク、インコーポレイテッド４代理人 ６、補正の対象：明細書の「図面の簡単な説明」の欄お
よび図面 、イてて一７−ミ、 ７、補正の内容 イ）図面の簡単な説明の欄の？ｉｌｉ ｉＥｌ、）１１
６頁１０行、［顕微鏡図（Δ）］を「顕微鏡写真の模写
図（Ａ月と訂正。 ２）１１６頁１１行、「顕微鏡図（Ｂ）」を［顕微鏡写
真の模写図（ｉＤＪと訂正１゜ ３）１１６頁１４行、［示ナク゛ラフ−１を［撮影しｌ
こ写真の模写図」と訂正。 ４）１００頁末行、「示ずクラツ」を１撮影した写真の
模２ｊ図」と訂正。 ５）１１７頁ｌ〜２行、「示ずグラ；７」をｉ撮影した
写真の模写図」と訂正。 ６）１１７頁９行、［解Ｖ↑を示ずクラツ］を１解叶の
結果を撮影した写真の模写図−１と訂正。 口）ａ墨を用いて適正な用紙に鮮明に描いｌこ第、１．
５．９、ｌ０１１４図を提出する。 以−１−
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図、第２図はＨ５Ｖ−１および
Ｈ５Ｖ−２タンパク質からのｇＤタンパク質のヒトロバ
シー解析を示すグラフ、第３図は膜結合型のＨ５Ｖ−１
糖タンパク質りの発現のために組立てられたｐｇＤ−ｄ
１１ｆｒプラスミドの模式図、第４図はＨＳ Ｖに対す
るヒト抗体でｇＤ１２細胞を標識した結果を示す位相差
顕微鏡図（Ａ）および螢光顕微鏡？）＄５図はｇＤ１２
細胞系からの△ クローンされたｇＤおよびＨ５Ｖ−１に感染させたヒト
の細胞から得られた天然のｇＤの放射免疫沈降を示すグ
ラフ、第６図はｇＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞系に
対するヒト抗Ｈ５Ｖ抗体の結谷度を示すグラフ、第７図
はＨ５Ｖ−１ｇＤタンパク質の模式図、第８図は分泌型
のＨ５Ｖ−１ｇｌ）タンパク質のための発現プラスミド
ｐｇＤｔ ｒｕｎｃｄｈｆｒの組立てを示す模式図、第
９図はｇＤｌｏ、２細胞系からの放射免疫沈降を示すグ
ラフ、第１０図は増幅前後のｇＤｌｏ、２細胞系からの
放射免疫沈降を示すグラフ、第１１図はＭｔｘで増幅し
たｇＤｌｏ、２細胞系で達成された増幅度を示すグラフ
、第１２図はＤＮＡ配列解析を行なったｐｇＣ２Ｓａ１
２．９の断片を示す模式図、第１３図はＰｇＣ２Ｓａ
１２．９カラ誘導すしたＤＮＡ配列とＨ５Ｖ−ｉｇｃ領
域のＤＮＡ配列の比較を示す模式図、第１４図はＨ５Ｖ
−２ゲノムＤＮＡとｐｇｃ２ｓａｌ ２．９ Ｄ Ｎ
Ａ （７） サザーンブロツテイング解析を示すグラフ
、第１５図はＨ５Ｖ−２のラージオープンリーディング
フレームの翻訳とＨ５Ｖ−１ｇｃのアミノ酸配列の比較
を示す模式図、第１６図はＨ５Ｖ−１ｇＣタフハク質ト
Ｈ５Ｖ−２のメジャー・オープンリーディングフレーム
タンパク質のヒトロバシー解析結果を示すグラフである
。 特許出願人 ジェネンテク、インコーポレイテッド代理
人 弁理士青白 葆番勤）１名 −画の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ、５ Ａ Ｂ −面の浄書（内容に変更なし） ｇＤ１２ １ ２ １ ２ −＋−＋−十＋−＋ − ｇ面の浄書ぐ内容に変更なし） １２３４ ■関の浄（■内８＆：＊−なＬ″〉 □ ＝ １ ．２ ３ ４．、．５ ６．、、。 −５６４−・ｐ・ 手続補正盲動式） 昭和６０年 ２月２６日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第 １８３６２３ 万３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国カリ７オルニア９４０８０、サウ
ス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブルーノ・
ブールバード４６０番 名称 ジェネンテク、インコーポレイテッド４代理人 ６、補正の対象：明細書の「図面の簡単な説明」の欄お
よび図面 、イてて一７−ミ、 ７、補正の内容 イ）図面の簡単な説明の欄の？ｉｌｉ ｉＥｌ、）１１
６頁１０行、［顕微鏡図（Δ）］を「顕微鏡写真の模写
図（Ａ月と訂正。 ２）１１６頁１１行、「顕微鏡図（Ｂ）」を［顕微鏡写
真の模写図（ｉＤＪと訂正１゜ ３）１１６頁１４行、［示ナク゛ラフ−１を［撮影しｌ
こ写真の模写図」と訂正。 ４）１００頁末行、「示ずクラツ」を１撮影した写真の
模２ｊ図」と訂正。 ５）１１７頁ｌ〜２行、「示ずグラ；７」をｉ撮影した
写真の模写図」と訂正。 ６）１１７頁９行、［解Ｖ↑を示ずクラツ］を１解叶の
結果を撮影した写真の模写図−１と訂正。 口）ａ墨を用いて適正な用紙に鮮明に描いｌこ第、１．
５．９、ｌ０１１４図を提出する。 以−１−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １］ 病原体に対する中和抗体を産生じ得る露出した抗
原決定基を持った膜結合性ポリペプチドであって、それ
を生産し得る安定な連続した組み換え体細胞系の膜と機
能的に連合しているポリープチーを門有しているワクチ
ン。 ２、病原体に対する中和抗体を産生じ得る露出した抗原
決定基を持った膜結合性ポリペプチドの一木含誘ｉ体で
あって、それを生産し得る安定な蓮続した組み換え体細
胞系の膜と機能的に連合す−形で形成され、次いで該膜
から遊離することに上り生成した該膜不含誘導体を含有
するワクチン。 ３、組み換え体宿主細胞が安定な真核細胞系であ纂第ｉ
項また番１第２項に記載のワクチン。 ４、宿主細胞が哺乳動物細胞系である第１項または第２
項に記載のワクチン。 の生産性を欠失しており ｄｈｆｒ選択マーカーおよび
該ポリペプチドを暗号化している遺伝子を含んでいる発
現ベクターを含有しているものである第３瑣または第４
′項に記載のワクチン６６、ポリペプチドが単純ヘルペ
スウィルス・１型または２型の少な（とも１個の糖タン
パク質を含んでおり、該病原体が単純ヘルペスウィルス
１型および／または２型である第１項〜第５項のいずれ
かに記載のワクチン。 ７、該糖タンパク質がｇＤから成る第６項に記載のワク
チン。 ８、該糖タンパク質がｇＣから成る第６項に記載のワク
チン。 ９、−該ポリペプチドが糖タンパク質Ｃお工び糖タンパ
ク費□Ｄの混合物から成る第６項に記載のワクチン。 ｌ〇−膜結合ポリペプチドの先端を切断された膜不含誘
導体を含有するワクチンであ□って、該誘導体ポがペプ
チドが膜結合領域を含まず、膜を含ま出した抗原決定基
を持っていることを特徴とするワクチン。 １１、先端を切断されたポリペプチドが単純ヘルペスウ
ィルス１型または２型の糖タンパク質りの誘導体であり
、病原体が単純ヘルペスウィルス１型および／または２
型である第１０項に記載のワクチン。 １２、先端を切断されたポリペプチドが単純ヘルペスウ
ィルス１型または２型の糖タンパク質Ｃの誘導体であり
、病原体が単純ヘルペスウィルス１型および／または２
型である第１０項に記載のワクチン。 １３、先端を切断された誘導体が、アミノ酸残基約３０
０までのｇＤポリペプチドのＮ−末端領域から成る第１
１項に記載のワクチン。 １４、該膜結合ポリペプチドを暗号化しているＤＮＡを
製造し、膜結合領域を暗号化している部分を欠失させ、
そのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベク
タでトランスフェクトし、分泌生成物として先端切断ポ
リペプチドを採取することを特徴とする第１０項〜第１
３項のいずれかに記載のワクチンを製造する方法。 １５、トランスフェクトされる宿主細胞が安定した真核
細胞系である第１４項に記載の方法。 １６、トランスフェクトされる宿主細胞が哺乳動物細胞
系である第１５項に記載の方法。 １７、細胞系がｄｈｆｒ生産性を欠失し、ベクターがｄ
ｈｆｒ選択マーカーを含んでいる第１５項または第１６
項に記載の方法。 １８、先端切断ポリペプチドが単純ヘルペスウィルス１
型または２型の糖タンパク質である第１４項〜第１６項
のいずれかに記載の方法。 １９、先端切断ポリペプチドが糖タンパク質りの最初の
３００アミノ酸残基に制限されている第１８項に記載の
方法。
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| JPS5739784A (en) * | 1980-04-22 | 1982-03-05 | Pasteur Institut | Conversion of cell culture |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08253428A (ja) * | 1983-08-30 | 1996-10-01 | Genentech Inc | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
Also Published As
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