DK172694B1 - Vacciner indeholdende glycoprotein C eller D fra herpes simplex virus - Google Patents

Description

DK 172694 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte vacciner, som er ejendommelige ved det i krav 1 henholdsvis 2 angivne.

Analysen af immunreaktionen på en række forskellige infektiøse midler har været 5 begrænset af, at det ofte har vist sig vanskeligt at dyrke patogener i tilstrækkelige mængder til at muliggøre isoleringen af vigtige celleoverfladeantigener. Fremkomsten af molekylær kloning har overvundet nogle af disse begrænsninger ved at tilvejebringe et middel, hvorved genprodukter fra patogene midler kan udtrykkes i praktisk taget ubegrænsede mængder i en ikke-patogen form. Overflade antigener fra sådanne virus 10 som influenza (1), mund- og klovsyge (2), hepatitis (3), vesiculær stomatitis (4), rabies (5), og herpes simplex (6) virus, er nu blevet udtrykt i E. coli og S. cerevisiae, og giver løfte om, i fremtiden at kunne tilvejebringe forbedrede underenhedsvacciner. Det er imidlertid klart, at udtrykkeisen af overfladeantigener i lavere organismer ikke er helt tilfredsstillende, fordi potentielt vigtige antigeniske determinanter kunne gå tabt på 15 grund af ufuldstændig forarbejdning (f.eks. proteolyse, glycosylering) eller ved denaturering under rensningen af det klonede genprodukt.

Dette er især tilfældet med membranproteiner, som på grund af hydrophobe transmembrandomæner har tendens til at aggregere og blive uopløselige, når de 20 udtrykkes i E. coli. Klonede gener, som koder for membranproteiner, kan udtrykkes i pattedyrceller, hvor værtscellen tilvejebringer de faktorer, som er nødvendige for rigtig forarbejdning, polypeptidfoldning og inkorporering i cellemembranen (7, 8). Medens disse undersøgelser viser, at membranproteiner kan udtrykkes på overfladen af en rekombinant værtscelle, og, f.eks. (8), at et afkortet membranprotein, som mangler 25 det hydrophobe carboxyterminale domæne, kan secerneres langsomt fra værtscellen fremfor at blive bundet til den, er det ikke klart, at det således udtrykte membranbundne protein eller det således secernerede afkortede protein faktisk vil være i stand til at fremkalde antistoffer, som er effektive over for det patogen, hvorfra proteinet er afledt.

30

Herpes simplex |HSV) er et DNA-virus, som forekommer i to beslægtede, men skelnelige, former i humane infektioner. Mindst fire af det store antal virus-indkodede proteiner har vist sig at være glycosyleret og til stede på overfladen af både virionet og de inficerede celler (9). Disse glycoproteiner, betegnet gA/B, gC, gD og gE, findes i DK 172694 B1 2 både HSV type 1 (HSV1) og HSV type 2 (HSV2), medens der i tilfælde af HSV2 er blevet rapporteret at være fundet et yderligere glycoprotein (gF>. Selv om deres funktioner forbliver noget af et mysterium, er disse glycoproteiner uden tvivl involveret i virustilknytning til celler, cellefusion og en række forskellige værtsimmunologiske 5 reaktioner på virusinfektionen (11). Selv om HSV1 og HSV2 kun viser ca. 50% DNA-sekvens-homologi (12), synes glycoproteiner for størstedelen at være type-fælles.

Således viser gA/B, gD og gE et stort antal type-fælles antigeniske determinanter (13 - 16), medens gC, som tidligere blev antaget for at være fuldstændigt type-specifik (17, 18), også har vist sig at have nogle type-fælles determinanter. Type-specifikke 10 antigeniske determinanter kan imidlertid påvises ved anvendelse af monoklonale antistoffer for nogle af glycoproteiner (10, 19), hvilket viser, at der er sket nogle aminosyreændringer, siden HSV1 og HSV2 skiltes ad.

Et af de vigtigste glycoproteiner med hensyn til virusneutralisering er gD (11). Der er 15 fremført et betydeligt materiale, som stærkt tyder på, at de respektive gD-proteiner hos HSV1 og HSV2 er beslægtede. F.eks. har rekombinationskortlægning lokaliseret de respektive gener til colineære områder i begge virusgenomer. Aminosyreanalyse viste stor homologi mellem de to proteiner. gD-proteinerne inducerer neutraliserende antistoffer for både type 1 og type 2 virus på en type-fælles måde (19-21). Desuden 20 er de fleste morioklonale antistoffer dannet over for disse glycoproteiner type-fælles, hvilket også tyder på en høj grad af strukturelt slægtskab mellem de to typer af glycoproteiner (20). Nogle monoklonale antistoffer fandtes imidlertid at reagere typespecifikt, hvilket tyder på væsentlige forskelle mellem proteinerne (19). Peptidkort over proteinerne afslørede også med sikkerhed sådanne forskelle (22a). Selv om disse 25 resultater antyder, at disse polypeptider er beslægtede, er de dog utilstrækkelige til at indicere nøjagtigt hvor nært slægtskabet er.

For at undersøge arten af type-fællesskabet hos HSV1- og HSV2-gD-proteiner, blev DNA-sekvenserne af gD-generne fra HSV1 og HSV2 bestemt. De afledte 30 aminosyresekvenser viste lighed. De resulterende afledte proteinsekvenser blev også analyseret for strukturforskelle ved anvendelse af et program beregnet til at bestemme hydrophobe og hydrophile områder af proteinet. Denne analyse viste en høj grad af bevarelse på et groft strukturniveau. Selv om der fandtes flere aminosyreudskiftninger mellem de to glycoproteiner, var størstedelen af disse udskiftninger bevarende, hvilket antyder et vigtigt strukturkrav i dette glycoprotein for viruset, DK 172694 B1 3 I modsætning til HSV1 viser HSV2 sig at kode for endnu et glycoprotein, betegnet gF 5 (22b, 10, 22c, 22d). Selv om HSV2-gF havde en elektroforetisk mobilitet, som var meget hurtigere end HSV1-gC, afslørede kortlægningsundersøgelser med rekombinante virus, at dette protein var indkodet i et område af HSV2-genomet, som var tilnærmelsesvis colineært med genet for HSVI-gC (22c, 22d). Desuden er det for nylig blevet påvist, at et monoklonalt antistof over for HSV2-gF vil krydsreagere svagt med HSV1-10 gC (22f), og at et polyklonalt antiserum fremstillet over for HSV1-verion-hylster- proteiner udfældede gF (22d), hvilket antyder en mulig strukturel homologi mellem de to glycoproteiner. Således forekom det, at en mulig homolog til HSV1-gC var HSV2-gF-proteinet. Dette slægtskab blev undersøgt i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

15

Ved undersøgelse af beslægtetheden mellem HSV1 og HSV2 er det i denne beskrivelse blevet fastslået, at en DNA-sekvens på et 2,29 kb område i HSV2-genomet er colineær med HSV1 -gC-genet. Translation af en stor åben aflæsningsramme i dette område viser, at et protein, som har væsentlig homologi til HSVI-gC er indkodet i 20 dette område. Det antages, at dette område koder for HSV2-gF-genet, og at gF-proteinet er den HSV2-homologe til HSV1-gC.

En bestemt udførelsesform af opfindelsen angår en vaccine baseret på gD-proteinet. I lyset af denne information om strukturen af gD-proteinet, som beskrevet nærmere i 25 det følgende, blev det besluttet at udtrykke gD-protein-DNA i pattedyrceller for at se, om dette var muligt, og hvis det var muligt, om det udtrykte protein ville bindes til værtscellemembranen, og om en afkortet form af proteinet, som manglede membranbindingsdomænet ville secerneres fra værtscellen, og i hvert af de sidstnævnte tilfælde, om udtrykkelsesproduktproteineme kunne fremkalde antistoffer, 30 som var effektive over for HSV1 og/eller HSV2. Som resultaterne angivet i det følgende viser, er disse formål blevet opnået. Især gør opfindelsen det muligt at anvende disse proteiner opnået ved rekombinant-DNA-processer, som komponenter i en vaccine, der er effektiv over for HSV type 1 og HSV type 2. Således tilvejebringes beskyttende vaccine over for forekomsten af herpes-infektion og en reduktion i DK 172694 B1 4 hyppigheden og alvoren af genopstået herpes-infektion hos individer, som allerede er inficeret.

En anden bestemt udførelsesform angår en anden klasse af glycoproteiner opnået ved 5 rekombinant-DNA-processer, der er nyttige som komponenter i en vaccine over for HSV type 1 og/eller HSV type 2. Nærmere bestemt inkluderer denne klasse af glycoproteiner HSV1-gC (effektiv over for HSV1), HSV2-gF (mere korrekt betegnet som et H5V2-gC, effektiv over for HSV2) eller kombinationer af de to proteiner (effektive over for begge virus). Det antages, at en vaccine baseret på de kombinerede 10 glycoproteiner, gC og gD, ville være væsentligt mere effektiv end en vaccine baseret på hvert glycoprotein alene.

Sammenfattende angår opfindelsen en vaccine omfattende et polypeptid med antigeniske determinanter, som overraskende er i stand til specifikt at fremkalde 15 komplementært antistof over for Herpes simplex type 1 og Herpes simplex type 2 virus. I én udføreisesform omfatter vaccinen et polypeptid med disse antigeniske determinanter, men som ikke er funktionelt forbundet med overflademembranen. Som anført mere detaljeret nedenfor er et sådant polypeptid et afkortet, membranfrit derivat af et membranbundet polypeptid. Derivatet dannes ved udeladelse af et mem-20 branbindende domæne fra polypeptidet, hvilket tillader det at secerneres fra det rekombinante værtscellesystem, hvori det er blevet produceret. I en anden udførelsesform dannes polypeptidet først i funktionel forbindelse med en overflademembran, og derefter opløses polypeptidet, fortrinsvis i et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, for at frigøre det fra membranen.

25 I denne beskrivelse henfører betegnelsen "rekombinant" til celler, som er blevet transficeret med vektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi og således transformeret med evnen til at producere det her omhandlede polypeptid.

"Funktionel forbindelse" betyder bundet til membranen, typisk ved at rage ud til begge 30 sider af membranen, på en sådan måde, at antigeniske determinanter ligger blot foldet i en nativ konformation, som kan genkendes af antistof udløst over for det native patogen. "Membranbundet" med henvisning til de her omhandlede polypeptider henfører til en klasse af polypeptider, som almindeligvis produceres i eukaryotiske celler og er karakteriseret ved at have en signalsekvens, som antages at hjælpe med til DK 172694 B1 5 deres sekretion igennem forskellige cellemembraner såvel som et membranbindende domæne (sædvanligvis af hydrophob art og forekommende ved den C-terminale ende), som menes at udelukke deres fuldstændige sekretion igennem cellemembranen.

Således forbliver polypeptidet funktionelt forbundet med eller bundet til membranen.

5 I denne beskrivelse anvendes betegnelserne "HSV2-gF”, "HSV2-gC" og ”gC-2B valgfrit for at betegne en glycoproteindel af HSV2, som er stærkt homolog med HSV1-gC, og som er i stand til at fremkalde tilstrækkelige antistoffer til at være nyttige som vaccine.

10 « Når først de antigeniske determinanter i polypeptiderne i vaccinerne ifølge opfindelsen er tilvejebragt ved funktionel forbindelse med overflademembranen, kan membranen derefter fjernes fra polypeptiderne uden ødelæggelse af de antigeniske egenskaber.

Således kan det membranbundne polypeptid f.eks. fjernes fra membranen ved 1 5 soiubilisering med en egnet opløsning, fortrinsvis en, der indeholder et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, for at fjerne polypeptidet fra membranen. En fordel ved at gøre dette er at polypeptidet isoleres fra fremmed cellemateriale, hvilket forøger den potentielle styrke ved dets anvendelse i en vaccine. En teknik til fjernelse af membranen fra polypeptidet er beskrevet nedenfor.

20

Der kan opnås membranfrie præparater ved skabelse af et sekretionssystem. Som beskrevet mere detaljeret nedenfor har et sådant secerneret polypeptid mindst nogle af de antigeniske centre, som er nødvendige for antistofstimulering.

25 Kort forklaring af tegningerne

Fig. 1A og 1B viser DNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens af HSV1- og HSV2-gD-generne og omgivende flankerende områder.

30 Fig. 2 viser en hydropatianalyse af gD-proteinerne fra HSV1- og HSV2-proteinerne.

Fig. 3 er et diagram over plasmidet pgD-dhfr, konstrueret til udtrykkelse af en membranbundet form af HSV1 -glycoprotein D.

DK 172694 B1 6

Fig. 4 viser resultatet af mærkning af gD12-celler med humane antistoffer over for HSV, idet (A) er en visualisering med fasekontrastoptik, og (B) et fluorescensbillede af de samme celler.

5 Fig. 5 viser radioimmunofældninger af klonet gD fra den her omhandlede gD12-cellelinie og nativt gD fra HSV 1-inficerede humane celler.

Fig. 6 viser bindingen af humane anti-HSV-antistoffer til gD12-celler og udgangs-CHO-cellelinien.

10 *

Fig. 7 er en skematisk gengivelse af HSV1-gD-protein og belyser placeringerne af signalsekvens og membranbindende domæne.

Fig. 8 er et diagram af udtrykkelsesplasmidet pgDtrunc-dhfr for en secerneret form af 15 HSV1-gD-protein.

Fig. 9 viser radioimmunofældninger fra den her omhandlede gD10.2-cellelinie.

Fig. 10 viser radioimmunofældninger fra forforstærkede og forstærkede gDl0.2-20 cellelinier.

Fig. 11 viser den grad af forstærkning, som opnås med den Mtx-forstærkede gD10.2-cellelinie.

25 Fig. 12 viser fragmenterne af pgC2Sal2.9, som blev underkastet DNA-sekvensanalyse.

Fig. 13 viser DNA-sekvensen afledt fra pgC2SAI2.9 sammenlignet med DNA-sekvensen af HSVI-gC-området.

30 Fig. 14 belyser Southern-blottinganalyse af HSV2-genomisk DNA og pgCzSal2.9-DNA.

Fig. 15 belyser translationen af den store åbne HSV2-aflæsningsramme og sammenligning med HSV1-gC-aminosyresekvensen.

DK 172694 B1 7

Fig. 16 belyser hydropatianalyse af HSV1-gC-proteinet og proteinet fra den store åbne HSV2-af læsningsramme.

Opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.

5 EKSEMPEL 1

Dette eksempel omhandler gD-protein.

10 Virusvækst og isolering af viral DNA.

HSV1 (stamme Hzt) og HSV2 (stamme G) blev dyrket på Hep 2 celler ved henholdsvis 37°C og 33°C. Den virale DNA blev isoleret fra inficerede cellekulturer ved nedbrydning med proteinase K og dannelse af bånd med CsCI (23).

15

Kloning af gD-generne fra HSV1 og HSV2.

Forudgående kortlægnings- og kloningsundersøgelser har lokaliseret HSV1-gD-genet til et ca. 6,6 kb BamHI-fragment (6,24). HSV1 -DNA blev spaltet med BamHI, og 6-7 kb 20 området blev isoleret ved agarosegel-elektroforese. Dette fragment blev ligeret ind i BamHI-nedbrudt pBR322, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 (ATCC nr.- 31446). De plasmider fra de ampicillin-resistente tetracyelinsensitive kloner blev screenet for det rigtige HSV1-fragment ved restriktionsenzymnedbrydning. Det korrekte gD-holdige Sstl-fragment blev subklonet i 25 Sstl-nedbrudt plasmid pFM3 (EP offentliggørelsesskrift nr. 0068693).

Selv om gD-genet fra HSV2 i forvejen var kortlagt ved rekombination med HSV1, var den nøjagtige placering af dette gen ukendt. Derfor blev et ca. 10 kb Hindlll- fragment fra det lille unikke område af HSV2-genomet (4) ligeret ind i Hindi Il-centret af 30 bakteriofag-X-kloningsvektoren 590 (25). In vitro pakket fag blev udpladet i lav tæthed og screenet ved Benton-Davis-proceduren med en 32P-mærket subklon af gD-genet fra HSV1 (26). Positivt hybridiserende pletter blev dyrket, DNA'en isoleret, og gD-genet lokaliseret ved Southern-blotting og hybridisering med det 32P-mærkede HSV1-gD-gen DK 172694 B1 8 (27). De positivt hybridiserende, HSV2-gD-holdige fragmenter blev subklonet i plasmidet p(JC9 (28).

DNA-sekvensbestemmelse og dataanalyse.

5

Forskellige fragmenter fra HSV1- og HSV2-gD-generne blev subklonet i m13-fag-vektor-mp9 (29) og blev sekvensbestemt ved dideoxynucleotidmetoden beskrevet af Sanger (30).

10 Nucleotidsekvenserne blev analyseret under anvendelse af HOM-programmet (31).

Hydropatien af den afledte proteinsekvens blev analyseret under anvendelse af en bredde på 12 og et spring på 1 (31a).

Kloning af gD-områderne fra HSV1 og HSV2.

15

Andre undersegeiser havde lokaliseret HSV1-gD-genet til 6,6 kb BamHI-3-fragmentet ifølge nomenklaturen angivet af Roizman (6, 12, 24). Isolering og sekvensbestemmelse af en del af dette fragment viste, at dette fragment indeholdt HSV1-gD-genet.

Da man kunne forvente, at DNA-sekvenserne i HSV1-gD-genet ville være relativt 20 homologe med HSV2-gD-genet, anvendtes dette fragment som sonde til isolering af gD-genet fra HSV2-genomet.

Da de fleste af generne fra HSV1- og HSV2-genomerne viser sig at ligge colineært på kortet (35), blev området fra det lille unikke område af HSV2-genomet, som svarede til 25 HSV1-gD-området (Hindlll-L-fragmentet (12)), klonet i en λ-fag-vektor. Screening af de resulterende pletter med en 32P-mærket HSV1-gD-gen-subklon afslørede positivt hybridiserende pletter, hvilket antyder, at der virkelig var nucleinsyresekvenshomologi mellem de to virusgenomer i dette område. Isolering af fag-DNA'en og efterfølgende Southern-blottinganalyse afslørede det område af dette fragment, som svarede til gD-30 genet. Dette område blev subklonet til DNA-sekvensanalyse.

DK 172694 B1 9

Kodningsområderne.

Fig. 1 belyser de to gD-DNA-sekvenser sammenlignet ved HOM-programmet (31).

Nucleotid nr. 1 vælges som A’et i ATG-startcodonen, der koder for methionin.

5 Åbninger er blevet indført af HOM-datamatprogrammet for at maksimere sekvens-homologierne (31). Nucleotidforskelle er vist ved symbolet (*), medens aminosyre-forskelle er vist ved indramning. Aminosyreforskelle mellem den her rapporterede HSV1-gD-sekvens, bestemt for Hzt-stammen af HSV1, og den der er rapporteret af Watson et al. (6) for Patton-stammen, er angivet ved symbolet ( + ). Starten af HSV1-10 gD-gen-transcriptionen, vist ved en pil, er fra Watson et al. (32). Mulige N-forbundne glycosyleringscentre er vist gråtonet. To mulige "TATA"-sekvenser er vist 5' for starten af gD-transcriptionen, medens en tredje mulig ”TATA"-sekvens er vist 5' for en anden åben aflæsningsramme ved 3'-enden af HSV2-sekvensen. To områder af ikke-kodningssekvenshomologi bør bemærkes 5' for gD-generne og 5' for den anden åbne 15 aflæsningsramme fra HSV2-sekvensen.

Hydropatien af gD-proteiner.

Hydropatien af hvert glycoprotein blev analyseret under anvendelse af det program, 20 der er udviklet af Hopp et al. (31a). Som vist i fig. 2 findes der et hydrophobt transmembran-domæne ved 3'-enden af genet. Tolv aminosyrer lange strækninger blev analyseret, og gennemsnitshydropatien blev udregnet. Forskelle i rester mellem de to glycoproteiner er vist med bevarede ændringer markeret (*) og ikke-bevarende ændringer markeret ( + ). A) HSV1-gD-protein-hydropati, B) HSV2-gD-protein-25 hydropati.

DNA-sekvensanalyse viser, at HSV1- og HSV2-gD-proteinerne er 80% homologe.

Hovedparten af de forskelle, der blev fundet mellem disse to proteiner, var i de amino-og carboxy-terminale områder. Disse proteiners amino-terminale område indeholder et 30 stærkt hydrophobt område, som indeholder en argininrest nær ved det amino-terminale methionin. Dette hydrophobe domæne er signalsekvensen, som er karakteristisk for secernerede og membranbundne proteiner, og som antageligvis har den funktion at dirigere mindst en del af proteinet ind i rummet af det endoplasmiske reticulum (33).

En sammenligning af de første 20 amino-terminale aminosyrer viste, at der var ialt 12 DK 172694 B1 10 forskelle mellem type 1- og type 2-genet. Praktisk taget alle forskelle er imidlertid bevarende, da de koder for andre hydrophobe aminosyrer. Undtagelserne er gly-arg-udskiftningen ved rest nr. 3 og arg-gly-udskiftningen ved rest nr. 7. Selv om disse udskiftninger ikke er bevarende, ændrer de dog ikke nettostrukturen af signaldomænet.

5 Begge gener bevarer en positivt ladet rest i de første 10 aminosyrer.

Hydropatikurven i fig. 2 afslørede et hydrophilt carboxylterminalt domæne efter et hydrophobt område. Denne struktur er karakteristisk for membranbundne glycoproteiner og er tidligere blevet fundet i andre virale overfladeantigener (5, 34).

10 Dens funktion er at forankre proteinet i de cellulære og virale membraner, og den spiller som sådan en vigtig rolle for virusinfektion. Der blev fundet 12 aminosyre-ændringer i dette område af gD-proteinerne fra rest 333 til rest 362, hvoraf de fleste er bevarende. Dette antyder, at det eneste kriterium for aminosyrerne i dette område er, at de er overvejende apolære for at spænde over lipid-dobbeltlaget. Desuden viser 15 området efter membrandomænet (resterne 363-375), der hovedsageligt tjener til at forankre proteinet i membranen (33), 5 ændringer i dets første 13 aminosyrerester efterfulgt af en homolog strækning. Dette resultat antyder, at de første 10-15 rester i det carboxylterminale hydrophiie domæne kun har en forankrende funktion og derfor kun behøver at være ladet, medens de efterfølgende 23 rester kan have en anden 20 funktion, som er specifikt vigtig for gD-proteinet.

Selv om der findes mange andre aminosyreændringer igennem disse to proteiner, er det store flertal af ændringerne bevarende. Dette understreges af den struktur, som er afsløret af det i fig. 2 viste hydropatiprogram. Som det kan ses ved denne sammen-25 ligning, viser de to glyco-proteiner meget ens kurver. De aminosyreændringer, som ikke er bevarende, viser sig ikke at ændre proteinets hydropati.

Udtrykkelse af HSV1-gD.

30 For at etablere en permanent cellelinie, som producerer membranbundet gD, blev det gD-holdige fragment ligeret (fig. 3) ind i en pattedyr-udtrykkelsesvektor (36) indeholdende den selekterbare markør, dihydrofolatreductase (dhfr). Fig. 3 viser et diagram af plasmidet pgD-dhfr, konstrueret til udtrykkelse af HSV1 -glycoprotein D.

DK 172694 B1 11

Udtrykkelsesplasmidet bestod af repliceringsoriginet og '3-lactamase-genet (smpr) afledt fra E. coli plasmidet pBR322 (37), en cDNA-indsætning, der koder for muse-dhfr (36, 38) under styring af den tidlige SV40-promotor og et 4,6 kb Hindlll-BamHI-fragment indeholdende gD-genet også under styring af den tidlige SV40-promotor.

5 Hindlll-enden af dette fragment ligger 74 bp til 5'-siden for start-methionincodonen og inkluderer mRNA-cap-centret. Hindlll-centret ligger 250 bp til 3’-siden for Goldberg-Hogness-kassen i SV40-promotoren. Kodeområdet af det gD-kodende fragment er 1179 bp langt og slutter sig til et stort (1,9 kb) 3'-område, som indeholder mindst en del af gE-genet (24, 32), en translationsstop-codon og et polyadenyleringscenter.

10

Plasmidet pgD-dhfr blev konstrueret som følger: 4,6 kb Hindlll-BamHI-fragmentet indeholdende hele gD-kode sekvensen blev isoleret fra BamHI-fragmentet klonet fra HSV1-genomet (se ovenfor). 2,8 kb Hindlll-Sall-fragmentet indeholdende en SV40-origin/tidlig promotor og pBR322-ampicillinresistens-genet og -originet for DIMA-15 replicering blev isoleret fra plasmidet pEHBal 14. 2,1 kb Sall-BamHI-fragmentet indeholdende en muse-dihydrofolatreductase-cDNA-klon under styring af en anden SV40-origin/tidlig promotor blev isoleret fra plasmidet pE34BHBV E400D22 (36).

Disse 3 fragmenter blev ligeret sammen i en tredobbelt Tigering under anvendelse af T4-DNA-ligase, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli 20 stamme 294. De resulterende kolonier blev dyrket, og plasmid-DNA'en screenet ved nedbrydning med Sac 2. Den korrekte DNA-konstruktion, pgD-dhfr (fig. 3), blev anvendt til yderligere transfektionsundersøgelser.

Plasmidet blev indført i kinesisk-hamster-ovarieceller (CHO), som var deficiente med 25 hensyn til produktion af dhfr (39), under anvendelse af calciumphosphatfældnings-metoden (40). Kolonier, som var i stand til at vokse i medier, der manglede hypoxanthin, glycin og thymidin, blev opnået, og 9 dhfr+-kloner blev analyseret. Af disse kunne gD detekteres i 5 kolonier under anvendelse af anti-HSV1-antistoffer ved radioimmunofældnings- og indirekte immunofluorescens-prøvninger. En af de fem linier 30 (gD12) blev udpeget til yderligere undersøgelse. For at karakterisere det klonede gD-gen-produkt blev gD12-celler metabolisk mærket med 35S-methonin eller 3H-glucosamin og analyseret ved radioimmunofældning. Den anvendte procedure var som følger: celler blev dyrket i Ham's F12-medium (Gibco) suppleret med 7% kommercielt dialyseret føtalt okseserum (Gibco), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 DK 172694 B1 12 enh./ml). Da kulturerne var omkring 80% konfluente, blev mediet fjernet, cellerne blev vasket to gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS), og der tilsattes et mærkende medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium indeholdende enten 1/10 af den normale koncentration af methionin eller glucose) til en slutkoncentration på 0,064 5 ml/cm2. Der tilsattes enten 35S-methionin (SJ.204, Amersham Int.) (50-75 pCi/ml) eller H-glucosamin (100 pCi/ml), og cellerne blev dyrket i yderligere 18-20 timer. Efter mærkningen blev mediet indhøstet, og cellerne blev vasket to gange i PBS og fjernet fra kulturskålene ved behandling med PBS indeholdende 0,02% EDTA. Cellerne blev derpå solubiliseret i lysepuffer bestående af: PBS, 3% NP-40. 0,1% okseserum-10 albumin, 5 χ I05 M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TIU/ml apoprotinin, og det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12000 χ G. Til immuno-fældningsreaktioner blev cellelysaterne fortyndet tredobbelt med PBS, og aliquoter (typisk 180 μΙ) blev blandet med 2-5 μΙ antisera og inkuberet ved 4eC i 30 minutter. Immunkomplekser blev derpå adsorberet til fikserede S. aureus celler ved Kessler’s 1 5 metode (40a) og blev genudfældet ved centrifugering ved 12000 χ G i 30 sekunder.

S. aureus cellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskningspuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3% natriumdodecylsulfat), og immunkomplekserne blev elueret med 20 μΙ polyacrylamidgel-prøvepuffer (62,5 mM "Tris"-HCI-puffer, pH 6,8, indeholdende 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,01 % bromphenolblåt) ved 90°C i 3 minutter. Efter 20 centrifugering i 30 s blev supernatanterne påført 10% polyacrylamidgeler ifølge Laemmli's metode (45).

Fig. 4a sammenligner autoradiografier opnået med gD12-cellelinien og HSV1-inficerede celler: kontrolimmunofældning fra gD12-cellelysatet med normal kaninserum (bane 1); 25 immunofældning af nativt gD dyrket i HEL-celler (bane 2)og A549-celler (bane 3) med det monoklonale anti-gD-antistof, 55-S (41); immunofældning af klonet gD fra gD12-cellelysatet med polyklonale kaninantistoffer (Dako Corp.) for HSV1 (bane 4) og det monoklonale antistof, 55-S (bane 5); immunofældning af klonet gD fra gD2-cellerne, som var metabolisk mærket med H-glucosamin, med polyklonale kanin-anti-HSV1-30 antistoffer (bane 6).

Det ses (bane 4 og 5) at et diffust bånd på 59-60 kilodalton blev specifikt fældet fra gD1 2-cellelinien under anvendelse af enten kanin-anti-HSV1-antistoffer eller det DK 172694 B1 13 monoklonale anti-gD-antistof, 55-S, som er specifikt for HSV1-proteinet (41). Denne molekylvægt stemmer godt overens med den, der er rapporteret for gD isoleret fra HSV1 -inficerede KB-celler (42). Det ses, at det samme monoklonale antistof fældede proteiner af lignende, men forskellige molekylvægte fra HSV1 inficerede humane 5 cellelinier. Hovedproduktet, som blev fældet fra den humane lungecarcinoma-cellelinie A549 (bane 2) var på 53 kilodalton, og det, der blev fældet fra den humane embryoniske lunge-cellelinie (HEL) var på 56 kilodalton (bane 3). Tidligere undersøgelser (43) har vist, at molekylvægten af HSV-glycoproteiner varierer afhængigt af værtscellen, og at denne forskel skyldes forskelle i glycosylering. For at bestemme, om 10 det i CHO-celler producerede gD-protein faktisk var glycosyleret, blev cellerne metabolisk mærket med 3H-glucosamin. Da der blev udfældet bånd af identiske molekylvægte (bane 5 og 6) efter metabolisk mærkning med 35S-methioning eller H-glucosamin, konkluderede vi, at det i CHO-celler producerede gD-protein er glyco-syleret.

15

De humane cellelinier A549 (ATCC CCL 185) og HEL 299 (ATCC CCL 137) blev dyrket til konfluens i 3,5 cm vævskulturskåle og inficeret med HSV1 i en multiplicitet på 10 pfu pr. celle. Virus-inficerede celler blev mærket ved en metode mage til den, der er beskrevet af Cohen et al. (44). 4 Timer efter infektionen blev mediet fjernet, og 20 cellerne blev vasket én gang med frisk medium (Dulbecco's modificerede Eagle’s medium) og én gang med phosphatpufret saltopløsning (PBS). Derpå sattes frisk medium indeholdende 1/10 af den normale koncentration af methionin til cellerne sammen med 35S-methionin (Amersham, International) til en slutkoncentration på 75 μΟ pr. ml medium. Cellerne blev dyrket i yderligere 20 timer og derpå indhøstet ved behandling 25 af de vaskede celler med PBS indeholdende EDTA (0,02%). Virale proteiner blev solubiliseret i lysepuffer bestående af PBS, 3% NP-40, 1 % okseserumalbumin, 5x10 M phenylmethylsulfonylfluorid og 0,017 TIU/ml apoprotinin. Det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12000 x C i en mikrocentrifuge. Til immuno-fældningsreaktioner blev cellerne eller viruslysaterne fortyndet tredobbelt med 30 phosphatpufret saltopløsning, blandet med 2-5 μΙ af det passende antiserum og inkuberet i 30 minutter ved 4°C. Antistof-antigen-komplekser blev fjernet fra reaktionsmediet ved tilsætning af 25 μ! af en 10% opløsning af fikseret S. aureus (Kessler (40a)) og blev udfældet ved centrifugering ved 12000 x G i 30s S. aureus cellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskepuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3% DK 172694 B1 14 natriumdodecylsulfat), og cellerne blev suspenderet i 20 ml polyacryl-amidgel-prøvepuffer (10% glycerol, 5% 2.mercaptoethanol; 0,0625 M med hensyn til pH 6,8 "Tris"-puffer, 0,01% bromphenolblåt) og inkuberet ved 90°C i 3 minutter. Efter centrifugering (12000 χ G) i 30s blev supernatanterne påført 10% polyacrylamidgeler 5 (45).

For yderligere at udforske den post-translationelle forarbejdning af klonet gD gennemførtes impuls-forfølgelses-undersøgelser. Fig. 4B viser immunofældning af klonet gD fra gD12-celler med kanin-anti-HSV1-antistoffer (Dako, Corp.) til forskellige 10 tider efter impulsmærkning med 35S-methionin. Fig. 4B viser en impulsmærkning af gD12-celler. Ved disse undersøgelser blev celler dyrket til konfluens i 10 cm vævskulturskåle og mærket med 35S-methionin som beskrevet ovenfor med undtagelse, at mærkningareaktionen blev udført i 15 minutter på is, cellerne vasket 3 gange med frisk medium og derpå ført tilbage til inkubatoren og inkuberet ved 37°C i forskellige 15 tidsrum. Reaktionerne blev afsluttet ved vaskning af cellerne i kold phosphatpufret saltopløsning og solubilisering af cellerne som beskrevet ovenfor. Proteiner blev immunofældet ved de følgende tider efter impulsmærkning: bane 1,5 minutter; bane 2, 15 minutter; bane 3, 30 minutter; bane 4, 60 minutter; bane 5, 120 minutter. Forstadieformen af gD med en molekylvægt på 51 kd blev specifikt udfældet fra 20 gD12-cellelinien 5 minutter efter en impuls med 35S-methionin, og dette forstadium blev fulgt ind i formen med højere molekylvægt (59 kd) efter omkring 60 minutter. Ud fra disse undersøgelser bedømmer vi halveringstiden for denne post-translationelle begivenhed til at være omkring 45 minutter. Forstadieproduktets forbindelse mellem 51 kd båndet og 59 kd båndet minder nært om den, der er rapporteret for virusproduceret 25 gD (14, 42, 46, 47), og kinetikken for denne proces ligner den, der er beskrevet af Cohen et al. (42). I virusinficerede celler er forskellen i molekylvægt mellem forstadiet og produktet blevet tilskrevet både N-forbundne og O-forbundne oligosaccharider (48).

For at bestemme om gD blev eksporteret til celleoverfladen udførtes indirekte 30 immunofluorescens-undersøgelser. Ved disse undersøgelser blev kanin-, muse- og humant anti-HSV-antistof omsat med ufikserede celler under betingelser, som ikke permeabiliserer cellemembranen (49). gD12-celler og udgangs(CHO)-cellerne (forhold 1:1) blev udpladet på glasdækplader (2,2 x 2,2 cm) og dyrket, indtil cellerne var omkring 60% konfluente. Humant serum, som vides at indeholde antistoffer over for DK 172694 Bl 15 HSV1 (50), blev fortyndet 40 gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS), og 100 μΙ blev pipetteret ud på vaskede celler, og cellerne blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i et befugtet kammer. Cellerne blev neddyppet 3 gange i PBS for at bortvaske ubundet antistof og blev derpå inkuberet med 100 μΙ 20 gange fortyndet 5 tetramethylrhodaminisothiocyanat-mærkede gede-antihuman-lgG-antistoffer (Cappel Laboratories) i yderligere 30 minutter. Det ubundne mærkede antistof blev bortvasket med PBS, og cellerne blev dehydratiseret i iskoldt 50% ethanol og 100% ethanol og rehydratiseret med glycerol på et mikroskop-præparatglas (49). Cellerne blev derpå betragtet under fasekontrast- og fluorescens-optik i fluorescensmikroskop (Zeiss). Fig.

10 5 viser: A, gD12- og CHO-celler set visualiseret med fasekontrastoptik; B, fluorescensbillede af de samme celler som i A. Sammenligning af fasekontrast-billederne med fluorescensbillederne (fig. 5) viste, at gD12-cellerne var kraftigt mærket, medens udgangs-CHO-cellerne kun vandt lidt eller intet mærket antistof. Ved kontrolforsøg med normale musesera, normale kaninsera eller humane sera, som vides 15 at være negative for HSV-antistoffer, kunne der ikke detekteres nogen specifik mærkning af cellerne. Disse undersøgelser tydede på, at gD-proteinet blev eksporteret til celleoverfladen. Forsøg med CHO-og gD12-celler fikseret før mærkningen med midler, som vides at permeabilisere cellemembranen (methanol eller acetone) gav et forskelligt mærkningsmønster. Ved disse undersøgelser blev der iagttaget en kraftig 20 perinucleær mærkning af gD12-cellerne med anti-HSV 1 -antistoffer og ingen specifik mærkning af CHO-cellerne.

For at bestemme om gD12-celler udtrykte antigeniske determinanter relevante for humane HSV1- og HSV2-infektioner undersøgtes bindingen af antistoffer fra individer, 25 som man vidste havde anti-HSVI- eller anti-HSV2-antistoffer (50). Radioimmu-nofældning af lysater fra metabolisk mærkede gD12-celler gav resultater, som var sammenlignelige med dem, der blev opnået med gnaver-anti-HSV-sera (fig. 4). På lignende måde gav humane anti-HSV1-sera specifik mærkning af gD12-celler ved en indirekte immuno-fluorescens-prøvning (fig. 5) og mærkede ikke udgangs-CHO-30 cellelinien. Tilsammen giver resultaterne opnået med forskellige gnaver-anti-HSV1- og -HSV2-antisera, monoklonale anti-gD-antistoffer og humane anti-HSV-antisera bevis for, at gD udtrykt på overfladen af gD12-celler har et antal antigeniske determinanter fælles med det native virus, og at strukturen af disse determinanter ikke er afhængig af samvirken med andre HSV 1-proteiner. Den kendsgerning, at et af de prøvede DK 172694 B1 16 monoklonale antistoffer (l-S> vides at neutralisere HSV1 in vitro (41) og viser, at det gD, der produceres i CHO-celler, har mindst én af de neutraliserende antigeniske determinanter fælles med det native virus.

5 For at få et kvantitativt mål for bindingen Sf anti-HSV1- antistoffer til gD12-celler udvikledes en enzymforbundet immunosorptionsprøvning (ELISA) (52). Ved disse undersøgelser blev gD12-celler og CHO-celler udpladet og kemisk fikseret til skiftende huller i 96 hullers mikrotitervævskulturplader. Forskellige antisera, som vides at indeholde antistoffer over for HSV, blev derpå rækkefortyndet og fik lov at reagere 10 med de fikserede celler. Ved prøvningens afslutning blev absorbansen i hvert hul målt, og der blev konstrueret normalbindingskurver. Den specifikke binding af antistoffer til gD12-cellerne blev bestemt ved subtraktion af værdierne opnået med udgangs-CHO* cellerne fra dem, der blev opnået med gD12-cellerne. Specifik binding af høj-titer-sera kunne detekteres i fortyndinger på 1:10000.

15

Serumtitere bestemt under anvendelse af gD12-celle-ELISA-prøvningen blev sammenlignet med anti-HSV1- og anti-HSV2- titere bestemt ved konventionelle metoder. Humane sera, som i forvejen var titreret (50) over for HSV ved konventionelle prøvninger, dvs. inhibering af hæmagglutination (IHA) eller komplement-20 fiksering (CF), blev rækkefortyndet i huller på mikrotiterplader indeholdende enten gD12-celler eller udgangs-CHO-cellelinien, og bindingen af anti-gD-antistoffer blev kontrolleret ved en ELISA-prøvning. gD12-cellerne og udgangs-CHO-cellerne blev podet i skiftende huller på 96 hullers mikrotiter-vævs-kulturplader (Falcon Labware) og blev dyrket til konfluens i F12-medium (GIBCO) indeholdende 10% føtalt okseserum.

25 Cellerne blev vasket 3 gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS) og blev derpå kemisk fikseret med 0,0625 glutaraldehyd i PBS. Cellerne blev igen vasket 3 gange med PBS og opbevaret indtil anvendelsen ved 4°C i PBS indeholdende 1 % okseserumalbumin, 100 mM glycin, 1 mM NaN3. For at måle anti-gD-antistoftitere blev cellerne vasket med PBS og rækkefortyndede antisera fik lov at reagere med de fik-30 serede celler (50 μΙ slutvolumen) i 1 time ved stuetemperatur. Ubundet antistof blev vasket bort, og cellerne blev inkuberet med 50 μΙ 1:2000 fortyndet gede-antihumant-IgG koblet til peberrod-peroxidase (Tago, Inc.). Det enzymforbundne antistof fik lov at reagere i 1 time ved stuetemperatur, og cellerne blev derpå vasket 3 gange med PBS.

Efter inkubation tilsattes peroxidase-substratet, o-phenylendiamin (200 μΙ), og DK 172694 B1 17 reaktionen fik lov at skride frem i 10 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2,5 M H2 S04 (50 μΙ), og absorbansen af reaktionsmediet fra hvert hu! blev bestemt med et automatiseret pladeaflæsningsspektrofotometer (Titertek). I fig. 6 udviste serumet, repræsenteret ved de åbne og lukkede cirkler, en HSV1-CF-titer på 128 og 5 HSV1- og HSV2-IHA-titere på 4096. Serumet, repræsenteret ved åbne og lukkede kvadrater, udviste en HSV1-CF-titer på <8 og HSV1- og HSV2-IHA-titere på <8. A, lukket cirkel og lukket kvadrat angiver binding til gD12-celler, åben cirkel og åbent kvadrat angiver binding til CHO-celler. B, lukket cirkel og lukket kvadrat repræsenterer den specifikke binding til gD12-cetler udregnet ved subtraktion af værdierne i A. I fig.

10 6 kan det ses, at et serum med en høj anti-HSV-titer bestemt ved konventionelle prøvninger gav en høj ELISA-titer, medens et andet serum med lave anti-HSV-titere ikke gav nogen detekterbar binding ved gD12- ELISA.

De beskrevne undersøgelser viser, at stabile cellelinier konstitutivt på deres overflade 1 5 udtrykker et transficeret genprodukt, som forbinder sig med antistoffer frembragt af herpes-virus-infektion.

Immunisering af mus med gD12-celler.

20 20 BALB/c-hunmus (5 uger gamle) blev skaffet fra Simonsen Laboratories (Gilroy,

California). Musene blev delt i to grupper på hver 10 mus: en "forsøgs”-gruppe og en "kontrol”-gruppe. Hver mus i forsøgsgruppen blev injiceret med gD12-celler, som vides at udtrykke HSV1 -glycoprotein D på deres overflade. Hver mus i kontrolgruppen blev injiceret med udgangs-CHO-cellelinien, hvorfra gD12-cellelinien var afledt. Til immuni-25 sering af mus blev begge typer celler dyrket til konfluens i 15 cm vævskulturskåle.

CHO-cellerne blev dyrket i Hama F12-medium (GIBCO) suppleret med 7% kommercielt dialyseret føtalt okseserum (GIBCO), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 enh./ml). gD12-cellerne blev dyrket i det samme medium uden glycin, hypoxanthin og thymidin. For at indhøste cellerne blev hver skål vasket to gange med 15 ml 30 phosphatpufret saltopløsning (PBS) og derpå behandlet med 15 ml PBS indeholdende 0,02% EDTA. Efter 15-20 minutter blev cellerne fjernet fra skålen og peletteret ved centrifugering i 5 minutter ved fuld hastighed i en klinisk centrifuge (IEC modol CL clinical centrifuge, rotor model 221). Supernatanten blev smidt væk, og cellerne blev gensuspenderet i PBS til en slutkoncentration på 1 ml PBS pr. hver 15 cm skål med DK 172694 B1 18 celler. Hver mus blev derpå injiceret med 0,5 ml cellesuspension (ca. 5x10 celler) fordelt som følger: 0,25 ml injiceret intraperitonealt og 0,25 ml injiceret subcutant i den løse hud i nakken. Musene blev derpå forstærkningsinjiceret 2 gange med friske celler (fremstillet som beskrevet ovenfor) den 38. dag og den 55. dag efter den 5 oprindelige immunisering. Musene blev blødtappet via halevenen den 68. dag for at opnå sera til in vitro neutraliseringsundersøgelser. Musene blev udsat for HSV1 (MacIntyre stamme) den 70. dag. Virusudsættelsen skete ved en intraperitoneal injektion på 2 χ 107 pfu virus i hver mus. Musene blev bedømt dagligt for dødelighed og hver anden dag for vægtændring og indtræden af lammelse. Alle musene i 10 kontrolgruppen døde inden for 7 dage for virusudsættelsen, medens alle forsøgsmusene blev beskyttet og ikke viste noget tegn på infektion. Disse undersøgelser fører til den konklusion, at immunisering med gD12-cellerne beskytter mod en dødelig HSV1 -udsættelse.

15 En varietet af transfektionsskemaer er selvfølgelig mulig under anvendelse af en række forskellige selekterbare markører. F.eks. kan muse-L-celler nyttigt transficeres under anvendelse af et mutant dhfr-gen som en selekterbar markør. gD-genet blev transficeret ind i sådanne celler via en vektor, der indeholder en sådan markør. I princippet kunne den beskrevne strategi anvendes til enhver situation, hvor der ønskes 20 udtrykkelse af et membranprotein.

Udtrykkelse af en afkortet form af gD-genet.

Den forudgående beskrivelse angår fremstillingen af membranbundet gD-protein. Som 25 omtalt ovenfor i forbindelse med fig. 2 blev der imidlertid ved analyse af amino-syresekvenserne af gD-proteinet i HSV1 og HSV2 i hvert tilfælde identificeret et hydrophobt/hydrophilt carboxyl- terminalt membranbindende domæne (fig. 7).

Et skematisk diagram af HSV1-glycoprotein D (gD).

30

Hydrophobe (gråtonet) og hydrophile (mærket +) områder af proteinet blev bestemt ud fra hydropatianalysen af gD-proteinsekvensen afledt fra gensekvensen. Kun de områder, som menes at være vigtige for membranlokalisering og -binding, er vist. De funktionelle domæner er: a) signalsekvensen (33), b) det hydrophobe transmembran- DK 172694 B1 19 domæne og c) det ladede membrananker. De 3 formodede N-forbundne glycosyleringssteder er vist med bogstavet G. Udtrykkelsesplasmidet bestod af det bakterielle pBR322-repliceringsorigin og -ampicillinresistensgen, en cDNA-indsætning, som koder for muse-dihydrofolatreductase-genet under transcriptionsstyring af den 5 tidlige SV40-promotor (53) og et Hindlll-Hinfl-fragment, som koder for de første 300 aminosyrer af gD under transcriptionsstyring af en anden tidlig SV40-promotor. Hindlll-centret i dette fragment ligger 74 bp til 5’-siden for gD-genets start-methionincodon. Hindlll-centret i vektorens tidlige SV40-område (36) ligger 250 bp til 3’-siden for SV40-promotorens Goldberg-Hogness-kasse. Hinfl-centret (gjort stumpt med Klenow-10 DNA-polymerase og 4 deoxynucleotidtriphosphater) ligeres til Hpal-centret i det 3’-utranslaterede område af hepatitis-B-virus-overfladeantigen-genet (36). Denne metode er også nyttig til fremstilling af et afkortet HSV2-gen. Den resulterende sekvens skaber en stopcodon (TAA) umiddelbart efter aminosyre 300 i gD-genet. Transcriptions-afslutnings- og -polyadenyleringscentre for den afkortede gD-gen-transcript er indkodet 15 af det 3’-utranslaterede område af hepatitis-B-overfladeantigen-genet (36).

Plasmidet pgDtrunc.dhfr blev konstrueret som følger: det gD-holdige Sacl-fragment på 2,9 kb blev isoleret fra BamHI-fragmentet klonet fra HSV1-genomet (se ovenfor) i plasmidet pFM3 (se ovenfor) skåret med Sacl. Et Hindlll-BstNI-fragment på 1,6 kb 20 indeholdende hele gD-genet blev subklonet ind i Hindlll-BstNI-nedbrudt pFM42 (EP ansøgning nr. 68693). Dette plasmid blev derpå skåret med Hinfl, gjort stumpt med Klenow-DNA-polymerase og 4 deoxynucleotidtriphosphater og derpå skåret med Hindlll. Hindlll-stump-Hinfl-fragmentet på 960 bp indeholdende det afkortede gD-gen blev isoleret og ligeret til Hindlll-Hpal-bedbrudt pEHBall4. Den resulterende kon-25 struktion (pgDCos-trunc) indeholdt det afkortede gD-gen med hepatitis-B-overfladeantigen-genet ved dets 3’-ende. Et 2,3 kb Hindlll-BamHI-fragment indeholdende det afkortede gD-gen blev isoleret fra pgDCos-trunc. Fragmentet på 2,8 kb indeholdende originet og den tidlige promotor fra SV40 og ampicillinresistens-genet og det bakterielle repliceringsorigin fra pBR322 blev isoleret fra plasmidet pEHBal 14.

30 Fragmentet på 2,1 kb indeholdende muse-dihydrofolatreductase-cDNA-klonen under transcriptionsstyring af en anden SV40-tidlig-promotor blev isoleret fra plasmidet pE348HBVE400D22 (36). Disse 3 fragmenter blev ligeret sammen med T4-DNA-ligase, og den resulterende blanding blev anvendt ved at transformere E. coli stamme 294. Plasmid-DNA fra de resulterende kolonier blev screenet med Sac 2, og den DK 172694 B1 20 korrekte konstruktion pgD-trunc.dhfr (fig. 8) blev anvendt til yderligere transfektions-undersøgelser.

Plasmidet pEHBal 14 blev konstrueret ved spaltning af pE342AR1 (beskrevet 5 nedenfor), en SV40-hepatitis-chimæra, med Xba I, som spalter én gang i kodeområdet for HBV-overfladeantigenet, og derpå sekventielt fjerner sekvenser, der omgiver dette Xbal-center ved anvendelse af nucleasen Bal 31. Plasmidet blev ligeret i nærvær af det syntetiske oligonucleotid 5'-AGCTGAATTC, som forbinder HBV-DNA’en med et Hindi Il-restriktionscenter.

10

Resulterende plasmider blev screenet for et EcoRI-Hindlll-fragment på ca. 150 bp. pEHBal 14 blev sekvensbestemt, hvilket bekræftede, at et Hindlll-center var blevet placeret ved et punkt lige ovenfor, hvor HBsAg-startcodonen normalt findes. Denne konstruktion placerer således et unikt Hindlll-center, som er egnet til kloning ved en 15 position, hvor et hejt udtrykt protein (HBsAg) begynder translation. Alle formodede signaler, som er nødvendige for høj udtrykkelse af et protein, bør være til stede på denne 5'-ledersekvens.

Plasmidet pE342, som udtrykker HBV-overfladeantigen (også betegnet som pHBs348-20 E), er blevet beskrevet af Levinson et al., EP offentliggørelsesskrift nr. 0073656, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning. (Kort fortalt blev originet fra abevirus SV40 isoleret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hindlll og omdannelse af Hindlll-enderne til EcoRI-ender ved tilføjelse af en omsætter (AGCT-GAATTC)). Denne DNA blev skåret med Pvull, og Rl-linkere tilføjet. Efter nedbrydning 25 med EcoRI blev 348 bp fragmentet, der spænder over originet, isoleret ved polyacrylamidgel-elektroforese og elektroeluering og klonet i pBR322. Udtrykkelses-plasmidet pHBs34B-E blev konstrueret ved kloning af 1986 bp fragmentet fra EcoRI-og Bglll-nedbrydning af HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) Acad. Press, N.Y. (1980)) (som spænder over genet, der koder for HBsAg) ind i plasmidet pML (Lusky et al., 30 Nature, 293: 79 (1981)) ved EcoRI- og BamHI-centrene. (pML er et derivat af pBR322, som har en deletion, der eliminerer sekvenser, som er inhiberende for plasmid-replicering i abeceller). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev derpå lineariseret med EcoRI, og 348 bp fragmentet repræsenterende SV40-originområdet blev indført i EcoRI-centret i pRI-Bgl. Originfragmentet kan indtræde i såvel den ene som den anden DK 172694 B1 21 orientering. Da dette fragment koder for både den tidlige og den sene SV40-promotor foruden repliceringsoriginet, vil HBV-gener udtrykkes under styring af såvel den ene som den anden promotor afhængigt af denne orientering (pHBs34B-E repræsenterer HBs udtrykt under styring af den tidlige promotor). pE342 modificeres ved delvis 5 nedbrydning med EcoRI udfyldning i det spaltede center under anvendelse af Klenow-DNA-polymerase I og ligering af plasmidet sammen igen, hvorved man fjerner EcoRI-centret forud for SV40-originet i pE342. Det resulterende plasmid betegnes pE342ÅRI.

Den resulterende sekvens skaber en stopcodon (TAA) umiddelbart efter aminosyre 10 300 i gD-genet. Transcriptionsafslutnings- og polyadenyleringscentrene for afkortet-gD-gen-transcripten er indkodet af det 3'-utransiaterede område af hepatitis-B-overfladeantigen-genet (36).

Den resulterende vektor blev transficeret (40) ind i en dhfr' CHO-cellelinie (39), og der 1 5 blev selekteret en egnet klon gG10.2, som producerede det afkortede gD-protein og secernerede det til det omgivende medium. Proteinet blev ekstraheret fra mediet, og cellerne blev prøvet for immunogenaktivitet. Fig. 9 viser resultaterne af immuno-fældninger af intra- og ekstracellulære 35S-methionin-mærkede ekstrakter.

20 Radioimmunofældning af celleforbundne og secernerede former af gD.

Celler blev dyrket i Ham’s F12-medium (Gibco) suppleret med 7% kommercielt dialyseret føtalt okseserum (Gibco), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 enh./ml). Da kulturerne var omkring 80% konfluente, blev mediet fjernet, cellerne blev 25 vasket to gange med phosphatpufret saltopløsning (PBS), og der tilsattes et mærkende medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium indeholdende 1/10 af den normale koncentration af methionin) til en slutkoncentration på 0,05 ml/cm . Der tilsattes 35S-methionin SJ.204, Amersham Int.) til en slutkoncentration på 50-75 pCi/ml, og cellerne blev dyrket i yderligere 18-20 timer. Efter mærkningen blev mediet indhøstet, 30 og cellerne blev vasket to gange i PBS og fjernet fra kulturskålene ved behandling med PBS indeholdende 0,02% EDTA. Cellerne blev derpå solubiliseret i lysepuffer bestående af: PBS, 3% NP-40, 0,1% okseserumalbumin, 5 χ 10'5 M phenylmethyl-sulfonylfluorid og 0,017 TIU/ml apoprotinin, og det resulterende lysat blev klaret ved centrifugering ved 12000 χ C. Til immunofældningsreaktioner blev cellelysaterne DK 172694 B1 22 fortyndet tredobbelt med PBS, og aliquoter (typisk 180 μΙ) blev blandet med 2-5 μΙ antisera og inkuberet ved 4°C i 30 minutter. For at immunofælde den secernerede form af gD blev 500 μΙ konditioneret medium inkuberet med 2 μΙ antisera i 30 minutter ved 4°C. Immunkomplekser blev derpå adsorberet til fikserede S. aureus celler ved 5 Kessler's metode (40a) og blev udfældet ved centrifugering ved 12000 x G i 30 s. S. aureus cellerne blev derpå vasket 3 gange med vaskepuffer (PBS, 1 % NP-40, 0,3% natriumdodecylsulfat), og immunkomplekserne blev elueret med 20 μΙ polyacryl-amidgel-prøvepuffer (62,5 mM "Tris"-HCI-puffer (pH 6,8) indeholdende 10% glycerol, 5% 2-mercapto-ethanol og 0,01 % bromphenolblåt ved 90°C i 3 minutter. Efter 10 centrifugering i 30 s blev supernatanterne påført 10% polyacrylamidgeler ifølge Laemmli's metode (45). A, immunofældning af fuld-længde membranbundet gD fra gD12-cellelinien. B, immunofældning af den celleforbundne form af det afkortede gD fra lysater af to uafhængigt afledte cellelinier (1 og 2). C, immunofældning af det afkortede gD fra kultursupernatanterne af de to cellelinier fra B. (-) viser kontrol-15 kaninantiserum; { + ) viser kanin-anti-HSV1 -antiserum (Dako Corp.).

Der ses tydeligt en intracellulær form på 35000 dalton og et secerneret og tilsyneladende glycosyleret ekstracellulært gD-protein.

20 Fremstilling af afkortet gD anvendt til immunisering.

gD10.2-celler blev dyrket til konfluens i polystyren-vævskultur-rulleflasker (Corning 25140) i F12-medium suppleret med 7% kommercielt dialyseret føtalt kalveserum, 50 pg/ml streptomycin og 0,3 pg glutamin. Efter at der var nået konfluens, blev mediet 25 fjernet, og cellerne blev vasket 3 gange i det samme medium uden føtalt kalveserum og suppleret med 2 mg/ml Hepes-puffer (serumfrit medium). Cellerne blev derpå dyrket i 3-4 dage i serumfrit medium, og det konditionerede medium blev derpå indhøstet og opbevaret ved -20°C. Mediet blev derpå optøet ved 37°C og centrifugeret ved 5000 omdr./min. i 20 minutter i en Sorvall GS-3 rotor. Efter centrifugeringen blev pellet 30 smidt væk, og supernatanten blev koncentreret i et ultrafiltreringsapparat (Amicon) udstyret med en YM-5 ultrafiltreringsmembran. Det resulterende præparat blev koncentreret omkring 150 gange i forhold til udgangsmaterialet og indeholdt omkring 8 mg protein pr. liter. Præparatet blev derpå dialyseret i udstrakt grad over for DK 172694 B1 23 phosphatpufret saltopløsning (PBS) og anvendt til immunisering uden yderligere rensning.

Immunisering af mus 5

Hver 8 uger gamle BALB/c-mus blev immuniseret med 36 pg protein indeholdt i 200 μΙ af en emulsion bestående af 50% vandigt antigen og 50% "Complete Freund's adjuvant". Hver mus blev immuniseret med flere intradermale og subcutane steder som følger: 25 μΙ i hver bagfodstrædepude, 50 μΙ i halen og 100 μΙ fordelt blandt 3-5 10 intradermale steder langs ryggen. 4 Uger efter den primære immunisering blev musene forstærkningsimmuniseret med 36 pg af proteinet som ovenfor med undtagelse af, at emulsionen blev fremstillet med "incomplete Freund's adjuvant". Til forstærknings-immunisering modtog hver mus 200 μΙ af antigenemulsionen fordelt som følger: 50 μΙ i halen, 150 μΙ fordelt mellem 5 intradermale steder langs ryggen. 19 Dage efter 15 forstærkningen blev omkring 500 μΙ blod opsamlet fra hver mus ved haleaftapning. De sera, som blev opnået fra denne aftapning, blev anvendt til in vitro neutraliseringsundersøgelser (se nedenfor). 37 dage efter forstærkningen blev musene anvendt til virusudsættelsesundersøgelser. Kontrolmus, som passede til forsøgsmusene med hensyn til alder, køn og stamme, blev immuniseret med humant serum-20 albumin (15 pg pr. mus) under anvendelse af den samme forskrift som med forsøgsmusene.

In vitro neutralisering.

25 Sera fra 11 mus immuniseret med koncentreret gD10.2-kultur-supernatant blev prøvet for evnen til at neutralisere HSV1 in vitro. Rækkefortyndet museserum (dobbeltfortyndinger: 1:8 til 1:16384) blev inkuberet med omkring 40 pfu HSV1 i 1 time ved 37°C i Dulbecco's modificerede Eagle’s medium (DMEM). Efter seruminkubationen blev hver fortynding påført omkring 40000 Vero-celler indeholdt i hvert hul på en 96 30 hullers vævskulturplade. Efter 3-4 dage blev virusvækst bestemt ved farvning af hvert hul med 0,5% krystalviolet. Huller hvori der var virusvækst, viste ingen farvning. Neutraliseringstitere blev udregnet ved bestemmelse af den højeste serumfortynding, som forhindrede virusinduceret celledød. Alle prøvede sera (n = 10) fra mus DK 172694 B1 24 immuniseret med gD10.2-supernatantmateriale viste HSV1-neutraliseringsaktivitet (område 1:16 til 1:512) og HSV2-neutra!iseringsaktivitet (område 1:8 til 1:16).

Kontrolmusesera (n = 8) gav ikke nogen neutralisering. Serum opnået fra en mus immuniseret med HSV1 gav en neutraliserende titer på 1:32.

5

Virusudsaettelse 11 mus immuniseret med koncentreret gD10.2-supernatant og 13 kontrolmus immuniseret med humant serumalbumin blev udsat for 10000000 pfu HSV1 10 (Maclntyre-stamme) ved intraperitoneal injektion. 14 dage efter injektionen af virus viste ingen af de gD10.2-immuniserede mus noget tegn på virusinfektion. I kontrolgruppen var 7 af de 13 mus dede ved den 14. dag, 3 viste alvorligt tab og lammelse, og 3 så sunde ud. Statistisk analyse (two tailed Fisher exact test) viste, at forskellen mellem den immuniserede gruppe og kontrolgruppen var signifikant ved 15 niveauet p = 0,002 (se tabel 1).

DK 172694 B1 25

-U

c ω i—i <11 *—I ~ •h o C 4-» u- H c

Ql Q) ¢0 > -1 f-4 e?

X) Ό CD O «—JO O

0) C rH K\ Μ E H (0 c UU- O »I

03 CD f-H μ t—i -H D 4-> >N 01 ΙΛ on 3 E

.-Η > 0) %____ £ (/) 4J X) μ O ^ 6 D

O) φ 4_j >> μ. © © *>> μ E μ <4_ co »—i 4-j u o xrcT* cn © w -h ©

U-) Qj μ t-, U- CD -H H Jj CO W

tø qj.h 1) e οι Ό co co cn co οι οι > ^ ^ ks c ε <h c -4->

Ό “O I O' © CM _C μ 01 CD μ O -H C

ZD ® I o r- (O £0 5 t/S © Ό *<D > d) <*- C (0 x>| -0 3 1o -h ~ in c cl tj^ce

E X O 01 (0 fi) ^ D

C7N 4-> ci c E μ c tø χ:

r-H 01 μ X> X> 4-> CD O ϋ i) 4J

I Ό 0) H <D (0 ro ^ ιΛ C CO CO O) 4-1 G .-H Q E © "O CO ·Η D μ X) -4J β)ΌΗΐ ·η ο ό CEOcn CM <u 4J c 0) O S D -rH fl) 0) Cu c r-H E ·Η >> Ό O £ CT-u> μ D tø

>ΕΟίΛ > 4J .-I C D 03 .H 0) 0) f-4 E

cn æ ·η μ :> ·η u c *-h h-> hh ij x r—t 4J O (/) <001 Q. CJ Q ·*- D -u

CO <*- C

COO) 0) r- H *D cn 0) 01 CO ^ CuH Q)C*- O 4-1 0) C r~i (oh c (o »~< -u o) > h 0) ro <-h c tø © *-< Qic-.c-.cr>>

• -H CC μ O © © X O' fll AJ JJ (0 H

4-1 μ © I «-Η 0) CO C D «Ό >

DVO Ql · “O O r-H «-4 .-4 4-1 μ μ Η .X

dl r-H CO Ω © ^ © © 4-) © O C Os tø c ·· *«η σ> χ © o ε <+-. cn o o 3h

I r—i *—< C D> E 0] ro © ·η E C

·—< CM 1 O (0 4J 01 > O -r-i 0) C E <0 ©

> CO (4 © O © 4-1 c D —» D

-J to·· 4J ^ D O Η (Π OD σε f-t Ό UJ X #—< 3 © X) O .o © Ή © D E © ·Η ©

CD © C C O -O 4-1 r-H ^cH μ D E

< c l·· © <7 © JsC jQ tø

Η- I © Ό O' XJ © ΙΛ > E U( 4J

CM CJ ·—14-)©© ---)0) ©·ΗΟΟ> r-H Q> (0 t-4 Ό > CD θ' Ή μ U_ μ • LO CD J* ® —< E C J] Q. Cl 4-1 CM X E^sT+J ή 410)

0 i—i *D © *© © ·—Η © μ CD C (Ό Ή CM

© ιΑ θ' © μ Q_ μ C <D 41 .* D © CO C O

c·· o ε **- © σ> ©4J εςτόχιο o

1 i-H > 4l © C© O DE

r-H i O lCO©t»-t-* OO) · <4 E o

> VO H 04 HUTJ 4-1 X) Ό O fl) > H

tO t—i > -H 4D D Ή CD © C 4i © I! X·· tO 4-» X) · · μ EH«---1 > •-H x © © σ © > 41 Q) · C G .O © Q.

C E C Ό ί) 05 CL^ 4-> £/) r-H

μ -H *H (0 r-H J* CO© ©QU©jO 41 O O +> Ό η £ tø μ E μ ^H © C ©

c rs <*-C©CQ- D 41 E G Q_ O' G CO D

©o (o μ >s ti ©wc© cn o ro co d © ac 4-1 > G 41 © μ O ·γΗ41 ·η de © •H O © 0) JO μ 4ΐ © μ O) C r <7 2Γ i > 4-1 <4 > O' D O Ή 4-> Ή μ I 3 41 O Ή c 4i c © c -ic 4i-H > o© ε c * · μ c <£ Ω tn μ *h c o 4i <*- μ E ro u-u+j cn x o. c η μ μ ro o >> *h > © © c *o ^ o ^ cn X) 4i4->c ο ~σ μ o · © > μ > > -H C © coco >"->©© s^ > © tt © X Ε *«h μ« co h **h © x> -*i cn <t -η η η η μχ> X)cj4i h ro cn ή -co 41

03 · © © C α Σ J3 CCXC

41 W -H KS μ» u μ w H ^ O tO G D © —' © CD »—i r-H ©Or^oG-rHX > μ- © - c ε σ

< Σ ^H r-H μ <D C- DXJfOECC **H

© 00 rH © o »—Η >> -Η E C -»I H —U~ © c ks ks D μ μ- J3tn 1 ddoiue ή © © so x 41 x «-η μ © o σ © d c C7| (ΟΌηΌ DE tn> © μ jo C 01 jd cn

O D C ·· © SO O O D μ 1/5 >U,DrH*Hr-H -H

© O O 2: © *-H >02 01 Σ © X I-<OCCCO tO

U Os CTS

000 · ·

U- ιΛ ιΛ *—i CM I^S <J

DK 172694 B1 26

Det fandtes, at det afkortede protein frigivet til mediet fra gD10.2-celler var effektivt til at beskytte mus mod en dødelig infektion af HSV1,

Antigenfremstilling til HSV2-virusudsættelse.

5

Forstærkede gD10.2.2-celler, dyrket i nærværelse af 250 nM methotrexat, blev podet i rullekulturflasker (850 cm2) og blev dyrket i Ham's F12-medium (GIBCO) suppleret med 7% fatalt okseserum. Efter at cellerne havde nået konfluens (ca. 3 dage) blev dyrkningsmediet fjernet, cellerne blev vasket 3 gange i phosphatpufret saltopløsning 10 (PBS) for at fjerne serumproteiner, og der tilsattes nyt "serumfrit” dyrkningsmedium.

Det serumfrie medium bestod af Ham's F12-medium indeholdende 25 mM Hepes-puffer. Cellerne blev derpå dyrket i 3 dage, og det resulterende konditionerede medium blev indhøstet og anvendt til antigenfremstilling. Derpå sattes frisk serumfrit medium til cellerne, og kredsløbet med indhøstning af konditioneret medium med 3 dages 1 5 intervaller blev gentaget yderligere 1 eller 2 gange, indtil cellerne døde eller ikke længere hæftede til kulturoverfladen. Det gD10.2.2-konditionerede serumfrie medium blev derpå filtreret og centrifugeret med lav hastighed for at fjerne cellerester, og det resulterende materiale blev koncentreret 10-20 gange med en ultrafiltreringsindretning (YM-IO membran, Amicon). Det koncentrerede medium blev derefter dialyseret natten 20 over imod PBS (3 udskiftninger af PBS, 1 liter pr. udskiftning). Det resulterende materiale blev prøvet for at bestemme proteinkoncentrationen og analyseret ved polyacrylamidgelelektroforese for at bestemme proteinsammensætningen og bedømme præparatets renhed. Det ved denne fremgangsmåde fremstillede materiale blev derpå anvendt til at immunisere dyr mod HSV2-infektion som beskrevet nedenfor.

25

Immunisering af mus mod HSV2-infektion.

40 BALB/c-hunmus blev skaffet fra the Charles River Laboratories (Boston, MA) og blev immuniseret med det secernerede gD-protein (gDtrunc) eller humant 30 serumalbumin (HSA) i en alder på 12 uger. Til den primære immunisering mod det secernerede gD-protein blev antigenet indstillet til en koncentration på omkring 70 pg/ml i phosphatpufret saltopløsning og blev emulgeret med et lige så stort volumen "complete Freund's adjuvant". Hver mus blev derpå immuniseret med 200 μΙ af denne emulsion fordelt som følger: 50 μΙ subcutant ved et sted ca. 1 cm fra haleroden, 26 μΙ DK 172694 B1 27 subcutant i hver bagpotetrædepude og 100 μΙ fordelt blandt 3-5 intradermale steder langs ryggen. Musene blev derpå forstærkningsimmuniseret med det samme antigen 1 måned efter den primære immunisering. Til forstærkningsimmuniseringen blev antigenet fremstillet ved den samme procedure som ved den primære immunisering 5 med undtagelse af, at "complete Freund’s adjuvant" blev erstattet med "incomplete Freund’s adjuvant". Til forstærkningsimmuniseringen blev 200 μΙ antigenemulsion injiceret i hver mus, fordelt som følger: 50 μΙ i halen, 25 μΙ subcutant i den løse hud over hvert lår og 100 μΙ fordelt blandt 3-5 intradermale steder langs ryggen. Kontrolgruppen af mus blev immuniseret ifølge den samme forskrift som forsøgsgruppen af mus med 10 den undtagelse, at humant serumalbumin erstattede det secernerede gD-protein som immunogenet. Serum blev opsamlet fra musene 24 dage efter forstærkningen til anvendelse ved in vitro neutraliseringsundersøgelser.

HSV2-virus-udsættelse.

15 Både forsøgsgruppen (injiceret med secerneret gD) og kontrolgruppen (injiceret med HSA) af mus blev udsat ved en intraperitoneal injektion af HSV2 (MS-stamme) 31 dage efter forstærkningsimmuniseringen. Hver mus modtog 2x10* pfu virus i 100 μΙ Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt 20 okseserum. LD50-forsøg vista, at denne mængde virus repræsenterede 100-500 gange den mængde virus, som kræves til at dræbe 50% af en population af normale (uinjicerede) BALB/c-mus. De virusinjicerede mus blev iagttaget i et tidsrum på 3 uger.

Alle kontrolmusene (injiceret med HSA) døde inden for 9 dage fra virusudsættelsen.

Alle musene, som var vaccineret med det secernerede gD-protein, overlevede alle 3 25 uger og forekom normale (dvs. de viste ikke tab eller lammelse).

DK 172694 B1 28

*-H I I

C -H rH £Ξ 03 4-J (D I fl)

03 XJ CO 4-> E C

Ό CO <D CO D C

03 C lAO ^ ·· E H u β)

(Π O rH 03 ·—l -*H D t-i (D CP

-H > ^ cn

O) CJ U- O

-4-· 1-1 o) CO p—I -t-3 o° 03 "O

-U C-, É-i 4_) tø O fl) ·Η 0) Λ (Λ ^ CO CP CO D> - 0) 0 Ό Ό OJ 0) N £ O ’Π t-· D B O iTN Q Gi Ό CM 3 LO -Η Ό _C 4-i

On E X O C

»—i -4-> E C 03

03 U "D O CO

+JO i)H+JO (U

fl) G} H O dl M C

• 4-> 4joht ><4- a <υ

CM O -H c G) 0) ^ (D 0) CO

·—» E o >>s"Dcau *-h > E O -H -U —I Ct G) <13 UD CO 4J(-(> HC0<-i j~>

X ·—I J* O LO O) H o 4J

tfllkl μ C 0) ·Η RJ

03 03 0) t-< E X> <0 CP _SC L- Η β) E ^ X3 C0HH <D ft) 3 ·—i o i • cm tnctrtHCJocn cm xjq <υ α> i u 03 03 d=> 3 r—i (I) . ό o dc cn

0> H O 0) C-ι > > X

C *-Ηθ Η σι GJ G) Ό ·Η

Il CO C > H G) σ Ό ^ CM CM μ G) J3 > C 03 > H 4-> 03 O CD > —I LO lT\ D Ch 03 O O -J->

W X·· Q30)X?OC7'0)0 M

2 —I C C C O CO C Ω 03 ^ I M GJ <ί Ό CTi 'r-3

CM 03 “O 03 · rH

CD > UjJ Q

rH <j- in gj tu ^ x> to -i-) • O I 10 JC Q L·· D JC 03 4-> CM E *«- 03 tø X) D ·· CP Ό 03 «Π3 > > 03 i—I O GJ b D. C*- 03 W —<

Cl EU- UH D -H

i <r i > d u · 4-> rH CM O ι-H C O 03 · -H C3

> O 5 OsiH G) G) ? U C

CO ^H C/)-H_OX>UC3>n

X·· T 43 Ό COQ3 034J CD

*—< OJ 03 CTH 4-> X3 H c U C ε C Q_ *H 03 4J 03

o Ή Ή U 4-> f-ι CO X

U-O-t->X03(/3X3CP

C K\ O 0) C 4-> CP C C X) 03 o 43 CO U c ·Η H 03

C7 C GJ>G34J4JH£U E

•«H 3 >W^Df-«OC-*t-«0)

-*-> P-ι QCTDO^GIO!/) U

c 4-><t p-iCj^u-^ccnu-H o <t Q LO Ο,Ή C ·Η *H rH L—

CP X C ·Η i-« E «-Η E CO C

;> j* 03 ra o u. pj GJl4>>(|)UtD4J >

ι-H tø 0) X U .U D O

<-H XJ jJ H QJ D «* G3 CO cn X3 · H (U LP C c 43 ro ΙΛ ΙΛ EU U H ^ c 0) C 13 Ή CM D O ^*N O D -H 03 -»-* «te c-- u_ <j _c · ό σ in 0) co -u> c h j* CO C ίΛ ΙΛ Ό O) >» rH 03 0) 03 vO 0\ rH 4-3 4—> 4_)

CJ| W Ό Η Ό O U H

Q DC-03C-HOC03 co c_> O xajrH>0)>u-i/) en «-< σ> <7s o r~- r-- · .

L lO lA rH CM

DK 172694 B1 29

Afkortet glycoprotein D blev renset fra dyrkningsmedium, som var konditioneret ved væksten af den tidligere beskrevne gD10.2-cellelinie. Dyrkningsmediet blev koncentreret ved ultrafiltrering, og afkortet gD blev renset ved immunoaffinitetschromatografi under anvendelse af et monoklonalt anti-gD-1-antistof koblet til "Sephadex® 4BM.

5 Afkortet HSV1-glycoprotein D (gD-1) blev isoleret fra serumfrit medium konditioneret ved væksten af gD10.2-celler som tidligere beskrevet. Celledyrkningsmediet blev koncentreret ved ultrafiltrering under anvendelse af kommercielt tilgængelige membraner (Amicon Corp.) og ammoniumsulfatfældning. gD-1 blev derpå renset til næsten homogenitet ved immunoaffinitetschromatografi. Immunoaffinitetssøjlen blev 10 fremstillet ved kobling af et monoklonalt antistof, produceret over for HSV1, til tværbundet sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) og elueret ved en metode mage til den, som er beskrevet af Axen et al. Nature 214. 1302-1304 (1967). Hovedproduktet i mediet af ufraktioneret dyrkningsmedium konditioneret af gD10.2-cellelinien er den modne afkortede form af gD-1 (omkring 43 - 46 kd) og en forstadieform af gD 15 (omkring 38-40 kd). I gennemsnit repræsenterer gD proteinet 20-50% af det protein, som er til stede i vækstkonditioneret medium. Fraktionering af dette materiale ved immunoaffinitetschromatografi resulterede i en betydelig berigelse på gD. Det kan ses, at det eluerede materiale er frit for alle forurenende proteiner, der er detekterbare ved sølvfarvning. For at bestemme om rensning af proteinet ved denne forskrift 20 denaturerede proteinet eller brød molekylets antigeniske struktur, gennemførtes antigenicitetsundersøgelser med en række forskellige monoklonale antistoffer. Ved disse undersøgelser fandtes, at alle prøvede antistoffer undtagen dem, der er reaktive med carboxylenden, reagerede med det rensede præparat. Der kunne ikke detekteres nogen forskel i antistofbindingsopførsel med det rensede præparat i forhold til 25 materialet, som findes i ufraktionerede kultursupernatanter.

For at bestemme om det rensede gD-1-protein kunne anvendes effektivt som basis for en underenheds-vaccine til at beskytte mod genital infektion med HSV2, blev marsvin vaccineret med gD-1 sammensat i forskellige tilsætningsopløsninger. Ved de første 30 undersøgelser blev renset gD inkorporeret i "complete Freund's adjuvant" og injiceret i intramuskulære og subcutane steder på Hartley-hunmarsvin. Hartley-hunmarsvin, 2 måneder gamle og med en vægt på omkring 250 g, blev købt fra Charles River Laboratories (Portage, Ml). Til undersøgelser under anvendelse af "Freund's adjuvant” bestod den primære immunisering af injektionen af 30 pg gD-1 emulgeret i 50% DK 172694 B1 30 "complete Freund’s adjuvant" fordelt som følger: 0,5 ml injiceret subcutant i den løse hud i nakken og 0,5 ml injiceret intramuskulært i låret. Efter 31 dage blev dyrene forstærkningsimmuniseret med den samme mængde antigen inkorporeret i "incomplete Freund’s adjuvant". Kontroldyrene blev injiceret ifølge den samme forskrift som 5 forsøgsdyrene med den undtagelse, at der blev injiceret tilsætningsopløsning alene.

Forsøgs- og kontroldyrene blev udsat ved intravaginal infektion med HSV2 19 dage efter forstærkningsimmuniseringen. Ved undersøgelser under anvendelse af alun-tilsat gD-1 blev 30 gD-1 inkorporeret i enten alun-phosphat eller alunhydroxid (0,15 ml) anvendt til både den primære immunisering og forstærkningsimmuniseringen. Alun-10 tilsat protein blev injiceret ved intramuskulær injektion i bagbenene. Dyrene blev for- ft stærkningsimmuniseret 51 dage efter den primære immunisering og udsat for levende virus 27 dage senere. Hvert dyr modtog én primær immunisering indeholdende 30 pg renset protein inkorporeret i "complete Freund's adjuvant'" og en forstærkningsimmunisering (31 dage senere) med den samme mængde antigen inkorporeret i 15 "incomplete Freund's adjuvant". Alle dyrene blev udsat ved intravaginal indpodning af HSV2 19 dage efter forstærkningsimmuniseringen. Tabel 3 angiver resultaterne opnået ved disse undersøgelser. Det kan ses, at dyrene vaccineret med gD producerede høje niveauer af antistoffer, som var i stand til at forhindre både HSV1 og HSV2-virus-infektion ved en in vitro virusneutraliseringsprøvning. Det fandtes, at seraene fra disse 20 dyr neutraliserede HSV1 lidt mere effektivt end HSV2. Dette resultat er rimeligt i betragtning af, at immunogenet var afledt fra HSV1, og at der vides at være typespecifikke antigeniske determinanter på gD-1 (Eisenberg, R.J. et al., J. Virol. 35: 428 (1980); Pereira, L. et al., Infect, and Immun, 29: 724 (1980); Showalter, J.D. et al.,

Infect, and Immun. 34^ 684 (1981)). Mere slående var det, at alle dyrene vaccineret 25 med gD-1 var fuldstændigt beskyttet mod de kliniske manifestationer af virusinfektion (dvs. rødme, hævelse, vesikel-dannelse, ulceration, tab af urintilbageholdelse og dødelig encephalitis). 13 Af de 14 dyr, som var injiceret med tilsætningsmiddel alene, udviklede alvorlige primære infektioner. Der var talrige vesikler, som typisk koalescerede til dannelse af akutte ulcerationer. I modsætning hertil gav dyrene vacci-30 neret med gD-1 ingen indikation på virusinfektion. Disse resultater viste klart, at gD-1 inkorporeret i "complete Freund's adjuvant" kan give effektiv beskyttelse mod genital HSV2-infektion.

DK 172694 B1 31

Da "complete Freund’s adjuvant" ikke er acceptabelt til brug hos mennesker, ønskede man dernæst at bestemme, om gD-1 kunne give beskyttelse mod HSV2-infektion, når det blev sammensat med et tilsætningsmiddel, som var egnet til human brug. Til formål blev der igangsat undersøgelser med alun-fældede proteinkomplekser (J.S.

5 Garvey et al., Methods in Immunology (1977), side 185(17)). I tabel 3 sammenlignes resultater opnået under anvendelse af gD-1 inkorporeret i tilsætningsmidlerne alunhydroxid og alun-phosphat. Ved kontrolundersøgelser blev dyr vaccineret med tilsætningsmiddel alene. Det kan ses, at begge de alun-baserede præparater udløste høje niveauer af neutraliserende antistoffer over for HSV1, og at de neutraliserende 10 titere over for HSV1 var sammenlignelige med dem, der blev udløst over for gD-1 inkorporeret i "complete Freund's adjuvant". Imidlertid var titerne af antistof, som var i stand til at neutralisere HSV2, væsentligt lavere med gD-1 inkorporeret i et af alun-præparaterne end med gD-1 inkorporeret i "complete Freund's adjuvant". Dette resultat tyder på, at inkorporering af gD-1 i alun resulterer i tabet af en eller flere 15 antigeniske determinanter fælles for HSV1 og HSV2, eller at genkendelsen af krydsreaktive antigener er mere effektiv, når proteinet er inkorporeret i "Freund's adjuvant". Disse resultater tyder også på, at alun-hydroxid er et mere effektivt tilsætningsmiddel end alunphosphat, da de neutraliserende titere over for HSV1 og HSV2 er væsentligt højere med det førstnævnte end med det sidstnævnte.

20

Selv om den beskyttelse, som gives af alun-tilsætningspræparaterne, var mindre effektiv end den, der opnås med "Freund’s adjuvant"-præparaterne var den ikke desto mindre signifikant. Selv om et antal dyr viste tegn på virusinfektion, var infektionernes alvor betydeligt mindre end den, der blev iagttaget hos kontroldyr injiceret med 25 tilsætningsmiddel alene. Således var middellæsionstallet 0,9 hos dyr vaccineret med alunphosphatvaccinesammensætningen og 0,7 hos dyr vaccineret med alun-hydroxid-vaccinesammensætningen sammenlignet med et middellæsionstal på 3,2 for kontroldyrene injiceret med tilsætningsmiddel. Ifølge 4+ skalaen, der anvendes til bedømmelse af læsionsgrad, svarer reduktionen fra et middellæsionstal på 3,2 til 0,7 30 til en reduktion i kliniske symptomer fra flere store vesikler (bedømmelse på 3) til mindre betydelig rødme og hævelse (bedømmelse på 0,5). Interessant er det, at den gennemsnitlige in vitro neutraliseringstiter over for HSV2 igennem disse undersøgelser korrelerede med alvoren af klinisk sygdom.

DK 172694 B1 32

De ovenfor beskrevne resultater viser, at de kliniske manifestationer af primær genital HSV2-infektion kan reduceres væsentligt ved vaccination med rekombinant gD-1. De opnåede resultater viser, at et enkelt HSV1-afledt glycoprotein kan give fuldstændig beskyttelse mod genital HSV2-infektion, når det indgives i forbindelse med et kraftigt 5 tilsætningsmiddel.

DK 172694 B1 33 C » ·- I to to <} (vi i rg cn ro fy .y C I ~ ~ '4 E r 1 Cg

t 0) H I—1 »—t <—I O fl} E

-o ·—i c -C ro ε tu o +I+I+I+I 4-> -u · jj ό j-> D TD—1+0 TO TO 44 >s 0) tu

H T> tn r-H ΙΛ OJs \0 CO 3 Cn X) CJ P-i P-ι XI

tu ή [i α ---- tu o tu ω tu t-ι Σηυ r-» □ o t'n ι_, p_ ro p- t_, p_ 3T 0>C OU) <3 X) tn CO -4 1-4 o o TO * TO S -~t 44 E + JD Ή ^ · i) D Ή

I 44 —O >-) CO C

c o tu e# r-t o n o jj p -η ^ « oj ti e ή cl tn o r- f— o <u c-< c · > o tu eu ju e "-i o -s ό h or« ro o -4 tu 44 c cl

TO XU Η -H 44 -.4 CO X CO C CL

E Cfl CO r-4 .y 44 01 u —< < ε ti ro _y 44 - to cn u

U ·<4 04 TO TO + ti CO

o +j ro p- «—< ro o TO * ^C C * H 3C 04 > * E .ri . .»V »1 01 itu o o eæ p -ri > "O o _y 10 «I D · 01 * Ll£ tu 44 t n h p j u + oi

3 CLH O KN PD K\ O 44 > --( TO <ί E -H

o e + o\LT><to\ +.xi>-lj x: c >, ro s 3 >s ή ·- u p o C ifl E P- .<0 c_. rH Pj -H>s —I ·Ί E L> α p TO 0) 0-. X) 44 TO o TO CD TO E -4 Λ

^LJ p* * C ^ Cfl Pi TO

ΡΊ TOO 4-J t-ι <r N ΙΛ C OCO-H 4-1

P-U -r4 TO - - - (U TO TO TO C CD TO CO

—i c cl >4J -—i cst *—i σι ^ u Li η οι xj UJ ·*-! o H fsJ CO CO CO > 4-1

OD I O C 44 > +1 Γ^ι + I + t K"\ > —C C TOTO

<c csi>s h m m V V to 4-> to p— c to σ> £ »— i cn x o \o r- --itocncoop· coo ΙΛ C1 CJl c - »s _Q EC CJi O 44 4-i

XI rlrlCM CO iTt VO O Ή 44 C 44 CL

<-<I rH P (4 44 ---TO Ή W 44 E

44 tu O TO CL > o >.

TOO -Hina OD N N CO E TO TO - TO CO

44 x c: *h »—t - - »—t >s .m p o t-ι X) co .—t —- o c4 —t tu to tn jc tu toto c e ro -4 σ> η m .. h >x> TO TOt4> +1 M +1 +1 n S TO44CUTOP- m C 44 LO V V CO 04 CO X> TJ 4400

C 3 X ri CN1 cts (4 W E C + TO O

x> TOTO - - - CU^OPjTO^ c Γ.

o o c cn cn o X) 44 tu 44 cn E ,-t c 44 E 44 ... tu 44

O (0>sETOP (4(U

c to to o p- tu X) t-i

•ro c tn » (Λ O' □ σι r-ι CD to C —I O TO

> 1-4 -H -TO C -HTO-y 3 <0 -H 44 f—t — £ »4 > t->

t-> P4 TO E E CO TO TO

TO 01 4HDCII01 >-1(0

E 44 TJ to E H 4) (O 5 JD JD

S OT *»4 TO -r-lSTOcn o P- 44 XI >t C »—t X >s · .CD r—t

TO C CL O TO tOTO^-tD^sE CD 1—I

CO <0 OT 04 -4 p o c 01N i) 4) ttl TO - > O X> CO 44 O TO CD 0044 10 X) 3 _C >s 3 > r-1 00 tJs »CD C 10

•“I C 'r~> Q. X 44 TO 0)4)440- OC

<U O Ό I I TO C 4 4C 0)-— -HO

44 <v a c c r: jdtoeto to —t

44 O4 3 3 CL O P- ε r~ ^4 fj CO

c u. = ro *-4 *-4 tn t4 c c Q σ' cn · ^4W

uc to = 44 - ro ro o 44 -4 -4 xj 4s o t-< .—i ·—t tn ocxj x *h p> to to c to to to o—c roe -4 -^t cl > cn 3 .o · c -aro cn c > 3 TO I C-ι t-< I sO - O XI -4 3 —t 3 TO C -4 --4 C C 10 '4 4 <1 + 4 -4 to ε i-^utoi 13 >-4 ς 5 + 4 n μ s:e E Χ)Χ>ίι_>-ΙΟΩ^4 * 4 u a : to σι σ 10 » * + DK 172694 B1 34

Fordelene ved at anvende det afkortede protein til diagnostiske og vaccineanvendelser er, at det, fordi det er secerneret til det ekatracellulære medium, er forurenet med langt færre proteiner, end der ville findes i et hel-celle-præparat.

5 Det vil bemærkes, at der ifølge den foreliggende opfindelse anvendes en permanent cellelinie til at producere proteinet. Ved transfektion inkorporeres vektoren i celleliniens genom og kan producere proteinet uden cellelyse. Cellelinien kan således anvendes til kontinuert produktion af proteinet, især i den afkortede form, som secerneres fra cellen. F.eks. kan cellerne, der udtrykker afkortet protein, kontinuerligt anvendes i et 10 perfusionssystem ved konstant at fjerne antigenrigt medium fra cellerne og erstatte det med frisk medium.

Den bestemte, her anvendte cellelinie var en CHO-linie, som var deficient med hensyn til dhfr-produktion, transficeret med en vektor indeholdende en dhfr-markør. Ved at 15 udsætte cellelinien for methotrexat (Mtx) under egnede betingelser (54) kan dhfr- produktionen og dermed den forbundne gD-produktion forstærkes. Tre cellelinier afledt ved transfektion af afkortet gD-genet ind i dhfr CHO-celler blev udpladet parallelt, mærket med ^S-methionin og immunofældet som beskrevet i fig. 2. Banerne 1 og 2 angiver mængden af secerneret gD immunofældet fra 500 μΙ dyrkningsmedium 20 konditioneret af to uafhængigt isolerede cellelinier før selektion med methotrexat. Bane 3 angiver mængden af afkortet gD immunofældet fra et lige så stort volumen dyrkningsmedium fra en cellelinie (gD10.2.2) selekteret for vækst i 250 nM methotrexat. Kanin-anti-HSV1-antistoffer (Dako Corp.) blev anvendt til immunofældningerne, der er vist i bane 1-3. Bane 4 repræsenterer en kontrolimmunofældning af 500 μΙ 25 medium konditioneret af gD10.2.2-cellelinien med normalt kaninserum.

For at kvantificere de relative mængder af afkortet gD secerneret til dyrkningsmediet af cellelinier før og efter selektion i methotrexat gennemførtes en kompetitiv ELISA-prøvning. gD12-celler, der udtrykte en membranbundet form af gD, blev udpladet på 30 og fikseret med glutaraldehyd til overfladen af 96 hullers mikrotiterplader som tidligere beskrevet. Konditioneret medium fra forskellige cellelinier, der var kendt for at producere det afkortede gD, blev rækkefortyndet hen over mikrotiterpladen og blev inkuberet med en fikseret mængde (2 μΙ) kanin-anti-HSV1-antistof (Dako Corp.) i 1 time ved 20°C. Ubundet antistof og opløselige afkortet-gD-antistof-komplekser blev DK 172694 B1 35 fjernet ved vaskning af hvert hul 3 gange med PBS. Peberrod-peroxidase koblet til gede-antikanin-lgC blev derpå omsat med de fikserede celler i 1 time ved 20°C, og ubundet antistof blev fjernet ved vaskning 3 gange med PBS. Det kolorimetriske substrat, OPD (o-phenylendiamin), sattes derpå til hvert hul og fik lov at reagere med 5 de bundne peberrodperoxidase-antistof-komplekser i 15 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af svovlsyre til en slutkoncentration på 0,25 N. Absorbansen af OPD'et i hvert hul blev bestemt ved anvendelse af en automatiseret mikro-titerpladescanner {Titertek multiskan), og der afsattes fortyndingskurver. Bindingen af anti-HSV1-antistoffer til udgangs-CHO-cellelinien blev anvendt til at måle graden af 10 ikke-specifik binding ved hver fortynding. Mængden af afkortet gD i hver kultursupernatant var omvendt proportional med mængden af absorbans i hvert hul.

Åben cirkel, binding af anti-HSV1-antistoffer til gD12-celler i nærværelse af medium konditioneret af celler, der secernerede afkortet gD før forstærkning med methotrexat.

Lukket cirkel, binding af anti-HSVI-antistoffer til gD12-celler i nærværelse af medium 15 fra gD12.2.2-celler selekteret for vækst i 250 nM methotrexat. Åbent kvadrat, binding af anti-HSVI-antistoffer til gD12-celler i nærværelse af 100 gange koncentreret medium fra uforstærkede celler, der secernerede afkortet gD. Denne procedure blev udført gD10.2-cellellnien for at producere en forstærket cellelinie gD10.2.2, som var i stand til at vokse i 250 nM methotrexat, og som secernerede omkring 20 gange mere 20 afkortet gD til dyrkningsmediet end udgangs-gD10.2-cellelinien (se fig. 10 og 11).

dhfr-markør/forstærknings-systemet kan anvendes med andre celler, som er i stand til at optage og stabilt inkorporere fremmed DNA.

25 Opfindelsens succes med at påvise, at en afkortet form af et membranbundet protein, der mangler den del af det hydrophobt-hydrophile carboxylterminale område, som er ansvarligt for at binde det til membranen, alligevel kan være immunogen, viser, at lignende resultater kan forventes med andre immunogene membranbundne proteiner, der således tilvejebringer en forbedret kilde til vaccine over for virus, parasitter og 30 andre patogene organismer.

I det ovenstående eksempel var DNA'en, der koder for gD-proteinet, afkortet ved rest nr. 300, fordi der var et hensigtsmæssigt restriktionssted der. Dette havde det resultat, at det carboxylterminale hydrophobt/hydrophile område blev fuldstændigt DK 172694 B1 36 fjernet, som det kan ses af hydropatikurven i fig. 2; faktisk blev et yderligere foranliggende område fjernet fra rest 301 til rest 332, uden at det øjensynligt ødelagde proteinets immunogene karakter. Det synes at følge heraf, at graden af afkortning i dette protein og sandsynligvis i andre immunogene membranbundne proteiner, om 5 ønsket, kunne være betydeligt mindre, så længe det har den virkning at fjerne den membranbindende karakter, således at proteinet secerneres til det omgivende medium.

EKSEMPEL 2 10 Dette eksempel omhandler et HSV2-gC-protein (tidligere betegnet som et gF-protein).

Celler, virus og DNA-isolering.

HSV2 (stamme G) blev dyrket på HEp 2 celler efter inficering af cellekulturen ved en 15 input-multiplicitet på 0,1 i 3 dage ved 33°C i Dulbecco's modificerede Eagle’s medium indeholdende 10% føtalt okseserum og antibiotika. HSV2-DNA blev isoleret ved nedbrydning med proteinase K efterfulgt af CsCI-ultracentrifugering som beskrevet (23).

20 DNA-manipulationer.

Restriktionsenzymer, DNA-polymerase-Klenow-fragment, T4-DNA-ligase og 14-polynucleotidkinase blev købt fra Bethesda Research Labs og blev anvendt ifølge leverandørens retningslinier.

25

Molekylær kloning af HSV2-DNA-restriktionsfragmenter.

EcoRI-"P"-fragmentet, som svarer til den tilnærmede kortposition ca. 0,650 i HSV2-genomet, blev isoleret fra EcoRl-nedbrudt HSV2-DNA på 5% acrylamidgeler. Det 30 isolerede fragment blev klonet ind i EcoRI-nedbrudt pUC9 (28). Dette plasmid blev kaldt pUC-RIP.

pUC-RIP-subklonen blev derpå anvendt til at lokalisere et Sacl-fragment af HSV2-genomet, som indeholdt EcoRI-’P'’-fragmentet. Southern-blottingforsøg (27) viste, at DK 172694 B1 37 et 4,9 kb Sacl-fragment af HSV2 indeholdt EcoRI-"P"-fragmentet. Dette fragment blev isoleret på 0,7% agarosegeler og blev klonet ind i et fra pBR322 afledt plasmid, som indeholdt et unikt Sacl-center (55). Dette plasmid blev kaldt pBRSacl-”E". Yderligere restriktionsenzymanalyse af pBRSacl-"E" påviste et 2,9 kb Sall-fragment med 5 sekvenser homologe med EcoRI-"P"-fragmentet, som var subklonet ind i Sall-nedbrudt pUC9 som beskrevet ovenfor. Dette plasmid blev kaldt pgC2Sal2.9.

DNA-sekvensanalyse af klonet HSV2-DNA.

10 Hovedparten af DNA-sekvenserne blev bestemt under anvendelse af dideoxynucleotid-kædeafslutnings-teknikken. Forskellige fragmenter blev subklonet ind i den replikative form af m 13-fag-vektorerne mp7, mp8 og mp9, og DNA-sekvensen blev bestemt som tidligere beskrevet (29). I nogle tilfælde blev fragmenter 32P-mærket ved deres 5'-ender med γ32Ρ-ΑΤΡ og T4-polynucleotidkinase, og fragmentets DNA-sekvens blev bestemt 15 ved anvendelse af den kemiske degradationsmetode (56). Datamatassisteret analyse af DNA- og protein-sekvesadata blev gennemført under anvendelse af HOM-programmet (57). Hydropatien af de afledte aminosyresekvenser blev analyseret under anvendelse af en bredde på 12 aminosyrer og et spring på 1 (31a).

20 Southern-blottinganalyse af HSV2-DNA.

Restriktionsendonuclease-nedbrudt HSV2-DNA og plasmid-DNA blev fraktioneret på 1,5% agarosegeler og afduppet på nitrocellulose under anvendelse af standardprocedurer. De enkeitstrengede ender af Sac2-fragmentet, markeret med en 25 stjerne i fig. 12, blev udfyldt med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I, og det resulterende stumpendede fragment blev ligeret til Smal-nedbrudt replikativ form af ml3mp7 (29) med T4-DNA-ligase. Den enkeltstrengede DNA fremstillet ud fra denne ligering og transfektion blev anvendt som skabelon for syntesen af 32P-mærket enkeltstrenget sonde-DNA med hej specifik aktivitet (1 χ 109 cpm/pg) under 30 anvendelse af Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I. Hybridiseringer blev gennemført under anvendelse af standardprocedurer (27, 58).

DK 172694 B1 38

Resultater

Molekylær kloning af gF-kodningsområdet af HSV2-genomet.

5 Den strategi, som blev antaget til isolering af gF-genet fra HSV2, var baseret på den antagelse, at dette gen var colineært med HSV1-gC-genet. Denne antagelse blev understøttet af den nylige erkendelse, at et 75000 dalton glycoprotein, gF, med antigenisk beslægtethed til HSV1 glycoprotein C findes i HSV2, og at genet for dette protein er tilnærmelsesvis colineært med HSV1-gC-genet (22d, 59). Desuden tydede 10 isoleringen af et monoklonalt antistof, som binder til både HSV1-gC og HSV2-F, yderligere på at disse to proteiner kan være homologe med hinanden (22f). Det blev således besluttet, at DNA-sekvensanalyse af det HSV2-genomiske område, som er colineart med HSV1-gC-genet, ville resultere i afledningen af proteinsekvens-information, som ville lokalisere HSV2-gF-genet.

15 600 bp EcoRI-"P"-fragmentet af HSV2-genomet er blevet vist at høre til i position ca.

0,650 på kortet (12). Dette område er tilnærmelsesvis colineart med det kendte kodeområde for HSV1-gC-genet, som ligger mellem ca. 0,630 og ca. 0,640 på kortet over HSV1-genomet (59). Dette fragment blev isoleret fra en EcoRI-nedbrydning af 20 HSV2-DNA klonet i plasmidet pUC9 (28), og dets DNA-sekvens blev bestemt (29, 56). Sammenligning af den resulterende sekvens med HSV1-gC-sekvensen (59) afslørede en betydelig grad af sekvenshomologi mellem EcoRrP"-fragmentet og 3'-enden af HSV1-gC-kodeområdet. Således blev EcoRI-"P"-fragmentet derefter anvendt som sonde til at isolere et Sacl-restriktionsendonucleasefragment fra HSV2-genomisk DNA, 25 der overlappede EcoRI"P”-fragmentet tilstrækkeligt til at inkludere resten af HSV2-genet, som var homologt med HSV1-gC-genet. Fig. 12 belyser de trin, der blev foretaget for at isolere et 2,9 kb Sall-fragment fra HSV2-genomet, som indeholdt EcoRI-"P"-fragmentet, og som blev anvendt til efterfølgende DNA-sekvensanalyse.

30 DNA-sekvensanalyse af EcoRI-"P"-området i HSV2-genomet.

Sacl-"E"-fragmentet på 4,3 kb, som blev isoleret fra HSV2-genomet baseret på dets sekvenshomologi med EcoRrPMragmentet, blev yderligere nedbrudt til opnåelse af et 2,9 kb Sall-fragment, som blev betegnet pgC2Sal2.9. Fig. 12 belyser fragmenterne fra DK 172694 B1 39 pgC2Sal2.9, som blev underkastet DNA-sekvensanalyse under anvendelse af enten dideoxynucleotid-sekvensbestemmelsesproceduren (29) eller den kemiske degradationsprocedure (56). Desuden viser denne figur positionen af EcoR I-" P"- fragmentet i pgC2Sa12.9 såvel som positionen af et Bg1 Il-center, der svarer til den højre ende af 5 Bglll-"Nn-fragmentet ved position ca. 0,628 i HSV2-genomet (12).

Specifikt viser fig. 12 kloningen af pgC2Sal2.9, det HSV2-område, som ligger colineært med HSV1-gC på kortet. Området af HSV2-genom-kortlægningen fra ca.

0,61 til ca. 0,66 blev klonet som et Sacl-fragment (pBRSac-"E") under anvendelse af 10 600 bp EcoRI-" P"-fragmentet som sonde. En Sall-subklon af pBRSac-”E", pgC2Sal2.9, blev anvendt til DNA-sekvensanalyse. Pile henfører til de sekvensbestemte områder, og lokaliseringen af en større åben aflæsningaramme på 479 aminosyrer afledt fra sekvensen er belyst. Forskellige restriktionscentre er belyst, herunder EcoRI-centrene, som afgrænser EcoRI-"P"-fragmentet, og det Bglll-center, som findes ved den højre 15 ende af Bglll-"N”-fragmentet (kort position ca. 0,628) (26). Sacll-fragmentet markeret med en stjerne (*) blev anvendt ved Southern-blottingforsøg for at undersøge den deletion, som viser sig i dette område (se resultater). Andre centre blev anvendt til DNA-sekvensbestemmelsesforsøg. Sm: Smal, Sa: Sac2, Rs: Rsal, Bg: Bgl2, Pv: Pvu2, RI: EcoRI.

20

Fig. 13 belyser DNA-sekvensen opnået fra pgC2Sa12.9 sammenlignet med DNA-sekvensen af HSV1-gC-området (59). HSV1-gC-området (HSV-I) og sekvensen opnået fra pgC2Sal2.9 (HSV-2) blev sammenlignet under anvendelse af HOM-programmet (57). Eftersom forskellige deletioner blev udnyttet til at maksimere 25 sekvensoverlapning, er alle positioner, herunder mellemrum, blevet nummereret for tydeligheds skyld. Stjerner er anbragt over ikke-overensstemmende nucleotider. Den understregede "A"-rest ved position 43 i HSV1-sekvensen er det omtrentlige transcriptionsstartcenter for gC-mRNA’en (59). "TATA" 1 og TATA" 2 er de sandsynlige transcriptionsstyringsområder for henholdsvis HSV1-gC-mRNA'en og 730 30 base mRNA'en (59, 60). Den indsatte T-rest ved position 1728 i HSV1-sekvensen blev opdaget ved gentagen sekvensbestemmelse af dette område (M. Jackson, upubliceret) og fandtes at indføre en i-fase stopcodon ved positionerne 1735-1737, som var homolog med stopcodonen forden større åbne HSV2-aflæsningsramme. Positionen af DK 172694 B1 40 730 base mRNA-startcodonen i HSV1 er vist ved position 2032-2034 ligesom positionen af en anden HSV2-startcodon ved position 1975-1977.

I fig. 13 blev den belyste afledte sekvens af HSV2 sammenlignet med DNA-sekvensen 5 af gC-genområdet i HSV1 (59), som viste, at den samlede sekvenshomologi mellem disse to fragmenter var omkring 68%. Imidlertid viste visse områder af sekvensen enten en meget højere eller en lavere grad af sekvenshomologi end andre. F.eks. viste sekvenserne mellem positionerne 0 og 570 i HSV1- og HSV2-sekvenserne kun 51 % homologi, medens området mellem position 570 og 1740 viste en meget højere grad 10 af sekvenshomologi (80%). Et yderligere hcjhomologt område (70%) fandtes også ved enden af de to sekvenser fra position 1975 til position 2419. Foruden nucleotid-sekvensændringerne viste de to genomer forskellige deletioner eller indsætninger, når de blev sammenlignet med hinanden. Den mest bemærkelsesværdige var et 81 bp område ved position 346-426 i HSV1-gC-sekvensen, som mangler i HSV2-genomet.

15 Af denne samlede sekvenssammenligning fremgår det, at der var en høj grad af sekvenshomologi mellem HSV1-gC-området og det her sekvensbestemte HSV2-område.

Frink et al. (59) har fundet, at 5'-enden af den 2520 base mRNA, der koder for HSV1-20 gC, rækker til den understregede A-rest ved position 43 i fig. 13. Desuden udpegede de en AT-rig "TATA"-kasse-sekvens (60) omkring 22 bp 5' for denne rest. Sammenligning af de to i fig. 13 viste sekvenser viser, at HSV1- og HSV2-sekvenserne begge indeholdt den identiske sekvens CGGGTATAAA, i dette område. Denne sekvens er identisk med den, der er rapporteret tidligere af Whitton et al. (61), som er fundet at 25 forekomme ved "TATA"-kasse-områderne i mange af de hidtil bestemte HSV1- og HSV2-sekvenser. Denne bevarede sekvens efterfølges også af et G-rigt område i begge virusgenomer. Foruden dette formodede transcriptionsstyringsområde fandtes en anden "TATA"-kasse i begge sekvenser ved position 1845-1849 i fig. 13. Denne anden "TATA"-kasse er blevet foreslået at styre transcriptionen af en 730 base mRNA 30 i HSV1-genomet (59).

Både HSV1 og HSV2 indeholder denne sekvens omgivet af GC-rige flankerende sekvenser, inkluderende en CGGGCG-sekvens, som minder om den CGGG-sekvens, der går forud for den første "TATA"-kasse. Desuden koder begge genomer for åbne i DK 172694 B1 41 aflæsningsrammer 3' for disse andre "TATA" kasser, som det vil blive omtalt nedenfor.

For at bestemme om den ovenfor beskrevne 81 bp deletion virkelig fandtes i HSV2-5 genomet, eller om den var et kunstprodukt af kloning eller sekvensbestemmelse, gennemførtes Southern-blottinganalyse af den HSV2-genomiske DNA og den klonede HSV2-DNA. En 32P-mærket blev fremstillet ud fra et Sac2-fragment (se fragmentet i fig. 12), som spænder området, der mangler de 81 nucleotider. Hvis den HSV2-genomiske DNA mangler 81 bp området, så vil et Smal-Bglll-fragment, som spænder 10 over det område, være på 576 bp, et Smal-fragment vil være på 662 bp, og et Sac2- fragment vil være på 195 bp.

Fig. 14 belyser Southern-blottinganalyse af HSV2-genomisk DNA og pgC2Sal2.9-DNA.

Området, der spænder over 81 bp området, som mangler i den i fig. 13 viste HSV2-15 sekvens (HSV2-positionerne 346-426), blev analyseret under anvendelse af Sac2-fragmentet mærket med en stjerne i fig. 12, som overlapper det deleterede område.

Banerne 1-3 er restriktionsnedbrydninger af HSV2-genomisk DNA, og banerne 4-6 er restriktionsenzymnedbrydninger af pgC2Sal2.9. De nedbrudte DNA'er blev underkastet elektroforese på 1,5% agarosegeler, denatureret, afduppet på nitrocellulose og 20 sonderet med det 32P-mærkede Sac2-fragment. (Pilene viser positionen af 564 bp Hindi Il-fragmentet af fag-X-DNA.) Bane 1, 6: Saml -t- Bgl2; bane 2, 5: Smal; bane 3, 4: Sac2.

De i fig. 14 viste resultater påviser, at de forudsagte restriktionscentre omgav 25 området, der manglede de 81 basepar, i både den HSV2-genomiske DNA og den klonede HSV2-DNA. Desuden vandrede de HSV2-genomiske fragmenter og de klonede fragmenter nøjagtigt sammen, hvilket påviser, at deletionen ikke er et kunstprodukt af kloning eller sekvensbestemmelse.

30 Analyse af den større åbne aflæsningsramme i HSV2-Sall-fragmentet på 2,9 kb

Analyse af de potentielle kodesekvenser i 2,9 kb Sall-DNAfragmentet af HSV2 afslørede en åben aflæsningsramme på 479 aminosyrer, som begyndte med methioninet indkodet ved positionen 199-201 af den i fig. 13 viste HSV2 sekvens og DK 172694 B1 42 endte med TAA-afslutningskodonen ved position 1735-1737 af HSV2-sekvensen i denne figur. Som det kan ses af fig. 13, starter både HSV1-gC-proteinet og den åbne HSV2-aflæsningsramme ved omkring samme position i de to sekvenser i forhold til "TATA"-kasse-homologierne. Desuden har det vist sig, at medens det oprindeligt 5 syntes, at den åbne HSV2-aflæsningsramme fundet i dette område sluttede 12 codoner før HSV1-gC-genet, så har gentagen sekvensbestemmelse af det carboxylter-minale område af gC-gensekvensen (M. Jackson, upubliseret) af HSV1-stamme F afsløret, at den af Frink et al. (59) rapporterede sekvens manglede et thymidin-nucleotid efter position 1727, og at indsætning af denne rest resulterede i et trans-10 lateret HSV1 -gU-protein, der sluttede på samme sted som den åbne HSV2- aflæsningsramme (1735-1737 i fig. 13). Når man således tager de forskellige deletioner og indsætninger i betragtning, som belyst i fig. 13, viser HSV1-gC-genet og den åbne HSV2-aflæsningaramme en meget høj grad af overlapning.

15 Fig. 15 belyser translation af den store åbne HSV2-aflæsningsramme og sammenligning med HSV1-gC-aminosyresekvensen. Der anvendtes enkelt-bogstavsaminosyresymbolerne. HSV-I gC henfører til HSV1-gC-sekvensen, og HSV-2 gF henfører til den åbne HSV2-aflæsningsramme-sekvens. Proteinerne blev sammenlignet under anvendelse af HOM-programmet, som maksimerede homologier ved at 20 indsætte åbninger, hvor det var nødvendigt (57). Stjerner er placeret over ikke- homologe aminosyrer. Formodede N-forbundne glycosyleringscentre (NXS eller NXT) (62) er gråtonede, og cysteinrester (C) er indrammede. Kun aminosyrer og ikke mellemrum er nummeret. 15B belyser translationen af den anden åbne HSV2-aflæsningsramme og sammenligning med 730 base mRNA-HVSI-proteinet. HVS-2 730 25 bp ORF er den ufuldstændige aminosyresekvens af den anden åbne HSV2- aflæsningsramme fra position 1975 til position 2406 af den i fig. 13 viste HVS2-sekvens. HVS-I 730 bp ORF er aminosyresekvensen afledt for det protein, der er indkodet af 730 base mRNA'en for HSV1 (59). Bevarende aminosyreændringer med hensyn til ladning er mærket (C) og ikke-bevarende ændringer med hensyn til ladning 30 er mærket (N) i både fig. 4A og 4B.

Fig. 15 belyser den høje grad af sekvenshomologi mellem HSV1-gC-genet og den åbne HSV2-aflæsningsramme på 479 aminosyrer. De første 19 aminosyrer indeholder omkring 80% sekvenshomologi, hvor ændringerne i de første 25 aminosyrer alle er DK 172694 B1 43 bevarende med hensyn til ladning. Fra rest 124 i HSV1-gC (rest 90 i HSV2-sekvensen) til enden af begge proteiner er der omkring 74% sekvenshomologi, hvor 75% af aminosyreændringerne er bevarende med hensyn til ladning. Fem formodede N-forbundne glycosyleringscentre (NXS eller NIXT (62)) er bevaret mellem de to 5 proteiner, og alle syv cysteinrester er lokaliseret i homologe positioner i forhold til den C-terminale ende. Foruden den samlede bevarelse af sekvenser i de carboxyterminale 3/4 af proteinerne er der også store områder af sammenhængende aminosyresekvenshomologi med en længde på op til 20 rester (dvs. position 385-405 i HSV1 -sekvensen og 352-372 i HSV2-sekvensen). Det kan konkluderes af denne 10 sekvenssammenligning, at den åbne aflæsningsramme i dette område af HVS2-genomet koder for et protein, som er homologt med HSV1-gC.

Medens HSV2-proteinet, som dette områder koder for, viser en betydelig grad af sekvenshomologi med HSV1-gC-sekvensen, er der flere bemærkelsesværdige forskelle 15 mellem de to sekvenser. Den mest slående forskel er en deletion af 27 aminosyrer i HSV2-sekvensen, som findes i HSV1-gC-sekvensen fra rest 50 til rest 76 (fig. 15), og som svarer til den ovenfor beskrevne 81 bp deletion. Foruden denne store deletion viser begge sekvenser mindre deletioner på en eller to aminosyrer. Alle disse deletioner findes i de aminoterminale områder af proteinerne. Foruden disse deletioner er der et 20 stort antal aminosyreændringer i proteinernes aminoterminale område, som er klumpet sammen mellem resterne 29 og 123 i HSV1-gC-sekvensen (resterne 31-90 i HSV2-sekvensen). Kun 30% af aminosyrerne i dette område er homologe, og meget af denne homologi skyldes bevarede prolinrester. 43% af aminosyreudskiftningerne i dette område er ikke-bevarende med hensyn til ladning. De eneste andre områder, som 25 viste et så stort antal ændringer, er et carboxyl-terminalt hydrophont domæne (resterne 476-496 i HVS1-sekvensen og 443-463 i HSV2-sekvensen), hvor proteinerne er 55% homologe, men hvor alle ændringerne er bevarende, uladede, hydrophobe aminosyrer, og proteinernes carboxylender, hvor sekvenserne kun er 25% homologe, men hvor den samlede aminosyresammensætning minder om hinanden (resterne SOOSO 512 i HSV1-sekvensen og 467-479 i HSV2-sekvensen). Medens 5 af de formodede N-forbundne glycosyleringscentre er bevaret mellem de to proteiner, indeholder HSV1-gC-sekvensen to flere centre end MSV2-sekvensen (i alt ni mod syv). HSV1-gC-sekvensen indeholder 2N-forbundne glycosyleringscentre i de 27 aminosyrer, som er deleteret fra HSV2-sekvensen og et overlappende par centre mellem resterne 109 og DK 172694 B1 44 112 i fig. 15. HSV2-sekvensen indeholder 2N-forbundne glycosyleringscentre, som ikke findes i HSV1-sekvensen, hvoraf det ene er proksimalt ti! aminoenden.

For mere fuldstændigt at undersøge de mulige strukturelle homologier mellem HSV1-5 og HSV2-sekvenser gennemførtes en hydropatianalyse (31a). Fig. 6 belyser hydropatianalysen af HSV1-gC-proteinet og proteinet indkodet af den større åbne HSV2-aflæsningsramme. Hydropatien af hvert protein blev bestemt under anvendelse af programmet angivet af Hopp og Woods (31a). Hydrophobe områder er over midterlinien og hydriphile områder er under midterlinien. Strækninger på 12 aminosyrer 10 blev analyseret, og gennemsnitshydropatien blev udregnet. Formodede asparagin-forbundne glycosyleringscentre (62) er mærket (0). gC-l: HSV1-gC-protein-hydropati. gC-2 (gF): hydropati af proteinet indkodet i den større åbne HSV2-aflæsningsramme.

Fig. 16 viser, at begge proteiner udviste en yderst høj grad af strukturel homologi 15 baseret på aminosyresekvensernes hydrophile og hydrophobe egenskaber. Hvert viser et N-terminalt hydrophobt domæne efterfulgt af en strækning af hydrophile aminosyrer, som indeholder enten 6 af i alt 9 (HSV1) eller 3 af i alt 7 (HSV2) formodede N-forbundne glycosyleringscentre. Toppene og dalene, som følger dette hydrophile område, er meget ens i begge proteiner, inklusive det hdyrophile domæne 20 indeholdende det afsluttende N-forbundne glycosyleringscenter. Begge proteiners carboxylender viser et meget hydrophobt område på 20 rester efterfulgt af en hydro-phil carboxylende. De 27 på hinanden følgende aminosyrer, som findes udelukkende i HSV1-gC-proteinet, viser sig at kode for et relativt hydrophilt område mellem resterne 50 og 76 (fig. 16). Som konklusion afslører denne analyse, at hydropatitrækkene ved 25 HSV1-gC- og HVS2-proteinerne er meget ens, og at de mindst bevarede aminotermi-nale områder af proteinerne findes i hydrophile områder, som har evnen til at blive stærkt glycosyleret.

Analyse af den anden åbne HSV2-aflæsningsramme 30

Translation af de sidste 431 basepar af den i fig. 13 viste HSV2-sekvens (resterne 1975 - 2406) afslørede en anden åben aflæsningsramme på 105 aminosyrer. Selv om den her rapporterede sekvensinformation er utilstrækkelig til at indeholde hele den anden åbne HSV2-aflæsningsramme, afslørede en sammenligning af denne sekvens DK 172694 B1 45 med den åbne aflæsningsramme, som er indkodet af 730 base mRNA'en for HSV1, som rapporteret af Frink et al. (10), også en høj grad af sekvenshomologi. Som det kan ses i fig. 15B, viste de to sekvenser 75% sekvenshomologi i de overlappende områder, hvor omkring 90% af aminosyreændringerne var bevarende med hensyn til 5 ladning. Hovedforskellen mellem de to sekvenser var et 19 aminosyrer langt N-terminalt område, som fandtes i HSV2-sekvensen, men ikke i HSV1 -sekvensen. Selv om funktionen af det i dette område indkodede protein er ukendt, viste proteinerne fra HSV1 og HVS2 således en betydelig grad af sekvenshomologi.

10 Diskussion

De ovenstående resultater viser, at HVS2-genomet koder for en colineært kortlagt homolog til HVS-glycoprotein C. Colineariteten af de her fundne sekvenser bestyrkes ved fundet af en sekvens 3' for den større åbne HSV2- aflæsningsramme, som 15 øjensynligt koder for en homolog til 730 base mRNA'en for HSV1 (10). Tidligere kortlægning af HSV2-gF-genet (33) sammen med de her beskrevne egenskaber for den større åbne aflæsningsramme i dette område af HSV2-genomet inkluderende flere potentielle N-forbundne glycosyleringscentre og en tilsyneladende aminoterminalsignalsekvens (5) såvel som et formodet carboxyl terminalt 20 transmembrandomsne (28) tillader den konklusion, at det her beskrevne HSV2-protein er glycoproteinet gF. Desuden er størrelsen af det translaterede HSV2-protein (ca.

52000 dalton) mage til den, som er rapporteret med det endoglycosidase H behandlede native HSV2-gF (54 000 dalton) (22d). Endelig angiver den store grad af aminosyresekvenshomologi såvel som bevarelsen af flere potentielle N-forbundne 25 glycosyleringscentre og alle 7 cysteinrester en strukturel homologi mellem HSV1-gC og HSV2-gF. Disse resultater tyder således stærkt på, at HSV1-gC-proteinet og HSV2-gF-proteinet er homologe med hinanden.

Disse resultater hjælper til at forklare tidligere resultater, som viste, at HSV2-gF og 30 HSV1-gC var i hovedsagen typespecifikke, men at de havde type-fælles determinanter (17, 22d, 22f, 43). Da flere tidlige undersøgelser (17, 18, 43) viste, at disse proteiner inducerede overvejende type-specifikke antistoffer, er det rimeligt, at de mest antige-niske områder af proteiner findes i de mere divergente N-terminale sekvenser, som følger de formodet hydrophobe signalsekvenser. De divergente områders hydrophile art DK 172694 B1 46 sammen deres høje indhold af potentielle N-forbundne glycosyleringscentre (62) tyder på, at disse områder vil være lokaliseret på proteinets overflade. Blotlæggelse af disse divergente sekvenser ved proteinernes yderside kan være ansvarlig for frembringelsen af type-specifikke antistoffer rettet mod disse divergente epitoper. Imidlertid kan type-5 fælles antistoffer sandsynligvis også frembringes af de mere højtbevarede carboxyl-terminale 3/4 af proteinerne, da hydrophile områder bevaret mellem gC og gF kunne blotlægges på ydersiden af proteinerne og, i et tilfælde, kan være glycosyleret (resterne 363-366 i HSV1-gC og 330-332 i HSV2-gF). Således har HSVI-gC og HSV2-gF både type-specifikke og type-fælles determinanter, men det synes som om 10 de type-specifikke determinanter er mere antigeniske.

Selv om en forklaring af de type-specifikke og type-fælles determinanter i gC og gF ikke er kendt, er det muligt, at proteinerne har mindst 2 funktioner, hvoraf den ene er vigtig for levedygtigheden af begge virus, det type-fælles domæne, og den anden er 1 5 specifik for hver virus-type, det type-specifikke domæne. Selv om funktionerne af gC og gF for tiden er ukendt, og selv om levedygtige gC' mutanter af HSV1 er blevet isoleret in vitro (65), er det ikke klart, at hverken gC eller gF kan undværes af virusserne under in vivo infektion af den humane og etableringen af latens. Det er muligt, at mindst nogle af de biologiske forskelle mellem HSV1 og HSV2, herunder 20 forkærlighed for infektionssted og virulens, kan skyldes de betydelige strukturelle forskelle mellem de aminoterminale områder af gC og gF. Det kan konkluderes, selv uden nogen funktionel viden om disse proteiner, at der må virke forskellige selektionstryk på de divergente og bevarede domæner af gC og gF.

25 Tidligere sekvenssammenligning af gD-generne i HSV1 og HSV2 (58) viste, at den aminoterminale signalsekvens (63) og det carboxylsterminale transmembrandomæne (64) var i stand til at tolere et stort antal mutationer, så længe de indførte aminosyrer var hydrophobe. gC- og gF-sekvenssammenligning viser et lignende resultat i det carboxylterminale formodede transmembrandomæne (64) fra resterne 476-496 i gC og 30 443-463 i gF. Det store antal heterologe hydrophobe udskiftninger i dette områder tyder på, at ligesom i gD enhver aminosyre, som er lipidopløselig, kan tolereres i dette område. I modsætning til gD er de aminoterminale signalsekvenser i gC og gF imidlertid stærkt homologe i de første 19 rester. Således har dette område enten en vigtig bevaret funktion udover dirigering af glycoproteinerne ind i det rå endoplasmiske DK 172694 B1 47 reticulum (5), eller der kan være et overlappende gen eller en anden funktionel sekvens i dette område af genomet, som må bevares (66).

Selv om der her præsenteret utilstrækkelig HSV2-sekvens til en fuldstændig 5 sammenligning, viser området 5’ for starten af HSVI-gC-mRNA-transcription en identisk sekvens, CGGGTATAA, i både HSV1- og HSV2-genomet. Desuden efterfølges begge sekvenser af et G-rigt område umiddelbart forud for starten af transcription.

Således findes der, som det tidligere blev fundet for gD-generne i HSV1 og HSV2, opstrøms-sekvenshomologier mellem de to virustyper, som antyder muligheden af, at 10 disse områder er involveret i transcriptionsregulering af disse gener. Interessant nok viser den anden "TATA"-kasse homologi, som er fundet i begge virusgenomer, og som sandsynligvis styrer transcriptionen af 730 base mRNA'en (59, 60), også en relativt høj grad af sekvenshomologi i HSV1 og HSV2. Forud for disse "TATA"-kasser ligger CG-rige sekvenser, som ligner, men ikke er identiske, med dem, der ligger forud de 15 første "TATA"-områder vist i fig. 13, og de efterfølges begge af et 14 bp område, der viser ca. 80% sekvenshomologi. Hele området med homologi, som omgiver dette område, er kun på 33 bp med en samlet sekvenshomologi på ca 75%. Hvis dette område er involveret i transcriptionsregulering af 730 base mRNA’en, forekommer det, at en relativt kort sekvens kan være tilstrækkelig til genkendelse af 20 transcriptionsregulerende elementer.

Resultaterne viser, at HSV1-gC og HSV2-gF er stærkt homologe, og at de koder for type-fælles og type-specifikke domæner. Da de to proteiner udviser væsentlig sekvenshomologi, og da de øjensynligt ligger coliniært på kortet, støtter vi det forslag, 25 der er fremsat af Zeulak og Spear (22d), at ændre navnet på HSV2-gF til HSV-gC eller gC-2. Desuden åbner de her rapporterede sekvensbestemmelsesdata vejen for en funktionel analyse af gC-1- og gC-2-proteinerne ved gensidig ombytning af forskellige type-specifikke områder mellem de to proteiner in vitro og udtrykkelse af chimæriske sekvenser i pattedyrceller (67) eller reinkorporering af disse områder i virusset (68).

30

Det antages, at de klonede gC-2-glycoproteiner kan udtrykkes og præpareres til en vaccine på en måde, som er analog med den, der er angivet i eksempel 1.

DK 172694 B1 48

Det antages endvidere, at en vaccine, som inkluderer en blanding af sådanne rekombinante gC- og gD-glycoproteiner, vil være væsentligt mere effektiv som vaccine overfor HSV1 og HSV2 end en, der er baseret på et af glycoproteinerne alene.

5 Referencerne, som er samlet i den efterfølge bibliografi, og hvortil der er henvist ved parenteser i den forudgående tekst, betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

DK 172694 B1 49

Bibliografi 1. Emtage et al.. Nature 283, 171 (1980); Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) 78, 5376 (1981); Wetland et al.. Nature 292, 851 (1981).

5 2. Kupper et al.. Nature 289, 555 (1981); Kleid et al.. Science 214, 1125 (1981).

3. Charnay et al., Nucleic Acids Research 7, 335 (1979); Valenzuela et a!., Nature 298, 347 (1982).

10 4. Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 6670 (1981).

5. Yelverton et al., Science 219, 614 (1983).

15 6. Watson et al., Science 218, 381 (1982).

7. Gething et al., Nature 293, 620(1981); Liu et al., DNA 1,213 (1982);

Goodenow et al., Science 215, 677 (1982); Goodenow et al.. Nature 300, 231 (1982); Crowley et al., Molec. and Cell. Biol. 3, 44 (1983).

20 8. Rose et al., Cell 30, 753 (1982).

9. Spear, P.G., (1980), Herpesviruses, p709-750, in H.A. Blough and J.M. Tiffaney (ed).. Cell Membranes and Viral Envelopes, Vol. 2., Academic Press, Inc., New 25 York.

10. Balachandran et al., J. Virol. 44, 344 (1982).

11. Norrild, Curr. Top. Microbiol Immunol. 90, 67 30 (1980).

12. Roizman, Cell 16, 481 (1979).

13. Baucke et al., J. Virol. 32, 779 (1979).

DK 172694 B1 50 14. Cohen et al., J. Virol. 27, 172.

15. Eberle et al., J. Virol. 36, 665 (1980).

5 16. Norrild et al., J. Virol. 26, 712 (1978).

17. Powell et al., Nature 249, 360 (1974).

10 18. Eberle et al., Infect. Immun. 31, 1062 (1981).

1 9. Pereira et al., Infect. Immun. 29, 724.

20. Sim, C., et al., J. Gen. Virol. 19, 217 (1973).

15 21. Showalter et al., Infect. Immun. 34, 684 (1981).

22a. Eisenberg et al., J. Virol. 41, 1099.

20 22b. Balachandran et al., J. Virol. 39, 438 (1981).

22c. Para et al., J. Virol. 41, 137 (1982).

22d. Zezulak et al., J. Virol. 47, 553 (1983).

25 22f. Zweig et al., J. Virol. 47, 185 (1983).

23. Anderson et al., J. Virol. 30, 805 (1979).

30 24. Lee et al., J. Virol. 43, 41 (1982).

25. Murray et al., Mol. Genet. 1 50, 53 (1977).

26. Benton et al., Science 196, 180 (1977).

DK 172694 B1 51 27. Southern, J, Mol. Biol. 98, 503 (1975).

28. Vieira et al., Gene 19, 259 (1982).

5 29. Messing et al., Nuc. Acid. Res. 9, 309 (1981).

30. Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 74, 5436 (1977).

10 31. Atlas of Protein Sequence and Structure V.5, Supplement 2, 1976, M.O.

Dayhoff, ed., The Biochemical Research Foundation, Spring, Maryland, p. 311.

31a. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3824 (1981).

15 32. Watson et al., Nuci. Acid. Res. 11, 1507 (1983).

33. Biobel, Proc. Natl. Acad. Sol. (USA) 77, 1746 (1980).

20 34. Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 3884 (1980).

35. Ruyechan et al., J. Virol. 29, 677 (1979); Roizman, Cell 26, 481 (1979).

36. Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 2495 (1983).

25 37. Lusky et al.. Nature 293, 79 (1981).

38. Nunberg et al.. Cell 19, 355 (1980).

30 39. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4216 (1980).

40. Graham et al., Virol. 52, 456, (1973).

40a. Kessler, J. Immuno. 115, 1617 (1975).

DK 172694 B1 52 41. Showalter et al.. Infect, and Immun. 34, 684 (1981); Monoclonal anti-gD antibodies, 1-S and 55-S were kindly provided by Dr. Martin Zweig of the Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Institute, Frederick, Maryland 5 21701.

42. Cohen et al., J. Virol. 36, 429 (1980).

43. Pereira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 5202 (1981).

10 44. Cohen et al., J. Virol. 27, 172 (1978).

45. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).

15 46. Honess et al., J. Virol. 16, 1308 (1975).

47. Spear, J. Virol. 17, 991 (1976).

48. Campadelli-Fiume et al., J. Virol. 43, 1061 (1982); Johnson et al.. Cell 32, 987 20 (1983); Cohen et al., J. Virol. 46, 679 (1983).

49. Bloch, J. Cell. Bid. 82, 629 (I979).

50. Humant herpetisk serum titreret overfor HSV-I og HSV-2 ved 25 hæmaglutinationsinhiberings- og komplementbindingaprøvninger blev venligst leveret af Dr. John A. Stewart for the Centers for Disease Control, Atlanta,

Georgis.

51. Rector et al., Infect, and Immun. 38, 168 (1982).

30 52. Kennett i Monoclonal Antibodies, K. Kerrett, I McKearn, and B. Bechtel, eds.

(Plenum Press, N.Y., 1980), pp. 376-377.

53. Fiers et al.. Nature 273, 113 (1978); Gluzman, Cell 23, 275 (1981).

DK 172694 B1 53 54. Lee et al.. Nature 294, 228 (1981); Kaufman et al., Mol. and Cell. Biol. 2, 1304 (1983); Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159, 601 (1982).

5 55. Kleid et al., Science 214, 1125 (1981).

56. Maxam et al.. Methods Enzymol. 65, 499 (1980).

57. Oayhoff, M., Ed. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Supplement 2, 10 National Biochemical Research Foundation, Silver Spring, Maryland, p. 311 , (1976).

58. Lasky et al., DNA, in press (I984).

15 59. Frink et al., J. Virol. 45, 634 (1983).

60. McKnight et al.. Science 217, 316 (1982).

61. Whitton et al., Nucl. Acids Res. 18, 6271 (1983).

20 62. Hubbard et al., Ann. Rev. Biochem; 50; 555 (1981).

63. Biobel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1491 (1980).

25 64. Sabatini et al., J. Cell. Biol. 92. 1 (1982).

65. Cassai et al., Intervirology 6, 212 (1975).

66. Hall et al., J. Virol. 43, 594. (I982).

30

Claims (4)

54 DK 172694 B1

1. Vaccine omfattende et glycosyleret, trunkeret, membranfrit derivat af et membranbundet glycoprotein D fra herpes simplex-virus type 1 eller 2, hvilket derivat er 5 produktet af ekspression i og sekretion fra en eukaryot værtscelle af rekombinant DNA, der koder for dette virale polypeptid, men mangler det membranbindende domæne, hvorved polypeptidderivatet er et immunogent rekombinant sekretionsprodukt fri for denne membran, og som har eksponerede antigene determinanter, der fremkalder neutraliserende antistoffer og giver beskyttelse i et immuniseret 10 individ ved in v/Vo-udsættelse for herpes simplex-virus type 1 og/eller type 2. ,

2. Vaccine omfattende et glycosyleret, trunkeret, membranfrit derivat af et membranbundet glycoprotein C fra herpes simplex-virus type 1 eller 2, hvilket derivat er produktet af ekspression i og sekretion fra en eukaryot værtscelle af rekombinant

15 DNA, der koder for dette virale polypeptid, men mangler det membranbindende domæne, hvorved polypeptidderivatet er et immunogent sekretions-produkt fri for denne membran, og som har eksponerede antigene determinanter, der fremkalder neutraliserende antistoffer og giver beskyttelse i et immuniseret individ ved in vivo-udsættelse for herpes simplex-virus type 1 og/eller type 2. 20

3. Vaccine ifølge krav 1, hvor det membranfri trunkat omfatter den N-terminale region af gD-polypeptid op til omkring aminosyrerest 300.

4. Vaccine ifølge krav 1 eller 3, hvor polypeptidet alene består af gD-glycoprotein fra 25 herpes simplex-virus type 1 eller type 2.