JPH08253428A - 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 - Google Patents
膜結合性タンパク質を含有するワクチン類Info
- Publication number
- JPH08253428A JPH08253428A JP7222311A JP22231195A JPH08253428A JP H08253428 A JPH08253428 A JP H08253428A JP 7222311 A JP7222311 A JP 7222311A JP 22231195 A JP22231195 A JP 22231195A JP H08253428 A JPH08253428 A JP H08253428A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hsv
- membrane
- polypeptide
- cells
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- 101800001295 Putative ATP-dependent helicase Proteins 0.000 title 1
- 101800001006 Putative helicase Proteins 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 194
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 185
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 101800000342 Glycoprotein C Proteins 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 abstract description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 abstract description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 143
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 142
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 86
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 43
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 42
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 42
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 101150036031 gD gene Proteins 0.000 description 28
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 19
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 18
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 17
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 16
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 15
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 14
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 14
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 101150002378 gC gene Proteins 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 102000006392 myotrophin Human genes 0.000 description 10
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 8
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 6
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037205 Sal-like protein 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710192308 Sal-like protein 2 Proteins 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000011597 hartley guinea pig Methods 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710085003 Alpha-tubulin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710085461 Alpha-tubulin N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100440696 Caenorhabditis elegans cor-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100008044 Caenorhabditis elegans cut-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 102100035964 Gastrokine-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710205776 Gastrokine-2 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical group NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101001047819 Homo sapiens Heparanase Proteins 0.000 description 1
- 101000590492 Homo sapiens Nuclear fragile X mental retardation-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100032428 Nuclear fragile X mental retardation-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710183681 Uncharacterized protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006833 reintegration Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000007332 vesicle formation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 病原菌に対して有効なワクチンを提供する。
【解決手段】 病原菌に対する中和抗体を産生し得る露
出した抗原決定基を持った膜結合性ポリペプチドであっ
て、それを生産し得る安定な連続した組み換え体細胞系
の膜と機能的に連合しているポリペプチドを含有してい
るワクチン。
出した抗原決定基を持った膜結合性ポリペプチドであっ
て、それを生産し得る安定な連続した組み換え体細胞系
の膜と機能的に連合しているポリペプチドを含有してい
るワクチン。
Description
【０００１】本発明は膜結合型タンパク質とその誘導
体、およびそれらから得られるワクチン類に関する。発明の背景 種々の感染源に対する免疫応答の解析は、重要な細胞表
面抗原を分離できるに足る充分量の病原体を培養するこ
とがしばしば困難である事実から限度があった。分子ク
ローニング法の出現によって、病原体からの遺伝子生成
物を非病原型で事実上量的に無限に発現できる手段が提
供され、これらの限界が克服されるようになった。現在
ではインフルエンザ(１)、口蹄病(２)、肝炎(３)、小水
疱性口内炎ウイルス(４)、狂犬病(５)、および単純ヘル
ペスウイルス(６)のようなウイルスからの表面抗原が
Ｅ．coliおよびＳ．cerevisiaeにおいて発現され、将
来、改良されたサブユニットワクチンの提供を約束して
いる。然し、下等微生物における表面抗原の発現は、不
完全なプロセシングのために(例えば、タンパク質分
解、糖付加)、またはクローンした遺伝子産物を精製す
る間の変性により、恐らく重要な意味のある抗原決定基
を失うかも知れないという理由で満足すべきものである
とは言い難いことは明らかである。
体、およびそれらから得られるワクチン類に関する。発明の背景 種々の感染源に対する免疫応答の解析は、重要な細胞表
面抗原を分離できるに足る充分量の病原体を培養するこ
とがしばしば困難である事実から限度があった。分子ク
ローニング法の出現によって、病原体からの遺伝子生成
物を非病原型で事実上量的に無限に発現できる手段が提
供され、これらの限界が克服されるようになった。現在
ではインフルエンザ(１)、口蹄病(２)、肝炎(３)、小水
疱性口内炎ウイルス(４)、狂犬病(５)、および単純ヘル
ペスウイルス(６)のようなウイルスからの表面抗原が
Ｅ．coliおよびＳ．cerevisiaeにおいて発現され、将
来、改良されたサブユニットワクチンの提供を約束して
いる。然し、下等微生物における表面抗原の発現は、不
完全なプロセシングのために(例えば、タンパク質分
解、糖付加)、またはクローンした遺伝子産物を精製す
る間の変性により、恐らく重要な意味のある抗原決定基
を失うかも知れないという理由で満足すべきものである
とは言い難いことは明らかである。
【０００２】このことは、膜タンパク質の場合は、Ｅ．
coli中で発現された時に、それが疎水性の膜透過領域の
ために、凝集し、不溶性となり勝ちであるので特にそう
である。膜タンパク質を暗号化したクローン遺伝子は、
哺乳動物細胞中で発現させることができ、この場合、こ
の宿主細胞が適宜プロセスし、ポリペプチドを組み合わ
せ、細胞膜内に取り込むのに必要な因子を提供する
(７、８)。これらの研究により、膜タンパク質を組み換
え宿主細胞表面で発現できることがわかったし、また例
えば先端を切り取られたカルボキシル末端領域を欠く膜
タンパク質は宿主細胞と結合するより、むしろ徐々にそ
こから分泌されることが報告されているが(８)、このよ
うに発現される膜結合タンパク質や、このように分泌さ
れる先端を切り取られたタンパク質が、該タンパク質の
ソースとなった病原体に対して有効な抗体を実際に生成
せしめる働きがあるのかは明らかにされていない。
coli中で発現された時に、それが疎水性の膜透過領域の
ために、凝集し、不溶性となり勝ちであるので特にそう
である。膜タンパク質を暗号化したクローン遺伝子は、
哺乳動物細胞中で発現させることができ、この場合、こ
の宿主細胞が適宜プロセスし、ポリペプチドを組み合わ
せ、細胞膜内に取り込むのに必要な因子を提供する
(７、８)。これらの研究により、膜タンパク質を組み換
え宿主細胞表面で発現できることがわかったし、また例
えば先端を切り取られたカルボキシル末端領域を欠く膜
タンパク質は宿主細胞と結合するより、むしろ徐々にそ
こから分泌されることが報告されているが(８)、このよ
うに発現される膜結合タンパク質や、このように分泌さ
れる先端を切り取られたタンパク質が、該タンパク質の
ソースとなった病原体に対して有効な抗体を実際に生成
せしめる働きがあるのかは明らかにされていない。
【０００３】単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)は、関連性
はあるが区別できる二つの型でヒト感染症に見出される
巨大ＤＮＡウイルスである。ウイルスが暗号化している
多数のタンパク質のうちの少なくとも４個が、グリコシ
ル化した形で発見され、それらがウイルス粒子(ビリオ
ン)および感染細胞の両表面に存在していることが明ら
かにされた(９)。gＡ／Ｂ、gＣ、gＤ、およびgＥと呼ば
れるこれらの糖タンパク質はＨＳＶ１型(ＨＳＶ−１)お
よびＨＳＶ２型(ＨＳＶ−２)の双方に見出されるが、Ｈ
ＳＶ−２の場合は、更にもう１個の糖タンパク質(gＦ)
が発見されたと報告されている(１０)。それらの機能に
ついてはなお幾つか不明の点が残されているが、それら
の糖タンパク質が、ウイルスの細胞への付着、細胞融
合、およびウイルス感染に対する宿主の免疫学的応答に
関与していることは間違いない(１１)。ＨＳＶ−１とＨ
ＳＶ−２は５０％までのＤＮＡ配列相同性しか示さない
が(１２)、それらの糖タンパク質の大部分は両型に共通
しているようである。このように、gＡ／Ｂ、gＤ、およ
びgＥは型に共通した多くの抗原決定基を示すが(１３〜
１６)、以前には完全に型特異性があると思われていたg
Ｃ(１７、１８)も幾つかの型共通性の決定基を有するこ
とが明らかになって来た。然しながら、幾つかの糖タン
パク質に対する単クローン性抗体を使用して、型特異性
のある抗原決定基を証明でき(１０、１９)、ＨＳＶ−１
とＨＳＶ−２に分れて以来、ある種のアミノ酸変化が起
こったことを物語っている。
はあるが区別できる二つの型でヒト感染症に見出される
巨大ＤＮＡウイルスである。ウイルスが暗号化している
多数のタンパク質のうちの少なくとも４個が、グリコシ
ル化した形で発見され、それらがウイルス粒子(ビリオ
ン)および感染細胞の両表面に存在していることが明ら
かにされた(９)。gＡ／Ｂ、gＣ、gＤ、およびgＥと呼ば
れるこれらの糖タンパク質はＨＳＶ１型(ＨＳＶ−１)お
よびＨＳＶ２型(ＨＳＶ−２)の双方に見出されるが、Ｈ
ＳＶ−２の場合は、更にもう１個の糖タンパク質(gＦ)
が発見されたと報告されている(１０)。それらの機能に
ついてはなお幾つか不明の点が残されているが、それら
の糖タンパク質が、ウイルスの細胞への付着、細胞融
合、およびウイルス感染に対する宿主の免疫学的応答に
関与していることは間違いない(１１)。ＨＳＶ−１とＨ
ＳＶ−２は５０％までのＤＮＡ配列相同性しか示さない
が(１２)、それらの糖タンパク質の大部分は両型に共通
しているようである。このように、gＡ／Ｂ、gＤ、およ
びgＥは型に共通した多くの抗原決定基を示すが(１３〜
１６)、以前には完全に型特異性があると思われていたg
Ｃ(１７、１８)も幾つかの型共通性の決定基を有するこ
とが明らかになって来た。然しながら、幾つかの糖タン
パク質に対する単クローン性抗体を使用して、型特異性
のある抗原決定基を証明でき(１０、１９)、ＨＳＶ−１
とＨＳＶ−２に分れて以来、ある種のアミノ酸変化が起
こったことを物語っている。
【０００４】ウイルス中和に関して最も重要な糖タンパ
ク質の一つはgＤである(１１)。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−
２のそれぞれのgＤタンパク質が近縁であることを強く
示唆する注目すべき証據が提示されている。例えば、遺
伝子組み換え地図を作ると、対応する遺伝子が二つのウ
イルスのゲノムの共直線領域につきとめられる。アミノ
酸分析の結果は二つのタンパク質間に総体的な相同性が
有ることを示した。gＤタンパク質は１型および２型の
両ウイルスに対し型共通性の型式で中和抗体を誘導する
(１９−２１)。更に、これらの糖タンパク質に対して生
じるモノクローナル抗体の大部分は型共通性であり、同
様に二つの糖タンパク質の型の間の高度な構造的相関性
を示している(２０)。然し、幾つかの単クローン性(モ
ノクローナル)抗体は型特異的に反応することが知られ
ており、両タンパク質の間に有意の差のあることを示し
た(１９)。同様に、タンパク質のペプチド地図も不明瞭
ではあるがそのような違いを示した(２２a)。これらの
結果は、これらのポリペプチドが相関していることを示
唆しているが、その関係がどの程度近縁であるかを正確
に示すには不充分である。
ク質の一つはgＤである(１１)。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−
２のそれぞれのgＤタンパク質が近縁であることを強く
示唆する注目すべき証據が提示されている。例えば、遺
伝子組み換え地図を作ると、対応する遺伝子が二つのウ
イルスのゲノムの共直線領域につきとめられる。アミノ
酸分析の結果は二つのタンパク質間に総体的な相同性が
有ることを示した。gＤタンパク質は１型および２型の
両ウイルスに対し型共通性の型式で中和抗体を誘導する
(１９−２１)。更に、これらの糖タンパク質に対して生
じるモノクローナル抗体の大部分は型共通性であり、同
様に二つの糖タンパク質の型の間の高度な構造的相関性
を示している(２０)。然し、幾つかの単クローン性(モ
ノクローナル)抗体は型特異的に反応することが知られ
ており、両タンパク質の間に有意の差のあることを示し
た(１９)。同様に、タンパク質のペプチド地図も不明瞭
ではあるがそのような違いを示した(２２a)。これらの
結果は、これらのポリペプチドが相関していることを示
唆しているが、その関係がどの程度近縁であるかを正確
に示すには不充分である。
【０００５】ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２のgＤタンパク質
の型共通性の特徴を検討するため、ＨＳＶ−１とＨＳＶ
−２のgＤ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。誘導された
アミノ酸配列は近似性を示した。また、その結果生じた
タンパク質配列についても、タンパク質の疎水性領域と
親水性領域を測定すべく設計されたプログラムを使用す
ることにより、構造的な相違を解析した。この解析の結
果から、総体的構造水準は高度に維持されていることが
明らかにされた。二つの糖タンパク質の間に数ケ所のア
ミノ置換が見られたが、これらの置換のほとんど大部分
はコンサーバティブである。この糖タンパク質がウイル
スの構造上重要な必要条件であることを示していた。
の型共通性の特徴を検討するため、ＨＳＶ−１とＨＳＶ
−２のgＤ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。誘導された
アミノ酸配列は近似性を示した。また、その結果生じた
タンパク質配列についても、タンパク質の疎水性領域と
親水性領域を測定すべく設計されたプログラムを使用す
ることにより、構造的な相違を解析した。この解析の結
果から、総体的構造水準は高度に維持されていることが
明らかにされた。二つの糖タンパク質の間に数ケ所のア
ミノ置換が見られたが、これらの置換のほとんど大部分
はコンサーバティブである。この糖タンパク質がウイル
スの構造上重要な必要条件であることを示していた。
【０００６】ＨＳＶ−１と対照的に、ＨＳＶ−２はgＦ
と呼ばれるもう１個の糖タンパク質を暗号化しているよ
うである(２２b、１０、２２c、２２d)、ＨＳＶ−２ g
Ｆは電気泳動によってＨＳＶ−１ gＣよりはるかに速く
移動するが、組み換え体ウイルスのマッピング研究によ
り、このタンパク質はＨＳＶ−２ゲノムのＨＳＶ−１g
Ｃのための遺伝子とほぼ共直線的な領域で暗号化されて
いることが明らかになった(２２c、２２d)。更に最近、
ＨＳＶ−２gＦの単クローン性抗体が弱いながらもＨＳ
Ｖ−１ gＣと交叉反応するらしいということ(２２f)、
およびＨＳＶ−１ウイルス粒子のエンベロープタンパク
質に対して作られた多クローン性抗血清がgＦを沈降さ
せること(２２d)が証明され、二つの糖タンパク質の間
に構造上の相同性の可能性があることが示唆された。こ
のように、ＨＳＶ−１ gＣとの相同性はＨＳＶ−２タン
パク質である可能性がある。この関係は本発明において
検討された。
と呼ばれるもう１個の糖タンパク質を暗号化しているよ
うである(２２b、１０、２２c、２２d)、ＨＳＶ−２ g
Ｆは電気泳動によってＨＳＶ−１ gＣよりはるかに速く
移動するが、組み換え体ウイルスのマッピング研究によ
り、このタンパク質はＨＳＶ−２ゲノムのＨＳＶ−１g
Ｃのための遺伝子とほぼ共直線的な領域で暗号化されて
いることが明らかになった(２２c、２２d)。更に最近、
ＨＳＶ−２gＦの単クローン性抗体が弱いながらもＨＳ
Ｖ−１ gＣと交叉反応するらしいということ(２２f)、
およびＨＳＶ−１ウイルス粒子のエンベロープタンパク
質に対して作られた多クローン性抗血清がgＦを沈降さ
せること(２２d)が証明され、二つの糖タンパク質の間
に構造上の相同性の可能性があることが示唆された。こ
のように、ＨＳＶ−１ gＣとの相同性はＨＳＶ−２タン
パク質である可能性がある。この関係は本発明において
検討された。
【０００７】ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の間の相関性を検
討するため、ＨＳＶ−２ゲノムの２．２９kb(キロベー
ス)領域のＤＮＡ配列がＨＳＶ−１ gＣ遺伝子と共直線
的であることを測定した。この領域の大−オープンリー
ディングフレーム(open reading frame)の翻訳によ
り、ＨＳＶ−１ gＣと有意な相同性を有するタンパク質
がこの領域に暗号化されていることがわかる。この領域
がＨＳＶ−２ gＦ遺伝子を暗号化していること、および
gＦタンパク質はＨＳＶ−１糖タンパク質ＣのＨＳＶ−
２相同体であることが示唆される。
討するため、ＨＳＶ−２ゲノムの２．２９kb(キロベー
ス)領域のＤＮＡ配列がＨＳＶ−１ gＣ遺伝子と共直線
的であることを測定した。この領域の大−オープンリー
ディングフレーム(open reading frame)の翻訳によ
り、ＨＳＶ−１ gＣと有意な相同性を有するタンパク質
がこの領域に暗号化されていることがわかる。この領域
がＨＳＶ−２ gＦ遺伝子を暗号化していること、および
gＦタンパク質はＨＳＶ−１糖タンパク質ＣのＨＳＶ−
２相同体であることが示唆される。
【０００８】発明の要旨 本発明は、gＤタンパク質に基づくワクチンに関する。
本明細書において更に詳細に記載するように、gＤタン
パク質の構造に関するこの知見に照らして、gＤタンパ
ク質ＤＮＡを哺乳動物細胞に発現させることが可能であ
るかどうか、またもし可能とすれば発現されたタンパク
質が宿主の細胞膜に結合するのかどうか、また先端の切
り取られ膜結合領域を欠いた形のタンパク質が宿主細胞
から分泌されるのかどうか、またその場合、発現した生
成体タンパク質がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２
に対する抗体を生成するかどうかを調べることにした。
本発明で検討の結果、これらの目標は達成された。特
に、本発明は組み換えＤＮＡ操作によって得られたこれ
らのタンパク質を、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイル
スに有効なワクチンの構成成分として使用する方法を提
供するものである。このようにして製造されたワクチン
はヘルペス(疱疹)感染の発生を予防し、また既に感染し
た患者のヘルペス感染の再発の頻度と重篤度を低下させ
る防御ワクチンである。
本明細書において更に詳細に記載するように、gＤタン
パク質の構造に関するこの知見に照らして、gＤタンパ
ク質ＤＮＡを哺乳動物細胞に発現させることが可能であ
るかどうか、またもし可能とすれば発現されたタンパク
質が宿主の細胞膜に結合するのかどうか、また先端の切
り取られ膜結合領域を欠いた形のタンパク質が宿主細胞
から分泌されるのかどうか、またその場合、発現した生
成体タンパク質がＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２
に対する抗体を生成するかどうかを調べることにした。
本発明で検討の結果、これらの目標は達成された。特
に、本発明は組み換えＤＮＡ操作によって得られたこれ
らのタンパク質を、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイル
スに有効なワクチンの構成成分として使用する方法を提
供するものである。このようにして製造されたワクチン
はヘルペス(疱疹)感染の発生を予防し、また既に感染し
た患者のヘルペス感染の再発の頻度と重篤度を低下させ
る防御ワクチンである。
【０００９】もう一つの本発明の目的は、ＨＳＶ−１お
よび／またはＨＳＶ−２ウイルスに対するワクチンの構
成成分として有用な、組み換えＤＮＡ操作によって得ら
れる他の一組の糖タンパク質を提供することにある。具
体的には、そのような糖タンパク質は、ＨＳＶ−１ gＣ
(ＨＳＶ−１に有効)、ＨＳＶ−２に有効なＨＳＶ−２g
Ｆ(ＨＳＶ−２ gＣと表現する方がより適切)、または両
ウイルスに有効なこの二つのタンパク質の組み合わせ物
である。またそのような糖タンパク質として、そのほか
gＡ、gＢおよびgＥが含まれる。gＣおよびgＤ糖タンパ
ク質の組み合わせに基づくワクチンは、個々の糖タンパ
ク質単独よりもワクチンとして著しく有効であろうと考
えられる。
よび／またはＨＳＶ−２ウイルスに対するワクチンの構
成成分として有用な、組み換えＤＮＡ操作によって得ら
れる他の一組の糖タンパク質を提供することにある。具
体的には、そのような糖タンパク質は、ＨＳＶ−１ gＣ
(ＨＳＶ−１に有効)、ＨＳＶ−２に有効なＨＳＶ−２g
Ｆ(ＨＳＶ−２ gＣと表現する方がより適切)、または両
ウイルスに有効なこの二つのタンパク質の組み合わせ物
である。またそのような糖タンパク質として、そのほか
gＡ、gＢおよびgＥが含まれる。gＣおよびgＤ糖タンパ
ク質の組み合わせに基づくワクチンは、個々の糖タンパ
ク質単独よりもワクチンとして著しく有効であろうと考
えられる。
【００１０】更に要約すると、本発明はＨＳＶ−１およ
びＨＳＶ−２ウイルスに対する相補的抗体を特異的に生
成せしめ得る抗原決定基を有するポリペプチドを含有す
るワクチンに関する。その一つの態様として、そのポリ
ペプチドは、それを産生し得る組み換え体宿主細胞の表
面膜と機能的に連合している。典型的な例では、そのよ
うな機能的連合性は、ポリペプチドが膜を通じて突出す
るように、表面膜とポリペプチドが結合することであ
る。組み換え体細胞系(セルライン)は、安定で、連続し
た系から誘導される。
びＨＳＶ−２ウイルスに対する相補的抗体を特異的に生
成せしめ得る抗原決定基を有するポリペプチドを含有す
るワクチンに関する。その一つの態様として、そのポリ
ペプチドは、それを産生し得る組み換え体宿主細胞の表
面膜と機能的に連合している。典型的な例では、そのよ
うな機能的連合性は、ポリペプチドが膜を通じて突出す
るように、表面膜とポリペプチドが結合することであ
る。組み換え体細胞系(セルライン)は、安定で、連続し
た系から誘導される。
【００１１】他の一実施態様としてのワクチンは、同じ
抗原決定基を持っているが、膜表面と機能的に連合しな
い抗原決定基を有するポリペプチドを含んでいる。詳細
については後述するが、そのようなポリペプチドは、膜
結合ポリペプチドの、先端を切り取られた膜不含誘導体
である。該誘導体はポリペプチドから膜結合領域が脱落
することによって形成され、それを産生した組換え体宿
主細胞系から分泌され得る。
抗原決定基を持っているが、膜表面と機能的に連合しな
い抗原決定基を有するポリペプチドを含んでいる。詳細
については後述するが、そのようなポリペプチドは、膜
結合ポリペプチドの、先端を切り取られた膜不含誘導体
である。該誘導体はポリペプチドから膜結合領域が脱落
することによって形成され、それを産生した組換え体宿
主細胞系から分泌され得る。
【００１２】他の一実施態様では、ポリペプチドは最初
膜表面と機能的に連合して形成され、その後、望ましく
は非イオン界面活性剤に溶解して、膜を含まないポリペ
プチドとする。
膜表面と機能的に連合して形成され、その後、望ましく
は非イオン界面活性剤に溶解して、膜を含まないポリペ
プチドとする。
【００１３】本明細書で使用する“組み換え体"なる用
語は、組み換えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベク
ターでトランスフェクトされ、ポリペプチドを生産する
能力を形質導入された細胞を意味する。“機能的連合"
とは、膜に結合することであり、典型的には、天然の病
原体によって誘発された抗体によって認識され得る天然
の立体配座に含まれている抗原決定基を露出する様に、
膜の両側へ突出して膜と結合することを意味する。“膜
結合"ポリペプチドとは、通常真核細胞で生産され、そ
れが種々の細胞膜を通って分泌されるのを助けると考え
られているシグナル配列、および細胞膜からの完全な分
泌を妨げると考えられる膜結合領域(通常、疎水性であ
り、Ｃ−末端に存在する)を有していることにより特徴
づけられるポリペプチドの一群を言う。従って、それは
機能的に膜に連合または結合した状態のままでいる。本
発明では、特に病原微生物、例えばヘルペスウイルスに
関する膜結合ポリペプチドを開発しようとするものであ
る。
語は、組み換えＤＮＡ技術を用いて組み立てられたベク
ターでトランスフェクトされ、ポリペプチドを生産する
能力を形質導入された細胞を意味する。“機能的連合"
とは、膜に結合することであり、典型的には、天然の病
原体によって誘発された抗体によって認識され得る天然
の立体配座に含まれている抗原決定基を露出する様に、
膜の両側へ突出して膜と結合することを意味する。“膜
結合"ポリペプチドとは、通常真核細胞で生産され、そ
れが種々の細胞膜を通って分泌されるのを助けると考え
られているシグナル配列、および細胞膜からの完全な分
泌を妨げると考えられる膜結合領域(通常、疎水性であ
り、Ｃ−末端に存在する)を有していることにより特徴
づけられるポリペプチドの一群を言う。従って、それは
機能的に膜に連合または結合した状態のままでいる。本
発明では、特に病原微生物、例えばヘルペスウイルスに
関する膜結合ポリペプチドを開発しようとするものであ
る。
【００１４】本明細書で使用している“ＨＳＶ−２ g
Ｆ"、“ＨＳＶ−２ gＣ"および“gＣ−２"なる用語は、
ＨＳＶ−１ gＣと高度の相同性を有し、ワクチンとして
有用な充分な量の抗体を生成せしめることができるＨＳ
Ｖ−２の糖タンパク質部分を指す用語として、交換可能
に使用される。
Ｆ"、“ＨＳＶ−２ gＣ"および“gＣ−２"なる用語は、
ＨＳＶ−１ gＣと高度の相同性を有し、ワクチンとして
有用な充分な量の抗体を生成せしめることができるＨＳ
Ｖ−２の糖タンパク質部分を指す用語として、交換可能
に使用される。
【００１５】表面膜と機能的に連合した形で本発明のポ
リペプチドの抗原決定基が得られれば、この膜は、ポリ
ペプチドから、抗原性を破壊することなく除去すること
ができる。例えば、この膜結合ポリペプチドを好適な溶
液、望ましくは非イオン界面活性剤を含有する溶液に溶
解することにより、ポリペプチドを膜から除去すること
ができる。これを行なうことの利点は、無関係な細胞性
物質からポリペプチドを分離し、ワクチンに使用する際
の、その潜在的活性を充分に高めることである。ポリペ
プチドから膜を除去する技術は後述する。
リペプチドの抗原決定基が得られれば、この膜は、ポリ
ペプチドから、抗原性を破壊することなく除去すること
ができる。例えば、この膜結合ポリペプチドを好適な溶
液、望ましくは非イオン界面活性剤を含有する溶液に溶
解することにより、ポリペプチドを膜から除去すること
ができる。これを行なうことの利点は、無関係な細胞性
物質からポリペプチドを分離し、ワクチンに使用する際
の、その潜在的活性を充分に高めることである。ポリペ
プチドから膜を除去する技術は後述する。
【００１６】もう一つの実施態様としては、分泌系を創
製することによって、膜を含有しない標品を得ることで
ある。後段で更に詳細に記述するように、そのように分
泌されたポリペプチドは少なくとも抗体産生を刺激する
のに必要な幾つかの抗原部位を持っている。
製することによって、膜を含有しない標品を得ることで
ある。後段で更に詳細に記述するように、そのように分
泌されたポリペプチドは少なくとも抗体産生を刺激する
のに必要な幾つかの抗原部位を持っている。
【００１７】以下、図面について説明する。図１、図
２、図３、図４および図５は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２ gＤ遺伝子およびその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配
列と、推定されたアミノ酸配列を示す。図６は、ＨＳＶ
−１とＨＳＶ−２タンパク質からのgＤタンパク質のヒ
ドロパシー(hydropathy)解析を示す。図７および図８
は、膜結合型のＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現のため
に組み立てられた、pgＤ−dhfrプラスミドの模式図であ
る。図９は、ヒトＨＳＶ抗体でgＤ１２細胞を標識した
結果を示し、(Ａ)は位相差顕微鏡像、(Ｂ)は同じ細胞の
蛍光顕微鏡像である。図１０は、gＤ１２細胞系からク
ローンしたgＤおよびヒトの細胞に感染させたＨＳＶ−
１から得られた天然のgＤの放射免疫沈降を示すグラフ
である。図１１は、gＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞
系に対するヒト抗ＨＳＶ抗体の結合度を示す。横軸に血
清希釈度の逆数、縦軸に４９２nmにおける吸光度を示
す。図１２は、ＨＳＶ−１ gＤタンパク質を模式的に表
わしたもので、シグナル配列および膜結合領域の位置を
示す。図１３は、分泌型のＨＳＶ−１ gＤタンパク質の
ための発現プラスミドpgＤtrunc−dhfrの組立て模式図
である。図１４は、gＤ１０.２細胞系からの放射免疫沈
降線を示す。図１５は、増幅前および増幅を行なったg
Ｄ１０.２細胞系からの放射免疫沈降線を示す。図１６
は、Ｍtxで増幅したgＤ１０.２細胞系で達成された増幅
度を示す。図１７は、ＤＮＡ配列解析を行なったpgＣ2
Ｓal２.９の断片を示す。図１８、図１９、図２０、図
２１、図２２および図２３は、pgＣ2Ｓal ２.９から誘
導されたＤＮＡ配列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列
の比較を示す。図２４は、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとpg
Ｃ2Ｓal２.９ＤＮＡのサザーンプロッティング解析を示
す。図２５、図２６および図２７は、ＨＳＶ−２のラー
ジオープンリーディングフレームの翻訳とＨＳＶ−１ g
Ｃのアミノ酸配列の比較を示す。図２８および図２９
は、ＨＳＶ−１ gＣタンパク質とＨＳＶ−２のメジャー
オープンリーディングフレームタンパク質のヒドロパシ
ー解析結果を示す。
２、図３、図４および図５は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２ gＤ遺伝子およびその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配
列と、推定されたアミノ酸配列を示す。図６は、ＨＳＶ
−１とＨＳＶ−２タンパク質からのgＤタンパク質のヒ
ドロパシー(hydropathy)解析を示す。図７および図８
は、膜結合型のＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現のため
に組み立てられた、pgＤ−dhfrプラスミドの模式図であ
る。図９は、ヒトＨＳＶ抗体でgＤ１２細胞を標識した
結果を示し、(Ａ)は位相差顕微鏡像、(Ｂ)は同じ細胞の
蛍光顕微鏡像である。図１０は、gＤ１２細胞系からク
ローンしたgＤおよびヒトの細胞に感染させたＨＳＶ−
１から得られた天然のgＤの放射免疫沈降を示すグラフ
である。図１１は、gＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞
系に対するヒト抗ＨＳＶ抗体の結合度を示す。横軸に血
清希釈度の逆数、縦軸に４９２nmにおける吸光度を示
す。図１２は、ＨＳＶ−１ gＤタンパク質を模式的に表
わしたもので、シグナル配列および膜結合領域の位置を
示す。図１３は、分泌型のＨＳＶ−１ gＤタンパク質の
ための発現プラスミドpgＤtrunc−dhfrの組立て模式図
である。図１４は、gＤ１０.２細胞系からの放射免疫沈
降線を示す。図１５は、増幅前および増幅を行なったg
Ｄ１０.２細胞系からの放射免疫沈降線を示す。図１６
は、Ｍtxで増幅したgＤ１０.２細胞系で達成された増幅
度を示す。図１７は、ＤＮＡ配列解析を行なったpgＣ2
Ｓal２.９の断片を示す。図１８、図１９、図２０、図
２１、図２２および図２３は、pgＣ2Ｓal ２.９から誘
導されたＤＮＡ配列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列
の比較を示す。図２４は、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとpg
Ｃ2Ｓal２.９ＤＮＡのサザーンプロッティング解析を示
す。図２５、図２６および図２７は、ＨＳＶ−２のラー
ジオープンリーディングフレームの翻訳とＨＳＶ−１ g
Ｃのアミノ酸配列の比較を示す。図２８および図２９
は、ＨＳＶ−１ gＣタンパク質とＨＳＶ−２のメジャー
オープンリーディングフレームタンパク質のヒドロパシ
ー解析結果を示す。
【００１８】
【実施例】実施例 １ 実施例１はgＤタンパク質に関する。ウイルスの増殖とウイルス性ＤＮＡの分離 Ｈep２細胞でＨＳＶ−１(Ｈzt株)およびＨＳＶ−２(Ｇ
株)をそれぞれ３７℃および３３℃で増殖させた。ウイ
ルス性ＤＮＡを、感染細胞培養からタンパク分解酵素Ｋ
による消化とＣＳＣl勾配により分離した(２３)。
株)をそれぞれ３７℃および３３℃で増殖させた。ウイ
ルス性ＤＮＡを、感染細胞培養からタンパク分解酵素Ｋ
による消化とＣＳＣl勾配により分離した(２３)。
【００１９】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のgＤ遺伝子
のクローニング 先のマッピングおよびクローニング研究でＨＳＶ−１ g
Ｄ遺伝子は〜６．６kbのＢamＨＩ断片につきとめられた
(６、２４)。ＨＳＶ−１をＢamＨＩで切断し、アガロー
スゲル電気泳動により６〜７kb領域を分離した。この断
片をＢamＨＩで消化したpＢＲ３２２に連結(リゲーショ
ン)し、得られた混合物をＥ．coli２９４株(ＡＴＣＣ
Ｎo．３１４４６)に導入した。制限酵素消化により、好
適なＨＳＶ−１断片を求めてアンピシリン耐性、テトラ
サイクリン感受性のプラスミドをスクリーニングした。
正確なgＤを含有するＳst１断片を、Ｓst−１で消化し
たプラスミドpＦＭ３にサブクローンした(ヨーロッパ特
許公報、第００６８６９３号;１９８３年１月５日)。
のクローニング 先のマッピングおよびクローニング研究でＨＳＶ−１ g
Ｄ遺伝子は〜６．６kbのＢamＨＩ断片につきとめられた
(６、２４)。ＨＳＶ−１をＢamＨＩで切断し、アガロー
スゲル電気泳動により６〜７kb領域を分離した。この断
片をＢamＨＩで消化したpＢＲ３２２に連結(リゲーショ
ン)し、得られた混合物をＥ．coli２９４株(ＡＴＣＣ
Ｎo．３１４４６)に導入した。制限酵素消化により、好
適なＨＳＶ−１断片を求めてアンピシリン耐性、テトラ
サイクリン感受性のプラスミドをスクリーニングした。
正確なgＤを含有するＳst１断片を、Ｓst−１で消化し
たプラスミドpＦＭ３にサブクローンした(ヨーロッパ特
許公報、第００６８６９３号;１９８３年１月５日)。
【００２０】ＨＳＶ−２のgＤ遺伝子は先にＨＳＶ−１
による組み換えによりマッピングが行なわれているが、
この遺伝子の正確な位置はまだ判っていない。そこでＨ
ＳＶ−２ゲノムの短かい単一領域(４)からの〜１０kb
ＨindＩＩＩ断片を、バクテリオファージλクローニン
グベクター５９０(２５)のＨindＩＩＩ部位へ連結し
た。インビトロ(試験管内)でパッケージングしたファー
ジを低密度でプレートに撒き、ＨＳＶ−１から得たgＤ
遺伝子の32Ｐ−標識サブクローンとＢenton−Ｄavis法
によりスクリーニングした(２６)。陽性のハイブリダイ
ゼーションを示したプラークを発育させ、ＤＮＡを分離
し、サザーン・プロッティグおよび32Ｐ−標識ＨＳＶ−
１gＤ遺伝子とのハイブリダイゼーション法によりgＤ遺
伝子の位置をつきとめた(２７)。ハイブリダイゼーショ
ン陽性のＨＳＶ−２ gＤ含有断片をプラスミドpＵＣ９
へサブクローンした(２８)。
による組み換えによりマッピングが行なわれているが、
この遺伝子の正確な位置はまだ判っていない。そこでＨ
ＳＶ−２ゲノムの短かい単一領域(４)からの〜１０kb
ＨindＩＩＩ断片を、バクテリオファージλクローニン
グベクター５９０(２５)のＨindＩＩＩ部位へ連結し
た。インビトロ(試験管内)でパッケージングしたファー
ジを低密度でプレートに撒き、ＨＳＶ−１から得たgＤ
遺伝子の32Ｐ−標識サブクローンとＢenton−Ｄavis法
によりスクリーニングした(２６)。陽性のハイブリダイ
ゼーションを示したプラークを発育させ、ＤＮＡを分離
し、サザーン・プロッティグおよび32Ｐ−標識ＨＳＶ−
１gＤ遺伝子とのハイブリダイゼーション法によりgＤ遺
伝子の位置をつきとめた(２７)。ハイブリダイゼーショ
ン陽性のＨＳＶ−２ gＤ含有断片をプラスミドpＵＣ９
へサブクローンした(２８)。
【００２１】ＤＮＡ配列決定とコンピューター解析 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ gＤ遺伝子から得た種々の
断片をm１３ファージベクターmp９へサブクローンし(２
９)、Ｓangerのジデオキシヌクレオチド法により配列決
定した(３０)。ヌクレオチド配列はＨＯＭプログラムを
使用して解析した(３１)。推定したタンパク質配列のヒ
ドロパシーは１２幅(width)および１ジャンプ(jump)を
使用して解析した(３１a)。
断片をm１３ファージベクターmp９へサブクローンし(２
９)、Ｓangerのジデオキシヌクレオチド法により配列決
定した(３０)。ヌクレオチド配列はＨＯＭプログラムを
使用して解析した(３１)。推定したタンパク質配列のヒ
ドロパシーは１２幅(width)および１ジャンプ(jump)を
使用して解析した(３１a)。
【００２２】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２から得たgＤ
領域のクローニング 他の研究でＨＳＶ−１ gＤ遺伝子はＲoizmanの命名法に
従い、６．６kb ＢamＨＩ Ｊ断片につきとめられた
(６、１２、２４)。この断片部分を分離した配列決定を
行ない、この断片がＨＳＶ−１ gＤ遺伝子を含有するこ
とがわかった。ＨＳＶ−１ gＤ遺伝子のＤＮＡ配列はＨ
ＳＶ−２ gＤ遺伝子と比較的相同的であると予想される
ので、この断片をＨＳＶ−２ゲノムからのgＤ遺伝子の
分離のためのプローブとして使用した。
領域のクローニング 他の研究でＨＳＶ−１ gＤ遺伝子はＲoizmanの命名法に
従い、６．６kb ＢamＨＩ Ｊ断片につきとめられた
(６、１２、２４)。この断片部分を分離した配列決定を
行ない、この断片がＨＳＶ−１ gＤ遺伝子を含有するこ
とがわかった。ＨＳＶ−１ gＤ遺伝子のＤＮＡ配列はＨ
ＳＶ−２ gＤ遺伝子と比較的相同的であると予想される
ので、この断片をＨＳＶ−２ゲノムからのgＤ遺伝子の
分離のためのプローブとして使用した。
【００２３】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ゲノムからの
遺伝子の大部分は共直線的に配列していると思われるの
で(３５)、ＨＳＶ−１ gＤ領域に対応するＨＳＶ−２の
ゲノムの短かい単一の領域からの領域(ＨindＩＩＩ Ｌ
断片(１２))をλファージベクターへクローンした。得
られたプラークを32Ｐ−標識ＨＳＶ−１ gＤ遺伝子サブ
クローンでスクリーニングすると陽性のハイブリダイゼ
ーションを示したプラークの存在することがわかった。
このことは、二つのウイルスゲノムのこの領域に、事実
上核酸配列の相同性が存在することを示唆している。フ
ァージＤＮＡを分離し、次いでサザーンブロッティング
解析を行なうことにより、gＤ遺伝子に対応するこの断
片の領域が明らかにされた。この領域をＤＮＡ配列解析
のためサブクローンした。
遺伝子の大部分は共直線的に配列していると思われるの
で(３５)、ＨＳＶ−１ gＤ領域に対応するＨＳＶ−２の
ゲノムの短かい単一の領域からの領域(ＨindＩＩＩ Ｌ
断片(１２))をλファージベクターへクローンした。得
られたプラークを32Ｐ−標識ＨＳＶ−１ gＤ遺伝子サブ
クローンでスクリーニングすると陽性のハイブリダイゼ
ーションを示したプラークの存在することがわかった。
このことは、二つのウイルスゲノムのこの領域に、事実
上核酸配列の相同性が存在することを示唆している。フ
ァージＤＮＡを分離し、次いでサザーンブロッティング
解析を行なうことにより、gＤ遺伝子に対応するこの断
片の領域が明らかにされた。この領域をＤＮＡ配列解析
のためサブクローンした。
【００２４】暗号化領域 図１、図２、図３、図４および図５は二つのgＤ ＤＮ
Ａ配列をＨＯＭプログラム(３１)と比較したものを示し
ている。ヌクレオチド番号の１番は、イニシエーターメ
チオニンのＡＴＧのＡから始めた。ギャップは、配列相
同性を最大にするためにＨＯＭコンピュータープログラ
ムにより導入した(３１)。ヌクレオチドの相違は★印で
示し、アミノ酸の相違は枠で囲んで示してある。ここに
報告するＨＳＶ−１のＨzt株で測定したＨＳＶ−１ gＤ
配列と、Ｗatsonら(６)によりＰatton株について報告さ
れた配列との間のアミノ酸の相違は＋印で示した。矢印
で示したＨＳＶ−１ gＤ遺伝子の転写開始はＷatsonら
による(３２)。Ｎ−結合糖付加(グリコシル化)部位は陰
影をつけて示してある。二つの可能性のある“ＴＡＴ
Ａ"の配列はgＤ転写開始への５'で示されるが、第３の
“ＴＡＴＡ"配列はＨＳＶ−２配列の３'終末における２
番目のオープンリーディングフレームへの５'で示され
る。非暗号化配列の２つの相同領域はgＤ遺伝子への５'
−位と、ＨＳＶ−２配列からの２番目のオープンリーデ
ィングフレームへの５'−位に記録されるべきである。
Ａ配列をＨＯＭプログラム(３１)と比較したものを示し
ている。ヌクレオチド番号の１番は、イニシエーターメ
チオニンのＡＴＧのＡから始めた。ギャップは、配列相
同性を最大にするためにＨＯＭコンピュータープログラ
ムにより導入した(３１)。ヌクレオチドの相違は★印で
示し、アミノ酸の相違は枠で囲んで示してある。ここに
報告するＨＳＶ−１のＨzt株で測定したＨＳＶ−１ gＤ
配列と、Ｗatsonら(６)によりＰatton株について報告さ
れた配列との間のアミノ酸の相違は＋印で示した。矢印
で示したＨＳＶ−１ gＤ遺伝子の転写開始はＷatsonら
による(３２)。Ｎ−結合糖付加(グリコシル化)部位は陰
影をつけて示してある。二つの可能性のある“ＴＡＴ
Ａ"の配列はgＤ転写開始への５'で示されるが、第３の
“ＴＡＴＡ"配列はＨＳＶ−２配列の３'終末における２
番目のオープンリーディングフレームへの５'で示され
る。非暗号化配列の２つの相同領域はgＤ遺伝子への５'
−位と、ＨＳＶ−２配列からの２番目のオープンリーデ
ィングフレームへの５'−位に記録されるべきである。
【００２５】gＤタンパク質のヒドロパシー 各糖タンパク質のヒドロパシーをＨoppら(３１a)によっ
て開発されたプログラムを使用して解析した。図６に示
したように、疎水性の膜透過性領域は遺伝子の３'−末
端に存在する、１２個の長さのアミノ酸鎖を解析し、平
均ヒドロパシーを計算した。二つの糖タンパク質間の残
基の相違のうち、コンサーバティブな変化を★印、ノン
コンサーバティブの変化を＋印で示す。Ａ)はＨＳＶ−
１ gＤタンパク質のヒドロパシーを、Ｂ)はＨＳＶ−２
gＤタンパク質のヒドロパシーを示す。
て開発されたプログラムを使用して解析した。図６に示
したように、疎水性の膜透過性領域は遺伝子の３'−末
端に存在する、１２個の長さのアミノ酸鎖を解析し、平
均ヒドロパシーを計算した。二つの糖タンパク質間の残
基の相違のうち、コンサーバティブな変化を★印、ノン
コンサーバティブの変化を＋印で示す。Ａ)はＨＳＶ−
１ gＤタンパク質のヒドロパシーを、Ｂ)はＨＳＶ−２
gＤタンパク質のヒドロパシーを示す。
【００２６】ＤＮＡ配列分析の結果、ＨＳＶ−１および
ＨＳＶ−２のgＤタンパク質は８０％の相同性があるこ
とが明らかにされた。これらの２個のタンパク質間で見
出された相違点の大部分はアミノ末端およびカルボキシ
ル末端領域にあった。これらのタンパク質のアミノ末端
領域は、アミノ末端メチオニンの近くにアルギニン残基
を含有する高度に疎水性の領域を含んでいる。この疎水
性領域は、分泌され、そして、膜と結合する蛋白質に特
徴的なシグナル配列であり、また多分、少なくとも一部
のタンパク質を小胞体の内腔へ誘導すべく機能するシグ
ナル配列である(３３)。最初の２０個のアミノ末端アミ
ノ酸の比較から、１型と２型との遺伝子間には、総計で
１２ケ所の差違があることが示された。然し実質的に
は、すべての差異は、それらが他の疎水性アミノ酸を暗
号化しているので、コンサーバティブである。例外は、
３番目の残基のgly−arg置換と、７番目の残基のarg−g
ly置換である。これらの置換はコンサーバティブではな
いが、これらはシグナル領域の本質的な構造を変化させ
るものではない。両遺伝子とも最初の１０個のアミノ酸
の中にプラスの電荷を有する残基を保有している。
ＨＳＶ−２のgＤタンパク質は８０％の相同性があるこ
とが明らかにされた。これらの２個のタンパク質間で見
出された相違点の大部分はアミノ末端およびカルボキシ
ル末端領域にあった。これらのタンパク質のアミノ末端
領域は、アミノ末端メチオニンの近くにアルギニン残基
を含有する高度に疎水性の領域を含んでいる。この疎水
性領域は、分泌され、そして、膜と結合する蛋白質に特
徴的なシグナル配列であり、また多分、少なくとも一部
のタンパク質を小胞体の内腔へ誘導すべく機能するシグ
ナル配列である(３３)。最初の２０個のアミノ末端アミ
ノ酸の比較から、１型と２型との遺伝子間には、総計で
１２ケ所の差違があることが示された。然し実質的に
は、すべての差異は、それらが他の疎水性アミノ酸を暗
号化しているので、コンサーバティブである。例外は、
３番目の残基のgly−arg置換と、７番目の残基のarg−g
ly置換である。これらの置換はコンサーバティブではな
いが、これらはシグナル領域の本質的な構造を変化させ
るものではない。両遺伝子とも最初の１０個のアミノ酸
の中にプラスの電荷を有する残基を保有している。
【００２７】ヒドロパシーの結果を図示した図６では、
疎水性の領域に引き続いて親水性のカルボキシル末端領
域が見られる。この構造は膜結合型糖タンパク質の特徴
であって、以前にも他のウイル表面抗原で発見された
(５、３４)。その働きは細胞膜およびウイルス膜にタン
パク質を固定することにあり、そのことからウイルス感
染に重要な役割りを果たす。gＤタンパク質のこの領域
における１２ケ所のアミノ酸変化は３３３番目〜３６２
番目の残基に見られ、それらの大部分はコンサーバティ
ブである。このことは、この領域のアミノ酸としての唯
一条件が、脂質二重層に架橋するために著しく無極性で
あるということであることを示唆している。更に、恐ら
くタンパク質を膜に固定させる働きをしてると考えられ
る膜領域に続く領域(３６３〜３７５残基)(３３)は、最
初の１３個の残基に５ケ所の変化を示し、その後に長い
相同鎖を有する。この結果から、カルボキシル末端親水
性領域の最初の１０〜１５残基は固定機能を果すだけで
あって、従って荷電されることだけが必要であるが、一
方、それに続く２３残基はgＤタンパク質に特異的に重
要な何か他の機能を果しているのかも知れないことが示
唆される。
疎水性の領域に引き続いて親水性のカルボキシル末端領
域が見られる。この構造は膜結合型糖タンパク質の特徴
であって、以前にも他のウイル表面抗原で発見された
(５、３４)。その働きは細胞膜およびウイルス膜にタン
パク質を固定することにあり、そのことからウイルス感
染に重要な役割りを果たす。gＤタンパク質のこの領域
における１２ケ所のアミノ酸変化は３３３番目〜３６２
番目の残基に見られ、それらの大部分はコンサーバティ
ブである。このことは、この領域のアミノ酸としての唯
一条件が、脂質二重層に架橋するために著しく無極性で
あるということであることを示唆している。更に、恐ら
くタンパク質を膜に固定させる働きをしてると考えられ
る膜領域に続く領域(３６３〜３７５残基)(３３)は、最
初の１３個の残基に５ケ所の変化を示し、その後に長い
相同鎖を有する。この結果から、カルボキシル末端親水
性領域の最初の１０〜１５残基は固定機能を果すだけで
あって、従って荷電されることだけが必要であるが、一
方、それに続く２３残基はgＤタンパク質に特異的に重
要な何か他の機能を果しているのかも知れないことが示
唆される。
【００２８】この二つのタンパク質の全体にわたり、他
の多くのアミノ酸変化が見られるが、その変化の大部分
はコンサーバティブである。この事実は、図６に示した
ヒドロパシープログラムによって現わされた構造によっ
て強調される。この比較で見られるように、二つの糖タ
ンパク質は非常に近似した図形を示す。コンサーバティ
ブでないアミノ酸変化はタンパク質のヒドロパシーを変
化させないようである。
の多くのアミノ酸変化が見られるが、その変化の大部分
はコンサーバティブである。この事実は、図６に示した
ヒドロパシープログラムによって現わされた構造によっ
て強調される。この比較で見られるように、二つの糖タ
ンパク質は非常に近似した図形を示す。コンサーバティ
ブでないアミノ酸変化はタンパク質のヒドロパシーを変
化させないようである。
【００２９】ＨＳＶ−１ gＤの発現 恒久的に膜結合したgＤを生産する細胞系を確立するた
めに、選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhf
r)、を含有しているヒト発現ベクター(３６)へgＤを含
有する断片を連結した(図７および図８)。図７および図
８は、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現のために組み立
てられたプラスミドpgＤ−dhfrの図式を示す。この発現
プラスミドは、Ｅ．coliプラスミドpＢＲ３２２から誘
導された複製起原とβ−ラクタマーゼ遺伝子(ampr)(３
７)、ＳＶ−４０の初期(第一)プロモーターのコントロ
ール下にマウスのdhfrを暗号化したcＤＮＡ挿入体(３
６、３８)および同じくＳＶ−４０初期プロモーターの
コントロール下にgＤ遺伝子を含有しているＨindＩＩＩ
−ＢamＨＩの４.６kb断片から成っていた。この断片の
ＨindＩＩＩ終末は、イニシエーターメチオニンのコド
ンの５'−側へ７４bpで位置しており、mＲＮＡのキャッ
プ部位を含有している。ＨindＩＩＩ部位は、ＳＶ−４
０プロモーターのＧoldberg−Ｈognessボックスの３'−
側へ２５０bpで位置している。gＤを含有する断片の暗
号化領域は１１７９bpの長さを有し、少なくとも翻訳停
止コドン、ポリアデニル化部位および糖タンパク質Ｅ遺
伝子(２４,３２)の一部を含んでいる巨大(１.９kb)な
３'−領域に隣接している。
めに、選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhf
r)、を含有しているヒト発現ベクター(３６)へgＤを含
有する断片を連結した(図７および図８)。図７および図
８は、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現のために組み立
てられたプラスミドpgＤ−dhfrの図式を示す。この発現
プラスミドは、Ｅ．coliプラスミドpＢＲ３２２から誘
導された複製起原とβ−ラクタマーゼ遺伝子(ampr)(３
７)、ＳＶ−４０の初期(第一)プロモーターのコントロ
ール下にマウスのdhfrを暗号化したcＤＮＡ挿入体(３
６、３８)および同じくＳＶ−４０初期プロモーターの
コントロール下にgＤ遺伝子を含有しているＨindＩＩＩ
−ＢamＨＩの４.６kb断片から成っていた。この断片の
ＨindＩＩＩ終末は、イニシエーターメチオニンのコド
ンの５'−側へ７４bpで位置しており、mＲＮＡのキャッ
プ部位を含有している。ＨindＩＩＩ部位は、ＳＶ−４
０プロモーターのＧoldberg−Ｈognessボックスの３'−
側へ２５０bpで位置している。gＤを含有する断片の暗
号化領域は１１７９bpの長さを有し、少なくとも翻訳停
止コドン、ポリアデニル化部位および糖タンパク質Ｅ遺
伝子(２４,３２)の一部を含んでいる巨大(１.９kb)な
３'−領域に隣接している。
【００３０】プラスミドpgＤ．dhfrは次のように組み立
てられた:ＨＳＶ−１ゲノムからクローンしたＢamＨＩ
断片から、全gＤ暗号配列を含有する４.６kbのＨindＩ
ＩＩ−ＢamＨＩ断片を分離した(上記参照)。ＳＶ４０に
由来する初期プロモーターおよびpＢＲ３２２アンピシ
リン耐性遺伝子から成る２.８kbのＨindＩＩＩ−Ｓal１
断片およびＤＮＡ複製起原をプラスミドpＥＨＢal１４
から分離した。第２のＳＶ４０由来の初期プロモーター
のコントロール下にあるマウスのジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼcＤＮＡクローンを含有している２.１kbのＳal１−
ＢamＨＩ断片をプラスミドpＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ
２２(３６)から分離した。これら３個の断片はＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを使用する三重連結法(トリプルリゲーショ
ン)によって互いに連結し、得られた混合物をＥ．coli
２９４菌株への導入に使用した。生成したコロニーを増
殖させ、プラスミドＤＮＡをＳac２で消化することによ
りスクリーニングした。正しいＤＮＡコンストラクショ
ンpgＤ−dhfr(図７および図８)を次のトランスフェクシ
ョン研究に使用した。
てられた:ＨＳＶ−１ゲノムからクローンしたＢamＨＩ
断片から、全gＤ暗号配列を含有する４.６kbのＨindＩ
ＩＩ−ＢamＨＩ断片を分離した(上記参照)。ＳＶ４０に
由来する初期プロモーターおよびpＢＲ３２２アンピシ
リン耐性遺伝子から成る２.８kbのＨindＩＩＩ−Ｓal１
断片およびＤＮＡ複製起原をプラスミドpＥＨＢal１４
から分離した。第２のＳＶ４０由来の初期プロモーター
のコントロール下にあるマウスのジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼcＤＮＡクローンを含有している２.１kbのＳal１−
ＢamＨＩ断片をプラスミドpＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ
２２(３６)から分離した。これら３個の断片はＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを使用する三重連結法(トリプルリゲーショ
ン)によって互いに連結し、得られた混合物をＥ．coli
２９４菌株への導入に使用した。生成したコロニーを増
殖させ、プラスミドＤＮＡをＳac２で消化することによ
りスクリーニングした。正しいＤＮＡコンストラクショ
ンpgＤ−dhfr(図７および図８)を次のトランスフェクシ
ョン研究に使用した。
【００３１】リン酸カルシウム沈澱法(４０)を使用し
て、このプラスミドをdhfr生産欠乏のチャイニーズハム
スター卵巣細胞(ＣＨＯ)(３９)へ導入した。ヒポキサン
チン、グリシン、およびチミジンを含まない培地で発育
し得るコロニーを採り、９個のdhfr+クローンを分析し
た。これらのうち、５個のコロニーに、抗ＨＳＶ−１抗
体を使用する放射免疫沈降法および免疫蛍光検定で、g
Ｄが検出できた。この５個の系列のうちの１個(gＤ１
２)を更に次の研究用にあてた。クローンしたgＤ遺伝子
生産物を特徴づけるために、gＤ１２細胞を35Ｓ−メチ
オニンまたは3Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識し、放
射免疫沈澱法により分析した。使用した方法は次の通り
である:市販の７％のウシ胎児透析血清(Ｇibco)、ペニ
シリン(１００u／ml)、およびストレプトマイシン(１０
０u／ml)を添加したＨamのＦ１２培地で細胞を発育させ
た。培養が約８０％まで密集した状態(confluent)にな
ったら、培地を除き、細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)
で２回洗滌した後、標識培地(１／１０規定濃度)のメチ
オニンまたはグルコースを含有するＤulbeccoの改良Ｅa
gleの培地)を最終濃度０.０６４ml／cm2となるまで添加
した。35Ｓ−メチオニン(ＳＪ．２０４、Ａmersham Ｉ
nt．)(５０〜７５μＣi／ml)または3Ｈ−グルコサミン
(１００μＣi／ml)を加え、更に細胞を１８〜２０時間
発育させた。標識終了後、培地を回収し、細胞をＰＢＳ
で２回洗滌し、０.０２％のＥＤＴＡを含有するＰＢＳ
で処理することによって培養皿から除いた。次いで細胞
を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４０、０.１％ウシ血清アルブ
ミン、５×１０-5Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、０.０１７ＴＩＵ／mlのアポプロチニンから成る溶
菌緩衝液に溶解し、得られた溶解物を１２,０００×gで
遠心分離により透明にした。免疫沈降反応のために、細
胞溶解液をＰＢＳで３倍に希釈し、検液(典型的には１
８０μl)を２〜５μlの抗血清と混合し、４℃で３０分
間インキュベートした。免疫複合体をＫessler法(４０
a)により、固定したＳ．aureus細胞に吸着させ、１２,
０００×gで３０分間遠心分離して沈澱させた。次に、
Ｓ．aureus細胞を洗滌緩衝液(ＰＢＳ、１％ＮＰ−４
０、０.３％ドデシル硫酸ナトリウム)で３回洗滌後、免
疫複合体を２０μlのポリアクリルアミドゲル検体緩衝
液(１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノー
ル、０.０１％ブロモフェノールブルーを含有する６２.
５mＭトリス−ＨＣlバッファー、pＨ６.８)で９０℃で
３分間溶出した。３０秒間遠心分離後、上清をＬaemmli
の方法(４５)に従い１０％ポリアクリルアミドスラブゲ
ルにかけた。
て、このプラスミドをdhfr生産欠乏のチャイニーズハム
スター卵巣細胞(ＣＨＯ)(３９)へ導入した。ヒポキサン
チン、グリシン、およびチミジンを含まない培地で発育
し得るコロニーを採り、９個のdhfr+クローンを分析し
た。これらのうち、５個のコロニーに、抗ＨＳＶ−１抗
体を使用する放射免疫沈降法および免疫蛍光検定で、g
Ｄが検出できた。この５個の系列のうちの１個(gＤ１
２)を更に次の研究用にあてた。クローンしたgＤ遺伝子
生産物を特徴づけるために、gＤ１２細胞を35Ｓ−メチ
オニンまたは3Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識し、放
射免疫沈澱法により分析した。使用した方法は次の通り
である:市販の７％のウシ胎児透析血清(Ｇibco)、ペニ
シリン(１００u／ml)、およびストレプトマイシン(１０
０u／ml)を添加したＨamのＦ１２培地で細胞を発育させ
た。培養が約８０％まで密集した状態(confluent)にな
ったら、培地を除き、細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)
で２回洗滌した後、標識培地(１／１０規定濃度)のメチ
オニンまたはグルコースを含有するＤulbeccoの改良Ｅa
gleの培地)を最終濃度０.０６４ml／cm2となるまで添加
した。35Ｓ−メチオニン(ＳＪ．２０４、Ａmersham Ｉ
nt．)(５０〜７５μＣi／ml)または3Ｈ−グルコサミン
(１００μＣi／ml)を加え、更に細胞を１８〜２０時間
発育させた。標識終了後、培地を回収し、細胞をＰＢＳ
で２回洗滌し、０.０２％のＥＤＴＡを含有するＰＢＳ
で処理することによって培養皿から除いた。次いで細胞
を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４０、０.１％ウシ血清アルブ
ミン、５×１０-5Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、０.０１７ＴＩＵ／mlのアポプロチニンから成る溶
菌緩衝液に溶解し、得られた溶解物を１２,０００×gで
遠心分離により透明にした。免疫沈降反応のために、細
胞溶解液をＰＢＳで３倍に希釈し、検液(典型的には１
８０μl)を２〜５μlの抗血清と混合し、４℃で３０分
間インキュベートした。免疫複合体をＫessler法(４０
a)により、固定したＳ．aureus細胞に吸着させ、１２,
０００×gで３０分間遠心分離して沈澱させた。次に、
Ｓ．aureus細胞を洗滌緩衝液(ＰＢＳ、１％ＮＰ−４
０、０.３％ドデシル硫酸ナトリウム)で３回洗滌後、免
疫複合体を２０μlのポリアクリルアミドゲル検体緩衝
液(１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノー
ル、０.０１％ブロモフェノールブルーを含有する６２.
５mＭトリス−ＨＣlバッファー、pＨ６.８)で９０℃で
３分間溶出した。３０秒間遠心分離後、上清をＬaemmli
の方法(４５)に従い１０％ポリアクリルアミドスラブゲ
ルにかけた。
【００３２】図１０ＡはgＤ１２細胞系とＨＳＶ−１感
染細胞で得られたオートラジオグラフを比較したもので
ある:gＤ１２細胞溶菌液と正常家兎血清から得た対照免
疫沈降(１列目);ＨＥＬ細胞で発育させた野性(天然)のg
Ｄと単クローン性(モノクローナル)抗gＤ抗体、５５−
Ｓ(４１)との免疫沈降(２列目)、およびＡ５４９細胞と
５５−Ｓの免疫沈降(３列目);gＤ１２細胞の溶解液から
のクローンしたgＤと、多クローン性ＨＳＶ−１家兎抗
体(Ｄako Ｃorp．)の免疫沈降(４列目)、および単クロ
ーン性抗体５５−Ｓとの免疫沈降(５列目);3Ｈ−グルコ
サミンで代謝的に標識したgＤ１２細胞からのクローン
したgＤと多クローン性家兎抗ＨＳＶ−１抗体の免疫沈
降(６列目)。
染細胞で得られたオートラジオグラフを比較したもので
ある:gＤ１２細胞溶菌液と正常家兎血清から得た対照免
疫沈降(１列目);ＨＥＬ細胞で発育させた野性(天然)のg
Ｄと単クローン性(モノクローナル)抗gＤ抗体、５５−
Ｓ(４１)との免疫沈降(２列目)、およびＡ５４９細胞と
５５−Ｓの免疫沈降(３列目);gＤ１２細胞の溶解液から
のクローンしたgＤと、多クローン性ＨＳＶ−１家兎抗
体(Ｄako Ｃorp．)の免疫沈降(４列目)、および単クロ
ーン性抗体５５−Ｓとの免疫沈降(５列目);3Ｈ−グルコ
サミンで代謝的に標識したgＤ１２細胞からのクローン
したgＤと多クローン性家兎抗ＨＳＶ−１抗体の免疫沈
降(６列目)。
【００３３】gＤ１２細胞系から、ＨＳＶ−１タンパク
に特異的な(４１)、単クローン性抗−gＤ抗体、５５−
Ｓまたは家兎抗ＨＳＶ−１抗体を使用して、５９〜６０
kdの拡散バンドが特異的に沈澱したことが見られる(４
および５列目)。この分子量は、ＨＳＶ−１に感染させ
たＫＢ細胞(４２)から分離されたgＤに関して報告され
た値とよく一致する。同じ単クローン性抗体が、ＨＳＶ
−１に感染させたヒト細胞系からの類似の、しかし分子
量の異なるタンパク質を沈降させるのが見られる。Ａ５
４９ヒト肺癌細胞系から沈降させた主生成物は５３kdで
あり(２列目)、ヒト胎児肺細胞系(ＨＥＬ)から沈降させ
た生成物は５６kdであった(３列目)。以前の研究(４３)
で、ＨＳＶ糖タンパク質の分子量は宿主によって変化
し、この相違は糖付加反応の相違に起因することが示さ
れている。ＣＨＯ細胞で生産されたgＤタンパク質が実
際に糖付加されているかどうかを調べるために、細胞を
3Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識した。35Ｓ−メチオ
ニンまたは3Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識した後
に、同一分子量のバンドが沈降したことから(５および
６列目)、ＣＨＯ細胞で生産されたgＤタンパク質は糖付
加されていると結論した。
に特異的な(４１)、単クローン性抗−gＤ抗体、５５−
Ｓまたは家兎抗ＨＳＶ−１抗体を使用して、５９〜６０
kdの拡散バンドが特異的に沈澱したことが見られる(４
および５列目)。この分子量は、ＨＳＶ−１に感染させ
たＫＢ細胞(４２)から分離されたgＤに関して報告され
た値とよく一致する。同じ単クローン性抗体が、ＨＳＶ
−１に感染させたヒト細胞系からの類似の、しかし分子
量の異なるタンパク質を沈降させるのが見られる。Ａ５
４９ヒト肺癌細胞系から沈降させた主生成物は５３kdで
あり(２列目)、ヒト胎児肺細胞系(ＨＥＬ)から沈降させ
た生成物は５６kdであった(３列目)。以前の研究(４３)
で、ＨＳＶ糖タンパク質の分子量は宿主によって変化
し、この相違は糖付加反応の相違に起因することが示さ
れている。ＣＨＯ細胞で生産されたgＤタンパク質が実
際に糖付加されているかどうかを調べるために、細胞を
3Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識した。35Ｓ−メチオ
ニンまたは3Ｈ−グルコサミンで代謝的に標識した後
に、同一分子量のバンドが沈降したことから(５および
６列目)、ＣＨＯ細胞で生産されたgＤタンパク質は糖付
加されていると結論した。
【００３４】ヒト細胞系Ａ５４９(ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１８５)およびＨＥＬ２９９(ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３
７)を、３.５cmの組織培養皿で密に発育させ、ＨＳＶ−
１を細胞当たり１０pfuの多重度で感染させた。ウイル
ス感染細胞はＣohenら(４４)の記載した方法と同様の方
法で標識した。感染させてから４時間後に、培地を除去
し、細胞を新しい培養液(Ｄulbeccoの改良Ｅagle培地)
で１回、更にリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で１回洗滌し
た。１／１０規定濃度のメチオニンを含有する新しい培
地を、35Ｓ−メチオニン(Ａmersham．Ｉnternational)
と共に、最終放射活性が培地ml当たり７５μＣiとなる
まで細胞に加えた。細胞を更に２０時間発育させ、次に
ＥＤＴＡを含有する(０.０２％)ＰＢＳで洗滌処理した
細胞を回収した。ウイルス性タンパク質を、ＰＢＳ、３
％ＮＰ−４０、１％ウシ血清アルブミン、５×１０-5Ｍ
フェニルメチルスルホニルフルオリド、および０.０１
７ＴＩＵ／mlのアポプロチニンから成る溶菌緩衝液に溶
解した。得られた細胞溶解物を小型遠心機で１２,００
０×gの回転数で遠沈することにより透明にした。免疫
沈降反応を行なうため、細胞またはウイルスの溶解液を
リン酸緩衝液で３倍に希釈し、２〜５μlの好適な抗血
清と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。抗原
−抗体複合物を、固定した１０％Ｓ．aureus溶液(Ｋess
ler(４０a))の２５mlを加えることによって反応培地か
ら除き、１２,０００×gで３０秒間遠心分離して沈澱さ
せた。次に、Ｓ．aureus細胞を洗滌用緩衝液(ＰＢＳ、
１％ＮＰ−４０、０.３％ドデシル硫酸ナトリウム)で３
回洗滌し、細胞を２０μlのポリアクリルアミドゲルサ
ンプル緩衝液(１０％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール、０.０６２５Ｍトリスバッファー(pＨ６.
８)、０.０１％ブロモフェノールブルー)に懸濁させ、
９０℃で３分間インキュベートした。３０秒間遠心分離
(１２,０００×g)した後、上清を１０％ポリアクリルア
ミドゲルスラブゲル(４５)にかけた。
１８５)およびＨＥＬ２９９(ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３
７)を、３.５cmの組織培養皿で密に発育させ、ＨＳＶ−
１を細胞当たり１０pfuの多重度で感染させた。ウイル
ス感染細胞はＣohenら(４４)の記載した方法と同様の方
法で標識した。感染させてから４時間後に、培地を除去
し、細胞を新しい培養液(Ｄulbeccoの改良Ｅagle培地)
で１回、更にリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で１回洗滌し
た。１／１０規定濃度のメチオニンを含有する新しい培
地を、35Ｓ−メチオニン(Ａmersham．Ｉnternational)
と共に、最終放射活性が培地ml当たり７５μＣiとなる
まで細胞に加えた。細胞を更に２０時間発育させ、次に
ＥＤＴＡを含有する(０.０２％)ＰＢＳで洗滌処理した
細胞を回収した。ウイルス性タンパク質を、ＰＢＳ、３
％ＮＰ−４０、１％ウシ血清アルブミン、５×１０-5Ｍ
フェニルメチルスルホニルフルオリド、および０.０１
７ＴＩＵ／mlのアポプロチニンから成る溶菌緩衝液に溶
解した。得られた細胞溶解物を小型遠心機で１２,００
０×gの回転数で遠沈することにより透明にした。免疫
沈降反応を行なうため、細胞またはウイルスの溶解液を
リン酸緩衝液で３倍に希釈し、２〜５μlの好適な抗血
清と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。抗原
−抗体複合物を、固定した１０％Ｓ．aureus溶液(Ｋess
ler(４０a))の２５mlを加えることによって反応培地か
ら除き、１２,０００×gで３０秒間遠心分離して沈澱さ
せた。次に、Ｓ．aureus細胞を洗滌用緩衝液(ＰＢＳ、
１％ＮＰ−４０、０.３％ドデシル硫酸ナトリウム)で３
回洗滌し、細胞を２０μlのポリアクリルアミドゲルサ
ンプル緩衝液(１０％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール、０.０６２５Ｍトリスバッファー(pＨ６.
８)、０.０１％ブロモフェノールブルー)に懸濁させ、
９０℃で３分間インキュベートした。３０秒間遠心分離
(１２,０００×g)した後、上清を１０％ポリアクリルア
ミドゲルスラブゲル(４５)にかけた。
【００３５】クローンしたgＤの翻訳後修飾(プロセシン
グ)を更に調べるために、パルスチエイス実験を行なっ
た。図１０Ｂは35Ｓ−メチオニンでパルス標識した種々
の時間後の、gＤ−１２細胞からのクローン化したgＤと
家兎抗ＨＳＶ−１抗体(ＤakoＣorp．)との免疫沈降線を
示している。図１０ＢはgＤ１２細胞のパルス標識を示
す。これらの研究では、細胞は１０cmの組織培養皿で密
集して発育させ、前記と同様にして35Ｓ−メチオニンで
標識されるが、標識化反応は氷上で１５分間行ない、細
胞は新しい培養液で３回洗滌した後、恒温器に戻し、３
７℃で種々の時間インキュベートした。冷リン酸緩衝食
塩液中で細胞を洗滌することによって反応を停止させ、
前記と同様にして細胞を溶解した。タンパク質はパルス
標識後、次の時間で免疫沈降させた:１列目、５分後;２
列目、１５分後;３列目、３０分後;４列目、６０分後;
５列目、１２０分後。５１kdの分子量を有するgＤの前
駆体型は、gＤ１２細胞系から、35Ｓ−メチオニンでパ
ルス標識後、５分後から特異的に沈降し、この前駆体は
約６０分後により高い分子量型(５９kd)の所に追跡され
た。これらの検討から、本発明者らは、この翻訳後エベ
ントのハーフタイムは約４５分と推定した。５１kdバン
ドと５９kdバンドとの間の前駆体−生成物の関係は、ウ
イルスが生産したgＤに関する報告(１４、４２、４６、
４７)と非常によく似ており、またこのプロセスの反応
速度はＣohenらの記載(４２)とよく類似している。ウイ
ルス感染細胞における前駆体と生成物の分子量の相違
は、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴサッカライドの双方
に起因している(４８)。
グ)を更に調べるために、パルスチエイス実験を行なっ
た。図１０Ｂは35Ｓ−メチオニンでパルス標識した種々
の時間後の、gＤ−１２細胞からのクローン化したgＤと
家兎抗ＨＳＶ−１抗体(ＤakoＣorp．)との免疫沈降線を
示している。図１０ＢはgＤ１２細胞のパルス標識を示
す。これらの研究では、細胞は１０cmの組織培養皿で密
集して発育させ、前記と同様にして35Ｓ−メチオニンで
標識されるが、標識化反応は氷上で１５分間行ない、細
胞は新しい培養液で３回洗滌した後、恒温器に戻し、３
７℃で種々の時間インキュベートした。冷リン酸緩衝食
塩液中で細胞を洗滌することによって反応を停止させ、
前記と同様にして細胞を溶解した。タンパク質はパルス
標識後、次の時間で免疫沈降させた:１列目、５分後;２
列目、１５分後;３列目、３０分後;４列目、６０分後;
５列目、１２０分後。５１kdの分子量を有するgＤの前
駆体型は、gＤ１２細胞系から、35Ｓ−メチオニンでパ
ルス標識後、５分後から特異的に沈降し、この前駆体は
約６０分後により高い分子量型(５９kd)の所に追跡され
た。これらの検討から、本発明者らは、この翻訳後エベ
ントのハーフタイムは約４５分と推定した。５１kdバン
ドと５９kdバンドとの間の前駆体−生成物の関係は、ウ
イルスが生産したgＤに関する報告(１４、４２、４６、
４７)と非常によく似ており、またこのプロセスの反応
速度はＣohenらの記載(４２)とよく類似している。ウイ
ルス感染細胞における前駆体と生成物の分子量の相違
は、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴサッカライドの双方
に起因している(４８)。
【００３６】gＤが細胞表面へ輸送されるかどうか調べ
るために、間接免疫蛍光実験を行なった。これらの検討
では、細胞膜を透過せしめないような条件下(４９)で、
固定していない細胞を、家兎、マウスおよびヒト抗ＨＳ
Ｖ−１抗体と反応させた。gＤ細胞と成体(親)ＣＨＯ細
胞(１:１の比)をカバーグラス(２.２×２.２cm)に載
せ、細胞が約６０％密集(confluent)するまで発育させ
た。ＨＳＶ−１の抗体を含有することが判っているヒト
血清(５０)をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で４０倍に希釈
して、洗滌した細胞にその１００μlをピペットで滴下
し、増湿箱の中で室温で３０分間インキュベートした。
細胞をＰＢＳに３回浸漬して、結合していない抗体を洗
い去り、次に２０倍希釈のテトラメチルロダミンイソチ
オシアネート−標識ヤギ抗ヒトＩgＧ抗体(Ｃappel Ｌa
boratories)１００μlと更に３０分間インキュベートし
た。結合しなかった標識抗体をＰＢＳで洗い去り、細胞
を氷冷した、５０％エタノールおよび１００％エタノー
ル中で脱水し、顕微鏡のスライドグラス上でグリセロー
ルで再水和した(４９)。次に細胞を蛍光顕微鏡(Ｚeiss)
で位相差および蛍光光学下に検鏡した。図９のＡは、g
Ｄ１２およびＣＨＯ細胞の位相差光学的顕微鏡像であ
り、Ｂは、Ａと同じ細胞を蛍光像で把えたものである。
位相差顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を比較すると(図９)、g
Ｄ１２細胞は強く標識されているのに対し、成体(親)Ｃ
ＨＯ細胞は標識抗体とほとんどまたは全く結合しなかっ
たことがわかる。ＨＳＶ抗体に対してネガティブである
ことが知られている正常マウス血清、正常家兎血清、ま
たはヒト血清で行なった対照実験では、何ら特異的な細
胞の標識は検出できなかった。これらの検討からgＤは
細胞表面へ輸送されることが示唆された。細胞膜を透過
させ得ることが知られている薬剤(メタノールまたはア
セトン)で標識する前に固定したＣＨＯおよびgＤ細胞で
の実験では、異なった標識パターンが得られた。これら
の検討で、抗ＨＳＶ−１抗体によるgＤ１２細胞の強い
核周囲標識が観察されたが、ＣＨＯ細胞では何ら特異的
な標識化が見られなかった。
るために、間接免疫蛍光実験を行なった。これらの検討
では、細胞膜を透過せしめないような条件下(４９)で、
固定していない細胞を、家兎、マウスおよびヒト抗ＨＳ
Ｖ−１抗体と反応させた。gＤ細胞と成体(親)ＣＨＯ細
胞(１:１の比)をカバーグラス(２.２×２.２cm)に載
せ、細胞が約６０％密集(confluent)するまで発育させ
た。ＨＳＶ−１の抗体を含有することが判っているヒト
血清(５０)をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で４０倍に希釈
して、洗滌した細胞にその１００μlをピペットで滴下
し、増湿箱の中で室温で３０分間インキュベートした。
細胞をＰＢＳに３回浸漬して、結合していない抗体を洗
い去り、次に２０倍希釈のテトラメチルロダミンイソチ
オシアネート−標識ヤギ抗ヒトＩgＧ抗体(Ｃappel Ｌa
boratories)１００μlと更に３０分間インキュベートし
た。結合しなかった標識抗体をＰＢＳで洗い去り、細胞
を氷冷した、５０％エタノールおよび１００％エタノー
ル中で脱水し、顕微鏡のスライドグラス上でグリセロー
ルで再水和した(４９)。次に細胞を蛍光顕微鏡(Ｚeiss)
で位相差および蛍光光学下に検鏡した。図９のＡは、g
Ｄ１２およびＣＨＯ細胞の位相差光学的顕微鏡像であ
り、Ｂは、Ａと同じ細胞を蛍光像で把えたものである。
位相差顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を比較すると(図９)、g
Ｄ１２細胞は強く標識されているのに対し、成体(親)Ｃ
ＨＯ細胞は標識抗体とほとんどまたは全く結合しなかっ
たことがわかる。ＨＳＶ抗体に対してネガティブである
ことが知られている正常マウス血清、正常家兎血清、ま
たはヒト血清で行なった対照実験では、何ら特異的な細
胞の標識は検出できなかった。これらの検討からgＤは
細胞表面へ輸送されることが示唆された。細胞膜を透過
させ得ることが知られている薬剤(メタノールまたはア
セトン)で標識する前に固定したＣＨＯおよびgＤ細胞で
の実験では、異なった標識パターンが得られた。これら
の検討で、抗ＨＳＶ−１抗体によるgＤ１２細胞の強い
核周囲標識が観察されたが、ＣＨＯ細胞では何ら特異的
な標識化が見られなかった。
【００３７】gＤ１２細胞がヒトのＨＳＶ−１およびＨ
ＳＶ−２感染に対し適切な抗原決定基を発現するかどう
か決定するために、抗ＨＳＶ−１抗体または抗ＨＳＶ−
２抗体を有することが判っている個体(５０)から得た抗
体の結合性を検討した。代謝的に標識したgＤ１２細胞
から得られた細胞溶解物の放射免疫沈降反応では、げっ
歯類の抗ＨＳＶ血清で得られた結果に匹敵し得る結果を
得た(図１０)。同様に、ヒト抗ＨＳＶ−１血清は、間接
的免疫蛍光測定法により、特異的なgＤ１２細胞の標識
化を示す(図９)が、成体ＣＨＯ細胞系を標識化しなかっ
た。これらから、種々のげっ歯類の抗ＨＳＶ−１および
抗ＨＳＶ−２抗血清、単クローン性抗gＤ抗体およびヒ
ト抗ＨＳＶ抗血清によって得られた結果は、gＤ１２細
胞表面に発現されたgＤは、野性の該ウイルスと共通し
た多くの抗原決定基を有しており、しかもこれらの決定
基の構造は他のＨＳＶ−１タンパク質との相互反応に依
存していないという証據を提供している。試験した単ク
ローン性抗体の一つ(１−Ｓ)がインビトロ(４１)および
インビボ(５１)でＨＳＶ−１を中和することが知られて
いる事実は、ＣＨＯ細胞で生産されるgＤが野性のウイ
ルスと共通した中和抗原決定基を少なくとも１個は有し
ていることを示している。
ＳＶ−２感染に対し適切な抗原決定基を発現するかどう
か決定するために、抗ＨＳＶ−１抗体または抗ＨＳＶ−
２抗体を有することが判っている個体(５０)から得た抗
体の結合性を検討した。代謝的に標識したgＤ１２細胞
から得られた細胞溶解物の放射免疫沈降反応では、げっ
歯類の抗ＨＳＶ血清で得られた結果に匹敵し得る結果を
得た(図１０)。同様に、ヒト抗ＨＳＶ−１血清は、間接
的免疫蛍光測定法により、特異的なgＤ１２細胞の標識
化を示す(図９)が、成体ＣＨＯ細胞系を標識化しなかっ
た。これらから、種々のげっ歯類の抗ＨＳＶ−１および
抗ＨＳＶ−２抗血清、単クローン性抗gＤ抗体およびヒ
ト抗ＨＳＶ抗血清によって得られた結果は、gＤ１２細
胞表面に発現されたgＤは、野性の該ウイルスと共通し
た多くの抗原決定基を有しており、しかもこれらの決定
基の構造は他のＨＳＶ−１タンパク質との相互反応に依
存していないという証據を提供している。試験した単ク
ローン性抗体の一つ(１−Ｓ)がインビトロ(４１)および
インビボ(５１)でＨＳＶ−１を中和することが知られて
いる事実は、ＣＨＯ細胞で生産されるgＤが野性のウイ
ルスと共通した中和抗原決定基を少なくとも１個は有し
ていることを示している。
【００３８】gＤ１２細胞に対する抗ＨＳＶ抗体の結合
を定量的に測定するために酵素標識イムノソープション
アッセイ(enzyme−linked immunosorbtionassay)(ＥＬ
ＩＳＡ)が開発された(５２)。今回の研究では、９６穴
のマイクロタイター組織培養平板を使用し、gＤ１２細
胞とＣＨＯ細胞を交互に穴に加え、化学的に固定した。
次にＨＳＶに対する抗体を有することが判っている種々
の抗血清を連続的に逐次希釈して加え、固定した細胞と
反応させた。測定の終末点で、各穴の吸光度を測定し、
正常な結合曲線を作成した。gＤ１２細胞に対する抗体
の特異的な結合は、gＤ１２細胞で得られた値から成体
ＣＨＯ細胞で得られた値を減じることによって決定し
た。高い力価の血清による特異な結合は１:１０,０００
に希釈して検出することができた。
を定量的に測定するために酵素標識イムノソープション
アッセイ(enzyme−linked immunosorbtionassay)(ＥＬ
ＩＳＡ)が開発された(５２)。今回の研究では、９６穴
のマイクロタイター組織培養平板を使用し、gＤ１２細
胞とＣＨＯ細胞を交互に穴に加え、化学的に固定した。
次にＨＳＶに対する抗体を有することが判っている種々
の抗血清を連続的に逐次希釈して加え、固定した細胞と
反応させた。測定の終末点で、各穴の吸光度を測定し、
正常な結合曲線を作成した。gＤ１２細胞に対する抗体
の特異的な結合は、gＤ１２細胞で得られた値から成体
ＣＨＯ細胞で得られた値を減じることによって決定し
た。高い力価の血清による特異な結合は１:１０,０００
に希釈して検出することができた。
【００３９】gＤ１２細胞ＥＬＩＳＡ測定法を使用して
測定した血清力価を、通常の方法により決定した抗ＨＳ
Ｖ−１と抗ＨＳＶ−２力価と比較した。予じめ通常の方
法、即ち、血液凝集阻止反応(ＩＨＦ)または補体結合反
応(ＣＦ)でＨＳＶに対する力価測定を行なったヒト血清
(５０)を逐次希釈し、gＤ１２細胞系または成体ＣＨＯ
細胞系を含有するマイクロタイター板の孔に加え、抗g
Ｄ抗体の結合をＥＬＩＳＡ測定法で調べた。gＤ１２細
胞とＣＨＯ細胞は９６穴のマイクロタイター組織培養平
板(Ｆalcon Ｌabware)の穴に交互に植え、１０％ウシ
胎児血清を加えたＦ１２培地(ＧＩＢＣＯ)中で、密集し
て発育させた。細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で３回
洗滌し、次に０.０６２５％グルタールアルデヒドを加
えたＰＢＳで化学的に固定した。細胞は再度ＰＢＳで３
回洗滌し、所望の時期まで、１％ウシ血清アルブミン、
１００mＭグリシン、１mＭ ＮaＮ3を含有するＰＢＳ中
で４℃で貯蔵した。抗gＤ抗体力価を測定するには、細
胞をＰＢＳで洗滌し、逐次希釈した抗血清を固定した細
胞と室温で１時間反応させた(最終容量５０μl)。結合
しない抗体を洗い去り、細胞を西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(Ｔago Ｉnc．)とカップリングさせたヤギの抗ヒ
トＩgＧ(１:２０００希釈)５０μlとインキュベートし
た。酵素を結合した抗体を室温で１時間反応させ、次に
細胞をＰＢＳで３回洗滌した。インキュベーションの
後、ペルオシキダーゼの基質、o−フェニレンジアミン
を加え(２００μl)、更に１０分間反応を進行させた。
２.５Ｍ Ｈ2ＳＯ4(５０μl)を加えて反応を停止し、各
穴の反応液の吸光度を自動ブレートリーディングスペク
トロフォトメーター(Ｔitertek)で測定した。図１１に
おいて、白丸および黒丸で表わした血清は、１２８のＨ
ＳＶ−１ ＣＦ力価、および４０９６のＨＳＶ−１およ
びＨＳＶ−２のＩＨＦ力価を示している。白の四角およ
び黒の四角で表わした血清は、８以下のＨＳＶ−１ＣＦ
力価、８以下のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ＩＨＦ力
価を示している。Ａ図の黒丸および黒の四角はgＤ１２
細胞との結合を示し、白丸および白の四角はＣＨＯ細胞
との結合を示す。Ｂ図の黒丸および黒の四角は、Ａにお
ける値を差引いて算出したgＤ１２細胞への特異的な結
合を示す。図１１から、通常の方法による測定で高い抗
ＨＳＶ力価を示した血清は、ＥＬＩＳＡ法でも高い力価
が得られるが、一方、低い抗ＨＳＶ力価の別の血清では
gＤ１２ＥＬＩＳＡで検出し得る結合が得られないこと
が判る。
測定した血清力価を、通常の方法により決定した抗ＨＳ
Ｖ−１と抗ＨＳＶ−２力価と比較した。予じめ通常の方
法、即ち、血液凝集阻止反応(ＩＨＦ)または補体結合反
応(ＣＦ)でＨＳＶに対する力価測定を行なったヒト血清
(５０)を逐次希釈し、gＤ１２細胞系または成体ＣＨＯ
細胞系を含有するマイクロタイター板の孔に加え、抗g
Ｄ抗体の結合をＥＬＩＳＡ測定法で調べた。gＤ１２細
胞とＣＨＯ細胞は９６穴のマイクロタイター組織培養平
板(Ｆalcon Ｌabware)の穴に交互に植え、１０％ウシ
胎児血清を加えたＦ１２培地(ＧＩＢＣＯ)中で、密集し
て発育させた。細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で３回
洗滌し、次に０.０６２５％グルタールアルデヒドを加
えたＰＢＳで化学的に固定した。細胞は再度ＰＢＳで３
回洗滌し、所望の時期まで、１％ウシ血清アルブミン、
１００mＭグリシン、１mＭ ＮaＮ3を含有するＰＢＳ中
で４℃で貯蔵した。抗gＤ抗体力価を測定するには、細
胞をＰＢＳで洗滌し、逐次希釈した抗血清を固定した細
胞と室温で１時間反応させた(最終容量５０μl)。結合
しない抗体を洗い去り、細胞を西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(Ｔago Ｉnc．)とカップリングさせたヤギの抗ヒ
トＩgＧ(１:２０００希釈)５０μlとインキュベートし
た。酵素を結合した抗体を室温で１時間反応させ、次に
細胞をＰＢＳで３回洗滌した。インキュベーションの
後、ペルオシキダーゼの基質、o−フェニレンジアミン
を加え(２００μl)、更に１０分間反応を進行させた。
２.５Ｍ Ｈ2ＳＯ4(５０μl)を加えて反応を停止し、各
穴の反応液の吸光度を自動ブレートリーディングスペク
トロフォトメーター(Ｔitertek)で測定した。図１１に
おいて、白丸および黒丸で表わした血清は、１２８のＨ
ＳＶ−１ ＣＦ力価、および４０９６のＨＳＶ−１およ
びＨＳＶ−２のＩＨＦ力価を示している。白の四角およ
び黒の四角で表わした血清は、８以下のＨＳＶ−１ＣＦ
力価、８以下のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ＩＨＦ力
価を示している。Ａ図の黒丸および黒の四角はgＤ１２
細胞との結合を示し、白丸および白の四角はＣＨＯ細胞
との結合を示す。Ｂ図の黒丸および黒の四角は、Ａにお
ける値を差引いて算出したgＤ１２細胞への特異的な結
合を示す。図１１から、通常の方法による測定で高い抗
ＨＳＶ力価を示した血清は、ＥＬＩＳＡ法でも高い力価
が得られるが、一方、低い抗ＨＳＶ力価の別の血清では
gＤ１２ＥＬＩＳＡで検出し得る結合が得られないこと
が判る。
【００４０】記載した検討から、安定した細胞系列は、
ヘルペスウイルス感染によって生じる抗体と結合するト
ランスフェクト遺伝子産物を、細胞表面に構成的に発現
することが証明された。
ヘルペスウイルス感染によって生じる抗体と結合するト
ランスフェクト遺伝子産物を、細胞表面に構成的に発現
することが証明された。
【００４１】gＤ１２細胞によるマウスの免疫感作 雌性ＢＡＬＢ／c系マウス(５週令)２０匹をＳi−monsen
Ｌaboratories(Ｇilroy、Ｃalifornia)から入手し
た。マウスを各１０匹づつの“実験"群と“対照"群の２
群に分けた。実験群の各マウスには、細胞表面にＨＳＶ
−１糖タンパク質Ｄを発現することが知られているgＤ
１２細胞を注射した。対照群の各マウスには、gＤ１２
細胞が誘導された成体(親)チャイニーズハムスターの卵
巣細胞系(ＣＨＯ細胞)を注射した。マウスを免疫感作す
るために、この２つのタイプの細胞を１５cmの組織培養
皿に密集して増殖させた。ＣＨＯ細胞は、市販の透析し
た７％ウシ胎児血清(ＧＩＢＣＯ)、ペニシリン(１００u
／ml)、およびストレプトマイシン(１００u／ml)を添加
したＨams Ｆ１２培地(ＧＩＢＣＯ)で発育させた。gＤ
１２細胞はグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを
欠いた同じ培地に発育させた。細胞を回収するため、各
皿を１５mlのリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で２回洗滌し、
次に０.０２％ＥＤＴＡを加えた１５mlのＰＢＳで処理
した。１５〜２０分後に細胞を皿から除き、臨床検査用
遠心機(ＩＥＣモデルＣＬ臨床用遠心機、ローターモデ
ル２２１)を用い、全速回転で５分間遠心分離すること
によりペレット化した。上清を廃棄し、各１５cmの皿上
の細胞当たりＰＢＳの最終濃度が１mlとなるよう、細胞
をＰＢＳに再懸濁させた。各マウス１匹当たり０.５ml
の細胞浮遊液(〜５×１０6細胞)を、その０.２５mlを腹
腔内に、０.２５mlを頸背部のたるんだ皮膚に皮下注射
するやり方で注入した。次いでマウスに、一次免疫感作
後３８日目および５５日目の２回、新しい細胞(前記と
同様にして調製する)で追加免疫した。６８日目に、マ
ウスの尾静脈から採血し、インビトロの中和試験用の血
清を得た。７０日目にマウスにＨＳＶ−１(Ｍac Ｉnty
re株)をチャレンジ(抗原刺激)した。ウイルスのチャレ
ンジは、各マウス当たり２×１０7pfuのウイルスの腹腔
内注射によって行なった。マウスの死亡率、１日おきの
体重変化および麻痺の出現を毎日記録した。対照群のマ
ウスは、ウイルスチャレンジ後７日以内に全例死亡した
のに対し、実験群マウスは全例防御され、何ら感染の徴
候を示さなかった。この研究によって、gＤ１２細胞に
よる免疫感作は致死量のＨＳＶ−１ウイルスのチャレン
ジを防御することが結論された。
Ｌaboratories(Ｇilroy、Ｃalifornia)から入手し
た。マウスを各１０匹づつの“実験"群と“対照"群の２
群に分けた。実験群の各マウスには、細胞表面にＨＳＶ
−１糖タンパク質Ｄを発現することが知られているgＤ
１２細胞を注射した。対照群の各マウスには、gＤ１２
細胞が誘導された成体(親)チャイニーズハムスターの卵
巣細胞系(ＣＨＯ細胞)を注射した。マウスを免疫感作す
るために、この２つのタイプの細胞を１５cmの組織培養
皿に密集して増殖させた。ＣＨＯ細胞は、市販の透析し
た７％ウシ胎児血清(ＧＩＢＣＯ)、ペニシリン(１００u
／ml)、およびストレプトマイシン(１００u／ml)を添加
したＨams Ｆ１２培地(ＧＩＢＣＯ)で発育させた。gＤ
１２細胞はグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを
欠いた同じ培地に発育させた。細胞を回収するため、各
皿を１５mlのリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で２回洗滌し、
次に０.０２％ＥＤＴＡを加えた１５mlのＰＢＳで処理
した。１５〜２０分後に細胞を皿から除き、臨床検査用
遠心機(ＩＥＣモデルＣＬ臨床用遠心機、ローターモデ
ル２２１)を用い、全速回転で５分間遠心分離すること
によりペレット化した。上清を廃棄し、各１５cmの皿上
の細胞当たりＰＢＳの最終濃度が１mlとなるよう、細胞
をＰＢＳに再懸濁させた。各マウス１匹当たり０.５ml
の細胞浮遊液(〜５×１０6細胞)を、その０.２５mlを腹
腔内に、０.２５mlを頸背部のたるんだ皮膚に皮下注射
するやり方で注入した。次いでマウスに、一次免疫感作
後３８日目および５５日目の２回、新しい細胞(前記と
同様にして調製する)で追加免疫した。６８日目に、マ
ウスの尾静脈から採血し、インビトロの中和試験用の血
清を得た。７０日目にマウスにＨＳＶ−１(Ｍac Ｉnty
re株)をチャレンジ(抗原刺激)した。ウイルスのチャレ
ンジは、各マウス当たり２×１０7pfuのウイルスの腹腔
内注射によって行なった。マウスの死亡率、１日おきの
体重変化および麻痺の出現を毎日記録した。対照群のマ
ウスは、ウイルスチャレンジ後７日以内に全例死亡した
のに対し、実験群マウスは全例防御され、何ら感染の徴
候を示さなかった。この研究によって、gＤ１２細胞に
よる免疫感作は致死量のＨＳＶ−１ウイルスのチャレン
ジを防御することが結論された。
【００４２】種々の選択マーカーを使用して、種々のト
ランスフェクション計画が可能である。例えば、マウス
Ｌ細胞は変異体dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用し
て、有効にトランスフェクションされる。gＤ遺伝子
を、そのようなマーカーを包含するベクターを介してそ
のような細胞にトランスフェクトした。原則として、本
発明者らが記載した方法は、膜タンパク質の発現が所望
される如何なる状況においても適用が可能である。
ランスフェクション計画が可能である。例えば、マウス
Ｌ細胞は変異体dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用し
て、有効にトランスフェクションされる。gＤ遺伝子
を、そのようなマーカーを包含するベクターを介してそ
のような細胞にトランスフェクトした。原則として、本
発明者らが記載した方法は、膜タンパク質の発現が所望
される如何なる状況においても適用が可能である。
【００４３】先端切断型gＤ遺伝子の発現 これまでの記述は膜結合型gＤタンパク質の生産に関す
る。然しながら、図６に関連して先に論じたように、Ｈ
ＳＶ−１とＨＳＶ−２のgＤタンパク質のアミノ酸配列
の解析から、いずれの場合も疎水性／親水性カルボキシ
ル末端の膜結合領域の存在することが確かめられた(図
１２)。
る。然しながら、図６に関連して先に論じたように、Ｈ
ＳＶ−１とＨＳＶ−２のgＤタンパク質のアミノ酸配列
の解析から、いずれの場合も疎水性／親水性カルボキシ
ル末端の膜結合領域の存在することが確かめられた(図
１２)。
【００４４】ＨＳＶ−１糖タンパク質(gＤ)の模式図 遺伝子配列から導かれたgＤ遺伝子配列のヒドロパシー
解析(３１a)から、タンパク質の疎水性領域(陰影部分)
および親水性領域(＋印)が決定された。膜に局在し、結
合するのに重要であると思われる領域だけを示した。機
能的領域は、a)シグナル配列(３３)、b)疎水性の膜透過
領域、c)荷電している膜固定領域である。推定される３
ケ所のＮ−連結糖付加部位はＧの文字で示す。発現プラ
スミドは、pＢＲ３２２の細菌性複製起源とアンピシリ
ン耐性遺伝子、ＳＶ４０初期(第一)プロモーターの転写
コントロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子を暗号化しているcＤＮＡ挿入体(５３)、および
第２のＳＶ４０初期プロモーターの転写コントロール下
にあるgＤの最初の３００アミノ酸を暗号化しているＨi
nd ＩＩＩ−Ｈinf１断片から成る。この断片のＨindＩ
ＩＩ部位はgＤ遺伝子のイニシエーターメチオニンの５'
−位側へ７４bpに位置している。ＳＶ−４０の初期領域
ベクターのＨindＩＩＩ部位(３６)はＳＶ４０プロモー
ターのＧoldberg−Ｈognessボックスの３'−位側へ２５
０bpに位置している。Ｈinf１部位(ＫlenowＤＮＡポリ
メラーゼと４デオキシヌクレオチド−３リン酸で平滑化
した)を、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原遺伝子の３'非翻
訳領域のＨpa １部位(３６)へ連結(リゲーション)す
る。この方法は先端切断ＨＳＶ−２遺伝子を生産するの
にも有用である。得られた配列は、gＤ遺伝子のアミノ
酸３００のすぐ後に停止コドン(ＴＡＡ)を作り出す。先
端切断gＤ遺伝子転写のための転写停止およびポリアデ
ニル化部位は、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の３'非翻訳領
域(３６)により暗号化されている。
解析(３１a)から、タンパク質の疎水性領域(陰影部分)
および親水性領域(＋印)が決定された。膜に局在し、結
合するのに重要であると思われる領域だけを示した。機
能的領域は、a)シグナル配列(３３)、b)疎水性の膜透過
領域、c)荷電している膜固定領域である。推定される３
ケ所のＮ−連結糖付加部位はＧの文字で示す。発現プラ
スミドは、pＢＲ３２２の細菌性複製起源とアンピシリ
ン耐性遺伝子、ＳＶ４０初期(第一)プロモーターの転写
コントロール下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子を暗号化しているcＤＮＡ挿入体(５３)、および
第２のＳＶ４０初期プロモーターの転写コントロール下
にあるgＤの最初の３００アミノ酸を暗号化しているＨi
nd ＩＩＩ−Ｈinf１断片から成る。この断片のＨindＩ
ＩＩ部位はgＤ遺伝子のイニシエーターメチオニンの５'
−位側へ７４bpに位置している。ＳＶ−４０の初期領域
ベクターのＨindＩＩＩ部位(３６)はＳＶ４０プロモー
ターのＧoldberg−Ｈognessボックスの３'−位側へ２５
０bpに位置している。Ｈinf１部位(ＫlenowＤＮＡポリ
メラーゼと４デオキシヌクレオチド−３リン酸で平滑化
した)を、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原遺伝子の３'非翻
訳領域のＨpa １部位(３６)へ連結(リゲーション)す
る。この方法は先端切断ＨＳＶ−２遺伝子を生産するの
にも有用である。得られた配列は、gＤ遺伝子のアミノ
酸３００のすぐ後に停止コドン(ＴＡＡ)を作り出す。先
端切断gＤ遺伝子転写のための転写停止およびポリアデ
ニル化部位は、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の３'非翻訳領
域(３６)により暗号化されている。
【００４５】プラスミドpgＤtrunc．dhfrは次のように
して組み立てられた。gＤを含有している２.９キロベー
スのＳac１断片を、Ｓac１で切断したプラスミドpＦＭ
３(前述)中でＨＳＶ−１ゲノム(前述)からクローンした
ＢamＨＩ断片から分離した。完全なgＤ遺伝子を含有す
る１.６kb ＨindＩＩＩ−ＢstＮ１断片を、ＨindＩＩ
Ｉ−ＢstＮ１で消化したpＦＭ４２(ＥＰＯ特許出願第６
８６９３号)へサブクローンした。次に、このプラスミ
ドをＨinf１で切断し、Ｋlenow ＤＮＡポリメラーゼと
４個のデオキシヌクレオチド−３リン酸で平滑化し、次
いでＨindＩＩＩで切断した。先端を切断したgＤ遺伝子
を含有する９６０塩基対(bp)のＨindＩＩＩ−プラント
(平滑化)Ｈinf１断片を分離し、ＨindＩＩＩ−Ｈpa１で
消化したpＥＨＢal１４へ連結した。得られた組み立て
体(pgＤＣos−trunc)は、その３プライム末端にＢ型肝
炎ウイルスの表面抗原遺伝子を持った先端切断gＤ遺伝
子を含有していた。先端を切断されたgＤ遺伝子を含有
する２．３kb ＨindＩＩＩ−ＢamＨ１断片をpgＤＣos
−truncから分離した。ＳＶ−４０由来の初期プロモー
ターおよびpＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子および
細菌性複製起源を含有する２．８kb断片をプラスミドp
ＥＨＢal１４から分離した。第２のＳＶ−４０初期プロ
モーターの転写コントロール下にあるマウスジヒドロ葉
酸レダクターゼcＤＮＡクローンを含有する２．１kb断
片をプラスミドpＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２(３６)
から分離した。これら３個の断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結し、得られた混合物をＥ．coli細菌株２９４への
導入に使用した。得られたコロニーから得たプラスミド
ＤＮＡをＳac２でスクリーニングし、正確に組み立てら
れたpgＤtrunc．dhfr(図１３)を更にトランスフェクシ
ョン研究に使用した。
して組み立てられた。gＤを含有している２.９キロベー
スのＳac１断片を、Ｓac１で切断したプラスミドpＦＭ
３(前述)中でＨＳＶ−１ゲノム(前述)からクローンした
ＢamＨＩ断片から分離した。完全なgＤ遺伝子を含有す
る１.６kb ＨindＩＩＩ−ＢstＮ１断片を、ＨindＩＩ
Ｉ−ＢstＮ１で消化したpＦＭ４２(ＥＰＯ特許出願第６
８６９３号)へサブクローンした。次に、このプラスミ
ドをＨinf１で切断し、Ｋlenow ＤＮＡポリメラーゼと
４個のデオキシヌクレオチド−３リン酸で平滑化し、次
いでＨindＩＩＩで切断した。先端を切断したgＤ遺伝子
を含有する９６０塩基対(bp)のＨindＩＩＩ−プラント
(平滑化)Ｈinf１断片を分離し、ＨindＩＩＩ−Ｈpa１で
消化したpＥＨＢal１４へ連結した。得られた組み立て
体(pgＤＣos−trunc)は、その３プライム末端にＢ型肝
炎ウイルスの表面抗原遺伝子を持った先端切断gＤ遺伝
子を含有していた。先端を切断されたgＤ遺伝子を含有
する２．３kb ＨindＩＩＩ−ＢamＨ１断片をpgＤＣos
−truncから分離した。ＳＶ−４０由来の初期プロモー
ターおよびpＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子および
細菌性複製起源を含有する２．８kb断片をプラスミドp
ＥＨＢal１４から分離した。第２のＳＶ−４０初期プロ
モーターの転写コントロール下にあるマウスジヒドロ葉
酸レダクターゼcＤＮＡクローンを含有する２．１kb断
片をプラスミドpＥ３４８ＨＢＶＥ４００Ｄ２２(３６)
から分離した。これら３個の断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結し、得られた混合物をＥ．coli細菌株２９４への
導入に使用した。得られたコロニーから得たプラスミド
ＤＮＡをＳac２でスクリーニングし、正確に組み立てら
れたpgＤtrunc．dhfr(図１３)を更にトランスフェクシ
ョン研究に使用した。
【００４６】プラスミドpＥＨＢal１４は、ＳＶ−４０
−肝炎ウイルスのキメラ遺伝子であるpＥ３４２ΔＲ
1(後述)をＸbaＩで開裂することにより、一度ＨＢＶ表
面抗原の暗号化領域において開裂し、引続きこのＸbaＩ
部位の周囲の配列をヌクレアーゼＢal３１を使用して除
去することにより組み立てた。このプラスミドを合成オ
リゴヌクレオチド５'−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣの存在下
でライゲートした。これにより、ＨＢＶ、ＤＮＡにＨin
dＩＩＩ制限部位が加わる。
−肝炎ウイルスのキメラ遺伝子であるpＥ３４２ΔＲ
1(後述)をＸbaＩで開裂することにより、一度ＨＢＶ表
面抗原の暗号化領域において開裂し、引続きこのＸbaＩ
部位の周囲の配列をヌクレアーゼＢal３１を使用して除
去することにより組み立てた。このプラスミドを合成オ
リゴヌクレオチド５'−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣの存在下
でライゲートした。これにより、ＨＢＶ、ＤＮＡにＨin
dＩＩＩ制限部位が加わる。
【００４７】得られたプラスミドを、〜１５０bpのＥco
ＲＩ−ＨindＩＩＩ断片についてスクリーニングした。p
ＥＨＢal１４の配列決定をし、ＨindＩＩＩ部位はＨＢs
Ａg開始コドンが標準的に見出される場所のすぐ上流の
位置に存在することが確かめられた。このように、この
組み立てにより、クローンするのに好適な独特のＨind
ＩＩＩ部位が、高度に発現されるタンパク質(ＨＢsＡg)
の翻訳開始位置に置かれる。タンパク質を高度に発現す
るのに必要ななんらかの推定されるシグナルが、この
５'−リーダー配列上に存在するはずである。
ＲＩ−ＨindＩＩＩ断片についてスクリーニングした。p
ＥＨＢal１４の配列決定をし、ＨindＩＩＩ部位はＨＢs
Ａg開始コドンが標準的に見出される場所のすぐ上流の
位置に存在することが確かめられた。このように、この
組み立てにより、クローンするのに好適な独特のＨind
ＩＩＩ部位が、高度に発現されるタンパク質(ＨＢsＡg)
の翻訳開始位置に置かれる。タンパク質を高度に発現す
るのに必要ななんらかの推定されるシグナルが、この
５'−リーダー配列上に存在するはずである。
【００４８】ＨＢＶ表面抗原を発現するプラスミドpＥ
３４２(pＨＢs３４８−Ｅとも呼ばれる)は、ＥＰＯ公報
第００７３６５６号(１９８３年３月９日)にＬevinson
らにより記載されている(簡単に説明すると、Ｓimianウ
イルスＳＶ４０の起源は、ＳＶ４０ＤＮＡをＨindＩＩ
Ｉで消化し、コンバーター(ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ)を加
えることによりＨindＩＩＩ末端をＥcoＲＩ末端へ変換
することによって分離した。)。このＤＮＡをＰvuＩＩ
で切断し、ＲＩリンカーを加えた。次いでＥcoＲＩで消
化した後、起源にまで及ぶ３４８塩基対(bp)の断片をポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法および電気溶出法によ
り分離し、pＢＲ３２２にクローンした。ＨＢＶをＥco
ＲＩおよびＢgＩＩＩで消化して得られた１９８６bp断
片(ＡnimalＶirus Ｇenetics,(Ｃh．５)Ａcad．Ｐres
s,Ｎ．Ｙ．(１９８０))(これはＨＢsＡgを暗号化してい
る遺伝子にまで及ぶ)をプラスミドpＭＬ(Ｌuskyら,Ｎat
ure,２９３:７９(１９８１))のＥcoＲＩとＢamＨＩ部位
にクローンすることによって、発現プラスミドpＨＢＳ
３４２−Ｅを組み立てた。(pＭＬは、サル細胞における
プラスミド複製を抑制する配列を欠失したpＢＲ３２２
の誘導体である)。次に、得られたプラスミド(pＲＩ−
Ｂgl)をＥcoＲＩとつなぎ、ＳＶ４０の起源領域を表わ
す３４８bpの断片をpＲＩ−ＢglのＥcoＲＩ部位へ導入
した。起源断片はどちらの方向からでも挿入できる。こ
の断片は複製起源だけではなく、初期および後期ＳＶ４
０プロモーターの両方を暗号化しているので、ＨＢＶ遺
伝子はこの方向によってどちらかのプロモーターのコン
トロール下に発現されることができる(ＨＢsを表わすp
ＨＢＳ−３４８−Ｅは初期プロモーターのコントロール
下に発現される)。pＥ３４２は、ＥcoＲＩで部分消化
し、ＫlenowＤＮＡポリメラーゼＩを使用して切断部位
を充填し、プラスミドの背後同志を連結(リゲーション)
し、pＥ３４２のＳＶ４０起源に先行するＥcoＲＩ部位
を除くことにより修飾された。得られたプラスミドはp
Ｅ３４２ΔＲＩと命名した。
３４２(pＨＢs３４８−Ｅとも呼ばれる)は、ＥＰＯ公報
第００７３６５６号(１９８３年３月９日)にＬevinson
らにより記載されている(簡単に説明すると、Ｓimianウ
イルスＳＶ４０の起源は、ＳＶ４０ＤＮＡをＨindＩＩ
Ｉで消化し、コンバーター(ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ)を加
えることによりＨindＩＩＩ末端をＥcoＲＩ末端へ変換
することによって分離した。)。このＤＮＡをＰvuＩＩ
で切断し、ＲＩリンカーを加えた。次いでＥcoＲＩで消
化した後、起源にまで及ぶ３４８塩基対(bp)の断片をポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法および電気溶出法によ
り分離し、pＢＲ３２２にクローンした。ＨＢＶをＥco
ＲＩおよびＢgＩＩＩで消化して得られた１９８６bp断
片(ＡnimalＶirus Ｇenetics,(Ｃh．５)Ａcad．Ｐres
s,Ｎ．Ｙ．(１９８０))(これはＨＢsＡgを暗号化してい
る遺伝子にまで及ぶ)をプラスミドpＭＬ(Ｌuskyら,Ｎat
ure,２９３:７９(１９８１))のＥcoＲＩとＢamＨＩ部位
にクローンすることによって、発現プラスミドpＨＢＳ
３４２−Ｅを組み立てた。(pＭＬは、サル細胞における
プラスミド複製を抑制する配列を欠失したpＢＲ３２２
の誘導体である)。次に、得られたプラスミド(pＲＩ−
Ｂgl)をＥcoＲＩとつなぎ、ＳＶ４０の起源領域を表わ
す３４８bpの断片をpＲＩ−ＢglのＥcoＲＩ部位へ導入
した。起源断片はどちらの方向からでも挿入できる。こ
の断片は複製起源だけではなく、初期および後期ＳＶ４
０プロモーターの両方を暗号化しているので、ＨＢＶ遺
伝子はこの方向によってどちらかのプロモーターのコン
トロール下に発現されることができる(ＨＢsを表わすp
ＨＢＳ−３４８−Ｅは初期プロモーターのコントロール
下に発現される)。pＥ３４２は、ＥcoＲＩで部分消化
し、ＫlenowＤＮＡポリメラーゼＩを使用して切断部位
を充填し、プラスミドの背後同志を連結(リゲーション)
し、pＥ３４２のＳＶ４０起源に先行するＥcoＲＩ部位
を除くことにより修飾された。得られたプラスミドはp
Ｅ３４２ΔＲＩと命名した。
【００４９】得られた配列はgＤ遺伝子のアミノ酸３０
０のすぐ後に停止コドン(ＴＡＡ)を作り出す。先端を切
り取ったgＤ遺伝子転写の転写停止部位とポリアデニル
化部位は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の非翻訳３'領域
(３６)によって暗号化されている。
０のすぐ後に停止コドン(ＴＡＡ)を作り出す。先端を切
り取ったgＤ遺伝子転写の転写停止部位とポリアデニル
化部位は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の非翻訳３'領域
(３６)によって暗号化されている。
【００５０】生成したベクターをdhfr-ＣＨＯ細胞系(３
９)へトランスフェクション(ＤＮＡ感染)させ、先端を
切り取ったgＤタンパク質を生産し、それを周囲の媒質
へ分泌する好適なクローンgＤ１０.２を選択した。タン
パク質を媒質から抽出し、細胞の免疫原性活性を試験し
た。図１４に、細胞内および細胞外の35Ｓ−メチオニン
標識抽出物の免疫沈降試験の成績を示す。
９)へトランスフェクション(ＤＮＡ感染)させ、先端を
切り取ったgＤタンパク質を生産し、それを周囲の媒質
へ分泌する好適なクローンgＤ１０.２を選択した。タン
パク質を媒質から抽出し、細胞の免疫原性活性を試験し
た。図１４に、細胞内および細胞外の35Ｓ−メチオニン
標識抽出物の免疫沈降試験の成績を示す。
【００５１】細胞連合型および分泌型gＤの放射免疫沈
降試験 市販の透析した７％のウシ胎児血清(Ｇibco)、ペニシリ
ン(１００u／ml)、およびストレプトマイシン(１００u
／ml)を添加したＨamのＦ１２培地(Ｇibco)に細胞を発
育させた。培養が約８０％に密集した時に、培地を除去
し、細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で２回洗滌し、標
識培地(１／１０規定濃度のメチオニンを含有するＤulb
eccoにより改良されたＥagle培地)を最終濃度０.０５ml
／cm2となるまで加えた。35Ｓ−メチオニン(ＳＪ．２０
４、Ａmersham Ｉnt．)を最終濃度５０〜７５uＣi／ml
となるまで加え、細胞を１８〜２０時間発育させた。標
識後、培地を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗滌し、０.
０２％ＥＤＴＡを加えたＰＢＳで処理することにより培
養皿から除いた。次に細胞を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４
０、０.１％ウシ血清アルブミン、５×１０-5Ｍフェニ
ルメチルスルホニルフルオリド、および０.０１７ＴＩ
Ｕ／mlのアポプロチニンから成る細胞溶解緩衝液に溶解
し、得られた溶解液を１２,０００×gで遠心分離するこ
とにより透明にした。免疫沈降反応に使用するため、細
胞溶解液をＰＢＳで３倍に希釈し、検液(標準的には１
８０μl)を２〜５μlの抗血清と混合し、４℃で３０分
間インキュベートした。分泌型のgＤを免疫沈降するた
め、５００μlの条件培地を２μlの抗血清と３０分間、
４℃でインキュベートした。免疫複合体はＫesslerの方
法(４０a)により固定したＳ．aureus細胞に吸着させ、
１２,０００×gで３０分間遠心分離して沈降させた。次
に、Ｓ．aureus細胞を洗滌緩衝液(ＰＢＳ、１％ＮＰ−
４０、０.３０％ドデシル硫酸ナトリウム)で３回洗滌
し、免疫複合体を２０μlのポリアクリルアミドゲルサ
ンプル緩衝液(１０％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール、０.０１％ブロモフェノールブルーを含
有する６２.５mＭトリス−ＨＣl緩衝液(pＨ６.８))で、
９０℃で３分間溶出した。３０秒間遠心後、Ｌaemmliの
方法(４５)に従い、上清を１０％ポリアクリルアミド平
板(スラブ)ゲルに掛けた。Ａ:gＤ１２細胞系から得た全
膜結合型gＤの免疫沈降線。Ｂ:２個の別個に誘導した細
胞系(１および２)の溶解液から得た先端切断gＤの細胞
連合型の免疫沈降線。Ｃ:Ｂに示した２個の細胞系の培
養上清から得られた先端切断gＤの免疫沈降線。(−)
は、対照家兎抗血清を示し、(＋)は、家兎抗ＨＳＶ−１
抗血清を示す(Ｄako Ｃorp．)。
降試験 市販の透析した７％のウシ胎児血清(Ｇibco)、ペニシリ
ン(１００u／ml)、およびストレプトマイシン(１００u
／ml)を添加したＨamのＦ１２培地(Ｇibco)に細胞を発
育させた。培養が約８０％に密集した時に、培地を除去
し、細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)で２回洗滌し、標
識培地(１／１０規定濃度のメチオニンを含有するＤulb
eccoにより改良されたＥagle培地)を最終濃度０.０５ml
／cm2となるまで加えた。35Ｓ−メチオニン(ＳＪ．２０
４、Ａmersham Ｉnt．)を最終濃度５０〜７５uＣi／ml
となるまで加え、細胞を１８〜２０時間発育させた。標
識後、培地を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗滌し、０.
０２％ＥＤＴＡを加えたＰＢＳで処理することにより培
養皿から除いた。次に細胞を、ＰＢＳ、３％ＮＰ−４
０、０.１％ウシ血清アルブミン、５×１０-5Ｍフェニ
ルメチルスルホニルフルオリド、および０.０１７ＴＩ
Ｕ／mlのアポプロチニンから成る細胞溶解緩衝液に溶解
し、得られた溶解液を１２,０００×gで遠心分離するこ
とにより透明にした。免疫沈降反応に使用するため、細
胞溶解液をＰＢＳで３倍に希釈し、検液(標準的には１
８０μl)を２〜５μlの抗血清と混合し、４℃で３０分
間インキュベートした。分泌型のgＤを免疫沈降するた
め、５００μlの条件培地を２μlの抗血清と３０分間、
４℃でインキュベートした。免疫複合体はＫesslerの方
法(４０a)により固定したＳ．aureus細胞に吸着させ、
１２,０００×gで３０分間遠心分離して沈降させた。次
に、Ｓ．aureus細胞を洗滌緩衝液(ＰＢＳ、１％ＮＰ−
４０、０.３０％ドデシル硫酸ナトリウム)で３回洗滌
し、免疫複合体を２０μlのポリアクリルアミドゲルサ
ンプル緩衝液(１０％グリセロール、５％２−メルカプ
トエタノール、０.０１％ブロモフェノールブルーを含
有する６２.５mＭトリス−ＨＣl緩衝液(pＨ６.８))で、
９０℃で３分間溶出した。３０秒間遠心後、Ｌaemmliの
方法(４５)に従い、上清を１０％ポリアクリルアミド平
板(スラブ)ゲルに掛けた。Ａ:gＤ１２細胞系から得た全
膜結合型gＤの免疫沈降線。Ｂ:２個の別個に誘導した細
胞系(１および２)の溶解液から得た先端切断gＤの細胞
連合型の免疫沈降線。Ｃ:Ｂに示した２個の細胞系の培
養上清から得られた先端切断gＤの免疫沈降線。(−)
は、対照家兎抗血清を示し、(＋)は、家兎抗ＨＳＶ−１
抗血清を示す(Ｄako Ｃorp．)。
【００５２】図に見られるように、３５,０００ダルト
ンの細胞内型、および分泌され、明らかに糖付加されて
いる細胞外gＤタンパク質が明瞭である。
ンの細胞内型、および分泌され、明らかに糖付加されて
いる細胞外gＤタンパク質が明瞭である。
【００５３】免疫感作に使用する先端切断gＤ製剤 gＤ１０.２細胞を、ポリスチレン製回転組織培養瓶(Ｃo
rning ２５１４０)で、市販の透析した７％ウシ胎児血
清、５０μg／mlのストレプトマイシン、および０.３μ
gのグルタミンを添加したＦ１２培地中で密に発育させ
た。密生後、培地を除き、ウシ胎児血清を含まない同じ
培養液で３回洗滌し、２mg／mlのＨepes緩衝液(血清を
含まぬ培地)を添加した。細胞を血清を含まぬ培地中で
３〜４日発育させ。次に条件付き培地を回収して、−２
０℃で貯蔵した。培地を３７℃で融解し、ＳorvallＧＳ
−３ローターで２０分間５００rpmで遠心した。遠心
後、ペレットは破棄し、上清はＹＭ−５限外濾過膜を備
えた限外濾過装置(Ａmicon)で濃縮した。得られた標品
を出発物質と比較して約１５０倍に濃縮したところ、１
l当たり約８mgのタンパク質を含有していた。次にこの
標品をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)でよく透析し、それ以
上精製することなく免疫感作に使用した。
rning ２５１４０)で、市販の透析した７％ウシ胎児血
清、５０μg／mlのストレプトマイシン、および０.３μ
gのグルタミンを添加したＦ１２培地中で密に発育させ
た。密生後、培地を除き、ウシ胎児血清を含まない同じ
培養液で３回洗滌し、２mg／mlのＨepes緩衝液(血清を
含まぬ培地)を添加した。細胞を血清を含まぬ培地中で
３〜４日発育させ。次に条件付き培地を回収して、−２
０℃で貯蔵した。培地を３７℃で融解し、ＳorvallＧＳ
−３ローターで２０分間５００rpmで遠心した。遠心
後、ペレットは破棄し、上清はＹＭ−５限外濾過膜を備
えた限外濾過装置(Ａmicon)で濃縮した。得られた標品
を出発物質と比較して約１５０倍に濃縮したところ、１
l当たり約８mgのタンパク質を含有していた。次にこの
標品をリン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)でよく透析し、それ以
上精製することなく免疫感作に使用した。
【００５４】マウスの免疫感作 各８週令のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスを、５０％の水性抗原
と５０％完全フロイントアジュバントからなる２００μ
lの乳液に含有される３６μgのタンパク質で免疫感作し
た。それぞれのマウスは次のような皮内および皮下部位
の各所に免疫した:各後脚部に２５μlずつ、尾に５０μ
l、および背中に沿って３〜５ケ所の皮内部位に１００
μlを分布させた。最初の免疫感作から４週間後に、上
記と同様の３６μgのタンパク質を、今度は不完全フロ
イントアジュバントを使用して調製した乳液で追加免疫
した。追加免疫では、各マウスは２００μlの抗原乳液
を次のように分布して投与された:尾に５０μl、背中に
沿って５ケ所の皮内部位に１５０μlを分布させた。追
加免疫から１９日後に、各マウス毎に尾部採血により約
５００μlの血液を採取した。この血液から得られた血
清は、インビトロの中和実験に使用した(下記参照)。追
加免疫から３７日後に、マウスをウイルスチャレンジ試
験に使用した。実験マウス群と年令、性および系統を一
致させた対照マウス群は、実験群と同一のプロトコール
でヒト血清アルブミン(１匹当たり１５μg)を用いて免
疫した。
と５０％完全フロイントアジュバントからなる２００μ
lの乳液に含有される３６μgのタンパク質で免疫感作し
た。それぞれのマウスは次のような皮内および皮下部位
の各所に免疫した:各後脚部に２５μlずつ、尾に５０μ
l、および背中に沿って３〜５ケ所の皮内部位に１００
μlを分布させた。最初の免疫感作から４週間後に、上
記と同様の３６μgのタンパク質を、今度は不完全フロ
イントアジュバントを使用して調製した乳液で追加免疫
した。追加免疫では、各マウスは２００μlの抗原乳液
を次のように分布して投与された:尾に５０μl、背中に
沿って５ケ所の皮内部位に１５０μlを分布させた。追
加免疫から１９日後に、各マウス毎に尾部採血により約
５００μlの血液を採取した。この血液から得られた血
清は、インビトロの中和実験に使用した(下記参照)。追
加免疫から３７日後に、マウスをウイルスチャレンジ試
験に使用した。実験マウス群と年令、性および系統を一
致させた対照マウス群は、実験群と同一のプロトコール
でヒト血清アルブミン(１匹当たり１５μg)を用いて免
疫した。
【００５５】インビトロの中和試験 gＤ１０.２培養上清濃縮物で免疫した１１匹のマウスか
ら得られた血清を用い、インビトロにおけるＨＳＶ−１
の中和能について試験した。逐次希釈したマウス血清
(倍数希釈法: １:８〜１:１６３８４)を約４０pfuのＨ
ＳＶとＤulbecoが改良したＥagle培地(ＤＭＥＭ)中で１
時間、３７℃でインキュベートした。血清インキュベー
ションの後、９６穴の組織培養板の各穴に含有される約
４０,０００vero細胞に各希釈液を適用した。３〜４日
後、各穴を０.５％クリスタルバイオレットで染色し
て、ウイルスの増殖を測定した。ウイルスの増殖が起こ
った穴は染色を示さなかった。ウイルスによる細胞死を
防御した最高血清希釈度を測定し、中和力価を算出し
た。gＤ１０.２の上清物質で免疫したマウスから得られ
た試験血清(n＝１０)は、すべてＨＳＶ−１中和活性
(１:１６〜１:５１２)およびＨＳＶ−２中和活性(１:８
〜１:１６)を示した。対照マウス血清(n＝８)からは何
ら中和反応を提供できなかった。ＨＳＶ−１で免疫した
マウスから得られた血清では１:３２の中和力価が得ら
れた。
ら得られた血清を用い、インビトロにおけるＨＳＶ−１
の中和能について試験した。逐次希釈したマウス血清
(倍数希釈法: １:８〜１:１６３８４)を約４０pfuのＨ
ＳＶとＤulbecoが改良したＥagle培地(ＤＭＥＭ)中で１
時間、３７℃でインキュベートした。血清インキュベー
ションの後、９６穴の組織培養板の各穴に含有される約
４０,０００vero細胞に各希釈液を適用した。３〜４日
後、各穴を０.５％クリスタルバイオレットで染色し
て、ウイルスの増殖を測定した。ウイルスの増殖が起こ
った穴は染色を示さなかった。ウイルスによる細胞死を
防御した最高血清希釈度を測定し、中和力価を算出し
た。gＤ１０.２の上清物質で免疫したマウスから得られ
た試験血清(n＝１０)は、すべてＨＳＶ−１中和活性
(１:１６〜１:５１２)およびＨＳＶ−２中和活性(１:８
〜１:１６)を示した。対照マウス血清(n＝８)からは何
ら中和反応を提供できなかった。ＨＳＶ−１で免疫した
マウスから得られた血清では１:３２の中和力価が得ら
れた。
【００５６】ウイルスチャレンジ gＤ１０.２上清濃縮物で免疫した１１匹のマウスとヒト
血清アルブミンで免疫した１３匹の対照マウスに、１
０,０００,０００pfuのＨＳＶ−１(Ｍac Ｉntyre株)を
腹腔内注射することによりチャレンジした。gＤ１２で
免疫したマウスでは、ウイルス注射から１４日間、何ら
ウイルス感染の徴候を示さなかった。対照群では、１３
匹のマウス中の７匹が１４日までに死亡し、３匹は重篤
な衰弱と麻痺を示し、３匹は健康に見えた。統計的解析
(Ｆisherの直接検定法、両側検定)で、免疫群と対照群
の間の差はＰ＝０.００２の水準で有意であった(表
１)。
血清アルブミンで免疫した１３匹の対照マウスに、１
０,０００,０００pfuのＨＳＶ−１(Ｍac Ｉntyre株)を
腹腔内注射することによりチャレンジした。gＤ１２で
免疫したマウスでは、ウイルス注射から１４日間、何ら
ウイルス感染の徴候を示さなかった。対照群では、１３
匹のマウス中の７匹が１４日までに死亡し、３匹は重篤
な衰弱と麻痺を示し、３匹は健康に見えた。統計的解析
(Ｆisherの直接検定法、両側検定)で、免疫群と対照群
の間の差はＰ＝０.００２の水準で有意であった(表
１)。
【００５７】
【表１】 表１ 実験 マウス ＨＳＶ-1 ＨＳＶ-2 ＨＳＶ-12)4) チャレンジ番号 数 抗原 中和活性1) 中和活性1) 麻痺 死亡 生存 509C 11 gDtrunc3) 1:16-1:512 1:8-1:16 0 0 11 509D 13 ＨＳＡ 0 0 3 7 3 １．分泌型gＤの追加免疫を接種してから１９日後に、
マウス血清のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルス中和
活性を試験した。マウス血清を倍数希釈(１:８〜１:１
６３８４)し、これをＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の４
０プラーク形成単位(pfu)と３７℃で１時間インキュベ
ートした。各希釈液を、９６穴のマイクロタイターの各
穴に含まれている４０,０００vero細胞に適用した。４
日後、０.５％クリスタルバイオレットで細胞を染色し
た。中和力価は、ウイルスの増殖を防御する最高血清希
釈度を測定することにより算出した。 ２．マウスはＨＳＶ−１(ＭacＩntyre株)の１×１０7プ
ラーク形成単位(pfu)を腹腔内注射することによりチャ
レンジした。チャレンジしたマウスは、ＨＳＶ−１感染
について３週間観察した。 ３．各マウスは、それぞれ約３μgの分泌型gＤの５０％
水と５０％フロイントアジュバント溶液で免疫した。マ
ウスは皮内および皮下部位の各所に免疫した。最初の免
疫から４週間後に、マウスは追加免疫をした。追加免疫
して１９日後にマウスはチャレンジを受けた。対照マウ
スは等量のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)で免疫された。 ４．Ｐ＝０.００２水準で有意。gＤ１２細胞から培地中
へ遊離された。先端を切断したタンパク質は、マウスの
ＨＳＶ−１の致死量感染を防御することが明らかになっ
た。
マウス血清のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルス中和
活性を試験した。マウス血清を倍数希釈(１:８〜１:１
６３８４)し、これをＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の４
０プラーク形成単位(pfu)と３７℃で１時間インキュベ
ートした。各希釈液を、９６穴のマイクロタイターの各
穴に含まれている４０,０００vero細胞に適用した。４
日後、０.５％クリスタルバイオレットで細胞を染色し
た。中和力価は、ウイルスの増殖を防御する最高血清希
釈度を測定することにより算出した。 ２．マウスはＨＳＶ−１(ＭacＩntyre株)の１×１０7プ
ラーク形成単位(pfu)を腹腔内注射することによりチャ
レンジした。チャレンジしたマウスは、ＨＳＶ−１感染
について３週間観察した。 ３．各マウスは、それぞれ約３μgの分泌型gＤの５０％
水と５０％フロイントアジュバント溶液で免疫した。マ
ウスは皮内および皮下部位の各所に免疫した。最初の免
疫から４週間後に、マウスは追加免疫をした。追加免疫
して１９日後にマウスはチャレンジを受けた。対照マウ
スは等量のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)で免疫された。 ４．Ｐ＝０.００２水準で有意。gＤ１２細胞から培地中
へ遊離された。先端を切断したタンパク質は、マウスの
ＨＳＶ−１の致死量感染を防御することが明らかになっ
た。
【００５８】ＨＳＶ−２ウイルスチャレンジのための抗
原製剤 ２５０nＭメソトレキセートの存在で発育させ、増殖さ
せたgＤ１０、２.２細胞を回転培養瓶(８５０cm2)に植
え、７％のウシ胎児血清を添加したＨam'sＦ１２培地
(ＧＩＢＣＯ)で培養した。細胞が密に繁殖した後(約３
日後)、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢ
Ｓ)で３回洗滌して血清タンパク質を除去し、新たに
“血清を含まない"培養液を加えた。血清を含まない培
地は、２５mＭのＨepes緩衝液を含有するＨam'sＦ１２
培地から成っていた。細胞を３日間培養し、生成した条
件付き培地(調整培地)を回収し、抗原調製に使用した。
次に、血清を含まない培地を細胞に加え、３日毎に条件
付き培地を回収する繰り返しを、細胞が死ぬか、または
培養表面にもはや付着しなくなるまで、更に１〜２回行
なった。次に血清を含まないgＤ１０．２．２の条件付
き培地(調整培地)を、濾過し、低速度で遠心して細胞残
渣を除き、得られた材料を限外濾過装置(ＹＭ−１０メ
ンブラン、Ａmicon)を用いて１０〜２０倍に濃縮した。
次いで濃縮した培地をＰＢＳに対して一夜透析した(Ｐ
ＢＳを３回交換、交換当たり１リットル)。次に、得ら
れた材料を測定してタンパク質濃度を決定し、タンパク
質組成を決定し標品の純度を調べるため、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により分析した。この方法により
調製した材料は、下記のように動物のＨＳＶ−２感染に
対して免疫するのに使用した。
原製剤 ２５０nＭメソトレキセートの存在で発育させ、増殖さ
せたgＤ１０、２.２細胞を回転培養瓶(８５０cm2)に植
え、７％のウシ胎児血清を添加したＨam'sＦ１２培地
(ＧＩＢＣＯ)で培養した。細胞が密に繁殖した後(約３
日後)、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩液(ＰＢ
Ｓ)で３回洗滌して血清タンパク質を除去し、新たに
“血清を含まない"培養液を加えた。血清を含まない培
地は、２５mＭのＨepes緩衝液を含有するＨam'sＦ１２
培地から成っていた。細胞を３日間培養し、生成した条
件付き培地(調整培地)を回収し、抗原調製に使用した。
次に、血清を含まない培地を細胞に加え、３日毎に条件
付き培地を回収する繰り返しを、細胞が死ぬか、または
培養表面にもはや付着しなくなるまで、更に１〜２回行
なった。次に血清を含まないgＤ１０．２．２の条件付
き培地(調整培地)を、濾過し、低速度で遠心して細胞残
渣を除き、得られた材料を限外濾過装置(ＹＭ−１０メ
ンブラン、Ａmicon)を用いて１０〜２０倍に濃縮した。
次いで濃縮した培地をＰＢＳに対して一夜透析した(Ｐ
ＢＳを３回交換、交換当たり１リットル)。次に、得ら
れた材料を測定してタンパク質濃度を決定し、タンパク
質組成を決定し標品の純度を調べるため、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により分析した。この方法により
調製した材料は、下記のように動物のＨＳＶ−２感染に
対して免疫するのに使用した。
【００５９】ＨＳＶ−２感染に対するマウスの免疫感作 ４０匹の雌性ＢＡＬＢ／c系マウスをＣharles Ｒiver
Ｌaboratories(Ｂoston,ＭＡ)から入手し、１２週令
時に、分泌型gＤタンパク質(gＤtrunc)またはヒト血清
アルブミン(ＨＳＡ)で免疫した。分泌型gＤタンパク質
に対する初回免疫では、抗原をリン酸緩衝食塩液で約７
０μg／mlの濃度となるように調節し、等量の完全フロ
イントアジュバントを加えて乳化した。各マウスはそれ
ぞれこの懸濁液の２００μlで、次のような分布で免疫
した:尾の付け根から約１cmの部位に５０μlを皮下注、
後方の各脚部にそれぞれ２５μlを皮下注、背中に沿っ
て１００μlを３〜５ケ所に分けて、皮内注射。次にマ
ウスは初回免疫から１ケ月後に同じ抗原で追加免疫し
た。追加免疫の場合は、抗原は初回免疫の場合と同じ方
法で調製するが、但し、完全フロイントアジュバントの
代わりに、不完全フロイントアジュバントを使用した。
追加免疫では、各マウスにそれぞれ２００μlの抗原乳
液を次のような分布で注射した;尾部に５０μl、各大腿
上のたるんだ皮膚にそれぞれ２５μlずつ皮下注、背中
に沿って１００μlを３〜５ケ所に分けて皮内注射。対
照マウス群は、実験マウス群と同じプロトコールに従
い、免疫原として分泌gＤタンパク質の代わりにヒト血
清アルブミンで免疫した。インビトロの中和試験に使用
するため、追加免疫から２４日後にマウスから血清を採
取した。
Ｌaboratories(Ｂoston,ＭＡ)から入手し、１２週令
時に、分泌型gＤタンパク質(gＤtrunc)またはヒト血清
アルブミン(ＨＳＡ)で免疫した。分泌型gＤタンパク質
に対する初回免疫では、抗原をリン酸緩衝食塩液で約７
０μg／mlの濃度となるように調節し、等量の完全フロ
イントアジュバントを加えて乳化した。各マウスはそれ
ぞれこの懸濁液の２００μlで、次のような分布で免疫
した:尾の付け根から約１cmの部位に５０μlを皮下注、
後方の各脚部にそれぞれ２５μlを皮下注、背中に沿っ
て１００μlを３〜５ケ所に分けて、皮内注射。次にマ
ウスは初回免疫から１ケ月後に同じ抗原で追加免疫し
た。追加免疫の場合は、抗原は初回免疫の場合と同じ方
法で調製するが、但し、完全フロイントアジュバントの
代わりに、不完全フロイントアジュバントを使用した。
追加免疫では、各マウスにそれぞれ２００μlの抗原乳
液を次のような分布で注射した;尾部に５０μl、各大腿
上のたるんだ皮膚にそれぞれ２５μlずつ皮下注、背中
に沿って１００μlを３〜５ケ所に分けて皮内注射。対
照マウス群は、実験マウス群と同じプロトコールに従
い、免疫原として分泌gＤタンパク質の代わりにヒト血
清アルブミンで免疫した。インビトロの中和試験に使用
するため、追加免疫から２４日後にマウスから血清を採
取した。
【００６０】ＨＳＶ−２ウイルスチャレンジ 実験群(分泌型gＤ注射群)および対照群(ＨＳＶ注射群)
のマウスを、いずれも追加免疫をしてから３０日後にＨ
ＳＶ−２(ＭＳ株)を腹腔内注射してチャレンジした。各
マウスは、１０％のウシ胎児血清を含有するＤulbecco
の改良したＥagle培地(ＤＭＥＭ)１００μl中の２×１
０5pfuのウイルスを投与した。ＬＤ50実験の結果、この
量は正常(注射していない)ＢＡＬＢ／cマウス母集団の
５０％致死に要するウイルス量の１００〜５００倍に相
当することが明らかになった。ウイルスを注射したマウ
スは３週間観察した。対照マウス(ＨＳＡを注射)はウイ
ルスチャレンジ後９日以内に全例死亡した。分泌型gＤ
タンパク質のワクチン投与を受けたマウスは、全例との
３週間完全に生存し、正常に見えた(即ち、衰弱または
麻痺を示さなかった)。
のマウスを、いずれも追加免疫をしてから３０日後にＨ
ＳＶ−２(ＭＳ株)を腹腔内注射してチャレンジした。各
マウスは、１０％のウシ胎児血清を含有するＤulbecco
の改良したＥagle培地(ＤＭＥＭ)１００μl中の２×１
０5pfuのウイルスを投与した。ＬＤ50実験の結果、この
量は正常(注射していない)ＢＡＬＢ／cマウス母集団の
５０％致死に要するウイルス量の１００〜５００倍に相
当することが明らかになった。ウイルスを注射したマウ
スは３週間観察した。対照マウス(ＨＳＡを注射)はウイ
ルスチャレンジ後９日以内に全例死亡した。分泌型gＤ
タンパク質のワクチン投与を受けたマウスは、全例との
３週間完全に生存し、正常に見えた(即ち、衰弱または
麻痺を示さなかった)。
【００６１】
【表２】 表２ 実験 マウス 抗原 HSV-1中和1) HSV-2中和1) HSV-12) チャレンジ番号 数 麻 痺 死亡 生存 579C 15 gDtrunc 1:1024- 1:512- 0 0 15 1:2048 1:1024 579D 25 ＨＳＡ 0 0 0 25 0 １．マウス血清は、分泌型gＤ追加免疫を行なってから
１９日後に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２中和活性につ
いて試験した。倍数希釈したマウス血清(１:８−１:１
６３８４)を４０プラーク形成単位のＨＳＶ−１または
ＨＳＶ−２と３７℃で１時間インキュベートした。各希
釈液は９６穴のマイクロタイターの各穴に含有する４
０,０００vero細胞に適用した。４日後細胞は０.５％ク
リスタルバイオレットで染色した。中和力価はウイルス
増殖を防御する最高血清希釈度を測定することにより算
出した。示した値は中和力価の平均値で表わしてある。 ２．ＨＳＶ−２チャレンジの詳細については本文参照。
先端を切断した糖タンパク質Ｄは、先述したようにgＤ
１０.２細胞系の発育により条件付けられた培養基から
精製した。培養液は限外濾過によって濃縮し、先端切断
gＤはセファロース４Ｂにカップリングさせた抗gＤ−１
単クローン性抗体を使用する免疫アフイニティークロマ
トグラフィーによって精製した。先端を切断したＨＳＶ
−１糖タンパク質Ｄ(gＤ−１)は、先述のように、gＤ１
０.２細胞の発育によって条件付けられた血清を含まな
い培地から分離した。細胞培養液は、市販のメンブラン
(Ａmico Ｃorp．)を使用する限外濾過と硫酸アンモニ
ウム沈澱法により濃縮した。次いで免疫アフィニティー
クロマトグラフィーによりgＤ−１を精製し、均質に近
づけた。免疫アフィニティー用カラムは、ＨＳＶ−１に
対して産生せしめた単クローン性抗体と交差結合したセ
ファロース(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals)をカップ
リングすることにより調製し、Ａxenら(Ｎature２１４:
１３０２〜１３０４(１９６７))が記載しているのと同
様の方法により溶出した。gＤ１０.２細胞系によって条
件付けられた未分画の培養液の主な生成物は、成熟した
先端切断型のgＤ−１(〜４３−４６kb)とgＤの前駆型
(〜３８−４０kb)である。gＤタンパク質は、増殖調整
培地に存在するタンパク質の、平均２０〜２５％を占め
ている。この物質を免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーで分画することによりgＤはかなり豊富化された。
溶出した物質は銀染色により検出し得る汚染したタンパ
ク質を全く含んでいないことが判った。このプロトコー
ルに基づくタンパク質の精製によってタンパク質の変性
や、分子の抗原性構造の破壊が起こるかどうか調べるた
めに、種々の単クローン性抗体による抗原性の試験を行
なった。この試験において、カルボキシル末端基と反応
するもの以外のすべての抗体が、精製した製剤と反応す
ることが判った。未分画の培養上清に存在する物質と比
較して、精製した製剤の抗体結合の挙動には何らの差違
も検出できなかった。
１９日後に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２中和活性につ
いて試験した。倍数希釈したマウス血清(１:８−１:１
６３８４)を４０プラーク形成単位のＨＳＶ−１または
ＨＳＶ−２と３７℃で１時間インキュベートした。各希
釈液は９６穴のマイクロタイターの各穴に含有する４
０,０００vero細胞に適用した。４日後細胞は０.５％ク
リスタルバイオレットで染色した。中和力価はウイルス
増殖を防御する最高血清希釈度を測定することにより算
出した。示した値は中和力価の平均値で表わしてある。 ２．ＨＳＶ−２チャレンジの詳細については本文参照。
先端を切断した糖タンパク質Ｄは、先述したようにgＤ
１０.２細胞系の発育により条件付けられた培養基から
精製した。培養液は限外濾過によって濃縮し、先端切断
gＤはセファロース４Ｂにカップリングさせた抗gＤ−１
単クローン性抗体を使用する免疫アフイニティークロマ
トグラフィーによって精製した。先端を切断したＨＳＶ
−１糖タンパク質Ｄ(gＤ−１)は、先述のように、gＤ１
０.２細胞の発育によって条件付けられた血清を含まな
い培地から分離した。細胞培養液は、市販のメンブラン
(Ａmico Ｃorp．)を使用する限外濾過と硫酸アンモニ
ウム沈澱法により濃縮した。次いで免疫アフィニティー
クロマトグラフィーによりgＤ−１を精製し、均質に近
づけた。免疫アフィニティー用カラムは、ＨＳＶ−１に
対して産生せしめた単クローン性抗体と交差結合したセ
ファロース(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals)をカップ
リングすることにより調製し、Ａxenら(Ｎature２１４:
１３０２〜１３０４(１９６７))が記載しているのと同
様の方法により溶出した。gＤ１０.２細胞系によって条
件付けられた未分画の培養液の主な生成物は、成熟した
先端切断型のgＤ−１(〜４３−４６kb)とgＤの前駆型
(〜３８−４０kb)である。gＤタンパク質は、増殖調整
培地に存在するタンパク質の、平均２０〜２５％を占め
ている。この物質を免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーで分画することによりgＤはかなり豊富化された。
溶出した物質は銀染色により検出し得る汚染したタンパ
ク質を全く含んでいないことが判った。このプロトコー
ルに基づくタンパク質の精製によってタンパク質の変性
や、分子の抗原性構造の破壊が起こるかどうか調べるた
めに、種々の単クローン性抗体による抗原性の試験を行
なった。この試験において、カルボキシル末端基と反応
するもの以外のすべての抗体が、精製した製剤と反応す
ることが判った。未分画の培養上清に存在する物質と比
較して、精製した製剤の抗体結合の挙動には何らの差違
も検出できなかった。
【００６２】精製したgＤタンパク質が、ＨＳＶ−２に
よる外陰部感染を防御するサブユニットワクチンの主成
分として効果的に使用できるかどうかを調べるために、
種々のアジュバントで調製したgＤをモルモットに接種
した。第一の試験では、精製gＤを完全フロイントアジ
ュバントに混合し、雌性Ｈartleyモルモットの筋肉内お
よび皮下部位に注射した。２月令で体重約２５０gの雌
性ＨartleyモルモットをＣharles Ｒiver Ｌavorator
ies(Ｐortgan,ＭＩ)から購入した。フロイントアジュバ
ントを使用した試験では、５０％の完全フロイントアジ
ュバントに乳化した３０μgのgＤ−１を注射した。この
初回免疫感作は次のような分布で行なった:０.５mlを頸
背部の軟かい皮膚へ皮下注射、０.５mlを大腿筋肉内に
注射した。３１日後、動物は不完全フロイントアジュバ
ントに混合した同量の抗原で追加免疫した。対照動物は
実験群と同じプロトコールに従い、アジュバントだけを
注射した。実験動物と対照動物は、追加免疫を行なって
から１９日後にＨＳＶ−２を膣内に感染させてチャレン
ジした。gＤ−１のアルム−アジュバントを使用する試
験では、３０μgのgＤ−１をリン酸アルミニウムまたは
水酸化アルミニウムのいずれか(０.１５ml)のゲルに混
合し、初回および追加免疫の両方に使用した。アルム−
アジュバントは後肢へ筋肉内注射した。動物は初回免疫
から５１日後に追加免疫し、更に２７日後に生菌ウイル
スでチャレンジした。各動物は、完全フロイントアジュ
バントに混合した３０μgの精製したタンパク質による
１回の初回免疫と、不完全フロイントアジュバントに混
合した同量の抗原による１回の追加免疫(３１日後)を受
けた。すべての動物は、追加免疫から１９日後にＨＳＶ
−２の膣内接種によりチャレンジされた。表３にこれら
の試験から得られた成績を示した。gＤの接種を受けた
動物は、インビトロのウイルス中和測定でＨＳＶ−１お
よびＨＳＶ−２の双方の感染を防御し得る高濃度の抗体
を生産することが判る。これらの動物から得られた血清
は、ＨＳＶ−２よりもＨＳＶ−１の方を僅かにより効果
的に中和することが判った。この結果は、免疫原がＨＳ
Ｖ−１から誘導されたものであり、gＤ−１の抗原決定
基には型特異性のある事実から考えて当然のことである
(Ｅisenberg,Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖirol．３５:４２８(１
９８０);Ｐereira,Ｌ．ら、Ｉnfect and Ｉmmun．２
９:７２４(１９８０);Ｓhowalter,Ｊ．Ｄ．ら、Ｉnfec
t．and Ｉmmun．３４:６８４(１９８１))。一層印象的
なことは、gＤ−１の接種を受けたすべての動物がウイ
ルス感染による臨床的徴候から完全に防御された事実で
あった(即ち、発赤、腫脹、小水疱形成、潰瘍形成、尿
貯留の減少、および致死的な脳炎)。アジュバント単独
を注射した１４匹の動物のうちの１３匹は、重篤な原発
性の感染を起こした。典型的な癒着を起こして急性の潰
瘍を形成する多数の小水胞が見られた。これに反して、
gＤ−１を接種した動物ではウイルス感染の前兆が何ら
表れなかった。これらの結果は明らかに、完全フロイン
トアジュバントに混合したgＤ−１が、ＨＳＶ−２の外
陰部感染に対し効果的な防御作用を有することを示して
いる。
よる外陰部感染を防御するサブユニットワクチンの主成
分として効果的に使用できるかどうかを調べるために、
種々のアジュバントで調製したgＤをモルモットに接種
した。第一の試験では、精製gＤを完全フロイントアジ
ュバントに混合し、雌性Ｈartleyモルモットの筋肉内お
よび皮下部位に注射した。２月令で体重約２５０gの雌
性ＨartleyモルモットをＣharles Ｒiver Ｌavorator
ies(Ｐortgan,ＭＩ)から購入した。フロイントアジュバ
ントを使用した試験では、５０％の完全フロイントアジ
ュバントに乳化した３０μgのgＤ−１を注射した。この
初回免疫感作は次のような分布で行なった:０.５mlを頸
背部の軟かい皮膚へ皮下注射、０.５mlを大腿筋肉内に
注射した。３１日後、動物は不完全フロイントアジュバ
ントに混合した同量の抗原で追加免疫した。対照動物は
実験群と同じプロトコールに従い、アジュバントだけを
注射した。実験動物と対照動物は、追加免疫を行なって
から１９日後にＨＳＶ−２を膣内に感染させてチャレン
ジした。gＤ−１のアルム−アジュバントを使用する試
験では、３０μgのgＤ−１をリン酸アルミニウムまたは
水酸化アルミニウムのいずれか(０.１５ml)のゲルに混
合し、初回および追加免疫の両方に使用した。アルム−
アジュバントは後肢へ筋肉内注射した。動物は初回免疫
から５１日後に追加免疫し、更に２７日後に生菌ウイル
スでチャレンジした。各動物は、完全フロイントアジュ
バントに混合した３０μgの精製したタンパク質による
１回の初回免疫と、不完全フロイントアジュバントに混
合した同量の抗原による１回の追加免疫(３１日後)を受
けた。すべての動物は、追加免疫から１９日後にＨＳＶ
−２の膣内接種によりチャレンジされた。表３にこれら
の試験から得られた成績を示した。gＤの接種を受けた
動物は、インビトロのウイルス中和測定でＨＳＶ−１お
よびＨＳＶ−２の双方の感染を防御し得る高濃度の抗体
を生産することが判る。これらの動物から得られた血清
は、ＨＳＶ−２よりもＨＳＶ−１の方を僅かにより効果
的に中和することが判った。この結果は、免疫原がＨＳ
Ｖ−１から誘導されたものであり、gＤ−１の抗原決定
基には型特異性のある事実から考えて当然のことである
(Ｅisenberg,Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖirol．３５:４２８(１
９８０);Ｐereira,Ｌ．ら、Ｉnfect and Ｉmmun．２
９:７２４(１９８０);Ｓhowalter,Ｊ．Ｄ．ら、Ｉnfec
t．and Ｉmmun．３４:６８４(１９８１))。一層印象的
なことは、gＤ−１の接種を受けたすべての動物がウイ
ルス感染による臨床的徴候から完全に防御された事実で
あった(即ち、発赤、腫脹、小水疱形成、潰瘍形成、尿
貯留の減少、および致死的な脳炎)。アジュバント単独
を注射した１４匹の動物のうちの１３匹は、重篤な原発
性の感染を起こした。典型的な癒着を起こして急性の潰
瘍を形成する多数の小水胞が見られた。これに反して、
gＤ−１を接種した動物ではウイルス感染の前兆が何ら
表れなかった。これらの結果は明らかに、完全フロイン
トアジュバントに混合したgＤ−１が、ＨＳＶ−２の外
陰部感染に対し効果的な防御作用を有することを示して
いる。
【００６３】完全フロイントアジュバントはヒトの使用
に適さないので、次にヒトの使用に好適なアジュバント
で処方した時、gＤ−１がＨＳＶ−２感染に対して防御
効果を示すかどうか決定することが望まれた。この目的
のために、みょうばん沈澱タンパク質複合体(Ｊ．Ｓ．
Ｇarveyら、Ｍethods in Ｉmmunology(１９７７)１８
５頁(１７))の研究が開始された。表３には、gＤ−１を
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムゲルに混
合して使用して得られた成績を比較している。対照試験
では、動物はアジュバント単独を接種された。アルミニ
ウムによる両製剤ともＨＳＶ−１に対する高濃度の中和
抗体を誘発し、またＨＳＶ−１に対する中和力価は、完
全フロイントアジュバントに混合したgＤ−１に対し誘
発される力価に匹敵し得るものであることが認められ
た。然しながら、ＨＳＶ−２を中和し得る抗体の力価
は、完全フロイントアジュバントに混合したgＤ１に比
べて、アルミニウム製剤のいずれかに混合したgＤ−１
の場合の方が有意に低かった。この結果は、アルミニウ
ムに混合したgＤ−１は、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２に共
通した１個またはそれ以上の抗原決定基の消失を生じる
か、またはタンパク質をフロイントアジュバントに混合
した場合の方が、交差反応性抗原の認識がより一層効果
的であることを示唆している。この成績はまた、ＨＳＶ
−１とＨＳＶ−２に対する中和力価が水酸化アルミニウ
ムの場合の方が、リン酸アルミニウムの場合よりも有意
に高いことから、前者の方が後者より効果的なアジュバ
ントであることを示唆している。
に適さないので、次にヒトの使用に好適なアジュバント
で処方した時、gＤ−１がＨＳＶ−２感染に対して防御
効果を示すかどうか決定することが望まれた。この目的
のために、みょうばん沈澱タンパク質複合体(Ｊ．Ｓ．
Ｇarveyら、Ｍethods in Ｉmmunology(１９７７)１８
５頁(１７))の研究が開始された。表３には、gＤ−１を
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムゲルに混
合して使用して得られた成績を比較している。対照試験
では、動物はアジュバント単独を接種された。アルミニ
ウムによる両製剤ともＨＳＶ−１に対する高濃度の中和
抗体を誘発し、またＨＳＶ−１に対する中和力価は、完
全フロイントアジュバントに混合したgＤ−１に対し誘
発される力価に匹敵し得るものであることが認められ
た。然しながら、ＨＳＶ−２を中和し得る抗体の力価
は、完全フロイントアジュバントに混合したgＤ１に比
べて、アルミニウム製剤のいずれかに混合したgＤ−１
の場合の方が有意に低かった。この結果は、アルミニウ
ムに混合したgＤ−１は、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２に共
通した１個またはそれ以上の抗原決定基の消失を生じる
か、またはタンパク質をフロイントアジュバントに混合
した場合の方が、交差反応性抗原の認識がより一層効果
的であることを示唆している。この成績はまた、ＨＳＶ
−１とＨＳＶ−２に対する中和力価が水酸化アルミニウ
ムの場合の方が、リン酸アルミニウムの場合よりも有意
に高いことから、前者の方が後者より効果的なアジュバ
ントであることを示唆している。
【００６４】アルミニウムアジュバント製剤によって得
られた防御効果は、フロイントアジュバント製剤で得ら
れたものより低いが、それでもなお有意である。多くの
動物がウイルス感染の徴候を示すが、感染の重篤度はア
ジュバント単独を注射した対照動物の場合に比較してか
なり軽い。即ち、障害度の平均点数は、アジュバントを
注射した対照動物の障害度の平均点数が３.２であるの
に比較して、リン酸アルミニウムワクチン製剤を接種し
た動物では０.９、水酸化アルミニウムに基づく製剤の
場合は０.７であった。障害の重篤度の採点に使用した
４＋評価法に従えば、平均障害点数３.２から０.７へ低
下することは、臨床症状において、数個の大水疱(３点)
から軽度の発赤および腫脹(０.５点)へ低下するのに対
応する。興味深いことは、これらの試験を通じて、イン
ビトロでのＨＳＶ−２に対する平均中和力価が臨床疾患
の重篤度と良く相関していた。
られた防御効果は、フロイントアジュバント製剤で得ら
れたものより低いが、それでもなお有意である。多くの
動物がウイルス感染の徴候を示すが、感染の重篤度はア
ジュバント単独を注射した対照動物の場合に比較してか
なり軽い。即ち、障害度の平均点数は、アジュバントを
注射した対照動物の障害度の平均点数が３.２であるの
に比較して、リン酸アルミニウムワクチン製剤を接種し
た動物では０.９、水酸化アルミニウムに基づく製剤の
場合は０.７であった。障害の重篤度の採点に使用した
４＋評価法に従えば、平均障害点数３.２から０.７へ低
下することは、臨床症状において、数個の大水疱(３点)
から軽度の発赤および腫脹(０.５点)へ低下するのに対
応する。興味深いことは、これらの試験を通じて、イン
ビトロでのＨＳＶ−２に対する平均中和力価が臨床疾患
の重篤度と良く相関していた。
【００６５】上記の結果は、ＨＳＶ−２による外陰部の
原発性感染の臨床的発現が、組み換え体gＤ−１のワク
チン接種によって低下することを証明している。得られ
た結果は、ＨＳＶ−１から誘導された単一の糖タンパク
質が強力なアジュバントと組み合わせて投与すると、外
陰部のＨＳＶ−２感染を完全に防御できることを示して
いる。
原発性感染の臨床的発現が、組み換え体gＤ−１のワク
チン接種によって低下することを証明している。得られ
た結果は、ＨＳＶ−１から誘導された単一の糖タンパク
質が強力なアジュバントと組み合わせて投与すると、外
陰部のＨＳＶ−２感染を完全に防御できることを示して
いる。
【００６６】
【表３】 ＊ インビトロの中和試験は先の記載と同様にして実
施した。 ＊＊ モルモットは、Ｓtanberry,Ｌ．Ｒ．ら(Ｊ．Ｉnf
et．Ｄis．１４６:３９７(１９８２))の記載に従い、＋
４点評価法で、症状判定(ウイルス感染の特徴を表わす)
および無症状性判定(ウイルス感染の徴候なし)を行なっ
た。要約すれば ０,異常なし;１＋、腫脹および発赤;２＋、少数の小水
疱;３＋、数ケ所の大水疱;４＋、数ケ所の大潰瘍性の損
傷。 ＋ 平均障害点数は症候性の動物群で観察される最大
算術平均をとることにより計算した。
施した。 ＊＊ モルモットは、Ｓtanberry,Ｌ．Ｒ．ら(Ｊ．Ｉnf
et．Ｄis．１４６:３９７(１９８２))の記載に従い、＋
４点評価法で、症状判定(ウイルス感染の特徴を表わす)
および無症状性判定(ウイルス感染の徴候なし)を行なっ
た。要約すれば ０,異常なし;１＋、腫脹および発赤;２＋、少数の小水
疱;３＋、数ケ所の大水疱;４＋、数ケ所の大潰瘍性の損
傷。 ＋ 平均障害点数は症候性の動物群で観察される最大
算術平均をとることにより計算した。
【００６７】先端切断タンパク質を診断およびワクチン
適用に使用することの進歩性は、それが細胞外媒質へ分
泌されるので、全細胞製剤で見られるより、汚染タンパ
ク質の夾雑がはるかに少ないということである。
適用に使用することの進歩性は、それが細胞外媒質へ分
泌されるので、全細胞製剤で見られるより、汚染タンパ
ク質の夾雑がはるかに少ないということである。
【００６８】本発明においては、タンパク質の生産に永
久細胞系を使用していることがわかるであろう。トラン
スフェクションによって、ベクターは細胞系のゲノムに
取り込まれ、細胞溶解を起こすことなくタンパク質を生
産できる。従って細胞系は、タンパク質の連続的生産に
使用でき、特に先端を切り取られた形で細胞から分泌し
て来る。例えば、先端を切り取ったタンパク質を発現す
る細胞は、抗原に富んだ培地を細胞から絶えず除去し、
新鮮な培地と置き換えることにより、灌流系の中で連続
的に使用できる。
久細胞系を使用していることがわかるであろう。トラン
スフェクションによって、ベクターは細胞系のゲノムに
取り込まれ、細胞溶解を起こすことなくタンパク質を生
産できる。従って細胞系は、タンパク質の連続的生産に
使用でき、特に先端を切り取られた形で細胞から分泌し
て来る。例えば、先端を切り取ったタンパク質を発現す
る細胞は、抗原に富んだ培地を細胞から絶えず除去し、
新鮮な培地と置き換えることにより、灌流系の中で連続
的に使用できる。
【００６９】ここに使用した特殊な細胞系はdhfr生産を
欠くＣＨＯ系に、dhfrマーカーを含有するベクターを導
入したものであった。該細胞系を好適な条件下にメソト
レキセート(ＭＴＳ)と接触させることにより(５４)、dh
fr生産と、従って連結したgＤタンパク質の生産が増幅
される。先端を切断したgＤ遺伝子をdhfr-ＣＨＯ細胞に
トランスフェクトさせることにより誘導された３種の細
胞系を並列してプレートに並べ、35Ｓ−メチオニンで標
識し、先に図６で記載したように免疫沈降させた。１列
目および２列目は、メソトレキセートで選択する前に独
立して分離された２個の細胞系によって条件付けられた
培養液５００μlから免疫沈降させた分泌型gＤの量を示
す。３列目は２５０nＭのメソトレキセート中における
発育で選択された細胞系(gＤ１０．２．２)から同量の
培養基へ免疫沈降された先端切断gＤの量を示す。１〜
３列目に示した免疫沈降には家兎の抗ＨＳＶ−１抗体
(ＤakoＣorp．)を使用した。４列目は、gＤ１０．２．
２細胞系により条件づけた５００μl培地と正常家兎血
清の対照免疫沈降を表わす。
欠くＣＨＯ系に、dhfrマーカーを含有するベクターを導
入したものであった。該細胞系を好適な条件下にメソト
レキセート(ＭＴＳ)と接触させることにより(５４)、dh
fr生産と、従って連結したgＤタンパク質の生産が増幅
される。先端を切断したgＤ遺伝子をdhfr-ＣＨＯ細胞に
トランスフェクトさせることにより誘導された３種の細
胞系を並列してプレートに並べ、35Ｓ−メチオニンで標
識し、先に図６で記載したように免疫沈降させた。１列
目および２列目は、メソトレキセートで選択する前に独
立して分離された２個の細胞系によって条件付けられた
培養液５００μlから免疫沈降させた分泌型gＤの量を示
す。３列目は２５０nＭのメソトレキセート中における
発育で選択された細胞系(gＤ１０．２．２)から同量の
培養基へ免疫沈降された先端切断gＤの量を示す。１〜
３列目に示した免疫沈降には家兎の抗ＨＳＶ−１抗体
(ＤakoＣorp．)を使用した。４列目は、gＤ１０．２．
２細胞系により条件づけた５００μl培地と正常家兎血
清の対照免疫沈降を表わす。
【００７０】メソトレキセートにおける選択前と選択後
の細胞系によって培地中に分泌される先端切断gＤの相
対量を定量するため、コンペティティブＥＬＩＳＡアッ
セイを実施した。膜結合型gＤを発現するgＤ１２細胞を
平板から採り、先に記載した９６穴のマイクロタイター
平板の表面にグルタールアルデヒドで固定した。先端を
切断されたgＤを生産することが知られている種々の細
胞系からの調整培地を、マイクロタイター平板上に連続
的に逐次希釈し、一定量(２μl)の家兎抗ＨＳＶ−１抗
体(Ｄako Ｃorp)と１時間２０℃でインキュベートし
た。各穴をＰＢＳで３回洗滌することにより、未結合の
抗体と易溶性の先端を切断したgＤ−抗体複合体を除去
した。次にヤギ抗家兎ＩgＧとカップリングさせた西洋
ワサビのペルオキシダーゼを固定した細胞と１時間２０
℃で反応させ、未結合の抗体をＰＢＳで３回洗滌するこ
とにより除去した。次に比色用基質、ＯＰＤ(o−フェニ
レンジアミン)を各穴に加え、結合している西洋ワサビ
のペルオキシダーゼ抗体複合体と１５分間反応させた。
次いで、硫酸を最終濃度０.２５Ｎとなるまで加えて反
応を停止した。各穴のＯＰＤの吸光度を自動マイクロタ
イタースキャナー(Ｔitertekmultiskan)を使用して測定
し、希釈曲線を作成した。成体(親)ＣＨＯ細胞系と抗Ｈ
ＳＶ−１抗体の結合は、各希釈度における非特異的結合
の程度を測定するのに使用した。各培養の上清に含有さ
れる先端切断gＤの量は各穴の吸光度量と逆比例した。
白丸は、メソトレキセートで増幅する前の、先端切断g
Ｄを分泌する細胞によって条件付けされた培地の存在下
における、抗ＨＳＶ−１抗体のgＤ１２細胞への結合を
表わす。黒丸は、２５０nＭメソトレキセート中の発育
で選択されたgＤ１０．２．２細胞から得た培地の存在
下における抗ＨＳＶ−１抗体のgＤ１２細胞への結合を
表わす。白の四角は、先端切断したgＤを分泌する増幅
していない細胞から得た１００倍濃度の培地の存在下
に、抗ＨＳＶ−１抗体とgＤ１２細胞の結合を表わす。
この方法はgＤ１０．２細胞系において、２５０nＭ Ｍ
txで発育でき、もとのgＤ１０．２細胞系より約２０倍
多量の先端切断gＤを培養液中に分泌する増幅細胞系gＤ
１０．２．２を生産するために行なわれる(図１５およ
び図１６参照)。
の細胞系によって培地中に分泌される先端切断gＤの相
対量を定量するため、コンペティティブＥＬＩＳＡアッ
セイを実施した。膜結合型gＤを発現するgＤ１２細胞を
平板から採り、先に記載した９６穴のマイクロタイター
平板の表面にグルタールアルデヒドで固定した。先端を
切断されたgＤを生産することが知られている種々の細
胞系からの調整培地を、マイクロタイター平板上に連続
的に逐次希釈し、一定量(２μl)の家兎抗ＨＳＶ−１抗
体(Ｄako Ｃorp)と１時間２０℃でインキュベートし
た。各穴をＰＢＳで３回洗滌することにより、未結合の
抗体と易溶性の先端を切断したgＤ−抗体複合体を除去
した。次にヤギ抗家兎ＩgＧとカップリングさせた西洋
ワサビのペルオキシダーゼを固定した細胞と１時間２０
℃で反応させ、未結合の抗体をＰＢＳで３回洗滌するこ
とにより除去した。次に比色用基質、ＯＰＤ(o−フェニ
レンジアミン)を各穴に加え、結合している西洋ワサビ
のペルオキシダーゼ抗体複合体と１５分間反応させた。
次いで、硫酸を最終濃度０.２５Ｎとなるまで加えて反
応を停止した。各穴のＯＰＤの吸光度を自動マイクロタ
イタースキャナー(Ｔitertekmultiskan)を使用して測定
し、希釈曲線を作成した。成体(親)ＣＨＯ細胞系と抗Ｈ
ＳＶ−１抗体の結合は、各希釈度における非特異的結合
の程度を測定するのに使用した。各培養の上清に含有さ
れる先端切断gＤの量は各穴の吸光度量と逆比例した。
白丸は、メソトレキセートで増幅する前の、先端切断g
Ｄを分泌する細胞によって条件付けされた培地の存在下
における、抗ＨＳＶ−１抗体のgＤ１２細胞への結合を
表わす。黒丸は、２５０nＭメソトレキセート中の発育
で選択されたgＤ１０．２．２細胞から得た培地の存在
下における抗ＨＳＶ−１抗体のgＤ１２細胞への結合を
表わす。白の四角は、先端切断したgＤを分泌する増幅
していない細胞から得た１００倍濃度の培地の存在下
に、抗ＨＳＶ−１抗体とgＤ１２細胞の結合を表わす。
この方法はgＤ１０．２細胞系において、２５０nＭ Ｍ
txで発育でき、もとのgＤ１０．２細胞系より約２０倍
多量の先端切断gＤを培養液中に分泌する増幅細胞系gＤ
１０．２．２を生産するために行なわれる(図１５およ
び図１６参照)。
【００７１】dhfrマーカー／増幅系は、外来性ＤＮＡを
獲得し、それを安定に組み込むことができる他の細胞と
も使用できる。
獲得し、それを安定に組み込むことができる他の細胞と
も使用できる。
【００７２】本発明において、膜に結合させる働きを有
する疎水性−親水性カルボキシル末端領域を欠いている
膜結合性タンパク質の先端切断体がなお免疫原となり得
ることを証明し得たことは、他の膜結合型免疫原タンパ
ク質でも同様の結果を期待し得ることを示しており、ウ
イルス、寄生虫または他の病原微生物に対する改良され
たワクチン源が提供されることが期待できる。
する疎水性−親水性カルボキシル末端領域を欠いている
膜結合性タンパク質の先端切断体がなお免疫原となり得
ることを証明し得たことは、他の膜結合型免疫原タンパ
ク質でも同様の結果を期待し得ることを示しており、ウ
イルス、寄生虫または他の病原微生物に対する改良され
たワクチン源が提供されることが期待できる。
【００７３】これまでの実施例では、gＤタンパク質の
ＤＮＡは、そこに都合の良い制限部位があるので残基３
００の位置で切断された。このことから、図６のヒドロ
パシー図に見られるように、カルボキシル末端疎水性／
親水性領域を完全に除く結果となった。実際、それより
先の領域の残基３０１〜３３２の範囲を越えて除去され
ると、タンパク質の免疫原性は明らかに破壊された。従
って、このタンパク質の場合、および恐らく他の免疫原
性の膜結合型タンパク質の場合も、先端切断の程度は、
膜に結合するという性質が除かれ、タンパク質が周囲の
媒質に分泌される効果が得られる限り、かなり少なくし
得るということが、そこから結論される。
ＤＮＡは、そこに都合の良い制限部位があるので残基３
００の位置で切断された。このことから、図６のヒドロ
パシー図に見られるように、カルボキシル末端疎水性／
親水性領域を完全に除く結果となった。実際、それより
先の領域の残基３０１〜３３２の範囲を越えて除去され
ると、タンパク質の免疫原性は明らかに破壊された。従
って、このタンパク質の場合、および恐らく他の免疫原
性の膜結合型タンパク質の場合も、先端切断の程度は、
膜に結合するという性質が除かれ、タンパク質が周囲の
媒質に分泌される効果が得られる限り、かなり少なくし
得るということが、そこから結論される。
【００７４】実施例 ２ 実施例２はＨＳＶ−２gＣタンパク質(以前はgＦタンパ
ク質と命名されていた)に関する。細胞、ウイルス、およびＤＮＡ分離 ＨＳＶ−２(Ｇ株)を０.１のインプット多重度ＨＥp２細
胞に感染させた後この細胞培養を、１０％のウシ胎児血
清および抗生物質を含有するＤulbeccoの改良Ｅagle培
地で３日間、３３℃で増殖させた。ＨＳＶ−２ ＤＮＡ
は、前述のようにプロティナーゼＫで消化し、ＣＳＣl
超遠心により分離した(２３)。
ク質と命名されていた)に関する。細胞、ウイルス、およびＤＮＡ分離 ＨＳＶ−２(Ｇ株)を０.１のインプット多重度ＨＥp２細
胞に感染させた後この細胞培養を、１０％のウシ胎児血
清および抗生物質を含有するＤulbeccoの改良Ｅagle培
地で３日間、３３℃で増殖させた。ＨＳＶ−２ ＤＮＡ
は、前述のようにプロティナーゼＫで消化し、ＣＳＣl
超遠心により分離した(２３)。
【００７５】ＤＮＡ操作 制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼＫlenow 断片、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼは
Ｂethesda Ｒesearch Ｌabsから購入し、提供者の指
示に従って使用した。
ＮＡリガーゼ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼは
Ｂethesda Ｒesearch Ｌabsから購入し、提供者の指
示に従って使用した。
【００７６】ＨＳＶ−２ＤＮＡ制限断片の分子クローニ
ング ＥcoＲＩで消化したＨＳＶ−２ＤＮＡを５％ポリアクリ
ルアミドゲルで処理することにより、ＨＳＶ−２ゲノム
の地図でほぼ０.６５０の位置に相当するＥcoＲＩ“Ｐ"
断片を分離した。分離した断片を、ＥcoＲＩで消化した
pＵＣ９(２８)へクローンした。このプラスミドはpＵＣ
−ＲＩＰと呼ばれた。
ング ＥcoＲＩで消化したＨＳＶ−２ＤＮＡを５％ポリアクリ
ルアミドゲルで処理することにより、ＨＳＶ−２ゲノム
の地図でほぼ０.６５０の位置に相当するＥcoＲＩ“Ｐ"
断片を分離した。分離した断片を、ＥcoＲＩで消化した
pＵＣ９(２８)へクローンした。このプラスミドはpＵＣ
−ＲＩＰと呼ばれた。
【００７７】次に、pＵＣ−Ｒ１Ｐサブクローンを、Ｅc
oＲ１“Ｐ"断片を含有するＨＳＶ−２ゲノムのＳac１断
片の位置を突き止めるのに使用した。サザーンブロッテ
ィング実験(２７)によって、ＨＳＶ−２の４.９Ｋb Ｓ
ac１フラグメントがＥcoＲ１“Ｐ"断片を含有している
ことがわかった。この断片を０.７％アガロースゲルで
分離し、独特のＳac１部位(５５)を含有しているpＢＲ
３２２誘導プラスミドへクローンした。このプラスミド
は“pＢＲＳac１−Ｅ"と呼ばれた。更に、pＢＲＳac１
−“Ｅ"の制限酵素分析によりＥcoＲ１“Ｐ"断片と配列
相同性を有する２.９kbのＳal１断片が証明され、前述
と同様にしてＳal１で消化されたpＵＣ９へサブクーロ
ンした。このプラスミドはpgＣ2Ｓal２.９と呼ばれた。
oＲ１“Ｐ"断片を含有するＨＳＶ−２ゲノムのＳac１断
片の位置を突き止めるのに使用した。サザーンブロッテ
ィング実験(２７)によって、ＨＳＶ−２の４.９Ｋb Ｓ
ac１フラグメントがＥcoＲ１“Ｐ"断片を含有している
ことがわかった。この断片を０.７％アガロースゲルで
分離し、独特のＳac１部位(５５)を含有しているpＢＲ
３２２誘導プラスミドへクローンした。このプラスミド
は“pＢＲＳac１−Ｅ"と呼ばれた。更に、pＢＲＳac１
−“Ｅ"の制限酵素分析によりＥcoＲ１“Ｐ"断片と配列
相同性を有する２.９kbのＳal１断片が証明され、前述
と同様にしてＳal１で消化されたpＵＣ９へサブクーロ
ンした。このプラスミドはpgＣ2Ｓal２.９と呼ばれた。
【００７８】クローンしたＨＳＶ−２ＤＮＡのＤＮＡ配
列解析 ＤＮＡ配列の大部分はジデオキシヌクレオチドチェーン
ターミネーション法を使用して決定した。種々の断片を
複製型のm１３ファージベクター、mp７、mp８、およびm
p９にサブクローンし、前述したようにＤＮＡ配列を決
定した(２９)。幾つかの場合には、断片を、r−32Ｐ−
ＡＴＰとＴ４ポリヌクレアーゼを用いてその５'−位を
32Ｐで標識し、断片のＤＮＡ配列を化学的分解法を使用
して決定した(５６)。ＤＮＡおよびタンパク質配列のコ
ンピューターを使用する解析はＨＯＭプログラムを用い
て実施した(５７)。推定したアミノ酸配列のヒドロパシ
ーは１２アミノ酸幅、１ジャンプ法を使用して解析した
(３１a)。
列解析 ＤＮＡ配列の大部分はジデオキシヌクレオチドチェーン
ターミネーション法を使用して決定した。種々の断片を
複製型のm１３ファージベクター、mp７、mp８、およびm
p９にサブクローンし、前述したようにＤＮＡ配列を決
定した(２９)。幾つかの場合には、断片を、r−32Ｐ−
ＡＴＰとＴ４ポリヌクレアーゼを用いてその５'−位を
32Ｐで標識し、断片のＤＮＡ配列を化学的分解法を使用
して決定した(５６)。ＤＮＡおよびタンパク質配列のコ
ンピューターを使用する解析はＨＯＭプログラムを用い
て実施した(５７)。推定したアミノ酸配列のヒドロパシ
ーは１２アミノ酸幅、１ジャンプ法を使用して解析した
(３１a)。
【００７９】ＨＳＶ−２ＤＮＡのサザーンブロッティン
グ解析 制限エンドヌクレアーゼでＨＳＶ−２ＤＮＡを消化し、
プラスミドＤＮＡを１.５％アガロースゲル上で分画
し、標準的な方法でニトロセルロース上にブロット(移
し換え)した。図１７で星印を付したＳac２断片の一本
鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫlenow断片で充填し、
得られた平滑末端断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し
て、Ｓma１で消化されたm１３m７複製型(２９)に連結
(ライゲーション)した。このライゲーションおよびトラ
ンスフェクションにより調製された一本鎖ＤＮＡを、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫlenow断片を使用し、高い特異
的活性(１×１０9ＣＰm／μg)を有する32Ｐ−標識一本
鎖プローブＤＮＡの合成の鋳型として使用した。ハイブ
リダイゼーションは標準的な方法を使用して実施した
(２７,５８)。
グ解析 制限エンドヌクレアーゼでＨＳＶ−２ＤＮＡを消化し、
プラスミドＤＮＡを１.５％アガロースゲル上で分画
し、標準的な方法でニトロセルロース上にブロット(移
し換え)した。図１７で星印を付したＳac２断片の一本
鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ１のＫlenow断片で充填し、
得られた平滑末端断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し
て、Ｓma１で消化されたm１３m７複製型(２９)に連結
(ライゲーション)した。このライゲーションおよびトラ
ンスフェクションにより調製された一本鎖ＤＮＡを、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫlenow断片を使用し、高い特異
的活性(１×１０9ＣＰm／μg)を有する32Ｐ−標識一本
鎖プローブＤＮＡの合成の鋳型として使用した。ハイブ
リダイゼーションは標準的な方法を使用して実施した
(２７,５８)。
【００８０】結果 ＨＳＶ−２ゲノムのgＦ暗号化領域の分子クローニング ＨＳＶ−２のgＦ遺伝子を分離するのに採られた方針
は、この遺伝子がＨＳＶ−１ gＣ遺伝子と共直線的(コ
リニアー)であるという仮定に基づいていた。この仮定
は、ＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｃと抗原的に相関性のあ
る７５,０００ダルトンの糖タンパク質gＦがＨＳＶ−２
中に発見されたこと、およびこのタンパク質のための遺
伝子がＨＳＶ−１ gＣ遺伝子とほぼ共直線的であると言
う最近の知見によって支持されていた(２２d、５９)。
また、ＨＳＶ−１ gＣおよびＨＳＶ−２ gＦの双方に結
合する単クローン性抗体が分離されたことは、この二つ
のタンパク質が相互に相同的であるかも知れないことを
更に示唆している(２２f)。従って、ＨＳＶ−gＣ遺伝子
と共直線的であるＨＳＶ−２ゲノム領域のＤＮＡ配列を
解析すれば、ＨＳＶ−２ gＦ遺伝子の配置を突き止める
タンパク質配列情報の手懸りが得られるであろうと考え
られた。
は、この遺伝子がＨＳＶ−１ gＣ遺伝子と共直線的(コ
リニアー)であるという仮定に基づいていた。この仮定
は、ＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｃと抗原的に相関性のあ
る７５,０００ダルトンの糖タンパク質gＦがＨＳＶ−２
中に発見されたこと、およびこのタンパク質のための遺
伝子がＨＳＶ−１ gＣ遺伝子とほぼ共直線的であると言
う最近の知見によって支持されていた(２２d、５９)。
また、ＨＳＶ−１ gＣおよびＨＳＶ−２ gＦの双方に結
合する単クローン性抗体が分離されたことは、この二つ
のタンパク質が相互に相同的であるかも知れないことを
更に示唆している(２２f)。従って、ＨＳＶ−gＣ遺伝子
と共直線的であるＨＳＶ−２ゲノム領域のＤＮＡ配列を
解析すれば、ＨＳＶ−２ gＦ遺伝子の配置を突き止める
タンパク質配列情報の手懸りが得られるであろうと考え
られた。
【００８１】ＨＳＶ−２ゲノムの６００塩基対のＥcoＲ
１“Ｐ"断片は〜０.６５０の位置に存在することがわか
った(１２)。この領域は、ＨＳＶ−１ゲノムの約０.６
３０〜０.６４０に位置するＨＳＶ−１ gＣ遺伝子の既
知の暗号化領域(５９)とほぼ共直線的である。この断片
はＨＳＶ−２ＤＮＡのＥcoＲ１消化物から分離され、プ
ラスミドpＵＣ９(２８)にクローンされ、そのＤＮＡ配
列が決定された(２９,５６)。得られた配列をＨＳＶ−
１ gＣ配列と比較すると(５９)、ＥcoＲ１“Ｐ"断片と
ＨＳＶ−１ gＣ暗号化領域の３'−末端の間に高度の配
列相同性が見られた。それ故、ＨＳＶ−１ gＣ遺伝子と
相同性であるＨＳＶ−２遺伝子の残りの部分も十分に含
んでいるＥcoＲ１“Ｐ"断片と重複しているＨＳＶ−２
ゲノムＤＮＡから、Ｓac１制限エンドヌクレアーゼ断片
を分離するプローブとして、このＥcoＲ１“Ｐ"を使用
した。図１７には、ＥcoＲ１“Ｐ"断片を含んでおり、
ＤＮＡ配列解析に使用した２.９kbのＳal１断片をＨＳ
Ｖ−２ゲノムから分離するのに要した手順を図示した。
１“Ｐ"断片は〜０.６５０の位置に存在することがわか
った(１２)。この領域は、ＨＳＶ−１ゲノムの約０.６
３０〜０.６４０に位置するＨＳＶ−１ gＣ遺伝子の既
知の暗号化領域(５９)とほぼ共直線的である。この断片
はＨＳＶ−２ＤＮＡのＥcoＲ１消化物から分離され、プ
ラスミドpＵＣ９(２８)にクローンされ、そのＤＮＡ配
列が決定された(２９,５６)。得られた配列をＨＳＶ−
１ gＣ配列と比較すると(５９)、ＥcoＲ１“Ｐ"断片と
ＨＳＶ−１ gＣ暗号化領域の３'−末端の間に高度の配
列相同性が見られた。それ故、ＨＳＶ−１ gＣ遺伝子と
相同性であるＨＳＶ−２遺伝子の残りの部分も十分に含
んでいるＥcoＲ１“Ｐ"断片と重複しているＨＳＶ−２
ゲノムＤＮＡから、Ｓac１制限エンドヌクレアーゼ断片
を分離するプローブとして、このＥcoＲ１“Ｐ"を使用
した。図１７には、ＥcoＲ１“Ｐ"断片を含んでおり、
ＤＮＡ配列解析に使用した２.９kbのＳal１断片をＨＳ
Ｖ−２ゲノムから分離するのに要した手順を図示した。
【００８２】ＨＳＶ−２ゲノムのＥcoＲ１“Ｐ"領域の
ＤＮＡ配列 ＥcoＲ１“Ｐ"断片との配列相同性に基づき、ＨＳＶ−
２ゲノムから分離した４.３kbのＳac１“Ｅ"断片を更に
消化して、２.９kbのＳal１断片を得て、これをpgＣ2Ｓ
al ２.９と命名した。図１７は、ジデオキシヌクレオ
チド配列決定法(２９)または化学的分解法(５６)のいず
れかによりＤＮＡ配列解析が行なわれたpgＣ2Ｓal ２.
９からの断片を示している。更にこの図は、pgＣ2Ｓal
２.９の中のＥcoＲ１“Ｐ"断片の位置と同時に、ＨＳ
Ｖ−２ゲノムの〜０.６２８の位置のＢglＩＩ“Ｎ"断片
の右側末端に相当するＢglＩＩ部位の位置を示している
(１２)。
ＤＮＡ配列 ＥcoＲ１“Ｐ"断片との配列相同性に基づき、ＨＳＶ−
２ゲノムから分離した４.３kbのＳac１“Ｅ"断片を更に
消化して、２.９kbのＳal１断片を得て、これをpgＣ2Ｓ
al ２.９と命名した。図１７は、ジデオキシヌクレオ
チド配列決定法(２９)または化学的分解法(５６)のいず
れかによりＤＮＡ配列解析が行なわれたpgＣ2Ｓal ２.
９からの断片を示している。更にこの図は、pgＣ2Ｓal
２.９の中のＥcoＲ１“Ｐ"断片の位置と同時に、ＨＳ
Ｖ−２ゲノムの〜０.６２８の位置のＢglＩＩ“Ｎ"断片
の右側末端に相当するＢglＩＩ部位の位置を示している
(１２)。
【００８３】更に詳細に述べると、図１７は、ＨＳＶ−
１ gＣと共直線的に配置しているＨＳＶ−２領域、pgＣ
2Ｓal ２．９のクローニングを示している。〜０.６１
〜０.６６に配置しているＨＳＶ−ゲノムの領域は、６
００塩基対のＥcoＲ１“Ｐ"断片をプローブとして使用
し、Ｓac１断片(pＢＲＳac“Ｅ")としてクローンした。
pＢＲＳac“Ｅ"のサブクローン、pgＣ2Ｓal２.９はＤＮ
Ａ配列解析に使用した。矢印は配列化された領域を表わ
し、その配列から誘導された主な４７９アミノ酸のオー
プンリーディングフレームの位置が図示されている。Ｅ
coＲ１“Ｐ"断片を略示するＥcoＲ１部位、およびＢgl
２“Ｎ"断片の右端にあるＢgl２部位(地図の〜０.６２
８の位置)(２６)を含む種々の制限部位が示されてい
る。星(★)印で示してあるＳac２断片は、この領域に出
現する欠失を調べるために行なったサザーンブロッティ
ング実験に使用した(結果参照)。Ｓm;Ｓma１,Ｓa;Ｓac
２,Ｒs:Ｒsa１,Ｂg;Ｂgl２,Ｐv;Ｐvu２,Ｒ１;ＥcoＲ１
などの他の部位はＤＮＡ配列決定実験に使用した。
１ gＣと共直線的に配置しているＨＳＶ−２領域、pgＣ
2Ｓal ２．９のクローニングを示している。〜０.６１
〜０.６６に配置しているＨＳＶ−ゲノムの領域は、６
００塩基対のＥcoＲ１“Ｐ"断片をプローブとして使用
し、Ｓac１断片(pＢＲＳac“Ｅ")としてクローンした。
pＢＲＳac“Ｅ"のサブクローン、pgＣ2Ｓal２.９はＤＮ
Ａ配列解析に使用した。矢印は配列化された領域を表わ
し、その配列から誘導された主な４７９アミノ酸のオー
プンリーディングフレームの位置が図示されている。Ｅ
coＲ１“Ｐ"断片を略示するＥcoＲ１部位、およびＢgl
２“Ｎ"断片の右端にあるＢgl２部位(地図の〜０.６２
８の位置)(２６)を含む種々の制限部位が示されてい
る。星(★)印で示してあるＳac２断片は、この領域に出
現する欠失を調べるために行なったサザーンブロッティ
ング実験に使用した(結果参照)。Ｓm;Ｓma１,Ｓa;Ｓac
２,Ｒs:Ｒsa１,Ｂg;Ｂgl２,Ｐv;Ｐvu２,Ｒ１;ＥcoＲ１
などの他の部位はＤＮＡ配列決定実験に使用した。
【００８４】図１９、図２０、図２１、図２２および図
２３はpgＣ2Ｓal ２.９から得られたＤＮＡ配列をＨＳ
Ｖ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列(５９)と比較して示してい
る。ＨＳＶ−１ gＣ領域(ＨＳＶ−１)とpgＣ2Ｓal ２.
９から得た配列(ＨＳＶ−２)はＨＯＭプログラム(５７)
を用いて比較した。種々の欠失は配列の重複を最大化す
るのに使用されたから、わかり易くするためにスペース
を含むすべての位置に番号を付けた。星印は一致しない
ヌクレオチドの上に付けた。ＨＳＶ−１配列の４３位に
ある下線を引いた“Ａ"残基は、gＣmＲＮＡのほぼ転写
開始部位である(５９)。“ＴＡＴＡ"１、および“ＴＡ
ＴＡ"２は、それぞれＨＳＶ−１ gＣmＲＮＡと７３０塩
基mＲＮＡの転写コントロール領域と推定される(５９,
６０)。ＨＳＶ−１配列の１７２８の位置に挿入された
Ｔ残基はこの領域の配列再決定により発見され(Ｍ．Ｊa
ckson未発表)、それはＨＳＶ−２の主オープンリーディ
ングフレームの停止コドンと相同である１７３５〜１７
３７の位置にインフェース停止コドンを導入するもので
あることが明らかにされた。第２ＨＳＶ−２開始コドン
の位置が１９７５〜１９７７であるように、ＨＳＶ−１
の７３０塩基mＲＮＡ開始コドンの位置は２０３２〜２
０３４に示されている。
２３はpgＣ2Ｓal ２.９から得られたＤＮＡ配列をＨＳ
Ｖ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列(５９)と比較して示してい
る。ＨＳＶ−１ gＣ領域(ＨＳＶ−１)とpgＣ2Ｓal ２.
９から得た配列(ＨＳＶ−２)はＨＯＭプログラム(５７)
を用いて比較した。種々の欠失は配列の重複を最大化す
るのに使用されたから、わかり易くするためにスペース
を含むすべての位置に番号を付けた。星印は一致しない
ヌクレオチドの上に付けた。ＨＳＶ−１配列の４３位に
ある下線を引いた“Ａ"残基は、gＣmＲＮＡのほぼ転写
開始部位である(５９)。“ＴＡＴＡ"１、および“ＴＡ
ＴＡ"２は、それぞれＨＳＶ−１ gＣmＲＮＡと７３０塩
基mＲＮＡの転写コントロール領域と推定される(５９,
６０)。ＨＳＶ−１配列の１７２８の位置に挿入された
Ｔ残基はこの領域の配列再決定により発見され(Ｍ．Ｊa
ckson未発表)、それはＨＳＶ−２の主オープンリーディ
ングフレームの停止コドンと相同である１７３５〜１７
３７の位置にインフェース停止コドンを導入するもので
あることが明らかにされた。第２ＨＳＶ−２開始コドン
の位置が１９７５〜１９７７であるように、ＨＳＶ−１
の７３０塩基mＲＮＡ開始コドンの位置は２０３２〜２
０３４に示されている。
【００８５】再び図１９、図２０、図２１、図２２およ
び図２３において、ＨＳＶ−２の図示された誘導配列を
ＨＳＶ−１のgＣ遺伝子領域のＤＮＡ配列(５９)と比較
すると、これら二つの断片間の全体的な配列相同性は約
６８％であった。然しながら配列のある一定の領域を見
ると、配列相同性の程度は他に比較してはるかに高い
か、または低かった。例えば、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
の０〜５７０位の配列は僅かに５１％の相同性しか示さ
ないが、５７０〜１７４０位の領域は、遥かに高い配列
相同性を示した(８０％)。もう一つの相同性の高い領域
(７０％)は二つの配列の終りの１９７５位〜２４１９位
に見出された。ヌクレオチド配列の変化に加えて、二つ
のゲノムを相互に比較すると、種々の欠失または挿入が
見られた。最も顕著なのはＨＳＶ−１ gＣ配列の３４６
〜４２６の位置に見られる８１塩基対の領域が、ＨＳＶ
−２ゲノムでは失われていることであった。この全体的
な配列比較から、ここに配列決定を行なったＨＳＶ−１
gＣ領域とＨＳＶ−２領域との間には高度の配列相同性
があることが示された。
び図２３において、ＨＳＶ−２の図示された誘導配列を
ＨＳＶ−１のgＣ遺伝子領域のＤＮＡ配列(５９)と比較
すると、これら二つの断片間の全体的な配列相同性は約
６８％であった。然しながら配列のある一定の領域を見
ると、配列相同性の程度は他に比較してはるかに高い
か、または低かった。例えば、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
の０〜５７０位の配列は僅かに５１％の相同性しか示さ
ないが、５７０〜１７４０位の領域は、遥かに高い配列
相同性を示した(８０％)。もう一つの相同性の高い領域
(７０％)は二つの配列の終りの１９７５位〜２４１９位
に見出された。ヌクレオチド配列の変化に加えて、二つ
のゲノムを相互に比較すると、種々の欠失または挿入が
見られた。最も顕著なのはＨＳＶ−１ gＣ配列の３４６
〜４２６の位置に見られる８１塩基対の領域が、ＨＳＶ
−２ゲノムでは失われていることであった。この全体的
な配列比較から、ここに配列決定を行なったＨＳＶ−１
gＣ領域とＨＳＶ−２領域との間には高度の配列相同性
があることが示された。
【００８６】Ｆrinkら(５９)は、ＨＳＶ−１ gＣを暗号
化している２,５２０塩基mＲＮＡの５'−末端が、図１
９、図２０、図２１、図２２および図２３の４３位の下
線を引いたＡ残基にマップ(配置)することを発見した。
更に、彼らは、この残基の約２２塩基対(５')にＡＴに
富んだ“ＴＡＴＡ"ボックス(６０)を指摘している。図
１９、図２０、図２１、図２２、および図２３に示した
二つの配列を比較すると、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の配
列は共にこの領域に同一の配列、ＣＧＧＧＴＡＴＡＡＡ
を含んでいることを示している。この配列は、これまで
決定された多くのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２配列中の
“ＴＡＴＡ"ボックス領域に存在することが見い出され
ている先のＷhittonらの報告(６１)の配列と一致する。
この保存配列に続いて、両ウイルスゲノムともＧに富ん
だ領域がある。この推定上の転写コントロール領域のほ
かに、第２の“ＴＡＴＡ"ボックスが図１９、図２０、
図２１、図２２および図２３に二つの配列の１８４５〜
１８４９の位置に見出された。この第２の“ＴＡＴＡ"
ボックスはＨＳＶ−１ゲノムにおいて７３０塩基mＲＮ
Ａの転写をコントロールするものと推定されている(５
９)。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２は共にこの配列を含んで
おり、それは第一の“ＴＡＴＡ"ボックスの前にあるＣ
ＧＧＧ配列と類似したＣＧＧＧＣＧ配列を含むＧＣに富
んだフランキング配列に囲まれている。更に両ゲノムと
も、この第２の“ＴＡＴＡ"ボックスの３'にオープンリ
ーディングフレームを暗号化しており、これについては
後に論じる。
化している２,５２０塩基mＲＮＡの５'−末端が、図１
９、図２０、図２１、図２２および図２３の４３位の下
線を引いたＡ残基にマップ(配置)することを発見した。
更に、彼らは、この残基の約２２塩基対(５')にＡＴに
富んだ“ＴＡＴＡ"ボックス(６０)を指摘している。図
１９、図２０、図２１、図２２、および図２３に示した
二つの配列を比較すると、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の配
列は共にこの領域に同一の配列、ＣＧＧＧＴＡＴＡＡＡ
を含んでいることを示している。この配列は、これまで
決定された多くのＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２配列中の
“ＴＡＴＡ"ボックス領域に存在することが見い出され
ている先のＷhittonらの報告(６１)の配列と一致する。
この保存配列に続いて、両ウイルスゲノムともＧに富ん
だ領域がある。この推定上の転写コントロール領域のほ
かに、第２の“ＴＡＴＡ"ボックスが図１９、図２０、
図２１、図２２および図２３に二つの配列の１８４５〜
１８４９の位置に見出された。この第２の“ＴＡＴＡ"
ボックスはＨＳＶ−１ゲノムにおいて７３０塩基mＲＮ
Ａの転写をコントロールするものと推定されている(５
９)。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２は共にこの配列を含んで
おり、それは第一の“ＴＡＴＡ"ボックスの前にあるＣ
ＧＧＧ配列と類似したＣＧＧＧＣＧ配列を含むＧＣに富
んだフランキング配列に囲まれている。更に両ゲノムと
も、この第２の“ＴＡＴＡ"ボックスの３'にオープンリ
ーディングフレームを暗号化しており、これについては
後に論じる。
【００８７】前述した８１塩基対の欠失がＨＳＶ−２ゲ
ノムに実際に見出されるのか、或いはクローニングまた
は配列決定の実験中に起こる人為的なものなのかどうか
を決定するために、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡおよびクロ
ーンしたＨＳＶ−２ＤＮＡのサザーンブロッティング解
析を実施した。失われた８１塩基対の領域にまたがるＳ
ac２断片(図１７の断片参照)から32Ｐ−標識プローブを
調製した。もしＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡが８１塩基対の
領域を欠失しているならば、この領域にまたがるＳma１
−ＢgＩＩＩ断片は５７６塩基対となり、Ｓma１断片は
６６２塩基となり、Ｓac２断片は１９５塩基対となるで
あろう。
ノムに実際に見出されるのか、或いはクローニングまた
は配列決定の実験中に起こる人為的なものなのかどうか
を決定するために、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡおよびクロ
ーンしたＨＳＶ−２ＤＮＡのサザーンブロッティング解
析を実施した。失われた８１塩基対の領域にまたがるＳ
ac２断片(図１７の断片参照)から32Ｐ−標識プローブを
調製した。もしＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡが８１塩基対の
領域を欠失しているならば、この領域にまたがるＳma１
−ＢgＩＩＩ断片は５７６塩基対となり、Ｓma１断片は
６６２塩基となり、Ｓac２断片は１９５塩基対となるで
あろう。
【００８８】図２４は、ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとpgＣ
2Ｓal２.９ＤＮＡのサザーンブロッティング解析を示
す。図１９、図２０、図２１、図２２および図２３に示
したＨＳＶ−２配列中、脱落している８１塩基対領域に
またがる領域(ＨＳＶ−２の３４６〜４２６の位置)を、
欠失領域に重なり合う図１７の星印で示したＳac２断片
を使用して解析した。１〜３列はＨＳＶ−２ゲノムＤＮ
Ａの制限消化物であり、４〜６列はpgＣ2Ｓal ２.９の
制限酵素消化物である。消化されたＤＮＡは１.５％ア
ガロースゲルで電気泳動し、変性し、ニトロセルロース
にブロットし、32Ｐ−標識Ｓac２断片でプローブした。
(矢印は、ファージλＤＮＡの５６４塩基対のＨindＩＩ
Ｉ断片の位置を示す)。１列および６列目;Ｓma１＋Ｂgl
２:２列目および５列目;Ｓma１:３列および４列目;Ｓ
ac２。
2Ｓal２.９ＤＮＡのサザーンブロッティング解析を示
す。図１９、図２０、図２１、図２２および図２３に示
したＨＳＶ−２配列中、脱落している８１塩基対領域に
またがる領域(ＨＳＶ−２の３４６〜４２６の位置)を、
欠失領域に重なり合う図１７の星印で示したＳac２断片
を使用して解析した。１〜３列はＨＳＶ−２ゲノムＤＮ
Ａの制限消化物であり、４〜６列はpgＣ2Ｓal ２.９の
制限酵素消化物である。消化されたＤＮＡは１.５％ア
ガロースゲルで電気泳動し、変性し、ニトロセルロース
にブロットし、32Ｐ−標識Ｓac２断片でプローブした。
(矢印は、ファージλＤＮＡの５６４塩基対のＨindＩＩ
Ｉ断片の位置を示す)。１列および６列目;Ｓma１＋Ｂgl
２:２列目および５列目;Ｓma１:３列および４列目;Ｓ
ac２。
【００８９】図２４に示された結果から、予測した制限
部位がＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨＳ
Ｖ−２ＤＮＡの双方において、８１塩基対を欠失してい
る領域を囲んでいることが明らかになった。更に、ＨＳ
Ｖ−２ゲノム断片およびクローンした断片は正確に伴移
動(コマイグレート)しており、欠失がクローニングまた
は配列決定における手技によって人為的に起こったもの
でないことがわかった。
部位がＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡおよびクローンしたＨＳ
Ｖ−２ＤＮＡの双方において、８１塩基対を欠失してい
る領域を囲んでいることが明らかになった。更に、ＨＳ
Ｖ−２ゲノム断片およびクローンした断片は正確に伴移
動(コマイグレート)しており、欠失がクローニングまた
は配列決定における手技によって人為的に起こったもの
でないことがわかった。
【００９０】ＨＳＶ−２の２.９kbＳal１断片に含まれ
る主要なオープンリーディングフレームの解析 ＨＳＶ−２の２.９kbＳal１断片に含まれている潜在的
暗号化配列を解析し、図１９、図２０、図２１、図２２
および図２３に示したＨＳＶ−２配列の１９９〜２０１
の位置に暗号化されているメチオニンから始まり、この
図のＨＳＶ−２配列の１７３５〜１７３７の位置のＴＡ
Ａ停止コドンに終る４７９個のアミノ酸から成るオープ
ンリーディングフレームを明らかにした。図１９、図２
０、図２１、図２２および図２３から判るように、ＨＳ
Ｖ−１ gＣタンパク質とＨＳＶ−２オープンリーディン
グフレームは、共に二つの配列の、“ＴＡＴＡ"ボック
ス相同に対してほぼ同じ位置から開始する。更に、最初
この領域に存在するＨＳＶ−２オープンリーディングフ
レームはＨＳＶ−１ gＣ遺伝子の前の１２コドンで終る
と考えられていたが、ＨＳＶ−１Ｆ株のgＣ遺伝子配列
のカルボキシル末端領域の配列を再決定することにより
(Ｍ．Ｊackson、未発表)、Ｆrinkら(５９)によって報告
された配列は１７２７の位置の後のチミジンヌクレオチ
ドを見落としていたこと、およびこの残基を挿入する
と、翻訳したＨＳＶ−１ gＣタンパク質はＨＳＶ−２オ
ープンリーディングフレームと同じ場所(図１９、図２
０、図２１、図２２および図２３の１７３５〜１７３
７)で終了する翻訳されたＨＳＶ−１ gＣ蛋白質となる
ことが明らかになった。このようにして、種々の欠失お
よび挿入を考慮すると、図１９、図２０、図２１、図２
２および図２３に示したように、ＨＳＶ−１ gＣ遺伝子
とＨＳＶ−２のオープンリーディングフレームは非常に
高度の重なりを示す。
る主要なオープンリーディングフレームの解析 ＨＳＶ−２の２.９kbＳal１断片に含まれている潜在的
暗号化配列を解析し、図１９、図２０、図２１、図２２
および図２３に示したＨＳＶ−２配列の１９９〜２０１
の位置に暗号化されているメチオニンから始まり、この
図のＨＳＶ−２配列の１７３５〜１７３７の位置のＴＡ
Ａ停止コドンに終る４７９個のアミノ酸から成るオープ
ンリーディングフレームを明らかにした。図１９、図２
０、図２１、図２２および図２３から判るように、ＨＳ
Ｖ−１ gＣタンパク質とＨＳＶ−２オープンリーディン
グフレームは、共に二つの配列の、“ＴＡＴＡ"ボック
ス相同に対してほぼ同じ位置から開始する。更に、最初
この領域に存在するＨＳＶ−２オープンリーディングフ
レームはＨＳＶ−１ gＣ遺伝子の前の１２コドンで終る
と考えられていたが、ＨＳＶ−１Ｆ株のgＣ遺伝子配列
のカルボキシル末端領域の配列を再決定することにより
(Ｍ．Ｊackson、未発表)、Ｆrinkら(５９)によって報告
された配列は１７２７の位置の後のチミジンヌクレオチ
ドを見落としていたこと、およびこの残基を挿入する
と、翻訳したＨＳＶ−１ gＣタンパク質はＨＳＶ−２オ
ープンリーディングフレームと同じ場所(図１９、図２
０、図２１、図２２および図２３の１７３５〜１７３
７)で終了する翻訳されたＨＳＶ−１ gＣ蛋白質となる
ことが明らかになった。このようにして、種々の欠失お
よび挿入を考慮すると、図１９、図２０、図２１、図２
２および図２３に示したように、ＨＳＶ−１ gＣ遺伝子
とＨＳＶ−２のオープンリーディングフレームは非常に
高度の重なりを示す。
【００９１】図２５、図２６および図２７は、ＨＳＶ−
２の大−オープンリーディングフレームの翻訳と、ＨＳ
Ｖ−１ gＣアミノ酸配列との比較を示す。アミノ酸は１
文字略号法を使用して表わした。ＨＳＶ−１ gＣはＨＳ
Ｖ−１ gＣ配列を意味し、ＨＳＶ−２ gＦはＨＳＶ−２
オープンリーディングフレーム配列を意味する。タンパ
ク質はＨＯＭプログラムを使用して比較し、間隙の場所
は、所望により相同体を最大化して挿入した。相同でな
いアミノ酸の上に星印を付した。Ｎ−結合糖タンパク質
と推定される部位(ＮＸＳまたはＮＸＴ)(６２)には陰影
を付け、システイン残基(Ｃ)は枠で囲んだ。空間部分
(スペース)を除き、アミノ酸だけに番号を付した。図２
７は、２番目のＨＳＶ−２オープンリーディングフレー
ムの翻訳およびＨＳＶ−１７３０塩基mＲＮＡタンパク
質との比較を示す。７３０ ＯＲＦＨＳＶ−２は、図１
９、図２０、図２１、図２２および図２３に示したＨＳ
Ｖ−２配列の１９７５〜２４０６の位置から誘導された
第２のＨＳＶ−２オープンリーディングフレームの不完
全アミノ酸配列である。７３０ ＯＲＦ ＨＳＶ−１
は、ＨＳＶ−１の７３０塩基mＲＮＡ(５９)によって暗
号化されたタンパク質へ誘導するアミノ酸配列である。
図９Ａおよび図９Ｂのいずれにおいても、電荷に関して
保守(コンサーブ)されているアミノ酸変化には(Ｃ)印
を、電荷に関して保守(コンサーブ)されていない変化に
は(Ｎ)印を付けた。
２の大−オープンリーディングフレームの翻訳と、ＨＳ
Ｖ−１ gＣアミノ酸配列との比較を示す。アミノ酸は１
文字略号法を使用して表わした。ＨＳＶ−１ gＣはＨＳ
Ｖ−１ gＣ配列を意味し、ＨＳＶ−２ gＦはＨＳＶ−２
オープンリーディングフレーム配列を意味する。タンパ
ク質はＨＯＭプログラムを使用して比較し、間隙の場所
は、所望により相同体を最大化して挿入した。相同でな
いアミノ酸の上に星印を付した。Ｎ−結合糖タンパク質
と推定される部位(ＮＸＳまたはＮＸＴ)(６２)には陰影
を付け、システイン残基(Ｃ)は枠で囲んだ。空間部分
(スペース)を除き、アミノ酸だけに番号を付した。図２
７は、２番目のＨＳＶ−２オープンリーディングフレー
ムの翻訳およびＨＳＶ−１７３０塩基mＲＮＡタンパク
質との比較を示す。７３０ ＯＲＦＨＳＶ−２は、図１
９、図２０、図２１、図２２および図２３に示したＨＳ
Ｖ−２配列の１９７５〜２４０６の位置から誘導された
第２のＨＳＶ−２オープンリーディングフレームの不完
全アミノ酸配列である。７３０ ＯＲＦ ＨＳＶ−１
は、ＨＳＶ−１の７３０塩基mＲＮＡ(５９)によって暗
号化されたタンパク質へ誘導するアミノ酸配列である。
図９Ａおよび図９Ｂのいずれにおいても、電荷に関して
保守(コンサーブ)されているアミノ酸変化には(Ｃ)印
を、電荷に関して保守(コンサーブ)されていない変化に
は(Ｎ)印を付けた。
【００９２】図２５、図２６および図２７には、ＨＳＶ
−１ gＣ遺伝子と４７９アミノ酸ＨＳＶ−２オープンリ
ーディングフレーム間の高度の配列相同性を図示してい
る。最初の１９個のアミノ酸は、電荷に関してすべて保
守的(コンサーバティブ)である最初の２５個のアミノ酸
の変化を伴ない、約８０％の配列相同性を含んでいる。
ＨＳＶ−１ gＣの１２４番目の残基(ＨＳＶ−２配列の
９０番目の残基)から両タンパク質の末端までは、電荷
に関して保守的(コンサーバティブ)である７５％のアミ
ノ酸変化を伴なう約７４％の配列相同性がある。Ｎ−連
結糖付加が推定される５ケ所の部位(ＮＸＳまたはＮＸ
Ｔ(６２))は、両タンパク質間で保守(コンサーブ)さ
れ、７個のシスティン残基はすべてＣ末端に対し相同的
に位置に局在している。タンパク質のカルボキシル末端
基の３／４における全般的な配列の保守性(コンサーベ
ーション)に加えて、２０残基の長さにわたる大きい領
域のアミノ酸配列の偶発的な相同性もある(即ち、ＨＳ
Ｖ−１の３８５〜４０５の位置の配列とＨＳＶ−２の３
５２〜３７２の位置の配列)。この配列の比較から、Ｈ
ＳＶ−２ゲノムのこの領域のオープンリーディングフレ
ームは、ＨＳＶ−１ gＣと相同なタンパク質を暗号化さ
れていると結論して良い。
−１ gＣ遺伝子と４７９アミノ酸ＨＳＶ−２オープンリ
ーディングフレーム間の高度の配列相同性を図示してい
る。最初の１９個のアミノ酸は、電荷に関してすべて保
守的(コンサーバティブ)である最初の２５個のアミノ酸
の変化を伴ない、約８０％の配列相同性を含んでいる。
ＨＳＶ−１ gＣの１２４番目の残基(ＨＳＶ−２配列の
９０番目の残基)から両タンパク質の末端までは、電荷
に関して保守的(コンサーバティブ)である７５％のアミ
ノ酸変化を伴なう約７４％の配列相同性がある。Ｎ−連
結糖付加が推定される５ケ所の部位(ＮＸＳまたはＮＸ
Ｔ(６２))は、両タンパク質間で保守(コンサーブ)さ
れ、７個のシスティン残基はすべてＣ末端に対し相同的
に位置に局在している。タンパク質のカルボキシル末端
基の３／４における全般的な配列の保守性(コンサーベ
ーション)に加えて、２０残基の長さにわたる大きい領
域のアミノ酸配列の偶発的な相同性もある(即ち、ＨＳ
Ｖ−１の３８５〜４０５の位置の配列とＨＳＶ−２の３
５２〜３７２の位置の配列)。この配列の比較から、Ｈ
ＳＶ−２ゲノムのこの領域のオープンリーディングフレ
ームは、ＨＳＶ−１ gＣと相同なタンパク質を暗号化さ
れていると結論して良い。
【００９３】この領域に暗号化されているＨＳＶ−２タ
ンパク質はＨＳＶ−１ gＣ配列と著しい配列相同性を示
しているが、一方、二つの配列間には数ケ所の注目すべ
き差異がある。最も際立った差異は、ＨＳＶ−１ gＣ配
列における５０〜７６残基から見出される２７個のアミ
ノ酸がＨＳＶ−２配列に欠失している(図２５、図２６
および図２７)ことであり、これは先に記述した８１塩
基対の欠失に対応する。この大きい欠失のほかに、両配
列には１個または２個のアミノ酸から成る短かい欠失が
見られる。これらの欠失のすべてはタンパク質のアミノ
末端領域に見出される。これらの欠失のほかに、ＨＳＶ
−１ gＣ配列の２９〜１２３残基の間(ＨＳＶ−２配列
の３１〜９０残基)に頻発するタンパク質のアミノ末端
領域には多くのアミノ酸の変異がある。この領域ではア
ミノ酸の３０％だけが相同性であり、この相同の多くは
保守(コンサーブ)されたプロリン残基に起因している。
この領域に見出されるアミノ酸置換の４３％は電荷に関
して非保守的(ノンコンサーバティブ)である。そのよう
な多数の変異を示す唯一の他の領域はカルボキシル末端
疎水性領域(ＨＳＶ−１配列の４７６〜４９６残基およ
びＨＳＶ−２配列の４４３〜４６３残基)であり、そこ
ではタンパク質の５５％が相同性であるが、すべての変
化が保守(コンサーブ)され、荷電されず、疎水性のアミ
ノ酸であり、また該タンパク質のカルボキシル末端では
配列の僅か２５％だけが相同であるが、全般的なアミノ
酸の構成は相似している(ＨＳＶ−１の５００〜５１２
残基およびＨＳＶ−２の４６７〜４７９残基)。二つの
タンパク質間には５ケ所のＮ−結合糖付加推定部位が保
守(コンサーブ)されているが、一方ＨＳＶ−gＣ配列は
ＨＳＶ−２配列より２ケ所含んでいる部位が多い(総計
９:７)。ＨＳＶ−１ gＣ配列には、ＨＳＶ−２部位から
欠失している２７個のアミノ酸中に２ケ所のＮ−結合糖
付加部位と、図２５、図２６および図２７の１０９〜１
１２残基間に１対の重複している部位が含まれている。
ＨＳＶ−２配列はＨＳＶ−１配列には見られない２ケ所
のＮ−結合糖付加部位を含んでおり、その１個はアミノ
末端領域の近くにある。
ンパク質はＨＳＶ−１ gＣ配列と著しい配列相同性を示
しているが、一方、二つの配列間には数ケ所の注目すべ
き差異がある。最も際立った差異は、ＨＳＶ−１ gＣ配
列における５０〜７６残基から見出される２７個のアミ
ノ酸がＨＳＶ−２配列に欠失している(図２５、図２６
および図２７)ことであり、これは先に記述した８１塩
基対の欠失に対応する。この大きい欠失のほかに、両配
列には１個または２個のアミノ酸から成る短かい欠失が
見られる。これらの欠失のすべてはタンパク質のアミノ
末端領域に見出される。これらの欠失のほかに、ＨＳＶ
−１ gＣ配列の２９〜１２３残基の間(ＨＳＶ−２配列
の３１〜９０残基)に頻発するタンパク質のアミノ末端
領域には多くのアミノ酸の変異がある。この領域ではア
ミノ酸の３０％だけが相同性であり、この相同の多くは
保守(コンサーブ)されたプロリン残基に起因している。
この領域に見出されるアミノ酸置換の４３％は電荷に関
して非保守的(ノンコンサーバティブ)である。そのよう
な多数の変異を示す唯一の他の領域はカルボキシル末端
疎水性領域(ＨＳＶ−１配列の４７６〜４９６残基およ
びＨＳＶ−２配列の４４３〜４６３残基)であり、そこ
ではタンパク質の５５％が相同性であるが、すべての変
化が保守(コンサーブ)され、荷電されず、疎水性のアミ
ノ酸であり、また該タンパク質のカルボキシル末端では
配列の僅か２５％だけが相同であるが、全般的なアミノ
酸の構成は相似している(ＨＳＶ−１の５００〜５１２
残基およびＨＳＶ−２の４６７〜４７９残基)。二つの
タンパク質間には５ケ所のＮ−結合糖付加推定部位が保
守(コンサーブ)されているが、一方ＨＳＶ−gＣ配列は
ＨＳＶ−２配列より２ケ所含んでいる部位が多い(総計
９:７)。ＨＳＶ−１ gＣ配列には、ＨＳＶ−２部位から
欠失している２７個のアミノ酸中に２ケ所のＮ−結合糖
付加部位と、図２５、図２６および図２７の１０９〜１
１２残基間に１対の重複している部位が含まれている。
ＨＳＶ−２配列はＨＳＶ−１配列には見られない２ケ所
のＮ−結合糖付加部位を含んでおり、その１個はアミノ
末端領域の近くにある。
【００９４】ＨＳＶ−１配列とＨＳＶ−２配列間に起こ
り得る構造上の相同性を一層充分に吟味するために、ヒ
ドロパシー解析を実施した(３１a)。図１１に、ＨＳＶ
−１gＣタンパク質とＨＳＶ−２主−オープンリーディ
ングタンパク質のヒドロパシー解析を図示する。各タン
パク質のヒドロパシーはＨoppおよびＷoods(３１a)のプ
ログラムを使用して測定した。中央線より上方は疎水性
領域、中央線より下方は親水性領域である。１２個ずつ
のアミノ酸を解析し、その平均ヒドロパシー値を計算し
た。アスパラギン−連結糖付加推定部位(６２)を(Ｏ)印
で示した。gＣ−１:ＨＳＶ−１ gＣタンパク質ヒドロパ
シー。gＣ−２(gＦ):ＨＳＶ−２ 主−オープンリーデ
ィングフレームヒドロパシー。
り得る構造上の相同性を一層充分に吟味するために、ヒ
ドロパシー解析を実施した(３１a)。図１１に、ＨＳＶ
−１gＣタンパク質とＨＳＶ−２主−オープンリーディ
ングタンパク質のヒドロパシー解析を図示する。各タン
パク質のヒドロパシーはＨoppおよびＷoods(３１a)のプ
ログラムを使用して測定した。中央線より上方は疎水性
領域、中央線より下方は親水性領域である。１２個ずつ
のアミノ酸を解析し、その平均ヒドロパシー値を計算し
た。アスパラギン−連結糖付加推定部位(６２)を(Ｏ)印
で示した。gＣ−１:ＨＳＶ−１ gＣタンパク質ヒドロパ
シー。gＣ−２(gＦ):ＨＳＶ−２ 主−オープンリーデ
ィングフレームヒドロパシー。
【００９５】両タンパク質が、アミノ酸配列の親水性と
疎水性の性質に基づいた極度の構造上の相同性を示すこ
とを図２８および図２９に示す。各図において、Ｎ−末
端疎水性領域の後には親水性のアミノ酸鎖が続いてお
り、それぞれ総計９個のうち６個(ＨＳＶ−１)または総
計７個のうち３個(ＨＳＶ−２)のＮ−連結糖付加推定部
位を含んでいることを示している。この親水性領域に続
くピークと谷は、最後のＮ−結合糖付加部位を含む親水
性領域を含めて両タンパク質とも非常に相似している。
両タンパク質のカルボキシル末端領域は非常に疎水性の
２０残基領域を示し、その後にカルボキシル末端領域が
続いている。ＨＳＶ−１ gＣにだけ見出される２７個の
近接するアミノ酸は５０〜７６残基間に比較的親水性の
領域を暗号化されているようである(図２８および図２
９)。以上結論すると、この解析によってＨＳＶ−１ g
ＣとＨＳＶ−２タンパク質の両者のヒドロパシー像は非
常に相似しており、これらタンパク質の最低に保守(コ
ンサーブ)されたアミノ末端両域は高度に糖付加を受け
る電位を有する親水性領域に見出されることが明らかに
された。
疎水性の性質に基づいた極度の構造上の相同性を示すこ
とを図２８および図２９に示す。各図において、Ｎ−末
端疎水性領域の後には親水性のアミノ酸鎖が続いてお
り、それぞれ総計９個のうち６個(ＨＳＶ−１)または総
計７個のうち３個(ＨＳＶ−２)のＮ−連結糖付加推定部
位を含んでいることを示している。この親水性領域に続
くピークと谷は、最後のＮ−結合糖付加部位を含む親水
性領域を含めて両タンパク質とも非常に相似している。
両タンパク質のカルボキシル末端領域は非常に疎水性の
２０残基領域を示し、その後にカルボキシル末端領域が
続いている。ＨＳＶ−１ gＣにだけ見出される２７個の
近接するアミノ酸は５０〜７６残基間に比較的親水性の
領域を暗号化されているようである(図２８および図２
９)。以上結論すると、この解析によってＨＳＶ−１ g
ＣとＨＳＶ−２タンパク質の両者のヒドロパシー像は非
常に相似しており、これらタンパク質の最低に保守(コ
ンサーブ)されたアミノ末端両域は高度に糖付加を受け
る電位を有する親水性領域に見出されることが明らかに
された。
【００９６】第２ＨＳＶ−２オープンリーディングフレ
ームの解析 図６に示したＨＳＶ−２配列の最終４３１塩基対(１９
７５〜２４０６残基)の翻訳によって１０５アミノ酸か
ら成る第２オープンリーディングフレームが明らかに成
った。ここに報告する配列情報は、ＨＳＶ−２第２オー
プンリーディングフレームの全部を十分に把握している
わけではないが、この配列をＦrinkら(１０)が報告した
ＨＳＶ−１の７３０塩基mＲＮＡにより暗号化されたオ
ープンリーディングフレームと比較すると、この場合も
また高度の相同性を示している。図９Ｂで明らかなよう
に、二つの配列は重なり合う領域では７５％の配列相同
性を示し、またそのアミノ酸変異の約９０％は電荷に関
して保守的(コンサーバティブ)である。二つの配列の主
な差異は、ＨＳＶ−２に見られる１９アミノ酸Ｎ−末端
領域がＨＳＶ−１配列には見出されない点である。従っ
てこの領域に暗号化されている機能は不明であるが、Ｈ
ＳＶ−１とＨＳＶ−１から得られるタンパク質はかなり
の配列相同性を示している。
ームの解析 図６に示したＨＳＶ−２配列の最終４３１塩基対(１９
７５〜２４０６残基)の翻訳によって１０５アミノ酸か
ら成る第２オープンリーディングフレームが明らかに成
った。ここに報告する配列情報は、ＨＳＶ−２第２オー
プンリーディングフレームの全部を十分に把握している
わけではないが、この配列をＦrinkら(１０)が報告した
ＨＳＶ−１の７３０塩基mＲＮＡにより暗号化されたオ
ープンリーディングフレームと比較すると、この場合も
また高度の相同性を示している。図９Ｂで明らかなよう
に、二つの配列は重なり合う領域では７５％の配列相同
性を示し、またそのアミノ酸変異の約９０％は電荷に関
して保守的(コンサーバティブ)である。二つの配列の主
な差異は、ＨＳＶ−２に見られる１９アミノ酸Ｎ−末端
領域がＨＳＶ−１配列には見出されない点である。従っ
てこの領域に暗号化されている機能は不明であるが、Ｈ
ＳＶ−１とＨＳＶ−１から得られるタンパク質はかなり
の配列相同性を示している。
【００９７】考察 上記の結果は、ＨＳＶ−２ゲノムが共直線的に配置して
いるＨＳＶ−１糖タンパク質Ｃの同族体を暗号化されて
いることを証明している。ここに見出された配列の共直
線性は、ＨＳＶ−１の７３０塩基対mＲＮＡの同族体(１
０)を明らかに暗号化されているＨＳＶ−２の主−オー
プンリーディングフレームの３'配列の発見によって強
化される。ＨＳＶ−２ gＦ遺伝子の以前の地図作成(３
３)は、ここに記載した数ケ所の潜在性のＮ−結合糖付
加部位と、明らかなアミノ末端シグナル配列(５)、およ
び推定カルボキシル末端膜透過領域(２８)を包含するＨ
ＳＶ−２ゲノムの主−オープンリーディングフレームの
性質の双方によって、ここに記載したＨＳＶ−２タンパ
ク質は糖タンパク質gＦであると結論される。更に、翻
訳されたＨＳＶ−２タンパク質の大きさ(〜５２,０００
ダルトン)は、エンドグリコシダーゼＨで処理したＨＳ
Ｖ−２ gＦの天然の大きさとして報告されている値(５
４,０００ダルトン)と近似している。最後に、広範囲に
わたるアミノ酸配列の相同性と、数ケ所の潜在性Ｎ−結
合糖付加部位および７個のシステイン残基すべてのコン
サーベーション(保存性)はＨＳＶ−１ gＣとＨＳＶ−２
gＦ間の構造的相動性を示している。
いるＨＳＶ−１糖タンパク質Ｃの同族体を暗号化されて
いることを証明している。ここに見出された配列の共直
線性は、ＨＳＶ−１の７３０塩基対mＲＮＡの同族体(１
０)を明らかに暗号化されているＨＳＶ−２の主−オー
プンリーディングフレームの３'配列の発見によって強
化される。ＨＳＶ−２ gＦ遺伝子の以前の地図作成(３
３)は、ここに記載した数ケ所の潜在性のＮ−結合糖付
加部位と、明らかなアミノ末端シグナル配列(５)、およ
び推定カルボキシル末端膜透過領域(２８)を包含するＨ
ＳＶ−２ゲノムの主−オープンリーディングフレームの
性質の双方によって、ここに記載したＨＳＶ−２タンパ
ク質は糖タンパク質gＦであると結論される。更に、翻
訳されたＨＳＶ−２タンパク質の大きさ(〜５２,０００
ダルトン)は、エンドグリコシダーゼＨで処理したＨＳ
Ｖ−２ gＦの天然の大きさとして報告されている値(５
４,０００ダルトン)と近似している。最後に、広範囲に
わたるアミノ酸配列の相同性と、数ケ所の潜在性Ｎ−結
合糖付加部位および７個のシステイン残基すべてのコン
サーベーション(保存性)はＨＳＶ−１ gＣとＨＳＶ−２
gＦ間の構造的相動性を示している。
【００９８】これらの結果は、ＨＳＶ−２ gＦとＨＳＶ
−１ gＣは主として型特異性であるが、それらは型共通
性の決定基を有していることを証明した以前の成績(１
７、２２d、２２f、４３)を説明することを助ける。２,
３の以前の研究(１７、１８、４３)で、これらのタンパ
ク質が型特異性抗体を優勢に誘導することを証明してい
るので、大部分のタンパク質抗原領域が推定疎水性シグ
ナル配列に続く、より分岐したＮ−末端配列の中に見出
されるのは理屈にあっている。分岐領域の潜在性のＮ−
結合糖負荷部位の高い含量と共に、その親水性の性質
(６２)から、これらの領域がタンパク質表面に位置する
ことが示唆される。これらの分岐配列がタンパク質の外
側へ暴露していることは、これらの分岐抗原決定基(エ
ピトープ)に対する型特異性抗体の生成に対する役割り
を果たしているのかも知れない。然し、gＣとgＦの間で
保守(コンサーブ)されている親水性領域がタンパク質の
外側へ暴露することができ、１例において糖付加されて
いる(ＨＳＶ−１ gＣの３６３〜３６６残基およびＨＳ
Ｖ−２ gＦの３３０〜３３２残基)ことがあり得るの
で、型共通性抗体もタンパク質の３／４のより高度に保
守(コンサーブ)されているカルボキシル末端によって生
成される可能性がある。このように、ＨＳＶ−１gＣと
ＨＳＶ−２ gＦは型特異性および型共通性決定基の双方
を共有しているが、型特異性決定基の方がより抗原性で
あるようである。
−１ gＣは主として型特異性であるが、それらは型共通
性の決定基を有していることを証明した以前の成績(１
７、２２d、２２f、４３)を説明することを助ける。２,
３の以前の研究(１７、１８、４３)で、これらのタンパ
ク質が型特異性抗体を優勢に誘導することを証明してい
るので、大部分のタンパク質抗原領域が推定疎水性シグ
ナル配列に続く、より分岐したＮ−末端配列の中に見出
されるのは理屈にあっている。分岐領域の潜在性のＮ−
結合糖負荷部位の高い含量と共に、その親水性の性質
(６２)から、これらの領域がタンパク質表面に位置する
ことが示唆される。これらの分岐配列がタンパク質の外
側へ暴露していることは、これらの分岐抗原決定基(エ
ピトープ)に対する型特異性抗体の生成に対する役割り
を果たしているのかも知れない。然し、gＣとgＦの間で
保守(コンサーブ)されている親水性領域がタンパク質の
外側へ暴露することができ、１例において糖付加されて
いる(ＨＳＶ−１ gＣの３６３〜３６６残基およびＨＳ
Ｖ−２ gＦの３３０〜３３２残基)ことがあり得るの
で、型共通性抗体もタンパク質の３／４のより高度に保
守(コンサーブ)されているカルボキシル末端によって生
成される可能性がある。このように、ＨＳＶ−１gＣと
ＨＳＶ−２ gＦは型特異性および型共通性決定基の双方
を共有しているが、型特異性決定基の方がより抗原性で
あるようである。
【００９９】gＣとgＦの型特異性および型共通決定基の
説明は知られていないが、タンパク質には少なくとも二
つの機能、即ち、その一つは両ウイルスの生存率に重要
である型共通性領域、またその一つは各ウイルスの型に
特異的である型特異性領域である。gＣおよびgＦの機能
は現在のところ不明であり、生存し得るgＣマイナスの
ＨＳＶ−１突然変異株がインビトロで分離されているが
(６５)、ヒト宿主のインビボ感染期間および潜伏確立期
間において、gＣまたはgＦのいずれが必要不可欠である
のかは明らかでない。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の間
で、感染部位の偏好性と毒性の強さを含む生物学的な差
異の少なくとも幾つかはgＣとgＦのアミノ末端領域間の
著しい構造的差異に由来するであろうことは考えられ
る。例えこれらタンパク質の機能的な知識が全くなくて
も、異なった選択圧がgＣおよびgＦの分岐領域と保守
(コンサーブ)領域に作用するに違いないと結論しても良
かろう。
説明は知られていないが、タンパク質には少なくとも二
つの機能、即ち、その一つは両ウイルスの生存率に重要
である型共通性領域、またその一つは各ウイルスの型に
特異的である型特異性領域である。gＣおよびgＦの機能
は現在のところ不明であり、生存し得るgＣマイナスの
ＨＳＶ−１突然変異株がインビトロで分離されているが
(６５)、ヒト宿主のインビボ感染期間および潜伏確立期
間において、gＣまたはgＦのいずれが必要不可欠である
のかは明らかでない。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の間
で、感染部位の偏好性と毒性の強さを含む生物学的な差
異の少なくとも幾つかはgＣとgＦのアミノ末端領域間の
著しい構造的差異に由来するであろうことは考えられ
る。例えこれらタンパク質の機能的な知識が全くなくて
も、異なった選択圧がgＣおよびgＦの分岐領域と保守
(コンサーブ)領域に作用するに違いないと結論しても良
かろう。
【０１００】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のgＤ遺伝子
の配列に関する以前の比較(５８)で、アミノ末端シグナ
ル配列(６３)とカルボキシル末端膜透過領域(６４)は、
置換アミノ酸が疎水性である限り多数の突然変異に耐容
し得ることを証明した。gＣおよびgＦの配列比較によ
り、gＣの４７９〜４９６残基とgＦの４４３〜４６３残
基からカルボキシル末端、推定膜透過領域(６４)で同様
の知見が示された。この領域における多くの非対応性疎
水性置換体は、gＤの場合のように、脂溶性であるアミ
ノ酸ならばこの領域に耐容できることが示唆される。然
しながら、gＤとは対照的にgＣとgＦのアミノ末端シグ
ナル配列は最初の１９残基で高度に相同である。このよ
うにこの領域は、糖タンパク質を粗面小胞体へ指向させ
る以外に重要な保守(コンサーブ)された機能を持つか
(５)、或いは保守されねばならないゲノムのこの領域
に、重複する遺伝子または他の機能的な配列がある(６
６)かである。
の配列に関する以前の比較(５８)で、アミノ末端シグナ
ル配列(６３)とカルボキシル末端膜透過領域(６４)は、
置換アミノ酸が疎水性である限り多数の突然変異に耐容
し得ることを証明した。gＣおよびgＦの配列比較によ
り、gＣの４７９〜４９６残基とgＦの４４３〜４６３残
基からカルボキシル末端、推定膜透過領域(６４)で同様
の知見が示された。この領域における多くの非対応性疎
水性置換体は、gＤの場合のように、脂溶性であるアミ
ノ酸ならばこの領域に耐容できることが示唆される。然
しながら、gＤとは対照的にgＣとgＦのアミノ末端シグ
ナル配列は最初の１９残基で高度に相同である。このよ
うにこの領域は、糖タンパク質を粗面小胞体へ指向させ
る以外に重要な保守(コンサーブ)された機能を持つか
(５)、或いは保守されねばならないゲノムのこの領域
に、重複する遺伝子または他の機能的な配列がある(６
６)かである。
【０１０１】完全な比較をするにはＨＳＶ−２配列が不
充分であるが、ＨＳＶ−１ gＣmＲＮＡ転写開始への５'
領域は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ゲノムの双方とも
同じＣＧＧＧＴＡＴＡＡ配列を示す。更に、両配列と
も、それに続いて転写開始の直前のＧに富んだ領域があ
る。このように、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のgＤ遺
伝子で以前に発見されたように、二つのウイルス型間の
上流配列に相同性が存在しており、このことはこれらの
領域がこれら遺伝子の転写調節に関与している可能性を
示唆している。両ウイルスゲノムに見出され、多分７３
０塩基mＲＮＡの転写をコントロールしていると思われ
る(５９,６０)“ＴＡＴＡ"ボックス相同性も、ＨＳＶ−
１とＨＳＶ−２における比較的高度な配列相同性を示し
ているのは興味深い。図１９、図２０、図２１、図２２
および図２３に示したように、この“ＴＡＴＡ"ボック
スの前にあるＣＧに富んだ配列が来るが、これは第一の
“ＴＡＴＡ"領域の前にある配列と相似しているが、全
く同一ではなく、それらの後にいずれも〜８０％の配列
相同性を示す１４塩基対の領域が続く。全般的な配列相
同性は〜７５％であるのに対し、この領域を囲む全領域
の相同性は僅かに３３塩基対である。もしこの領域が７
３０塩基mＲＮＡの転写調節に関与するならば、転写調
節因子による認識には比較的短かい配列で充分であるよ
うである。
充分であるが、ＨＳＶ−１ gＣmＲＮＡ転写開始への５'
領域は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ゲノムの双方とも
同じＣＧＧＧＴＡＴＡＡ配列を示す。更に、両配列と
も、それに続いて転写開始の直前のＧに富んだ領域があ
る。このように、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のgＤ遺
伝子で以前に発見されたように、二つのウイルス型間の
上流配列に相同性が存在しており、このことはこれらの
領域がこれら遺伝子の転写調節に関与している可能性を
示唆している。両ウイルスゲノムに見出され、多分７３
０塩基mＲＮＡの転写をコントロールしていると思われ
る(５９,６０)“ＴＡＴＡ"ボックス相同性も、ＨＳＶ−
１とＨＳＶ−２における比較的高度な配列相同性を示し
ているのは興味深い。図１９、図２０、図２１、図２２
および図２３に示したように、この“ＴＡＴＡ"ボック
スの前にあるＣＧに富んだ配列が来るが、これは第一の
“ＴＡＴＡ"領域の前にある配列と相似しているが、全
く同一ではなく、それらの後にいずれも〜８０％の配列
相同性を示す１４塩基対の領域が続く。全般的な配列相
同性は〜７５％であるのに対し、この領域を囲む全領域
の相同性は僅かに３３塩基対である。もしこの領域が７
３０塩基mＲＮＡの転写調節に関与するならば、転写調
節因子による認識には比較的短かい配列で充分であるよ
うである。
【０１０２】結果からＨＳＶ−１ gＣとＨＳＶ−２ gＦ
糖タンパク質は高度に相同的であり、それらが型共通性
および型特異性領域を暗号化されていることを証明し
た。二つのタンパク質が有意な配列相同性を示し、また
明らかに共直線的に配置されているので、本発明人らは
ＨＳＶ−２ gＦをＨＳＶ−２ gＣまたgＣ−２と命名し
直すというＺeznlakおよびＳpear(２２d)の提案を支持
する。また、ここに報告した配列決定データは、インビ
トロでgＣ−１とgＣ−２タンパク質間の種々の型特異性
領域を交換することによる二つのタンパク質の機能的解
析と、キメラ様配列をヒト細胞に発現すること(６７)ま
たはこれらの領域をウイルスへ再編入する(６８)道を開
いた。
糖タンパク質は高度に相同的であり、それらが型共通性
および型特異性領域を暗号化されていることを証明し
た。二つのタンパク質が有意な配列相同性を示し、また
明らかに共直線的に配置されているので、本発明人らは
ＨＳＶ−２ gＦをＨＳＶ−２ gＣまたgＣ−２と命名し
直すというＺeznlakおよびＳpear(２２d)の提案を支持
する。また、ここに報告した配列決定データは、インビ
トロでgＣ−１とgＣ−２タンパク質間の種々の型特異性
領域を交換することによる二つのタンパク質の機能的解
析と、キメラ様配列をヒト細胞に発現すること(６７)ま
たはこれらの領域をウイルスへ再編入する(６８)道を開
いた。
【０１０３】クローンしたgＣ−２糖タンパク質は実施
例１に開示したのと同様の方法で発現し、ワクチンに形
成されると確信する。更に、そのような組み換えgＣお
よびgＤ糖タンパク質の混合物から成るワクチンは、い
ずれの糖タンパク質単独から成るワクチンより、ＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２に対して有意に一層効果的である
ことを確信する。
例１に開示したのと同様の方法で発現し、ワクチンに形
成されると確信する。更に、そのような組み換えgＣお
よびgＤ糖タンパク質の混合物から成るワクチンは、い
ずれの糖タンパク質単独から成るワクチンより、ＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２に対して有意に一層効果的である
ことを確信する。
【０１０４】以下に参考図書、および本明細書中に、そ
の都度文字および数字でそれぞれ付加的に引用した参考
文献を挙げる。 １．Ｅmtage,et al．,Ｎature ２８３,１７１(１９８
０);Ｄavis,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(Ｕ
ＳＡ)７８,５３７６(１９８１);Ｗeiland,et al．,Ｎa
ture ２９２,８５１(１９８１)． ２．Ｋupper,et al．,Ｎature ２８９,５５５(１９８
１);Ｋleid,et al．,Ｓcience ２１４,１１２５(１９
８１)． ３．Ｃharnay,et al．,Ｎucleic Ａcids Ｒesearch
７,３３５(１９７９);Ｖalenzuela,et al．,Ｎature
２９８,３４７(１９８２)． ４．Ｒose,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(Ｕ
ＳＡ)７８,６６７０(１９８１)． ５．Ｙelverton,et al．,Ｓcience ２１９,６１４(１
９８３)． ６．Ｗatson,et al．,Ｓcience ２１８,３８１(１９
８２)． ７．Ｇething,et al．,Ｎature ２９３,６２０(１９
８１);Ｌiu,et al．,ＤＮＡ １,２１３(１９８２);Ｇ
oodenow,et al．,Ｓcience ２１５,677(１９８２);Ｇ
oodenow,et al．,Ｎature３００,２３１(１９８２);Ｃ
rowley,et al．,Ｍolec．and Ｃell．Ｂiol．３,４４
(１９８３)． ８．Ｒose,et al．,Ｃell ３０,７５３(１９８２)． ９．Ｓpear,Ｐ．Ｇ．,(１９８０),Ｈerpesviruses,p７
０９−７５０,in Ｈ.Ａ．Ｂlough and Ｊ．Ｍ．Ｔiff
aney(ed)．,Ｃell Ｍembranes and ＶiralＥnvelope
s,Ｖol．２．,Ａcademic Ｐress,Ｉnc．,Ｎew Ｙor
k． 10. Ｂalachandran,et al．,Ｊ．Ｖirol．４４,３４４
(１９８２)． 11．Ｎorrild,Ｃurr．Ｔop．Ｍicrobiol Ｉmmunol．９
０,６７(１９８０)． 12．Ｒoizman,Ｃell １６,４８１(１９７９)． 13．Ｂaucke,et al．,Ｊ．Ｖirol．３２,７７９(１９
７９)． 14．Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．２７,１７２． 15．Ｅberle,et al．,Ｊ．Ｖirol．３６,６６５(１９
８０)． 16．Ｎorrild,et al．,Ｊ．Ｖirol．２６,７１３(１９
７８)． 17．Ｐowell,et al．,Ｎature ２４９,３６０(１９７
４)． 18．Ｅberle,et al．,Ｉnfect．Ｉmmun．３１,１０６
２(１９８１)． 19．Ｐereira,et al．,Ｉnfect．Ｉmmun．２９,７２
４． 20．Ｓim,Ｃ．,et al．,Ｊ．Ｇen．Ｖirol．１９,２１
７(１９７３)． 21．Ｓhowalter,et al．,Ｉnfect．Ｉmmun．３４,６８
４(１９８１)． 22a．Ｅisenberg,et al．,Ｊ．Ｖirol．４１．１０９
９． 22b．Ｂalachandran,et al．,Ｊ．Ｖirol．３９,４３
８(１９８１)． 22c．Ｐara,et al．,Ｊ．Ｖirol．４１,１３７(１９８
２)． 22d．Ｚezulak,et al．,Ｊ．Ｖirol．４７．５５３(１
９８３)． 22f．Ｚweig,et al．,Ｊ．Ｖirol．４７,１８５(１９
８３)． 23．Ａnderson,et al．,Ｊ．Ｖirol．３０,８０５(１
９７９)． 24．Ｌee,et al．,Ｊ．Ｖirol．４３,４１(１９８
２)． 25．Ｍurray,et al．,Ｍol．Ｇenet．１５０,５３(１
９７７)． 26．Ｂenton,et al．,Ｓcience １９６,１８０(１９
７７)． 27．Ｓouthern,Ｊ．Ｍol．Ｂiol．９８,５０３(１９７
５)． 28．Ｖieira,et al．,Ｇene １９,２５９(１９８
２)． 29．Ｍessing,et al．,Ｎuc．Ａcid．Ｒes．９,３０９
(１９８１)． 30．Ｓanger,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７４,５４３６(１９７７)． 31．Ａtlas of Ｐrotein Ｓequence and Ｓtructu
re Ｖ．５,Ｓupplement２,１９７６,Ｍ．Ｏ．Ｄayhof
f,ed．,Ｔhe Ｂiochemical ＲesearchＦoundation,Ｓ
pring,Ｍaryland,p．３１１． 31a．Ｈopp,et．,al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７８,３８２４(１９８１)． 32．Ｗatson,et al．,Ｎucl．Ａcid．Ｒes．１１,１５
０７(１９８３)． 33．Ｂlobel,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)７
７,１７４６(１９８０)． 34．Ｒose,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(Ｕ
ＳＡ)７７,３８８４(１９８０)． 35．Ｒuyechan,et al．,Ｊ．Ｖirol．２９,６７７(１
９７９);Ｒoizman,Ｃell２６,４８１(１９７９)． 36．Ｓimonsen,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)８０,２４９５(１９８３)． 37．Ｌusky,et al．,Ｎature２９３,７９(１９８１)． 38. Ｎunberg,et al．,Ｃell １９,３５５(１９８
０)． 39．Ｕrlaub,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７７,４２１６(１９８０)． 40．Ｇraham,et al．,Ｖirol．５２,４５６(１９７
３)． 40a．Ｋessler,Ｊ．Ｉmmuno．１１５,１６１７(１９７
５)． 41．Ｓhowalter．et al．,Ｉnfect．and Ｉmmun．３
４,６８４(１９８１);モノクローナル抗−gＤ抗体、１
−Ｓおよび５５−Ｓは、Ｄr．ＭartinＺweig(Ｌaborato
ry of Ｍolecular Ｏncology,Ｎational ＣancerＩ
nstitute,Ｆrederick,Ｍaryland ２１７０１)により提
供された。 42．Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．３６,４２９(１９８
０)． 43．Ｐereira,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７８,５２０２(１９８１)． 44．Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．２７,１７２(１９７
８)． 45．Ｌaemmli,Ｎature ２２７,６８０(１９７０)． 46．Ｈoness,et al．,Ｊ．Ｖirol．１６,１３０８(１
９７５), 47．Ｓpear,Ｊ．Ｖirol．１７,９９１(１９７６)． 48．Ｃampadelli−Ｆiume,et al．,Ｊ．Ｖirol．４３,
１０６１(１９８２);Ｊohnson,et al．,Ｃell ３２,
９８７(１９８３);Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．４６,
６７９(１９８３)． 49．Ｂloch,Ｊ．Ｃell．Ｂiol．８２,６２９(１９７
９)． 50．血球凝集反応阻止および補体結合反応により、ＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２に対して力価測定を行なったヒ
トヘルペス血清は、Ｄr.Ｊohn Ａ.Ｓtewartof the
Ｃenters for Ｄisease Ｃontrol,Ａtlanta,Ｇeorgi
aから提供された。 51．Ｒector,et al．,Ｉnfect．and Ｉmmun．３８,１
６８(１９８２)． 52．Ｋennett,in Ｍonoclonal Ａntibodies,Ｋ．Ｋer
rett,Ｔ．Ｍckearn,andＢ．Ｂechtel,eds．(Ｐlenum
Ｐress,Ｎ．Ｙ．,１９８０),pp．３７６−３７７． 53. Ｆiers,et al．,Ｎature ２７３,１１３(１９７
８);Ｇluzman,Ｃell２３,２７５(１９８１)． 54．Ｌee,et al．,Ｎature ２９４,２２８(１９８
１);Ｋaufman,et al．,Ｍol．and Ｃell．Ｂiol．２,
１３０４(１９８３);Ｋaufman,et al．,Ｊ．Ｍol．Ｂi
ol．１５９,６０１(１９８２)． 55．Ｋleid,et al．,Ｓcience ２１４,１１２５(１９
８１)． 56．Ｍaxam,et al．,Ｍethods Ｅnzymol, ６５,４９
９(１９８０)． 57．Ｄayhoff,Ｍ．,Ｅd．Ａtlas of Ｐrotein Ｓequ
ence and Ｓtructure,Ｖol．５,Ｓupplement ２,Ｎa
tional Ｂiochemical ＲesearchＦoundation,Ｓilver
Ｓpring,Ｍaryland,p．３１１(１９７６)． 58．Ｌasky,et al．,ＤＮＡ,印刷中(１９８４)． 59．Ｆrink,et al．,Ｊ．Ｖirol．４５,６３４(１９８
３)． 60．Ｍcknight,et al．,Ｓcience ２１７,３１６(１
９８２)． 61．Ｗhitton,et al．,Ｎucl．Ａcids Ｒes．１８,６
２７１(１９８３)． 62.Ｈubbard,et al．,Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．５０,５
５５(１９８１)． 63．Ｂlobel,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ７
７,１４９１(１９８０)． 64．Ｓabatini．et al．,Ｊ．Ｃell．Ｂiol．９２,１
(１９８２), 65．Ｃassai,et al．,Ｉntervirology ６,２１２(１
９７５), 66．Ｈall,et al．,Ｊ．Ｖirol．４３,５９４(１９８
２)．
の都度文字および数字でそれぞれ付加的に引用した参考
文献を挙げる。 １．Ｅmtage,et al．,Ｎature ２８３,１７１(１９８
０);Ｄavis,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(Ｕ
ＳＡ)７８,５３７６(１９８１);Ｗeiland,et al．,Ｎa
ture ２９２,８５１(１９８１)． ２．Ｋupper,et al．,Ｎature ２８９,５５５(１９８
１);Ｋleid,et al．,Ｓcience ２１４,１１２５(１９
８１)． ３．Ｃharnay,et al．,Ｎucleic Ａcids Ｒesearch
７,３３５(１９７９);Ｖalenzuela,et al．,Ｎature
２９８,３４７(１９８２)． ４．Ｒose,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(Ｕ
ＳＡ)７８,６６７０(１９８１)． ５．Ｙelverton,et al．,Ｓcience ２１９,６１４(１
９８３)． ６．Ｗatson,et al．,Ｓcience ２１８,３８１(１９
８２)． ７．Ｇething,et al．,Ｎature ２９３,６２０(１９
８１);Ｌiu,et al．,ＤＮＡ １,２１３(１９８２);Ｇ
oodenow,et al．,Ｓcience ２１５,677(１９８２);Ｇ
oodenow,et al．,Ｎature３００,２３１(１９８２);Ｃ
rowley,et al．,Ｍolec．and Ｃell．Ｂiol．３,４４
(１９８３)． ８．Ｒose,et al．,Ｃell ３０,７５３(１９８２)． ９．Ｓpear,Ｐ．Ｇ．,(１９８０),Ｈerpesviruses,p７
０９−７５０,in Ｈ.Ａ．Ｂlough and Ｊ．Ｍ．Ｔiff
aney(ed)．,Ｃell Ｍembranes and ＶiralＥnvelope
s,Ｖol．２．,Ａcademic Ｐress,Ｉnc．,Ｎew Ｙor
k． 10. Ｂalachandran,et al．,Ｊ．Ｖirol．４４,３４４
(１９８２)． 11．Ｎorrild,Ｃurr．Ｔop．Ｍicrobiol Ｉmmunol．９
０,６７(１９８０)． 12．Ｒoizman,Ｃell １６,４８１(１９７９)． 13．Ｂaucke,et al．,Ｊ．Ｖirol．３２,７７９(１９
７９)． 14．Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．２７,１７２． 15．Ｅberle,et al．,Ｊ．Ｖirol．３６,６６５(１９
８０)． 16．Ｎorrild,et al．,Ｊ．Ｖirol．２６,７１３(１９
７８)． 17．Ｐowell,et al．,Ｎature ２４９,３６０(１９７
４)． 18．Ｅberle,et al．,Ｉnfect．Ｉmmun．３１,１０６
２(１９８１)． 19．Ｐereira,et al．,Ｉnfect．Ｉmmun．２９,７２
４． 20．Ｓim,Ｃ．,et al．,Ｊ．Ｇen．Ｖirol．１９,２１
７(１９７３)． 21．Ｓhowalter,et al．,Ｉnfect．Ｉmmun．３４,６８
４(１９８１)． 22a．Ｅisenberg,et al．,Ｊ．Ｖirol．４１．１０９
９． 22b．Ｂalachandran,et al．,Ｊ．Ｖirol．３９,４３
８(１９８１)． 22c．Ｐara,et al．,Ｊ．Ｖirol．４１,１３７(１９８
２)． 22d．Ｚezulak,et al．,Ｊ．Ｖirol．４７．５５３(１
９８３)． 22f．Ｚweig,et al．,Ｊ．Ｖirol．４７,１８５(１９
８３)． 23．Ａnderson,et al．,Ｊ．Ｖirol．３０,８０５(１
９７９)． 24．Ｌee,et al．,Ｊ．Ｖirol．４３,４１(１９８
２)． 25．Ｍurray,et al．,Ｍol．Ｇenet．１５０,５３(１
９７７)． 26．Ｂenton,et al．,Ｓcience １９６,１８０(１９
７７)． 27．Ｓouthern,Ｊ．Ｍol．Ｂiol．９８,５０３(１９７
５)． 28．Ｖieira,et al．,Ｇene １９,２５９(１９８
２)． 29．Ｍessing,et al．,Ｎuc．Ａcid．Ｒes．９,３０９
(１９８１)． 30．Ｓanger,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７４,５４３６(１９７７)． 31．Ａtlas of Ｐrotein Ｓequence and Ｓtructu
re Ｖ．５,Ｓupplement２,１９７６,Ｍ．Ｏ．Ｄayhof
f,ed．,Ｔhe Ｂiochemical ＲesearchＦoundation,Ｓ
pring,Ｍaryland,p．３１１． 31a．Ｈopp,et．,al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７８,３８２４(１９８１)． 32．Ｗatson,et al．,Ｎucl．Ａcid．Ｒes．１１,１５
０７(１９８３)． 33．Ｂlobel,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)７
７,１７４６(１９８０)． 34．Ｒose,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(Ｕ
ＳＡ)７７,３８８４(１９８０)． 35．Ｒuyechan,et al．,Ｊ．Ｖirol．２９,６７７(１
９７９);Ｒoizman,Ｃell２６,４８１(１９７９)． 36．Ｓimonsen,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)８０,２４９５(１９８３)． 37．Ｌusky,et al．,Ｎature２９３,７９(１９８１)． 38. Ｎunberg,et al．,Ｃell １９,３５５(１９８
０)． 39．Ｕrlaub,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７７,４２１６(１９８０)． 40．Ｇraham,et al．,Ｖirol．５２,４５６(１９７
３)． 40a．Ｋessler,Ｊ．Ｉmmuno．１１５,１６１７(１９７
５)． 41．Ｓhowalter．et al．,Ｉnfect．and Ｉmmun．３
４,６８４(１９８１);モノクローナル抗−gＤ抗体、１
−Ｓおよび５５−Ｓは、Ｄr．ＭartinＺweig(Ｌaborato
ry of Ｍolecular Ｏncology,Ｎational ＣancerＩ
nstitute,Ｆrederick,Ｍaryland ２１７０１)により提
供された。 42．Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．３６,４２９(１９８
０)． 43．Ｐereira,et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
(ＵＳＡ)７８,５２０２(１９８１)． 44．Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．２７,１７２(１９７
８)． 45．Ｌaemmli,Ｎature ２２７,６８０(１９７０)． 46．Ｈoness,et al．,Ｊ．Ｖirol．１６,１３０８(１
９７５), 47．Ｓpear,Ｊ．Ｖirol．１７,９９１(１９７６)． 48．Ｃampadelli−Ｆiume,et al．,Ｊ．Ｖirol．４３,
１０６１(１９８２);Ｊohnson,et al．,Ｃell ３２,
９８７(１９８３);Ｃohen,et al．,Ｊ．Ｖirol．４６,
６７９(１９８３)． 49．Ｂloch,Ｊ．Ｃell．Ｂiol．８２,６２９(１９７
９)． 50．血球凝集反応阻止および補体結合反応により、ＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２に対して力価測定を行なったヒ
トヘルペス血清は、Ｄr.Ｊohn Ａ.Ｓtewartof the
Ｃenters for Ｄisease Ｃontrol,Ａtlanta,Ｇeorgi
aから提供された。 51．Ｒector,et al．,Ｉnfect．and Ｉmmun．３８,１
６８(１９８２)． 52．Ｋennett,in Ｍonoclonal Ａntibodies,Ｋ．Ｋer
rett,Ｔ．Ｍckearn,andＢ．Ｂechtel,eds．(Ｐlenum
Ｐress,Ｎ．Ｙ．,１９８０),pp．３７６−３７７． 53. Ｆiers,et al．,Ｎature ２７３,１１３(１９７
８);Ｇluzman,Ｃell２３,２７５(１９８１)． 54．Ｌee,et al．,Ｎature ２９４,２２８(１９８
１);Ｋaufman,et al．,Ｍol．and Ｃell．Ｂiol．２,
１３０４(１９８３);Ｋaufman,et al．,Ｊ．Ｍol．Ｂi
ol．１５９,６０１(１９８２)． 55．Ｋleid,et al．,Ｓcience ２１４,１１２５(１９
８１)． 56．Ｍaxam,et al．,Ｍethods Ｅnzymol, ６５,４９
９(１９８０)． 57．Ｄayhoff,Ｍ．,Ｅd．Ａtlas of Ｐrotein Ｓequ
ence and Ｓtructure,Ｖol．５,Ｓupplement ２,Ｎa
tional Ｂiochemical ＲesearchＦoundation,Ｓilver
Ｓpring,Ｍaryland,p．３１１(１９７６)． 58．Ｌasky,et al．,ＤＮＡ,印刷中(１９８４)． 59．Ｆrink,et al．,Ｊ．Ｖirol．４５,６３４(１９８
３)． 60．Ｍcknight,et al．,Ｓcience ２１７,３１６(１
９８２)． 61．Ｗhitton,et al．,Ｎucl．Ａcids Ｒes．１８,６
２７１(１９８３)． 62.Ｈubbard,et al．,Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．５０,５
５５(１９８１)． 63．Ｂlobel,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ７
７,１４９１(１９８０)． 64．Ｓabatini．et al．,Ｊ．Ｃell．Ｂiol．９２,１
(１９８２), 65．Ｃassai,et al．,Ｉntervirology ６,２１２(１
９７５), 66．Ｈall,et al．,Ｊ．Ｖirol．４３,５９４(１９８
２)．
【図１】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ gＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図２】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ gＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図３】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ gＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図４】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ gＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図５】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ gＤ遺伝子およ
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
びその周囲の非翻訳領域のＤＮＡ配列とその推定される
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図６】 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２タンパク質から
のgＤタンパク質のヒドロパシー解析を示すグラフであ
る。
のgＤタンパク質のヒドロパシー解析を示すグラフであ
る。
【図７】 膜結合型のＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現
のために組立てられたpgＤ−dhfrプラスミドの模式図で
ある。
のために組立てられたpgＤ−dhfrプラスミドの模式図で
ある。
【図８】 膜結合型のＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの発現
のために組立てられたpgＤ−dhfrプラスミドの模式図で
ある。
のために組立てられたpgＤ−dhfrプラスミドの模式図で
ある。
【図９】 ＨＳＶに対するヒト抗体でgＤ１２細胞を標
識した結果を示す位相差顕微鏡写真の模写図(Ａ)および
蛍光顕微鏡写真の模写図(Ｂ)である。
識した結果を示す位相差顕微鏡写真の模写図(Ａ)および
蛍光顕微鏡写真の模写図(Ｂ)である。
【図１０】 gＤ１２細胞系からのクローンされたgＤお
よびＨＳＶ−１に感染させたヒトの細胞から得られた天
然のgＤの放射免疫沈降を撮影した写真の模写図であ
る。
よびＨＳＶ−１に感染させたヒトの細胞から得られた天
然のgＤの放射免疫沈降を撮影した写真の模写図であ
る。
【図１１】 gＤ１２細胞および親のＣＨＯ細胞系に対
するヒト抗ＨＳＶ抗体の結合度を示すグラフである。
するヒト抗ＨＳＶ抗体の結合度を示すグラフである。
【図１２】 ＨＳＶ−１ gＤタンパク質の模式図であ
る。
る。
【図１３】 分泌型のＨＳＶ−１ gＤタンパク質のため
の発現プラスミドpgＤtruncdhfrの組立てを示す模式図
である。
の発現プラスミドpgＤtruncdhfrの組立てを示す模式図
である。
【図１４】 gＤ１０.２細胞系からの放射免疫沈降を撮
影した写真の模写図。
影した写真の模写図。
【図１５】 増幅前後のgＤ１０.２細胞系からの放射免
疫沈降を撮影した写真の模写図である。
疫沈降を撮影した写真の模写図である。
【図１６】 Ｍtxで増幅したgＤ１０.２細胞系で達成さ
れた増幅度を示すグラフである。
れた増幅度を示すグラフである。
【図１７】 ＤＮＡ配列解析を行なったpgＣ2Ｓal ２.
９の断片を示す模式図である。
９の断片を示す模式図である。
【図１８】 pgＣ2Ｓal ２.９から誘導されたＤＮＡ配
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
【図１９】 pgＣ2Ｓal ２.９から誘導されたＤＮＡ配
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
【図２０】 pgＣ2Ｓal ２.９から誘導されたＤＮＡ配
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
【図２１】 pgＣ2Ｓal ２.９から誘導されたＤＮＡ配
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
【図２２】 pgＣ2Ｓal ２.９から誘導されたＤＮＡ配
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
【図２３】 pgＣ2Ｓal ２.９から誘導されたＤＮＡ配
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
列とＨＳＶ−１ gＣ領域のＤＮＡ配列の比較を示す模式
図である。
【図２４】 ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとpgＣ2Ｓal ２.
９ＤＮＡのサザーンブロッティング解析の結果を撮影し
た写真の模写図である。
９ＤＮＡのサザーンブロッティング解析の結果を撮影し
た写真の模写図である。
【図２５】 ＨＳＶ−２のラージオープンリーディング
フレームの翻訳とＨＳＶ−１ gＣのアミノ酸配列の比較
を示す模式図である。
フレームの翻訳とＨＳＶ−１ gＣのアミノ酸配列の比較
を示す模式図である。
【図２６】 ＨＳＶ−２のラージオープンリーディング
フレームの翻訳とＨＳＶ−１ gＣのアミノ酸配列の比較
を示す模式図である。
フレームの翻訳とＨＳＶ−１ gＣのアミノ酸配列の比較
を示す模式図である。
【図２７】 ＨＳＶ−２のラージオープンリーディング
フレームの翻訳とＨＳＶ−１ gＣのアミノ酸配列の比較
を示す模式図である。
フレームの翻訳とＨＳＶ−１ gＣのアミノ酸配列の比較
を示す模式図である。
【図２８】 ＨＳＶ−１ gＣタンパク質とＨＳＶ−２の
メジャー・オープンリーディングフレームタンパク質の
ヒドロパシー解析結果を示すグラフである。
メジャー・オープンリーディングフレームタンパク質の
ヒドロパシー解析結果を示すグラフである。
【図２９】 ＨＳＶ−１ gＣタンパク質とＨＳＶ−２の
メジャー・オープンリーディングフレームタンパク質の
ヒドロパシー解析結果を示すグラフである。
メジャー・オープンリーディングフレームタンパク質の
ヒドロパシー解析結果を示すグラフである。
Claims (19)
- 【請求項１】 病原体に対する中和抗体を産生し得る露
出した抗原決定基を持った膜結合性ポリペプチドであっ
て、それを生産し得る安定な連続した組み換え体細胞系
の膜と機能的に連合しているポリペプチドを含有してい
るワクチン。 - 【請求項２】 病原体に対する中和抗体を産生し得る露
出した抗原決定基を持った膜結合性ポリペプチドの膜不
含誘導体であって、それを生産し得る安定な連続した組
み換え体細胞系の膜と機能的に連合する形で形成され、
次いで該膜から遊離することにより生成した該膜不含誘
導体を含有するワクチン。 - 【請求項３】 組み換え体宿主細胞が安定な真核細胞系
である請求項１または請求項２に記載のワクチン。 - 【請求項４】 宿主細胞が哺乳動物細胞系である請求項
１または請求項２に記載のワクチン。 - 【請求項５】 細胞系がジヒドロ葉酸レダクターゼdhfr
の生産性を欠失しており、dhfr選択マーカーおよび該ポ
リペプチドを暗号化している遺伝子を含んでいる発現ベ
クターを含有しているものである請求項３または請求項
４に記載のワクチン。 - 【請求項６】 ポリペプチドが単純ヘルペスウイルス１
型または２型の少なくとも１個の糖タンパク質を含んで
おり、該病原体が単純ヘルペスウイルス１型および／ま
たは２型である請求項１〜請求項５のいずれかに記載の
ワクチン。 - 【請求項７】 該糖タンパク質がgＤから成る請求項６
に記載のワクチン。 - 【請求項８】 該糖タンパク質がgＣから成る請求項６
に記載のワクチン。 - 【請求項９】 該ポリペプチドが糖タンパク質Ｃおよび
糖タンパク質Ｄの混合物から成る請求項６に記載のワク
チン。 - 【請求項１０】 膜結合ポリペプチドの先端を切断され
た膜不含誘導体を含有するワクチンであって、該誘導体
ポリペプチドが膜結合領域を含まず、膜を含まず、かつ
病原体に対する中和抗体を産生し得る露出した抗原決定
基を持っていることを特徴とするワクチン。 - 【請求項１１】 先端を切断されたポリペプチドが単純
ヘルペスウイルス１型または２型の糖タンパク質Ｄの誘
導体であり、病原体が単純ヘルペスウイルス１型および
／または２型である請求項１０に記載のワクチン。 - 【請求項１２】 先端を切断されたポリペプチドが単純
ヘルペスウイルス１型または２型の糖タンパク質Ｃの誘
導体であり、病原体が単純ヘルペスウイルス１型および
／または２型である請求項１０に記載のワクチン。 - 【請求項１３】 先端を切断された誘導体が、アミノ酸
残基約３００までのgＤポリペプチドのＮ−末端領域か
ら成る請求項１１に記載のワクチン。 - 【請求項１４】 膜結合ポリペプチドを暗号化している
ＤＮＡを製造し、膜結合領域を暗号化している部分を欠
失させ、そのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞
を該ベクターでトランスフェクトし、分泌生成物として
先端切断ポリペプチドを採取することを特徴とする膜結
合ポリペプチドの先端を切断された膜不含誘導体を含有
するワクチンであって、該誘導体ポリペプチドが膜結合
領域を含まず、膜を含まず、かつ病原体に対する中和抗
体を産生し得る露出した抗原決定基を持っていることを
特徴とするワクチンを製造する方法。 - 【請求項１５】 トランスフェクトされる宿主細胞が安
定した真核細胞系である請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 トランスフェクトされる宿主細胞が哺
乳動物細胞系である請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 細胞系がdhfr生産性を欠失し、ベクタ
ーがdhfr選択マーカーを含んでいる請求項１５または請
求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 先端切断ポリペプチドが単純ヘルペス
ウイルス１型または２型の糖タンパク質である請求項１
４〜請求項１６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１９】 先端切断ポリペプチドが糖タンパク質
Ｄの最初の３００アミノ酸残基に制限されている請求項
１８に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52791783A | 1983-08-30 | 1983-08-30 | |
| US54755183A | 1983-10-31 | 1983-10-31 | |
| US58817084A | 1984-03-09 | 1984-03-09 | |
| US527917 | 1984-03-09 | ||
| US547551 | 1984-03-09 | ||
| US588170 | 1984-03-09 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59183623A Division JP2599350B2 (ja) | 1983-08-30 | 1984-08-30 | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08253428A true JPH08253428A (ja) | 1996-10-01 |
Family
ID=27414978
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59183623A Expired - Lifetime JP2599350B2 (ja) | 1983-08-30 | 1984-08-30 | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
| JP7222311A Pending JPH08253428A (ja) | 1983-08-30 | 1995-08-30 | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59183623A Expired - Lifetime JP2599350B2 (ja) | 1983-08-30 | 1984-08-30 | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5851533A (ja) |
| EP (1) | EP0139417B2 (ja) |
| JP (2) | JP2599350B2 (ja) |
| AU (1) | AU579323B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341181C (ja) |
| DE (1) | DE3479085D1 (ja) |
| DK (2) | DK172694B1 (ja) |
| ES (2) | ES8605039A1 (ja) |
| GR (1) | GR80220B (ja) |
| HK (1) | HK98792A (ja) |
| IE (1) | IE58030B1 (ja) |
| IL (1) | IL72785A (ja) |
| NZ (1) | NZ209308A (ja) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3228501A1 (de) * | 1982-07-30 | 1984-02-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung eines herpes-antigens, dazu geeignetes mittel sowie verfahren zu seiner herstellung und die verwendung dieses antigens |
| NZ209307A (en) * | 1983-08-30 | 1990-07-26 | Genentech Inc | Diagnostic product: antigenic peptide produced by recombinant dna techniques |
| NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| US5612041A (en) * | 1984-07-17 | 1997-03-18 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gD vaccine |
| US5853978A (en) * | 1985-12-04 | 1998-12-29 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and methods of use |
| US6534285B1 (en) | 1984-12-24 | 2003-03-18 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
| CA1331355C (en) * | 1986-04-21 | 1994-08-09 | Bioenterprises Pty. Ltd | Immunopotentation |
| GR862472B (en) * | 1986-09-30 | 1986-10-09 | Elliniko Institouto Paster | Determination of antibodies specific of hsv-1 herpes or hsv-2 in human serum with the elisa technic using the specific antigen of hsv-1 or hsv-2 type in semi - clean form |
| IE81149B1 (en) | 1987-02-12 | 2000-05-03 | Genentech Inc | Methods and deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein |
| US5976839A (en) * | 1987-03-13 | 1999-11-02 | Bioenterprises Pty Limited | Immunopotentiation through covalent linkage between immunogen and immunopotentiating molecules |
| WO1990013652A1 (en) * | 1989-05-12 | 1990-11-15 | Triton Diagnostics, Inc. | Herpes simplex virus type 2-glycoprotein g proteins and polypeptides |
| AU6161390A (en) * | 1989-07-31 | 1991-03-11 | Basil Rapaport | Recombinant human thyroid peroxidase |
| JP3005292B2 (ja) * | 1990-08-02 | 2000-01-31 | カイロン コーポレイション | 単純ヘルペスウィルスのｖｐ１６のワクチン |
| GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| EP0668918A1 (en) * | 1991-08-28 | 1995-08-30 | Institute Diagnostics Nichols | Disease associated human autoantibodies specific for human thyroid peroxidase |
| NZ253137A (en) | 1992-06-25 | 1996-08-27 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine comprising antigen and/or antigenic composition, qs21 (quillaja saponaria molina extract) and 3 de-o-acylated monophosphoryl lipid a. |
| WO1999005161A1 (en) | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Ligand Pharmaceuticals Incorporated | HUMAN PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GAMMA (PPARη) GENE REGULATORY SEQUENCES AND USES THEREFOR |
| US6692752B1 (en) | 1999-09-08 | 2004-02-17 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Methods of treating human females susceptible to HSV infection |
| US20020090382A1 (en) * | 2000-08-01 | 2002-07-11 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Antiviral compounds and methods |
| JP4592284B2 (ja) | 2001-07-27 | 2010-12-01 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 髄膜炎菌付着因子 |
| JP2004099584A (ja) * | 2002-05-02 | 2004-04-02 | Keio Gijuku | Ｈｓｖを用いた抗腫瘍剤 |
| US8541002B2 (en) | 2003-09-12 | 2013-09-24 | Agenus Inc. | Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection |
| BRPI0518284A2 (pt) | 2004-11-24 | 2008-11-11 | Shell Int Research | aparelhos para separar substancialmente um fluxo em duas fases em um componente gasoso e um componente lÍquido, para separar substancialmente um fluxo de mistura em um componente lÍquido e pelo menos outro componente lÍquido e um componente gasoso e para separar substancialmente um fluxo de mistura em partes componentes com base nas densidades das partes componentes, sistema para separar substancialmente um fluxo de mistura em partes componentes, e, mÉtodos para separar substancialmente um fluxo tampço e para projetar um separador para separar substancialmente um fluxo tampço |
| US8865185B2 (en) | 2006-09-08 | 2014-10-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of use for HSV-1 and HSV-2 vaccines |
| CA2663109A1 (en) | 2006-09-08 | 2008-03-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hsv-1 and hsv-2 vaccines and methods of use thereof |
| US10478490B2 (en) | 2006-12-28 | 2019-11-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
| US9284355B2 (en) | 2006-12-28 | 2016-03-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
| GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
| EP3590533A1 (en) * | 2009-05-22 | 2020-01-08 | Genocea Biosciences, Inc. | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| PL2380558T5 (pl) | 2009-12-03 | 2020-10-05 | Novartis Ag | Wytwarzanie emulsji w układzie komory oddziaływań i komory przeciwciśnieniowej do mikrofluidyzacji |
| DE102009056884B4 (de) | 2009-12-03 | 2021-03-18 | Novartis Ag | Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben |
| DE102009056883B4 (de) | 2009-12-03 | 2012-08-16 | Novartis Ag | Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben |
| JP5820390B2 (ja) | 2009-12-03 | 2015-11-24 | ノバルティス アーゲー | エマルジョンの微小流動化中および／または均質化中における成分の循環 |
| MX2012005598A (es) | 2009-12-03 | 2012-05-29 | Novartis Ag | Filtracion hidrofilica durante la fabricacion de adyuvantes de vacuna. |
| DE102009056871A1 (de) | 2009-12-03 | 2011-06-22 | Novartis AG, 4056 | Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben |
| ES2453316T5 (es) | 2010-05-12 | 2017-07-18 | Novartis Ag | Procedimientos mejorados para preparar escualeno |
| EP2643014A4 (en) | 2010-11-24 | 2015-11-11 | Genocea Biosciences Inc | HERPES SIMPLEX TYPE 2 VIRUS VACCINES: COMPOSITIONS AND METHODS FOR STIMULATING AN IMMUNE RESPONSE |
| CA2885693C (en) | 2011-11-23 | 2020-07-28 | Genocea Biosciences, Inc. | Nucleic acid vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| CN107540730B (zh) | 2012-05-16 | 2021-07-16 | 免疫设计公司 | 用于hsv-2的疫苗 |
| CA2942166A1 (en) * | 2014-03-03 | 2015-09-11 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Recombinant herpes simplex virus 2 (hsv-2) vaccine vectors |
| ES2861806T3 (es) | 2014-12-02 | 2021-10-06 | Novartis Ag | Fabricación de composiciones que contienen tensioactivo |
| WO2018064232A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Genocea Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating herpes |
| JP2023532944A (ja) | 2020-06-30 | 2023-08-01 | セキラス ユーケー リミテッド | 水中油型エマルジョンアジュバントの低温濾過 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60155128A (ja) * | 1983-08-30 | 1985-08-15 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374127A (en) * | 1977-09-19 | 1983-02-15 | Merck & Co., Inc. | Herpes sub unit vaccine |
| FI66020C (fi) * | 1977-09-19 | 1984-08-10 | Merck & Co Inc | Foerfarande foer framstaellning av antigeniska immunogeniska subunits av hsv-1 och hsv-2 |
| DE2949031A1 (de) * | 1978-12-15 | 1980-07-17 | Sandoz Ag | Vakzine |
| FR2480780B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1985-12-06 | Pasteur Institut | Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| US4317811A (en) * | 1980-09-11 | 1982-03-02 | Merck & Co., Inc. | Herpes simplex type 1 subunit vaccine |
| NZ199866A (en) * | 1981-03-09 | 1984-11-09 | Cetus Corp | Vaccine for prevention of gastroenteric disease:non-pathogenic strain genetically engineered to comprise genes for adhesin and/or toxoids |
| GB2103622B (en) | 1981-06-16 | 1986-01-15 | Genentech Inc | Production of foot and mouth disease vaccine from microbially expressed antigens |
| ZW18282A1 (en) | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| US4442205A (en) * | 1981-09-22 | 1984-04-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Simian virus recombinant that directs the synthesis of hepatitis B surface antigen |
| US4593002A (en) * | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
| US4762708A (en) * | 1982-02-18 | 1988-08-09 | University Patents, Inc. | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
| US4818694A (en) * | 1982-07-20 | 1989-04-04 | American Cyanamid Company | Production of herpes simplex viral protein |
| AU1678783A (en) * | 1982-07-20 | 1984-01-26 | Molecular Genetics, Inc. | Production of herpes simplex viral proteins |
| PT77014B (en) * | 1982-07-20 | 1986-01-24 | Molecular Genetics Inc | Production of herpes simplex viral proteins |
| US4891315A (en) * | 1982-10-25 | 1990-01-02 | American Cyanamid Company | Production of herpes simplex viral porteins |
| DE3228501A1 (de) * | 1982-07-30 | 1984-02-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur herstellung eines herpes-antigens, dazu geeignetes mittel sowie verfahren zu seiner herstellung und die verwendung dieses antigens |
| DE3461928D1 (en) * | 1983-06-23 | 1987-02-12 | Person Stanley | Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein b of herpes virus types 1 and 2 |
| US4855224A (en) * | 1984-03-09 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned diagnostic product and method of use |
| US4618578A (en) * | 1984-07-17 | 1986-10-21 | Chiron Corporation | Expression of glycoprotein D of herpes simplex virus |
| DE3587991T2 (de) * | 1984-04-06 | 1995-07-20 | Chiron Corp | Rekombinanter herpes simplex gb-gd impfstoff. |
| US4859587A (en) * | 1984-06-04 | 1989-08-22 | Institut Merieux | Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods |
| JPS615786A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-11 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａ、形質転換動物細胞および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法 |
| DE3582200D1 (de) * | 1984-07-20 | 1991-04-25 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Rekombinante dns, enthaltend ein herpes-simplex-virus-gen oder ein fragment davon, hefe transformiert mit dieser rekombinanten dns und verfahren zur herstellung von herpes-simplex-virus-proteinen. |
-
1984
- 1984-08-22 NZ NZ209308A patent/NZ209308A/xx unknown
- 1984-08-27 AU AU32423/84A patent/AU579323B2/en not_active Expired
- 1984-08-27 IL IL72785A patent/IL72785A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-08-27 CA CA000461897A patent/CA1341181C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-28 GR GR80220A patent/GR80220B/el unknown
- 1984-08-29 EP EP84305909A patent/EP0139417B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-29 DK DK198404122A patent/DK172694B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-08-29 DE DE8484305909T patent/DE3479085D1/de not_active Expired
- 1984-08-29 IE IE221084A patent/IE58030B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-08-30 JP JP59183623A patent/JP2599350B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-30 ES ES535554A patent/ES8605039A1/es not_active Expired
-
1986
- 1986-02-28 ES ES552539A patent/ES8705036A1/es not_active Expired
-
1992
- 1992-12-10 HK HK987/92A patent/HK98792A/xx not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-12-15 US US08/357,084 patent/US5851533A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-30 JP JP7222311A patent/JPH08253428A/ja active Pending
-
1997
- 1997-01-24 DK DK009197A patent/DK9197A/da not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60155128A (ja) * | 1983-08-30 | 1985-08-15 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE842210L (en) | 1985-02-28 |
| DK412284D0 (da) | 1984-08-29 |
| IL72785A0 (en) | 1984-11-30 |
| GR80220B (en) | 1984-11-15 |
| EP0139417A1 (en) | 1985-05-02 |
| AU579323B2 (en) | 1988-11-24 |
| ES552539A0 (es) | 1987-05-01 |
| EP0139417B1 (en) | 1989-07-26 |
| JPS60155128A (ja) | 1985-08-15 |
| ES8705036A1 (es) | 1987-05-01 |
| IL72785A (en) | 1990-07-26 |
| EP0139417B2 (en) | 1999-03-17 |
| DK9197A (da) | 1997-01-24 |
| ES8605039A1 (es) | 1986-03-16 |
| DK172694B1 (da) | 1999-05-31 |
| CA1341181C (en) | 2001-02-20 |
| IE58030B1 (en) | 1993-06-16 |
| HK98792A (en) | 1992-12-18 |
| DE3479085D1 (en) | 1989-08-31 |
| US5851533A (en) | 1998-12-22 |
| DK412284A (da) | 1985-04-11 |
| AU3242384A (en) | 1985-03-07 |
| JP2599350B2 (ja) | 1997-04-09 |
| NZ209308A (en) | 1991-08-27 |
| ES535554A0 (es) | 1986-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2599350B2 (ja) | 膜結合性タンパク質を含有するワクチン類 | |
| US5294548A (en) | Recombianant Hepatitis a virus | |
| Cantin et al. | Expression of herpes simplex virus 1 glycoprotein B by a recombinant vaccinia virus and protection of mice against lethal herpes simplex virus 1 infection. | |
| KR100242671B1 (ko) | 유전학적으로 처리한 백신 균주 | |
| US5648079A (en) | Herpes simplex virus glycoprotein B vaccine | |
| Pensiero et al. | Expression of the Hantaan virus M genome segment by using a vaccinia virus recombinant | |
| JPH03503478A (ja) | 組換えｃｍｖ中和タンパク | |
| JP3005292B2 (ja) | 単純ヘルペスウィルスのｖｐ１６のワクチン | |
| US5612041A (en) | Recombinant herpes simplex gD vaccine | |
| JP2005333990A (ja) | ｇｐ３５０／２２０非スプライシング変異体 | |
| US7264817B1 (en) | Immunogenic composition based on a truncated derivative of a membrane bound protein and process for making it | |
| WO1990001546A1 (en) | Equine herpesvirus-1 vaccine | |
| JPH0658372B2 (ja) | 分子クローンされた診断用産物 | |
| US20120058136A1 (en) | NON-SPLICING VARIANTS OF gp350/220 | |
| EP0598759A1 (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus | |
| CA2047585A1 (en) | Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot and mouth disease virus epitope on the surface of virus-infected cells and on the surface of virus particles, and vaccine against foot and mouth disease containing the same | |
| Zamb et al. | Synthesis, cellular location, and immunogenicity of bovine herpesvirus 1 glycoproteins gI and gIII expressed by recombinant vaccinia virus. | |
| CA1341291C (en) | Vaccines based on membrane bound proteins and process for making them | |
| Van Drunen Littel-Van Den Hurk et al. | Synthesis, cellular location, and immunogenicity of bovine herpesvirus 1 glycoproteins gI and gIII expressed by recombinant vaccinia virus | |
| DK173597B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et membranfrit trunkat af et membranbundet polypeptid | |
| NZ259362A (en) | Varicella zoster virus immediate early protein 175 (vzv iep 175) and derivatives, its production and use |