JPH03503478A - 組換えｃｍｖ中和タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＣＭＶ中和タンパク 肢歪光丘 本発明は組換えヒト・サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）タンパクに関し、特に中 和ｇＢタンパクとその切形型との産生、そのワクチンポテンシャルならびにその 診断用ＤＮＡ断片に関する。

発浬Ｆη１量 ヒト・サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）は、ヒト集団に遍在する作用物質である 。感染は一般に無症候性であるが、免疫無防備状態の個体（移植組織の受容者お よびエイズの患者）ならびに先天的に感染した新生児には１重篤な、内科疾患の 症状が発現し得る。免疫不全の患者においては、　ＣＭＶの一次惑染および潜伏 ウィルスの再活性化が、網膜炎と肺炎を含む重篤な疾症を併発する。またＣＭＶ に感染すると、その患者は。

真菌および細菌に感染しやすくなる。胎児の先天的ＣＭＶ惑染は、米国で一年間 に出生する幼児の約１χ（３６，０００名）に発生している。これらの幼児の内 １０〜２０χは、出生時または出生後２年以内に、症候性の感染性にかかってお り、その死亡率は１０〜１５χである。生存者中の多くは、聴覚喪失、学習不全 および精神遅滞を含む軽度から重度の神経科の合併症にかかっている。

ＣＭＶ関連疾患を防止もしくは減少させるワクチンが必要なことは明らかである 。ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）株は、正常な個体および腎臓移植の患者のワクチンの 候補として試験されている〔キナン　　Ｊｒ、、Ｇ、Ｖ、ら（Ｑｕｉｎｎａｎ、 　　Ｊｒ、、Ｇ、Ｖ、ｅｔ　　ａｌ、）、　　Ａ＋＊　　Ｉｎｔｅｒｎ　　Ｍｅ ｄ。

１０１巻：４７８〜４８３頁、　１９８４年）　；　（Ｔｈｅ　Ｈｅｒｐｅｓ　 Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｖｏｌ、４＋ＲｏｉｚｍａｎとＬｏｐｅｚｍ集、　Ｐｌｅｎ ｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、２９７〜３１２頁、　１９８５年中のプロトキン ＋　Ｓ、Ａ、（Ｐｌｏｔｋｉｎ、Ｓ、Ａ、）　ＣＭＶ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）　＊ このワクチンは、有害な作用はないようであり、移植受容者のＣＭＶ疾患を軽減 したが、ウィルス感染に起因する免疫障害が起こる可能性があり、　ＣＭＶと腫 瘍形成が関連している可能性があるという報告から、実験的な生の弱毒化ウィル スワクチンを使用することには多くの欠点がある。

ＣＭＶの生物学は完全には理解されていないので、ワクチンを最も合理的に得る には、中和抗体を引出す組換えウィルス糖タンパクを用いて、ウィルスの表面糖 タンパクに基づいたサブユニットワクチンの開発を行う必要がある。

他のヘルペスウィルスと同様に、　ＣＭＶは多重糖タンパクを特定する（スティ ンスキ、Ｍ、（ＳｔｉｎｓｋｉＪ、）、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ＋　１９巻＝５９４− ６０９頁、　１９７６年；ペレイラ、Ｌ、、ら（Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｌ、ｅｔ　ａ ｌ、）＋　Ｉｎｆｅｅｔ　Ｉｓ＋ｓｕｎ＋　３６巻：　９３３−９４２頁、　１ ９８２年）、これらの特性を決定するには、ポリクローナル抗体およびモノクロ ーナル抗体を用いて、　ＣＭＶに惑染した細胞とＣＭＶの精製したピリオンの研 究を行うことが含まれる（ペレイラ、Ｌ、、ら（Ｐｅｒｅｉｒａ、　Ｌ。

ｅｔ　ａｌＬ　ＶｉｒｏｌｏｇＬ　１３９巻ニア３−８６頁、　１９８４年；ブ リット、−１Ｊ、（Ｂｒｉｔｔ、Ｗ、Ｊ、）＋：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＋　１３５巻 ：３６９−３７８頁、　１９８４年；ノ　ワックら（Ｎｏｗａｋ、Ｂ、ｅｔ　ａ ｌ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１３２巻＝３２５頁〜３３８頁、１９１９８４年； 　ロー、　Ｋ、Ｍ、ら（Ｌａｗ＋に、Ｍ、ｅｔ　ａｌ）、Ｊ　Ｍｅｄ　Ｖｉｒｏ ｌ、　１７巻：２５５−２６６頁、　１９８５年：ラスムラセン、Ｌ、ら（Ｒａ ｓｍｕｓｓｅｎ＋　Ｌ、ｅｔａｌ）、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ 　ＵＳＡ＋　８１巻：８７６〜８８０頁、　１９８４年；およびブリットとオー ジェ（Ｂｒｉｔｔ　ａｎｄ　Ａｕｇｅｒ）、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ、　５８巻＝１８５ 〜１９１頁、　１９８６年）。

ベレイラらの上記文献に記載された研究に基づいた。　１９８７年８月２５日付 けで発行された米国特許第４．６８９．２２５号には。

サイトメガロウィルスの糖タンパクＡ（ｇＡｌ−Ａ７）と命名したポリペプチド を用いる。　ＣＭＶ感染症に対する方法とワクチンが記載されている。　ｐ１３ ０（ｇｐ１３０）とｐ５５　（ｇｐ５５）と命名される２種の糖タンパク（キロ ダルトンで示す分子量に基づく）が　部分的に精製され９モルモットに中和応答 を引出すことが示されている（ラスムラセン、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ＋（ＲａＳａｌ ｕＳＳｅｎ、Ｌ、ｉｔ　ａｌ）、　ＪＶｉｒｏｌｏｇｙ、５５巻：　２７４〜２ ８０頁、　１９８５年）　、　ａｐ１３０８Ｉタンパクは。

ｇｐ５５糖タンパクの前駆体のようである。

ＣＭＶ株ＡＤ１６９由来のｇＢ遺伝子（ラスムラセンら、前出に記載されている ｐ１３０　ＣＭＶタンパクと類似のもののようである）は。

ヌクレオチド配列決定により同定され、（クレナージ、？１．Ｐ、ら（Ｃｒａｎ ａｇｅ、　Ｍ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ）、　ＥＭＢＯＪ、５（１１）巻、　３０５７− ３０６３頁、１９８６年）、そこから９０６のアミノ酸からなるタンパクが推定 されている。　ｇＢ遺伝子の産物は組換えワタシュアウィルス中で発現され、こ の遺伝子の産物で免疫化されたラビットは、　ＣＭＶに感染した細胞由来のｇＢ を免疫沈澱させ、インビトロでＣＭＶの伝染性を中和する抗体を産出した（第一 ０８７１０５３２６号参照）。

ウィルス中和の標的である主要な糖タンパクの同定と、サブユニッ）　ＣＭＶワ クチンの開発に対して多くの活動がなされているが、現在まで、　ｇｐ５５　Ｃ ＦＩＶｌｉタンパクの起源は確認されておらず、またｇｐ５５はヌクレオチド配 列もアミノ酸配列も同定されていないので、　５５．０００ダルトンの組換えウ ィルスｇＢタンパクもしくはその切形組換えポリペプチドからなるワクチンは全 く報告されていない。ＣＭＶの生物学が完全には理解されていないことからみて 、サイトメガロウィルスに惑染しないように保護することができる安全、有効、 かつ、経済的なワクチンを提供するとともに、　ＣＭＶ惑染に起因する特定の免 疫原性刺激を検出できる診断試薬を提供することが望ましいことは明らかである 。

発ユ少皿丞 本発明は、　ＣＭＶゲノムがコードするもので免疫学的に同定可能なエピトープ を含有する２ｇＢとその切形断片由来の５５，０００ダルトンのタンパクから誘 導される組換えポリペプチドを提供する。ｇｐ５５　ＣＭＶ糖タンパクｇＢ由来 の組換えポリペプチドは９本発明の実施様態として提供される。

ｇＢ由来のｇｐｓｓタンパクの特性を完全に特定すれば１診断試験における標準 もしくは試薬およびワクチンの成分として有用なポリペプチドを生産することが できる。所望のポリペプチドは、比較的純粋な形態で合成法によって、あるいは 組換えＤＮＡ法によって作製することができるので、免疫原とワクチンの他の製 造法に付随する問題点１例えば競合抗原および汚染物の共精製などが回避される 。

本発明の好ましい実施様態では、切形のｇｐ５５ｇＢの断片は。

ＣＭＶ中和抗体と免疫学的に反応性のあるエピトープをもっている。この中和抗 体は、ラスムラセンら、前出および米国特許第４　、６８９　、２２５号に開示 されているモノクローナル抗体について報告されているような当該技術分野での 公知の技術で生成され得る。

本発明の他の好ましい実施様態として、　ＣＭＶｌｉタンパクｇＢ内にコードさ れた組換えポリペプチドも提供され、このポリペプチドは、　ｇＢタンパクの開 裂を有効に阻害する修飾された内部タンパク加水分解開裂部位（ｅｎｄｏｐｒｏ ｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｃｌｅｖａｇｅ　ｓｉ　ｔｅ）をもっている。開裂部位の修 飾は、タンパク分解開裂部位もしくはその近傍で、ポリペプチドをコードするＤ ＮＡに部位特異的変異を誘発させて行われる。この組換えポリペプチドをコード するポリヌクレオチドは２本発明のこの局面に関連するものである。

本発明の他の局面は、　ＣＭＶ　ｇＢ遺伝子由来のヌクレオチド配列からなる組 換えｇｐ５５ポリヌクレオチドである。本発明のこの局面に関連するものとして 、　ｇｐｓｓの１３８１〜２０４０のヌクレオチドとｇｐｓｓの１３８１〜１９ ３８のヌクレオチドとを含有する領域をもっている切形の組換えポリヌクレオチ ドがあり、これらの領域は、　ＣＭＶ中和抗体と免疫学的の反応性のあるエピト ープを含有している。

本発明のもう一つの局面とて１本発明の組換えポリヌクレオチドを含有するベク ターで形質転換された宿主細胞でなる発現系が提供される。

本発明のもう一つの局面として、ヒト・サイトメガロウィルス感染に対抗するワ クチンもしくは予防剤が提供され、このワクチンは、側シｇＢゲノム由来の組換 えｇｐｓｓポリペプチドまたは内部タンパク分解開裂部位が修飾されたｇＢポリ ペプチドを、り病性個体に投与した際にサイトメガロウィルスに対するウィルス 中和活性を引出すのに有効な量で含有している。

本発明の更にもう一つの局面として、ヒト・サイトメガロウィルス感染に対抗す るワクチンを提供するものであり、このワクチンは、　ＣＭＶ［タンパクｇＢ内 にコードされた切形の断片由来の組換えポリペプチドを含有し、その切形の断片 はＣＭＶ中和抗体と免疫学的に反応性のあるエピトープを含有している。上記組 換えポリペプチドは、り病性個体に投与した際にサイトメガロウィルスに対する 中和活性を引出すのに有効な量で、免疫学的に許容される担体中に存在している 。

本発明の他の局面として、生物学的サンプル中のＣＭＶ相同配列を検出するＤＮ Ａハイブリダイゼーシジンアッセイを提供する。このアッセイは、ａ）生物学的 サンプルを、酵素、放射性タグもしくは螢光タグで任意に標識されたＤＮＡプロ ーブ（ｇｐ５５ヌクレオチド配列由来）とともに、　ＤＮＡ二本鎖の生成を促進 する条件下でインキュベートする工程；次いでｂ）生成した。　ＤＮＡプローブ を含有するＤＮＡ二本鎖を検出する工程を包含する方法である。

本発明の更にもう一つの態様として、生物学的被検物中の。

Ｃ？ｔＶ抗原に対する抗体を検出する免疫学的アッセイ法を提供するものである 。このアッセイは・ ａ）生物学的サンプルを、プローブポリペプチドとともに。

抗体−抗原複合体を生成する条件下でインキュベートする工程、ここで上記プロ ーブポリペプチドは、　９５５ＣＭν組換えタンパクもしくはその切形の断片か らなり、この組換えタンパクもしくは切形断片は、　ＣＭＶ中和抗体と免疫学的 に反応性のあるエピトープを含有している；および ｂ）上記プローブ抗原を含有する抗体−抗原複合体を検出する工程；を包含する 。

本発明の更にもう一つの実施態様として、免疫予防に用いる９組換えｇｐｓｓも しくはその切形ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を提供する。

本発明の更に他の実施態様として、以下の説明および請求の範囲から明らかにな るので、同じ、もしくは同等の原理を利用する本発明の他の実施態様は９本発明 と添付の請求の範囲とから逸脱することなく、当業者によって利用され得る。

図面の簡単な説明 第１図は、！ｌｔの配向で表示したＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）ゲノムのＨｉｎｄＩ ［制限地図である。単一配列は細線で示し、逆方向反復配列の長い成分（Ｌ）と 短い成分（Ｓ）は、ボックス印、ａｂ”ｂ’ａ’および鉱ζ−印で示しである。

白抜きボックス印で示した工配列は、　Ｌ／Ｓ連結部における逆方向のコピー（ 絋）による末端の直接反復配列である。

第１図の下方の制限地図は、　ｇＢ遺伝子をコードする。約４゜９６ｋｂのＢａ ｍＨＩ　Ｅ／Ｒ−Ｈｉｎｄ　ｍ　Ｄ／Ａ断片を示す、　ｐＸｇＢｌにクローン化 されたＴｏｅｖｎｅ　ＤＮＡ断片は線の上に示し、大部分が共直線性のＡＤ１６ ９断片は線の下に示した。制限酵素の略字は次のとおりである。すなわちＢはＢ ａｍＨＩ；　ＢｇはＢｇｌｌＩ；ＣはＣ１ａＩ；　ＥはＥｃｏＲＩ；　ＥｇはＥ ａｇＩ；　Ｈは旧ｎｄ［［；Ｅｔｃは旧ｎｃＩ［：にはＫｐｎＩ；　ＰはＰｓｔ ｌ；　Ｓは５ａｃＩ［ＨＳａは５ａｉｌ；　ＸはＸｈｏＩである。

第２図は、　ＣＭＶ株ＴｏｗｎｅおよびＡＤ１６９のｇＢエンベロープタンパク に対するヌクレオチドと推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸４６０と４６１との 間のｇｐ５５開裂部位は矢印で示しである。ｇｐｓｓのＮ末端配列を分析するこ とによって、この開裂部位が明らかになった。この分析結果は、第２表に示しで ある。

第３図は１本発明の哺乳類細胞の発現ベクターを表す図である。プラスミドｇＸ ｇＢ？（４，５ｋｂ）とｐＸｇＢ８　（６，５ｋｂ）は２部分的５ａｃＩＩ／Ｘ ｈｏｌ断片としテ、　ｐＳＶ７ｄ、　ＳＶ４０ヘース（７）発現ベクターもしく はｐＯＮ２６０．　ＣＭＶ−ベースの発現ベクターにそれぞれクローン化された ｇＢの切形型をコードしている。プラスミドｐＸｇＢ１２（６，４ｋｂ）とｐＸ ｇＢｌ３（５，５ｋｂ）は、　Ｅａｇｌ断片として、プラスミドｐｌ’ｌｌＥ、 　ＣＭＶベースの発現ベクター、およびｐｓＶ７ｄｓそれぞれにクローン化され た全長のｇＢ遺伝子をコードする。転写の開始と終止の要素は各構造中で異なる 。

第４図は、　ＣＭＶｇＢ上のエピトープの地形地図の概略図である。不連続の中 和ドメイン（ドメイン１＝アミノ酸４６１〜６１９；ドメイン２ａと２ｂ−アミ ノ酸６２０〜６８０）は楕円形で示されている。

日を　　　るための７ ■、定義 本願で用いる場合、所定の配列“由来の”ポリヌクレオチド、例えばＣＭＶ　ｇ Ｂ遺伝子からのＤＮＡは、所定のヌクレオチド配列の領域に対応する。すなわち この領域に同一もしくは相補的な、少なくとも６〜２０のヌクレオチド、更に好 ましくは少なくとも１５〜２０のヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド 配列を意味する。その核酸配列に対する一致度は、約７０％以上であり、好まし くは少なくとも８０χで、更に好ましくは少なくとも９０χである。

他の配列に対する誘導された配列の一致度もしくは不一致度は、液相中もしくは 固体支持体上での標準ＤＮＡハイブリダイゼーシゴン法を用いて、適切な緊縮条 件下でハイブリダイズさせることによって決定され得る。核酸配列の相補性を決 定するハイブリダイゼーション法は、当該技術分野で公知であり〔例えばマニア ティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）の文献（１９８２年）参照〕、後 述する。さらに、ハイブリダイゼーションで形成される二本鎖ポリヌクレオチド の不対合は公知の方法で決定され得る。この方法としては、二本鎖ポリヌクレオ チド内の一本鎖領域を特異的に消化するＳｌのようなヌクレアーゼによる消化が ある。代表的なりＮＡ配列が、それから“誘導′。

され得る領域は、限定はないが、特異的なエピトープをコードする領域を包含す る。

誘導されたポリヌクレオチドは、示されているヌクレオチド配列から、必ずしも 物理的に誘導されるものではなく２例えば、化学的合成、　ＤＮＡ複製法もしく は逆転写法のような方法で生成されてもよく、これらの方法は、ポリヌクレオチ ドがそこから誘導される領域中の塩基の配列によって提供される情報に基づいて いる。

同様に、所定の配列“由来の”ポリペプチド、例えば切形のＣＭＶ　ｇＢ［タン パクは、その配列にコードされているポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有す るポリペプチドまたはそのタンパクを意味し、その部分は少なくとも５〜１０の アミノ酸、更に好ましくは少なくとも１０〜１５のアミノ酸からなり。

またはその配列中にコードされているポリペプチドで免疫学的に同定可能である 。

ＣＭＶの診断剤および／またはサブユニットワクチンを生産するのに有用なポリ ヌクレオチドの特性決定に本願で用いられる“組換えポリヌクレオチド”という 用語は、ゲノム起源。

ｃＤＮＡ起源、半合成物の起源もしくは合成物の起源のポリヌクレオチドを意味 し、この組換えポリヌクレオチドは、その起源もしくはその操作によって、（１ ）天然もしくはライブラリーの形態で連結されているポリヌクレオチドのすべて もしくはいるポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されている。

単細胞体として培養される原核微生物もしくは真核細胞系を示す組換え宿主細胞 ＩＺ１１宿主細胞”、“°細胞′°、“細胞系°゛、“細胞培養物°”などの用 語は、交換可能に使用され。

組換えベクターもしくは他の転移ＤＮＡに対する受容体として用いられることが できるかまたは用いられている細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞 の子孫を含む。単一の親細胞の子孫が、偶然もしくは故意の変異によって２元の 親と、形態、ゲノムもしくは全ＤＮＡの補体が、必ずしも完全に同一でないこと が理解されている。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在すると いうような関連する性質で特性決定がなされる。親に充分類似している親細胞の 子孫は、この定義が意味する子孫に含まれ、上記の用語に包含される。

゛レプリコン”は９例えばプラスミド、染色体、ウィルスのような遺伝子の要素 であり、細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律性単位として挙動し、すなわち それ自身の制御下で複製することができる。

“°ベクター”は、他のポリヌクレオチドセグメントが連結しているレプリコン であり、連結されたセグメントが複製および／または発現するように連結されて いる。

゛制御配列（コントロール配列）”は、これが連結されているコード配列の発現 を行うのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の性質 は宿主生物によって異なり、原核生物では、このような制御配列として一般に。

プロモーター、リポソーム結合部位およびターミネータ−が含まれ、真核生物で は一般に、このような制御配列として。

プロモーター、ターミネータ−およびいくつかの例ではエンハンセーが含まれて いる。′制御配列”という用語は、最低でも、その存在が発現に必要であるすべ ての要素を含むことを意味し、またその存在が発現に有利な付加要素２例えばリ ーダー配列を含み得る。

“作動可能に連結されている”という用語は、記載されている要素が、その意図 された方法で機能できる関係にある近位を意味する。コード配列に“作動可能に 連結されている”制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が 達成されるように連結されている。

“〜で／として免疫学的に同定可能な”という用語は、非天然の、すなわち人工 的に合成されたタンパクまたは組換えのタンパク中にエピトープが存在すること を意味し、またこのエピトープは、指定されたＣＭＶポリペプチド内に存在し。

このポリペプチドに対して特異的なものである。免疫学的同一性は、抗体の結合 性および／または結合における競合によって決定され得る。これらの方法は、平 均的な当業者にとっては公知であり、後述する。エピトープの特異性は３例えば 。

Ｇｅｎｂａｎｋのような、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列の公知 のデータバンクをコンピュータで調査することおよび、他の公知のタンパクとの アミノ酸配列の比較によって決定され得る。

本願で用いる“エピトープという用語は、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、 １つのエピトープは、これに特有の立体配置内に３個のアミノ酸を含むことが可 能で、一般にエピトープは少なくとも５個のこのようなアミノ酸で構成され。

更に一般的には少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸で構成されている。

ポリペプチドは、その中に含まれている特異的なエピトープが抗体を認識するこ とによって抗体と結合する場合は、その抗体と“′免疫学的に反応性”である、 免疫学的反応性は。

抗体結合によって決定され得るが、特に、抗体結合の速度論。

および／または抗体が対応するエピトープを含有する公知のポリペプチドを競合 体として用いる。結合反応の競合によって決定され得る。ポリペプチドが抗体と 免疫学的に反応性があるか否かを決定する方法は当該技術分野で公知である。

“ポリペプチド”という用語は、ゲノム内にコードされている配列のアミノ酸産 物を意味し、特定の長さの産物を意味しない。したがって、ペプチド類、オリゴ ペプチド類およびタンパクはポリペプチドの定義内に含まれる。またこの用語は 、ポリペプチドの発現後の修飾物１例えば、グリコジル化物、アセチル化物、リ ン酸化物などを意味しない。

本願で用いる°゛形質転換”という用語は、挿ノ、に用いる方法２例えば直接捕 捉法、形質導入法またはｆ−交配法にかかわらず、宿主細胞に外因性ポリヌクレ オチドを挿入することを意味する。外因性ポリヌクレオチドは１例えば９組み込 まれていないベクター例えば、プラスミドとして保管するか。

あるいは、宿主ゲノムに組み込んでもよい。

本願で用いる“治療”という用語は、予防および／または治療法を意味する。

本願で用いる“個体”という用語は、を椎動物、特に哺乳類の種のメンバーを意 味し、家畜にかぎらず、競技用動物。

霊長類、およびヒトが含まれる。

所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、融合形もしくは成熟形にかかわらず 、および分泌を可能にするシグナル配列をもっているか否かにかかわらず、好都 合な宿主に対して適切な発現ベクターに連結され得る。真核宿主系と原核宿主系 の両者は、現在２組換えポリペプチド類を作製するのに使用されており、より一 般的な制御系と宿主細胞系のい（つかを要約して、後記のＩＩｔＡ項で説明する 。次いでポリペプチドは。

溶解された細胞もしくは培地から単離され、その目的とする用途に必要な程度ま で精製される。精製は、当該技術分野で公知の方法２例えば、塩分画法、イオン 交換樹脂によるクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフイー、遠心分 離などによって実施され得る。（例えば、タンパクの各種精製法の酵素学的方法 参照）、このようなポリペプチドは９診断剤として使用され得、または抗体の中 和を起こすポリペプチドはワクチンに製剤され得る。これらのポリペプチドに対 する抗体も９診断剤として、または受動免疫療法に使用され［臨肌 本発明の主題である糖タンパクである糖タンパクＢ遺伝子によってコードされる ５５，０００ダルトンの糖タンパクが、　ＣＭＶに対する中和抗体を誘発するこ とが判明している（ラスム・ンセンら、前出、　１９８５年）。特に０本発明の ポリペプチドは。

ＣＭＶ　ｇＢエンベロープタンパクｇｐ１３０とこれから誘導されるｇｐｓｓの ある部分に相同のウィルスゲノムのタンパクに相当する。

ＣＭＶ株ＴｏｗｎｅとＡＤ１６９のｇＢエンベロープタンパクに対するヌクレオ チドと推定アミノ酸配列を示す第２図によれば９本発明のｇｐｓｓ組換えタンパ クは、残基４６１の位置にあるセリン（Ｓｅｒ４ｉ＋）を有するそのアミノ末端 で始まり、バリン残基９０１（Ｖａｌｗｏｔ）で終結する４４７個のアミノ酸の タンパクである。特に重要な、このタンパクの切形のものは、　ＣＭＶ中和抗体 と免疫学的に反応性のあるエピトープを含有するｇｐｓｓの領域に実質的に相同 のアミノ酸配列を有する。一般に、　ＣＭＶエンベロープタンパクのこの領域は 、残基４６１〜約残基６８０内に存在する。特に、不連続な中和ドメインが局在 していた。すなわちドメイン１が、アミノ酸４６１〜６１９にわたって存在し、 ドメイン２ａと２ｂはアミノ酸６２０〜６８０にわたって存在する。

これらの中和エピトープを含有するｇＢの領域を決定するために、　Ｔｏｎｎｅ 　ｇＢの遺伝子のヌクレオチド配列を最初に決定した。Ｔｏｗｎｅ株は、ワクチ ンとして安全なことが証明されているので選択した。ＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）の 類似のＨｉｎｄＩＩＩＤ断片の制限地図を得た。Ｈｉｎｄｌ［［Ｄの右端から始 まる。　４．９６ｋｂの旧ｎｄｌ［［〜Ｂａｌ１旧断片は、　ｇＢをコードする ようであるが（第１図参照）、これをサブクローン化した。第１図において、　 Ｔｏｗｎｅ株の制限地図をＡＤ１６９株の同じ領域と比較している。ｇＢｅｌ域 のヌクレオチド配列を、５゛側の最も遠位のＰｓｔ１部位から３゛側の旧ｎｃ１ １部位までを、　ｇＢコード配列に決定した（第１図）。第２図において、　ｇ Ｂ（Ｔｏｗｎｅ）の配列を上段に示し、比較のために、　ＣＭＶ（ＡＤ１６９） ｇＨの領域のＤＮＡ配列を下段に示す。

Ｔｏｗｎｅ　ｇＢ遺伝子は、　２７２１塩基対の開放読取り枠でコードされてい る。２つの他の長い開放読取り枠（ＯＲＦ）も、第２図に示すＴｏｗｎｅ配列に 存在している。第２のＯＲＦは、　ｇＢ遺伝子に対して読取り枠の外側にあり、 　ＢｉｎｄＩ［ｌＤ／Ａ部位（図示せず）からｇＢ遺伝子の５′側の未翻訳領域 を通って延長し、ヌクレオチド＋３６で終結する。第３のＯＲＦもｇＢ遺伝子に 対して枠の外側にあり、ヌクレオチド＋２８６４で開始し、第２図に示す配列の 末端にまで延長している。

２７２１ｂｐのＯＲＦから予測されるｇＢタンパクの大きさは、９０７アミノ酸 長であり９膜タンパクの特徴をもっている。潜在２４アミノ酸のシグナル配列を 第２図に示す（Ｍｅｔ、〜５ｅｒｚ４）。このシグナルドメインは、荷電残基（ Ａｒｇｎ）が先行する疎水性コア（Ａｓｎ＋３を除いたＩＩｅ５””Ｖａｌｚ３ ）を含有する。

ｇＢ遺伝子の全長と切形型を、＠乳類細胞中で発現するのに適切なプラスミドに クローン化した。これらのプラスミドの構築は、後述の実施例で詳細に述べる。

ｇＢ遺伝子の切形のものは、Ｃ末端における６８１〜９０７と６４７〜９０７の アミノ酸を削除して、膜内外とＣ末端領域を除去することによって構築した。

全長構築物と切形構築物によってコードされる。　ｇＢ遺伝子の発現を２発現の プローブとして、ウィルス中和性のネズミモノクローナル抗体１５０８　（ラス ムラセンら、前出１９８５年）を用いてＣＯ５−７細胞中に一時的に発現される ことによって分析した。この抗体は、　５５ｋｄのピリオン糖タンパク（ｇｐ５ ５）と、類縁の１３０ｋｄ　（ｇｐ１３０）の細胞内前駆体とに対して誘導され た抗体である。抗体１５Ｄ８は、補体の存在下で広範囲の臨床上の菌株と実験菌 株を中和し得るので、このｇＢエピトープが、ウィルス中和抗体に対する重要な 標的になる。

また切形のｇａタンパクの発現を米国特許第４．６８９，２２５号に記載のモノ クローナル抗体のパネルを使用して分析した。これらの抗体のうち、補体依存性 と補体非依存性の中和活性を有する１０個が、６１９のアミノ末端残基をもって いるが分子の膜内外と細胞内領域を欠いている。　ｇＢの切形誘導体（ｇＢ　ｔ ）と反応した。１２個の抗体が、６８０アミノＣ末端を削除されたｇＢ誘導体を 発現するＣＨＯ細胞系（ＣＨＯ細胞系６７）と反応した。

その上に５本願では、変異誘発された内部タンパク分解開裂部位をもったｇＢポ リペプチドが提供される。カルシウムに特異的なイオノフオアＡ２３１８７を安 定なＣＨＯ細胞系内に発現されたｇＢ分子（６７、７７）の開裂を阻害するため に用いて得た結果は。

すなわち膜内外と推定細胞質ドメインを欠いた１１０キロダルトンの熱開裂ｇＢ タンパクを発現する可能性を示している。その後のプロセッシングのないｇＢ分 子を発現する性能によって。

他の汚染産物もしくは望ましくないｇＢ産物のない所望のタンパクを産出するこ とができる。

タンパク分解開裂部位もしくはその近傍のアミノ酸配列を従来の方法で変化させ るように設計された。変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、アミノ酸Ａｒｇｉ ６゜の後の開裂点に対して−１，−２および−４の位置のアルギニンもしくはリ ジンを２例えばトレオニンもしくはグルタミン残基で置換した。

これらの内部のタンパク分解開裂部位変異体は、＠乳類細胞の発現ベクター内で 発現する際に、耐タンパク分解性を試験され、放射能で標識を付けた細胞溶解物 と、これらの構築物を受は取る細胞の条件付きの培地を、中和性モノクローナル 抗体で放射性免疫沈澱させてｇＢの発現を分析された。

Ｉｌ、Ｂ、　　　ポリペプチドの量　りと工担碧」Ｊｌｌ合金ポリペプチド抗原 領域は、一般に比較的小さく１通常８〜１０個以下のアミノ酸の長さである。５ 個程度のアミノ酸の断片が抗原領域の特徴を決定し得る。　ＣＭＶ　ｇＢポリペ プチドの短いセグメントをコードするＤＮＡは１組換えによって、融合タンパク もしくは単離されたポリペプチドとして発現され得る。更に、短いアミノ酸配列 を、化学合成法で簡便に得ることができる０合成されたポリペプチドが、正しい エピトープを与えるように正しく形成されているが、小さすぎて抗原性になるこ とができない場合には、そのポリペプチドを適切な担体に連結してもよい。

このような連結物を得る多数の方法には、当該技術分野で公知であり１例えば、 米国、イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手し たＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ ）と、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド、メチル）シクロヘキサン−１− カルボキシレート（ＳＭＣＣ）とを用いて、ジスルフィド結合を形成させる方法 がある。　（ペプチドがスルフヒドリル基を欠いている場合、この基はシスティ ン残基を付加することによって供給され得る）。

これらの試薬は、それら自身と１つのタンパク上のペプチドシスティンの残基と の間のジスルフィド結合、およびリジンのε−アミノ基もしくは他の化合物の他 の遊離アミノ基によるアミノ結合を生成する。各種のこのようなジスルフイルド ／アミド形成試薬は公知である（例えばｌｍ５ｕｎ　Ｒｅｖ、　６２巻＝１８５ Ｌ　１９８２年参照）。ぽかの二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合で はなくてチオエーテル結合を形成する。多数のこれらのチオ−エーテル形成試薬 は、市販されており。

６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレ イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステル４］含む 。ぞのカルボキシル基は、スクシンイミド、または１−ヒドロキシル−２−ニト ロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と結合させることによって、活性化し得る。上 記のリストは、網羅されたものではなく確定した化合物を修飾したものも使用し 得ることは明らかである。

宿主に対して有害な抗体の産出をそれ自体誘発しないものなら、いかなる担体で も使用され得る。適切な単体は、タンパクのような一般に大きな徐々に代謝され る高分子物ニラテックスで官能基化されたセファロース、アガロース、セルロー ス、セルロースビーズなどのような多Ｗ！類；ポリグルタミン酸、ポリリジンな どのような高分子アミノ酸ニアミノ酸共重合体；および不活性ウィルス粒子であ る。特に有用なタンパク基質は、血清アルブミン、キーホール・リンペット・ヘ モシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オバルブミン、破傷風トキ ソイド、および当業者にとっては公知の他の夕１ンパクである。

Ｉｆ　、Ｃ，ＣＭＶＩ　Ｉ？　）−ブ上倉Ｊ’　　６／％イア”ｌ−”　１　　 　　　　ノ璽製 また、　ＣＭＶのエピトープの免疫原性は、Ｂ型肝炎表面抗原と結合するような 粒子形成性タンパクと融合される哺乳類系もしくは酵母系中で、該エピトープを 調製することによっても強化され得る。ＣＭνエビトーブが２粒子形成性タンパ クコード配列に直接連結されている構築物は、　ＣＭＶエピトープに対して免疫 原性のハイブリッドを産生ずる。その上、調製されるべ々ターはすべて、　ＨＢ Ｖに特異的なエピトープを有し２例えばプレーＳペプチドのような種々の度合い の免疫原性をもっている。したがって、　ｃ１１ｖ配列を有する粒子形成性タン パクから構築された粒子は、　Ｃ？ｌＶと）ＩＢＶに対して抗原性である。

肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、ニス・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）（バレンズエラら（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、ｅｔ　ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ＋ ２９８巻；３４４頁。

１９８２年）、および１例えば哺乳類細胞中（バレンズエラ、Ｐ、ら（（Ｖａｌ ｅｎｚｕｅｌａ＋Ｐ、ｅｔ　ａｌ、）、１９８４年）および、Ｂ型肝炎（ミルマ ン。

１．（ＭＨＩ＋ｍａｎ、１．）［集＋Ｐｌｅｎｕｃｍ　Ｐｒｅｓｓ社、　２２５ 〜２３６頁）において形成され２粒子に組み立てられることが示されている。こ のような粒子の形成によって、モノマーのサブユニットの免疫原性を強化するこ とが示されている。またこの構築物は、　ＦＩＢＳＡｇの免疫優性エピトープを 含有し得、このエピトープは、５５アミノ酸の前表面〔ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ（ ｐｒｅ−Ｓ）　）領域を含有する。

にューラスら（Ｎｅｕｒａｔｈ、ｅｔ　ａｌ、、１９８４年）。酵母中で発現可 能なｐｒｅ−５−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は、ヨーロッパ特許出願公開第１７４ ，４４４号に開示され、酵母発現のための非相同ウィルス配列を含むハイブリッ ドは、ヨーロッパ特許出願公開第１７５゜２６１号に開示されている。上記の両 出願はともに本願の権利譲受人に譲渡されており、参照のため本願に引用されて いる。

これらの構築物は、ＳＶ４０ジヒドロ葉酸レダクターゼベクターを用いて、チャ イニーズハムスター卵巣（Ｃ１（０）細胞のような哺乳類細胞において発現し得 る。（ミッチェルら（Ｍｉｃｈｅｌｌｅｅｔ　ａｌ、）、Ｉｎｔ　５ｙｓｐｏｓ ｉｕ＊　ｏｎ　Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、１９８４年）。

（以下余白） ｎ、　Ｄ、ワクチンの調製 ワクチンは７ｇＢＯ組換えポリヌクレオチド配列内にコードされている１種以上 の免疫原生ポリペプチドから調製し得る。

さらに、１１０キロダルトンの非開裂のＣ末端の切形ｇＢタンパクからなる予防 剤は、　ＣＭＶの伝染性と病原性に対するプロ七ツシングの効果を評価するのに も有用である。いくつかの他のウィルスについて証明されているように（インフ ルエンザウィルスと旧Ｖ　ｇｐ１６０の赤血球凝集素）、前駆体ポリペプチドの 内部タンパク分解開裂は、ウィルスペプチドの成熟。

すなわち、ライスルの複製と伝染性に必須のステップである。

本発明の内部タンパク分解開裂部位変異体は、多重処理形のｇＨの産生をなくす のに加えて、活発な感染を導入するという危険を伴うことなく、被検体にウィル ス中和応答を発生させることができると考えられる。

活性成分として免疫原生ポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当業者にと って公知のことである。一般に、このようなワクチンは、液体の水溶液もしくは 懸濁液として注射剤に調製され；注射する前の液体の水溶液もしくは懸濁液用に 適切な固形形も調製し得る。またこの調製剤は乳化され得るか、もしくはリポソ ーム中にカプセル化されたタンパクであってもよい。活性な免疫原生成分は、医 薬的に許容され。

活性成分と適合する賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤としては１例え ば水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、およびそれ らの混合物がある。

さらに、所望により、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤。

ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの有効性を強化するアジュバントのような 補助物質を少量含有してもよい。有効なアジュバントの例としては、限定はない が９次のよ゛うなものがある。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル− Ｌ−）レオニル−ローイソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）　、　Ｎ−アセチル− ツルームラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ　１１６３７．　 ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれている）、Ｎ−アセチルムラミル−し−アラニル−Ｄ− イソグルタミニルーし一アラニンー２−（１′−２′−ジパルミトイル−５ｎ− グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ　１９８ ３５Ａ、　ＭＴＰ−ＰＨと呼ばれている）、およびＲＩＢＩである。このＲＩＢ Ｉは、細菌から抽出された３種の成分、モノホスホリル・リビッドＡ、　　）レ バロースシミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％のス クアレン／ツイーン８０乳濁液中に含有している。アジュバントの効力は１種々 のアジュバントからなるワクチンにこのポリペプチドを投与した結果。

ＣＭＶ抗原配列を含有する免疫原生ポリペプチドに対して生成した抗体の量を測 定することによって決定され得る。

このワクチンは９例えば皮下もしくは筋肉内に注射することによって簡便に非経 口投与される。他の投与法に適切な別の剤型には、串刺があり、ある場合には経 口剤がある。串刺用の伝統的な結合剤と担体としては７例えばポリアルカリグリ コールもしくはトリグリセリドがあり、このような串刺は。

０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物か ら形成し得る。経口剤は１例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース 、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、 炭酸マグネシウムなどのような通常用いられている賦形剤を含有する。これらの 組成物は、水溶液、懸濁液１錠剤、火剤、カプセル、持続放出性製剤または粉剤 の形態であり、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する 。

本発明のタンパクは、中性形もしくは塩の形でワクチンに処方され得る。医薬的 に許容される塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）が あるが９例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸。

酒石酸、マレイン酸などのような有機酸によって形成される。遊離のカルボキシ ル基によって形成される塩は９例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸 化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄のような無機塩基、お よびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒ スチジン、プロ力インなどのような有機塩基からも誘導され得る。

ｎ、　Ｅ、ワクチンの投与量と投与法 ワクチンは、投与剤形に適合した方法で、かつ予防上および／または治療上有効 な量で投与される。投与量は、一般に。

１回の投与当り抗原が５μｇ〜２５０μｇの範囲であるが、治療される被検者、 抗体を合成する被検者の免疫系の能力および所望の防御の程度によって決定され る。投与する必要がある活性成分の正確な量は、医師の判断によって決まり、各 被検体に固有のものであり得る。

ワクチンは、単一投与スケジュールで与えてもよいが、多重投与スケジュールで 与える方が好ましい。多重投与スケジュールは、予防接種の最初のコースでは、 １〜１０回の別個の投与がなされ、これに続いて、別の投与を、免疫反応を維持 および／または再強化するにに必要な時間間隔９例えば、第２回の投与まで１〜 ４ケ月間の間隔で行い、必要ならば数ケ月後に次の投与を行う。

ｎ、　　Ｆ、　ＣＩＡＶエピトープに対する抗体の調製上記のようにして調製さ れた免疫原生ポリペプチドは、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を生成 するのに使用され得る。ポリクローナル抗体が所望の場合は１選択された哺乳類 （例えばマウス、ラビット、ヤギ、モルモット、ウマなど）を、　ＣＭＶエピト ープを有する免疫原生ポリペプチドで免疫化する。免疫化された動物の血清を集 め、公知の方法で処理する。ＣＭ％’エピトープに対するポリクローナル抗体を 含有する血清が、他の抗原に対する抗体を含有している場合。

ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。

ポリクローナル抗血清を生成・プロセッシングする方法は、当該技術分野で公知 である（例えば、メイヤーとウォーカー（ＭａｙｅｒとＷａｌｋｅｒ）編集、　 ”ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１９８７年、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ ｓｓ、英国、ロンドン参照）。

ＣＭＶエピトープに対するモノクローナル抗体も当業者によって容易に製造され 得る。モノクローナル抗体をハイブリドーマで製造する一般的な方法は公知であ る。永久増殖化抗体産生細胞系は、細胞融合法、およびＢ　０７８球を腫瘍ＤＮ Ａで直接形質転換する方法、またはエプスタイン・バールウィルスによるトラン スフェクション法のような他の方法で作製され得る（例えば、ラスムラセンら、 前出１９８５年；Ｍ、シュレイヤー、ら（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ、　ｅｔ　ａｌ）、 　１９８０年Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　；ハマーリングら（ Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ）、　１９８１年、　１ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ；ケネッ トら（Ｋｅｎｎｅｔｔｅｔ　ａｌ）、　１９８０年、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；　　米国特許第４，３４１、７６１号、第４．３９９． １２１号、第４．４２７．７８３号、第４．４４４．８８７号、第４．４５２． ５７０号、第４．４６６、９１７号、第４．４７２．５００号、第４、４９１． ６３２号、および第４．４９３．８９０号参照’）　、　ＣＭＶ　、ｌＴ−ピト ープに対して産生されるモノクローンナル抗体のパネルは１種々の特性、すなわ ちイソタイプ、エピトープ親和性などについてスクリーニングされ得る。

ＣＭＶエピトープに対するモノクローナルとポリクローナルの両方の抗体は９診 断に特に有用であり、中和性の抗体は受動免疫療法に有用である。モノクローナ ル抗体は、特に、抗イデイオタイプ抗体を生成させるのに用いられ得る。

抗イデイオタイプ抗体は、防御が所望される感染因子の抗原の”内部イメージ（ ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｉｍａｇｅ）”をもっている免疫グロブリンである。抗イデ イオタイプ抗体を生成させる方法は当該技術分野で公知である。　（例えば、グ リッチら（Ｇｒｚｙｃｈｅｔ　ａｌ、）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６巻、７４頁、 　１９８５年；マクナマラら（Ｍａｃｎａｍａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２２６巻、　１３２５頁、　１９８４年参照）。

ＣＭＶ中和エピトープを含有する９本願に記載の切形ＣＭＶ組換えペプチドは、 抗イデイオタイプ抗体を発生し得るモノクローナル抗体を生成させるのに用いら れるであろう。これらの抗イデイオタイプ抗体も、　ＣＭＶの治療と、　ＣＭＶ 抗原の免疫原生領域の解明に有用である。

Ｉｌ、　Ｇ、診断用オリゴヌクレオチドプローブと診断用キット開示されたＣＭ Ｖ　ＤＮＡを主原料として用い、切除法もしくは合成法で、約８個以上のヌクレ オチドからなるオリゴマーを調製し得るが、このオリゴマーはＣＭＶ　ｇＢ遺伝 子とノ＼イブリダイズするので、ハイブリダイゼーションによって特有のウィル ス配列を検出するのに有用である。６〜８のヌクレオチドは、加工可能な長さで あるが、１０〜１２のヌクレオチドの配列が好ましく、約２０のヌクレオチドが 最適のようである。好ましくは、これらの配列は、不均一性を欠いている領域か ら得る。これらのプローブは、自動オリゴヌクレオチド合成法を含む２通常の方 法を用いて調製され得る。プローブとして用いるためには、完全な相補性が所望 されるが、断片の長さが増大する場合には不必要である。

このようなプローブを診断剤として用いるために、血液もしくは血清のような分 析されるべき生物学的サンプルは、所望により、処理されて、その中に含有され ている核酸が抽出される。サンプルから得られる核酸はゲル電気泳動法もしくは 他のサイズ分離法に付され得る。あるいは、この核酸サンプルは、大きさの分離 を行わずにドツトプロットされ得る。

次いでプローブに標識をつける。適切な標識およびプローブに標識をつける方法 は、当該技術分野では公知であり１例えば、ニックトランスレーションもしくは キナーゼ処理によって組込んだ放射能標識、ビオチン、蛍光プローブおよび化学 発光プローブがある。サンプルから抽出された核酸を２次に適切な緊縮ハイブリ ダイゼーション条件下で標識をつけたプローブで処理する。

プローブは、　ＣＭＶ　ｇＢ遺伝子に対して完全に相補的にされ得る。それ故に 、偽陽性をさけるために２通常、高い緊縮条件が望ましい。しかし高緊縮条件は 、プローブが、不均一性を欠いているウィルス遺伝子の領域に対して相補的であ る場合にのみ使用すべきである。ハイブリダイゼーションの緊縮度は、ハイブリ ダイゼーション中と洗浄工程中の多くの要因によって決定され、その要因として は温度、イオン強度９時間の長さ、およびホルムアミドの濃度が挙げられる。こ れらの要因は９例えば、マニアナイス、　Ｔ、　１９８２年の文献に概説されて いる。

一般に、　ＣＭＶゲノム配列は、感染した個体の血清中には比較的低いレベル、 すなわち約１０２〜１０３配列／ｍｌで存在していると予想される。このレベル では、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、増幅技術を用いる必要がある 。このような技術は、当該技術分野では公知である。例えば、　Ｅｎｚｏ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの’　Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ″系 は、ＤＮＡプローブに、未修飾の３′−ポＩＪ−ｄＴ−テールを付加するために 末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用している。ポＩＪ−ｄＴ− テールをつけたプローブを標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせ９次にビ オチンで修飾したポリ−Ａにハイブリダイズさせる。ＰＣＴ出願第８４１０３５ ２０号とヨーロッパ特許出願第１２４２２１号には９次のようなりＮＡハイブリ ダイゼーションアッセイが記載されている。すなわち（１）被分析物を、酵素で 標識をつけたオリゴヌクレオチドに相補的な一重鎖ＤＮＡプローブにアニールす る方法：および（２）得られたテールをつけた二本鎖を、酵素で標識を付けたオ リゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる方法である。ヨーロッパ特許出願第２ ０４５１０号には、被分析物のＤＮＡを、ボＩＪ−ｄＴテールのようなテールを 有するプローブと、ポリーＡ配列のようなプローブのテールとハイブリダイズす る配列を有し、かつ複数の、標識をつけたストランドを結合できる増幅ストラン ドと接触させるＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。特に 望ましい方法では、最初に、血清中で標的のＣＭＶ配列を約ｔｏ、　０００倍、 すなわち約１０６配列／ｒ１１１に増幅する。この増幅は１例えばサイキら（Ｓ ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２４巻：１６３頁、　１９８ ６年の方法で成し遂げられ得る。増幅された配列は９次に、１９８７年１０月１ ５日に出願された同時係属中の米国特許出願第１０９゜２８２号に記載されてい るハイブリダイゼーションアッセイを用いて検定され得る。なおこの特許出願は ２本願の譲受人に譲渡されており、また本願に参照のために援用するものである 。このハイブリダイゼーションアッセイは、　１０’　／ｍＮのレベルでの配列 を検出するはずであり、一本領の被分析物の核酸に結合し、かつ−・本鎖の標識 をつけたオリゴヌクレオチドの多数と結合する核酸多量体を利用する。標識をつ けたポリヌクレオチドプローブを用いて利用され得る適切な溶液相サンドイッチ アッセイと、プローブの調製法とが、　１９８７年６月１６日に公開された同時 係属中のヨーロッパ特許出願公開第２２５、８０７号に記載されている。なおこ の出願は１本願譲受人に譲渡されており２本願に参照のために援用する。

ｎ、Ｈ，免疫検定法と診断用キット ＣＭＶ抗体を含有する血清と免疫学的に反応する組換えポリペプチドと、これら の組換えポリペプチドに対する抗体の両者は９例えば血液もしくは血清のサンプ ルを含む生物学的サンプル中の、　ＣＭＶ抗体またはウィルスの存在を検出する 免疫検定法に有用である。免疫検定法の設計には非常に多くの種類があり、各種 の検定法が当該技術分野で公知である。例えば、免疫検定法は、１つのウィルス 抗原１例えば、　ｇＢ５５のアミノ酸４６１〜６８０由来の組換えポリペプチド を利用し、あるいは、この免疫検定法は、　ＣＭＶゲノム由来のウィルス抗原の 組合せを使用し得る。例えば１つのウィルス抗原に対するモノクローナル抗体、 １つのウィルス抗原に対するモノクローナル抗体の組合せ、各種のウィルス抗原 に対するモノクローナル抗体、同じウィルス抗原に対するポリクローナル抗体。

または各種のウィルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。プロト コルは１例えば競合もしくは直接反応に基づいたものであり、またはサンドイッ チ型アッセイであり得る。またプロトコルは９例えば、固体支持体を用いてもよ く、または免疫沈澱法に基づいたものでもよい。はとんどのアッセイでは１ｍ識 をつけた抗体もしくはポリペプチドが用いられ、その標識は９例えば、蛍光分子 、化学発光分子、放射性分子または染料分子でもよい。プローブからのシグナル を増幅するアッセイも公知である。その例としては、ビオチンとアビジンを利用 するアッセイと、酵素で標識を付けてこれを介して行う免疫検定法１例えば、　 ＥＬＩＳＡアッセイがある。

免疫診断法に適した。適切な標識を付けた試薬を含有するキットは、　ＣＭＶエ ピトープを含有する本発明の組換えポリペプチドまたはエピトープに対する抗体 を含む適切な材料を。

このアッセイを実施するのに必要なその他の試薬と材料と。

アッセイの適切な説明書と共に適切な容器にパッケージすることによって構築さ れ得る。

ポリヌクレオチドのプローブも診断用キットにパッケージされ得る。診断用キッ トには、プローブＤＮＡが含有されているが、これに標識をつけてもよい。ある いは、プローブＤＮＡは標識をつけずに標識を付けるための成分をキットにいれ てもよい。キットには、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要なその 他の適切にパッケージされた試薬と材料。

例えば標準物および試験を行うための説明書を入れてもよい。

（以下余白） ＩＩ＋、＝３し１沃 ゲノムをウィルスから抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを調製してプローブし、ク ローンの配列決定を行い２発現ベクターを構築し、細胞を形質転換する等に使用 される一般手法は。

当該技術においては既知であり、これらの手法を記述した実験用マニユアルが入 手可能である。しかし、一般的なガイドとして、これらの手法およびこれらを実 行するために役立つ材料として現在入手可能ないくつかの情報源を以下に示す。

１１１、Ａ、　　　および　　コントロール　１所定の宿主と融合性がある適当 なコントロール配列が使用される場合、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細 胞の両方が、所望のコード配列を発現するのに使用され得る。原核生物宿主の内 、イー・コリ（Ｅ、　刈且）が最も頻繁に使用される。

原核生物のための発現コントロール配列は、必要に応じてオペレータ一部位を有 するプロモーター、およびリボゾーム結合部位を有する。原核生物宿主と適合性 のある転移ベクターは通常１例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性 を付与するオペロンを有するプラスミドであるｐＢＲ３２２゜および抗生物質耐 性マーカーを付与する配列を有する様々のｐＵＣベクター由来である。これらの マーカーは１選択によって成功裏に形質転換体を得るのに使用され得る。通常、 使用される原核生物コントロール配列は、βラクタマーゼ（ぺ二シリナーゼ）お よびラクトースプロモーターシステム［チャンら、　　（Ｃｈａｎｇ、　ａｔ　 ａｌ、）　Ｎａｔｕｒｅ　　１９８巻：　１０５６頁、　１９７７年］。

トリプトファン　（ｔｒｐ）　　プロモーターシステム［ゴーデルら、　　（Ｇ ｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　８巻：　４０５ ７頁、　１９８０年］、λ由来のＰＬプロモーター［シマタケら、　　（Ｓｈｉ ｍａｔａｋｅ。

ａｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９２巻：１２８頁、　１９８１年コ、ならびに Ｎ遺伝子リボゾーム結合部位およびｍおよびｌａｃ　　ＵＶ５プロモーターの配 列由来のハイブリッドｔａｃプロモーター［テボアーら（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ、　ｅ ｔ　ａｌ、）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｊ　ＵＳＡ　　６９巻：　 ２１１０頁、　１９８３年］を有する。前述のシステムは、特にイー・コリ適合 性があり、所望されるなら、バクラスまたはシコードモナス菌株のような他の原 核生物宿主が、対応するコントロール配列と共に使用され得る。

原核生物宿主は、培養システム中の酵母および哺乳類細胞を含有する。サツカロ ミセス　セレビシア（Ｓａｃｃｈａ　ｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およ びサツカロミセス　カールスバーゲンシス（Ｓａｃｅｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃａ ｒｌｓｂｅｒ　ｅｎｓｉｓ）は、最も通常使用される宿主酵母であり、適切な真 菌宿主である。酵母適合性ベクターは、栄養要求性変異体に、原栄養性を、ある いは野生型株に重金属抵抗性を付与することによって、成功裏に形成された形質 転換体を選択することを可能とするマーカーを有する。

酵母適合性ベクター１ｉ［２”クロンの複製起点［ブローチら。

（Ｂｒｏａｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　１００巻＝３０７頁、　 １９８３年コ、　　ＣＥＮ３およびＡＲＳ　ｌまたは複製を確実にする他の手段 の組合せ２例えば、結果として適当な断片が宿主細胞ゲノムに取り込まれるよう な配列を有し得る。酵母ベクターのためのコントロール配列は、当該技術におい て既知であり、３−ホスホグリセレートキナーゼ［ヒララマン（旧ｔｚｅｍａｎ ）Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ　２−６５巻：　２０７３頁、　１９８０年］を含む、 解糖酵素の合成のためのプロモーター［ヘスら（ｌｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、）　 Ｊ　ＡｅＶ　Ｅｎｚ　Ｒｅｇ　７巻：１４９頁、　１９６８年；ホーランドら、 　　（Ｈｏｌｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、旧ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７巻：　４ ９００頁、　１９７８年］を有する。エノラーゼ遺伝子［ホーランド（Ｈｏｌｌ ａｎｄ）　Ｊ　ＢＩｏｌ　Ｃｈｅｗ　２５６巻：　１３８５頁、　１９８１年］ 由来のようなターミネータ−もまた、含有され得る。特に有用なコントロールシ ステムは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プ ロモーターまたはアルコールデヒ・ドロゲナーゼ（ＡＤＨ）制限可能プロモータ ー、ＧＡＰＤＨ由来のターミネータ−および分泌が所望されるなら。

酵母α因子由来のリーダー配列を有するものである。更に。

作動可能に連結された転写、制御領域および転写開始領域は。

野生型生体と自然に関連しないようにされ得る。これらのシステムは、１９８３ 年２月２２日、１９８３年８月１２日。

１９８５年７月２９日、および１９８６年５月２９日に各々出願の米国特許出願 下４６８．５８９号、第５２２．９０９号、第７６０．１９７号。

および第８６８．６３９号に記述されており、これらはすべて本発明の出願人に 譲渡されており、参考文献として本発明に組み込まれている。

発現のための宿主として入手可能な哺乳類細胞系は、当該技術分野において既知 であり、それには、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細ａ 、　ベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞、および多数の骨髄腫系を包含する 他の細胞系を含む、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の永久増殖性細胞系が包含され る。哺乳類細胞のための適切なプロモーターもまた。当該技術において既知であ り、それには、サルウィルス４０　（ＳＶ４０）■）、アデノウィルス（ＡＤＶ ）、　　ヒト、サルおよびネズミＣＭＶ、　　およびウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ Ｖ）３来のウィルスプロモーターが包含される。哺乳類細胞もまた。ターミネー タ−配列を必要とし得る。哺乳類細胞における複製に適するベクターは、ウィル スレプリフン、またはＣＭＶエピトープをコードする適切な配列を宿主ゲノムに 導入するのを確実にする配列を含有し得る。

発現もまた。形質転換され培養された昆虫細胞において。

適切なベクター、例えば、バキ二ロウィルスベクターにより行われ得る。例えば 、ｈ劇」旦」（頂１匝旺包を使用する昆虫細胞培養物についての方法は、当該技 術分野において既知であり、それらの培養および使用の詳細な方法は、　　［Ｍ 、　　Ｄ。

サマ・−およびＧ、　　Ｅ、　　スミス　（Ｍ、　Ｄ、　Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎ ｄ　Ｇ、　Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ）によるＡ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｌｒｕｐ　Ｖｅｃｔｏｒｓａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕ ｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉ＋ｍｅｎｔａｌ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉ ｎ　Ｎｏ、　１５５５．２ｎｄ　ｐｒｉｎｔｉｎｇＦｅｂ、　１９８ｇ）および １９８４年１２月１２日公開のスミス、　Ｇ、Ｅ、ら（Ｓ＋＊ｉｔｈ、　Ｇ、　 Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、）ヨーロッパ特許出願下１２７．８３９号に記載されている 。

ＩＩＩ。Ｂ、註！藍！ 形質転換は２例えば、ポリヌクレオチドをウィルス内テパッケージし、このウィ ルスを宿主細胞に形質導入することを含む、ポリオヌクレオチドを宿主細胞に導 入するいがなる方法、およびポリオヌクレオチドを直接取り込むことによって行 われ得る。使用される形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。例 えば、ＣＭＶ配列を含有するλｇｔｌの実施例の項で記述されている。直接の取 り込みによる細菌の形質転換には２通常、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウム による処理が使用される［コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃ ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　６９巻：　２１１０頁、　１９７２年；マニアティスら 、　　（Ｍａｎｆａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

１９８２年、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ、　Ｙ、　］。直接の取り込みによる酵母の形質転換は、　［ヒネンら（Ｈｉ ｎｎｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、）　１９７８年　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ ｃｉ　ＵＳＡ　７５巻：　１９２９年］の方法を用いて行われ得る。直接の取り 込みにょる哺乳類の形質転換は、グラハムおよびパン　デル　Ｅｂ（Ｇｒａｈａ ＋ａ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２巻：５４６ 頁、　１９７８年）、のリン酸カルシウム沈澱法またはその様々な既知の改変法 を使用して行われ得る。

１１１Ｃ，二叉Ｌユ立１！ ベクターの構築は、当該技術分野で既知の手法が使用される。部位特異的ＤＮＡ 開裂は、一般に、これらの市販されている酵素の製造業者によって特定される条 件の下で、適切な制限酵素で処理することによって成し遂げられる。一般に。

約１マイクログラムのプラスミドまたはＤＮＡ配列は、１ユニットの酵素で、約 ２０マイクロリツトルの緩衝溶液中、３７’Ｃで、１−２時間インキュベートす ることによって開裂する。制限酵素とインキュベートした後、タンパクをフェノ ール／クロロホルム抽出で取り除き、ＤＮＡをエタノールで沈澱させることによ って回収する。開裂した断片は、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、　６５巻：　４９９−５６０頁、　１９８０年において見いだされる一般的な 方法に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を使用する ことによって１分離され得る。

粘着末端開裂断片は、混合物中に存在する適当なデオキシヌクレオチド三リン酸 塩（ｄＮＴＰ　ｓ）の存在下で、イー・コリＤＮＡポリメラーゼ■（クレノー） を使用することによって、平滑末端となり得る。Ｓ１ヌクレアーゼで処理するこ とも可能であるが、結果として、いかなる１本鎖ＤＮＡ部分も加水分解すること になる。

連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを使用する標準的な緩衝液および温度 条件下で行われ、粘着末端の連結には。

平滑末端の連結よりもＡＴＰおよびリガーゼが少な（てよい。

ベクター断片が連結混合物の一部として使用される場合、べ細菌アルカリ性ホス ファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理され 、このようにして。

ベクターの再連結が防げられる。あるいは、不必要な断片の制限酵素消化を、連 結防止のために使用することも可能であ唱 る。　連結混合物は、イー・コリのような適切なりローニング宿主に形質転換さ れ２例えば、抗生物質耐性によって成功裏に形成された形質転換体が選択され、 正確な構築のためにスクリーニングされる。

＋１１．Ｄ、　　　のＤＮＡ　　　の 合成オリゴヌクレオチドはワーナー（ＩＦａｒｎｅｒ、　１９Ｊ１４年）によっ て説明されるように、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによって 調製され得る。必要に応じて９合成鎖は、標準反応条件を使用して、　３２ｐ− ＡＴＰの存在下でポリヌクｃＤＮＡライブラリーから単離されたものを含むＤＮ Ａ配列は９例えば、シラー（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｈｕｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１ ０巻：　６４１１７頁、　１９８２年）によって説明される２部位特異的変異を 含む既知の手法によって変性され得る。簡単に説明すると、変性されるべきＤＮ Ａを一本鎖配列としてファージにパッケージし。

変性される部位に相捕的であり、それ自身の配列に含まれる所望の変性を有する 合成オリゴヌクレオチドをブライマーとして使用し、ＤＮＡポリメラーゼで２本 鎖ＤＮＡに変換する。

生じた二本鎖ＤＮＡは、ファージを有する宿主細菌に形質転換される。ファージ の各鎖の複製を含む、形質転換された細菌の培養物を、プラークを得るため、寒 天中にプレートする。

理論的には、５０％の新しいプラークは、変異配列を有するファージを包含り残 （の５ｏ％は、もとの配列を育する。

プラークの複製を、非変性配列ではな（、正しい鎖でハイブリダイズするような 温度および条件下で、標識された合成プローブにハイブリダイズさせる。ハイブ リダイゼーションによって同定される配列を回収し、クローン化する。

１１１、Ｅ、プローブによるバイブ！　イゼーシｌンＤＮＡライブラリーは、グ ランスタインおよびホグネス（Ｇｒｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＳｃＩ　ＵＳＡ、　７３巻：３９６１頁、　１ ９７５年）による手法を使用することによって、プローブされるＤＮＡをニトロ セルミースフイルター上に固定し。

変性し、　０−ＳＯ％（Ｄ＊／ｌ／Ａ７　！　ｌ’、　０．７５　Ｍ　（Ｆ）Ｎ ａＣ１，７５ｍＭ（７）クエン酸カリウム、各々０．０２％（Ｗｔ／ｖ）のウシ 血清アルブミン、ポリビニルピロリジン、およびフィコール、　５０　ｔａＭの リン酸ナトリ’）ム（ｐＨ６，５）、０．１％１７）ＳＤＳ、および１００ｖイ クログラム／ｍｌのキャリア変性ＤＮＡを含む緩衝液でブレハイブリダイズする 。緩衝液中のホルムアミドの割合、プレハイブリダイゼーションの時間および温 度、およびそれに次ぐハイブリダイゼータ９ン工程は、必要とされる緊縮度に依 存する。

それほど緊縮性を必要としないオリゴマーのプローブは、一般に、低濃度のホル ムアミドで、低温で長いハイブリダイゼータ１フ時間の下で使用される。ｃＤＮ Ａまたはゲノム配列由来のプローブのような、ヌクレオチドを３０もしくは４０ を越えて有するプローブでは、一般に高温２例えば、約４０−４’ｉ’Ｃで、そ して高ｉ２例えば、５０％のホルムアミドが使用される。プレハイブリダイゼー シ曹ンに次いで、５°−３２ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に加 え、そして。

フィルターをこの混合物中において、ハイブリダイイーシコン条件下でインキユ ベートする。洗浄後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーにかける と、／−イブリダイズされたプローブの位置が示される。もとの寒天プレート上 のものと対応する位置におけるＤＮＡの所望のＤＮＡ起源として使用する。

＋１１．Ｆ）　　　および　　　　の確通常のベクター構築のために、連結混合 物は、イー・コリＨ８１０１株または他の適切な宿主中に形質転換され、成功裏 に形成された形質転換体が、抗生物質耐性または他のマーカーにより選択される 。次に、形質転換体由来のプラスミドが、フレウェルらの方法によって調製され 、　　（Ｃｌｅｗｅｌｌ、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅ ｔ　ＵＳＡ、　６２巻：　１１５９頁、１９６９年）９通常次いでクロラムフェ ニコール増幅が行われる（フレウェル；Ｃ１ｅｖｅｌｌ、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、　１１０巻：６６７頁、　１９７２年）。ＤＮＡは。

通常、制限酵素分析および／または配列決定により単離され。

分析される。配列決定は、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　７４巻：　５４６３頁）更に詳しくは、 メフシングら（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ａｔ　ａｌ、　Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 　９巻：３０９頁、　１９８１年）によるジデオキシ方法、またはマキクサム（ Ｍａｘａａ＋、　ｅｔ　ａｌ。

Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　６５巻＝４９９頁、　１９８０年）による方法で可能である 。

バンドが縮みあっていｊという問題は、ＧＣが豊富な領域において時々観察され るが、バーら（Ｂａｒｒ、　ａｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４巻 ＝４２８頁、　１９８６年）により、Ｔ−デアザグアノシンを使用することによ って解決された。

１１１、Ｇ、　　ＣＨＯ、ニよ　　　された　Ｂの多数の従来のタンパク精製法 が、ｇＢを精製するのに使用され得る。これらの手法は９例えば、イオン交換、 疎水性相互作用、ヒラマメレクチンクロマトグラフィーおよびゲル浸透クロマト グラフィーのようなりロマトグラフイーを包含する。

ｉｖ、案上Ｕ匹 以下１本発明の実施例について説明するが、これは本発明を例示する目的のみで 記載されており１本発明の範囲を制限するものではない。

ウ　ルスおよびブースミド　ヒトＣＭ　Ｖ　（Ｔｏｗｎｅ）をＥ。

Ｓ、モカースキ−［Ｅ、Ｓ、Ｍｏｃａｒｓｋｉ　（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ）］より得た。ウィルスを、スペードおよびモカースキー（Ｓｐａ ｅｔｅ　ａｎｄ　Ｍｏｃａｒｓｋｌ、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　５６巻：　１３５−１ ４３頁、　１９Ｊ１５ａ年）の手法に従って、ダルベツコ変性イーグル培地（Ｄ ＭＥ）　　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　０ｒａｎｄ　ｌ５ｌａ ｎｄ、　ＮＹ）を用い、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＰ）の培養物中で成長させたが 、上記培地には１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）　　（Ｂｙｃｌｏｎｅ　Ｌｏｇ ａｎ、　ＵＴ）を補給して用いた。

ヱ１工土ヱＬｉｉ　　Ｒ，Ｌ、　　ラ　フエミナおよびＧ、　　Ｓ、　ヘイワー ド［Ｒ，Ｌ、　Ｌａ　Ｐｅｍ１ｎａ　ａｎｄ　Ｇ、Ｓ、　Ｈａｙｖａｒｄ　（Ｊ ｏｈｎｓ　ＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）１から贈られた。第１図に示 すＣＭ　Ｖ　Ｌ：ＤＨｉｎｄＩＩＩ　Ｄ断片（Ｔｏｖｎｅ）を、プラスミドｐＢ Ｒ３２２にクローン化し、ｐＲＬ１０４ａと命名した。全長のｇＢ遺伝子をコー ドするプラスミドｐＸｇＢ１を、ｐＲＬ１０４ａの８．９５ｋｂＢａｔａＨＩ断 片を環化して得た。従って、ｐＸｇＢｌは、旧ｎｄｌｌＩＤブラフ、　ｐＢＲ３ ２２配列の右端からの４．９６ｋｂ断片（Ｈｉｎｄ　ｌｌＩＤ／ＡからＢａｍＨ ｒ　Ｅ／Ｒまで）を含有する。プラスミドｐＸｇＢ７は、ＳＶ４０初期プロモー ター−９複製開始点およびポリアデニル化配列ならびにｐＭＬ由来の配列を含有 する発現ベクターｐＳＶ７ｄ　［トルエツト、　Ｍ、　　Ａ、　　ら（Ｔｒｕｅ ｔｔ、　Ｍ、Ａ、、　ｅｔ　ａｔ、）　ＤＮＡ　４巻：　３３３−３４９頁、　 １９８５年）にクローン化された。

切形のｇＢ遺伝子を含有する。プラスミドｐＸｇＢ７は１ｇＢを２．１２　ｋｂ の部分５ａｃｌｌ／Ｘｈｏｌ断片として、クレノー断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用してｐＧＥＭ−１（Ｐ ｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ）ポリリンカーのＳａ ｌ　Ｉ部位にクローン化し、　５ａｃ１１部位を平滑末端とし、連結しなかった Ｓａｌ１部位を充填することにより構築された。この中間構築物を。

ｐＸｇＢ６と命名した。ｇＢ配列を、　　２．１３　ｋｂ　Ｘｂａ［／Ｈｉｎｄ ｌｌｌ断片として、ｐＸｇＢ６の周囲のポリリンカー配列から切り出し、ｐＳＶ ７ｄのＸｂａ　Ｉ部位に挿入した。旧ｎｄｌｌＩ部位を充填し、ｐＳＶ７ｄの充 填されたＸｂａ　１部位に連結し２ｇＢの３°末端においてＸｂａ　Ｉ部位を維 持した。結果として生じたプラスミドを、ｐＸｇＢ７と命名し、これを第３図に 示す。

プラスミドｐＸｇＢ８は、ｐＯＮ２６０　［ＣＭｖメジャー直接初期（＋＋＋ａ ｊｏｒ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）　　（Ｍ　Ｉ　Ｅ）プロモーター駆 動βガラクトシダーゼ（囲）発現ベクター］にクローン化された同様の切形のｇ Ｂ配列を含有する。プラスミドｐＯＮ２６０は、ＣＭＶ：Ｃンハンサーの上流の Ｂａｌ　ＩからＳａｌ　Ｉの断片を除去することにより、ｐＯＮ２４９　［ゲバ ール、Ａ。

Ｐ、ら（Ｇｅｂａｌｌｅ、　Ａ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、）　Ｃｅ１ｌ　４６巻： 　８６５−８７２頁、１９８６年］から誘導される。ｇＢをコードする２、１３ 　ｋｂ　Ｘｂａｌ断片をｐＸｇＢ７から切り出し、あらかじめＸｂａｌおよびＰ ｖｕＩＩで切断し、１ａｃＺコ一ド配列のＣ末端の１５個のアミノ酸以外すべて を取り除いたｐＯＮ２６０に移した。これらの１ａｃＺ配列は、上流の終止コド ンの存在のために、ｐＸｇＢ８において発現されない。発現プラスミドｐＭＩＥ に基づ（もう一つのＣＭＶ　　ＭＩＥプロモーターを、ｐＯＮ２６０に存在する １　ａｃＺコード配列を除去するために、構築した。エンハンサ−の上流にある 第１のＢａ１１部位からＴＡＴＡボックスの８ｂｐ下流にあるＳａｃ　［部位ま でのＣＭＶ　　ＭＩＥプロモーター配列を、ｐＯＮ２６０から０．６７ｋｂのＳ ａｌ　Ｉ／Ｘｂａ■断片として切り出し、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをそ のままの状態に保ちながら、ＳＶ４０エンハンサ−１複製起源およびプロモータ ーを取り除くためにＳａｌ　ＩおよびＢｇｌｌｌで消化したｐＳＶ７ｄに類似し た構築物であるプラスミドｐ５Ｖ７ｂにクローン化した。

全長のｇＢ遺伝子を、　３．１２　ｋｂ　Ｅａｇ　Ｉ断片として、　　ｐＭＴｌ ｌ／Ｅａｇｌ［スペードら（Ｓｐａｅｔｅ　ｅｔ　ａｌ、）によって記述される ｐＢＲ３２２由来のプラスミドベクター、　　１９８５ａ年］に両方向クローン 化し、プラスミドを、ｐＸｇＢ９およびｐＸ　ｇＢ　１１と命名した。ｇＢ配列 を、ポリシンカー中のＥｅｏＲｌおよびＥａｇ旧を使用してプラスミドｐＸｇＢ １１がら切り出し、ｐＭＩＥポリリンカー配列のＥｃｏＲＩおよびＸｂａ１部位 にクローン化した。生じたプラスミドを、ｐＸｇＢ１２と命名し。

これを第３図に示す。

ｐＸｇＢ１２を生じるのに使用されるＥｅｏＲ１／Ｂａ１ｌ旧断片をまた。　Ｅ ｃｏＲＩおよびＥａｇ旧で切断したｐｓＶ７ｄのポリリンカー配列にクローン化 した。このＳＶ４０発現プラスミドを。

ｐＸｇＢ１３と命名し、これも同様に第３図に示す。

ｐＸｇ　Ｂａにクローン化されたｇＢ遺伝子を、　　Ａａｔ１１部位および１ｉ ｄｅ１部位の間のＮ末端ｇＢコード配列の１１．０６ｂｐを取り除くことによっ て削除した。末端をクレノー断片を使用して平滑末端とし、再連結して５ｎａＢ １部位を作り出し１　リーディングフレームを維持した。このプラスミドを、ｐ ＸｇＢ工９と命名した。欠失ｇＢ遺伝子をコードする１０３６　ｂｐのＸｂａｌ ／Ｈ１ｎｄｌ　ＩＩ断片を、ｐＸｇＢ１９から切り出し、平滑末端の連結に先立 って部位を充填するためにクレノーを使用し、　ｐＭＣＭＶＡｄｈｆｒの唯一の ５ｏ１１部位へクローン化した。発現ベクターであるｐＭＣＭＶＡｄｈｆｒは、 下記に説明するように、ヒトＣＭＶプロモーターがＨｐａｉ／Ｐｓｔ、Ｉ断片と してクローン化されたネズミｃＭＶ　（ＭＣＭＶ）直接初期プロモーターによっ て置換されていること以外、　ｐｃＭ’ＶＡｄｈｆｒと共直線的（ｃｏｌｉｎｅ ａｒ）である。

非開裂ｇＢを発現するプラスミドを開発するため１ｇＢの内部タンパク分解開裂 部位を１Ｍ１３でクローン化されたテンプレートおよび以下に説明する４つの変 異オリゴヌクレオチドを使用して２　インビトロで変異させる。

→ｌ　　”−１−２−３−４ Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｑも匈即利５’　ＧＣＣＡＴＣＴＧＴ　 ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＡＴＴ　Ａ、ＴＧ　ＡＧＴ触ＧｇＢ およびＭ１３配列を探求しても、開裂部位以外に、これらの３６　ｍ　ａ　ｒに 対する強力な結合部位は見られなかった。

次の配列決定用ブライマーもまた。生じる。

５°ＣＧＣＣＣＧ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　ＡＣＣＧＣＧ　３’このブライマ ーは開裂部位から９３　ｂｐに存在する。テンプレート鎖を、各々の変異オリゴ ヌクレオチドでプライムし１次いで延長する。生じたｄｓＤＮＡを使用して適切 なＭ１３宿主株を形質転換し、そして、配列決定を行って変異ＤＮＡを単離し、 複製可能な型の（ＲＦ）ＤＮＡを生じさせる。ＲＦＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＡ ｐａＬＩにより消化し、これらの断片をｇＢ発現プラスミドｐＸｇＢ２３　（後 述）または転写がネズミＣＭＶ直接初期プロモーター−によって促進されるよう な同様のｇＢ構築物において、野生型部分と交換される。

ヒトＣＭＶメジャー直接初期（ＭＩＥ）プロモーターヲ使用し、またアデノウィ ルスメジャー後期プロモーターニ連結するマウスｄｈｆｒ　　ｃＤＮＡを含有す る発現ベクターであるｐｃＭＶＡｄｈｆｒ　［スチューブ（Ｓｔｕｖｅ、　ｅｔ 　ａｌ、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６１巻＝３２６−３３５頁、　　１９８７年コを使 用して、　２ｉ９６　ｂｐ　Ｅａｇｌ／Ｘｈｏｌ　ｇＢ断片を、ｐＸｇＢ９由来 のＢａｍＨ１／Ｘｈｏｌ断片として、クローン化した。このｇＢ構築物であるｐ ＸｇＢ２３は、５′末端におい°Ｃ。

その内部において５゛非翻訳ｇＢリーダー配列の１５３　ｂｐを含有する。ｐＸ ｇＢ１２およびｐＸｇＢ１３のｇＢ挿入物と等しい挿入物を有する。その構築物 は、３°末端において、その内部において膜内外ドメインおよびＣ末端ドメイン を取り除にようなアミノ酸６ａｔ−９ｏ７の削除によってＣ末端が切形である。

ｐＸｇＢ８０ｇＢ挿入物と同一である。

細菌のクローニングはすべて、スペードら（Ｓｐａｅｔｅ　ｅｔａｌ、、　Ｊ　 Ｖｉｒｏｌ　５４巻：　１１１？−８２４頁、１９８５ｂ年）の手法によってＥ ｓｃｈｅｒｔｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩまたはＤＨ５ａｌｐｈａにおいて 行われた。

プラスミドＤＮＡの調製および制限酵素分析に使用される手法もまた。スペード ら、　　（Ｓｐａ、ｅｔｅ　ｅｔ　ａｉ、、１９８ｓｂ年、前出）によって記述 されている。トランスフェクションにおいて使用されるすべてのプラスミドを、 塩化セシウム勾配において二度バンド化した。制限酵素およびＴ４　　ＤＮＡリ ガーゼをＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｆｏｌａｂｓまたはＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ）から購入し、製造業者 の説明書に基づいて使用した。

ヌクレオＬ臼ｖｔわＬ糺スμ丘近　ＤＮＡ断片をＭ１３ファージベクターｍｐ１ ８およびｍ　ｐ　１９　（Ｐｈａｒｍａｅｆａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ 、Ｊ、）ならびにこれらのベクターのポリリンカー誘導体であるプラスミドｒｔ ｌおよびｒｔ２にサブクローン化した。

プラスミドｒｔｌは、以下の制限酵素部位を次の順序で含有するポリリンカーを 有する：Ｈｉｎｄｌｌｌ、　Ｘｂａｌ、　ＥｃｏＲＶ、　５ａｌｔ、　Ｓｐｈ夏 、　ＢａｍＨＩ、　Ｎｃｏｌ、　ＰｓｔＸ、　Ｋｐｎｌ、　５ｓｔｌ、Ｅｃｏ旧 。ｒｔ２においては、ポリリンカー内の部位の順序は反対である。一本領ウィル スＤＮＡを、サンガー、Ｆ、、ら（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、、　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｉ　ＵＳＡ　７４巻：　５４６３−５４６ ７頁）のジデオ牛ジヌクレオチドチェーンターミネーション法により配列決定す るためのテンプレートとして生じさせた。ｄＧＴＰ塩基アナログである７−デア ザｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ　（Ａｔｉｅｒｉｃａｎ　Ｂｔｏｎｅｔｉｅｓ、　Ｈａｙｖａ ｒｄ、　ＣＡ；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ ｉｃａｌｓ）を、混みあった領域（Ｇ／Ｃ高含有領域）を解消するために使用し た。ＤＮＡの両鏡を全体にわたって配列決定し、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ３８０Ａ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で合成されたオリゴヌクレオチ ドブライマーを使用して、すべての連結部を連結した。

ＤＮＡ　ｌ−ランスフエフシー、７、ＣＯ５−７細胞［グルズマン。

Ｙ、　　（ＧＩｕｚ＋ｏａｎｎ、　Ｙ、）　Ｃｅ１ｌ　２３巻：　１７５−１８ ２頁、　　１９１１１年］をスペードら（Ｓｐａｅｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８５年）によって説明されるようにトランスフェクトした。簡単に説明すると、 １０から３５ｕｇのプラスミドＤＮＡを、１ｍｌあたり４００から６００ｕｇの ＤＥＡＥデキストランを含有する１、４ｍｌ　ＤＭＥ−５ｏ　１１Ｍ　）リス塩 酸（１）Ｈ７，４）と混合し、５０−８０％の集密度で細胞を含有する６ｃｍの 皿に加えた。細胞を、トランスフェクシゴン後４から６時間において、ＤＭＥ− ５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）で洗浄し、ＤＭＥ−１０％ＦＣ３中において ３７０Ｃでインキュベートした。２４時間後、トランスフェクトされた細胞の一 部を、蛍光抗体法により研究するために、４つに仕切つたプラスティックスライ ドウェル（Ｌａｂ−Ｔｅａ）において二次培養した。他の皿の細胞を増殖させて 集密化し、調製された培地をトランスフェクシ璽ン後７２時間において。

採取した。

ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系［アーラウブおよびチェイソン（Ｕｒｌａｕｂ　ａｎ ｄ　Ｃｈａｓｉｎ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７巻 ：　４２１６−４２２０頁、　１９１５０年〕を、ステ１−ブら（Ｓｔｕｖａ、 　ｅｔ　ａｌ、、前出）に説明されるようにプラスミドｐＸｇＢ８およびＡｄ− ｄｈｆｒを使用して、コトランスフェクトした。１０％の透・析されたウシ胎児 血清を有するＤＭＥからなり、パチルら（Ｐａｃｈｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｖ ｆｒｏｌ　６１巻：　３１５−３２５頁、　１９１１７年）に説明されるように 補足された選択培地を、感染２日後において、トランスフェクトされた細胞に加 えた。い（つかのｄｈｆｒ陽性クローンを、蛍光抗体法および調整倍増を用いた ＥＬＩＳＡによりｇＢの発現について分析した。ｇＢを分泌する安定細胞系を検 査すると、高産生クローンが、ＣＯＳ細胞において検出されたのと同様のレベル でｇＢを発現した。

当該技術において示されているように、メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅を使用 してこれらの安定細胞系においてｇＢ発現を増加させることも可能である。

１瓜仄生迭　ｇＢを産生するＣ０８−７細胞を、第一抗体としてネズミモノクロ ーナル抗体１５Ｄ８［ラスムラセンら（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　 １９８５年］を使用し、第二抗体としてＦＩＴＣ連結のヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　 （Ｔａｇｏ、Ｉｎｃ、、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ：Ｃｈｅ＋ｍ１ｃｏｎ 、　ＥＩ　Ｓｅｇｕｎｄｏ、　ＣＡ）を使用する間接蛍光抗体法によって同定し た。ＦＩＴＣ連結物を、　　１：　５０　（Ｔａｇｏ）および１　：　８０　（ Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の希釈物において使用した。　Ｌｅｉｔｚ　Ｄｌａｌｕｘ　 ２Ｇ　ＥＢ蛍光顕微鏡を使用すると、スライド（ｓｌ　１ｄｅｓ）が観察された 。

ｇＢの発現が、４つのすべてのｇＢ発現プラスミドでトランスフェクトされたＣ Ｏ８細胞において１５Ｄ８によって検出された。このことは、ｐ１３０およびｐ ５５の糖タンパクが２ｇＢ遺伝子によってコードされていることを示している。

切形型のｇＢを有する。トランスフェクトされた細胞は、散在する細胞質の蛍光 抗体染色パターンを示した。これに対して、全長のｇＢ遺伝子でトランスフェク トされた細胞は、小さな点状の細胞質染色パターンを示し、このことは、これら の構築物における膜内外ドメインの存在による膜のつながり（ａｓｓｏｃｉａｔ ｉｏｎ）を示唆している。

ＢのためのＥＬＩＳＡア　セイ　マイクロタイタープレー）　　　（Ｉｍｍｕｌ ｏｎ　　　ｌ、　　　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　　 Ｉｎｃ、）　　　を、　　　５０　ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，１）で希釈 したネズミモノクローナルｌ　５Ｄ８γグロブリンでコーティングしく０．ｌｕ ｇ／ウェル）、３７’Ｃで２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、リン 酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；０．１５　　Ｍ　　Ｎａｃｔ、２．７　　ｍＭ　 　ＫＣＩ、１５．３　　ｍＭ　　Ｎａ２ＨＰＯ４，１，５ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４ ）プラス２．０％ＢＳＡで１時間インキュベートし１次いでトランスフェクトさ れたＣＯ８細胞またはｇＢを含有するＣＭＶ糖タンパク（後述）混合物からの調 製培地で、３７’Ｃにて一部インキユベートした。その後、洗浄したプレートを 、ヒト抗ＣＭＶ血清（Ｗｈｉｔａｋｅｒ　Ｍ。

Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、夏ｎｃ、）とともに、３７０Ｃで１時間インキ 二べ一トシ１次いで１：５００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩ　ｇ　 Ｇ　（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｌｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｉｎｃ、）とともに、３７ｏ（ で１時間インキュベートした。プレートを０．１Ｍのクエン酸−リン酸緩衝液（ ｐＨ５，０）プラス０．０１５％Ｈ２Ｏ２中の０．８３ｍｇ／ｍｌの０−フェニ レンジアミンを用いて可視化し９反応を４ＭのＨ２ＳＯ４で終結させ、吸光度を ４９０ｎｍで測定した。抗原または抗体とともにインキュベートする毎に、プレ ートをＰＢＳプラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳＡで５回洗浄 し、そしてＰＢＳのみで５回最終洗浄した。抗原および抗体の希釈液はすべて、 ＰＢＳプラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡ中において調製さ れた。

ＥＬＩＳＡの標準として使用されるＣＭＶ糖タンパク混合物は。

約４ｘｌＯ”のＨＦ細胞を、０．２のＭＯＩにおいてＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｓ）で 感染することによって調製された。感染して７日後、細胞は、　　　１５０　　 ａ＋Ｍ　　ＮａＣ１，２０＋ａＭ　　Ｔｒｉｓ　　ｐＨ７，５，１％　　ＭＰ４ Ｇ、　　０．５％　ＤＯＣ。

１ｍＭ　ＰＭＳＦ、　ｌ　ｕｇ／ｍ’ｌペプスタチンおよび１７　ｕｇ／ｍｌ　 　アプロチニンを含有する４０鳳ｌの溶解緩衝液（ＬＢ）中で溶解した。溶解産 物を、ＬＢで平衡されたヒラマメレクチンセフ１０−ス４　Ｂ　（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）カラムにかけた。

カラムを、ＬＢプラス０．５Ｍ　　ＮａＣ１で洗浄し、結合している糖タンパク を、ＬＢプラス０．５Ｍ　　ＮａＣ１および１゜０Ｍαメチルマンノサイドで溶 出した。

調製培地を、切形のｇＢ遺伝子を有するトランスフェクトされた細胞から集め、 ＣＭＶｇＢに特異的な間接ＥＬＩＳＡによって９分泌されたｇＢタンパクの存在 を分析した。予想されたように１ｇＢタンパクを、以下の表１のデータに示され るように、切形型のタンパク（ｐＸｇＢ７およびｐＸｇＢ８）を発現する細胞か ら得られる培地において検出した。

（以下余白） 表１ 旦０８−７預↓巳五上ぷ擾辺彪ｐｌ一旦、ｐｌ勇プラスミド　　　　相対吸収値 　　増大倍率ｐｓＶ７ｄ　　　　　　　Ｏ，０３− ｐＸｇ８７　　　　　　０．１７　　　　　　５．７ｐＸｇＢ８　　　　　　１ ．０４　　　　　３４．７龜ＣＯ３−７細胞をＣＭＶ　　ｇＢ発現プラスミドで トランスフェクトし、トランスフェクトして７２時間後、調整培地を集め１ｇＢ の存在をマウスモノクローナル１５Ｄ８を使用してＥＬＩＳＡによって決定した 。吸収値を、標準曲線の直線部分内にある等希釈率の検体の２つの測定量の平均 から得た。標準曲線を、ｇＢを含有し、感染した細胞から単離されたヒラマメレ クチン精製ＣＭＶ糖タンパク混合物を使用して得た。

タンパ外分−届皿王、、胆側５延又　開裂（９３ｋＤａおよび３１　ｋＤａ）お よび非開裂（１１０ｋＤａ）型のｇＢは、プラスミドｐＸｇＢ８で形質転換され たＣＨＯ細胞系（系６７、７７）から分泌する。切形の、分泌型ｇＢを発現する 細胞系６７．７７および陰性細胞系５−５を、ＤＭＥ培地またはカルシウムを欠 損するＲＥＭ（補足されたイーグル培地）中で、カルシウム特異的イオノフオア Ａ２３１８７を加えるかまたは加えずに、濃度を増加させて（０，０５２ｕＭか ら０．２５　ｕＭ）　、　　２時間にわたり、３６Ｓメチオニンで放射標識した 。細胞を、標識されていない培地で４時間追跡し。

溶解産物および培地をＭＡｂ　１５Ｄ８で免疫沈降し、１２％の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅに付し、オートラジオグラフィーにかけた。ｇＢ開裂を最も完全に抑制するＡ ２３１８７の量は０．２５ｕＭである。結果より明らかなように、　　９３　ｋ Ｄａおよび３１　ｋＤａ、　ｇＢ開裂断片を。

薬物濃度を増加させながら１１０　ｋＤａ前駆体に追跡したが、前駆体の開裂は 、完全には抑制されなかった。

これらの結果から以下のことが示される：　（１）放射性免疫沈降およびウェス タンプロット分析により観察された１１０ｋＤａＲ駆体は、開裂生成物の非還元 複合体ではなく、非効率的に開裂した前駆体を示す。（ｉ　ｉ）非開列前駆体は ニンホメ・−シ冒ン依存性ウィルス中和ＭＡｂ　１５０８によって認識される。

このことによりこの重要なエピトープの天然構造が１１０　ｋＤａ分子中に維持 されることが証明される。および（ｉｌｌ）９３ｋＤａおよび３１　ｋＤａ開裂 生成物を、薬品の濃度を増加させて１１０ｋＤａ前駆体中に追跡する能力によっ て、これらの断片の前駆体／生成物の関係が確立され９　そして、　　９３　ｋ Ｄａ断片がｇＢのＮ末端を表すことが示される。３１　ｋＤ分子をＣ末端断片と 同定することは、アミノ酸配列分析によって確立され、以下にこれを説明する。

部分開裂複合体をＣＩＯ細胞系６７．７７から精製するよりも９非開裂８Ｂ分子 をＣＩ−！０１ｉ製培地から精製する方が簡単であるため、ｇＢのタンパク分解 開裂部位変異体は。

この重要な分子の単離および精製を簡素にする。

１見１１ｐ刃」７−　ｉ　、］Ｘ刀上ｌテｊ」すＣｂ　＆ｆ」」」−５ｉ。

ｍ決定　糖タンパクＢを、ＣＭＶ感染したヒト包皮繊維芽細胞由来の清澄化した 細胞溶解産物をモノクローナル抗体１５Ｄ８で調製された免疫アフィニティカラ ムに通過させることによって精製した。カラムに結合したタンパクをチオシアン 酸アンモニウムで溶出し、トリクロロ酢酸で沈澱させることによって濃縮した。

次に、タンパクを１０％の調製５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し１次 いでタンパクをイモピロン膜（Ｍｉ　１１１ｐｏｒｅ）上に電気泳動転移させた 。この膜をクマシーブルーで染色し、移されたタンパクの位置を突き止めた。ｇ ｐ５５のバンドを切り出し、気相タンパク配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅ＋ｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ３ｔｙ、ＣＡ）を使用するエドマン分 解による配列決定に使用した。フェニルチオヒダントイン（Ｐ　Ｔ　Ｈ）残基を 、Ｃ１８逆相高圧液体クロマトグラフィーにより同定した。

ｇｐ５５のＮ末端におけるアミノ酸配列分析の結果を表２に示すが、開裂部位を 二塩基残基ＬｙＳａｓｓＡｒｇａｓｓに続くペプチド結合に局在化する。開裂部 位は、第２図にｐ　ＡｒｇＪ６１および５ｅｔ４６１０間に示される太線の矢印 で示す。

（以下余白） 表２ ５　　　　Ｎ　　　　　　　Ｎ　　　　　　５０６　　　　Ｎ　　　　　　　Ｎ 　　　　　　２００暑アミノ酸配列は、ＣＭＶのＴｏｖｎｅ株（第２図参照）由 来のヌクレオチド配列に基づく。

ｂバックグラウンドまたは遅滞（ラグ）について補正されて０ないフェニルチオ ヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸のピコモル。

Ｏ低収量のＰＴＨアスパラギンは、この部位におけるグリコジル化の存在を示し 得る。

且ム！、に土、！’１５０８旦１ＪＩＡ玉Ｌｕ温王竺辷タ１匁大ヱエエヱｒ　　 ｐＸｇＢ７によってコードされる切形型のｇＢ遺伝子を、ｇＢ（７）ｇｐ５５領 域にさらにＣ末端欠失を形成するために使用した。３４アミノ酸を欠失した欠失 プラスミド、ｐＸｇＢ１６を、アミノ酸６４７−６８０を包含するｌｏｚ　ｂｐ Ｓａｌ　Ｉ／Ｘｈｏｌ断片を取り除くことによって形成した。このＤＮＡ断片は 、５′位がｐＸｇＢ７の構築に使用されたＸｈｏ　１部位に隣接していた。第二 の欠失プラスミド、ｐＸｇＢ１７は。

アミノ酸６１９−６８０を包含する６２アミノ酸をコードす６１８６　ｂｐのＢ ｇｌｌｒ／Ｘｈｏｌ断片を欠失しティた。従っｒ、ｐＸｇＢ１６およびｇＸｇＢ １７は、各々、１８６アミノ酸（残基Ｓ　ｅ　ｒ　４６１からＡ　Ｓ　Ｉ）ｅａ ｅ）および１５＆アミノ酸（残基Ｓ　ｅ　ｒ　４Ｈからｌ１ｅ６．８）である、 加工され／切形とされたタンパクを発現する。

第三の欠失プラスミド、ｐＸｇＢ１８は、３６９アミノ酸が欠失しており、ｐＸ ｇＢ８から倉、アミノ酸４３−４１１を包含する１１０６ｂｐの断片を取り除（ ことによって形成された。ｇＢＢ入物は、ｐＸｇＢ２２で説明されたものと同一 である。

これらの切形構築物の発現を検出する能力は、上記のように、プローブとしてモ ノクローナル１５Ｄ８を使用するＥＬＩＳＡにより、ＣＯ５−７細胞における一 過性発現後に分析された。

表３に示すように２発現を、前述の結果から予想されるように、ｐＸｇＢ７でト ランスフェクトされた細胞によって調製された培地において検出した。発現はま た。１８６アミノ酸切形ｇｐ５５断片を発現するｐＸｇＢ１６．および開裂した シグナルペプチドを含まない２８７アミノ酸ｇＢ断片を発現するｐＸｇ８１８で トランスフェクトされた細胞により調製さられた培地においても検出された。発 現は、コントロールプラスミド、ｐＳＶ７ｄを有する細胞、または１５８アミノ 酸ｇｐ５５断片を発現すべきｐＸｇＢ１７を有する細胞由来の培地においては、 検出されなかった。しかし、ｐＸｇＢ１８由来の発現は、トランスフェクトされ たＣＯ８細胞の免疫蛍光測定により検出された。このことは、１５Ｄ８がこのＮ 末端切形構築物を認識することができたことを示す。これらの結果は、１５Ｄ８ ！ビトープが、ｐＸｇＢ１６およびｐＸｇＢ１８によってコードされた１８６ア ミノ酸ｇｐ５５断片内に地図化され、更にこの断片のＣ末端からの２８アミノ酸 がさらに欠失していることにより、１５Ｄ８との反応に必須なエピトープの部位 が取り除かれるに違いないことを示している。

表３ Ｂ　　エピトープ−のマ　ピング ７°ラスミド　　　　相対吸収値　　　　発現ｐｓＶ７ｃｌ　　　　　　　ｏ、 　ｏｏ　　　　　　　−ｐＸｇＢ７　　　　　　０．２４　　　　　　　＋ｐＸ ｇＢ１６　　　　　　０．０ｇ　　　　　　　＋ｐＸｇＢ１７　　　　　　０． 　Ｇｏ　　　　　　　−ｐＸｇＢ１８　　　　　　　　　　　０．Ｇｏ　　　　 　　　　　　　　　十す一表１９脚注８参照 す蛍光抗体法により測定 以前にｇＡｌ−ｇＡ６と命名されたＣＭＶ糖タンパクの一群に対して調製された モノクローナル抗体のパネル（米国特許第４．６８９．２２５号）が、上述した プラスミドにより発現されたタンパクと反応したかどうかを決定するため、切形 ｇＢＢ成物を使用して、追加の実験を行った。

ｐＸｇＢ１７で説明したような配列をコードしｇＢの２８９カルボキシル末端ア ミノ酸を欠失するプラスミドでトランスフェクトされたＣＯ８細胞を用いて、一 過性発現の実験を行ったところ、このｇＢＢ形誘導体が、１０個の独立して得ら れたモノクローナル抗体と反応していることが示された（第４図およびバンクス ら（Ｂａｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　（印刷中）、　１ ９８９年、参照）。８つの反応性抗体が補体の存在下でウィルスを中和したが、 これに対して、１つの抗体は、中和に補体を必要とはしなかった。

また、１２の追加抗体が２ｇＢの２２７のカルボキシル末端アミノ酸を欠損する ｇＢＢ導体（ｐＸｇＢ８）を産生ずる安定細胞系と反応することも明かになった 。

これらの結果により１ｇＢ分子の中和ドメインの同定および位置が確立され２本 発明で説明されるｇＢ切切形タンクのウィルス中和特性が確認される。

本発明に関する技術分野における当業者に自明な１本発明を実施するための上述 した手法の改変は、以下に示す請求の範囲内にある。

二５ｉ計ｉ■ｊ蚕３曹コ卦ｐ蔦見；９＞ＦＥＨ卦ｊ弱ｊξ■ξξ目眠コミ藁５ぎ ｉｊｉ！、＋ｂ　＃Ｄ、。

■臣よコ囲コ３ヨヨ３４１誕屁と歴勃衰÷ま粍Ｇ　己巳６己　２１１−−ご６２ 　Ｇご６己　ＳととＳ訃’ｊ３Ｅ　！ｅｇ！ｊ　５’ｔＦ　Ｅｔ目Ｅ　Ｇ’ｔＷ Ｆ　社！ａｊよ旨日屁ｔｊ曾３５貧３葺コ５１１コ璽■補正書の翻訳文提出書（ 特許法第１８４条の８）平成２年７月３０日 ＰＣＴ／口５８９１００３２３ ２、発明の名称 組換えＣＭＶ中和タンパク ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４６０８エミリービル、ホートン　 ストリート　４５６０名称　カイロン　コーボレイション／ ４、代理人 住所　〒５３０大阪府大阪市北区西天満６丁目１番２号５、補正書の提出年月日 １９８９年１２月６日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　　１通ｕＬ会−と」駄」ユ １、組換えＣＭＶ糖タンパクｇｐ５５ポリペプチドであうで、該ポリペプチドは 、ＣＭＶゲノムによってコードされたものにより免疫学的に同定され得るエピト ープを含有する。

２６　請求項１に記載の組換えポリペプチドであって：前記エピトープは、免疫 学的にＣＭＶ中和抗体と反応する。

３、請求項２に記載の組換えポリペプチドであって、前記中和抗体は、モノクロ ーナル抗体１５Ｄ８である。

４、請求項２に記載の組換えポリペプチドであって、該ポリペプチドは、第２図 のＴｏｗｎｅ配列のアミノ酸残基４６１から９０７を有するｇｐ５５または実質 的にそれと相同な組換えポリペプチドである。

５、ＣＭＶ＠タンパクｇＢ内にコードされた切形の断片由来の組換えポリペプチ ドであって、該切形の断片は、免疫学的にＣＭＶ中和抗体と反応するエピトープ を含有する。

６、請求項５に記載の組換えポリペプチドであって、前記切形の断片は、第２図 のアミノ酸残基１から６８０または実質的にその領域に相同な断片をコードする 。

７、請求項５に記載の組換えポリペプチドであって、前記切形の断片は、第２図 のアミノ酸残基４６１から６８０または実質的にその領域に相同な断片をコード する。

８、請求項５に記載の組換えポリペプチドであって、前記切形の断片は、第２図 のアミノ酸残基４６１から６４６または実質的にその領域に相同な断片をコード する。

９、請求項５に記載の組換えポリペプチドであって、前記中和抗体は、モノクロ ーナル抗体１５Ｄ８である。

１０、ｇＢタンパクの開裂が効果的に抑制されるような。

変性内部タンパク分解開裂部位を有するＣＭＶ糖タシタ２８フ １１、請求項１０に記載の組換えポリペプチドであって。

前記変性により，アミノ酸配列が，タンパク分解開裂部位またはその付近におい て変化している。

１２、１求項１１に記載の組換えポリペプチドであって。

アルギニンまたはリジンは，開裂点に対応する，　　−１，　　−２。

および−４位においてトレオニンまたはグルタミン残基に置換されている。

１３、請求項１０に記載の組換えポリペプチドであって。

該ポリペプチドは，免疫学的に，ＣＭＶ中和抗体と反応するエピトープを含有す る切形のｇＢ断片由来である。

１４、請求項１３に記載の組換えポリペプチドであって。

該ポリペプチドは，膜内外および推定細胞質ドメインを欠損する１１０キロダル トンの非開裂タンパクである。

１５、ｔｆＩ求項１に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレ オチド。

１６。請求項１５に記載の組換えポリヌクレオチドであって，第２図のＴｏｗｎ ｅ配列のヌクレオチド１３８１から２７２１に対応するＤＮＡ配列を含有する。

１７、請求項５に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチ ド。

１８、請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチドの１から２７２１に対応するＤＮＡ配列を有する前 記切形のｇＢ断片をコードする。

１９、請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチド１３８１から１９３８に対応するＤＮＡ配列を有す る前記切形のｇＢ断片をコードする。

２０、請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチド１３８１から２０４０に対応するＤＮＡ配列を有す る前記切形のｇＢ断片をコードする。

２１、請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，前記エピトープは ，モノクローナル抗体１５Ｄ８と免疫学的に反応する。

２２、請求項１０に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオ チド。

２３、請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチドであって２ｇＢの内部タンパ ク開裂部位に対応する，　　−１，　　−２。

および−４位においてアルギニンまたはリジンがトレオニンまたはグルタミンの ためのコドンによりに置換されている。

２４、請求項１５に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクターであって，該 ベクターはそれ自身を複製および／または該ポリヌクレオチドによってコードさ れるポリペプチドを発現するのに効果的である。

２５、請求項１７に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクターであって，該 ベクターはそれ自身を複製および／または該ポリヌクレオチドによってコードさ れるポリペプチドを発現するのに効果的である。

２６、請求項１８に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクターであって，該 ベクターはそれ自身を複製および／または該ポリヌクレオチドによってコードさ れるポリペプチドを発現するのに効果的である。

２７、請求項２２に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクターであって，該 ベクターはそれ自身を複製および／または該ポリヌクレオチドによってコードさ れるポリペプチドを発現すのに効果的である。

２８、１求項２４に記載のベクターにより形質転換された原核細胞を有する発現 システム。

２９、請求項２５に記載のベクターにより形質転換された真核細胞を有し，該真 核細胞が，Ｉｌｉ乳類細胞および酵母細胞からなる群より選択される９発現シス テム。

３０、請求項２７に記載のベクターにより形質転換された真核細胞を有し．該真 核細胞が．１１乳類細胞または酵母細胞からなる群より選択される９発現システ ム。

３１、以下の工程を包含する，生物学的被検物においてＣＭＶ抗原に対する抗体 を検出するための免疫学的アッセイ：（ａ）抗体−抗原複合体を生成する条件の 下で，プローブポリペプチドとともに生物学的サンプルをインキ１ベートする工 程，ここで、該プローブポリペプチドは，ＣＭＶ糖タシタ２８フ は，ＣＭＶ中和抗体と免疫学的に反応するエピトープ゛を含有する；および （ｂ）該プローブ抗原を含有する抗体−抗原複合体を検出する工程。

３２、以下の工程を包含する，生物学的被検物においてＣＭＶ相同ＤＮＡ配列を 検出するためのＤＮＡハイブリダイゼーイーンアフセイ： ＜ａ＞二本鎖ＤＮＡの生成を促進する条件の下で，ＤＮＡプローブとともに生物 学的サンプルをインキュベートする工程，ここで、該ＤＮＡプローブは，ｇｐ５ ５ヌクレオチド配列由来である；および （ｂ）ＤＮＡプローブを含有する二本鎖ＤＮＡを検出する工程。

３３、１１求項３２に記載の方法であって．前記ＤＮＡプローブは，標識されて おり１．そして、該二本鎖ＤＮＡは，該標識の存在によって検出される。

３４、ヒトサイトメガロウィルスの感染に対するワクチンであって，該ワクチン は，ＣＭＶ中和抗体と免疫学的に反応するエピトープを有する，ＣＭＶ糖タシタ ２８フされるｇｐ５５由来の組換えポリペプチドを含有し．該組換えポリペプチ ドは、免疫学的に、受容され得るキャリア中に有効量存在し、り病性の個体に投 与されるとサイトメガロウィルスに対するウィルス中和活性が引き出される。

３５、ヒトサイトメガロウィルス感染に対するワクチンであって、該ワクチンは ｖｍ請求項に記載の組換えポリペプチドを、免疫学的に受容され得るキャリア中 に有効量含有し。

り病性の個体に投与されるとサイトメガロウィルスに対スるウィルス中和活性が 引き出される。

３６、請求項３５に記載のワクチンであって、前記切形の断片は、ｇｐ５５のア ミノ酸残基４６１から６４６をコードする。

３７、ヒトサイトメガロウィルス感染のための予防剤であって、該予防剤は、請 求項１０に記載の組換えポリペプチドを、免疫学的に受容され得るキャリア中に 有効量含有し、り病性の個体に投与されるとサイトメガロウィルスに対してウィ ルス中和活性が引き出される。

３８、ＩＩ求項ｌに記載の組換えポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗 体。

３９、請求項５に記載の組換えポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗体 。

国際調査報告

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＭＶゲノムによってコードされたものにより免疫学的に同定され得るエピ トープを含有するＣＭＶ糖タンパクｇＢ内にコードされた糖タンパクｇｐ５５由 来の組換えポリペプチド。
2. ２．請求項１に記載の組換えポリペプチドであって，前記エピトープは，免疫学 的にＣＭＶ中和抗体と反応する。
3. ３．請求項２に記載の組換えポリペプチドであって，前記中和抗体は，モノクロ ーナル抗体１５Ｄ８である。
4. ４．請求項２に記載の組換えポリペプチドであって，該ポリペプチドは，第２図 のアミノ酸残基４６１から９０７を有するｇｐ５５または実質的にそれと相同な 組換えポリペプチドである。
5. ５．ＣＭＶ糖タンパクｇＢ内にコードされた切形の断片由来の組換えポリペプチ ドであって，該切形の断片は，免疫学的にＣＭＶ中和抗体と反応するエピトープ を含有する。
6. ６．請求項５に記載の組換えポリペプチドであって，前記切形の断片は，第２図 のアミノ酸残基１から６８０または実質的にその領域に相同な断片をコードする 。
7. ７．請求項５に記載の組換えポリペプチドであって，前記切形の断片は，第２図 のアミノ酸残基４６１から６８０または実質的にその領域に相同な断片をコード する。
8. ８．請求項５に記載の組換えポリペプチドであって，前記切形の断片は，第２図 のアミノ酸残基４６１から６４６または実質的にその領域に相同な断片をコード する。
9. ９．請求項５に記載の組換えポリペプチドであって，前記中和抗体は，モノクロ ーナル抗体１５Ｄ８である。
10. １０．ｇＢタンパクの開裂が効果的に抑制されるような，変性内部タンパク分解 開裂部位を有するＣＭＶ糖タンパクｇＢ内にコードされる組換えポリペプチド。
11. １１．請求項１０に記載の組換えポリペプチドであって，前記変性により，アミ ノ酸配列が，タンパク分解開裂部位またはその付近において変化している。
12. １２．請求項１１に記載の組換えポリペプチドであって，アルギニンまたはリジ ンは，開裂点に対応する，−１，−２，および−４位においてトレオニンまたは グルタミン残基に置換されている。
13. １３．請求項１０に記載の組換えポリペプチドであって，該ポリペプチドは，免 疫学的に，ＣＭＶ中和抗体と反応するエピトープを含有する切形のｇＢ断片由来 である。
14. １４．請求項１３に記載の組換えポリペプチドであって，該ポリペプチドは，膜 内外および推定細胞質ドメインを欠損する１１０キロダルトンの非開裂タンパク である。
15. １５．請求項１に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチ ド。
16. １６．請求項１５に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチド１３８１から２７２１に対応するＤＮＡ配列を含有 する。
17. １７．請求項５に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチ ド。
18. １８．請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチドの１から２７２１に対応するＤＮＡ配列を有する前 記切形のｇＢ断片をコードする。
19. １９．請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチド１３８１から１９３８に対応するＤＮＡ配列を有す る前記切形のｇＢ断片をコードする。
20. ２０．請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，該ポリヌクレオチ ドは，第２図のヌクレオチド１３８１から２０４０に対応するＤＮＡ配列を有す る前記切形のｇＢ断片をコードする。
21. ２１．請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチドであって，前記エピトープは ，モノクローナル抗体１５Ｄ８と免疫学的に反応する。
22. ２２．請求項１０に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオ チド。
23. ２３．請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチドであって，ｇＢの内部タンパ ク開裂部位に対応する，−１，−２，および−４位においてアルギニンまたはリ ジンがトレオニンまたはグルタミンのためのコドンにより置換されている。
24. ２４．請求項１５に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクター。
25. ２５．請求項１７に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクター。
26. ２６．請求項１８に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクター。
27. ２７．請求項２２に記載のポリヌクレオチド配列を有するベクター。
28. ２８．請求項２４に記載のベクターにより形質転換された原核細胞を有する発現 システム。
29. ２９．請求項２５に記載のベクターにより形質転換されたる真核細胞を有し，該 真核細胞が，哺乳類細胞および酵母細胞から選択される，発現システム。
30. ３０．請求項２７に記載のベクターにより形質転換された真核細胞を有し，該真 核細胞が，哺乳類細胞または酵母細胞から選択される，発現システム。
31. ３１．以下の工程を包含する，生物学的被換物においてＣＭＶ抗原に対する抗体 を検出するための免疫学的アッセイ：（ａ）抗体−抗原複合体を生成する条件の 下で，プローブポリペプチドとともに生物学的サンプルをインキュベートする工 程，ここで，該プローブポリペプチドは，ＣＭＶ糖タンパクｇＢ内でコードされ る切形の断片からなり，該切形の断片は，ＣＭＶ中和抗体と免疫学的に反応する エピトープを含有する；および （ｂ）該プローブ抗原を含有する抗体−抗原複合体を検出する工程。
32. ３２．以下の工程を包含する，生物学的被検物においてＣＭＶ相同ＤＮＡ配列を 検出するためのＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ： （ａ）二本鎖ＤＮＡの生成を促進する条件の下で，ＤＮＡプローブとともに生物 学的サンプルをインキュベートする工程，ここで，該ＤＮＡプローブは，ｇｐ５ ５ヌクレオチド配列由来である；および （ｂ）ＤＮＡプローブを含有する二本鎖ＤＮＡを検出する工程。
33. ３３．請求項３２に記載の方法であって，前記ＤＮＡプローブは，標識されてお り，そして，該二本鎖ＤＮＡは，該標識の存在によって検出される。
34. ３４．ヒトサイトメガロウィルスの感染に対するワクチンであって，該ワクチン は，ＣＭＶ中和抗体と免疫学的に反応するエピトープを有する，ＣＭＶ糖タンパ クｇＢ内にコードされるｇｐ５５由来の組換えポリペプチドを含有し，該組換え ポリペプチドは，免疫学的に，受容され得るキャリア中に有効量存在し，り病性 の個体に投与されるとサイトメガロウィルスに対するウィルス中和活性が引き出 される。
35. ３５．ヒトサイトメガロウィルス感染に対するワクチンであって，該ワクチンは ，請求項５に記載の組換えポリペプチドを，免疫学的に受容され得るキャリア中 に有効量含有し，り病性の個体に投与されるとサイトメガロウィルスに対するウ ィルス中和活性が引き出される。
36. ３６．請求項３５に記載のワクチンであって，前記切形の断片は，ｇｐ５５のア ミノ酸残基４６１から６４６をコードする。
37. ３７．ヒトサイトメガロウィルス感染のための予防剤であって，該予防剤は，請 求項１０に記載の組換えポリペプチドを，免疫学的に受容され得るキャリア中に 有効量含有し，り病性の個体に投与されるとサイトメガロウィルスに対してウィ ルス中和活性が引き出される。
38. ３８．請求項１に記載の組換えポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗体 。
39. ３９．請求項５に記載の組換えポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗体 。