JP5833565B2 - ヒトサイトメガロウイルスに対する結合メンバー - Google Patents
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Description
いくつかの高度に強力で、gB特異的なhCMV中和ヒト抗体が、本明細書において記載され、これらはまた、完全に新しいhCMV中和エピトープを認識し、そのため、hCMVに対して特異的な他のすべての既知の抗体と比較して、異なる治療原理によって作用する。それらの発見および機能的特徴付けは、さらに下記に開示される。実施例においてより詳細に記載されるように、50の完全ヒトhCMV中和抗体が、同定された。それらは、hCMVに感染したドナーに由来する、EBV形質転換ヒト末梢血由来B細胞から単離された。抗体1〜50のCDR配列は、表19および20において詳述されるとおりである。抗体1〜46のパネルのためのVHドメインおよびVLドメインの組合せは、表7において詳述されるとおりである。表7および19において言及される配列はすべて、本開示の一部を形成する、添付の配列表において示される。
HCDR1がアミノ酸配列配列番号3を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号4を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号5を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号93を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号94を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号95を有する
CDRのセットから22以下のアミノ酸改変を有する、hCMVに対する単離結合メンバーを提供する。
Glyと交換されたKabat残基Asp31;
PheまたはTyrと交換されたKabat残基His32;
IleまたはLeuと交換されたKabat残基Met34;および
Asnと交換されたKabat残基Val35。
SerまたはCysと交換されたKabat残基Trp50;
AsnまたはHisと交換されたKabat残基Gln53;
Thrと交換されたKabat残基Ser54;
Lys、AsnまたはHisと交換されたKabat残基Gly58;
Alaと交換されたKabat残基Gly60;および
Argと交換されたKabat残基Gln64。
Alaと交換されたKabat残基Thr99;
Metと交換されたKabat残基Val100;
Thrと交換されたKabat残基Ser100A;
Thrと交換されたKabat残基Asn100B;
Pheと交換されたKabat残基Ser100C;
MetまたはAlaと交換されたKabat残基Leu100E;
Glyと交換されたKabat残基Ser100F;
Tyrと交換されたKabat残基His100K;
SerまたはAspと交換されたKabat残基Asn100L;
ValまたはIleと交換されたKabat残基Arg100M;
Metと交換されたKabat残基Leu100N;
Glyと交換されたKabat残基Asp101;および
ValまたはIleと交換されたKabat残基Ala102。
Alaと交換されたKabat残基Gly89;
Trpと交換されたKabat残基Pro91;
Serと交換されたKabat残基Arg93;
Aspと交換されたKabat残基Ser94;
GlyまたはAlaと交換されたKabat残基Ser95a;
Kabat残基95bに挿入されたAla;
Tyrと交換されたKabat残基Val96;および
Valと交換されたKabat残基Ile97。
本明細書において使用される場合の「および/または」が、他を伴うまたは伴わない2つの指定される特徴または構成成分のそれぞれの特定の開示として理解されることとなることをここで明らかにすることは好都合である。たとえば、「Aおよび/またはB」は、それぞれが本明細書において個々に説明されるかのように、(i)A、(ii)B、ならびに(iii)AおよびBのそれぞれの特定の開示として理解されることとなる。
ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)の完全長アミノ酸配列は、GenBank受託番号X17403(ヒトサイトメガロウイルス株AD169の完全なゲノム)を有し、229354塩基対配列を含む(Chee et al., 1990; Bankier et al., 1991)。
gB複合体は、CMVのビリオンエンベロープの表面糖タンパク質複合体である。gBタンパク質の多くの異なる株がある:
gB株AD169−SwissProt受託番号P06473(配列番号239)
gB株Towne−SwissProt受託番号P13201(配列番号240)
gBの既知の中和ドメインは、抗原性ドメイン1(AD−1;配列番号239[AD169]のアミノ酸552〜635)および抗原性ドメイン2(AD−2;配列番号239[AD169]のアミノ酸67〜86)を含む。さらなる抗原性ドメイン、AD−3もまた、存在する(配列番号239[AD169]のアミノ酸783〜906)。このドメインは、ウイルス内部に(intravirally)位置し、中和抗体の標的ではない。
これは、互いに結合する1対の分子のうちの一方のメンバーを説明する。結合対のメンバーは、天然に誘導されてもよいまたは全体的にもしくは部分的に合成して生成されてもよい。結合対の一方のメンバーは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、RNA干渉(RNAi;Milhavet et al., 2003を参照されたい)、アンチセンス(Opalinska & Gewirtz, 2003を参照されたい)、組換えタンパク質、抗体、またはその断片またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質であってもよい。
これは、天然にまたは部分的にもしくは全体的に合成して生成されるかどうかに関わらず、免疫グロブリンを説明する。用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明は、天然形態をした抗体に関するものではない、すなわち、それらは、自然環境にないが、それらは、天然の供給源から単離するもしくは精製によって得るまたは他の場合には、遺伝子組換えによってもしくは化学合成によって得ることができ、そういう訳で、それらは、非天然アミノ酸を含有することができることを本明細書で理解されなければならない。抗体抗原結合部位を含む抗体断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’−SH、scFv、Fv、dAb、およびFdなどのような分子を含むが、これらに限定されない。たとえばFab2、Fab3、二重特異性抗体(diabody)、三重特異性抗体(triabody)、四重特異性抗体(tetrabody)、およびミニボディ(minibody)ならびにさらに二特異性および三特異性(trispecific)抗体を含む、1つまたは複数の抗体抗原結合部位を含む様々な他の抗体分子が、遺伝子操作されてきた。抗体分子ならびにそれらの構築および使用のための方法は、Hollinger & Hudson (2005)において記載されている。
これは、標的抗原のすべてまたは一部に結合し、それに相補的である分子の一部を説明する。抗体分子では、それは、抗体抗原結合部位と呼ばれ、標的抗原のすべてまたは一部に結合し、それに相補的である抗体の一部を含む。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の一部にのみ結合してもよく、その一部は、エピトープと称される。抗体抗原結合部位は、1つまたは複数の抗体可変ドメインによって提供されてもよい。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含んでいてもよい。
これは、本発明の結合メンバーまたはそのような結合メンバーをコードする核酸が、一般に、本発明に従う状態を指す。したがって、たとえば、実質的に純粋なもしくは均一な形態をした、または核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子がないもしくは実質的にない、それらの天然の環境から単離されたならびに/または精製された本発明による結合メンバー、VHおよび/またはVLドメイン、およびコード核酸分子、ならびにベクターが提供されてもよい。単離メンバーおよび単離核酸は、それらが他のポリペプチドなどのような、天然に関連する物質またはそれらが天然環境またはそのような調製がインビトロでもしくはインビボで実施される組換えDNA技術によるものである場合、それらが調製される環境(たとえば細胞培養)において見つけられる核酸がないまたは実質的にないであろう。メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに処方されてもよく、なお、実際的な目的のために単離されてもよく、たとえば、メンバーは、イムノアッセイにおける使用のためにマイクロタイタープレートをコートするために使用される場合、通常、ゼラチンまたは他のキャリアと混合されるであろうまたは診断もしくは療法において使用される場合、薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤と混合されるであろう。結合メンバーは、天然にまたは異種真核細胞(たとえばCHO細胞もしくはNS0細胞)の系によってグリコシル化されてもよいまたはそれらは、たとえば、それらが原核細胞における発現によって生成される場合、グリコシル化されなくてもよい。
上記に言及されるように、本発明に従う結合メンバーは、hCMVの生物学的活性を調整し、中和してもよい。高い効力の結合メンバーは、最初のスクリーニング、たとえば生物学的hCMV中和アッセイから直接得られてもよい。アッセイおよび効力は、より詳細に本明細書において別記される。
・抗原に特異的な既知の抗体と比べた、抗原に対する結合親和性の増加
・活性が知られている場合、抗原に特異的な既知の抗体と比べた、抗原活性の中和の増加
・特定のモル比での、抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの特定の競合的能力。
・複合体を免疫沈降する能力
・たとえば直線状でスクリーニングされたペプチドを使用する直線状エピトープなどのような特定のエピトープおよび/または非連続的な残基によって形成される制限された立体構造もしくは立体構造エピトープに結合する能力
・hCMVの新しい生物学的活性または下流分子を調整する能力を含むが、これらに限定されない。そのような方法もまた、本明細書において提供される。
ドナーのインフォームドコンセントを得た後に、末梢血(300ml)を健康なhCMV血清陽性血液ドナーから収集し、この血清を、高いgB結合力価および効率的なhCMV中和活性についてあらかじめスクリーニングした。末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll密度勾配遠心分離(Lymphoflot、Biotest、Dreieich、Germany)によって精製した。抗ヒトCD22マイクロビーズ(Mitenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)を使用するB細胞濃縮後に、B細胞を以下の試薬を用いて標識した:a.抗ヒトCD19−FITC(Miltenyi Biotec、Germany);b.抗ヒトCD27−PE(BD Bioscience Pharmigen、Basel、Switzerland);c.抗ヒトIgG−bio(Jackson Immuno−Research、West Grove、PA、USA);d.ストレプトアビジン、Alexa Fluor(登録商標)350コンジュゲート(Molecular Probes Inc、Eugene、OR、USA)、およびe.Cy5標識糖タンパク質B(1×106 B細胞当たり100ng)。gB特異的IgG陽性記憶B細胞は、以下の4つの基準を満たした細胞をソートすることによって単離した:FITC+/PE+/Alexa Fluor(登録商標)350+およびCy5+(図2を参照されたい)。その代わりに、B細胞を以下の試薬を用いて標識した:a.抗ヒトCD19−PerCP(Dianova、Hamburg、Germany);b.抗ヒトCD27−PE(BD Bioscience Pharmigen、Basel、Switzerland);c.抗ヒトIgG−FITC(Dianova、Hamburg、Germany);d.Cy5標識糖タンパク質B(1×106 B細胞当たり100ng)。これらのgB特異的IgG陽性記憶B細胞は、FACSCalibur(登録商標)(Becton Dickinson、Heidelberg、German)を使用して分析したまたは基準PerCP+/PE+/FITC+およびCy5+を満たした細胞をソートすることによって単離した。
gB特異的培養上清は、hCMVゲノム中にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現カセットを含有し、標的細胞の感染に際してルシフェラーゼ酵素の発現をもたらすhCMV組換え株AD169(HB15−UL84prluc)を使用して、中和活性についてスクリーニングした(Prof.Dr.Thomas Stamminger、Institute of Clinical and Molecular Virology、University Hospital Erlangen、Germanyにより親切にも提供された)。ウイルス上清における感染力価は、Mahy & Kangro (1996)において記載されるように、96ウェルプレート上で一次線維芽細胞(HFFまたはMRC−5細胞のいずれか)においてTCID50アッセイによって決定した。ルシフェラーゼベースの中和アッセイについて、等容量のgB特異的培養上清および力価AD169△Luc上清(300pfu)を、96U底マイクロプレートにおいて1時間、37℃でインキュベートした。抗体ウイルス混合物を、先に接種したHFF単層上に移した。4時間の37℃でのさらなるインキュベーション後に、抗体ウイルス混合物を完全培地と交換した。37℃でのさらに42時間のインキュベーションに続いて、細胞をウェル当たり100μl Glo溶解バッファー(Promega、Madison、WI)を用いて溶解させた。30μlのそれぞれの溶解ウェルを、白色96ウェルLIAプレート(Greiner Bio−one、Frickenhausen、Germany)の中に配置した。ウェル当たり、50μLアッセイバッファー(15mM KH2PO4、25mMグリシルグリシン、1M MgSO4、0.5M EGTA、5mM ATP、1mM DTT)を添加した。ウェル当たり50μLのD−ルシフェリン(P.J.K.、Kleinbittersdorf、Germany)溶液(25mMグリシルグリシン、1M MgSO4、0.5M EGTA、2mM DTT、および0.05mM D−ルシフェリンにおいて)の注入および化学発光の検出は、Centro LB 960 Luminometer(Berthold Technologies、Bad Wildbad、Germany)によって実行した。MicroWin2000ソフトウェア(Mikrotek Laborsysteme、Overath、Germany)を分析のために使用した。ルミノメーターによって測定した相対的な光単位(RLU)は、以下の計算を使用して、中和パーセントで表した。
中和%=100×(V0−Vn)/V0
式中、Vnは、ウイルスおよび抗体を含有するウェルにおけるRLUを示し、V0は、ウイルスのみを含有したウェルにおけるRLUを示す。第1のスクリーニングは、hCMV感染性を中和した9つのgB特異的培養上清を明らかにし、第2のスクリーニングは、hCMV感染性を中和した3つのさらなるgB特異的培養上清を明らかにした。9つのEBV不死化記憶B細胞系およびそれらによって生成された中和抗体は、SM1、SM3、SM4、SM5、SM6、SM7、SM9、SM10、およびSM11と命名した(下記表1を参照されたい)。3つのさらなるEBV不死化記憶B細胞系およびそれらによって生成された中和抗体は、SM12、2C2、および1G2と命名した(下記表1を参照されたい)。
実施例3.1〜3.4において、9つのEBV形質転換ヒトB細胞系由来の抗hCMV中和抗体(SM1、3〜7、9〜11)の可変領域は、セミネステッドPCR(semi−nested PCR)によって増幅し、適切な免疫グロブリン定常領域を含有するpCDNA3ベクター(Invitrogen)においてクローニングした。これらのコンストラクトは、続いて、CHO細胞をトランスフェクトするために使用し、発現させた抗体は、第1のスクリーニングのために、懸濁アレイ技術および表面プラズモン共鳴(Biacore(登録商標)、GE Healthcare)(実施例5)および中和アッセイ(実施例4)を使用して試験した。実施例3.5〜3.7において、4つのEBV形質転換ヒトB細胞系由来の抗hCMV中和抗体(SM10、SM12、2C2、および1G2)の可変領域は、ネステッドPCRによって増幅し、Tiller et al., 2008において記載される方法に従って適切な免疫グロブリン定常領域を含有する発現ベクターにおいてクローニングした。これらのコンストラクトは、続いて、HEK 293T細胞をトランスフェクトするために使用し、発現させた抗体は、最初のスクリーニングの一部として中和アッセイ(実施例4)において試験した。
EBV形質転換記憶B細胞系SM1、3〜7、および9〜11の凍結細胞ペレットを、TRIZOL(登録商標)試薬(Invitrogen)と共に全RNA精製に付した。細胞ペレットは、−80℃のフリーザーから取り出し、TRIZOL(登録商標)を用いて直ちに溶解させた。室温での5分間のインキュベーション後に、1mlのTRIZOL(登録商標)当たり0.2mlのクロロホルム(Roth、Germany)を添加し、チューブを、1分間、穏やかに混合した。溶解物は、氷上で3分間インキュベートし、4℃で15分間、14000rpmで遠心分離した。水性の上部の相を新鮮なチューブに移し、1mlのTRIZOL(登録商標)当たり0.5mlのイソプロパノール(Roth、Germany)を添加した。室温での10分間のインキュベーション後に、チューブを4℃で10分間、14000rpmで遠心分離した。上清は、廃棄し、RNAペレットは、1mlの70%エタノール(Roth、Germany)を用いて洗浄した。ペレットは、室温で10〜15分間、空気乾燥させ、30〜50μlのRNアーゼなしの再蒸留水(Fermentas Life Sciences)の添加によって、また、55℃での10分間のインキュベーションによって、溶解させた。RNA濃度は、UV分光測光法によって測定し、RNA試料は、−80℃で保存した。第1鎖cDNA合成は、製品のマニュアルに従って、RevertAid(商標)第1鎖cDNA合成キット(Fermentas Life Sciences)を使用して実行した。
ヒト抗体の可変コード領域をセミネステッドPCRによって増幅した。セミネステッドPCRは、両方とも同じプログラム(TDNPCR1;下記の表4a)を用い、異なる5’フォワードプライマーおよび同じ3’リバースプライマーミックス(下記表5;ともにすべてJ−セグメントプライマー)を用い、2つの連続PCR(PCRパラメーターは下記表3に示す)を動かすことによって実行した。第1のPCRのための鋳型として、1μlcDNAを使用した。第2のPCRについては、第1のPCR由来の1μlのPCR産物を使用した(希釈せずまたは第1のPCR後のDNA収率に依存して1:10〜1:100に希釈)。すべてのEBV系のcDNAを、すべてのVH、Vκ、およびVλプライマーの組合せを使用して増幅した。異なる5つのフォワードプライマーを、カッパ軽鎖可変領域を増幅するために、5つのリバースプライマーと組み合わせて使用した(表5a)。異なる3つのフォワードプライマーを、ラムダ軽鎖可変領域を増幅するために、4つの異なるリバースプライマーと組み合わせて使用した(表5b)。異なる6つのフォワードプライマーを、重鎖可変領域を増幅するために、4つの異なるリバースプライマーと組み合わせて使用した(表5c)。
増幅した可変領域は、適切な免疫グロブリン重鎖および軽鎖定常領域を含有するpCDNA3ベクター(Invitrogen)の中にクローニングした。重鎖可変領域のクローニングのために、コンストラクトpd1612−Je(pCDNA3−EGFP−Cγ)は、HindIII/Eco47IIIを用いて消化し(6505bpおよび727bpの2本のバンドを生成する)、CIPを用いて脱リン酸し、6505bp断片をゲル精製した。ラムダ軽鎖可変領域のクローニングのために、コンストラクトpd1864−Je(pCDNA3−2−4 Vλ2−AvrII(−)は、HindIII/AvrIIを用いて消化し(5858bpおよび394bpの2本のバンドを生成する)、CIPを用いて脱リン酸し、5858bp断片をゲル精製した。カッパ軽鎖可変領域のクローニングのために、コンストラクトpd703−Je(pCDNA3−ITC88 Vκ)は、HindIII/Eco47IIIを用いて消化し(6050bpおよび392bpの2本のバンドを生成する)、CIPを用いて脱リン酸し、6050bpのバンドをゲル精製した。
増幅した抗体可変領域のPCR産物は、ゲル精製し、HindIII/Eco47III(重鎖およびカッパ軽鎖可変領域)またはHindIII/AvrII(ラムダ軽鎖可変領域)を用いて消化し、次いで、酵素メーカーによって推奨されるようにT4DNAリガーゼを使用して、適切な免疫グロブリン定常領域を含有するpCDNA3ベクターの中にインフレームでライゲーションした。DNAライゲーションは、16℃で一晩実行した。この方法に対する例外として、抗体可変領域、SM1 Vλ1、SM4 Vλ1、およびSM9 Vλ2のPCR産物は、最初に、平滑末端ライゲーションキット(Invitrogen)のユーザーマニュアルに従ってPCR4Blunt−TOPO(Invitrogen)の中に平滑末端でライゲーションした。様々なミニプレップの配列を分析した後に、真のVλ配列を含有する特有のクローンを、HindIII/AvrIIを用いて消化し、可変領域をゲル精製し、適切なpCDNA3ベクターの中にサブクローニングした(pd 1864−Je;下記を参照されたい)。1μlのそれぞれのライゲーションをDH10B細胞の中にエレクトロポレーションした(1900V/5ミリ秒)。次いで、200μlのエレクトロポレーションした細菌を、LB寒天+100μg/mlアンピシリンプレート上で平板培養した。それぞれのコンストラクトから、約10のコロニーを採集し、一晩成長させ、ミニプレップを実行した(それぞれのコロニーはまた、LB寒天+100μg/mlアンピシリンプレート上に画線した)。陽性クローンを同定するための対照の消化は、重鎖またはカッパ軽鎖を有するコンストラクトについてはHindIII/Eco47III(H/E)を用い、ラムダ軽鎖を有するコンストラクトについてはHindIII/AvrII(H/A)を用いて実行した。陽性クローンは、プライマー179−Je(配列:5’ AGA GAA CCC ACT GCT TAC TG 3’;配列番号196)を用いてDNA配列決定によって分析した。
EBV形質転換記憶B細胞系SM10、SM12、2C2、1G2由来の凍結細胞ペレットのRNA精製は、メーカーのマニュアルに従ってRNeasy(登録商標)Mini Kit(Qiagen)を使用して実行した。cDNA合成は、メーカーの説明書に従ってTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche)を使用して実行した。
上記の実施例3.5において合成したcDNAから、ヒト抗体の可変コード領域を、鋳型として1〜2μlのcDNAから開始し、2つの連続PCR(PCRパラメーターは下記表8において示す)を実行することによってネステッドPCRによって増幅した。両方のPCR反応は、同じプログラム(表9)を用い、異なる5’フォワードプライマーおよび3’リバースプライマー(表10)を用いて実行した。鋳型として、第1のPCRラウンドについては、50ngの鋳型cDNAを使用し、第2のPCRラウンドについては、第1のPCRラウンド由来の1〜2μlのPCR産物(QIAGEN PCR Purification Kitを使用して精製)を使用した。すべてのEBV系のcDNAは、表10aにおいて示される、第1のPCRラウンドについてのVH、Vκ、およびVλプライマーの組合せならびに表10bにおいて示される、第2のPCRラウンドについてのVH、Vκ、およびVλプライマーの組合せを使用して増幅した。PCRの第2ラウンドについては、「最良適合」プライマーを、PCRの第1のラウンドから得られた配列について選択した(表2、Tiller et al.、同書)。
クローニング前に、一定分量のVH、Vκ、およびVλ鎖第2PCR産物を、メーカーの説明書に従ってQUIAGEN PCR Purification Kitを用いて精製し、それぞれフォワードまたはリバースプライマーを用いて配列決定した(表10)。配列は、最も高い同一性を有する生殖系列V(D)J遺伝子セグメントを同定するために、IgBLAST(GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)によって分析した。
クローニング抗hCMV抗体のさらなる特徴付けには、それらの発現および続く精製を必要とした。46の組換え抗体(Ab−01〜Ab−46)は、CHO細胞(DSMZ、Braunschweig、DE)の一時的なトランスフェクションによって発現させた。手短に言えば、細胞は、2%FCS(Sigma)を含有するSF−IMDM培地(Invitrogen)において、皿当たり2.2×106細胞の密度で細胞培養皿(直径10cm;Greiner Bio−one、GmbH)に接種した。24時間後に、トランスフェクション混合物は、1ml MEM(PAA Laboratories)を、皿当たり、重鎖についての6.45μgの発現プラスミド、軽鎖についての6.45μgの発現ベクター、および12.9μlのMATraトランスフェクション試薬(IBA GmbH、Goettingen、DE)と混合することによって調製した。このトランスフェクション混合物は、室温で20分間、インキュベートした。接種した細胞の培地は、10mlのMEMと交換し、トランスフェクション混合物を細胞に滴下した。続いて、培養皿は、15分間、磁性プレート(IBA GmbH)上でインキュベートした。次いで、培地を吸引し、極めて低いレベルのウシIgG(Lonza)を含有する2%のFCSを有する10mlのSF−IMDM培地を細胞に添加した。24時間後に、培地を新しくした。さらに2日後に、培地を新しくし、組換え抗体を含有する上清は、5分間、244gでの遠心分離によって採取した。3日後に、調整細胞培養上清を、遠心分離によって再び採取し、きれいにした抗体含有上清をプールした。
5.1:懸濁アレイ技術(Luminex(登録商標))を使用するhCMV抗体の定量
ヒトIgGを含有する細胞培養上清は、アッセイバッファー(Roche、Cat# 1112589)中で希釈し、希釈液は、96ハーフウェルプレート(Corning、Cat#3 884)中で二通り評価した。手短に言えば、25μl試料は、抗ヒトIgG−Fc特異的(Caltag、Cat#H10500)をアミン結合によってロードした1200Luminex−COOHビーズを含有する5μlと共に1時間、暗中で(20℃、650rpm)インキュベートした。標準曲線は、2つ組の25μlの1:3希釈系列(0.08〜60ng/ml)のChromPureヒトIgG全分子(Jackson Immuno−Research、USA Cat# 009−000−003)を使用して作成した。検出は、R−PE(5μg/ml;JIR Cat# 109−116−098)により標識した30μl抗ヒトIgG−Fc特異的の添加および1時間のさらなるインキュベーションによって行った。次いで、プレートは、以下の設定を使用し、Luminex(登録商標)200機器(Millipore)を使用して、読み取り、分析した:100ビーズ、50μl試料サイズ。
gB(hCMV)を含有する細胞培養上清は、アッセイバッファー(Roche Cat# 1112589)中で希釈し、希釈液は、96ウェルフィルタープレート(Millipore Cat# MABVN 1250)において三通り評価した。手短に言えば、25μl試料は、社内で以前に同定された、中和しないが、非常に高い親和性hCMV特異的抗体であるヒト抗hCMV−IgG抗体 VH3/65−Vκ1/19をアミン結合によってロードした1500Luminex−COOHビーズを含有する5μlと共に1.5時間、暗中で(20℃、650rpm)インキュベートした。標準曲線は、三通りの25μlの1:3希釈系列(6〜1458ng/ml)のgBを使用して作成した。プレートは、バキュームマニホールドを使用して、2回(ウェル当たり100μl PBS)洗浄し、検出のために、50μlビオチン化抗hCMV−IgG抗体ITC52(5μg/ml;社内で作成;Ohlin et al., 1993)をさらに1.5時間、添加した。2回の洗浄工程(それぞれ100μl PBSを用いる)後、Luminex(登録商標)200機器(設定:100ビーズ、40μl試料サイズ)を使用して、プレートを読み取り、分析する前に、R−PE(Invitrogen、Cat# A2660)により標識した50μl/ml 1.2μg Neutravidinを30分間、添加した。
タンパク質間相互作用は、Biacore(登録商標)T100制御ソフトウェアv2.0.1を用い、Biacore(登録商標)T100機器(Biacore、GE Healthcare、Munich)を使用して、表面プラズモン共鳴技術によって分析した。相互作用はすべて、P20(0.05%)と共に1×DPBS中で25℃で分析した。結合相互作用はそれぞれ、少なくとも2回アッセイした。hCMV gBタンパク質は、標準的なアミン結合手順を介してCM5センサーチップ(カルボキシメチル化デキストランマトリックス、GE Healthcare)のフローセルにつないだ。カルボキシメチル化デキストランマトリックスは、メーカー(GE Healthcare)の説明書に従って、0.4M 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)および0.1M N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いて活性化した。2つのフローセルを活性化し、gBタンパク質を、10mM酢酸ナトリウム、pH5.0を用いて50μg/mlまで希釈し、結合実験(5,000共鳴単位)または反応速度実験(2,000共鳴単位)についての結合の適切なレベルに達するまで、5μl/分の流速で注入した。非反応性の基は、1M エタノールアミン−HCl、pH8.5の注入によって不活性化した。対照フローセルは、したがって、pH4.0で、オバルブミン(ovalbumine)(Imject、Pierce、Thermo Fisher Scientific、Schwerte、lot.JF124260)を用いて調製した。結合実験前に、フローセルは、ランニングバッファーを用いて徹底的に洗浄した。
hCMV研究所株および臨床分離株は、いくつかのgB遺伝子型において分類された(Chou and Dennison, 1991)。抗HCMV抗体の50%中和活性は、読取りとして間接免疫蛍光法を使用し、さらなる異なるhCMV gB遺伝子型を使用して決定した。ウイルス株Towne、AD169、および臨床分離株Altuは、gB−遺伝子型1、gB−遺伝子型2、およびgB−遺伝子型3としてそれぞれ分類される。ウイルス株はすべて、標準的な手順によってヒト包皮線維芽細胞(HFF)上で増やし、ウイルス上清における感染性のタイターは、Mahy & Kangro (1996)において記載される方法によって決定した。間接免疫蛍光法アッセイは、Andreoni et al. (1989)において記載されるように実行した。手短に言えば、6つのモノクローナル抗体(抗体Ab−04、Ab−11、Ab−14、Ab−19、Ab−28、およびAb−42)の2倍段階希釈溶液を、37℃で1時間、それぞれのHCMV gB遺伝子型の力価量(300pfu)と共にインキュベートした。インキュベーション後に、ウイルス−抗体混合物は、96ウェルマイクロプレートにおいてコンフルエンスまで成長させHFF培養物に添加した。試料はすべて、三通り試験した。ウイルス上清は、37℃での4時間のインキュベーション後に、HFFから除去し、完全培地と交換した。さらに16〜20時間のインキュベーション期間後に、細胞は、洗浄し、エタノールを用いて固定した。感染細胞は、hCMVの主要最初期(IE)タンパク質、UL123に対して特異的なモノクローナル抗体p63−27およびCy3コンジュゲート抗マウスIgG二次抗体(Jackson ImmunoResearch、USA)を使用して染色した。広範囲な洗浄に続いて、IE陽性の核を蛍光顕微鏡下でカウントし、中和パーセントを以下のように計算した:
中和%=100×(V0−Vn)/V0
式中、Vnは、ウイルスおよび抗体を含有するウェルにおけるIE陽性の核の数であり、V0は、ウイルスのみと共にインキュベートしたウェルにおけるIE陽性の核の数である。一般に、感染用量は、ウェル当たり1000の感染細胞を生成するように調節した。下記表16は、異なるgB遺伝子型を示すhCMVに対する様々な組換え抗体の50%中和活性を概説する。試験したモノクローナル抗体は、同等の効率により、hCMV gB遺伝子型1、2、および3を中和することが分かった。
先の実施例において記載される中和アッセイはすべて、標的細胞として線維芽細胞を使用して実行した。以前に同定された中和組換え抗体が内皮、上皮、および樹状細胞の感染を中和することもできるかどうかを調査するために、内皮および上皮親和性HCMV分離株TB40E(寛大にもDr.Christian Sinzger、Institute of Medical Virology and Epidemiology of Viral Diseases、University of Tuebingen、Germanyからの贈与である)を利用した。TB40Eは、HFFにおいて増やし、ウイルス上清における感染性の力価は、Mahy & Kangro (1996)によって記載されるように決定した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)は、EGM−2MVキット(Lonza、Verviers、Belgium)を補足した内皮細胞基本培地EBM−2において培養し、継代4〜7で実験のために使用した。ヒトARPE−19網膜色素上皮細胞(ATCC CRL−2302)は、Dulbeccoの修飾イーグル培地:2.5mMグルタミン、15mM Hepesバッファー、ピリドキシンHCl、55mg/lのピルビン酸ナトリウム、10%ウシ胎児血清(熱失活)、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(PAN−Biotech、Aidenbach、Germany)を補足した栄養素混合物F12、1:1混合物において増やした。一次樹状細胞(DC)は、以下のように単離した:HCMV血清陰性血液ドナーの精製末梢血単核細胞(PBMC)を、37℃で、2時間、自己由来の血清(2% v/v、熱失活)の存在下において、2mMグルタミン、10mM Hepesバッファー、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを補足したRPMI−1640培地においてインキュベートした。インキュベーション期間に続いて、非接着細胞は、細胞培養培地を用いて洗浄することによって除去し、接着単球は、単離2および4日後の、IL−4(25u/ml)およびgm−CSF(800u/ml)(CellGenix Technologie Transfer GmbH、Freiburg、Germany)の添加後にDCに分化した。6日目に、中和アッセイは、上記に記載されるように、37℃で1時間、抗体およびウイルスをインキュベートすることによって実行した。DCの感染は、500倍高い量のウイルス粒子を必要とした。抗体ウイルス混合物をDCに添加し、12時間のさらなるインキュベーション期間を続けた。氷冷メタノールを用いる固定および透過処理後に、感染細胞は、HCMVの主要最初期(IE)タンパク質、UL123に対して特異的であるモノクローナル抗体E13(Morphosys AbD GmbH、Duesseldorf、Germany)およびFITCコンジュゲート抗マウスIgG二次抗体(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)を使用して染色した。蛍光活性化セルソーター(FACS)は、読取りとして使用した。FlowJo 5.7.2.(Tree Star Inc.、Ashland、OR)およびGraph Pad Prism 4(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)の両方を分析のために使用した。結果は、表17aおよび17bにおいて概説する。
8.1 新規な抗hCMV抗体のBiacoreによるエピトープ結合競合アッセイ
エピトープ競合分析のために、抗体Ab−02(18’900RU)、Ab−04(16’800RU)、およびAb−28(18’300RU)を標準的なアミン結合を介してCM5センサーチップのフローセルにつなげた。したがって、対照フローセルは、関連性がないヒトIgG1抗体(12’500RU)を使用して調製した。結合実験前に、フローセルは、ランニングバッファーを用いて徹底的に洗浄した。hCMV gBタンパク質は、およそ13μg/ml gBを含有した、安定性gB産生CHO細胞系6−H5(ロット080527 KS)の上清から5μl/分の流速で180秒間、固定抗gB抗体上に捕捉させた。二次参照抗体ITC48(gBエピトープAD−1を認識する)、ITC52(gBエピトープAD−1を認識する)、およびITC88(エピトープgB AD−2を認識する)は、1000nMの濃度で適用した。結合は、30μl/分の流速で、0.02%BSAおよび0.05%Tween 20を有するPBSにおいて分析した。表面は、pH1.8の10mMグリシンを用いて再生した。結合曲線は、Biacore(登録商標)T100 Evaluation Softwareバージョン2.0.1を使用して評価した。結果は、下記表18において要約し、「+」は、二次結合抗体が、固定捕捉抗体と同時にgBタンパク質に結合することができたことを示す。
本発明の抗体がgB上の既知の抗原性ドメイン、抗原性ドメイン1(AD−1)および抗原性ドメイン2(AD−2)を認識するかどうかをさらに調査するために、ELISAを実行した。この目的のために、AD−1(原核生物により(procaryotically)発現させた融合タンパク質)およびAD−2(合成ペプチド、pep90、アミノ酸配列:NETIYNTTLKYGDVVGV(配列番号197)、Meyer et al., 1992)は両方とも、ELISAプレート上に1μg/mlでコートした。ウェル当たり50μlの非希釈上清を室温で1時間、インキュベートした。ELISAは、上記の実施例1において記載されるように実行した。ELISA分析は、本発明の抗体がAD−1特異的でも、AD−2特異的でもないことを明らかにし、それによって、実施例8.1のBiacore競合アッセイを確認した。
gBタンパク質への結合について、多くの抗hCMV抗体対抗hCMV抗体Ab−50の潜在的な競合を決定するために、実施例1において記載されるものと同様の方法を使用してELISAを実行した。手短に言えば、抗体Ab−47、Ab−48、Ab−49、C23(対照)、ITC52(特異的AD−1)、ITC88(特異的AD−2)、89−104(gH特異的)、または89−109(gH特異的)の連続的な希釈液は、調査する抗体のいずれかによるgBの早まった結合を予防するために、96ウェルプレートにおいて、一定の濃度のAb−50と共に、PBS/2%FCSにおいてあらかじめインキュベートした(ウェル当たり0.5ng;「抗体混合物」と称される)。さらに、ウェル当たり5ngの濃度のAb−50のみの5つのウェルは、潜在的な競合抗体を有していないAb−50のOD450を決定するために調製した。96ウェルELISAプレート(Nunc)は、4℃で、16時間、炭酸バッファー、pH9.6中、ウェル当たり25ngのgBタンパク質によりコートした。gBコートプレートは、0.01%Tween(ELISA洗浄バッファー)を補足したPBSを用いて3回洗浄し、PBS/2%FCS(ELISAバッファー)を用いて2時間ブロックし、ELISA洗浄バッファーを用いて再び3回洗浄した。次いで、プレートは、37℃で、1時間、PBS/2%FCSにおいて希釈した50μl抗体混合物と共にインキュベートした。さらなる洗浄工程に続いて、Ab−50の結合は、ペルオキシダーゼとつながれた抗λ特異的二次抗体を使用して明らかにした(antibodies−online.com)。1時間のインキュベーション期間後に、非結合二次抗体は、洗浄によって除去し、酵素活性は、ウェル当たり100μlの濃度でテトラメチルベンジジン(TMB)試薬(TMBペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Bの1:1のミックス(KPL,Inc.、USA)を使用して決定した。室温での5分間のインキュベーション後に、反応は、ウェル当たり100μl 1Mリン酸を用いて停止した。吸収(光学濃度(OD))は、Emaxマイクロプレートリーダーを使用して450nmで検出し、ソフトウェアSoftmax Pro 3.0(Molecular Devices、USA)を分析のために使用した。
現在hCMV gBタンパク質について入手可能な構造の情報がないので、融合後(postfusion)立体構造を示す可能性が高い、HSV−1 gBの結晶構造に基づくHCMV gB株AD169(配列番号239)の外部ドメインの三量体立体構造の三次元モデルを作成した(Heldwein et al., 2006)。hCMV gB融合後構造のこのモデルは、HSV−1 gBの鋳型構造との配列アライメントに基づいて(Heldwein et al.、同書)、プログラムMODELLERを使用し、標準的な相同性モデリング手順によって作成した(Eswar et al., 2006)。
抗体結合についてDomIおよびDomIIを調査するために、真核細胞においてどちらかのドメインの合成を可能にした発現プラスミドを構築した。両方の場合において、クローニング戦略は、検出を促進するために、それぞれのペプチドのアミノ末端へのHAエピトープタグの付加を伴った。
hCMV gBの構造モデルに基づいて、組換え発現gB DomIIが自然感染の間に免疫原性となるかどうかを分析した。この目的のために、哺乳動物細胞におけるDomIIの発現を可能にした真核生物発現ベクターを構築した。DomIIは、gB株AD169(配列番号239)のアミノ酸121〜132およびアミノ酸344〜438によって生成される非連続的エピトープである。DomIIを発現させるために、gB特異的残基121〜132および344〜438をコードするヌクレオチド配列は、可動性の5アミノ酸リンカー(Ile−Ala−Gly−Ser−Gly;配列番号319)をコードするヌクレオチドストレッチによってつないだ。このヌクレオチド配列は、hCMVのエンベロープ糖タンパク質gpUL132の真のシグナル配列(アミノ酸1〜27;配列番号320;Spaderna et al., 2005)、これに続くインフルエンザ赤血球凝集素(HA)エピトープタグ(YPYDVPDYA;配列番号321)を含有する発現ベクターpcUL132sigHA、pcDNA3.1ベースのベクターの中に挿入した。ヌクレオチド配列をコードするDomIIは、制限部位EcoRIおよびXbaIを使用して、HAタグ配列の下流に挿入した。プラスミドからの正確なタンパク質発現により、HAタグ付きDomII融合タンパク質が生じ、これは、小胞体およびトランスゴルジネットワークを通して輸送され、したがって、グリコシル化によって適切に修飾される。リンカーによりつながれた非連続的DomIIについてのコード領域は、化学的に合成した(GeneArt、Regensburg、Germany)。
DomIを発現させるために、gB株AD169(配列番号239)のアミノ酸132〜343をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターpcUL132sigHA(上記に記載される)の中に挿入し、ベクターpcAD−5を作成した。抗体認識についてDomIペプチドを分析するために、DomIは、Cos7細胞において一時的に発現させ、上記の実施例10.1において記載されるのと同じ方法を使用して間接免疫蛍光法によって反応性について分析した。
文献におけるデータは、gBが、自然感染の間の中和抗体の誘発に関して有力な抗原の1つであるという仮定を支持し、抗gB力価および中和能力の間の相関が、報告されている(Marshall et al., 1992)。多くの異なるエピトープに対して向けられる様々な異なる抗体特異性についてこの相関が存在するかどうかまたは限られた数のドメインが担うかどうかは不明瞭である。Ad−4(DomII)特異的抗体が、所与の血清の全体的な中和能力に有意に寄与するかどうか調査するために、発明者らは、血清パネルにおいて中和力価を決定し、それぞれ、組換えgB、AD−1、AD−2、およびAD−4に対するELISA力価にそれを関連づけた。タンパク質は、0.5M炭酸ナトリウムバッファー、pH9.6においてまたは6M尿素(AD−1)において25ng〜200ng(抗原に依存)の間で希釈し、50μlは、4℃で、マイクロタイタープレートを一晩コートするために使用した。続く工程はすべて、室温で実行した。反応ウェルは、0.1% Tween 20を補足したPBSを用いてすすぎ、2%FCSを含有するPBSを用いて2時間、ブロックした。プレートは、0.1%Tween 20を補足したPBSを用いて再びすすぎ、2時間、モノクローナル抗体、ヒト血清、ポリクローナル溶出抗体画分、またはマウス血清(50μl/ウェル)と共にインキュベートした。非結合抗体は、洗浄によって除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトまたは抗マウスIgG(Dako、Hamburg、Germany)を、1時間、適切な希釈で添加した。プレートは、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液B(KPL,Inc.、USA)において1:1に希釈した100μl テトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質を5分間添加した。反応は、100μl 1M H3PO4の添加によって停止し、OD450は、Emaxマイクロプレートリーダー(Eurofins MWG Operon、Ebersberg、Germany)を使用して決定した。すべての抗体の希釈は、2%FCSを用いてPBSにおいて行った。gB融合タンパク質を含むすべてのアッセイにおいて、それぞれの原核生物融合パートナーは、並行してアッセイし、光学濃度は、gB融合タンパク質を用いて得られた値から引いた。
AD−4が自然感染の間にウイルス中和抗体を誘発するかどうかという問題をより詳細に調査するために、発明者らは、2つのアプローチを使用した:第1に、発明者らは、親和性マトリックスとして精製AD−4−GST(DomII GST)融合タンパク質を使用して、プールしたヒトIgG調製物からポリクローナル抗AD−4抗体を単離した。期待されるように、プールしたヒトIgG調製物は、Cos−7細胞におけるそれぞれの糖タンパク質複合体の一時的発現に続いて、間接免疫蛍光法分析において、多くの異なるhCMV特異的エンベロープ糖タンパク質と反応性の抗体を含有した。第2に、発明者らは、AD−4への結合について、本発明において開示されるgB特異的ヒトモノクローナル抗体を試験した。組換え抗体はすべて、Cos7細胞において一時的に発現させたAD−4タンパク質を使用し、間接免疫蛍光法においてAD−4に結合することが分かった。そのため、AD−4は、本発明において開示されるヒトモノクローナル抗体によって認識される立体構造エピトープに相当する。
13.1:ヒト組換え抗体に結合するAD−4の優れた(fine)特異性
AD−4のサイズ(>100アミノ酸)は、エピトープに結合するいくつかの抗体を含むのに十分に大きい。中和および非中和抗体が結合することができるすぐ近くのエピトープは、gBのAD−1およびAD−2について見つけられており、有効なウイルス中和を回避するためのメカニズムとして示唆されてきた。したがって、AD−4内の潜在的なエピトープについてのよりさらに多くの情報を得ることは興味深い。アミノ末端のアミノ酸121〜132またはカルボキシ末端の最後の5つのアミノ酸の省略によってAD−4を短くするための最初の試みは、抗体結合の完全な損失をもたらし、全ドメインのみが抗体結合構造を形成することができることを示した。AD−4内の可能性として重大な抗体接触残基を同定するために、それぞれにおいて2つの隣接する表面暴露残基をアラニンに交換したAD−4変異体ペプチドを発現した多くの(n=17)真核生物発現プラスミドを構築した(図8)。残基の表面露出は、実施例9において記載されるように、hCMV gBモデルから同定した。
AD−4とは対照的に、AD−5は、原核生物発現後に正確にフォールドせず、そのため、アフィニティー精製のための抗原を生成することができなかったので、上記実施例13.1において記載されるものに類似する実験は、AD−5(DomI)を用いて実行することができなかった。しかしながら、AD−5は、2つのドメインに細分することが可能であり、これらを、次いで、抗体認識について試験した。構造の情報に基づいて、AD−5は、gBタンパク質AD169(配列番号239)のアミノ酸133〜144および251〜343を含んだサブドメイン1(AD−5−S1)ならびにgBタンパク質AD169(配列番号239)のアミノ酸140〜255を含んだサブドメイン2(AD−5−S2)に分けた。
HSV−1 gBに従ってモデル化したhCMV gBの構造内で、AD−4は、分子の真中の突出部に位置する。ジリジンモチーフは、表面に容易に到達できる。3D空間における、抗体に結合するAD−4の配向に関するデータがない限り、このタンパク質立体構造における抗体結合が、隣接するタンパク質とのgBの相互作用に影響を及ぼし得ることを予測することができる。hCMVを含む多くのヘルペスウイルスについて、gBが融合プロセスの間に適切に機能するためにさらなるエンベロープ糖タンパク質と相互作用する必要があることが知られている(Avitabile et al., 2009; Patrone et al., 2007)。しかしながら、おそらく、HSV−1 gBは、融合後立体構造に相当する。この仮定は、融合後および融合前構造の両方が入手可能であるVSV−Gに対するHSV−1 gBの構造の相同性に基づく(Roche et al., 2006 & 2007)。融合前形態がビリオンについて一般的であり、融合後形態は、主として、いくつかの、今までのところ未同定の細胞コンパートメントにおいて存在するように考えられる。見たところでは、AD−4特異的抗体は、それらが、gBの細胞およびウイルス形態に結合するので、両方のgB立体構造を認識することができる。VSV−Gについては、融合前および融合後形態が個々のタンパク質ドメインの広範囲な構造の再構成を示すので、発明者らは、融合前三量体内のAd−4の潜在的な局在化および抗体結合にとって重要な残基の位置に対するより多くの見識を得るためにHCMV gBの融合前形態をモデル化した。
臨床設定では、本発明の抗体は、静脈注射の手段によって予防的にまたは治療上投与されてもよい。そのため、抗体機能がヒト血清における抗体の存在によって損なわれる可能性を除く必要がある。異なる3つのタイプの血清を検査した:hCMV特異的抗体に対して陰性の血清、hCMV特異的抗体に対して陽性の血清、およびIntratect(登録商標)(Biotest AG)、CMV特異的抗体が豊富なhCMV血清調製物。第1に、それぞれの分析した血清のIgG濃度および50%中和活性を滴定によって決定した。手短に言えば、ELISAプレートは、抗ヒトIgG Fcγ断片特異的捕獲抗体(Jackson ImmunoResearch、USA)を用いてコートした。ELISAバッファー中の血清の2倍段階希釈溶液を、既知濃度のIgG標準物質と比較した(Jackson ImmunoResearch、USA)。IgG濃度は、ELISAソフトウェアSoftmax Pro 3.0(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を使用して計算した。血清の50%中和活性は、実施例2において上記に記載されるように、ルシフェラーゼベースの中和アッセイを実行することによって決定した。
本発明の抗体が、細胞へのウイルス侵入の初期の段階をブロックし得るかどうかを決定するために、発明者らは、吸着後中和アッセイを実行した。中和アッセイの方法は、実施例2において記載されるものと同様としたが、最初に、ウイルスおよび細胞の膜の融合ではなくウイルス吸着のみを可能にするために、HFFおよびルシフェラーゼ発現hCMVを4℃で1時間、インキュベートした。この吸着期間後に、吸着していないウイルスは、1×PBSを用いて洗浄した。抗体は、別々のプレートにおいて150μg/mlの非常に高いIgG濃度〜5μg/mlまで滴定し、次いで、あらかじめ吸着させたウイルス−細胞混合物に添加した。抗体Ab−02、Ab−28、Ab−04、および対照抗体C23(T123;親切にもTeijin Pharma Limited、Japanからの贈与)をこの実験のために使用し、抗体はそれぞれ、あらかじめ吸着させたウイルス−細胞混合物と共に4℃で、30、80、または120分間、インキュベートした。AD−2特異的抗体C23は、細胞へのウイルス侵入を阻害することが示されている(Ohizumi et al., 1992)。30、80、または120分間のインキュベーション期間後に、プレートはもう一度洗浄し、次いで、37℃で48時間、インキュベートした。この時点から、アッセイは、実施例2のように継続した。結果は、図13において示され、以下のように要約される。30分間のインキュベーション期間後に、少なくとも100μg/mlのそれぞれの抗体は、ウイルス感染性の50%の低下を達成するために必要とされた。他方、C23は、30分間のインキュベーション後に、5μg/mlの非常に低い濃度でさえウイルス侵入を阻害するように見えた。80分後に、20μg/mlのAb−02およびAb−28のみが、50%の中和のために必要とされた。しかしながら、Ab−04については、55μg/mlが、ウイルス感染性を50%中和するために必要とされた。対照抗体C23の80分間の曲線は、期待される結果を示さなかった。この抗体が、より長いインキュベーション後に、少なくとも同じくらい良好であった、そうでなければより良好であったことが期待されるであろう。また、平均値の標準誤差は、80分間のインキュベーション期間でC23について非常に分散しており、そのため、この時点は結果から除いた。120分間、抗体と、あらかじめ吸着させたウイルスをインキュベートする場合、たった約5〜15μg/mlのそれぞれの抗体またはC23が、ウイルス感染性の50%の低下に必要とされる。結論として、抗体Ab−02、Ab−28、およびAb−04は、既に吸着しているウイルスの細胞への侵入を予防することができる。
中和および非中和抗体の間のgBエピトープ結合について競合は、AD−1特異的抗体について報告されている(Ohlin et al., 1993)。本発明の抗体および他のgB特異的抗体の間の可能性のある競合的である、または相乗的でさえある効果を調査するために、競合的中和アッセイは、本発明の抗体の中和活性に対するAD−1(ITC52)およびAD−2特異的(ITC88)抗体の影響を決定するために実行した。これを行うために、一方の抗体を滴定し、他方の抗体は、その50%中和活性のあたりの一定の濃度で添加した。これらの競合的中和アッセイは、抗体のそれぞれ:Ab−11、Ab−14、Ab−19、Ab−28、Ab−04、Ab−42を用いて行った。異なる2つのアプローチを比較し、それによって、試験抗体は、滴定し、ITC52もしくはITC88は、一定の濃度で添加したまたはITC抗体は、滴定し、試験抗体は、一定の濃度で添加した。ITC52は非中和抗体であるので、それは、中和抗体ITC88を添加したのと同じ濃度である3μg/mlの濃度で添加した。試験した他の抗体が同様に作用したので、Ab−28についてのデータのみを示す。また、代替のアプローチが同等の結果を示したので、1つのアプローチのみを示す、すなわち、一定の濃度でAb−28を残し、ITC抗体を滴定する(図14)。
結合メンバーのVHドメイン、VLドメインおよびCDR配列を添付の配列表に示す。ここに、配列番号は下記の通り対応する。
1 SM5-1 VH ヌクレオチド
2 SM5-1 VH アミノ酸
3 SM5-1 VH CDR 1 aa
4 SM5-1 VH CDR 2 aa
5 SM5-1 VH CDR 3 aa
6 SM4-10 VH ヌクレオチド
7 SM4-10 VH アミノ酸
8 SM4-10 VH CDR 1 aa
9 SM4-10 VH CDR 2 aa
10 SM4-10 VH CDR 3 aa
11 SM6-5 VH ヌクレオチド
12 SM6-5 VH アミノ酸
13 SM6-5 VH CDR 1 aa
14 SM6-5 VH CDR 2 aa
15 SM6-5 VH CDR 3 aa
16 SM1-6 VH ヌクレオチド
17 SM1-6 VH アミノ酸
18 SM1-6 VH CDR 1 aa
19 SM1-6 VH CDR 2 aa
20 SM1-6 VH CDR 3 aa
21 SM3-1 VH ヌクレオチド
22 SM3-1 VH アミノ酸
23 SM3-1 VH CDR 1 aa
24 SM3-1 VH CDR 2 aa
25 SM3-1 VH CDR 3 aa
26 SM11-17 VH ヌクレオチド
27 SM11-17 VH アミノ酸
28 SM11-17 VH CDR 1 aa
29 SM11-17 VH CDR 2 aa
30 SM11-17 VH CDR 3 aa
31 SM11-21 VH ヌクレオチド
32 SM11-21 VH アミノ酸
33 SM11-21 VH CDR 1 aa
34 SM11-21 VH CDR 2 aa
35 SM11-21 VH CDR 3 aa
36 SM6-11 VH ヌクレオチド
37 SM6-11 VH アミノ酸
38 SM6-11 VH CDR 1 aa
39 SM6-11 VH CDR 2 aa
40 SM6-11 VH CDR 3 aa
41 SM4-3 VH ヌクレオチド
42 SM4-3 VH アミノ酸
43 SM4-3 VH CDR 1 aa
44 SM4-3 VH CDR 2 aa
45 SM4-3 VH CDR 3 aa
46 SM5-3 VH ヌクレオチド
47 SM5-3 VH アミノ酸
48 SM5-3 VH CDR 1 aa
49 SM5-3 VH CDR 2 aa
50 SM5-3 VH CDR 3 aa
51 SM5-9 VH ヌクレオチド
52 SM5-9 VH アミノ酸
53 SM5-9 VH CDR 1 aa
54 SM5-9 VH CDR 2 aa
55 SM5-9 VH CDR 3 aa
56 SM1-7 VH ヌクレオチド
57 SM1-7 VH アミノ酸
58 SM1-7 VH CDR 1 aa
59 SM1-7 VH CDR 2 aa
60 SM1-7 VH CDR 3 aa
61 SM1-8 VH ヌクレオチド
62 SM1-8 VH アミノ酸
63 SM1-8 VH CDR 1 aa
64 SM1-8 VH CDR 2 aa
65 SM1-8 VH CDR 3 aa
66 SM3-4 VH ヌクレオチド
67 SM3-4 VH アミノ酸
68 SM3-4 VH CDR 1 aa
69 SM3-4 VH CDR 2 aa
70 SM3-4 VH CDR 3 aa
71 SM6-23 VH ヌクレオチド
72 SM6-23 VH アミノ酸
73 SM6-23 VH CDR 1 aa
74 SM6-23 VH CDR 2 aa
75 SM6-23 VH CDR 3 aa
76 SM11-18 VH ヌクレオチド
77 SM11-18 VH アミノ酸
78 SM11-18 VH CDR 1 aa
79 SM11-18 VH CDR 2 aa
80 SM11-18 VH CDR 3 aa
81 SM11-19 VH ヌクレオチド
82 SM11-19 VH アミノ酸
83 SM11-19 VH CDR 1 aa
84 SM11-19 VH CDR 2 aa
85 SM11-19 VH CDR 3 aa
86 SM11-20 VH ヌクレオチド
87 SM11-20 VH アミノ酸
88 SM11-20 VH CDR 1 aa
89 SM11-20 VH CDR 2 aa
90 SM11-20 VH CDR 3 aa
91 SM5-1 VL ヌクレオチド
92 SM5-1 VL アミノ酸
93 SM5-1 VL CDR 1 aa
94 SM5-1 VL CDR 2 aa
95 SM5-1 VL CDR 3 aa
96 SM4-10 VL ヌクレオチド
97 SM4-10 VL アミノ酸
98 SM4-10 VL CDR 1 aa
99 SM4-10 VL CDR 2 aa
100 SM4-10 VL CDR 3 aa
101 SM6-5 VL ヌクレオチド
102 SM6-5 VL アミノ酸
103 SM6-5 VL CDR 1 aa
104 SM6-5 VL CDR 2 aa
105 SM6-5 VL CDR 3 aa
106 SM1-6 VL ヌクレオチド
107 SM1-6 VL アミノ酸
108 SM1-6 VL CDR 1 aa
109 SM1-6 VL CDR 2 aa
110 SM1-6 VL CDR 3 aa
111 SM3-1 VL ヌクレオチド
112 SM3-1 VL アミノ酸
113 SM3-1 VL CDR 1 aa
114 SM3-1 VL CDR 2 aa
115 SM3-1 VL CDR 3 aa
116 SM5-6 VL ヌクレオチド
117 SM5-6 VL アミノ酸
118 SM5-6 VL CDR 1 aa
119 SM5-6 VL CDR 2 aa
120 SM5-6 VL CDR 3 aa
121 SM6-48 VH ヌクレオチド
122 SM6-48 VH アミノ酸
123 SM6-48 VH CDR 1 aa
124 SM6-48 VH CDR 2 aa
125 SM6-48 VH CDR 3 aa
126 SM4-3 VL ヌクレオチド
127 SM4-3 VL アミノ酸
128 SM4-3 VL CDR 1 aa
129 SM4-3 VL CDR 2 aa
130 SM4-3 VL CDR 3 aa
131 SM5-9 VL ヌクレオチド
132 SM5-9 VL アミノ酸
133 SM5-9 VL CDR 1 aa
134 SM5-9 VL CDR 2 aa
135 SM5-9 VL CDR 3 aa
136 SM4-12 VL ヌクレオチド
137 SM4-12 VL アミノ酸
138 SM4-12 VL CDR 1 aa
139 SM4-12 VL CDR 2 aa
140 SM4-12 VL CDR 3 aa
141 SM5-5 VL ヌクレオチド
142 SM5-5 VL アミノ酸
143 SM5-5 VL CDR 1 aa
144 SM5-5 VL CDR 2 aa
145 SM5-5 VL CDR 3 aa
146 SM3-2 VL ヌクレオチド
147 SM3-2 VL アミノ酸
148 SM3-2 VL CDR 1 aa
149 SM3-2 VL CDR 2 aa
150 SM3-2 VL CDR 3 aa
151 SM3-4 VL ヌクレオチド
152 SM3-4 VL アミノ酸
153 SM3-4 VL CDR 1 aa
154 SM3-4 VL CDR 2 aa
155 SM3-4 VL CDR 3 aa
156 SM4-1 VL ヌクレオチド
157 SM4-1 VL アミノ酸
158 SM4-1 VL CDR 1 aa
159 SM4-1 VL CDR 2 aa
160 SM4-1 VL CDR 3 aa
161 SM4-5 VL ヌクレオチド
162 SM4-5 VL アミノ酸
163 SM4-5 VL CDR 1 aa
164 SM4-5 VL CDR 2 aa
165 SM4-5 VL CDR 3 aa
166 SM4-7 VL ヌクレオチド
167 SM4-7 VL アミノ酸
168 SM4-7 VL CDR 1 aa
169 SM4-7 VL CDR 2 aa
170 SM4-7 VL CDR 3 aa
171 SM6-6 VL ヌクレオチド
172 SM6-6 VL アミノ酸
173 SM6-6 VL CDR 1 aa
174 SM6-6 VL CDR 2 aa
175 SM6-6 VL CDR 3 aa
176 SM6-51 VL ヌクレオチド
177 SM6-51 VL アミノ酸
178 SM6-51 VL CDR 1 aa
179 SM6-51 VL CDR 2 aa
180 SM6-51 VL CDR 3 aa
181 VH FWR1
182 VH FWR3
183 VH FWR3 (*02,*03,*04)
184 VH FWR4 (*01)
185 VL FWR1
186 VL FWR2
187 VL FWR3
188 IGHJ6*02 aa
189 IGHJ3*02 aa
190 IGHJ5*01 aa
191 IGHJ5*02 aa
192 IGLJ1*01 aa
193 IGLJ2*01 aa
194 IGLJ3*01 aa
195 IGLG3*02 aa
196 プライマー 179-Je
197 合成ペプチド
198 プライマー 074-Je
199 プライマー 075-Je
200 プライマー 076-Je
201 プライマー 150-Je
202 プライマー 151-Je
203 プライマー 077-Je
204 プライマー 078-Je
205 プライマー 007-Je
206 プライマー 152-Je
207 プライマー 153-Je
208 プライマー 066-Je
209 プライマー 067-Je
210 プライマー 068-Je
211 プライマー 069-Je
212 プライマー 070-Je
213 プライマー 258-Je
214 プライマー 259-Je
215 プライマー 260-Je
216 プライマー 261-Je
217 プライマー 262-Je
218 プライマー 263-Je
219 プライマー 264-Je
220 プライマー 265-Je
221 プライマー 266-Je
222 プライマー 267-Je
223 プライマー 84-B
224 プライマー 155-Je
225 プライマー 85-B
226 プライマー 161-Je
227 プライマー 162-Je
228 プライマー 154-Je
229 プライマー 001-Je
230 プライマー 158-Je
231 プライマー 003-Je
232 プライマー 159-Je
233 プライマー 156-Je
234 プライマー 157-Je
235 プライマー 062-Je
236 プライマー 063-Je
237 プライマー 065-Je
238 プライマー 064-Je
239 gB strain AD169
240 gB strain Towne
241 SM10 VH ヌクレオチド
242 SM10 VH アミノ酸
243 SM10 VH CDR 1 aa
244 SM10 VH CDR 2 aa
245 SM10 VH CDR 3 aa
246 SM12 VH ヌクレオチド
247 SM12 VH アミノ酸
248 SM12 VH CDR 1 aa
249 SM12 VH CDR 2 aa
250 SM12 VH CDR 3 aa
251 2C2 VH ヌクレオチド
252 2C2 VH アミノ酸
253 2C2 VH CDR 1 aa
254 2C2 VH CDR 2 aa
255 2C2 VH CDR 3 aa
256 1G2 VH ヌクレオチド
257 1G2 VH アミノ酸
258 1G2 VH CDR 1 aa
259 1G2 VH CDR 2 aa
260 1G2 VH CDR 3 aa
261 SM10 VL ヌクレオチド
262 SM10 VL アミノ酸
263 SM10 VL CDR 1 aa
264 SM10 VL CDR 2 aa
265 SM10 VL CDR 3 aa
266 SM12 VL ヌクレオチド
267 SM12 VL アミノ酸
268 SM12 VL CDR 1 aa
269 SM12 VL CDR 2 aa
270 SM12 VL CDR 3 aa
271 2C2 VL ヌクレオチド
272 2C2 VL アミノ酸
273 2C2 VL CDR 1 aa
274 2C2 VL CDR 2 aa
275 2C2 VL CDR 3 aa
276 1G2 VL ヌクレオチド
277 1G2 VL アミノ酸
278 1G2 VL CDR 1 aa
279 1G2 VL CDR 2 aa
280 1G2 VL CDR 3 aa
281 IGHV4-39 FWR1
282 IGHV4-39 FWR2
283 IGHV4-39 FWR3
284 IGHV4-59 FWR1
285 IGHV4-59 FWR2
286 IGHV4-59 FWR3
287 IGKV2D-28 FWR1
288 IGKV2D-28 FWR2
289 IGKV2D-28 FWR3
290 IGKV1D-33 FWR1
291 IGKV1D-33 FWR2
292 IGKV1D-33 FWR3
293 IGLV1-47 FW1
294 IGLV1-47 FW2
295 IGLV1-47 FW3
296 プライマー 5’Ig L VH 4/6
297 プライマー 5’Ig L Vκ 1/2
298 プライマー 5’Ig L Vλ 3
299 プライマー 5’Ig L Vλ 1
300 プライマー 3’Ig Cγ CH 1
301 プライマー 3’Ig Cκ 543
302 プライマー 3’Ig Cλ 鎖
303 プライマー 5’Ig AgeI VH4
304 プライマー 5’Ig AgeI Vκ 2-24
305 プライマー 5’Ig AgeI Vκ 2-28
306 プライマー 5’Ig AgeI Vλ 3
307 プライマー 5’Ig AgeI Vκ 1-5
308 プライマー 5’Ig AgeI VH 4-39
309 プライマー 5’Ig AgeI Vλ 1
310 プライマー 3’Ig Sall JH
311 プライマー 3’Ig BsiWI Jκ 2
312 プライマー 3’Ig Sall JH 6
313 プライマー 3’Ig Bsi WIJκ 1/4
314 プライマー 3’Ig XhoI Cλ
315 プライマー 5’無し
316 プライマー 3’IgG 内部
317 プライマー 3’Cκ494
318 プライマー 3’Cλ
319 合成リンカー
320 gpUL132 シグナル配列
321 HA エピトープタグ
上記のどこかでの引用を含め、本明細書のどこかで引用した全ての参考文献は、出典明示により、全体として、全ての目的で、本明細書の一部とされる。
Claims (24)
- ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)gBタンパク質に残基121〜132および344〜438内の領域で結合し、残基番号付けは、完全長gB株AD169アミノ酸配列配列番号239に従って定義される、hCMV gBタンパク質に対する単離結合メンバーであって、
CDRのセット:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここに、
a)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号3を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号4を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号5を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号93を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号94を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号95を有するか、
b)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号8を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号9を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号10を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号98を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号99を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号100を有するか、
c)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号13を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号14を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号15を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号103を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号104を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号105を有するか、
d)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号18を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号19を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号20を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号108を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号109を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号110を有するか、
e)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号23を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号24を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号25を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号113を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号114を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号115を有するか、
f)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号43を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号44を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号45を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号163を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号164を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号165を有するか、または
g)
HCDR1がアミノ酸配列配列番号28を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号29を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号30を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号108を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号109を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号110を有し、
該結合メンバーが、表面プラズモン共鳴によって定められる50nM以下のKDを有する、単離結合メンバー。 - 結合メンバーがhCMV gBタンパク質の抗原性ドメイン1(AD−1)または抗原性ドメイン2(AD−2)に結合しない、請求項1記載の単離結合メンバー。
- hCMVの臨床分離株の50%の中和のために必要とされる結合メンバーの濃度がヒト包皮線維芽細胞のhCMV感染の中和についての中和アッセイにおいて10μg/ml以下である、請求項1または2記載の単離結合メンバー。
- 結合メンバーが、抗体分子または抗体VHドメインを含むその機能的断片を含み、該VHドメインが、配列番号2において示されるVHドメインアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれかに記載の単離結合メンバー。
- 結合メンバーが、抗体分子または抗体VLドメインを含むその機能的断片を含み、該VLドメインが、配列番号92において示されるVLドメインアミノ酸配列を有する、請求項1〜4のいずれかに記載の単離結合メンバー。
- アミノ酸配列配列番号2を含む重鎖と、アミノ酸配列配列番号92を含む軽鎖とを含む単離抗体分子。
- 配列番号2に対して少なくとも90%同一であるVHドメインアミノ酸配列と、配列番号92に対して少なくとも90%同一であるVLドメインアミノ酸配列とを含む、hCMV gBタンパク質に結合する単離抗体分子であって、請求項6に記載の単離抗体分子と同じ中和能力を有する単離抗体分子。
- IgGである、請求項6または7に記載の単離抗体分子。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項6〜8のいずれかに記載の単離抗体分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
- 療法によってヒトまたは動物の体を治療する方法における使用のための、請求項1〜5のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項6〜8のいずれかに記載の単離抗体分子を含む組成物。
- hCMVと関連する障害を治療するのに使用するための、請求項10に記載の組成物。
- hCMVと関連する障害の治療における使用のための、請求項1〜5のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項6〜8のいずれかに記載の単離抗体分子を含む組成物。
- 障害がhCMV感染である、請求項11または12に記載の組成物。
- hCMV gB、gH、gL、UL128、UL130、および/またはUL131Aタンパク質に結合する単離結合メンバーまたは単離抗体分子をさらに含む、請求項10〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項6〜8のいずれかに記載の単離抗体分子を含む、易感染性の免疫系を有する個体におけるhCMVと関連する障害を治療するのに使用するための組成物。
- 個体が、妊婦、新生児、移植レシピエント、またはHIVに感染した個体である、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の結合メンバー、または請求項6〜8のいずれかに記載の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 請求項17に記載の核酸分子を用いてインビトロでトランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞。
- 結合メンバーまたは抗体分子を生成する方法であって、該結合メンバーまたは抗体分子の生成のための条件下で、請求項18に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
- 結合メンバーまたは抗体分子を単離することおよび/または精製することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 結合メンバーまたは抗体分子を、少なくとも1つのさらなる構成成分を含む組成物に処方することをさらに含む、請求項19または請求項20に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項6〜8のいずれかに記載の単離抗体分子を含む、対象または試料におけるhCMVを中和するのに使用するための組成物であって、約0.1〜約5.0μg/mlの濃度でhCMV感染性を少なくとも50%低下させるのに十分な前記単離結合メンバーまたは単離抗体分子の量を含む組成物。
- 対象または試料におけるhCMVを中和する方法であって、約0.1〜約5.0μg/mlの濃度でhCMV感染性を少なくとも50%低下させるのに十分な量で、請求項1〜5のいずれかに記載の単離結合メンバーまたは請求項6〜8のいずれかに記載の単離抗体分子を前記対象または試料に投与することを含み、ここに前記対象はヒト以外である、方法。
- ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)gBタンパク質に残基121〜132および344〜438内の領域で結合し、残基番号付けは、完全長gB株AD169アミノ酸配列配列番号239に従って定義される、hCMV gBタンパク質に対する単離結合メンバーであって、
CDRのセット:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、ここに、
HCDR1がアミノ酸配列配列番号3を有し、
HCDR2がアミノ酸配列配列番号4を有し、
HCDR3がアミノ酸配列配列番号5を有し、
LCDR1がアミノ酸配列配列番号93を有し、
LCDR2がアミノ酸配列配列番号94を有し、かつ
LCDR3がアミノ酸配列配列番号95を有する、単離結合メンバー。
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