KR910000736B1 - 사이토메갈로 바이러스에 대한 사람·모노클로날 항체와 그 제조방법 - Google Patents
사이토메갈로 바이러스에 대한 사람·모노클로날 항체와 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
[발명의 명칭]
사이토메갈로 바이러스에 대한 사람·모노클로날 항체와 그 제조방법
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 항 CMV·사람 MCA의 CMV에 대한 중화활성을 나타낸 그림.
제2도는 본 발명의 항 CMV·사람 MCA의 면역침강분석 결과를 나타낸 그림.
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 사이토메갈로 바이러스(cytomegalo-virus, 이하 CMV라고 약기한다)에 대한 사람 모노클로날 항체(monoclonal antibody, 이하 MCA라고 약기한다)와 그 제조방법에 관한 것이다. 그 목적으로 하는 바는, CMV 감염증의 진단, 예방 및 치료에 유용한 CMV에 특이적인 사람 MCA를 제공하는데 있다.
[배경기술]
CMV는 헤르페스 바이러스속에 속하는 바이러스의 하나로써, DNA, 코어단백, 캡시드와 엔비로프로 이뤄져 있다. 이 바이러스가 인간에게 감염되어 대부분의 경우 어떠한 질병도 일으키지 않는다. 그러나, 면역능력이 저하된 신생아에게는 간염을 일으키며, 장기이식을 위하여 면역 억제된 환자에 간질성 폐렴을 일으켜 종종 치명적인 감염증을 일으킨다. 따라서, 이 감염증의 진단, 예방 및 치료는 큰 의료적 요구가 되고 있다. 콘디(condie)들(American J. Medicine, March 30, 134-141, 1984참조)은 골수이식 환자에게 항 CMV 항체가가 높은 사람 혈청 글로부린을 투여하여 CMV 감염과 그에 따른 간질성폐렴을 막는데 성공하고 있다. 고역가인 사람 혈청 글루부린은 혈청제공자의 항체값을 미리 검사하고, 고역가인 혈장만을 수집하여 분획시킨다. 이 방법으로 얻어지는 혈청 글로부린의 CMV에 대한 항체값은 랜덤으로 수집되었지만 기껏해야 10배에 불과하고, 또한 이와같이 고역가 혈청 글로부린을 수집하는 것은 매우 곤란하여 안정하게 공급할 수가 없다.
Milstein과 Kohler에 의해서 확립된 하이브리도마법에 따라서 고순도의 항체, 즉 MCA가 만들어지게 되었다.
Rasmussen들(Prco. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 81, 876-880 1984 참조)는 CMV를 쥐에 면역시키고 그 쥐의 지라세포와 쥐·미에로마세포를 융합함으로서 CMV 특이적 MCA를 생산하는 하이브리도마를 만들었다. 이들 이외에도 몇몇 연구진이 CMV에 대한 쥐 MCA를 얻고 있다(예를 들면, Goldstein들, Infection and Immunity, 38, 273-281, 1982; pereira들, Infection and Immunity, 36, 924-932, 1982참조).
이들 MCA중에 있어서, 바이러스를 중화하는 활성을 가진 MCA는 적지만, Rasmussen들의 MCA는 약 10μg/ml에서 CMV를 중화하는 능력이 있다. 이것은 고역가 혈청 글로부린과 비교했을때 매우 높은 중화활성이고, 이러한 MCA에 의한 CMV 감염증의 예방 혹은 치료가 기대된다. 그러나, 이들은 쥐 유래의 MCA이고, 인체에 투여했을때 이물로 인식되어 불합리한 부작용을 일으킨다. 그래서, 쥐 유래가 아닌 사람 유래의 항 CMV·MCA가 바람직하다.
일반적으로 사람 유래의 MCA는 쥐·미에로마세포, 사람·미에로마세포 혹은 다른 임파계 수립세포와 사람·임파구를 세포융합하여 얻어지는 하이브리도마에서 생산된다. 혹은 사람·임파구를 EB 바이러스에 의하여 변이시킨 임파아구(芽球)세포에서도 생산된다.
1980년부터 현재까지 많은 사람 MCA제작의 시도가 이루어졌지만 어느 방법도 각각 고유의 문제가 걸려 있다. 쥐·미에로마와 사람·임파구와의 세포융합으로 얻어진 하이브리도마의 MCA생산은 불안정하고, 사람·미에로마세포와 사람·임파구와의 세포융합은 매우 효율이 나쁘다. 또, EB 바이러스에 의하여 얻어지는 임파아구세포의 MCA생산은 양이 적고, 또한 불안정하다. 그 밖에 EB 바이러스는 종양을 일으키는 능력을 갖고 있어 안정성면에서 큰 문제가 있다. 이렇듯 MCA생산 세포를 수립하는 기술에 있어서 커다란 장애가 있지만, 더욱 더 하나, 특정항원에 특이적인 사람 MCA를 얻기 위해서는 큰 장애가 있다. 그것은 충분하게 면역된 사람·임파구를 얻고자 하는 과제이다. 일반적으로 정상인의 임파구는 CMV에 의해서 감작(感作)되고 있는 것이 많으나, 그 면역정도는 매우 낮다.
따라서, 정상인의 임파구에서 하이브리도마 혹은 임파아구 세포를 수립하더라도 항 CMV·MCA를 생산하는 세포를 얻을 수 있는 가능성은 거의 없다.
CMV에 대한 사람 MCA에 대하여는 한가지만 생산세포주가 얻어졌다는 보고가 있다(J. Immunol., 133, 2202-2205, 1984 참조). 이것에 의하면, 정상인 임파구를 EB 바이러스로 변이시켜 MCA생산세포주가 얻어지는 것이다. 그러나, 기재되어 있는 내용은 1장의 형광항체사진뿐이고 MCA를 안정하게 생산하고 있는 세포주가 수립되었는가 아닌가가 명백하지 않다. 게다가 상기한 바와같이, EB 바이러스유래의 발암성도 문제이고 인체에 투여하는 것은 큰 위험이 따른다. 또 이 방법에 의하여 얻어진 MCA는 CMV에 결합하더라도 CMV를 중화하는 능력을 전혀 갖고 있지 않은 사실이 명백해지고 있다.
이상과 같이, 목적으로 하는 특이성을 갖는 사람 MCA를 효율좋게 취득하는데 있어 가장 큰 문제는, 사람·임파구를 특정의 항원으로 충분히 면역하는 것이 곤란하다는 점이다. 쥐의 경우에는 생체를 갖고 유해한 항원일지라도 투여할 수 있고, 더우기 좋은 조건으로 투여 스케줄로 면역할 수가 있으나, 인간의 경우에는 이것이 불가능하다. CMV는 병원체이고 왁진이 나와 있지 않은 현재 인간에게 CMV를 고의로 투여하여 면역하는 것은 윤리상 허락되지 않는다. 사람 MCA를 만드는데 있어서 다음으로 문제가 되는 점은, 사람 MCA를 안정하게 생산하는 세포를 수립하는 방법이다. 하이브리도마법도 EBV 법도 일장일단이 있는 사실은 앞에서도 말한 바와 같다.
[발명의 개시]
본 발명자들은 항 CMV·사람 MCA를 취득하는 것을 목적으로 하여 예의 연구를 행한 결과, in vitro에서 마이토젠 존재하에 CMV 또는 CMV 유래의 단백 또는 당단백으로 감작된 사람·임파구와, 쥐·미에로마세포를 융합시키는 방법에 의해서 항 CMV·사람 MCA를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수가 있었다. 그리고, 이 하이브리도마 및/또는 게다가 유래하는 세포주를 배양하고 배양상청에서 항 CMV·사람 MCA를 채취할 수가 있었다.
본 발명의 사람 MCA는 CMV 및/또는 CMV 감염세포에 반응하는 항체이다. 본 발며의 항 CMV·사람 MCA중에서 좋은 것은 IgGl형의 것이고, 이것은 또 2개의 종류로 나뉜다. 한쪽 종류의 MCA는, 분자량 약 64,000의 CMV 항원단백, 또는 분자량 약 64,000의 항원단백을 주성분으로 하는 복수의 CMV 항원단백을 인식한다. 다른 종류의 MCA는 분자량 약 130,000과 약 55,000의 CMV 항원단백을 인식한다. 그리고 후자는 CMV를 중화하는 능력을 갖고, 아메리칸 타이프 컬츄어 콜렉숀(ATCC)에 기탁번호 HB 9215로 기탁되어 있는, 그리고 한국종균협회(KFCC)에 기탁번호 KFCC-10310으로 기탁되어 있는 하이브리도마 C41, 또는 그것과 같은 항원 단백을 인식하는 하이브리도마에 의해서 생산된다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
본 발명에 있어서 사용되는 사람·임파구는 비장, 임파절, 말초혈, 골수, 편도, 아데노이드 등의 중에 포함되어 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 어떠한 소스의 임파구로도 사용가능하지만, 바람직하기로는 비장, 골수 또는 편도이다.
쥐의 미에로마 세포로서는 8-아자구아닌 내성주를 사용하는 것이 유리하고, 공지의 것으로서는 BALB/C 쥐의 P3X65Ag 8주, P3-NS1/1-Ag4-1주, P3X63AgU1주, SP2/OAg14주, P3X63Ag8.6.5.3주, MPC11-45.6 TG1.7주, SP-1주 등이 있다.
본 발명에 있어서는 사람의 임파구와 쥐의 미에로마 세포를 융합시키기 전에 사람의 임파구를 in vitro로 마이토젠 존재하에 항원 감작한다. 사람의 경우 정상인에게서는 CMV에 대한 항체를 생산할 수 있는 능력이 있는 임파구는 존재하더라도 그 수가 매우 적다. 그렇기 때문에 목적으로 하는 하이브리도마가 얻어질 가능성이 극단적으로 낮다. 이에 대하여 본 발명의 in vitro로 사람·임파구를 감작하는 방법을 채택했을 때에는 그 항원에 특이적인 항체를 생산하는 임파구가 선택적으로 분화, 증식하고 그 결과 효율좋은 목적하는 MCA생산 하이브리도마를 얻을 수가 있다.
본 발명의 실시예에 있어서는 감작 항원으로서 CMV의 AD169주가 쓰여지고 있지만, 다른 실험용 CMV주 또는 임상분리 CMV주에서도 감작할 수 있다. 더우기 CMV 그 자체가 아니고 그 구성단백 또는 구성당단백을 사용해도 좋다.
마이토젠으로서는 임파구 분화 및 증식을 촉진시키는 것이라면 무엇이든 좋으나, 예를 들면, 포크위드, 마이토젠(PWM), B 세포증식인자(B cell growth factors, BCGF), 프로틴 A, 파이토헤마글루티닌(PHA), 콘카나발린 A가 있다. 바람직한 것은 2-200μg/ml의 PWM 또는 100분의 1에서 3분의 1용량의 BCGF이다.
감작의 방법조건은 특히 한정되는 것은 아니지만, 항원(CMV 또는 CMV유래의 단백 또는 당단백)의 농도는 1μg/ml°1ng/ml, PWM은 2-200μg/ml, BCGF는 100분의 1용량에서 3분의 1용량, 임파구(항체 생산세포)의 농도는 1×105°1×107개/ml가 적당하고, 배양온도는 35-40℃이며, 배양시간은 4-10일, 좋기로는 6-8일이다. 배양액은 사람, 소, 말 등의 혈청을 포함하는 것이라면 어느 것이라도 좋으나 특히 태아소혈청(FCS)을 함유한 배양액(예를 들면 RPMI 1640)이 바람직스럽다.
이렇게 해서 얻은 CMV로 감작된 사람의 항체 생산세포와 쥐의 미에로마 세포와는 다음의 공지의 방법에 따라서 세포 융합시킨다. 예를 들면, 임파구와 미에로마 세포를 10 : 1 : 1 : 100, 좋기로는 1 : 1∼1 : 10의 비율로 혼합하고, 적당한 세포융합용액, 예를들면 약 35% 폴리에틸렌글리콜(분자량 1,000∼6,000정도) 및 약 7.5% 디메틸술폭시드를 함유한 RPMI 1640을 가하여 실온∼37℃에서 1∼수분간 교반하며, 그후 10% FCS 가(加) RPMI 1640으로 서서히 희석하고 세정한후 HAT(히폭산틴-아미노프테린-티미딘)선택 배양액에서 세포농도가 1∼5×105개/ml로 되도록 조정한다. 이것을 0.2ml씩 예를들면 96구멍 플레이트에 나누어 담고, 5% CO2를 함유한 공기중에서 35-38℃로 3∼4주간 배양한다.
HAT 배양액중에서 하이브리도마마인 생존하고 8-아자구아닌 내성의 미에로마 세포 및 미에로마끼리의 융합세포는 생존할 수 없다(미융합 항체 생산세포는 수일만에 사멸한다). 배양후 배양액중의 항체값을 검사하고 목적으로 하는 항체를 생산하고 있는 하이브리도마만을 선택하여 단리한다(클로닝).
배양액중의 항체값의 검사는 라디오이무노앗세이법(RIA), 효소 항체법(ELISA), 형광항체법등 항원에의 항체 결합 그 자체를 검출하는 방법과, 바이러스의 생물활성을 저해하는 항체의 활성을 관찰하는 방법등으로 행할 수가 있다.
클로닝에 의하여 선택된 본 발명의 항 CMV·사람 MCA를 생산하는 쥐-사람 하이브리도마는 동결시켜 보존할 수 있다. 이러한 하이브리도마의 셀라인(세포주) 및/또는 거기서 유래하는 세포주를 적당한 방법으로 대량 배양하면 배양상청에서 본 발명의 목적으로 하는 사람 MCA를 얻을 수 있다. 또, 이 하이브리도마를 동물에 이식하여 종양화하고 그 복수나 혈청에서 사람 MCA를 얻을 수도 있다.
이상과 같이하여 얻은 항 CMV·사람 MCA는 다음과 같은 특성을 갖는다. 본 발명에서 얻은 항 CMV·사람 MCA는 많은 실험용 CMV주 및 임상 분리주에 공통으로 반응한다. 그러나 다른 헤르페스군 바이러스인 단순 헤르페스 바이러스, EB 바이러스, 수두대상포진바이러스에는 반응하지 않는다. 또, CMV감염세포에는 반응하지만 비감염세포에는 반응하지 않는다. 따라서, 이들 MCA는 CMV에 특이적이라고 할 수 있다. 이렇게 CMV에 특이적인 사실이 명료하게 나타난 사람 MCA는 본 발명에서 처음으로 얻어진 것이다.
CMV는 많은 항원물질로써 구성되어 있다. 그래서 본 발명의 사람 MCA가 어떠한 구성성분에 대하여 반응하는가 검토한 결과, 제1군의 MCA는 분자량 약 64,000의 단백(당단백 포함, 이하 같음)내지는 약 64,000을 주성분으로 하는 복수의 항원 단백에 반응하는 사실을 알았다. 이들 MCA는 바이러스를 중화하는 능력을 갖고 있지 않다.
한편, 제2군의 MCA는 분자량 약 130,000의 단백과 분자량 약 55,000의 단백에 반응하고 이 군의 MCA중에는 강한 바이러스 중화활성을 갖고 있는 MCA가 있는 것을 알았다. 이들 특성에서 생각컨대 CMV 감염의 진단에는 제1군과 제2군의 MCA가 사용할 수 있지만 CMV감염의 에방 및 치료에는 제2군의 MCA가 적합하다.
본 발명에 있어서는 항원물질을 특히 한정하는 것은 아니며, CMV특이적 사람 MCA는 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 그러나 예방 및 치료라는 목적에서 생각했을때 MCA에 바이러스 중화(불활화)활성이 있다고 하는 점은 매우 중요한 특성이다. 이하, 실시예에 따라 본 발명을 상술한다.
[실시예 1]
(1) CMV항원의 제작
단층으로 증식한 HEL 세포에 AD169주 감염세포를 7 : 1의 비율로 혼합하고 5일간 CO2인큐베이터중에서 배양하였다. 이리하여 얻은 감염세포를 0.1% EDTA를 함유한 인산완충생리식염수로 떼내어 모았다. 다음으로 45초간 초음파 파쇄하고 3,000rpm으로 20분간 원심한 상청을 얻었다. 이것을 60%와 20%의 중층 설탕용액상에 놓고 10,000Xg으로 1시간 원심하였다. 60%층과 20%층 사이에서 바이러스는 모아지며, 이것을 채취하여 재차 초음파처리로써 잘 분산시켰다. 이것을 1.28g/cm3의 CsCl2용액상에 놓고 100,000Xg으로 42시간 원심하였다. 그 결과, 밀도구배가 형성된 CsCl2용액의 1.29g/cm3농도인 곳에 CMV가 모아졌으므로 이를 채취하여 in vitro 감작용 항원으로 사용하였다. 또, ELISA용 항원은 다음과 같이 조제되었다.
AD169를 감염시킨 HEL 세포를 CO2인큐베이터중에서 배양하고 세포변성이 모든 세포에서 관찰되도록 이뤄진 시점에서 감염세포를 모았다. 이 감염세포를 3분간 초음파 처리하고 3,000rpm으로 20분간 원심하고 그 상청을 얻었다. 이것을 ELISA용 항원으로 이용하였다.
(2) CMV에 의한 임파구 감작
사람의 비장 임파구를 배양액 A(RPMI 1640+20% 태아소혈청+20mM HEPES+2mM 글루타민+1mM Na 피루빈산+0.02mg/ml 세린+80μg/ml 겐타마이신)에 부유시켰다. 세포농도는 12×105개/ml였다. 이 세포부유액을 1ml씩 배양 플레이트(24구멍)의 15구멍에 넣었다. 그것들을 3구멍씩 5군으로 나누고 제1군을 무첨가, 제2군에는 CMV항원 12ng단백/ml, 제3군에는 BCGF 0.1ml, 제4군에는 같은 량의 CMV와 BCGF, 제5군에는 CMV와 20μg/ml의 PWM을 첨가하였다. 이 배양 플레이트를 37℃, 5% CO2함유공기에서 6일간 배양하였다.
(3) 쥐·미에로마세포 P3X63Ag8U1주(P3U1이라고 약기한다)와의 세포융합
미리 P3U1을 배양액 B(RPMI 1640+10% 태아소혈청+2mM 글루타민+80μg/ml 겐타마이신)중에서 배양해두었다. 사용시의 세포농도는 6×105개/ml였다. 상기(2)의 감작 임파구(3구멍을 합쳤다) 5군과 P3U1을 각각 별도로 무혈청 RPMI 1640으로 2회 세정하였다. 각 군 3구멍의 임파구와 5×106개의 P3U1을 시험관 중에서 합쳤다. 1,500rpm으로 5분간 원심하고 상청을 버렸다. 세포펠릿을, 시험관을 두드려서 잘 분산시켰다. 여기에 0.5ml의 폴리에틸렌글리콜액(RPMI 1640 5.75ml+폴리에틸렌글리콜 1,000 3.5ml+디메틸술폭사이드 0.75ml)(PEG액이라고 약기한다)를 가하여 세포를 느리게 부유시켰다. 1분후에 0.5ml RPMI 1640을 가하고 다시 1분후에 1ml RPMI 다시 2분 후에 4ml의 HAT배양액(RPMI 1640+20% 태아소혈청+80μg/ml 겐타마이신+95μM 히폭산틴+0.4μM 아미노프테린+1.6μM 티미딘), 다시 2분후에는 4ml의 HAT배양액을 가했다.
마지막으로 HAT배양액으로 25ml 세포부유액으로 하였다. 이것을 배양 플레이트(96구멍) 1매에 뿌리고 37℃, 5% CO2함유 공기중에서 배양하였다. 1분간마다 반량의 배양액을 새로운 HT배양액(HAT에서 A를 제거한 것)으로 교환하여가며 하이브리도마를 얻었다.
(4) 사람 IgG와 항 CMV항체의 측정
ELISA에 의하여 측정하였다. 사람 IgG를 측정하기 위하여 염소 항사람 IgG항체(10μg/ml)를, 또는 항 CMV항체를 측정하기 위하여 CMV(AD169주) 2μg단백/ml을 50㎕/구멍씩 각각 팔콘(Flacon)·마이크로테스트 III의 96구멍 플레이트에 고정하였다.
이 플레이트에 하이브리도마 배양상청 60㎕을 가하고 실온에서 1시간 방치하였다. 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 행크스(Hank's) 염류완충액(HBSS-B)으로 3회 세정한 후 염소항 사람 IgG항체-알칼리포스파타제(2,000배 희석액)을 60㎕ 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 HBSS-B로 3회 세정하면서 P-니트로페닐포스페이트를 1M 디에타놀아민+1mM MgCl2의 PH 9.8용액에 0.6mg/ml의 비율로 용해한 용액 100㎕를 가했다. 30분에서 60분후에 405nm의 흡광도를 측정하고 표준 IgG액 또는 표준 CMV 양성 혈청과의 비교로부터 그 값을 산출하였다. 모든 군도 96구멍 플레이트 1매에 세포를 뿌리고 96구멍중의 하이브리도마가 육성된 구멍의 수(육안으로 판정), 다시 그 중에서 사람 IgG를 생산하고 있는 하이브리도마를 가진 구멍수, 그리고 항 CMV항체를 생산하고 있는 구멍수를 표 1에 나타냈다.
CMV와 BCGF를 가했을때에 가장 많은 항 CMV항체 생산 하이브리도마가 육성되었다.
[표 1]
[실시예 2]
사람 비장 임파구를 실시예 1의 (2)와 같이 CMV 또는 PWM으로 감작하고 실시예 1의 (3)과 같이 P3U1와 세포 융합을 행하였다. 얻은 하이브리도마중 CMV에 대한 MCA을 생산하고 있는 하이브리도마를 이하와 같이 클로닝하였다.
(1) 하이브리도마의 클로닝
클로닝은 한정 희석법을 이용하였다. 항 CMV항체 양성의 구멍에서 세포를 취출하고 세포수를 세어 배양액 B를 사용한 1개/구멍 또는 10개/구멍으로 세포를 뿌렸다. 2주일후에 세포가 충분히 증식하였으며, 그 상청에 항 CMV·MCA가 있는가 없는가를 ELISA에 의하여 측정하고 항 CMV·MCA생산 하이브리도마를 선별하였다. 이리하여, 하이브리도마 C1, C2, C3, C4, C7, C23 및 C41이 수립되었다. 이들 하이브리도마는 안정하게 IgG형의 항 CMV·사람 MCA를 생산하고 있었다. 하이브리도마 C41은 아메리컨 타이프 컬춰 콜랙숀(ATCC)에 1986년 9월 29일에 기탁되었고 기탁번호는 HB 9215이다.
(2) 항 CMV·사람 MCA의 조제
얻은 하이브리도마의 하나인 C41를 무혈청 배지 ITES(RPMI 1640 2용+덜베코 MEM 1용+F12 1용+인슐린 8.5μg/ml+트랜스페린 2μg/ml+에타놀아민 20μM+셀레나이트 2.5×10-8M)중에서 배양하였다. 그 배양상청을 한외여과(아미콘 P30)로 농축하고0.02M 인산나트륨(pH 7.8)에 대하여 투석하였다. 이 완충액으로 평형화한 DE 52컬럼(파마시아사제)에 걸고 미흡착 분획에 사람 MCA를 회수하였다. 도디실황산나트륨·폴리아크릴아미드 전기영(sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGe)으로 분석한 결과, H고리와 L고리로 되는 정제 MCA표준품인 사실이 확인되었다.
[실시예 3]
(1) 항 CMV·사람 MCA의 감염세포에 대한 반응성 CMV의 AD169주 또는 HI-1주를 감염시킨 HEL세포 및 감염되지 아니한 세포에 항 CMV·사람 MCA인 C1, C3, C4, C7, C23, C41을 반응시켰다. 다시 플오레세인 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)표지(labeled)항 사람 IgG항체를 반응시켜 형광현미경하에서 관찰하였다. 그 결과, 어떤 MCA도 비감염 세포에는 반응치 않고 감염세포만에 반응하였다. 또, C1, C3, C4, C7은 AD169 또는 Hi-1감염세포의 세포질내 CMV항원에 반응하고 세포막상의 CMV항원에는 반응하지 않았다. 다른 한편, C23과 C41은 세포질내 항원과 세포막상 항원 양쪽에 반응하였다.
(2) 항 CMV·MCA의 가용화 바이러스 항원에 대한 반응성
항 CMV·MCA의 헤르페스속 바이러스에 대한 결합성을 조사하기 위해서 HSV-1형 2주, HSV-2형 2주, VZV 2주, CMV 6주, EBV 1를 각각 감염시킨 HEL세포 및 비감염 HEL세포에서 실시예 1의 (1)과 같은 가용화 항원을 조제하고 실시예 1의 (4)와 같은 ELISA를 실시하였다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.
항 CMV·MCA(C1, C2, C3, C7, C23, C41)은 모두 CMV에만 결합하고 다른 헤르페스속 바이러스, 숙주세포에는 결합하지 않았다. 또 C41를 제외한 항 CMV·MCA는 CMV 6주 모두에 결합하였다. 그리고, H1은 단순 헤르페스 바이러스(HSV)에 대한 사람 MCA이다.
[표 2]
[실시예 4]
[항 CMV·사람 MCA의 바이러스 중화 활성]
사람 MCA용액 200㎕, 200CH 50/ml의 신선한 몰모트 혈청을 5배 희석한 용액 100㎕, 및 CMV(AD 169주) 737pfu(plaque-forming units)를 포함한 용액 100㎕를 혼합하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 이 혼합액 100㎕를 6구멍 플레이트에서 배양한 HEL세포에 걸고 37℃에서 1시간 인큐베이트한후 0.5%(M/W)아가로스 및 5%(V/V) FCS를 함유한 MEM배지를 가하고, CO2인큐베이터 내에서 11일간 배양하였다. 이 단층 세포를 10% 포르말린 수용액으로 고정하고 0.3% 메틸렌 블루수용액에 의해서 염색한 후 CMV감염에 의한 플라크수(pfu)를 측정하였다. 중화활성은 다음과 같이 표시하였다.
결과를 제1도에 나타냈다. C23은 0.75㎍/ml에서, C41은 0.18㎍/ml에서 50% 중화를 나타냈다. 그러나 C1,C3,C4,C7은 전부 중화활성을나타내지 않았다. 또, Hi-1주를 사용했을 때도 C23은 3.3㎍에서 100%중화, C41은 0.95㎍/ml에서 100% 중화를 나타낸데 대해서 C3는 17.7㎍/ml에서 35% 중화밖에 나타나지 않았다. 또, 실시예 3-(2)에 게재된 AD 69주 이외의 CMV주 5주에 대하여 중화활성을 조사하였더니 C23은 10㎍/ml에서 95% 이상의 중화를 모든 주에 대하여 나타냈다. 한편, C41은 실시예 3-(2)의 표 2에 표시한 ELISA의 데이타와 같이 10㎍/ml에서는 No. 12주와 YAN-3주에 대해서는 각각 20%, 64%의 약간 약한 중화활성을 나타내고, 다른 주에 대하여는 80% 이상의 중화활성을 나타냈다.
[실시예 5]
[항 CMV·사람 MCA의 면역침강분석]
사람 MCA가 반응하는 바이러스 입자의 구성성분이 무엇인가 결정하기 위하여 면역침강분석을 행하였다. HEL세포에 CMV(AD169주)를 감염시키고 35S-메티오닌에서 아이소토프 표식을 행하였다. 표식한 세포를 0.01M, Tris·HCl+0.15M NaCl+1% 디옥시클산나트륨+1% Triton X100+0.01% 도데실 황산 나트륨(SDS)+1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(pH 7.4)(용해액)으로 용해하였다. 이것에 항 CMV·사람 MCA를 가하여 항원·항체복합물을 형성시켜 두고 다시 프로틴 A-세파로스 4B에 의해서 복합체를 흡착 정제하였다. 이것을 0.125M Tris·HCl+1% SDS+3% 2-메르캅토에타놀+15% 글리세린(pH 8.2)으로 3분간 100℃ 처리하고 그 상청을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 걸었다. 영동 후 겔을 건조시키고 X선 필름에 -70℃로 노출시켰다. 그 결과를 제2도에 나타냈다. C1은 약 64,000과 약 50,000에, C2는 약 64,000과 약 46,000에 C4와 C7은 약 64,000에, C23과 C41은 약 130,000과 약 55,000의 분자량을 가진 바이러스 항원에 반응하는 사실이 판명되었다.
[실시예 6]
[항 CMV·MCA의 아이소타이프의 동정(同定)]
사람 MCA의 아이소타이프의 동정은 이하와 같이 행하였다. H고리의 동정은 사람 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4에 대한 토끼항 혈청을 사용한 면역확산법(Ouchterlony법)을 이용하고, L고리의 동정은 AD169감염세포를 항원 플레이트로 하여 2차 항체에 알칼리포스파타제 표식한 염소 항 사람 K 고리 내지는 λ고리를 이용한 ELISA를 행하였다. 결과를 표 3에 나타냈다.
[표 3]
[산업상 이용가능성]
본 발명의 항 CMV·사람 MCA는 CMV감염 진단약으로써 또한 CMV 감염증의 예방 및 치료약으로서 이용가능하다.
Claims (1)
- in vitro에서 마이토젠 존재하에 사이토메갈로 바이러스 또는 사이토메갈로 바이러스 유래의 단백 또는 당단백으로 감작한 사람·임파구와 쥐·미에로마 세포를 세포융합시켜 어은 하이브리도마중에서 사이토메갈로 바이러스에 대한 사람·모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하고, 다음으로 이 하이브리도마 및/또는 거기서 유래하는 세포주를 배양하고, 그 배양상청에서 사람·모노클로날 항체를 채취하여서 되는 사리토메갈로 바이러스에 대한 사람·모노클로날 항체의 제조법.
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