DE3650032T2

DE3650032T2 - Anticytomegaloviraler menschlicher monoklonaler antikörper und dessen herstellung.

Info

Publication number: DE3650032T2
Application number: DE3650032T
Authority: DE
Inventors: Shigeki Fujinaga; Yasuhiko Masuho; Yoh-Ichi Matsumoto; Toru Sugano
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1985-12-06
Filing date: 1986-12-02
Publication date: 1995-03-09
Anticipated expiration: 2006-12-03
Also published as: AU6721887A; EP0248909A4; KR910000736B1; US5043281A; EP0248909B1; KR880700823A; DE3650032D1; EP0248909A1; WO1987003602A1; AU590656B2; ATE110084T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft humane monoklonale Antikörper (im folgenden mit MCA abgekürzt) gegen Cytomegalovirus (im folgenden mit CMV abgekürzt) und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Das Ziel dieser Erfindung besteht darin, humane MCA, die für CMV spezifisch sind, zur Verfügung zu stellen, welche für die Diagnose, die Vorbeugung und die Therapie von infektiösen CMV-Krankheiten brauchbar sind.
CMV ist eines der Viren, welche der Gruppe der Herpesviren angehören und aus DNA, Kernprotein, Capsid und Hülle zusammengesetzt sind. Es werden in der Regel zwar kaum irgendwelche Krankheiten verursacht, selbst dann, wenn ein Mensch mit diesem Virus infiziert wird, es verursacht jedoch manchmal schwere Infektionen, wie Hepatitis bei einem infizierten Neugeborenen, welches eine geringe Immunität besitzt, und interstitielle Pneumonie bei einem Patienten, der wegen einer Organtransplantation immunsuprimiert ist. Demgemäß werden in medizinischen Kreisen wirksame Mittel zur Diagnose, Vorbeugung und Therapie solcher Infektionen dringend benötigt. Condie et al. (siehe American J. Medicine, 30. März 1984, Seiten 134-141) berichten über erfolgreiche Fälle, bei denen eine Verabreichung von humanem Serumimmunglobulin mit einem hohen Antikörpertiter gegen CMV Empfänger von Knochenmarktransplantaten vor CMV-Infektionen und interstitieller Pneumonie, die davon stammt, schützte. Humanes Serumimmunglobulin mit einem hohen Titer wird durch Sammeln und Fraktionieren von ausschließlich hochtitrigem Blutplasma hergestellt, wobei seine Auswahl durch Überprüfen des Antikörpertiters des Serums der Spender vorher getroffen wird. Der Antikörpertiter des auf diese Weise hergestellten Serumimmunglobulins gegen CMV ist maximal das 10-fache jenes von Serumimmunglobulin, das aus Blutplasma hergestellt wird, welches statistisch gesammelt wird, und es ist sehr schwierig, ein solches hochtitriges Serumimmunglobulin in einer für eine stabilisierte Versorgung genügenden Menge zu sammeln.
Die Herstellung von hochreinem Antikörper oder MCA ist seit der Einführung der Hybridom-Methode von Milstein und Köhler möglich. Rasmussen et al. (siehe Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81, Seiten 876-880, 1984) stellten Hybridome zur Verfügung, die MCA produzierten, die für CMV spezifisch sind, indem sie Maus- Myelomzellen und Milzzellen von mit CMV immunisierten Mäusen fusionierten. Neben ihr haben einige Forschergruppen Maus-MCA erhalten, die für CMV spezifisch sind (zum Beispiel Goldstein et al., in Infection and Immunity, 38, Seiten 273-281, 1982; Pereira et al., in Infection and Immunity, 36, Seiten 924-932, 1982). Von diesen MCA besitzen wenige MCA eine genügende wirksame Kapazität, Viren zu neutralisieren; aber MCA, die von Rasmussen et al. zur Verfügung gestellt wurden, besitzen die Kapazität, CMV bei etwa 10 ug/ml zu neutralisieren. Diese Neutralisierungskapazität ist sehr hoch, verglichen mit hochtitrigem Serumimmunglobulin, und es wird erwartet, daß sie zur Vorbeugung oder Heilung von CMV-Infektionen verwendet werden kann. Rasmussen et al. (J. Virology, 55(2), 274-280, 1985) haben auch über murine, monoklonale Antikörper berichtet, welche Polypeptide mit 130 000 und 55 000 Dalton erkennen und von mit CMV infizierten Zellen stammen. Allerdings werden diese MCA bei der Verabreichung an Menschen als eine Fremdsubstanz erkannt, da sie von Mausen stammen, was gefährliche Nebenwirkungen verursacht. Aus diesem Grund wird auf die Entwicklung von anti-CMV MCA, die von Menschen statt von Mäusen stammen, gehofft.
Humane MCA werden in der Regel von Hybridomen produziert, die durch Zellfusion zwischen Maus- Myelomzellen, humanen Myelomzellen oder Zellen, die von anderen lymphatischen Geweben und humanen Lymphozyten gewonnen werden, erhalten werden. Sie werden auch von Lymphoblastzellen produziert, die durch Transforumieren von humanen Lymphozyten mit dem Epstein-Barr-Virus erhalten werden. Seit 1980 sind viele Versuche unternommen worden, humane MCA zu entwickeln, aber jede Methode hat ihr eigenes charakteristisches Problem. Die Produktion von MCA aus einem Hybridom, das durch Zellfusion von Maus-Myelomzellen mit humanen Lymphozyten erhalten wird, ist nicht stabil, während die Zellfusion zwischen humanen Myelomzellen und humanen Lymphozyten eine sehr geringe Wirksamkeit aufweist. Die Produktion von MCA aus Lymphoblastzellen, die mittels des EB-Virus erhalten werden, weist die Probleme einer geringen Ausbeute und einer Instabilität auf. Außerdem kann das EB-Virus Tumore verursachen, wodurch ein ernstes Sicherheitsproblem besteht. Die Herstellungstechniken für MCA-produzierende Zellen weisen große Schwierigkeiten auf, wie oben beschrieben; es gibt jedoch eine andere schwierige Schranke, und wir fanden, daß diese in den Mitteln zur Erhaltung der für spezielle Antigene spezifischen MCA liegt. Dies ist ein Problem, daß in der Regel beim Sammeln von Lymphozyten aus voll immunisierten Menschen gesehen wird. Allgemein gesprochen sind Lymphozyten von normalen Personen in vielen Fällen durch CMV sensibilisiert, aber das Ausmaß der Immunität ist sehr gering. Sogar wenn Hybridome oder Lymphoblastzellen von Lymphozyten normaler Personen hergestellt werden, kann man daher kaum erwarten, Zellen zu erhalten, die anti-CMV MCA produzieren können.
Hinsichtlich humaner MCA gegen CMV wurde über einen einzigen Fall einer Herstellung einer Zellinie berichtet, die diese produziert (siehe J. Immunol., 133 Seiten 2202-2205). Gemäß dieses Berichtes wird eine MCA-produzierende Zellinie durch Transformieren von Lymphozyten normaler Personen mit dem EB-Virus erhalten. Der Bericht enthält jedoch lediglich eine Photographie eines fluoreszierenden Antikörpers, und es ist nicht klargestellt, ob eine Zellinie, welche MCA mit gesicherter Stabilität produziert, hergestellt wurde oder nicht. Außerdem ist damit ein Karzinogenitätsproblem verbunden, das vom EB-Virus, wie vorher erwähnt, stammt, und es wird verstanden, daß es ein hohes Lebensrisiko bei seiner Verabreichung in vivo mit sich bringen kann. Und es ist auch ersichtlich gemacht, daß dieser MCA nicht in der Lage ist, CMV zu neutralisieren, sogar falls er an CMV bindet.
Wie oben erklärt, ist das schwierigste Problem, auf das man beim effizienten Erhalten eines gewünschten spezifischen humanen MCA trifft, die Schwierigkeit, humane Lymphozyten mit einem spezifischen Antigen ausreichend zu immunisieren. In einem Fall, wo Mäuse verwendet werden, kann ihnen sogar ein Antigen, welches in vivo gefährlich ist, verabreicht werden, und auch die Immunisierung kann gemäß einem Schema, das für den Zweck gut geeignet ist, ausgeführt werden. Dies ist im Fall von Menschen nicht praktikabel, da CMV ein Pathogen ist, bis heute kein Impfstoff entwickelt wurde und es moralisch nicht zulässig ist, CMV absichtlich an Menschen zum Zweck der Immunisierung zu verabreichen; ein weiteres Problem, das der Produktion humaner MCA ständig entgegensteht. Sowohl die Hybridom-Methode als auch die EB-Virus-Methode haben ihre Vor- und Nachteile, wie oben beschrieben.

Offenbarung der Erfindung

Als Ergebnis intensiver Forschungen, die mit dem Ziel durchgeführt wurden, humane anti-CMV MCA zu erhalten, waren die Erfinder erfolgreich, Hybridome zu erhalten, die mit einem Verfahren humane anti-CMV MCA produzieren, in welchem Verfahren humane Lymphozyten, die in vitro auf CMV oder Protein oder Glycoprotein, das von CMV stammt, sensibilisiert sind, und Maus-Myelomzellen (in der Gegenwart eines Mitogens) einer Zellfusion unterworfen werden. Auf diese Weise erhaltene Hybridome und/oder eine Zellinie, die von ihnen stammt, werden dann kultiviert, und humane anti-CMV MCA werden vom Kulturüberstand erhalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein humaner monoklonaler Antikörper gegen Cytomegalovirus zur Verfügung gestellt, der 1) Cytomegalovirus-Antigenproteine mit Molekulargewichten von etwa 130 000 und etwa 55 000, bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, erkennt, 2) in der Lage ist, Cytomegalovirus zu neutralisieren, und 3) dessen Isotyp IgG1 ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper gegen Cytomegalovirus zur Verfügung gestellt, bei dem: (1) humane Lymphozyten in vitro in Gegenwart eines Mitogens gegen (a) Cytomegalovirus oder (b) Proteine oder Glycoproteine, stammend von Cytomegalovirus, sensibilisiert werden, (2) die sensibilisierten humanen Lymphozyten von Schritt (1) mit Maus- Myelomzellen fusioniert werden, (3) auf ein aus Schritt (2) erhaltenes Hybridom selektiert wird, das Antikörper gegen Cytomegalovirus produziert, die Cytomegalovirus-Antigenproteine mit einem Molekulargewicht von etwa 130 000 und etwa 55 000, bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, erkennen und in der Lage sind, Cytomegalovirus zu neutralisieren, (4) das selektierte Hybridom aus Schritt (3) oder eine davon stammende Zellinie kultiviert wird und (5) die humanen monoklonalen Antikörper von dem kultivierten Hybridom oder einer Zellinie von Schritt (4) erhalten werden.
Der humane MCA dieser Erfindung ist ein Antikörper, welcher mit CMV und/oder mit CMV infizierten Zellen reagiert. Der humane anti-CMV MCA dieser Erfindung ist vom Typus IgG1.
Ein erfindungsgemäßer MCA wird aus dem Hybridom C41 produziert, welcher bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer HP 9215 hinterlegt ist, oder aus jedem anderen ähnlichen Hybridom, welches das Antigenprotein erkennt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Zeichnung, welche die Neutralisationsaktivität der erfindungsgemäßen humanen anti-CMV MCA gegen CMV zeigt. Fig. 2 ist eine Zeichnung, die das Ergebnis eines Immunfällungsassays von humanen anti-CMV MCA zeigt, die mit den Hybridomen C23 und C41 dieser Erfindung produziert wurden.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Humane Lymphozyten, die in dieser Erfindung verwendet werden, sind in der Milz, den Lymphknoten, im peripheren Blut, dem Knochenmark, Tonsillen und Adenoiden enthalten. Es können Lymphozyten jeglicher Quelle verwendet werden, um das Ziel dieser Erfindung sicher zu erreichen; es sind jedoch jene bevorzugt, die von der Milz, dem Knochenmark und von den Tonsillen erhalten werden.
Als Maus-Myelomzellen werden vorteilhaft Zellinien verwendet, die gegen 8-Azaguanin resistent sind. Unter den öffentlich bekannten sind: die Zellinie P3X65Ag8, die Zellinie P3-NS1/1-Ag4-1, die Zellinie P3X63AgU1, die Zellinie 5P2/OAg14, die Zellinie P3X63Ag8.6.5.3, die Zellinie PMC-45.6.TG1.7 und die Zellinie SP-1 der BALB/C-Maus.
In dieser Erfindung werden humane Lymphozyten in vitro in Gegenwart eines Mitogens vor der Zellfusion zwischen den humanen Lymphozyten und den Maus-Myelomzellen auf ein Antigen sensibilisiert. Obgleich sie bei normalen Personen vorhanden sind, findet sich bei Menschen eine sehr kleine Anzahl von Lymphozyten, die Antikörper gegen CMV produzieren können. Es besteht somit nur eine geringe Möglichkeit, die gewünschten Hybridome zu erhalten. Im Gegensatz dazu beginnen die Lymphozyten, welche einen Antikörper spezifisch auf das Antigen produzieren, wenn das erfindungsgemäße Verfahren angewendet wird, in welchem humane Lymphozyten in vitro auf ein Antigen sensibilisiert werden, eine selektive Differenzierung und Vermehrung und ermöglichen es in der Folge, die gewünschten MCA-produzierenden Hybridome effizient zu erhalten.
In den Beispielen dieser Erfindung wird der CMV-Stamm AD 169 als das sensibilisierende Antigen verwendet, aber auch andere CMV-Stämme zur experimentellen Verwendung oder klinisch abgetrennte CMV-Stämme können für die Sensibilisierung verwendet werden. Statt CMV selbst können auch seine Aufbauproteine oder Aufbauglycoproteine verwendet werden.
Es kann jeder Typus Mitogen verwendet werden, sofern es die Differenzierung und Vermehrung von Lymphozyten fördern kann, und als Beispiele werden angegeben: das Pokeweed-Mitogen (PWM), der B-Zellenwachstumsfaktor (BCGF), das Protein A, das Phytohemagglutinin (PHA) und das Concanavalin A. Bevorzugte sind 2-200 ug/ml PWM und 1/100-1/3 Volumen BCGF.
Für das Verfahren und die Bedingungen der Sensibilisierung ist keine Grenze spezifisch gesetzt; Empfohlene Bedingungen sind jedoch z. B. eine Antigen-(CMV oder ein Protein oder ein Glycoprotein, die von CMV stammen)-Konzentration von 1 ug/ml-1 ng/ml, eine PWM-Konzentration von 2-200 ug/ml, eine BCGF-Konzentration von 1/100-1/3 Volumen und eine Lymphozyten-(antikörperproduzierende Zellen)-Konzentration von 1·10&sup5;-1·10&sup7; Zellen/ml. Es ist ratsam, die Kulturtemperatur auf 35-40ºC und die Kulturzeit bei 4-10 Tagen, vorzugsweise 6-8 Tagen, zu halten. Es kann jedes flüssige Kulturmedium verwendet werden, sofern es humanes Serum, bovines Serum, Schweineserum, etc. enthält; ein flüssiges Kulturmedium (wie RPMI 1640), welches fötales Kälberserum (FCS) enthält, ist besonders bevorzugt.
Die auf diese Weise erhaltenen antikörperproduzierenden humanen Zellen, die auf CMV und Maus-Myelomzellen sensibilisiert sind, werden dann einer Zellfusion nach einer öffentlich bekannten Methode unterworfen. Zum Beispiel werden Lymphozyten und Myelomzellen in einem Verhältnis von 10 : 1-1 : 100, vorzugsweise 1 : 1-1 : 10, gemischt, und eine geeignete Zellfusionslösung, wie RPMI 1640, welche etwa 35% Polyethylenglycol (Molekulargewicht etwa 1000-6000) enthält, und etwa 7,5% Dimethylsulfoxid werden dem Gemisch zugegeben. Nachdem das Gemisch bei Raumtemperatur -37ºC 1 bis einige Minuten gerührt wurde, wird es nach und nach mit RPMI 1640, welches FCS enthält, verdünnt. Nach Waschen wird das Gemisch mit HAT-(Hypoxantin-Aminoprerin-Thymidin)-selektivem Medium auf eine Zellkonzentration von 1-5·10&sup5; Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden in 0,2 ml Portionen in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, um in 5% CO&sub2;-Luft bei 35-38ºC 3-4 Wochen lang kultiviert zu werden. Im flüssigen HAT Kulturmedium überleben nur Hybridome, und gegen 8-Azaguanin resistente Myelomzellen, und zwischen Myelomen fusionierte Zellen können nicht überleben (unfusionierte antikörperproduzierende Zellen sterben im Verlauf einiger Tage ab).
Nachdem die Kultivierung beendet ist, wird der Antikörpertiter in jedem flüssigen Kulturmedium gemessen, und nur solche Hybridome, welche Antikörper wie gefordert produzieren, werden selektiert und isoliert (Klonen). Die Messung des Antikörpertiters im flüssigen Kulturmedium kann mit einer solchen Methode vorgenommen werden, in der die Bindung des Antikörpers an das Antigen als Radioimmunoassay (RIA), als Enzymverbundener Immunosorbentassay (ELISA) und als Fluoreszenzantikörpertechnik geprüft wird, und auch durch ein Verfahren, in welchem die Antikörperaktivität, welche die biologische Aktivität des Virus hemmen kann, gemessen wird. Ein humanes Maus-Hybridom, welches die erfindungsgemäßen humanen Anti-CMV MCA produzieren kann, kann im gefrorenen Zustand gelagert werden. Wenn diese Hybridomzellinie und/oder Zellinie, die davon stammt, mit einer geeigneten Methode massenkultiviert wird, können die erwünschten humanen MCA dieser Erfindung aus dem Kulturüberstand erhalten werden. Dieses Hybridom kann auch Tieren transplantiert werden, um Tumor zu verursachen, und humane MCA können von ihrem abdominalen Ödem und Serum erhalten werden.
Der auf diese Weise erhaltene humane anti-CMV MCA besitzt die folgenden charakteristischen Eigenschaften. Der mit dieser Erfindung erhaltene humane anti-CMV MCA reagiert gewöhnlich mit vielen Arten experimenteller CMV-Stämme und klinisch abgetrennter Stämme, reagiert jedoch nicht mit anderen Viren der Herpesgruppe, inklusive des Herpes simplex-Virus, EB-Virus, des Chickenpox Herpeszoster-Virus. Er reagiert mit CMV-infizierten Zellen, aber nicht mit uninfizierten Zellen. Man kann daher sagen, daß diese MCA für CMV spezifisch sind. Humane MCA, von denen somit klar herausgestrichen wurde, daß sie für CMV spezifisch sind, sind mit dieser Erfindung zum ersten Mal erhältlich geworden.
CMV sind aus vielen antigenen Substanzen zusammengesetzt. Als Ergebnis der Studie, die durchgeführt wurde zu klären, mit welchen CMV-Bestandteilen die humanen MCA dieser Erfindung reagieren, ist geklärt worden, daß MCA der ersten Gruppe, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, mit Proteinen (inklusive Glycoproteinen; das soll auch später zutreffen) mit einem Molekulargewicht von etwa 64 000 und einer Reihe von Antigenproteinen, die hauptsächlich aus Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 64 000 bestehen, reagieren. Diese MCA besitzen keine Fähigkeit, Virus zu neutralisieren. Während MCA der zweiten Gruppe, welche einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden, mit Proteinen, die ein Molekulargewicht von etwa 130 000 aufweisen, und mit Proteinen, die ein Molekulargewicht von etwa 55 000 aufweisen, reagieren, wurde geklärt, daß einige MCA, die dieser Gruppe angehören, eine starke Aktivität zur Neutralisierung von Virus besitzen. Von diesen Eigenschaften läßt sich beurteilen, daß MCA, die der ersten Gruppe angehören, und jene, die der zweiten Gruppe angehören, für die Diagnose einer CMV-Infektion verwendet werden können, während MCA, die der zweiten Gruppe angehören, in vorteilhafter Weise für die Vorbeugung und Therapie einer CMV-Infektion verwendet werden können.
In dieser Erfindung wird für antigene Substanzen keine Grenze gesetzt, und alle humanen MCA, die für CMV spezifisch sind, sind im Umfang dieser Erfindung enthalten. Es ist jedoch eine sehr wichtige Eigenschaft für MCA, daß sie eine Aktivität zur Neutralisierung (Inaktivierung) von Virus aufweisen, beurteilt vom Standpunkt einer Vorbeugung und Therapie.
Die vorliegende Erfindung wird mit den folgenden Beispielen detailliert beschrieben.

Beispiel 1

(1) Herstellung von CMV-Antigen

HEL-Zellen, die in Monoschichten gewachsen waren, wurden mit Zellen, die mit dem Stamm AD 169 bei einem Verhältnis von 7 : 1 infiziert worden waren, gemischt und 5 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator kultiviert. Die auf diese Weise erhaltenen infizierten Zellen wurden mit einer phosphatgepufferten Salzlösung, enthaltend 0,1% EDTA, abgezogen und gesammelt. Die gepoolten Substanzen wurden dann einem Aufbrechen mit Ultraschall 45 Sekunden lang unterworfen und 20 Minuten mit 3 000 UpM zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, welcher auf eine Doppelschicht-Succrose-Lösung gegeben wurde, wobei eine Schicht 66% und die andere 20% war, und bei 10 000 · g 1 Stunde lang zentrifugiert. Beim natürlichen Zusammentreffen zwischen der 60%-Schicht und der 20%-Schicht wurden die Viren gesammelt und gründlich durch Ultraschallbehandlung dispergiert. Die Dispergierflüssigkeit wurde auf eine CsCl&sub2;-Lösung von 1,28 g/cm³ gegeben und bei 100 000 g 42 Stunden zentrifugiert. Als Ergebnis wurde gefunden, daß sich die CMV in der CsCl&sub2;-Lösung bei einer Dichte von 1,29 g/cm³ sammelten, wo ein Dichtegradient erzeugt wurde, und für den Gebrauch als Antigen für die Sensibilisierung in vitro gesammelt.
Auch ein Antigen für die ELISA-Verwendung wurde wie folgt hergestellt. HEL-Zellen, die mit AD 169 infiziert worden waren, wurden in einem CO&sub2;-Inkubator kultiviert, und infizierte Zellen wurden gesammelt, als gesehen wurde, daß alle Zellen eine Zelldenaturierung entwickelt hatten. Diese Zellen wurden 3 Minuten mit Ultraschall behandelt und 20 Minuten mit 3 000 UpM zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Dieser wurde als ein Antigen für die ELISA-Verwendung verwendet.

(2) Sensibilisierung von Lymphozyten mit CMV

Humane Milz-Lymphozyten wurden in einem flüssigen Kulturmedium A (RPMI 1640 + 20% fötales Kälberserum + 20 mmol HEPES + 2 mmol Glutamin + 1 mmol Na-Brenztraubensäure + 0,02 mg/ml Serin + 80 ug/ml Gentamycin), dessen Zelldichte 12·10&sup5; Zellen/ml war, suspendiert. Diese Zellsuspension wurde in 15 Vertiefungen einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen in Portionen zu 1 ml gegeben. Sie wurden in 5 Gruppen zu 3 Vertiefungen geteilt, und der ersten Gruppe war nichts zugegeben worden, der zweiten Gruppe waren 12 ng Protein/ml CMV-Antigen zugegeben worden, die dritte Gruppe hatte 10 ml BCGF, die vierte Gruppe hatte die gleiche Menge CMV und BCGF, und die fünfte Gruppe hatte CMV und 20 ug/ml PWM. Die Kulturplatte wurde 6 Tage bei 37ºC in 5% CO&sub2;-Luft inkubiert.

(3) Zellfusion mit Maus-Myelomzellen, Zellinie P3X63Ag8U1 (abgekürzt: P3U1)

P3U1 war vorher in einem flüssigen Kulturmedium B (RPMI 1640 + 10% fötales Kälberserum + 2 mmol Glutamin + 80 ug/ml Gentamycin) kultiviert worden. Die Zelldichte war zum Zeitpunkt seiner Verwendung 6·10&sup5; Zellen/ml. Fünf Gruppen (zu 3 Vertiefungen) sensibilisierter Lymphozyten, die im vorhergehenden Abschnitt (2) erhalten worden waren, und P3U1 wurden getrennt zweimal mit serumfreiem RPMI 1640 gewaschen. Die Lymphozyten in den drei Vertiefungen der jeweiligen Gruppen und 5·10&sup6; Zellen P3U1 wurden zusammen in Teströhrchen gegeben. Sie wurden 5 Minuten mit 1 500 UpM zentrifugiert, und die Überstände wurden verworfen. Die Zellpellets wurden durch leichtes Klopfen der Teströhrchen grundlich dispergiert. 0,5 ml Polyethylenglycol Lösung {(RPMI 1640 5,75 ml + Polyethylenglycol 1000 3,5 ml + Dimethylsulfoxid 0,75 ml); als PEG-Lösung abgekürzt} wurden jedem Teströhrchen zugegeben, wobei die Zellen in der Losung leicht suspendieren gelassen wurden. Eine Minute später wurden 0,5 ml RPMI 1640, 1 weitere Minute später 1 ml RPMI 1640, weitere 2 Minuten später 4 ml flüssiges HAT-Kulturmedium (RPMI 1640 + 20% fötales Kälberserum + 80 ug/ml Gentamycin + 95 uMol Hypoxanthin + 0,4 uMol Aminopterin + 1,6 uMol Thymidin) und nach weiteren 2 Minuten später 4 ml flüssiges HAT-Kulturmedium zugegeben, wodurch schlußendlich 25 ml Zellsuspensionslösung erreicht wurden. Diese Lösung wurde in eine Kulturplatte (96 Vertiefungen) geimpft und in 5% CO&sub2;-Luft bei 37ºC kultiviert. Die Hälfte des Mediums wurde gegen frisches HT-Kulturmedium (ohne A aus HAT-Medium) jede Woche wiederholt getauscht, und auf diese Weise ein Hybridom erhalten.

(4) Messung von humanem IgG und CMV-Antikörper

Die Messung wurde mittels ELISA durchgeführt. Um die Messung auf humanes IgG, auf Ziege-anti human IgG-Antikörper (10 ug/ml) vorzunehmen, und um die Messung auf anti-CMV-Antikörper vorzunehmen, wurden jeweils 2 ug Protein CMV (Stamm AD 169)/ml auf Falcon-Mikrotest III-Platten mit 96 Vertiefungen in Portionen zu 50 ul/Vertiefung aufgetragen. 60 ul Hybridom-Kulturüberstand wurde den Platten zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen. Nach 3maligem Waschen der Platten mit Hank'schem ausgeglichenen Salzlösungspuffer (HBSS-B), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA), wurden 60 ul Ziege-anti-human IgG- Antikörper-alkalische Phosphatase (2000fach verdünnte Losung) zugegeben und die Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Platten wurden neuerlich 3mal mit HBSS-B gewaschen, und dann wurden 100 ul einer Lösung, hergestellt durch Auflösen von p-Nitrophenylphosphat in 1 Mol Diethanolamin + 1 mmol MgCl&sub2;- Lösung von pH 9,5 bei einem Verhältnis von 0,6 mg/ml zugegeben. Etwa 30 bis 60 Minuten später wurde die Absorption bei 405 nm gemessen, und die erforderlichen Werte wurden durch Vergleichen der Messung mit jener einer Standard-IgG-Lösung oder eines positiven Standard-CMV-Serums berechnet.
Alle Gruppen hatten ihre Zellen auf die jeweiligen Platten mit 96 Vertiefungen geimpft, und die Anzahl der Vertiefungen, in welchen Hybridome erzeugt waren (beobachtet mit bloßem Auge), ferner die Anzahl der Vertiefungen, in welchen diese Hybridome humanes IgG produziert hatten, und die Anzahl der Vertiefungen, in welchen anti-CMV-Antikörper produziert worden waren, wurden gezählt und sind in Tabelle I gezeigt. Wenn CMV und BCGF zugegeben wurden, wurde die größte Zahl von Hybridomen erzeugt, die anti-CMV-Antikörper produzieren. Tabelle 1 Sensibilisierung in vitro Anzahl Vertiefungen mit Hybridomen (beobachtet mit bloßem Auge) IgG-produzierend anti-CMV-produzierend Nichts zugegeben CMV BCGF

Beispiel 2

Humane Milzlymphozyten wurden mit CMV und BCGF oder PWM gemäß Beispiel 1, (2), sensibilisiert und gemäß Beispiel 1, (3), mit P3U1 zellfusioniert. Von den auf diese Weise erhaltenen Hybridomen wurden jene, welche MCA produziert hatten, wie folgt kloniert.

(1) Klonieren von Hybridomen

Das Klonieren wurde durch begrenzende Verdünnung durchgeführt. Die Zellen wurden aus den Vertiefungen, die auf anti-CMV-Antikörper positiv waren, herausgenommen und in Portionen von 1 Zelle/Vertiefung oder 10 Zellen/Vertiefung in die jeweilige Vertiefung, die ein flüssiges Kulturmedium B enthielt, geimpft. 2 Wochen später wurde gefunden, daß die Zellen unter Vermehrung gewachsen waren, und es wurde mittels ELISA geprüft, ob anti-CMV MCA in den Überständen vorhanden waren, wodurch auf diese Weise Hybridome selektiert wurden, welche anti-CMV MCA produzieren konnten.
Auf diese Weise wurden die Hybridome C1, C3, C4, C7, C23 und C41 hergestellt. Diese Hybridome sollen, da sie andauernd stabil sind, humane anti-CMV MCA vom IgG-Typus produzieren. Das Hybridom C41 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer HB 9212 am 29. September 1986 hinterlegt.

(2) Herstellung von humanen anti-CMV MCA

C41, eines der oben erhaltenen Hybridome, wurde in einem serumfreien ITES-Kulturmedium (2 Volumina RPMI 1640 + 1 Volumen Dulbecco's MEM + 1 Volumen F12 + 8,5 ug Insulin/ml + 2 ug Transferrin/ml + 2 uMol Ethanolamin + 2,5·10&supmin;&sup8; Mol Selenit) kultiviert. Sein Kulturüberstand wurde durch Ultrafiltration (Amicon P30) konzentriert und gegen 0,02 mol Natriumphosphat (pH 7,8) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine DE 52- Säule (Pharmacia), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war, gegeben, und humane MCA wurden aus nicht adsorbierten Fraktionen gewonnen. Durch Analyse mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde bestätigt, daß eine gereinigte MCA-Präparation mit H- und L-Ketten vorlag.

Beispiel 3

(1) Reaktivität von humanen anti-CMV MCA gegenüber infizierten Zellen

Die humanen anti-CMV MCA C1, C3, C4, C7, C23 und C41 wurden dazu gebracht, mit HEL-Zellen, die mit dem AD 169-Stamm von CMV oder dem Hi-1-Stamm infiziert waren, und mit den nicht infizierten Zellen zu reagieren. Ferner wurden humane IgG-Antikörper, die mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert waren, dazu gebracht, mit ihnen zu reagieren und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Das Ergebnis zeigte, daß nicht alle MCA mit den nicht infizierten Zellen, sondern nur mit den infizierten Zellen reagierten. Es wurde auch gefunden, daß C1, C3, C4 und C7 mit dem CMV-Antigen im Cytoplasma von Zellen, die mit AD 169 oder Hi-1 infiziert waren, reagierten, aber nicht mit CMV-Antigen auf ihrer Zellmembran reagierten. Andererseits reagierten C23 und C41 sowohl mit CMV-Antigen im Cytoplasma als auch mit CMV-Antigen auf der Zellmembran.

(2) Reaktivität humaner anti-CMV MCA gegenüber solubilisiertem Virus-Antigen

Mit dem Ziel, die Bindungsaktivität von anti-CMV MCA gegenüber Herpesviren zu studieren, wurden solubilisierte Antigene gemäß Beispiel 1, (1), von HEL-Zellen hergestellt, die jeweils mit 2 Stämmen HSV-1, 2 Stämmen HSV-2, 2 Stämmen VZV, 6 Stämmen CMV und 1 Stamm EBV infiziert waren, und von nicht infizierten HEL-Zellen, und ein ELISA wurde mit ihnen gemäß Beispiel 1, (4), durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
Es wurde gefunden, daß alle anti-CMV MCA (C1, C2, C3, C7, C23 und C41) nur an CMV binden, aber nicht an andere Herpesviren und Host-Zellen. Es wurde gefunden, daß anti-CMV MCA, außer C41, an alle 6 CMV-Stämme binden. Zufälligerweise ist H1 ein humaner MCA gegen den Virus Herpes simplex (HSV). Tabelle 2 Virus-Stamm Humane MCA CMV hSV VZV EBV Nicht-infiz. HEL
*1 Die Werte geben die Absorption bei 405 nm an. *2 Weniger als 0,1.

Beispiel 4

Virus-Neutralisierungsaktivität von humanen anti-CMV MCA

Ein Gemisch aus 200 al einer Lösung von humanen MCA, 100 ul einer 5-fach verdünnten Lösung von 200 CH50/ml von frischem Meerschweinchenserum und 100 ul einer Lösung, die 737 pfu (Plaque-bildende Einheiten) von CMV (Stamm AD 169) enthielt, wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nachdem 100 ul dieser gemischten Lösung über HEL-Zellen, die in einer Platte mit 6 Vertiefungen inkubiert und neuerliche 1 Stunde bei 37ºC inkubiert worden waren, ausgebreitet worden waren, wurde MEM-Medium, welches 0,5% (Gew./Vol.) Agarose und 5% (Vol./Vol.) FCS zugegeben und 11 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Die erhaltenen Einzelschicht- Zellen wurden mit einer 10%igen Formalinlösung fixiert und mit einer 0,3%igen Methylenblaulösung gefärbt, um die Plaque-bildenden Einheiten (pfu) der mit CMV infizierten Zellen zu bestimmen. Die Neutralisierungsaktivität wurde wie folgt berechnet.
(pfu von Probe, kein MCA zugegeben) - (pfu von Probe, MCA zugegeben)/(pfu von Probe, MCA zugegeben) · 100 (%)
Das Ergebnis ist in Fig. 1 gezeigt. Von C23 wurde eine 50%ige Neutralisierung bei 0,75 ug/ml und von C41 bei 0,18 ug/ml angezeigt C1, C3, C4 und C7 zeigten jedoch keine Neutralisierungsaktivität. Bei dem Fall, wo der Stamm Hi-1 verwendet wurde, zeigte C23 eine 10%ige Neutralisierung bei 3,3 ug/ml, und C41 zeigte eine 100%ige Neutralisierung bei 0,95 ug/ml, während C3 nur eine 35%ige Neutralisierung bei 17,7 ug/ml zeigte.
Bei Bestimmung der Neutralisierungsaktivität von 5 Stämmen der CMV-Stämme, ausgenommen der Stamm AD 169, zeigte C23 eine Neutralisierung von 95% oder mehr für alle Virusstämme bei 10 ug/ml. Während C41, entsprechend nahe den in Tabelle 2 von Beispiel 3 angegebenen ELISA-Daten, eine etwas niedrigere Neutralisierungsaktivität von 20% und 64% für den Stamm Nr. 12 bzw. den Stamm YAN-3 und mehr als 80% Neutralisierungsaktivität für andere Stämme zeigte.

Beispiel 5

Immunfällungsanalyse von humanen anti-CMV MCA

Eine Immunfällungsanalyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, welche(r) virale(n) Bestandteil(en) mit diesen humanen MCA reagiert (reagieren). HEL-Zellen wurden mit CMV (Stamm AD 169) infiziert und mit 35S-Metionin isotopenmarkiert. Die markierten Zellen wurden in einer Losung gelöst, die 0,01 mol Tris·HCl + 0,15 mol NaCl + 1% Natriumdeoxycholat + 1% Triton X 100 + 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) + 1 mmol Phenylmethylsulfonylfluorid (pH 7,4) enthielt. Humane anti-CMV MCA wurden zugegeben, um einen Antigen/Antikörper-Komplex zu erzeugen, welcher dann unter Verwendung von Protein A-Sepharose 4B einer Adsorptionsreinigung unterworfen wurde. Das gereinigte Produkt wurde 3 Minuten in einer Lösung von 0,125 mol Tris·HCl + 1% SDS + 3% 2-Mercaptoethanol + 15% Glycerin (pH 8,2) bei 100ºC wärmebehandelt, und der erhaltene Überstand wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und bei -70ºC einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Es wurde gefunden, daß C1 mit Virusantigenen reagiert, welche Molekulargewichte von etwa 64 000 und etwa 50 000 besitzen, daß C2 mit jenen reagiert, die Molekulargewichte von etwa 64 000 und etwa 46 000 besitzen, daß C4 und C7 mit jenem reagieren, das ein Molekulargewicht von etwa 64 000 besitzt, und daß C23 und C41 mit jenen reagieren, die Molekulargewichte von etwa 130 000 und etwa 55 000 besitzen.

Beispiel 6

Isotypenidentifizierung von humanen anti-CMV MCA

Eine Isotypenidentifizierung humaner MCA wurde wie folgt ausgeführt. Eine Identifizierung der H-Kette wurde mittels des Immundiffusionstests (Ouchterlony-Test) unter Verwendung von Kaninchen-Antiserum gegen humanes IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 durchgeführt. Die Identifizierung der L-Kette wurde mittels ELISA durchgeführt, in welchem mit AD 169 infizierte Zellen als Antigen-Platte und mit alkalischer Phosphatase markierte Ziege-anti-human K-Kette oder λ-Kette als sekundärer Antikörper verwendet wurden. Tabelle 3 MCA Isotypus

Industrielle Anwendungen

Die humanen anti-CMV MCA der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft als Diagnostikum für CMV-Infektionen und auch als ein Präventiv und Heilmittel für infektiöse CMV-Krankheiten verwendet werden.

Claims

1. Humaner monoklonaler Antikörper gegen Cytomegalovirus,

(1) der Cytomegalovirus-Antigenproteine mit Molekulargewichten von etwa 130 000 und etwa 55 000, bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, erkennt, und

(2) der in der Lage ist, Cytomegalovirus zu neutralisieren, und

(3) dessen Isotyp IgG1 ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, worin der Isotyp IgG1, K ist.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, worin der Isotyp IgG1, K ist.

4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, produziert durch das Hybridom C41, das bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungs-Nr. HB9215 hinterlegt ist.

5. Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper gegen Cytomegalovirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

(1) humane Lymphozyten in vitro in Gegenwart eines Mitogens gegen

(a) Cytomegalovirus oder

(b) Proteine oder Glycoproteine, stammend von Cytomegalovirus, sensibilisiert werden,

(2) die sensibilisierten humanen Lymphozyten von Schritt

(1) mit Maus-Myelomzellen fusioniert werden,

(3) auf ein aus schritt (2) erhaltenes Hybridom selektiert wird, das Antikörper gegen Cytomegalovirus produziert, die Cytomegalovirus-Antigenproteine mit eine;m Molekulargewicht von etwa 130 000 und etwa 55 000, bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, erkennen, und in der Lage sind, Cytomegalovirus zu neutralisieren,

(4) das selektierte Hybridom aus schritt (3) oder eine davon stammende Zellinie kultiviert wird und

(5) die humanen monoklonalen Antikörper von dem kultivierten Hybridom oder einer Zellinie von schritt (4) erhalten werden.

6. Hybridom, das zur Produktion eines Antikörpers nach Anspruch 1 fähig ist.

7. Hybridom, das zur Produktion eines Antikörpers nach Anspruch 2 fähig ist.

8. Hybridom C41, das bei ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. HB 9215 hinterlegt ist.