JP4218985B2 - ヒトサイトメガロウイルス（ｃｍｖ）を検出するためのペプチド試薬 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する抗体類に免疫化学的に反応性であるペプチド類と、前記ペプチド類に対する（モノクローナル）抗体類と、さらにモノクローナル抗体類を産生できる細胞系とを含有しているペプチド試薬に関する。本発明はさらに、ＣＭＶの（直接的）検出方法又はＣＭＶに対する抗体類の（間接的）検出方法に関する。
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、年齢及び社会経済状態に依存して全人類の５０〜１００％を感染させる、世界的に分布するヒトヘルペスウイルス科に属するウイルスである。
ＣＭＶは、自然に唾液、尿又は乳汁を通して媒介されるが、さらに他の身体分泌物から回収されることもある。さらに、ＣＭＶは分娩又は性交中の尿生殖器接触によって経胎盤性で胎児へ媒介されたり、輸血（特に白血球）及び骨髄ないしは臓器移植によって媒介されることがある。
一次感染後、ＣＭＶは動的潜伏期の状態でその宿主の生涯に渡って身体内で持続し、宿主免疫系によって良好に制御され、様々な部位及び身体分泌物から定期的に回収されることがある。
一般には良性であるが、移植レシピエント、エイズ患者、遺伝的に決定された免疫不全症を有する患者のような免疫欠損を有する個人及び未熟免疫系を持つ新生児においてはＣＭＶ感染症が破壊的及び致死的となることがある。
ウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼす薬剤を用いる治療的介入が可能ではあるが、これには重大な毒性が結び付いている。ＣＭＶ感染症を制御するためのもう１つの有効な方法は、ワクチン接種、免疫グロブリン若しくはＴ細胞を用いた受動免疫療法又は免疫抑制療法の操作によって達成できる宿主免疫の変調である。
ＣＭＶを原因とする活動性（症候性）感染症の同定及び監視は、臨床パラメーターだけを基礎にして行うことができないため−それらが多様かつ不定であるため−、迅速かつ正確な検査室診断に大きく依存している。
ＣＭＶ特異的診断は、ウイルス成分を直接に検出する又は宿主免疫状態における変化を間接的に測定する様々な方法によって達成できる。確実な診断アプローチには、明瞭に定義された高度にＣＭＶ特異的な試薬を基礎とする感受性かつ再現性のテクノロジー及びヒト宿主におけるＣＭＶ感染症の基礎となる分子プロセスに関する詳細な理解が必要とされる。
ＣＭＶは２３０−２７０キロベースのゲノムを持つヒトヘルペスウイルス科に属する最大で最も複雑なウイルスである。
ヘルペスウイルスに特徴的なことに、ＣＭＶビリオンの構造成分は、タンパク質−ＤＮＡコアと、１６２キャプソメアのサブユニットから構成される正二十面体キャプシドと、テグメント（外皮）と呼ばれる無定形タンパク質層さらにウイルス感染性のために不可欠な周囲プロテオリピッド・エンベロープとを含んでいる。
ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＭＶは相違するレベルのウイルス遺伝子発現をもつ様々な宿主細胞及び組織において所見できるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効な遺伝子発現及びウイルスＤＮＡ複製はヒト起源の一次線維芽細胞においてのみ可能である。このために、この系がウイルス遺伝子の発現、複製及び関連タンパク質産物の特性付けを研究するために最も広範囲に使用されてきた。
結合、脱エンベロープ及び感受性宿主細胞（例、ヒト線維芽細胞）内への侵入後、流入するビリオンからのテグメントタンパク質は、即時早期（ＩＥＡ）クラスのウイルス遺伝子の発現を活性化する。この遺伝子は極めて多様なウイルス及び宿主遺伝子の転写を行うことができる広域活動性転写活性化機能を有する少数のタンパク質種をコードする。ＩＥＡ産物によって活性化されるウイルス遺伝子は、主としてヌクレオチド代謝及びＤＮＡ合成に関与する酵素から構成されており、早期抗原（ＥＡ）グループとして分類されている。感染の最終段階においては、ウイルスによってコードされたＤＮＡポリメラーゼ（ＥＡ成分）による新しいウイルスＤＮＡ鋳型の合成に必然的に依存して、ウイルス子孫の構築及び遊離のために必要な構造成分から構成されるウイルスタンパク質の第３（後期抗原（ＬＡ））のグループが発現する。
ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらにおいても、この遺伝子発現の配列順序は様々な段階で中断されることがあり、これは制限された遺伝子発現パターンを特徴とする非溶解性（不全型又は不完全）感染症ないしは持続をもたらす。これらのパターンは感染した細胞の型及びその活性化や分化の状態の両方に依存する。従って、こうして発現したウイルス遺伝子産物は、まだ宿主細胞の特徴を変化させて、異常な行動及び機能を生じさせることがある。
３段階カスケード調節方法での自身の遺伝子の発現に加えて、ＣＭＶは感染後には宿主細胞遺伝子発現を刺激するため、ウイルス産物の特異的分析及び精製が複雑化する。
血液中では、ＣＭＶは散在性単核細胞／マクロファージ（複製）、リンパ球（不全型／制限）、多形核細胞（ＰＰ６５タンパク質のみ）及び循環内皮細胞（複製）内で所見できる。さらにＣＭＶは、動脈や小血管に沿って並んでいる平滑筋細胞（制限／溶解性）及び様々な組織に含まれる線維芽細胞及びマクロファージ様細胞中で検出できる。
有効な免疫反応が発生しない場合、ＣＭＶは身体内の実質的にあらゆる組織及び細胞型へ拡散することができる。
培養技術によって測定されるような血液中における感染性ウイルスの存在は活動性症候性感染症に関連する最善のマーカーと見なされているが、他方ウイルスＤＮＡの存在はウイルス保有状態のマーカーである。
ＣＭＶは免疫競合性宿主及び免疫低下宿主の両方において広く様々な疾患症候群と関連しているが、後者の方がはるかに頻回で、有意に高い罹患率及び致死率が結び付いている。
通常、免疫適格性宿主における一次感染は見過ごされる。しかし、ＣＭＶは青年期及び若年成人における単球増加症候群の１０％を惹起すると考えられており、急性非Ａ−Ｇ型肝炎と頻回に関連している。妊婦における一次感染は胎児へのＣＭＶの経胎盤性伝達と結び付いている。
ＣＭＶは世界中の新生児欠陥の主要原因であり、全新生児の０．５〜３％を感染させている。感染した新生児の約１０％ではＣＭＶ関連性欠損を検出できるが、母体内での一次感染の場合には最も深刻となる。
ＣＭＶは、実質性器官及び骨髄移植レシピエントにおける合併症にとって最も頻度の高い感染原因であるため、「移植のトロール」と呼ばれている。
ＣＭＶは又、ＨＩＶ陽性者及びエイズ患者における疾患の主要原因であり、肺炎、網膜炎及び胃腸合併症と極めて高頻度に結び付いている。
最後に、ＣＭＶは、しばしば遺伝的に決定された免疫不全症を有する患者、癌患者及び自己免疫疾患の患者において高頻度に疾患を誘発する。
休眠潜伏期状態におけるＣＭＶの複製及び拡散とウイルス持続との平衡を決定するのは宿主免疫状態の質である。
宿主免疫反応は、新たに合成された、又は身体内の様々な部位／組織で種々の感染期中に発現した安定性で持続しているウイルス遺伝子産物と遭遇することにより誘発かつ維持される。
分子レベルでのウイルス宿主相互作用−各個人によって相違する可能性がある−に依存して、免疫反応は一次感染後に、潜伏期と呼ばれる平衡状態が達成されるまで徐々に形成される。
ＣＭＶへの宿主免疫反応の質及び量を決定することは診断的及び予後的に重要であり、ＣＭＶへの免疫状態を決定するため、移植環境におけるドナー／レシピエントのＣＭＶ保有状態を確定するため、そして様々なＣＭＶ関連性疾患症候群における急性感染症を同定／監視するために広範囲に使用されてきた。
診断的アッセイは、ウイルス培養又はＤＮＡ検出／定量技術によって体液中のウイルスの存在及び量を直接に測定できる。しかし、このウイルスはほとんどの健常ＣＭＶ保有者において間欠的に尿及び唾液中へ分泌されることがあるので、血液中のＣＭＶ検出だけがヒトにおける活動性感染症を診断するための確実なパラメーターと見なされている。
血液中のＤＮＡ検出は、使用されたアッセイの感受性に依存して、全てではなくとも大多数の健常保有者において潜伏性感染しているＣＭＶ−ＤＮＡ陽性白血球を検出できるため、活動性ＣＭＶ感染症に対する確実な予測因子とは見なされていない。
白血球中のＣＭＶ−ＲＮＡ発現の測定は、分析されたゲノム標的アミノ酸配列に依存して、血液中の活動性ウイルス複製を検出するために有用な可能性がある。
或いは又、抗原血症アッセイ、すなわち細胞内ＰＰ６５（ＵＬ８３）の存在についての白血球（特に多形核球）の定量は、様々なＣＭＶ疾患症候群における活動性及び症候性ＣＭＶ感染症と良好に相関する確実な診断パラメーターであることが証明されている。
ウイルス又はウイルス産物の直接検出方法とは対照的に、ＣＭＶに対する液性免疫反応の分析はヒト宿主におけるＣＭＶ活性の間接的反映として使用できる。ＣＭＶ血清学は、おそらく活動性ＣＭＶ感染症の診断及び監視のため、そしてＣＭＶ保有状態を測定するために最も広範囲に使用されているアプローチであろう。ＣＭＶに対するＩｇＭ、ＩｇＧ又はＩｇＡ抗体を検出するための迅速かつ安価な極めて多種類の方法が利用できる。
ＣＭＶ−ＩｇＭ及びこれより少ない程度でのＣＭＶ−ＩｇＡの検出は、−特に一次感染中には−（最近の）活動性感染に対する直接的指標であり、他方ＣＭＶ−ＩｇＧの測定はＣＭＶ保有状態の測定とＣＭＶ疾患の診断／監視のどちらにも適用できる。
ＩｇＧ抗体は一次感染中に急速に形成され、生涯に渡って存在し続ける。ＣＭＶ−ＩｇＭの存在に加えてＣＭＶ−ＩｇＧの有意な上昇が見られる場合は、宿主における活動性感染症を反映している。ＣＭＶ−ＩｇＧは全血輸血又は免疫グロブリン療法の場合には複雑化されることがある。
ＣＭＶへの抗体反応の発生は、活動性感染症の尺度である他に免疫適格性の反映であり、免疫低下患者において抗ウイルス療法を誘導するために使用できる。抗ウイルス療法中の活発な抗体反応の検出は、治療を終了し、免疫系に宿主におけるＣＭＶの制御を任せるための指標として使用できる。
従って、血清学はヒト宿主におけるＣＭＶ感染症の診断及び監視における確実かつ汎用性のツールである。
血清学的アッセイの設計において極めて重要な要素は、分析される試料中の免疫グロブリンに結合するのに役立つＣＭＶ特異的抗原製剤である。従って、標準化を可能にするために、抗ＣＭＶ抗体反応の分子的に鋭敏な特異性を定義することが重要である。そうした試験は近年開始されているが、抗ＣＭＶ抗体反応が多様性であるのに加えてＣＭＶ系が複雑なために困難であることが証明されている。
プロトタイプ株ＡＤ１６９の２３５ＫＢ ＣＭＶゲノムは完全にアミノ酸配列が決定され、２００以上の可能性あるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは同定されているが、今日までに生化学的及び免疫学的に研究されているのはこれらのうち約４０のタンパク質に過ぎない。例えばｐｐ１５０（ＵＬ３２）、ｐｐ７２（ＵＬ１２２／１２３）、ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ｐｐ５２（ＵＬ４４）、ｐｐ３８（ＵＬ８０）、ｐｐ２８（ＵＬ９９）、ｇＢ（ＵＬ５５）及びＭＤＢＰ（ＵＬ５７）のような、少数のＣＭＶ−ポリペプチド類がヒト抗体反応のための標的として定義されている。追加の免疫反応性ポリペプチド類は免疫ブロット法を用いて分析されたＣＭＶ感染細胞抽出物中でそれらの分子量によって定義されているが、ＣＭＶゲノム上のコーディングフレームはまだ定義されていない。
上記のように、現在ではＣＭＶ血清学のために多種多様な技術が使用されている。
これらの方法は、細胞培養由来（半精製）抗原抽出物、部分精製された細胞外ビリオン及び血小板濃密小体又はより明確に定義された（組換え）タンパク質及びそれらの断片のいずれかを使用する。方法における多様性及び一様な明確に定義された試薬がないために、ＣＭＶ血清学は現在ではまだ良好には標準化されていない。このため、ＣＭＶ血清学による確実な診断及びいっそうの標準化には、分子的に定義されて高度に精製されたＣＭＶ抗原を使用することが必要である。
そうした抗原類はＣＭＶ細胞培養から生成及び精製することができるが、これは多数の宿主細胞タンパク質が存在するために費用がかかる上に複雑である。代替宿主系において発現させた組換えＣＭＶタンパク質は、患者血清がそうした宿主細胞成分への抗体類を有しているために擬陽性成績を生じさせる可能性があるので、いっそう高度の精製を必要とする。
組換えタンパク質の使用の例は、ＣＭＶ特異的ＩｇＭを検出するために組換え抗原（融合タンパク質）の混合物が使用されている特許出願ＷＯ９５／０００７３において所見できる。
合成ペプチド類はそうしたタンパク質抗原類の高度に定義された代替物を意味しており、高度に再現性のある方法で生成及び精製できる。
本発明の１つの目的は、ＩｇＧ及びＩｇＭ両方のクラスのヒト血清免疫グロブリン類と高度に反応性であるような、ＣＭＶ血清学的方法における適用に特に適合した合成ペプチド試薬の最適な組み合わせを定義することである。
これらの試薬類は高度に再現性で容易に精製できるので、従ってＣＭＶ血清学をいっそう向上させ、さらに標準化するために良好に適している。
これらのペプチド試薬類に対する抗体類は、血清学的アッセイの開発及び品質管理において、さらにＣＭＶを直接検出するために有用な可能性がある。
診断テストにおいて無傷タンパク質に置換できるＣＭＶタンパク質の免疫優勢ドメインを表している合成ペプチド断片を定義することが本発明の主題である。
合成ペプチド類は化学的に明確に定義されているので、従って高い産量で容易かつ再現性に生産することを許容し、極めて大きな再現性を備えて製造かつ使用できる診断用アッセイに適用するために良好に適しているという長所を有している。
本発明は、サイトメガロウイルスに対する抗体類を検出するためのペプチド試薬を提供するが、このとき前記試薬はサイトメガロウイルス構造リンタンパク質ｐｐ１５０（ＵＬ３２）に由来するペプチドとサイトメガロウイルスタンパク質；ｐｐ５２（ＵＬ４４）、ｐｐ２８（ＵＬ９９）、又はｇＢ（ＵＬ５５）のうちの１つに由来するペプチドとを含有している。
さらに、本発明は配列番号１〜６に示されているアミノ酸配列の少なくとも一部を含有しているＣＭＶ ｐｐ１５０タンパク質に由来するペプチドを含有しているペプチド試薬を提供する。
本発明の好ましい実施態様は、配列番号１に示されているアミノ酸配列の少なくとも一部を含有しているＣＭＶ ｐｐ１５０タンパク質に由来するペプチドを含有しているペプチド試薬である。
本発明の別の目的は、配列番号７に示されているアミノ酸配列の少なくとも一部を含有しているＣＭＶ ｇＢタンパク質に由来するペプチドを含有しているペプチド試薬である。
本発明のもう１つの目的は、配列番号８に示されているアミノ酸配列の少なくとも一部を含有しているＣＭＶ ｐｐ５２タンパク質に由来するペプチドを含有しているペプチド試薬である。
本発明のもう１つの目的は、配列番号９〜１０に示されているアミノ酸配列の少なくとも一部を含有しているＣＭＶ ｐｐ２８タンパク質に由来するペプチドを含有しているペプチド試薬である。
本発明の好ましい実施態様は、配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有しているペプチドを含有しているペプチド試薬である。
本発明の最も好ましい実施態様は、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有しているペプチドと、配列番号７に示されているアミノ酸配列を有しているペプチドと、さらに配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有しているペプチドとを含有しているペプチド試薬である。
本発明のもう１つの最も好ましい実施態様は、配列番号１に示されているアミノ酸配列を有しているペプチドと配列番号８に示されているアミノ酸配列とを有しているペプチドを含有しているペプチド試薬である。
天然ＣＭＶとは対照的に、本発明に記載のペプチド類はこれらが安全な非感染性起源に由来するという大きな長所を有している。
本発明に記載のペプチド試薬において優先的に使用されているペプチド類及びそれらの断片は、試料中のＣＭＶ又はＣＭＶ抗体類の存在を測定するための診断的方法に使用するために特に適していることが発見されている。さらに、前記ペプチド類及びそれらの断片は、ＣＭＶ関連性疾患の治療において適切な薬学的投与形態で使用することができる。活性成分としてペプチド又はその断片を含有している、このようにして入手されたワクチン類の調製は当業者には既知である。
本発明に記載のペプチド試薬において優先的に使用されているペプチド類は、現在利用可能なＣＭＶ試薬類に比較して反応性及び特異性（性能）を向上させた。
このため血清学的テストにおいてこれらの免疫学的試薬類を利用すると、活動性ＣＭＶ感染症の患者においてより優れた鑑別診断を許容するアッセイの開発が可能になる。
さらに、本発明の目的は、選択されたＣＭＶペプチド類に対する抗体の存在が活動性ＣＭＶ感染症と相関しているという発見である。
本書で使用される用語「ペプチド試薬」とは、１又は２以上のペプチド類及び適切な担体又は標識物質を意味している。
使用できる担体は、例えばマイクロテストのウエル若しくはキュベットの内壁、試験管又は毛細管、メンブラン、フィルター、試験ストリップ又は例えばラテックス粒子、アルデヒド粒子（例えば活性アルデヒド表面基を持つ磁化可能なセラミック粒子）のような粒子の表面、赤血球、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒子のような金属化合物、ＢＳＡ若しくはＫＬＨのようなキャリアタンパク質である。
使用できる標識物質は、特に放射性アイソトープ、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒子のような金属化合物である。
試料中の抗ＣＭＶ抗体類を検出するための方法では、本発明に記載のペプチド試薬が試料と接触させられる。その後、試料中でペプチドと抗体類の間で形成された免疫複合体の存在が検出され、この検出によって試料中のＣＭＶ抗体類の存在が判明し、定量的に測定することができる。
ペプチド試薬の性質及び詳細な特徴に依存して、発生する免疫化学反応はいわゆるサンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応である。
本書で使用される用語「ペプチド」は、生物学的活性を持つアミノ酸の分子鎖を意味しており、産物の特異的長さは意味していない。従って、特にタンパク質類、融合タンパク質類又は融合ペプチド類、オリゴペプチド類及びポリペプチド類が含まれる。
必要なら、本発明に記載のペプチド試薬において使用に適した必要なペプチド類は、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はホスホリル化によってｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾することができる。このため、例えば前記ペプチド類の酸添加塩類、アミド類、エステル類及び特にＣ末端エステル類及びＮアシル誘導体類のような機能的変種は本発明の一部と見なされる。本書に含まれている特定タンパク質類又はポリペプチド類については、天然変種も又存在することがあると理解されるであろう。これらの変種類は、全アミノ酸配列におけるアミノ酸の相違又は前記配列におけるアミノ酸（類）の欠失、置換、挿入、転換又は付加によって証明することができる。そこから必ずしも生物学的及び免疫学的活性を変化させないと予想できるアミノ酸置換が報告されている。進化において頻回に発生してきた関連アミノ酸類と置換物との間のアミノ酸置換は、中でもＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（タンパク質のアミノ酸配列順序及び構造集），Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３参照）。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感受性でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７，１４３５−１４４１，１９８５）、さらに同種タンパク質間の機能的類似性を測定するための方法を開発した。
本書で使用される用語「少なくとも〜の一部」は、本発明に記載のペプチド試薬において優先的に使用されているペプチドのサブ配列を含有しているアミノ酸配列を意味している。前記一部又は断片はＣＭＶ ｐｐ２８（ＵＬ９９）、ｐｐ１５０（ＵＬ３２）、ｐｐ７２（ＵＬ１２２／１２３）、ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ｐｐ５２（ＵＬ４４）、ｐｐ３８（ＵＬ８０）、ｇＢ（ＵＬ５５）及びＭＤＢＰ（ＵＬ５７）タンパク質の１又は２以上の免疫学的決定因子を有しているペプチドである。断片は、中でもＤＮＡに対する制限エンドヌクレアーゼ類及びポリペプチド類に対するプロテアーゼ類を使用して、前駆物質分子の酵素による開裂によって産生できる。その他の方法には、断片の化学合成又はＤＮＡ断片によるペプチド断片の発現が含まれる。
エピトープ（類）を含有している前記ペプチド類の適切な抗原性又は免疫学的断片は、考察下の完全なポリペプチドの部分アミノ酸配列に対応する一連の部分的重複ペプチド類が合成され、抗体類とのそれらの反応性が調査されるいわゆるペプスキャン法に基づいて、欧州特許第０，２２０，２４５号、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３９９８−４００２，１９８４）、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４，１９８７）に記載の方法によって発見することができる。
さらに、ペプチド類の多数の領域は理論的考察を基礎にエピトープ類へ指定できるが、これらの理論的考察の予測的価値は限定されている。これらの領域の決定はＨｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８，３８２４−３８２８，１９８１）による親水性基準とＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７，４５−１４８，１９８７）による二次構造の態様との組み合わせに基づいている。
本発明に記載のペプチド試薬において優先的に使用されるペプチド類又はそれらの断片の調製は、ペプチドを合成するための既知の有機化学方法の１つによって、又は組換えＤＮＡ技術の助けを借りて実行される。
ペプチドを合成するための有機化学的方法は、均質相中か又はいわゆる固相を使用するかのどちらかで、縮合反応によって必要なアミノ酸を結合することを含んでいると見なされている。
縮合反応は下記の通りに実施できる：
ａ）縮合剤の存在下で、遊離カルボキシル基及び保護された他の反応性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と遊離アミノ基及び保護された他の反応性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合；
ｂ）活性化カルボキシル基と遊離又は保護された他の反応性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）と遊離アミノ基及び遊離又は保護された他の反応性基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合。
カルボキシル基の活性化は、中でもカルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジ化物、無水物、イミダゾライド、又は例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール又はｐ−ニトロフェニルエステルのような活性化エステルへ転換させることによって発生させることができる。
上記の縮合反応を発生させるために最も一般的な方法は次の通りである：カルボジイミド法、アジ化物法、混合無水物法及びＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｅｓｉｓ（ペプチド類、分析、合成）、Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１−３（Ｅｄ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．）１９７９，１９８０，１９８１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているような活性化エステル類を使用する方法。
「固相法」を用いて上記のペプチド類の適切な断片を調製する方法は、例えばＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５，１６１−２１４（１９９０）に記載されている。調製されるペプチドのアミノ酸結合は、通常はカルボキシル末端側から始まる。この方法を行うためには、その上に反応性基が存在する又はその上にそうした基を導入できる固相が必要とされる。これは、例えばベンゼンと反応性クロロメチル基を持つジビニルベンゼンのコポリマー又はヒドロキシメチル若しくはアミン機能と反応性にさせられた高分子固相であって良い。
特別に適当な固相は、例えばＷａｎｇ（１９７４；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，１３２８）によって記載されたＰ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒドロキシ−メチル―フェノキシ−メチル−コポリステレン−１％ジビニル−ベンゼン樹脂）である。合成後、ペプチド類は穏和な条件下でこの固相から分離できる。
望ましいアミノ酸配列の合成後、樹脂からのペプチドの分離は例えばトリフルオロメタン−スルホン酸又はトリフルオロ酢酸に溶解させたメタンスルホン酸を用いて行われる。ペプチドは又、低級アルコール、好ましくはメタノール又はエタノールを用いてのエステル交換反応によっても担体から取り除くことができるが、この場合はペプチドの低級アルキルエステルが直接的に形成される。同様に、アンモニアを用いての分割は本発明に記載のペプチドのアミドを生じさせる。
縮合反応に関連しない可能性がある反応性基は、上記のように、酸、塩基又は還元の助けを借りて加水分解によって極めて容易に再び取り除ける基によって効果的に保護されている。従って、カルボキシル基は、例えばメタノール、エタノール、第三級ブタノール、ベンジルアルコール又はｐ−ニトロベンジルアルコール及び固相担体に連結されているアミン類を用いてのエステル化によって効果的に保護することができる。
アミノ基を効果的に保護できる基は、エトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシ−カルボニル（ｔ−ｂｏｃ）基又はｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基、又はベンゼン−スルホニル基若しくはｐ−トルエン−スルホニル基のようなスルホン酸由来の酸基であるが、例えばベンジル基及びトリフェニルメチル基のような置換された又は置換されていないアリル若しくはアラキル基のような他の基、又はオルソ−ニトロフェニル−スルフェニル基及び２−ベンゾイル−１−メチル−ビニル基のような他の基も使用できる。特別に適当なＡ−アミノ保護基は、例えば塩基感受性の９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基［Ｃａｒｐｉｎｏ ＆ Ｈａｎ（１９７０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２，５７４８］である。
可能性ある保護基についてのより広範な解説は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｅｓｉｓ（ペプチド類、分析、合成）、Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１−９（Ｅｄ．Ｇｒｏｓｓ，Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）１９７９−１９８７（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）の中で所見できる。
さらに又、リシンのε−アミノ基を保護することが必要であるが、これはアルギニンのグアニジン基にとっても賢明である。この関連における慣習的保護基はリシンに対してはＢｏｃ基及びアルギニンにとってはＰｍｃ−又はＰｍｓ−若しくはＭｂｓ基又はＭｔｒ基である。
保護基は特定基の性質に依存して、例えばトリフルオロ酢酸の助けを借りて、又は水素及びパラジウムのような触媒を用いての穏和な還元によって、又は氷酢酸中のＨＢｒを用いて、種々の従来型方法によって分割することができる。
本発明に記載のペプチド試薬において使用される免疫反応性ペプチド類はさらに単一分子内に結合することもできる。ハイブリッド又はコンビペプチド中における２個以上のペプチド類の共有結合は、例えば上記の方法を用いて、個々のペプチド類のアミノ酸配列が整列しているペプチド配列を持つ固相ペプチド合成によって実行することができる。個々のペプチド配列間にリンカー配列を挿入できることは理解されている。そうしたリンカー配列は例えばグリシンの２−５残基の伸張であって良い。
ハイブリッド又はコンビペプチドは、さらに断片縮合アプローチを用いる固相合成を通しても調製できる。断片（それらの配列が本発明による個々のペプチド類のアミノ酸配列と一致している可能性がある）が別個に調製かつ精製される後者の方法は、より長いハイブリッド又はコンビペプチド配列の合成において好ましい。より長いペプチドを調製するための方法は現行技術において既知であり、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，（ペプチド類、分析）、Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１−９（上記参照）に記載されている。
或いは又、ハイブリッド又はコンビペプチド類は適切に修飾した本発明のペプチド類の共役によって調製することもできる。
アミノ酸システインが欠けている２つの相違するペプチド配列を共役させるための好ましい方法においては、カルボキシル末端又はアミノ末端のどちらかでシステインの追加の残基を含有しているように誘導される。これらのペプチドの一方は引き続いて２，２‘−ジチオジピリジンを用いて単一システインチオール官能基で活性化される。結果として生じるピリジル−ジチオ−ペプチド誘導体はその後、個々のペプチドがジスルフィド結合を通して連結されているハイブリッドペプチドを産生するためにシステインチオール基を含有している第２ペプチドと反応させられる。
他の数多くのハイブリッドペプチド類を調製するための方法は想像できる。タンパク質−タンパク質共役の分野において開発されている化学的方法を利用することができる。そうした方法の概説はＭｅａｎｓ及びＦｅｅｎｅｙ（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１，２−１２，１９９０）によって与えられている。例えば、周知の同種又は異種二官能架橋結合剤を使用すると、ジスルフィド結合、又はチオエーテル若しくはアミド結合その他を通しての個々のペプチド類の結合が可能になる。
既に上記で指摘したように、本発明に記載のペプチド試薬において優先的に使用されるペプチド類は同様に組換えＤＮＡ技術の助けを借りて調製することができる。ペプチドが反復配列（「縦列で」）に組み込まれる場合、又はペプチドを（はるかに大きな）タンパク質又はポリペプチドの成分として又は例えばβ−ガラクトシダーゼ（の一部）との融合タンパク質として調製できる場合は、この可能性は特に重要である。このため、このタイプのペプチド類は同様に本発明の範囲内に含まれている。この目的で、組換えＤＮＡの成分として、本発明に記載のペプチドをコードし、更に天然型ＣＭＶゲノムにおいて上記の核酸配列の横に位置する核酸セグメントを実質的に含まない核酸配列が使用される。
この後者の方法は、宿主として適切な微生物中で１又は２以上の問題のペプチド類をコードする核酸配列を有する組換えポリヌクレオチドを発現させることによる望ましいペプチドの調製を含んでいる。
本発明に記載のペプチド試薬において使用されるようなペプチドをコードする核酸配列は、適切な宿主の形質転換のために使用できるいわゆる組換えベクター分子を生じさせる、事実上関連又は連結していない様々な複製効果ＤＮＡ配列に連結させることができる。有用な組換えベクター分子は、好ましくは例えばプラスミド類、バクテリオファージ類、コスミド類又はウイルス類に由来する。
核酸配列をクローン化するために使用できる特異的ベクター類若しくはクローニング媒介体類は現行技術において既知であるが、中でもｐＢＲ３２２，種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド類のようなプラスミドベクター類、例えばｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８及びＭ１３由来ファージ類のようなバクテリオファージ類、又はＳＶ４０、アデノウイルス又はポリオーマウイルスのようなウイルスベクター類が含まれる（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｄ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄ．，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ（ベクター：分子クローニングベクター及びそれらの使用に関する研究），Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１０，１−２４，１９９０も参照）。組換えベクター分子を構成するために使用できる方法は当業者には周知であるが、中でもＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（分子クローニング実験室マニュアル、第二版）；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている。
例えば、それによって相補的ＤＮＡ末端が産生するように遺伝子及び望ましいクローニング媒介体の両方が同一制限酵素を用いて切断されているときは、本発明に記載のペプチドをコードする核酸配列をクローニングベクター内に挿入することは容易に達成できる。
組換えベクター分子は、例えばｐＵＣ８におけるアンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドと同様に、ｐＢＲ３２２におけるアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のような望ましい形質転換細胞を選択するために使用できる１又は２以上のマーカー活性を追加して含有することができる。
もちろん、クローニングベクターの選択された部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換された宿主が少なくとも１又は２以上の抗原性又は免疫学的決定因子を有するポリペプチドを産生する限りにおいて、本発明に記載のペプチド試薬において使用されたペプチド類をコードする完全な核酸配列の断片だけを含有している可能性があると理解されなければならない。
前記ペプチド類に対する抗体類も又本発明の一部である。
上記のペプチド類又はそれらから調製された断片は、ポリクローナル及びモノクローナル両方の抗体類を産生するために使用できる。
このため、本発明に記載のモノクローナル抗体類はＣＭＶ感染を診断するための新規の手段を提供する。
本発明に記載の好ましい抗体類は、配列番号１〜１０に記載のアミノ酸配列を有するペプチドのエピトープに結合するモノクローナル抗体類である。
本発明に記載のより好ましい抗体類は、保管番号Ｎｏ．９６０７１１２３を付けて欧州動物細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），ＣＡＭＲ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：応用微生物学研究センター），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ（英国）に保管されているハイブリドーマ細胞系によって産生したモノクローナル抗体ＣＭＶ．ＯＴ３Ｃによってエピトープが認識される、ＣＭＶ ｐｐ１５０−タンパク質のエピトープに結合するモノクローナル抗体類である。
本発明に記載のヒト又は動物（例、マウス、ラット又はチンパンジー）モノクローナル抗体類を排出できる不死化細胞系も又本発明の一部である。
モノクローナル抗体類を産生する細胞系の調製は、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎがモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ形成を生じさせる技術を案出した（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９））、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を用いての形質転換、又は腫瘍原性ＤＮＡを有するＢリンパ球の直接形質転換法、又はヒトＢリンパ球とヒト又はマウス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系のどちらかである融合相手との直接融合、又はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系と前記骨髄腫細胞系との直接融合によって行うことができる。
本発明に記載の好ましい細胞系は、保管番号Ｎｏ．９６０７１１２３を付けて欧州動物細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），ＣＡＭＲ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：応用微生物学研究センター），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ（英国）に保管されている細胞系である。
これらのハイブリドーマ細胞系は、ＣＭＶ関連性合成ペプチド分子（必要な場合は免疫原性を強化するためにＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ：スカシガイのヘモシアニン）に結合させた）が事前に接種されたマウスに由来するリンパ球と骨髄腫細胞との融合によって産生させた。
ＣＭＶに由来するタンパク質類に対するモノクローナル抗体類は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ両方で細胞及び細胞抽出物に含まれているＣＭＶ発現を検出するため、精製の目的で、及びこれらのタンパク質類の機能を調査するために行う様々な生化学的及び免疫学的分析法のために有用なツールである。
本発明に記載の用語「免疫学的試薬」は、通常は１又は２以上の（モノクローナル）抗体類と適切な担体又は標識物質とから構成される。
使用できる担体類は、例えばマイクロテストウエル若しくはキュベットの内壁、試験管又は毛細管、メンブラン、フィルター、試験ストリップ、又は例えばラテックス粒子、アルデヒド粒子（例えば活性アルデヒド表面基を有する磁化可能なセラミック粒子）のような粒子の表面、赤血球、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒子のような金属化合物、ＢＳＡ若しくはＫＬＨのようなキャリアタンパク質である。
使用できる標識物質は、特に放射性アイソトープ、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒子のような金属化合物である。
本発明はさらに、被験液又は組織試料中の全長タンパク質を検出することを目的とする免疫学的及び生化学的方法における前記ペプチドに対する抗体類の使用を含有している。
本発明に記載のペプチド類に対するモノクローナル及びポリクローナル両方の抗体類は、組織試料中でのｉｎ ｓｉｔｕ検出のために診断学及び免疫細胞化学において極めて適しており、他方ではそれらの中和抗体類は受動免疫療法において極めて有用である。
本発明の一部は、さらに問題のモノクローナル抗体類を「ヒト化」である。「ヒト化」モノクローナル抗体類を作り出すための技術は現行技術において既知である。
試料中に含まれるＣＭＶを検出するためには、１又は２以上のペプチド類を含有している本発明に記載のペプチド試薬をその試料及び抗ＣＭＶと接触させると、その後に形成された免疫複合体の存在を検出することができ、これから試料中のＣＭＶの存在を決定することができる。
試料中のＣＭＶを検出するために特に適切な方法は、それによってペプチド及び抗原が固相担体に付着したＣＭＶに対する抗体と競合する、標識物質を含んでいる前記ペプチド試薬中に使用されたペプチドとＣＭＶ抗原（試料中に存在する）との間の競合反応に基づいている。
本発明はさらに、本発明に記載の抗体が試料と接触させられ、その後に形成された免疫複合体の存在が検出され、それが試料中のＣＭＶの存在に対する尺度であることを特徴とする、試料中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出するための方法を含んでいる。
本発明に記載の試験キットは、必須成分として上記のペプチド試薬を含有している。ＣＭＶ抗体類を検出するためにサンドイッチ反応を実行するためには、試験キットは例えばマイクロテストウエルの内壁である固相担体へ塗布された本発明に記載のペプチド試薬に使用されているペプチドと、本発明に記載のペプチド試薬に使用されている標識ペプチド又は標識抗−抗体のどちらかとを含有している場合がある。
競合反応を実行するためには、試験キットは固相担体へ塗布された本発明に記載のペプチド試薬に使用されているペプチドと、ＣＭＶに対する標識抗体、好ましくは前記ペプチドに対するモノクローナル抗体とを含有している場合がある。
凝集反応を実行するためには、試験キットは粒子類又はゾル類に塗布されたペプチドを含有しているペプチド試薬を含んでいる。
試験キットのもう１つの実施態様は、固相担体に塗布されている、ＣＭＶに対する抗体上の結合部位について検出されるべきＣＭＶ抗原との競合反応における、例えば本発明に記載のペプチド試薬に使用されている標識ペプチドの使用である。
上記の開示は本発明を一般的に説明している。例示する目的でのみ提供されているもので、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明は、下記の特異的実施例を参照することによってより完全に理解できる。
【図面の簡単な説明】
ペプチドコードの定義：
＃Ｋ−３８−Ｅ（ｐｐ１５０）：配列番号１
＃Ｔ−２１−Ｃ（ｐｐ１５０）：配列番号２
＃Ｃ−２１−Ｍ（ｐｐ１５０）：配列番号３
＃Ｔ２１ＣＣ２１Ｍ（ｐｐ１５０）：配列番号４
＃ＯＴＰ１９４（ｐｐ１５０）：配列番号５
＃ＯＴＰ１９７（ｐｐ１５０）：配列番号６
＃ＯＴＰ１０１Ａ（ｇＢ）：配列番号７
＃Ｆ−２８−Ｇ（ｐｐ５２）：配列番号８
＃ＯＴＰ１１８Ａ（ｐｐ２８）：配列番号９
＃ＯＴＰ１１９Ａ（ｐｐ２８）：配列番号１０
図１：
ペプチドスキャンＥＬＩＳＡによるＣＭＶ−ｐｐ２８（ＵＬ９９）上のヒトＩｇＧ抗体類（ＣＭＶ血清陽性者の血清１０例）に対する結合部位の同定：
Ａ＝試験した各被験者血清に対する相対吸光度値。
Ｂ＝各血清に対するバックグラウンド値について補正された、各ペプチドに対する個々の吸光度値の合計。
Ｃ＝試験した各血清に対する平均バックグラウンド値を少なくとも３ＳＤ越える吸光度値を産生した各ペプチドについての陽性スコア。
図２：
活動性ＣＭＶ感染症患者及び活動性ＣＭＶ感染症を有していない適切な対照被験者からの血清を用いて、ＩｇＧ抗体類と反応する最高のペプチドセットを表している分析。
図３：
ＣＭＶ抗体類に対して血清陽性又は血清陰性の任意健常被験者からの血清を用いて、標準抗体アッセイによって決定された、ＩｇＭ抗体類に反応する最高のペプチドセットを表している分析。
図４：
細胞培養由来ＣＭＶ−Ａｇ（横軸）及びＣＭＶペプチド試薬［＃Ｋ３８Ｅ＋＃ＯＴＰ１０１Ａ＋＃ＯＴＰ１１９Ａ］（配列番号１＋配列番号７＋配列番号９）（縦軸）のヒトＩｇＧとの反応性に関する比較。
図５：
細胞培養由来ＣＭＶ−Ａｇ（横軸）及びＣＭＶペプチド試薬［＃Ｋ３８Ｅ＋＃Ｆ２８Ｇ］（配列番号１＋配列番号８）（縦軸）のヒトＩｇＭとの反応性に関する比較。
図６：
ＣＭＶ．ＯＴ３Ｃを用いたＣＭＶ−ｐｐ１５０（ＵＬ３２）の免疫ブロット検出。図の下の説明に記載されているように、追加のＣＭＶタンパク質（Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，フロリダ州、米国から入手したＧＩＣＲシリーズ）及びＣＭＶ血清陽性ドナーからのヒト血清ＩｇＧに対するモノクローナル抗体類の対照反応が平行ストリップに示されている。
本発明を下記の実施例によってさらに詳細に例示する：
実施例１．
配列の長さ１２アミノ酸（ＡＡ）を有し、ＣＭＶ−ｐｐ２８をコードする完全ＵＬ９９リーディングフレームのアミノ酸配列の１１ＡＡによって重複しているペプチドをＧｅｙｓｅｎら（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，８３（１９８４）ｐ．３９９８−４００２）によって最初に報告された化学的に活性化されたピン上での全自動固相合成法によって合成した。
ヒト血清（ＣＭＶ血清陽性者１０例）からのＣＭＶ特異的抗体類との各ペプチドの免疫反応性をＭｉｄｄｅｌｄｏｒｐ及びＭｅｌｏｅｎ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１（１９８８）ｐ．１４７−１５９）によって報告されているように測定した。
相違するＣＭＶ血清陽性者からの血清１０例を用いたそうしたＰＥＰＳＣＡＮ分析の結果は図１に示されている。
パネルＡは、試験した各血清についての相対吸光度値を示している。
パネルＢは、各血清に対するバックグラウンド値について補正した、各ペプチドに対する個々の吸光度値の合計を示している。
パネルＣは、試験した各血清に対する平均バックグラウンド値を少なくとも３ＳＤ越える吸光度値を産生した各ペプチドについての陽性スコアを示している。
各血清に対するバックグラウンド吸光度値は、１０種の最小反応性ペプチドの平均吸光度値として決定した。
この図から、ほとんどの血清がｐｐ２８アミノ酸配列の明確な領域と反応性であることを見て取ることができる。一部の領域は多数の被験者によって認識されているので、従ってｐｐ２８の免疫優勢エピトープを表している。
ｐｐ１５０（ＵＬ３２）、ｐｐ６５（ＵＬ８３）、ｐｐ５２（ＵＬ４４）のような他のＣＭＶタンパク質のＰＥＰＳＣＡＮ分析によっても類似のデータが入手されている。
結論：相違する個人からの血清中の抗体類は明確な領域（エピトープクラスター）との相互作用を通してＣＭＶタンパク質を認識するが、その位置は各個人で有意に相違する場合がある。
実施例２．
単一分子内に多数のＰＥＰＳＣＡＮ反応性ドメインを結合させるために、標準固相合成法を用いて長さの相違する選択されたペプチド類（配列表参照）を合成した。
これらのペプチド類を９６ウエル・マイクロＥＬＩＳＡプレートのウエル内の固相上に一般的にはコーティング緩衝液中に１μｇ／ｍｌで塗布し、コーティング緩衝液に溶解させた１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて非結合位置をブロックした。至適化実験で決定された最高免疫化学反応性に基づいて、ペプチド類を直接に塗布するか、又は高度に精製されたＢＳＡへのペプチド類のグルタールアルデヒド媒介性結合によって合成されたＢＳＡペプチド複合体として塗布した。
塗布後、ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有しているｐｈ７．４の０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中に溶解させたヒト血清の希釈液（通常は１：１００）の抗体反応性を標準ＥＬＩＳＡ法によって分析した。
図２には、ＣＭＶ抗体類に対して血清陽性又は血清陰性の任意健常被験者からの血清を用いて、標準抗体アッセイによって測定されたＩｇＧ抗体類についてのペプチドＥＬＩＳＡ試験結果が示されている。
下記の表には、各パネルについて対応するペプチド分析が示されている：
パネル２Ａ−ペプチド ＃Ｔ２１Ｃ（配列番号２）、
パネル２Ｂ−ペプチド ＃Ｃ２１Ｍ（配列番号３）、
パネル２Ｃ−ペプチド ＃Ｔ２１ＣＣ２１Ｍ（配列番号４）
パネル２Ｄ−ペプチド ＃Ｋ３８Ｅ（配列番号１）
パネル２Ｅ−ペプチド ＃ＯＴＰ１９４（配列番号５）
パネル２Ｆ−ペプチド ＃ＯＴＰ１９７（配列番号６）
パネル２Ｇ−ペプチド ＃Ｆ２８Ｇ（配列番号８）
パネル２Ｈ−ペプチド ＃ＯＴＰ１０１Ａ（配列番号７）
パネル２Ｉ−ペプチド ＃ＯＴＰ１１８Ａ（配列番号９）
パネル２Ｊ−ペプチド ＃ＯＴＰ１１９Ａ（配列番号１０）
パネル２Ｋ−細胞培養抽出物であるＣＭＶ−Ａｇ（ゴールドスタンダード）
各パネルには、任意健常血液ドナーから入手した相違するヒト血清セットを用いた４例の実験結果が示されている。
ＣＭＶ免疫状態は、ＣＭＶ抗原由来細胞培養に基づく標準の「ゴールドスタンダード」（^*）ＥＬＩＳＡを使用して測定した（パネル２Ｋ）。
（○）はＣＭＶ血清陽性試料を表している。
（×）はＣＭＶ血清陰性試料を表している。
（^*）ＣＭＶ株ＡＤ−１６９の３ＰＦＵ／ｃｅｌｌを用いて６日間に渡って感染させたヒト胚肺線維芽細胞から調製した、精製され、脱エンベロープ化したビリオンと血小板濃密小体から構成される「ゴールドスタンダード」のための抗原。感染細胞は冷凍−解凍サイクルを３回繰り返し、溶解相中に細胞内ビリオンと血小板濃密小体を遊離させるために０．０５Ｎリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた０．３５％ ＴＸ１００を用いて抽出した。溶解性粒子を核から分離し、より大きな細胞性物質を＋４℃、１，２００ｘｇでの２０分間の密度勾配遠心法によってＦｉｃｏｌｌ層を通して分離した。上層から、１２，０００ｘｇでの１０分間の遠心によってウイルス粒子を単離し、ペレット粒子をＰＢＳ中に短時間の超音波処理によって溶解させた。電子顕微鏡検査により、これらの粒子は主として脱エンベロープ化したウイルスキャプシドと血小板濃密小体とから構成されていることが証明された。
図３には、活動性ＣＭＶ感染症を有する患者及び活動性ＣＭＶ感染症を有していない適切な対照被験者からの血清を用いて、ＩｇＭ抗体類に反応する最高のペプチドセットを表している分析結果の抜粋が示されている。
血清は標準ＥＬＩＳＡにおいてＣＭＶ−ＩｇＭに対して陽性反応を示している活動性ＣＭＶ感染症を有する腎臓移植患者から入手した（図３Ｅ参照）。
下記の表では、各パネルについて対応するペプチド分析が示されている：
パネル３Ａ−ペプチド ＃Ｋ３８Ｅ（配列番号１）
パネル３Ｂ−ペプチド ＃Ｔ２１ＣＣ２１Ｍ（配列番号４）
パネル３Ｃ−ペプチド ＃Ｆ２８Ｇ（配列番号８）
パネル３Ｄ−ペプチド ＃ＯＴＰ１１９Ａ（配列番号１０）
パネル３Ｅ−細胞培養抽出物であるＣＭＶ−Ａｇ（ゴールドスタンダード）
結論：図２及び図３に示されているデータは、個々のコンビペプチド類がほとんどのヒト血清中の抗体類と反応性であるが、全ての血清と反応性を示すペプチドはないことを証明している。時々、一部のペプチド類はＣＭＶ陰性血清とも反応する（擬陽性）。
このため、ほとんどの選択されたペプチド類は一部のヒト血清と反応性であると思われるが、全血清と反応性の単一ペプチドは存在しない。
実施例３．
実施した数例の実験において、相違する免疫反応性ＣＭＶタンパク質に由来する明確に定義された合成コンビペプチド類の選択された組み合わせ、特に［＃Ｋ３８Ｅ＋＃ＯＴＰ１０１Ａ＋＃ＯＴＰ１１９Ａ］（配列番号１＋配列番号７＋配列番号１０）の組み合わせは、細胞培養由来ＣＭＶ抗原類を使用する現在の「ゴールドスタンダード」であるＥＬＩＳＡと同等又はより良好な感受性でヒト血清中に含まれるＣＭＶ−ＩｇＧ抗体類を検出することができた。
ＣＭＶ−Ａｇは実施例２に記載された通りに調製し、固相上に塗布した。＃ＯＴＰ１０１Ａ（配列番号７）は、＃Ｋ３８Ｅ（配列番号１）及び＃ＯＴＰ１１９Ａ（配列番号１０）と等モル比で塗布前にＢＳＡへ結合させた。
図４には、ペプチド結合ＥＬＩＳＡにおけるＣＭＶ−ＩｇＧ反応性を固相上の半精製細胞培養由来ＣＭＶ抗原を使用する標準ＥＬＩＳＡと比較したデータが示されている。分析された血清は米国（４Ａ）又はオランダ（４Ｂ）のどちらかからの健常血液ドナーから入手した。
ペプチドをベースとするＥＬＩＳＡ（縦軸）で測定されたＣＭＶ−ＩｇＧ反応性は、「ゴールドスタンダード」であるＥＬＩＳＡ（横軸）に比較して同等又はより良好な反応性を生じる。ＣＭＶ−ＩｇＧに対して陰性である対照ヒト血清はどちらのアッセイでも陰性である。
固相上にこれら３種のペプチド類が存在することは、エピトープ特異的抗体類を用いて検査した（データは示されていない）。
結論：このように明確に特定されたＣＭＶ合成分子のセットが利用可能であることは、ヒト血清中の抗ＣＭＶ ＩｇＧを検出するための高度に精密なアッセイを開発するために極めて価値が高く、ＣＭＶ血清診断のいっそうの標準化及びＣＭＶ免疫状態の測定に寄与する可能性がある。
実施例４．
分析された全血清と細胞培養由来ＣＭＶ−Ａｇと同程度に反応できる単一ペプチドが存在しなかったので（実施例２）、ヒト抗ＣＭＶ ＩｇＭとの十分な反応性を得るためには単一ウエル中での選択された複数のコンビペプチド類の組み合わせが必要であった。
このためペプチド類の数種の組み合わせを試験して至適化した。
これらの試験成績から、ヒト血清中抗ＣＭＶ ＩｇＭを検出するために最高のペプチドの組み合わせは［＃Ｋ３８Ｅ＋＃Ｆ２８Ｇ］（配列番号１＋配列番号８）であることが証明された。
図５は、１μｇ／ｍｌで固相に結合させた細胞培養由来ＣＭＶ−Ａｇ及び［＃Ｋ３８Ｅ＋＃Ｆ２８Ｇ］（配列番号１＋配列番号８）のヒトＩｇＭとの反応性の比較を示している。
血清は明確に定義された一次ＣＭＶ感染症の腎臓移植患者から入手した。
ＣＭＶ−Ａｇは実施例２に記載された通りに調製して塗布し、ペプチド類は０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中１μｇ／ｍｌで同時に固相上に塗布した。
［＃Ｋ３８Ｅ＋＃Ｆ２８Ｇ］（配列番号１＋配列番号８）はヒト抗ＣＭＶ−ＩｇＭ抗体類の検出において細胞培養由来ＣＭＶ−Ａｇに取って代わることのできる優秀な、良好に定義された組み合わせを提供すると結論できる。
実施例５．
本発明に記載のＣＭＶペプチド試薬類に対して反応性のモノクローナル抗体類は診断アッセイのために有用である（例えば、ＩｇＭ捕獲アッセイにおけるＣＭＶ特異的抱合体として、固相上のペプチド塗布を測定する品質管理等）。
そうした抗体類は、培養細胞及び患者の組織又は体液中に含まれるＣＭＶの直接検出においても有用な可能性がある。
そうした抗体の１つだけを例示するために、ＣＭＶ−ｐｐ１５０（ＵＬ３２）のＣ末端ドメインに対するＣＭＶ．ＯＴ３Ｃと称する（保管番号Ｎｏ．９６０７１１２３を付けて欧州動物細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），ＣＡＭＲ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：応用微生物学研究センター），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ（英国）に保管されている）、及びＥＬＩＳＡによってペプチド＃Ｋ３８Ｅ（配列番号１）と反応性である抗体について説明する。この抗体はＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法又は免疫沈降法によってＣＭＶ感染細胞溶解物中の無傷ｐｐ１５０を検出することができ、さらに免疫蛍光法又は免疫組織学的方法によってＣＭＶ感染細胞を特異的に染色する。
ＣＭＶ．ＯＴ３Ｃの直接酵素結合は、（ＩｇＭ又はＩｇＡ）免疫捕獲アッセイにおいてＣＭＶ特異的検出試薬として使用できる抗体抱合体を産生する。
図６には、次のように調製された免疫ブロットが示されている：ＣＭＶ−ＡＤ１６９感染ヒト線維芽全細胞溶解液のタンパク質を標準Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって変性及び分離させ、ニトロセルロース上にブロッティングした。ストリップをカットし、残りのタンパク質結合部位を５％ウマ血清（ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳ中に溶解させた４％乾燥乳粉末と一緒に１時間インキュベートすることによってブロックした。引き続いてストリップを３７℃で１時間、ブロッキング緩衝液中でモノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄した後、抗マウスＨＲＰ抱合体を添加し、上記と同様にインキュベートし、沈降基質として４−クロロナフトールを使用して結合した酵素反応性を検出した。
図の下の説明に記載されているように、追加のＣＭＶタンパク質（Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，フロリダ州、米国から入手したＧＩＣＲシリーズ）及びＣＭＶ血清陽性ドナーからのヒト血清ＩｇＧに対するモノクローナル抗体類の対照反応が平行ストリップに示されている。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：２
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：３
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：４
配列の長さ：４２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：５
配列の長さ：２９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：６
配列の長さ：２７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：７
配列の長さ：２２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：８
配列の長さ：２８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：９
配列の長さ：３７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

配列番号：１０
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
配列

Claims (6)

1. サイトメガロウイルスに対する抗体を検出するためのペプチド試薬であって、
   配列番号１−６に示されているアミノ酸配列またはそれらの抗原決定基から選択される合成免疫優勢ペプチドと
   配列番号７−１０に示されているアミノ酸配列またはそれらの抗原決定基から選択される１又は２以上の合成免疫優勢ペプチドとを含有していることを特徴とするペプチド試薬。
2. 配列番号１に示されているアミノ酸配列からなる合成免疫優勢ペプチドと、配列番号７に示されているアミノ酸配列からなる合成免疫優勢ペプチドと、さらに配列番号１０に示されているアミノ酸配列からなる合成免疫優勢ペプチドとを含有している、請求項１に記載のペプチド試薬。
3. 配列番号１に示されているアミノ酸配列からなる合成免疫優勢ペプチドと配列番号８に示されているアミノ酸配列からなる合成免疫優勢ペプチドとを含有している、請求項１に記載のペプチド試薬。
4. 被験液中に含まれるサイトメガロウイルスに対する抗体の検出方法であって、被験液を請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド試薬と接触させ、さらに被験液中で形成された免疫複合体類の存在を検出することを特徴とする検出方法。
5. 被験液中に含まれるサイトメガロウイルスの検出方法であって、被験液を請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド試薬と接触させ、それにサイトメガロウイルスに対する抗体を接触させ、その後に形成された免疫複合体の存在を検出することを特徴とする検出方法。
6. 請求項４〜５のいずれかに記載の方法を実行するための試験キット。

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