JP2535455B2 - サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ - Google Patents
サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サイトメガロウイルス
（Cytomegalo-virus、以下ＣＭＶと略記する）に対する
ヒト・モノクローナル抗体（monoclonal antibody 、以
下ＭＣＡと略記する）を産生するハイブリドーマに関す
る。
（Cytomegalo-virus、以下ＣＭＶと略記する）に対する
ヒト・モノクローナル抗体（monoclonal antibody 、以
下ＭＣＡと略記する）を産生するハイブリドーマに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＣＭＶはヘルペス・ウイルス属に属する
ウイルスの一つであり、ＤＮＡ、コアタンパク、カプシ
ッドとエンビロープからなっている。このウイルスが人
間に感染しても、多くの場合何の疾病も引き起こさな
い。しかしながら、免疫能力の低下した新生児では肝炎
を起こしたり、臓器移植のために免疫抑制された患者に
間質性肺炎を起こし、しばしば致命的な感染症を引き起
こす。従って、この感染症の診断、予防および治療は大
きな治療ニーズがある。Condiら（American J. Medicin
e,March３０，１３４─１４１，１９８４参照）は骨髄
移植患者に抗ＣＭＶ抗体価の高いヒト血清グロブリンを
投与し、ＣＭＶ感染とそれによる間質性肺炎を防ぐこと
に成功している。高力価のヒト血清グロブリンは、血清
提供者の抗体価をあらかじめチエックし、高力価である
血漿のみを収集して分画される。この方法で得られる血
清グロブリンの、ＣＭＶに対する抗体価はランダムに収
集されたものの高々１０倍にしか過ぎず、かつこのよう
に高力価血清グロブリンを収集することは非常に困難で
あり、安定に供給することができない。
ウイルスの一つであり、ＤＮＡ、コアタンパク、カプシ
ッドとエンビロープからなっている。このウイルスが人
間に感染しても、多くの場合何の疾病も引き起こさな
い。しかしながら、免疫能力の低下した新生児では肝炎
を起こしたり、臓器移植のために免疫抑制された患者に
間質性肺炎を起こし、しばしば致命的な感染症を引き起
こす。従って、この感染症の診断、予防および治療は大
きな治療ニーズがある。Condiら（American J. Medicin
e,March３０，１３４─１４１，１９８４参照）は骨髄
移植患者に抗ＣＭＶ抗体価の高いヒト血清グロブリンを
投与し、ＣＭＶ感染とそれによる間質性肺炎を防ぐこと
に成功している。高力価のヒト血清グロブリンは、血清
提供者の抗体価をあらかじめチエックし、高力価である
血漿のみを収集して分画される。この方法で得られる血
清グロブリンの、ＣＭＶに対する抗体価はランダムに収
集されたものの高々１０倍にしか過ぎず、かつこのよう
に高力価血清グロブリンを収集することは非常に困難で
あり、安定に供給することができない。
【０００３】MilsteinとKoehler によって確立されたハ
イブリドーマ法によって、高純度の抗体、すなわちＭＣ
Ａが作製できるようになった。Rasmussen ら（Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA ,８１，８７６−８８０，１９８４
参照）はＣＭＶをマウスに免疫し、そのマウス脾細胞と
マウス・ミエローマ細胞を融合することによってＣＭＶ
特異的ＭＣＡを産生するハイブリドーマを作製した。彼
女ら以外にもいくつかの研究グループがＣＭＶに対する
マウスのＭＣＡを得ている（例えば、Goldstein ら、In
fection and Immunity ,３８，２７３−２８１，１９８
２；Pereira ら，Infection and Immunity ,３６，９２
４−９３２，１９８２参照）。これらのＭＣＡの中にあ
って、ウイルスを中和する活性を有するＭＣＡは少ない
が、Rasmussen らのＭＣＡは、約１０μg ／mlでＣＭＶ
を中和する能力がある。これは高力価血清グロブリンと
比較したとき、極めて高い中和活性であり、このような
ＭＣＡによるＣＭＶ感染症の予防あるいは治療が期待さ
れる。しかしながら、これらはマウス由来のＭＣＡであ
り、人体に投与したとき異物として認識され不都合な副
作用を引き起こす。そこで、マウス由来でなく、ヒト由
来の抗ＣＭＶ／ＭＣＡが望まれる。
イブリドーマ法によって、高純度の抗体、すなわちＭＣ
Ａが作製できるようになった。Rasmussen ら（Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA ,８１，８７６−８８０，１９８４
参照）はＣＭＶをマウスに免疫し、そのマウス脾細胞と
マウス・ミエローマ細胞を融合することによってＣＭＶ
特異的ＭＣＡを産生するハイブリドーマを作製した。彼
女ら以外にもいくつかの研究グループがＣＭＶに対する
マウスのＭＣＡを得ている（例えば、Goldstein ら、In
fection and Immunity ,３８，２７３−２８１，１９８
２；Pereira ら，Infection and Immunity ,３６，９２
４−９３２，１９８２参照）。これらのＭＣＡの中にあ
って、ウイルスを中和する活性を有するＭＣＡは少ない
が、Rasmussen らのＭＣＡは、約１０μg ／mlでＣＭＶ
を中和する能力がある。これは高力価血清グロブリンと
比較したとき、極めて高い中和活性であり、このような
ＭＣＡによるＣＭＶ感染症の予防あるいは治療が期待さ
れる。しかしながら、これらはマウス由来のＭＣＡであ
り、人体に投与したとき異物として認識され不都合な副
作用を引き起こす。そこで、マウス由来でなく、ヒト由
来の抗ＣＭＶ／ＭＣＡが望まれる。
【０００４】一般にヒト由来のＭＣＡはマウス・ミエロ
ーマ細胞、ヒト・ミエローマ細胞あるいは他のリンパ系
樹立細胞とヒト・リンパ球とを細胞融合して得られるハ
イブリドーマから産生される。あるいはヒト・リンパ球
をＥＢウイルスによって変異させたリンパ芽球細胞から
も産生される。１９８０年から現在まで、多くのヒトＭ
ＣＡ作製の試みがなされてきたが、いずれの方法もそれ
ぞれ固有の問題をかかえている。マウス・ミエローマと
ヒト・リンパ球との細胞融合で得られたハイブリドーマ
のＭＣＡ産生は不安定であるし、ヒト・ミエローマ細胞
とヒト・リンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。ま
たＥＢウイルスによって得られるリンパ芽球細胞のＭＣ
Ａ産生は量が少なく、かつ不安定である。その上、ＥＢ
ウイルスは腫瘍を引き起こす能力を有しており、安全性
上大きな問題がある。このようにＭＣＡ産生細胞を樹立
する技術において大きな障害があるが、さらにもう一
つ、特定抗原に特異的なヒトＭＣＡを得るためには大き
な障害がある。それは充分に免疫されたヒト・リンパ球
を得るという課題である。一般に正常人のリンパ球はＣ
ＭＶによって感作されていることが多いが、その免疫度
合いは極めて低い。従って、正常人のリンパ球からハイ
ブリドーマあるいはリンパ芽球細胞を樹立しても、抗Ｃ
ＭＶ・ＭＣＡを産生する細胞を得られる見込みはほとん
どない。
ーマ細胞、ヒト・ミエローマ細胞あるいは他のリンパ系
樹立細胞とヒト・リンパ球とを細胞融合して得られるハ
イブリドーマから産生される。あるいはヒト・リンパ球
をＥＢウイルスによって変異させたリンパ芽球細胞から
も産生される。１９８０年から現在まで、多くのヒトＭ
ＣＡ作製の試みがなされてきたが、いずれの方法もそれ
ぞれ固有の問題をかかえている。マウス・ミエローマと
ヒト・リンパ球との細胞融合で得られたハイブリドーマ
のＭＣＡ産生は不安定であるし、ヒト・ミエローマ細胞
とヒト・リンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。ま
たＥＢウイルスによって得られるリンパ芽球細胞のＭＣ
Ａ産生は量が少なく、かつ不安定である。その上、ＥＢ
ウイルスは腫瘍を引き起こす能力を有しており、安全性
上大きな問題がある。このようにＭＣＡ産生細胞を樹立
する技術において大きな障害があるが、さらにもう一
つ、特定抗原に特異的なヒトＭＣＡを得るためには大き
な障害がある。それは充分に免疫されたヒト・リンパ球
を得るという課題である。一般に正常人のリンパ球はＣ
ＭＶによって感作されていることが多いが、その免疫度
合いは極めて低い。従って、正常人のリンパ球からハイ
ブリドーマあるいはリンパ芽球細胞を樹立しても、抗Ｃ
ＭＶ・ＭＣＡを産生する細胞を得られる見込みはほとん
どない。
【０００５】ＣＭＶに対するヒトＭＣＡについては一つ
だけ産生細胞株が得られたとの報告がある。（J. Immun
ol. , １３３，２２０２−２２０５，１９８４参照）。
これによると、正常人リンパ球をＥＢウイルスで変異さ
せて、ＭＣＡ産生細胞株が得られている。しかしなが
ら、記載されている内容は一葉の蛍光抗体写真のみであ
り、ＭＣＡを安定に産生している細胞株が樹立できたの
か否か明白ではない。さらに前述したように、ＥＢウイ
ルス由来の発癌性も問題があり、人体に投与することは
大きな危険を伴う。また、この方法によって得られたＭ
ＣＡは、ＣＭＶに結合するとしてもＣＭＶを中和する能
力を全く有していないことが明らかにされている。以上
の如く、目的とする特異性を有するヒトＭＣＡを効率よ
く取得する上で最も大きな問題は、ヒト・リンパ球を特
定の抗原で充分免疫することが困難であるということで
ある。マウスの場合には、生体にとって有害な抗原であ
っても投与しうるし、さらに都合のよい投与スケジュー
ルで免疫することができるが、人間の場合にはこれがで
きない。ＣＭＶは病原体であり、ワクチンができていな
い現在、人間にＣＭＶを故意に投与し、免疫することは
倫理上許されない。ヒトＭＣＡを作製する上で、次に問
題となる点は、ヒトＭＣＡを安定に産生する細胞を樹立
する方法である。ハイブリドーマ法もＥＢＶ法も一長一
短があることは前にも述べたとおりである。
だけ産生細胞株が得られたとの報告がある。（J. Immun
ol. , １３３，２２０２−２２０５，１９８４参照）。
これによると、正常人リンパ球をＥＢウイルスで変異さ
せて、ＭＣＡ産生細胞株が得られている。しかしなが
ら、記載されている内容は一葉の蛍光抗体写真のみであ
り、ＭＣＡを安定に産生している細胞株が樹立できたの
か否か明白ではない。さらに前述したように、ＥＢウイ
ルス由来の発癌性も問題があり、人体に投与することは
大きな危険を伴う。また、この方法によって得られたＭ
ＣＡは、ＣＭＶに結合するとしてもＣＭＶを中和する能
力を全く有していないことが明らかにされている。以上
の如く、目的とする特異性を有するヒトＭＣＡを効率よ
く取得する上で最も大きな問題は、ヒト・リンパ球を特
定の抗原で充分免疫することが困難であるということで
ある。マウスの場合には、生体にとって有害な抗原であ
っても投与しうるし、さらに都合のよい投与スケジュー
ルで免疫することができるが、人間の場合にはこれがで
きない。ＣＭＶは病原体であり、ワクチンができていな
い現在、人間にＣＭＶを故意に投与し、免疫することは
倫理上許されない。ヒトＭＣＡを作製する上で、次に問
題となる点は、ヒトＭＣＡを安定に産生する細胞を樹立
する方法である。ハイブリドーマ法もＥＢＶ法も一長一
短があることは前にも述べたとおりである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＣＭ
Ｖ感染症の診断、予防および治療に役立つところの、Ｃ
ＭＶに特異的な、かつ人体にとって安全なヒトＭＣＡを
産生するハイブリドーマを提供することにある。
Ｖ感染症の診断、予防および治療に役立つところの、Ｃ
ＭＶに特異的な、かつ人体にとって安全なヒトＭＣＡを
産生するハイブリドーマを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗ＣＭＶ
・ヒトＭＣＡを取得することを目的として鋭意研究を行
った結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマイト−ジエン存在下
に、ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは糖蛋白で感
作したヒト・リンパ球と、マウス・ミエローマ細胞とを
融合させる方法によって、抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを産生
するハイブリドーマを得ることができた。そして、この
ハイブリドーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養
し、培養上清から抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを採取すること
ができた。本発明のハイブリドーマの産生するヒトＭＣ
Ａは、ＣＭＶ及び／又はＣＭＶ感染細胞に反応する抗体
である。本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡのなかで好ましいのはＩｇＧ１型のものであ
り、これはまた分子量約１３０，０００と約５５，００
０のＣＭＶ抗原蛋白を認識し、ＣＭＶを中和する能力を
有する。本発明のハイブリドーマは、アメリカンタイプ
カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号Ｈ
Ｂ９２１５として寄託されているハイブリドーマＣ４
１、またはそれと同様な抗体産生能を有するハイブリド
ーマである。
・ヒトＭＣＡを取得することを目的として鋭意研究を行
った結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマイト−ジエン存在下
に、ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは糖蛋白で感
作したヒト・リンパ球と、マウス・ミエローマ細胞とを
融合させる方法によって、抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを産生
するハイブリドーマを得ることができた。そして、この
ハイブリドーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養
し、培養上清から抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを採取すること
ができた。本発明のハイブリドーマの産生するヒトＭＣ
Ａは、ＣＭＶ及び／又はＣＭＶ感染細胞に反応する抗体
である。本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡのなかで好ましいのはＩｇＧ１型のものであ
り、これはまた分子量約１３０，０００と約５５，００
０のＣＭＶ抗原蛋白を認識し、ＣＭＶを中和する能力を
有する。本発明のハイブリドーマは、アメリカンタイプ
カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号Ｈ
Ｂ９２１５として寄託されているハイブリドーマＣ４
１、またはそれと同様な抗体産生能を有するハイブリド
ーマである。
【０００８】本発明において用いられるヒト・リンパ球
は脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイド等
の中に含まれている。本発明の目的のためには、いかな
るソースのリンパ球でも用いることができるが、望まし
くは脾臓、骨髄または扁桃である。マウスのミエローマ
細胞としては、８―アザグアニン耐性株を用いるのが有
利であり、公知のものとしては、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの
Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ１
株、ＳＰ２／０Ａｇ１４株、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６．
５．３株、ＭＰＣ１１−４５．６．ＴＧ１．７株、ＳＰ
−１株等がある。
は脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイド等
の中に含まれている。本発明の目的のためには、いかな
るソースのリンパ球でも用いることができるが、望まし
くは脾臓、骨髄または扁桃である。マウスのミエローマ
細胞としては、８―アザグアニン耐性株を用いるのが有
利であり、公知のものとしては、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの
Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ１
株、ＳＰ２／０Ａｇ１４株、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６．
５．３株、ＭＰＣ１１−４５．６．ＴＧ１．７株、ＳＰ
−１株等がある。
【０００９】本発明においては、ヒトのリンパ球とマウ
スのミエローマ細胞とを融合させるに先立って、ヒトの
リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでマイト−ジエン存在下に
抗原感作する。ヒトの場合、正常人ではＣＭＶに対する
抗体を産生し得る能力のあるリンパ球は存在しても、そ
の数が極めて少ない。そのため目的とするハイブリドー
マが得られる可能性が極端に低い。これに対して本発明
のｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト・リンパ球を感作する方法を
採ったときには、その抗原に特異的な抗体を産生するリ
ンパ球が選択的に分化、増殖し、その結果、効率よく目
的のＭＣＡ産生ハイブリドーマを得ることができる。
スのミエローマ細胞とを融合させるに先立って、ヒトの
リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでマイト−ジエン存在下に
抗原感作する。ヒトの場合、正常人ではＣＭＶに対する
抗体を産生し得る能力のあるリンパ球は存在しても、そ
の数が極めて少ない。そのため目的とするハイブリドー
マが得られる可能性が極端に低い。これに対して本発明
のｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト・リンパ球を感作する方法を
採ったときには、その抗原に特異的な抗体を産生するリ
ンパ球が選択的に分化、増殖し、その結果、効率よく目
的のＭＣＡ産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００１０】本発明の実施例においては、感作抗原とし
てＣＭＶのＡＤ１６９株が用いられているが、他の実験
用ＣＭＶ株あるいは臨床分離ＣＭＶ株でも感作できる。
さらにＣＭＶそのものでなく、その構成蛋白もしくは構
成糖蛋白を用いてもよい。マイト−ジエンとしては、リ
ンパ球の分化および増殖を促進させるものならば何でも
よいが、例えば、ポークウイードマイト−ジエン（ＰＷ
Ｍ）、Ｂ細胞増殖因子（B cell growth factors,BCG
F）、プロテインＡ，フィトヘムアグルチニン（ＰＨ
Ａ）、コンカナバリンＡがある。好ましいのは２〜２０
０μg ／mlのＰＷＭあるいは１００分の１容から３分の
１容のBCGFである。
てＣＭＶのＡＤ１６９株が用いられているが、他の実験
用ＣＭＶ株あるいは臨床分離ＣＭＶ株でも感作できる。
さらにＣＭＶそのものでなく、その構成蛋白もしくは構
成糖蛋白を用いてもよい。マイト−ジエンとしては、リ
ンパ球の分化および増殖を促進させるものならば何でも
よいが、例えば、ポークウイードマイト−ジエン（ＰＷ
Ｍ）、Ｂ細胞増殖因子（B cell growth factors,BCG
F）、プロテインＡ，フィトヘムアグルチニン（ＰＨ
Ａ）、コンカナバリンＡがある。好ましいのは２〜２０
０μg ／mlのＰＷＭあるいは１００分の１容から３分の
１容のBCGFである。
【００１１】感作の方法条件は特に限定されるものでは
ないが、抗原（ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは
糖蛋白）の濃度は１μg ／ml〜１ng／ml、ＰＷＭは２〜
２００μg ／ml、BCGFは１００分の１容から３分の１
容、リンパ球（抗体産生細胞）の濃度は１×１０5 〜１
×１０7 個／mlが適当であり、培養温度は３５〜４０℃
で、培養時間は４〜１０日、好ましくは６〜８日であ
る。培養液は人、牛、馬などの血清を含むものなら何で
もよいが、特に胎児牛血清（ＦＣＳ）を含む培養液（例
えばＲＰＭＩ１６４０）が好ましい。
ないが、抗原（ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは
糖蛋白）の濃度は１μg ／ml〜１ng／ml、ＰＷＭは２〜
２００μg ／ml、BCGFは１００分の１容から３分の１
容、リンパ球（抗体産生細胞）の濃度は１×１０5 〜１
×１０7 個／mlが適当であり、培養温度は３５〜４０℃
で、培養時間は４〜１０日、好ましくは６〜８日であ
る。培養液は人、牛、馬などの血清を含むものなら何で
もよいが、特に胎児牛血清（ＦＣＳ）を含む培養液（例
えばＲＰＭＩ１６４０）が好ましい。
【００１２】かくして得られたＣＭＶで感作したヒトの
抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とは、次いで公
知の方法に従って細胞融合せしめられる。例えばリンパ
球とミエローマ細胞を１０：１〜１：１００、好ましく
は１：１〜１：１０の比率で混合し、適当な細胞融合溶
液、例えば約３５％ポリエチレングリコール（分子量
１，０００〜６，０００程度）および約７．５％ジメチ
ルスルホキシドを含むＲＰＭＩ１６４０を加えて、室温
〜３７℃で１〜数分間攪拌し、その後１０％ＦＣＳを加
えＲＰＭＩ１６４０で徐々に希釈し、洗浄の後、ＨＡＴ
（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培
養液にて細胞濃度が１〜５×１０5 個／mlとなるように
調整する。これを０．２mlずつ、例えば９６穴プレート
に分注し、５％ＣＯ2 を含む空気中で３５〜３８℃で３
〜４週間培養する。ＨＡＴ培養液中ではハイブリドーマ
のみが生存し、８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞
およびミエローマ同士の融合細胞は生存しえない（未融
合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。
抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とは、次いで公
知の方法に従って細胞融合せしめられる。例えばリンパ
球とミエローマ細胞を１０：１〜１：１００、好ましく
は１：１〜１：１０の比率で混合し、適当な細胞融合溶
液、例えば約３５％ポリエチレングリコール（分子量
１，０００〜６，０００程度）および約７．５％ジメチ
ルスルホキシドを含むＲＰＭＩ１６４０を加えて、室温
〜３７℃で１〜数分間攪拌し、その後１０％ＦＣＳを加
えＲＰＭＩ１６４０で徐々に希釈し、洗浄の後、ＨＡＴ
（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培
養液にて細胞濃度が１〜５×１０5 個／mlとなるように
調整する。これを０．２mlずつ、例えば９６穴プレート
に分注し、５％ＣＯ2 を含む空気中で３５〜３８℃で３
〜４週間培養する。ＨＡＴ培養液中ではハイブリドーマ
のみが生存し、８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞
およびミエローマ同士の融合細胞は生存しえない（未融
合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。
【００１３】培養後、培養液中の抗体価をチエックし、
目的とする抗体を産生しているハイブリドーマのみを選
択し単離する（クローニング）。培養液中の抗体価のチ
エックは、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素抗
体法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法などの、抗原への抗体
の結合そのものを検出する方法と、ウイルスの生物活性
を阻害する抗体の活性をみる方法などで行うことができ
る。クローニングによって選択された、本発明の抗ＣＭ
Ｖ・ヒトＭＣＡを産生するマウス−ヒトハイブリドーマ
は、凍結して保存することができる。かかるハイブリド
ーマのセルライン（細胞株）及び／又はそれに由来する
細胞株を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から
本発明の目的とするヒトＭＣＡを得ることができる。ま
た、このハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、そ
の腹水や血清からヒトＭＣＡを得ることもできる。
目的とする抗体を産生しているハイブリドーマのみを選
択し単離する（クローニング）。培養液中の抗体価のチ
エックは、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素抗
体法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法などの、抗原への抗体
の結合そのものを検出する方法と、ウイルスの生物活性
を阻害する抗体の活性をみる方法などで行うことができ
る。クローニングによって選択された、本発明の抗ＣＭ
Ｖ・ヒトＭＣＡを産生するマウス−ヒトハイブリドーマ
は、凍結して保存することができる。かかるハイブリド
ーマのセルライン（細胞株）及び／又はそれに由来する
細胞株を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から
本発明の目的とするヒトＭＣＡを得ることができる。ま
た、このハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、そ
の腹水や血清からヒトＭＣＡを得ることもできる。
【００１４】以上の如くして得られた抗ＣＭＶ・ヒトＭ
ＣＡは、次のような特性を有する。本発明で得られた抗
ＣＭＶ・ヒトＭＣＡは、多くの実験用ＣＭＶ株および臨
床分離株に共通に反応する。しかし、他のヘルペス群ウ
イルスである単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、水
痘帯状疱疹ウイルスには反応しない。またＣＭＶ感染細
胞には反応するが、非感染細胞には反応しない。従って
これらのＭＣＡはＣＭＶに特異的であるといえる。この
ようにＣＭＶに特異的であることが明瞭に示されたヒト
ＭＣＡは、本発明において初めて得られたものである。
ＣＡは、次のような特性を有する。本発明で得られた抗
ＣＭＶ・ヒトＭＣＡは、多くの実験用ＣＭＶ株および臨
床分離株に共通に反応する。しかし、他のヘルペス群ウ
イルスである単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、水
痘帯状疱疹ウイルスには反応しない。またＣＭＶ感染細
胞には反応するが、非感染細胞には反応しない。従って
これらのＭＣＡはＣＭＶに特異的であるといえる。この
ようにＣＭＶに特異的であることが明瞭に示されたヒト
ＭＣＡは、本発明において初めて得られたものである。
【００１５】ＣＭＶは多くの抗原物質によって構成され
ている。そこで、本発明のヒトＭＣＡがどのような構成
成分に対して反応するのか検討した結果、分子量約１３
０，０００の蛋白と分子量約５５，０００の蛋白に反応
し、この群のＭＣＡの中には強いウイルス中和活性を有
しているＭＣＡがあることがわかった。これらの特性か
ら考えて、ＣＭＶ感染の診断、ＣＭＶ感染の予防および
治療に適している。予防および治療という目的から考え
たとき、ＭＣＡにウイルス中和（不活化）活性があると
いう点は極めて重要な特性である。
ている。そこで、本発明のヒトＭＣＡがどのような構成
成分に対して反応するのか検討した結果、分子量約１３
０，０００の蛋白と分子量約５５，０００の蛋白に反応
し、この群のＭＣＡの中には強いウイルス中和活性を有
しているＭＣＡがあることがわかった。これらの特性か
ら考えて、ＣＭＶ感染の診断、ＣＭＶ感染の予防および
治療に適している。予防および治療という目的から考え
たとき、ＭＣＡにウイルス中和（不活化）活性があると
いう点は極めて重要な特性である。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳述する。 実施例１ （１）ＣＭＶ抗原の作製 単層に増殖したＨＥＬ細胞に、ＡＤ１６９株感染細胞を
７：１の割合で混ぜ、５日間ＣＯ2 インキュベーター中
で培養した。こうして得られた感染細胞を、０．１％Ｅ
ＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水ではがし、集めた。
次いで、４５秒間超音波破砕し、３，０００rpm で２０
分間遠心した上清を得た。これを６０％と２０％の重層
ショ糖溶液の上に乗せ、１０，０００×ｇで１時間遠心
した。６０％層と２０％層の間にウイルスは集まるの
で、これを採取し、再度超音波処理によってよく分散さ
せた。これを１．２８g ／cm3 のＣｓＣｌ2 溶液の上に
乗せて、１００，０００×ｇで４２時間遠心した。その
結果、密度勾配が形成されたＣｓＣｌ2 溶液の１．２９
g ／cm3 濃度のところにＣＭＶが集まったので、これを
採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染作用抗原として用いた。
またＥＬＩＳＡ用の抗原は次のように調製された。ＡＤ
１６９を感染させたＨＥＬ細胞をＣＯ2 インキュベータ
ー中で培養し、細胞変性がすべての細胞に観察されるよ
うになった時点で、感染細胞を集めた。この感染細胞を
３分間超音波処理し、３，０００rpm で２０分間遠心
し、その上清を得た。これをＥＬＩＳＡ用抗原として用
いた。
７：１の割合で混ぜ、５日間ＣＯ2 インキュベーター中
で培養した。こうして得られた感染細胞を、０．１％Ｅ
ＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水ではがし、集めた。
次いで、４５秒間超音波破砕し、３，０００rpm で２０
分間遠心した上清を得た。これを６０％と２０％の重層
ショ糖溶液の上に乗せ、１０，０００×ｇで１時間遠心
した。６０％層と２０％層の間にウイルスは集まるの
で、これを採取し、再度超音波処理によってよく分散さ
せた。これを１．２８g ／cm3 のＣｓＣｌ2 溶液の上に
乗せて、１００，０００×ｇで４２時間遠心した。その
結果、密度勾配が形成されたＣｓＣｌ2 溶液の１．２９
g ／cm3 濃度のところにＣＭＶが集まったので、これを
採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染作用抗原として用いた。
またＥＬＩＳＡ用の抗原は次のように調製された。ＡＤ
１６９を感染させたＨＥＬ細胞をＣＯ2 インキュベータ
ー中で培養し、細胞変性がすべての細胞に観察されるよ
うになった時点で、感染細胞を集めた。この感染細胞を
３分間超音波処理し、３，０００rpm で２０分間遠心
し、その上清を得た。これをＥＬＩＳＡ用抗原として用
いた。
【００１７】（２）ＣＭＶによるリンパ球感作 ヒトの脾臓リンパ球を培養液Ａ（ＲＰＭＩ１６４０＋２
０％胎児牛血清＋２０mM ＨＥＰＥＳ＋２mMグルタミン
＋１mM Ｎａピルビン酸＋０．０２mg／mlセリン＋８０
μg ／mlゲンタマイシン）に浮遊させた。細胞濃度は１
２×１０5 個／mlであった。この細胞浮遊液を１mlず
つ、培養プレート（２４穴）の１５穴に入れた。それら
を３穴ずつ５群に分け、第１群は無添加、第２群はＣＭ
Ｖ抗原１２ngタンパク／ml、第３群にはＢＣＧＦ０．１
ml、第５群には同量のＣＭＶとＢＣＧＦ、第５群にはＣ
ＭＶと２０μg ／mlのＰＷＭを添加した。この培養プレ
ートを３７℃、５％ＣＯ2 含有空気で６日間培養した。
０％胎児牛血清＋２０mM ＨＥＰＥＳ＋２mMグルタミン
＋１mM Ｎａピルビン酸＋０．０２mg／mlセリン＋８０
μg ／mlゲンタマイシン）に浮遊させた。細胞濃度は１
２×１０5 個／mlであった。この細胞浮遊液を１mlず
つ、培養プレート（２４穴）の１５穴に入れた。それら
を３穴ずつ５群に分け、第１群は無添加、第２群はＣＭ
Ｖ抗原１２ngタンパク／ml、第３群にはＢＣＧＦ０．１
ml、第５群には同量のＣＭＶとＢＣＧＦ、第５群にはＣ
ＭＶと２０μg ／mlのＰＷＭを添加した。この培養プレ
ートを３７℃、５％ＣＯ2 含有空気で６日間培養した。
【００１８】（３）マウス・ミエローマ細胞Ｐ３×６３
Ａｇ８Ｕ１株（Ｐ３ＵＩと略記する）前もってＰ３ＵＩ
を培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２
mMグルタミン＋８０μg ／mlゲンタマイシン）中で培養
しておいた。使用時の細胞濃度は６×１０5 個／mlであ
った。上記（２）の感作リンパ球（３穴を一緒にした）
５群とＰ３ＵＩを、それぞれ別々に無血清ＲＰＭＩ１６
４０で２回洗浄した。各群３穴のリンパ球と５×１０6
個のＰ３ＵＩとを試験管の中で一緒にした。１，５００
rpm で５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、
試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに
０．５mlのポリエチレングリコール液（ＲＰＭＩ１６４
０５．７５ml＋ポリエチレングリコール１，０００
３．５ml＋ジメチルスルホキサイド０．７５ml）（ＰＥ
Ｇ液と略記する）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させ
た。１分後に０．５mlＲＰＭＩ１６４０を加え、さらに
１分後に１mlＲＰＭＩ１６４０、さらに２分後に４mlの
ＨＡＴ培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋２０％胎児牛血清＋
８０μg ／mlゲンタマイシン＋９５μM ヒポキサンチン
＋０．４μM アミノプテリン＋１．６μM チミジン）、
さらに２分後には４mlのＨＡＴ培養液を加えた。最後
に、ＨＡＴ培養液で２５ml細胞浮遊液とした。これを培
養プレート（９６穴）１枚に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ
2 含有空気中で培養した。１週間毎に半量の培養液を新
しいＨＴ培養液（ＨＡＴからＡを除去したもの）で交換
していきハイブリドーマを得た。
Ａｇ８Ｕ１株（Ｐ３ＵＩと略記する）前もってＰ３ＵＩ
を培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２
mMグルタミン＋８０μg ／mlゲンタマイシン）中で培養
しておいた。使用時の細胞濃度は６×１０5 個／mlであ
った。上記（２）の感作リンパ球（３穴を一緒にした）
５群とＰ３ＵＩを、それぞれ別々に無血清ＲＰＭＩ１６
４０で２回洗浄した。各群３穴のリンパ球と５×１０6
個のＰ３ＵＩとを試験管の中で一緒にした。１，５００
rpm で５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、
試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに
０．５mlのポリエチレングリコール液（ＲＰＭＩ１６４
０５．７５ml＋ポリエチレングリコール１，０００
３．５ml＋ジメチルスルホキサイド０．７５ml）（ＰＥ
Ｇ液と略記する）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させ
た。１分後に０．５mlＲＰＭＩ１６４０を加え、さらに
１分後に１mlＲＰＭＩ１６４０、さらに２分後に４mlの
ＨＡＴ培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋２０％胎児牛血清＋
８０μg ／mlゲンタマイシン＋９５μM ヒポキサンチン
＋０．４μM アミノプテリン＋１．６μM チミジン）、
さらに２分後には４mlのＨＡＴ培養液を加えた。最後
に、ＨＡＴ培養液で２５ml細胞浮遊液とした。これを培
養プレート（９６穴）１枚に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ
2 含有空気中で培養した。１週間毎に半量の培養液を新
しいＨＴ培養液（ＨＡＴからＡを除去したもの）で交換
していきハイブリドーマを得た。
【００１９】（４）ヒトＩｇＧと抗ＣＭＶ抗体の測定 ＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＩｇＧを測定するた
めにヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１０μg ／ml）を、あるい
は抗ＣＭＶ抗体を測定するためにＣＭＶ（ＡＤ１６９
株）２μg タンパク／mlを５０μl ／穴ずつそれぞれフ
ァルコン・ミクロテストIII の９６穴プレートに固定し
た。このプレートにハイブリドーマ培養上清６０μl を
加えて、室温で１時間放置した。１％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含有するハンクス塩類緩衝液（ＨＢＳＳ−
Ｂ）で３回洗浄の後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体−アルカリ
フォスファターゼ（２，０００倍希釈液）を６０μl 加
えて、室温で１時間反応させた。さらにＨＢＳＳ−Ｂで
３回洗浄したのち、Ｐ−ニトロフェニルフォスフェート
を１M ジエタノールアミン＋１mM ＭｇＣｌ2 のｐＨ
９．８溶液に０．６mg／mlの割合で溶かした溶液１００
μl を加えた。３０分から６０分後に４０５nmの吸光度
を測定し、標準ＩｇＧ液あるいは標準ＣＭＶ陽性血清と
の比較から、その値を算出した。
めにヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１０μg ／ml）を、あるい
は抗ＣＭＶ抗体を測定するためにＣＭＶ（ＡＤ１６９
株）２μg タンパク／mlを５０μl ／穴ずつそれぞれフ
ァルコン・ミクロテストIII の９６穴プレートに固定し
た。このプレートにハイブリドーマ培養上清６０μl を
加えて、室温で１時間放置した。１％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含有するハンクス塩類緩衝液（ＨＢＳＳ−
Ｂ）で３回洗浄の後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体−アルカリ
フォスファターゼ（２，０００倍希釈液）を６０μl 加
えて、室温で１時間反応させた。さらにＨＢＳＳ−Ｂで
３回洗浄したのち、Ｐ−ニトロフェニルフォスフェート
を１M ジエタノールアミン＋１mM ＭｇＣｌ2 のｐＨ
９．８溶液に０．６mg／mlの割合で溶かした溶液１００
μl を加えた。３０分から６０分後に４０５nmの吸光度
を測定し、標準ＩｇＧ液あるいは標準ＣＭＶ陽性血清と
の比較から、その値を算出した。
【００２０】全群とも９６穴プレート１枚に細胞を蒔
き、９６穴中の、ハイブリドーマが成育してきた穴の数
（肉眼で判定）、さらにそのうちヒトＩｇＧを産生して
いるハイブリドーマをもつ穴の数、そして抗ＣＭＶ抗体
を産生している穴の数を表１に示した。ＣＭＶとＢＣＧ
Ｆを加えたときに最も多くの抗ＣＭＶ抗体産生ハイブリ
ドーマが成育した。
き、９６穴中の、ハイブリドーマが成育してきた穴の数
（肉眼で判定）、さらにそのうちヒトＩｇＧを産生して
いるハイブリドーマをもつ穴の数、そして抗ＣＭＶ抗体
を産生している穴の数を表１に示した。ＣＭＶとＢＣＧ
Ｆを加えたときに最も多くの抗ＣＭＶ抗体産生ハイブリ
ドーマが成育した。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例２ ヒト脾臓リンパ球を、実施例１の（２）の如くＣＭＶあ
るいはＰＷＭで感作し、実施例１の（３）の如くＰ３Ｕ
Ｉと細胞融合を行った。得られたハイブリドーマのう
ち、ＣＭＶに対するＭＣＡを産生しているハイブリドー
マを以下の如くクローニングした。 （１）ハイブリドーマのクローニング クローニングは限定希釈法を用いた。抗ＣＭＶ抗体陽性
の穴より細胞を取り出し、細胞数を数え培養液Ｂを用い
１個／穴あるいは１０個／穴で細胞を蒔いた。２週間後
に細胞が充分増殖したので、その上清に抗ＣＭＶ・ＭＣ
Ａがあるか否かをＥＬＩＳＡによって測定し、抗ＣＭＶ
・ＭＣＡ産生ハイブリドーマを選別した。
るいはＰＷＭで感作し、実施例１の（３）の如くＰ３Ｕ
Ｉと細胞融合を行った。得られたハイブリドーマのう
ち、ＣＭＶに対するＭＣＡを産生しているハイブリドー
マを以下の如くクローニングした。 （１）ハイブリドーマのクローニング クローニングは限定希釈法を用いた。抗ＣＭＶ抗体陽性
の穴より細胞を取り出し、細胞数を数え培養液Ｂを用い
１個／穴あるいは１０個／穴で細胞を蒔いた。２週間後
に細胞が充分増殖したので、その上清に抗ＣＭＶ・ＭＣ
Ａがあるか否かをＥＬＩＳＡによって測定し、抗ＣＭＶ
・ＭＣＡ産生ハイブリドーマを選別した。
【００２３】こうして、ハイブリドーマＣ１、Ｃ３、Ｃ
４、Ｃ７、Ｃ２３およびＣ４１が樹立された。これらの
ハイブリドーマは安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶ・ヒトＭＣ
Ａを産生し続けている。ハイブリドーマＣ４１は、アメ
リカン タイプ カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）
に１９８６年９月２９日に寄託され、寄託番号はＨＢ９
２１５である。
４、Ｃ７、Ｃ２３およびＣ４１が樹立された。これらの
ハイブリドーマは安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶ・ヒトＭＣ
Ａを産生し続けている。ハイブリドーマＣ４１は、アメ
リカン タイプ カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）
に１９８６年９月２９日に寄託され、寄託番号はＨＢ９
２１５である。
【００２４】（２）抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡの調製 得られたハイブリドーマの一つＣ４１を無血清培地ＩＴ
ＥＳ（ＲＰＭＩ１６４０ ２容＋ダルベッコＭＥＭ１容
＋Ｆ１２ １容＋インシュリン８．５μg ／ml＋トラン
スフェリン２μg ／ml＋エタノールアミン２０μM ＋セ
レナイト２．５×１０-8M ）中で培養した。その培養上
清を限外濾過（アミコンＰ３０）で濃縮し、０．０２M
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）に対して透析した。同
緩衝液で平衡化したＤＥ５２カラム（ファルマシア社
製）にかけ、未吸着分画にヒトＭＣＡを回収した。ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（so
diumdodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electropho
resis,SDS-PAGE ）で分析した結果、Ｈ鎖とＬ鎖からな
る精製ＭＣＡ標品であることが確認された。
ＥＳ（ＲＰＭＩ１６４０ ２容＋ダルベッコＭＥＭ１容
＋Ｆ１２ １容＋インシュリン８．５μg ／ml＋トラン
スフェリン２μg ／ml＋エタノールアミン２０μM ＋セ
レナイト２．５×１０-8M ）中で培養した。その培養上
清を限外濾過（アミコンＰ３０）で濃縮し、０．０２M
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）に対して透析した。同
緩衝液で平衡化したＤＥ５２カラム（ファルマシア社
製）にかけ、未吸着分画にヒトＭＣＡを回収した。ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（so
diumdodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electropho
resis,SDS-PAGE ）で分析した結果、Ｈ鎖とＬ鎖からな
る精製ＭＣＡ標品であることが確認された。
【００２５】実施例３ （１）抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡの感染細胞に対する反応性 ＣＭＶのＡＤ１６９株あるいはＨｉ−１株を感染させた
ＨＥＬ細胞および感染させていない細胞に、抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡであるＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ２３、Ｃ
４１を反応させた。さらにフルオレッセンイソチオシア
ネイト（fluorescein isothiocyanate,FITC ）標識抗ヒ
トＩｇＧ抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。その
結果、いずれのＭＣＡも非感染細胞には反応せず、感染
細胞のみに反応した。またＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７はＡ
Ｄ１６９あるいはＨｉ−１感染細胞の細胞質内ＣＭＶ抗
原に反応して、細胞膜上のＣＭＶ抗原には反応しなかっ
た。他方、Ｃ２３とＣ４１は細胞質内抗原と細胞膜上抗
原の両方に反応した。
ＨＥＬ細胞および感染させていない細胞に、抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡであるＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ２３、Ｃ
４１を反応させた。さらにフルオレッセンイソチオシア
ネイト（fluorescein isothiocyanate,FITC ）標識抗ヒ
トＩｇＧ抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。その
結果、いずれのＭＣＡも非感染細胞には反応せず、感染
細胞のみに反応した。またＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７はＡ
Ｄ１６９あるいはＨｉ−１感染細胞の細胞質内ＣＭＶ抗
原に反応して、細胞膜上のＣＭＶ抗原には反応しなかっ
た。他方、Ｃ２３とＣ４１は細胞質内抗原と細胞膜上抗
原の両方に反応した。
【００２６】（２）抗ＣＭＶ・ＭＣＡの可溶化ウイルス
抗原に対する反応性 抗ＣＭＶ・ＭＣＡのヘルペス属ウイルスに対する結合性
を調べるため、ＨＳＶ―１型２株、ＨＳＶ―２型２株、
ＶＺＶ２株、ＣＭＶ６株、ＥＢＶ１株を各々感染させた
ＨＥＬ細胞および非感染ＨＥＬ細胞から、実施例１の
（１）の如く可溶化抗原を調製し、実施例１の（４）の
如くＥＬＩＳＡを実施した。その結果を表２に示す。抗
ＣＭＶ・ＭＣＡ（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ２３、Ｃ
４１）はすべてＣＭＶにのみ結合し、他のヘルペス属ウ
イルス、宿主細胞には結合しなかった。またＣ４１を除
く抗ＣＭＶ・ＭＣＡはＣＭＶ６株すべてに結合した。な
お、Ｈ１は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対するヒ
トＭＣＡである。
抗原に対する反応性 抗ＣＭＶ・ＭＣＡのヘルペス属ウイルスに対する結合性
を調べるため、ＨＳＶ―１型２株、ＨＳＶ―２型２株、
ＶＺＶ２株、ＣＭＶ６株、ＥＢＶ１株を各々感染させた
ＨＥＬ細胞および非感染ＨＥＬ細胞から、実施例１の
（１）の如く可溶化抗原を調製し、実施例１の（４）の
如くＥＬＩＳＡを実施した。その結果を表２に示す。抗
ＣＭＶ・ＭＣＡ（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ２３、Ｃ
４１）はすべてＣＭＶにのみ結合し、他のヘルペス属ウ
イルス、宿主細胞には結合しなかった。またＣ４１を除
く抗ＣＭＶ・ＭＣＡはＣＭＶ６株すべてに結合した。な
お、Ｈ１は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対するヒ
トＭＣＡである。
【００２７】
【表２】 ＊）値は４０５nmの吸収を示す。＊＊）０．１未満であ
る。
る。
【００２８】実施例４ 抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡのウイルス中和活性 ヒトＭＣＡ溶液２００μl 、２００ＣＨ５０／mlの新鮮
モルモット血清を５倍希釈した溶液１００μl およびＣ
ＭＶ（ＡＤ１６９株）７３７Pfu （plaque-forming uni
ts）を含む溶液１００μl を混合し、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。この混合液１００μl を６穴プレー
トに培養したＨＥＬ細胞にかけ、３７℃で１時間インキ
ュベートしたのち、０．５％（Ｗ／Ｖ）アガロースおよ
び５％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを含むＭＥＭ培地を加えて、Ｃ
Ｏ2 インキュベーター内で１１日間培養した。この単層
細胞を１０％ホルマリン水溶液で固定し、０．３％メチ
レンブルー水溶液によって染色したのち、ＣＭＶ感染に
よるプラーク数（pfu)を計測した。中和活性は次のよう
に表した。 （MCA を入れない対象のpfu ）−（MCA を入れたときのpfu ） ─────────────────────────────×１００ （MCA を入れない対象のpfu ） （％）
モルモット血清を５倍希釈した溶液１００μl およびＣ
ＭＶ（ＡＤ１６９株）７３７Pfu （plaque-forming uni
ts）を含む溶液１００μl を混合し、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。この混合液１００μl を６穴プレー
トに培養したＨＥＬ細胞にかけ、３７℃で１時間インキ
ュベートしたのち、０．５％（Ｗ／Ｖ）アガロースおよ
び５％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを含むＭＥＭ培地を加えて、Ｃ
Ｏ2 インキュベーター内で１１日間培養した。この単層
細胞を１０％ホルマリン水溶液で固定し、０．３％メチ
レンブルー水溶液によって染色したのち、ＣＭＶ感染に
よるプラーク数（pfu)を計測した。中和活性は次のよう
に表した。 （MCA を入れない対象のpfu ）−（MCA を入れたときのpfu ） ─────────────────────────────×１００ （MCA を入れない対象のpfu ） （％）
【００２９】結果を図１に示す。Ｃ２３は０．７５μg
／mlで、Ｃ４１は０．１８μg ／mlで５０％中和を示し
た。しかしながらＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７は全く中和活
性を示さなかった。またＨｉ−１株を用いたときも、Ｃ
２３は３．３μg で１００％中和、Ｃ４１は０．９５μ
g ／mlで１００％中和を示したのに対し、Ｃ３は１７．
７μg ／mlで３５％の中和しか示さなかった。また、実
施例３−（２）に掲げたＡＤ１６９株以外のＣＭＶ株５
株について中和活性を調べたところ、Ｃ２３は１０μg
／mlで９５％以上の中和を全株について示した。一方Ｃ
４１は実施例３−（２）の表２に示したＥＬＩＳＡのデ
ータと同様に、１０μg ／mlではＮｏ．１２株とＹＡＮ
−３株については、各々２０％、６４％のやや弱い中和
活性を示し、他の株については８０％以上の中和活性を
示した。
／mlで、Ｃ４１は０．１８μg ／mlで５０％中和を示し
た。しかしながらＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７は全く中和活
性を示さなかった。またＨｉ−１株を用いたときも、Ｃ
２３は３．３μg で１００％中和、Ｃ４１は０．９５μ
g ／mlで１００％中和を示したのに対し、Ｃ３は１７．
７μg ／mlで３５％の中和しか示さなかった。また、実
施例３−（２）に掲げたＡＤ１６９株以外のＣＭＶ株５
株について中和活性を調べたところ、Ｃ２３は１０μg
／mlで９５％以上の中和を全株について示した。一方Ｃ
４１は実施例３−（２）の表２に示したＥＬＩＳＡのデ
ータと同様に、１０μg ／mlではＮｏ．１２株とＹＡＮ
−３株については、各々２０％、６４％のやや弱い中和
活性を示し、他の株については８０％以上の中和活性を
示した。
【００３０】実施例５ 抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡの免疫沈降分析 ヒトＭＣＡが反応するウイルス粒子の構成成分が、何で
あるか決めるために、免疫沈降分析を行った。ＨＥＬ細
胞にＣＭＶ（ＡＤ１６９株）を感染させて、３５Ｓ−メ
チオニンでアイソトープ標識を行った。標識した細胞
を、０．０１M Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋０．１５M ＮａＣｌ
＋１％デオキシコール酸ナトリウム＋１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ１００＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
＋１mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐＨ
７．４）（溶解液）によって溶解した。これに抗ＣＭＶ
・ヒトＭＣＡを加えて、抗原・抗体複合物を形成させて
おき、さらにプロテインＡ―セファロース４Ｂによって
複合体を吸着精製した。これを、０．１２５M Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ＋１％ＳＤＳ＋３％２−メルカプトエタノール
＋１５％グリセリン（ｐＨ８．２）で３分間１００℃処
理し、その上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけた。泳動後ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに
−７０℃でさらした。その結果を図２に示す。Ｃ１は約
６４，０００と約５０，０００に、Ｃ３は約６４，００
０と約４６，０００に、Ｃ４とＣ７は約６４，０００
に、Ｃ２３とＣ４１は約１３０，０００と約５５，００
０の分子量をもつウイルス抗原に反応することがわかっ
た。
あるか決めるために、免疫沈降分析を行った。ＨＥＬ細
胞にＣＭＶ（ＡＤ１６９株）を感染させて、３５Ｓ−メ
チオニンでアイソトープ標識を行った。標識した細胞
を、０．０１M Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋０．１５M ＮａＣｌ
＋１％デオキシコール酸ナトリウム＋１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ１００＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
＋１mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐＨ
７．４）（溶解液）によって溶解した。これに抗ＣＭＶ
・ヒトＭＣＡを加えて、抗原・抗体複合物を形成させて
おき、さらにプロテインＡ―セファロース４Ｂによって
複合体を吸着精製した。これを、０．１２５M Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ＋１％ＳＤＳ＋３％２−メルカプトエタノール
＋１５％グリセリン（ｐＨ８．２）で３分間１００℃処
理し、その上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけた。泳動後ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに
−７０℃でさらした。その結果を図２に示す。Ｃ１は約
６４，０００と約５０，０００に、Ｃ３は約６４，００
０と約４６，０００に、Ｃ４とＣ７は約６４，０００
に、Ｃ２３とＣ４１は約１３０，０００と約５５，００
０の分子量をもつウイルス抗原に反応することがわかっ
た。
【００３１】実施例６ 抗ＣＭＶ・ＭＣＡのアイソタイプの同定 ヒトＭＣＡのアイソタイプの同定は以下の如く行った。
Ｈ鎖の同定は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、Ｉ
ｇＧ４に対するウサギ抗血清を用いた免疫拡散法（オク
タロニー法）を用い、Ｌ鎖の同定は、ＡＤ１６９感染細
胞を抗原プレートとし、２次抗体にアルカリフォスファ
ターゼ標識したヤギ抗ヒトＫ鎖ないしはλ鎖を用いたＥ
ＬＩＳＡを行った。結果を表３および表４に示す。
Ｈ鎖の同定は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、Ｉ
ｇＧ４に対するウサギ抗血清を用いた免疫拡散法（オク
タロニー法）を用い、Ｌ鎖の同定は、ＡＤ１６９感染細
胞を抗原プレートとし、２次抗体にアルカリフォスファ
ターゼ標識したヤギ抗ヒトＫ鎖ないしはλ鎖を用いたＥ
ＬＩＳＡを行った。結果を表３および表４に示す。
【表３】
【表４】
【００３２】
【発明の効果】本発明のハイブリドーマは、ＣＭＶ感染
の診断薬として、またＣＭＶ感染症の予防および治療薬
として利用できる抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを産生すること
ができる。
の診断薬として、またＣＭＶ感染症の予防および治療薬
として利用できる抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを産生すること
ができる。
【図１】本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡの、ＣＭＶに対する中和活性を示す図であ
る。
ヒトＭＣＡの、ＣＭＶに対する中和活性を示す図であ
る。
【図２】本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡの免疫沈降分析の結果を示す図である。
ヒトＭＣＡの免疫沈降分析の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (56)参考文献 特開 平５−260961（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−128323（ＪＰ，Ａ) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯ ＧＹ，55〜２！（1985．８）Ｐ．274− 280
Claims (9)
- 【請求項１】 ヒトリンパ球と、ヒトミエローマまたは
マウスミエローマ細胞との細胞融合によって得られる、
分子量約１３０，０００と約５５，０００のサイトメガ
ロウイルス抗原蛋白を認識し、サイトメガロウイルスを
中和するヒト・モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ。 - 【請求項２】 ヒトリンパ球とマウスミエローマ細胞と
の細胞融合によって得られる請求項１に記載のハイブリ
ドーマ。 - 【請求項３】 ヒトリンパ球が脾臓、リンパ節、末梢
血、骨髄、扁桃、またはアデノイド由来のものである請
求項１または２に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項４】 ヒトリンパ球が、細胞融合に先だってｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでマイトージェン存在下に、ＣＭＶまた
はＣＭＶ由来の蛋白もしくは糖蛋白で感作したものであ
る請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリドーマ。 - 【請求項５】 マイトージェンが、ポークウィードマイ
トージェンである請求項４に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 マウスミエローマがＢＡＬＢ／Ｃマウス
由来のものである請求項１〜５のいずれかに記載のハイ
ブリドーマ。 - 【請求項７】 マウスミエローマがＰ３Ｘ６３・Ａｇ８
・Ｕ１株である請求項１〜６のいずれかに記載のハイブ
リドーマ。 - 【請求項８】 細胞融合がポリエチレングリコール溶液
を用いてなされたものである請求項１〜７のいずれかに
記載のハイブリドーマ。 - 【請求項９】 ヒトモノクローナル抗体のサブクラスが
ＩｇＧ１である請求項１〜８のいずれかに記載のハイブ
リドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3036610A JP2535455B2 (ja) | 1991-02-07 | 1991-02-07 | サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3036610A JP2535455B2 (ja) | 1991-02-07 | 1991-02-07 | サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61506233 Division |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6154763A Division JP2538537B2 (ja) | 1994-07-06 | 1994-07-06 | サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体 |
| JP6154762A Division JP2538536B2 (ja) | 1994-07-06 | 1994-07-06 | サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211364A JPH04211364A (ja) | 1992-08-03 |
| JP2535455B2 true JP2535455B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=12474573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3036610A Expired - Lifetime JP2535455B2 (ja) | 1991-02-07 | 1991-02-07 | サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2535455B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9346874B2 (en) | 2009-12-23 | 2016-05-24 | 4-Antibody Ag | Binding members for human cytomegalovirus |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH652145A5 (de) * | 1982-01-22 | 1985-10-31 | Sandoz Ag | Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. |
| JPH04153035A (ja) * | 1990-10-18 | 1992-05-26 | Dainippon Printing Co Ltd | ソフトコート転写シート |
-
1991
- 1991-02-07 JP JP3036610A patent/JP2535455B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＶＩＲＯＬＯＧＹ，５５〜２！（１９８５．８）Ｐ．２７４−２８０ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9346874B2 (en) | 2009-12-23 | 2016-05-24 | 4-Antibody Ag | Binding members for human cytomegalovirus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04211364A (ja) | 1992-08-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |