JPH02504551A - サイトメガロウイルスの糖タンパク質ａと反応性のモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サイトメガロウィルスの糖タンパク質Ａと反応性のモノクローナル抗体 発明の背景 ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）感染症は一般に通常の人にとっては無症 候性であって自己限定的である。しかしながら、この感染症は尿路に感染すると 深刻な感染症を引き起こし、重篤な神経学的障害および／または欠損に至る症例 が多い。しかも、ＨＣＭＶは免疫抑制患者および免疫欠損疾患を有する患者が最 もかかり易い疾患の１つであり、最も一般的な死亡原因の１つである。

ＨＣＭＶはヘルペスウィルスの１員であって核酸とタンパク質の外側を糖タンパ ク質と糖脂質とで構成された膜エンベロープが包囲している。我々の研究室およ び他の研究室で抗原性が明らかに特性化されたエンベロープ糖タンパク質の内規 つかは、高分子量の複合体（コンプレックス）内に、ジスルフィド結合で会合（ アソシエート）していた。発明の名称“ヒトサイトメガロウィルスの免疫原性グ リコペプチド”の下での米国特許出願第９３３，７８９（１９８６年１１月２４ 日出願）では、抗原的に関連した分子ｊ１９３．　ＯＯＯダルトンおよび５０． ０００−５２．０００ダルトンのグリコペプチドが単離および特性化された。こ れらの糖タンパク質は分子量≧４５０゜０００ダルトンおよび１３０．０００− １８０，０００ダルトンの１組の糖タンパク質複合体を還元して得られた。また 、これらの個々の糖タンパク質、並びに抗原的に関連する糖タンパク質複合体は 、上記特許出願で明らかにされた２つの原型（プロトタイプ）ネズミモノクロー ナル抗体（＋＋＋ｃＡｂ）４１　Ｃ２および９Ｂ７によって免疫的に沈降された 。また、ｍｃＡｂ９　Ｂ　７は補体の存在下、インビトロでＨＣＭＶに対して中 和活性を示した。ＨＣＭＶ感染症から回復した患者の血清にもこれらＨＣＭＶ糖 タンパク質類を免疫沈降させる抗体が存在しており、これら糖タンパク質に反応 性を有する抗体がインビボでウィルスの中和に関与していることが示唆された。

従って、ＨＣＭＶ感染症の診断および治療に臨床上有用な、ＨＣＭＶ特異的ｍｃ Ａｂが必要とされる。さらに、臨床標本中のＨＣＭＶの直接的な検出、並びに組 織培養中のウィルスの迅速な同定のいずれにも有用なｌｌ１ｃＡｂが必要とされ ている。そのような抗体はウィルス抗原の捕獲および濃縮、または既知の様々な イムノア、セイ法によるウィルスの免疫学的検出のいずれにも有用である。最近 、器官移植または骨髄移植に先立って高度免疫グロブリンを免疫抑制患者に投与 すると、移植後の致命的なＩ（ＣＭＶ感染症が減少、または阻止され得るという ことを示唆する症例がある。しかしながら、健康な免疫抑制患者または既にＨＣ ＭＶによる疾患に罹病している患者の双方におけるＨＣＭＶ感染を予防、軽減お よび治癒するための、進歩した治療法が常に必要とされている。

発明の詳細な説明 本発明は、全Ｔ　ｏｖｎｅＨＣＭ　Ｖピリオンおよび／またはＴ　Ｏ＊ｎｅ株Ｈ ＣＭＶのエンベロープ糖タンパク質の界面活性割注抽出物でマウスを免疫するこ とにより生成される、１３種の関連した（近縁）ネズミｍｃＡｂを提供するもの である。次いで免疫マウスの肺臓細胞をネズミ骨髄腫細胞系統と融合して抗体産 生性のネズミＢ−細胞ハイブリドーマを得る。これらのネズミハイブリドーマに よって産生される抗体は分子量１３０，０００．９３．０００．および５０，０ ００−５２．０００ダルトンの糖タンパク質を免疫沈降させる。これらの糖タン パク質は１またはそれ以上のウィルスエンベロープの高分子量筒タンパク質複合 体と会合している。これらの糖タンパク質複合体はグレッチら［Ｄ、Ｒ，Ｇｒｅ ｔｃｈ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６２．８７５（１９８８）コによってｇｃＩファミ リーと称された。例えば、特許出願第９３３、７８９で開示された１３０ｋＤの 糖タンパク質複合体を本明細書中ではヒトサイトメガロウィルス糖タンパク質Ａ （ＨＣＭＶＧＣＡ）と称する。

様々なａｃＡｂによって認識される抗原部位相互の関係を研究するするために競 合的酵素−結合イムノン−ペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。驚Ｘべきこ とに、第２抗体が同時に存在する場合、抗体とウィルスとの結合が阻害されるか 増大されるという観察結果を得た。ｍｃＡｂはＨＣＭＶＧＣＡの３ドメインの別 々の抗原部位を認識する少なくとも７群に帰属された。

補体存在下でのこれらｍｃＡｂＯＴ　ｏｖｎｅ株ＨＣＭＶに対する中和活性をプ ラーク還元法で試験した。これら５ｃＡｂのあるもの（即ち９Ｂ７）は高度に中 和した（２μ９／ｘ（ｌで５０％プラーク還元）が、他のｍｃＡｂ（即ち４１Ｃ ２）は補体存在下で中和しないようであった。

ＥＬＩＳＡｙ、ｙセイにおける中和活性ｍｃＡｂの結合は第２の非中和性抗体の 存在下で２ないし４倍に増大した。しかも、中和性及び非中和性抗体を組み合わ せた中和活性は、中和性抗体単独の場合と比較して２０倍という予想外の増大で あった。２個の非中和性抗体の組み合わせによっても、時には有意な中和活性が 得られ、そのような混合物も本発明の範囲に包含される。

従って、本発明は、 ａ、ＨＣＭＶピリオンまたはＨＣＭＶＧＣＡから導かれた、分子量約１３０，０ ００，９３．０００または５０，０００−５３．０００ｆ　ル）　７　ｔＤｆｆ ４　製ＨＣＭ　Ｖエンベロープ糖ペプチドを含有する組成物でマウスを免疫し、 ｂ４　該マウスの肺臓細胞とネズミ骨髄腫細胞系統と融合させてノ１イブリドー マを生成させ、 Ｃ０分子量約１３０．０００．９３．０００または５０．０００−５３．０００ ダルトンのＨＣＭＶＧＣＡ糖タンパク質とは反応するが単純ヘルペス、アデノウ ィルス、または水ＦＭ　帯状ヘルペスウィルスとは反応しないｍｃＡｂを産生す るハイブリドーマを選択し、クローニング的に増幅することからなる方法で産生 される、ＨＣＭＶ特異的ネズミｍｃＡｂの生産を目的とするものである。

本発明のｓ＋ｃＡｂは、それらの特異性、結合親和性、および補体存在下での、 単独、または上記ステップ（ｃ）のハイブリドーマから得られる本発明の他のネ ズミｍｃＡｂと組み合わせての、ＨＣＭＶ中和能力により特性化された。

本発明はまた、）ＩＣＭＶに感染した生理学的物質から得た試料中のＨＣＭＶを 検出する効果的な方法を提供するものである。この方法は、 ａ、該生理学的物質と、ＨＣＭＶＧＰＡの第１エピトープと結合する第１モノク ローナル抗体とを反応させて該ＨＣＭＶＧＰＡと該第１モノクローナル抗体との 複合体を形成させ、ｂ、該複合体と、ＨＣＭＶＧＰＡの第２エピトープに対する 第２モノクローナル抗体であって、第１モノクローナル抗体と第１エピトープと の結合を促進し、検出可能なラベルを有するか該ラベルとの結合部位を有してい る第２モノクローナル抗体とを反応させて３重複合体を形成し、 Ｃ０該ラベルの存在を検出するか、または該結合部位と検出可能なラベルとを反 応させた後、検出に付すことからなる。該ラベルの濃度から該生理学的物質中に 存在するＨＣＭＶＧＰＡの濃度を測定することができる。

好ましくは、検出可能なラベルは放射性同位元素または第２抗体と化学的に結合 した酵素である。該ラベルのための結合部位はピオチンやデフェロ牛サミン等の 遊離酵素または放射性同位元素と結合し得る分子によって提供されることが好ま しい。これらの分子は当業者既知の方法でｍｃＡｂに化学的に結合することがで きる。例えば、米国特許出願第４，６８０．３３８参照。酵素は結合部位と強力 に結合する基質と結合していることが好ましく、例えば、アビジン−酵素抱合体 はビオチンと結合する。ステップ（ａ）および（ｂ）は、第１および第２Ｉｌｃ Ａｂの添加を同時に、または添加順序を逆にして行ってもよい。

従って、本発明は、ＨＣＭＶに感染した生理学的物質から得た試料中のＨＣＭＶ を検出する方法であって、ａ、該生理学的物質と、ＨＣＭＶＧＰＡの第１エピト ープに対する第１モノクローナル抗体であって、検出可能なラベルまたは該ラベ ルのための結合部位を含有する第１モノクローナル抗体とを反応させてＨＣＭＶ ＧＰＡと該第１モノクローナル抗体との複合体を形成させ、 ｂ、該複合体と、ＨＣＭＶＧＰＡの第２エピトープと結合する第２モノクローナ ル抗体であって、第１モノクローナル抗体と第１エピトープとの結合を促進する 第２モノクローナル抗体とを反応させて３重複合体を形成し、 Ｃ９該ラベルの存在を検出するか、または該結合部位と検出可能なラベルとを結 合させた後、該検出に付すことからなる方法を提供するものである。該ラベルの 濃度から該生理学的物質中に存在するＨＣＭＶＧＰＡの濃度を測定することがで きる。

高力価のＨＣＭＶＧＣＡに対するモノクローナル抗体を含有する組成物の、イン ビトロでのＨＣＭＶ感染中和能力はある種の原型ＨＣＭＶワクチンの効力の検定 の基礎を与えると共に、例えばウィルス遺伝子の発現産物に及ぼす突然変異効果 に関連させる等、ＨＣＭＶ感染機構の基礎的な検査に有用である。

本発明はまた、１またはそれ以上の本発明の抗体を含有する医薬単位投与製剤を ＨＣＭＶにさらされた患者に投与することにより血漿のＨＣＭＶ　Ｇ　Ｐ　Ａに 対する免疫原性を惹起することを目的とするものである。本発明の抗体は感染し たおよび／または罹病した患者における疾患の臨床的な進行を遅延させることに よって生存予測性を延長する予防薬として、あるいはウィルスのビルレンス（溶 菌）を消滅し得る治療剤として、治療上の可能性を有すると考えられる。

本発明の抗体は化学的抗ウィルス剤に添加することもできる。

従って、本発明はまた、本質的に、 （ａ）ＨＣＭＶＧＰＡの第１エピトープと結合する第１モノクローナル抗体であ って、補体の存在下インビトロでＨＣＭＶｇ染性を中和する該第１モノクローナ ル抗体（例えば９Ｂ７）と、（ｂ）ＨＣＭＶＧＰＡの第２エピトープと結合し、 補体の存在下にＨＣＭＶ感染性を中和しない第２モノクローナル抗体との混合物 であって、その中和活性が第１モノクローナル抗体の中和活性よりも大きい混合 物で構成される組成物を提供するものである。

予想外に、これらのＨＣＭＶＧＣＡに特異的な第１および第２ｍＣＡｂ類の治療 上有用な作用を実質上、または完全に遮断する、ＨＣＭＶＧＣＡに特異的なモノ クローナル抗体も単離し、特性化された。

従って、本発明の）（ＣＭＶＧＣＡ中和組成物はこれらの妨害性＋ｎｃＡｂを含 有しないように調製すること、即ち、組成物はＨＣＭＶＧＰＡの第３のエピトー プと結合する、補体の存在下または非存在下でＨＣＭＶ感染性を中和しない、そ して第１モノクローナル抗体と第２モノクローナル抗体との結合を阻害する、モ ノクローナル抗体を含有しないように調製することが極めて好ましい。そのよう なｍｃＡｂの具体例を以下に挙げる。

単離したｍｃＡｂは、生物活性の検定またはインビボに単位投与製剤として投与 する前に、水性■液等の薬学的に許容し得る液体担体で希釈することが好ましい ［レミングトン（Ｒｅ＋＊ｉｎｇｔｏｎ）、　　Ｐ　ｈａｒａａｃｅｕｔｉｃａ ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ａ、０ｓｏ１編、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、Ｃｏ、、　　 Ｅａｓｔｏｎ、　　ＰＡ（１６版、１９８０）、１４８８〜１４９６頁参照］。

得られた溶液を例えば滅菌ろ過により滅菌する。通常、マルトース、グリセリン またはチメロサール等のＩｇＧ製品を用いた保存剤を薬学上許容し得る量、加え るとよい。

得られた溶液を、静脈注入または注射によって非経口的に投与することが好まし い。ｍｃＡｂの投与量は免疫抑制患者またはＨＣＭＶ感染患者の体型および身体 条件によって左右される。そのような因子は必然的に経験的なものであり、医師 が既知のＨＣＭＶ病期基準によって決定することができる。ある臨床状況では、 感染した標的細胞からウィルス粒子が放出された際の感染性を中和するためにＩ ＩＣＡｂ組成物を複数回投与する必要があるかもしれない。

図面の簡単な説明 第１図は、還元されていない（ＵＲ）、または還元された（Ｒ）ＨＣＭＶＧＣＡ プロティンとＯＣＡ特異的モノクローナル抗体（ｉｃＡｂ）および回復期の血清 との反応により形成された免疫沈降像を示す図である。

第２図はＧＣＡ特異的ｍｃＡｂによって認識されるＨＣＭＶ糖タンパク質のウェ スタンプロットを示す図である。

第３図（パネルＡ）はＧＣＡ特異的ｍｃＡｂによって認識されるエピトープを図 示したものである。阻害をオーバーラツプした実線で、増加および増加の方向を 矢印で示した。ドメインＩ、■および■は右および左に示されている。パネルＢ はＨＣＭＶＧＣＡペプチドバックボーン上のエピトープの可能な配置を模式的に 示したものである。

第４図はＴ　Ｏｍｎｅ株ＨＣＭＶと抗体の組み合わせを用いて行ったプラーク還 元アッセイの結果を示すグラフである。

発明の詳細な説明 材料および方法 既述のごとく、ＨＣＭＶＴｏｖｎｅ株とＡＤ１６９株をｓＨ−グルコサミンと一 緒にヒト皮膚線維芽細胞培養上で培養し、収穫し、スクロースグラディエンドで 精製した［カリら（Ｋ　ａｒｉ）、　　Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏｌ、　　６０．３４ ５〜３５２（１９８６）コ。精製ウィルスをＴｒｉｓ−ＮａＣＱバッフｙ−（５ ０１１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２．１５０＋ａＭ　ＮａＣｆｆ５ｐＨ７，４）に 再懸濁し、Ｔｒｉｓ−ＮａＣ４２バッフｙ−（５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｇ、 　　１０ｍＭ　ＮａＣｌ２．２ｂＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、ｐＨ ７゜５）中１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０，Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅＩ ｌｌ、、　Ｃｏ、。

Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）で抽出した。［カリら（Ｋａｒｉ）、　　Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、　　６０＋３４５〜３５２（１９８６）］。感染しなかった皮膚線 維芽細胞を同様の方法で抽出し、負の対照として用いた。ＨＣＭＶＴｏｓｎｅＮ Ｐ−４０粗抽出物の還元およびアルキル化はカリ［Ｋ　ａｒｉ、　　Ｊ　、　Ｖ 　１ｒｏｌ。

６０．３４５〜３５２（１９８６）］の記載に従って行った。ウィルスの、また は対照線維芽細胞物質の界面活性剤抽出物をＥ　ｘｔｒａｃｔｉＧｅｌＤカラム に通し水で溶離して界面活性剤を除去した。

Ｂ、ＨＣＭＶに対するネズミモノクローナル抗体の生成ＨＣＭＶタンパク質に対 する園ｃＡｂを分泌するマウスハイブリドーマを既述のごとく調製した［カリら （Ｋａｒｉ）、　　ＪＪｉｒｏｌ、−影ρ。

３４５〜３５２（１９８６）］。本特許出願に記載の抗体にはＡＤＩ６９株また はＴｏｅｎｅ株の精製ＨＣＭＶピリオンのいずれかを用いる３種の融合実験が関 連している。Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを２．５または１０力月間免疫した。融合剤と してポリエチレングリコールを用い、免疫マウスの肺臓細胞とＳＰ−２−Ａｇ１ ４骨髄腫細胞（アメリカ組織培養コレクジコン）とを融合させた。

得られたハイブリドーマ細胞をエンザイムーリンクト・イムノアブソーベントア ッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＨＣＭＶに対する特異抗体の産生に関してスクリー ニングした（下記、セクションＧ参照）。

ＥＬＩＳＡアッセイに用いた抗原は精製ＨＣＭＶＴｏｗｎｅ株またはＡＤ１６９ 株の全ピリオンまたはＨＣＭＶ　ＴｏｖｎｅＮ　Ｐ　−４，０抽出物または非感 染皮膚線維芽細胞からのＮＰ−４０抽出物のいずれかである。ＩｇＧ用に、高速 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、増殖したクロー ンから腹水を精製した。［ジニアレツーサリナスら（Ｊｕａｒｅｚ−５ａｌｉｎ ａｓ）、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　’ｌ、　　ｌ　６４（１９８４ ）］。カラムから分取した画分の力価を、ＥＬＩＳＡアッセイによってＨＣＭＶ −比活性に関して測定した。画分のタンパク質含有量は精製マウスＩｇＧを標準 とし、Ｂ　１ｏｒａｄプロテインアツセイ（Ｂ　１ｏｒａｄ）によって測定した 。各操作において最高の力価を示す画分のみを以後の実験に用いた。ハイブリド ーマ４１Ｃ２および９Ｂ７は一貫して、腹水ｌｘＱにつきモノクローナル抗体５ −１０１９を産生じた。

各抗体を産生ずるハイブリドーマを２回サブクローニングしてｍｃＡｂのクロー ナリティー（クローン性）を確立した。さらに、各抗体はユニークなアイソタイ プを有しており（４１Ｃ２−ＩｇＧ１　；９Ｂ７１ｇＧ−２ｂ）、各々は等電点 電気泳動において別個の抗体と認めモノクローナル抗体は、免疫沈降前に還元や アルキル化に付されていない、−Ｈ−グルコサミン−標識ＨＣＭＶ　Ｔｏｖｎｅ Ｎ　Ｐ　−４０抽出タンパク質を免疫沈降させた。タンパク質をドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＤＳ）に溶解し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し た。ゲルのトリチウム標識糖タンパク質バンドをフルオログラフィーで同定した ［カリら（Ｋａｒｉ）、　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　　６０．　３４５〜３５２（１ ９８６）コ。

Ｄ、ウェスタンプロット ウェスタンプロットアッセイのために、精製ＨＣＭＶ　Ｔｏｗｎｅ株全ウィルス をＳＤＳで可溶化し、５−１５％グラディエンドポリアクリルアミドゲル電気泳 動で分離した。次いで、ゲル上のタンパク質をＢ　１ｏｒａｄ　トフランスプロ ット装置を用いてニトロセルロース上に電気的にプロットした。トリス緩衝化食 塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ　ＮａＣ１！、ＰＨ７，５）中 ３％ゼラチンでブロックした。

腹水中のｍｃＡｂを７８３９１％ゼラチンで１１５００に希釈し、室温で１夜、 ペーパーに結合させた。ペーパーをＰＢＳ−０，０５％Ｔｖｅｅｎ２０（ポリソ ルベート２０）で洗藻し、ＴＢＳ中１％セラチンで１／２０００倍希釈したアル カリホスファターゼ標識ヤギ抗−マウスＩ　ｇＧ（Ｋ　Ｐ　Ｌ）を加え、室温で １時間インキュベートした。ペーパーを再度洗浄し、Ｑ、１ＭＴｒｉｓバッファ ー（ＫＰＭ、）中の基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート ／ニトロブルーテトラゾリウムを加えた。抗原−抗体複合体と基質との反応の結 果、不溶性のパープル色の生成物が生成した。ペーパーを水に浸して反応を停止 した。

Ｅ、　　２抗体同時結合アッセイ ９６ウエルのマイクロタイター１ｍｍｕｌｏｎ　Ｉｆプレート中、１ウエル当た り０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９，５）中縁タンパク質２００ｎｇを４℃で １８時間インキニベートすることにより、ＨＣＭＶ抗原で９６ウエルのマイクロ タイター１ｍｍｕｌｏｎ　Ｉｆプレートをコート（被覆）した。次いで、ウェル をりん酸緩衝化食塩水と０．０５％Ｔ　５ｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回、蒸留 水で１回洗浄し、風乾した。これらのプレートを使用まで乾燥剤と一緒に保存し た。用いた抗原には精製ＨＣＭＶＴｏｗｎｅ株全ピリオン、ＨＣＭＶＴｏｗｎｅ 株で８−１２日間感染させた皮膚線維芽細胞から抽出したタンパク質であって、 還元されていないもの、および還元されたもの（Ａ欄、ウィルスの調製参照）、 または非感染皮膚線維芽細胞からのＮＰ−４０抽出タンパク質（Ａ欄、ウィルス の調製参照）が含まれる。

腹水中のｍｃＡｂをＨＰＬＣで精製し、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド エステルを用いてビオチニル化した。抗原で被覆したウェルに、ビオチニル化抗 体２５μｇ（固定量）とＰＢＳＴ２５μｇ。

または種々の量（５０μ９〜１０ｐｙ）の第２非標識ｍｃＡｂを含有する２５μ ｇを同時に加えて室温で９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回 洗浄し、ＰＢＳＴで１／２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプト アビジン（ＫＰＬ）を５０μＱ／ウエルで加え、得られた混合物を室温で９０分 間インキュベートした。

ＰＢＳＴで３回洗浄した後、基質Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびクエ ン酸バッファー中Ｈ＊　Ｏ−を加え、１５分後に２．５Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を加えて 反応を停止した。４９０ｎｍにおける生成物の光学密度（○、Ｄ、）をＤ　ｙｎ ａｔｅｃｈプレートリーダーで読み取った。１０倍希釈でビオチニル化抗体の力 価を測定した後、第２抗体の非存在下で０、Ｄ、が〉０．５、かつく１．５を与 える量を決定した。

非標識第２抗体をＨＣＭＶ全ウィルス抗原に対して力価測定し、活性であること が分かった。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス１ｇｃと基質ＯＰＤを加えるこ とにより結合量を定量した。アッセイは２回行い、以下の式を用いてデータを整 理した。

ＥＬＩＳＡアッセイでＴ　ｏｗｎｅ株ウィルスに陽性であった（上記セクション Ｂ）ＨＰＬＣ精製モノクローナル抗体の、プラーク還元アッセイ（カリら前掲） における同ウィルスに対する中和活性を試験した。

Ｔ　ｏｖｎｅ株ウィルス約１．０００−２．０ＯＯＰＦＵを、タンパク質含量１ ００μ９−０．００１１で２％モルモット補体（Ｐｅｌ　−Ｆ　ｒｅｅｚＢ　ｉ ｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　　Ｒｏｇｅｒｓ、　　Ａ　Ｋ　）と−緒に全量をダルベ ツコの改良イ−グ培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）中、０．０５μｇとして、−個の抗体 に加えた。

２個の抗体を用いる場合には、被検試料に第２抗体１０μ２を加えた。ウィルス の中和は下記式を用いてプラーク還元率（％）として表した。

２４ウエルプレートまたはシェルバイアル中の単層ヒト皮膚線維芽細胞にＨＣＭ Ｖ感染症と思われる患者から得た臨床試料（尿または唾液）を接種した。未接種 線維芽細胞を同様に処理して負の対照（ネガティブコントロール）とした。接種 の５日後に線維芽細胞単層から組織培養の培養液を吸引除去した。りん酸緩衝化 食塩水（ＰＢＳ）２００μＱを各ウェルに加え、完全に吸引除去した。各ウェル に５分間、可溶化ＰＢＳ−１％ＮＰ−４０（１００μｇ）を加えた。次いで、各 ウェルの底をピペットでかき落とし、繰り返しピペット処理して細胞を完全に再 懸濁した。この溶解した細胞の懸濁液を下記セクシ１ンＨにおける“患者試料” として用いた。

Ｈ１組織培養上清中のＨＣＭＶ検出のためのＥＬＩＳＡ検出９６ウエルのマイク ロタイタープレートのマイクロタイターウェルを捕獲（カブチャー）抗体として のＨＣＭＶ　ＧＣＡ特異的１ｃＡｂ４１Ｃ２（Ｉｖｌ−１１０１１９）でブＬ／ ：Ｉ−）した。各−ｊレ−）１：ｉｔ患者試料用のウェルの外に、ブランクウェ ル、非感染線維芽細胞用対照ウェル、ＨＣＭＶ正対照正対ルウエルれた。捕獲抗 体でコートした後、マイクロタイターウェルをバッフｙ　−（ＰＢＳ−０，０５ ％Ｔ　５ｅｅｎ）で１回洗浄した。試料溶液を各組織培養ウェル内でＰＢＳ−１ ％ＮＰ−４０に可溶化した後、個々のマイクロタイターウェルに分配した。各臨 床試料の測定には、ブランク、負の皮膚線維芽細胞および正の対照試料が含まれ ていた。次いで、ＧＣＡ上で４１Ｃ２が認識するエピトープと異なるエピトープ を認識する、０ＣＡ−特異的ビオチニル化ｍｃＡｂ　９Ｂ７（ＩＶＩ−１１０１ １７）５μ１２を、検出抗体として各ウェルに加えた。次いで、マイクロタイタ ープレートをプラスチックバッグの上に置き３７℃で１時間インキニベートした 。次いで、ウェルを洗浄バッファー（ＰＢＳ−０，０５％Ｔｖｅｅｎ）で４回洗 浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ１００μｇを加え、プレートをプ ラスチックバッグ中、３７℃で３０分間インキニベートした。次いで、ウェルを 洗浄バッファーで４回、さらに蒸留水で１回洗浄した。オルトフェニレンジアミ ン（ＯＰＤ）基質１００μｇを加え、室温で１５分間反応させた。次いで、５Ｎ Ｈ＊５Ｏ４２５μＱで反応を停止した。１０分後、マイクロタイタープレートを 、４９０ｎ劇でＤ　ｙｎｉｔｅｃｈプレートリーダーによって測定するか肉眼で 比色定置した。この方法により、総タンパク質濃度１０ｎｇでＨＣＭＶを検出す ることができることが分かった。

精製ｓＨ−グルコサミン標識ＨＣＭＶＴｏｖｎｅ株ピリオンを１％ＮＰ−４０で 抽出した。非還元物質、またはジチオスレイトールで還元しショートアセトアミ ドでアルキル化した物質を１３のネ７：ミｍｃＡｂで免疫沈降させた。免疫沈降 後、全試料をβ−メルカプトエタノールでさらに還元し５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離 した。フルオログラフィーにより、全ての＋ａｃＡｂが、抽出物が事前に還元さ れているか否かにかかわらず、分子量１３０，０００．９３．０００および５０ ゜０００−５２．０００の抗原的に近縁の糖タンパク質を免疫沈降させることが 分かった（代表的な結果は第１図、５ｐ２＝対照ｍｃＡｂ）。

このようにして免疫沈降される個々のタンパク質の数および相対量は免疫沈降前 の還元によって影響されなかった。５０−５２，０００の間で免疫沈降する糖タ ンパク質種の分子量の僅かな変動は、同じ糖タンパク質上の異なるエピトープを 認識するａ＋ｃＡｂによる免疫沈降後の電荷および／またはコンホメーシヨンの 僅かな相違を反映しているのかもしれない。ｍｃＡｂはまた、ウェスタンプロッ トでＨＣＭＶ　ＧＣＡの５２．　ＯＯＯダルトン糖タンパク質を認識したが、こ の方法でより高分子量の種を矛盾なく同定することはできなかつた（代表的な結 果を第２図に示す）。

２．緋 我々は免疫原的に関連した（ａ）分子１４５，０００ダルトン以上（ｂ）分子量 １３０．００００−１８０．０００ダルトンの、２種の高分子量糖タンパク質を 、ＨＣＭＶピリオンのエンベロープから、陰イオン交換ＨＰＬＣで単離してＨＣ ＭＶ　ＧＣＡと命名した。ジスルフィド結合の還元により、分子量１３０，００ ０．９３．０００および５０．０００−５２，０００の各糖タンパク質が同定さ れた。第１図に示すように、ジスルフィド結合した複合体と同様、３種の糖タン パク質は全て原型ｍｃＡｂ、４１Ｃ２および９Ｂ７により免疫沈降し、これらの 抗体が特有の種類（ユニークなりラス）のＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質お よび糖タンパク質複合体を認識することが示された。ヒ）ＨＣＭＶ陽性の回復血 清もこれらｍｃＡｂが認識したと同一の糖タンパク質を免疫沈降させた。

これら２種のｍｃＡｂで免疫沈降される９５．“０００ダルトンのポリペプチド をコードする遺伝子がＨＣＭＶゲノムのユニークロングくＵＬ）セグメント内に 同定された。パルスチェイス（追跡）実験、代謝阻害物質およびエンドグリフジ ダーゼを用い、このＨＣＭＶ糖タンパク質群の合成およびプロセシングを研究し たところ、分子量９３゜０００および５０，０００−５２．０００ダルトンの抗 原的に関連した糖タンパク質が、感染細胞には見い出されるが成熟ピリオンには 見い出されない分子量１３８，０００ダルトンの前駆体糖タンパク質から導かれ た、完全にグリコジル化された糖タンパク質であることが示された。さらにこの １３８ｋＤ糖タンパク質は糖タンパク質Ａの遺伝子によってコードされている９ ５，０００ダルトンのポリペプチドからも導かれる。このように、ＨＣＭＶＧＣ Ａ複合体を含有するＨＰＬＣ精製糖タンパク質を用いた、原型ｍｃＡｂ４１ｃ２ および９Ｂ７によって認識される免疫沈降像で１３０，０００，９３゜０００お よび５０，０００−５２，０００ダルトンの３種の成熟へ−型糖タンパク質、並 びに分子ｔ１３８，０００ダルトンの糖タンパク質人中間体が主に同定された。

モノクローナル抗体４１Ｃ２，９Ｂ７および１１Ｂ４、および追加のｍｃＡｂは ＨＣＭＶピリオンの界面活性剤抽出物から、同じ３種の糖タンパク質な免疫沈降 させることが示された。前駆体糖タンパク質の存在は、ピリオン製品が、これら の研究用のＨＣＭＶを大量に得るために用いた方法で生じた細胞関連のウィルス 性糖タンパク質中間体で汚染されていることを表している。我々は、ＨＣＭＶが ＯＣＡを構成する糖タンパク質と同様の分子量の他の糖タンパク質を含有してい ることを示したが、本明細書に記載のａｃＡｂで認識される３種の抗原的に関連 した糖タンパク質はＯＣＡに特有であり、従って、１３個のモノクローナル全部 が同一の糖タンパク質複合体、ＯＣＡを認識すると結論することができる。

Ｂ、精製Ｔ　ｏｗｎｅ株ＨＣＭＶの表面で発現されたＨＣＭＶ糖タンパク質への ２個のモノクローナル抗体の同時結合第１および第２図に示されているように、 免疫沈降およびウェスタンプロットデータに基づき、１３個のネズミｇａｃ　Ａ 　ｂは抗原的に関連した１３０，０００．９３．０００および５０，０００−５ ２．０００ダルトンのエンベロープ糖タンパク質に特異的であると同定された。

全ｍｃＡｂをヒドロキシアパタイトＨＰＬＣで精製し、ＹＭ−１０フイルターを 付けたマルチ−マイクロ限外ろ過システム（Ａｍｉｃｏｎ）で所望のタンパク質 含量に濃縮した。エンベロープ糖タン、ｆり質は９６ウエルのマイクロタイター ポリスチレンプレートに吸着された全ピリオン上に、抗原として存在していた。

種々の抗体によって認識される抗原部位の関係を研究する目的で競合的エンザイ ムーリンクト・イムノアブソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。最初、 第２の非標識抗体の存在下での、標識抗体のウィルスへの結合の相対的な阻害ま たは増大を測定するために、固定量のビオチニル化した、非標識ｍｃＡｂを同時 に加えた。２個の中和（９Ｂ７．１８Ｆ９）および２個の非中和（４１Ｃ２，３ ４Ｇ７）ビオチニル化抗体を用いる競合的結合につき、１３個のａｃＡｂ全てを 試験した。下記の表１に総括して示したように、ａｃＡｂ類は、自己と同じまた は別のグループに属する他のｍｃＡｂの結合を阻害または増大する作用に基づき 、明確な５群に分けることができる。

表１ １２．５ｎｇ　５ｎｇ　２５ｎｇ　２５ｎｇ１２Ｃ１１Ｇ□　ＮＤ　　−８１４ ８−９５−９３Ｉ３９Ｅ１１　　Ｇｔ、　　Ｙｅｓ　　−９０−３−９１−９４ １２６Ｂ１１　　Ｇ、、　　Ｎｏ　　−９６＋３４−７３−６８１４ＩＣ２Ｇ、 　　　　　　　　　Ｎｏ　　　　　　　−９９＋３９　　　　　＋３０６　　　 　　＋１５３３０Ｃ７Ｇ、　　　　　　　　　ＮＤ　　　　　　−９１＋１７　 　　　　＋２０９　　　　　＋１０５３８Ｂ１１　　Ｇ、　　ＮＤ　　−９８＋ １２　＋１４３　＋９７４３Ｃ８Ｇ、　　　　　　　　　ＮＤ　　　　　　−９ ７＋３０　　　　　＋２ｏｇ　　　　　＋１１９ＩＩ　９Ｂ７　　Ｇ、　　Ｙｅ ｓ　　−１３−６９−８１−９７１１１８Ｆ９　　Ｇ、、　　Ｙｅｓ　　＋７８ 　−８８−８０−９７ＩＩ　３４Ｇ７　　Ｇｔ−Ｎｏ　　＋３０　−９３−８１ −９８１［１１１Ｂ４　　ＧｆｆｉｂＮｏ　　−ａｓ　　−７３１ｉ８−８６Ｎ Ｄ＝測定せず 値は、各実験について、２回の試行で得た実験値の平均で表されている。

観察結果は以下の通りである。

１、モノクローナル抗体１２Ｃ１１，３９Ｅ１１および２６Ｂ　１１はビオチニ ル化４１Ｃ２，９Ｂ７、および１８Ｆ９の結合を阻害したがビオチニル化３４Ｇ ７（ＩＶＩ−１０１４２）の結合には殆んど、または全く影響を及ぼさなかった 。

２、モノクローナル抗体４１Ｃ２，３０Ｃ７，３８Ｂ１１および４３Ｃ８はビオ チニル化４１Ｃ２の結合を阻害し他の３種のビオチニル化ｍｃＡｂ（３４Ｇ　７ ．９Ｂ７および１８Ｆ９）の結合を増大した。

３、モノクローナル抗体９Ｂ７．１８Ｆ９および３４Ｇ７はビオチニル化３４Ｇ ７．９Ｂ７および１８Ｆ９の結合を阻害したが、これらの同じｍｃＡｂは、ビオ チニル化４１Ｃ２の結合を増大することも、または影響を及ぼすこともなかった 。

４、モノクローナル抗体１１Ｂ４および２３Ｂ１１は全４個のビオチニル化ａ＋ ｃＡｂの結合を阻害した。

５、モノクローナル抗体１９Ｄ６はビオチニル化４１Ｃ２の結合を阻害し、ビオ チニル化９Ｂ７．３４Ｇ７および１８Ｆ９の結合には殆んど、または全く影響を 及ぼさなかった。

ｍｃＡｂの結合に対する阻害および増大のパターンとそれらの中和活性との間に はなんらの相関性がなかった。しかも、他のｍｃＡｂとの関係における、任意の 特定ｍｃＡｂの結合に対する阻害または増大は、該初期実験に用いた特定のタン パク質濃度での各抗体の結合親和性に依存しているらしいことから、これらのデ ータに基づいて明確なエピトープマツプを構築することは不可能であった。

従うて、これらｍｃＡｂの内７個によって認識される抗原部位の地形的分析を、 種々の量の非標識ｍｃＡｂを、同一または異なるビオチニル化ｍｃＡｂに加えて 結合の阻害および／または増大を決定することにより、極めて詳しく行った。あ らゆる組合わせの標識されていない、ビオチニル化された、ｍｃＡｂ類、２６Ｂ １１，３９Ｅ１１．３４Ｇ７．１１Ｂ４．１８Ｆ９．１７Ｂ８．４１Ｃ２および ９Ｂ７の全ウィルスへの同時結合を検討した。結果を表２にまとめて示す。

表−１ ４１Ｃ２−ｏ％　　　−９３％　　−８９％　　　＋７３％　　＋８９％　　＋ １９５％　　　　−５３％２６Ｂ１１　　　−９３％　　−９５％　−９２％　 ＋９３％　−４４％　−５４％　　−７０％Ｅ　　　　　　　−８６，’　　　 −９７−９５＋４９　　−９０．　−８９　　　−６４グループ■ ３４Ｇ７　　　　＋９６％　＋９８％　＋５５％　−８０％　−８５％　−７５ ％　　−７８％１　８　　Ｆ　　９　　　　　　　４１３０％　　　＋７７％　 　＋１０５％　　　−７７％　　−９３％　　−９０％　　　　−７０％Ｂ　　 　　　＋４８　　４２１　　＋２％−８６−９５％−８６−６６グループ■ Ｂ　　　　　−５２’　　−２４−３３−６８−５５−５７％　　−５４非関連 試Ａｂ Ｂ−１３−５％　−９−１３−７−１４−１８表２にまとめたデータから、増加 量の非標識ｍｃＡｂの添加は、１１Ｂ４を除いて、同じビオチニル化抗体の結合 を８０％以上阻害することが明らかとなった。１ＩＢ４は同種のビオチニル化抗 体の結合を最高５４％阻害した。ウェスタンプロットで分子量が２４，０００ダ ルトンである、非近縁のグリコジル化されていないＨＣＭＶタンパク質を認識す るが、いがなる３Ｈ−グルコサミン標識物質をも免疫沈降しないａｃＡｂｌ　７ 　Ｂ　８の増加量の添加は、どのビオチニル化０ＣＡ−特異抗体の結合にも影響 を及ぼさながった。このように、様々なＧＣＡ−特異的ｍｃＡｂの組み合わせに 認められた阻害および／または増大は、免疫グロブリン分子相互の非特異的な相 互作用というよりも、むしろＯＣＡ糖タンパク質上で発現された抗原部位に対す る直接的な競合に関連している。

７個のｍｃＡｂの可能な一対の組み合わせの全てについて得られた阻害／増大曲 線に基づいて、抗体を主な３群に大別することができた（表２）。グループｌは 抗体４１ｃ２．２６Ｂｌ　ｌよび３９Ｅ　１１からなり、このグループの各ｍｃ Ａｂは、グループ内の他のｍｃＡｂとその特異抗原部位への結合を互いに阻害し 得ることに基づいて構成されている。同様に、グループ■は３４Ｇ７．１８Ｆ９ および９Ｂ７からなり、このグループの全抗体は相互に阻害作用を示す。グルー プ■は特有のｍｃＡｂｌｌＢ４単一で構成され、この抗体は他のグループＩおよ びグループ■のＧＣＡ−特異的抗体全ての結合を阻害し、それ自身、他のあらゆ るｍｃＡｂの存在下で阻害される。

この３つの主要グループの各ｍｃＡｂは同様の阻害パターンを示すが、非近縁グ ループのｍｃＡｂの結合の増加における能力には有意な相違が観察された。グル ープＩの抗体４１Ｃ２はグループＨの抗体３４Ｇ７．１８Ｆ９および９Ｂ７の結 合を増大した。また、グループ■の抗体はビオチニル化４１Ｃ２の結合を増大し た。この相互増大作用はグループ■のａ＋ｃＡｂ３４　Ｇ　７とグループ■の抗 体４１Ｃ２，２６Ｂ１１および３９Ｅ１１との間にも観察された。グループ■の ２６Ｂ１１と３９Ｅ１１の両者はグループＨの１８Ｆ９および９Ｂ７の結合を阻 害した。しかし、１８Ｆ９は２６Ｂ１１および３９Ｅ１１の結合を増大したが、 ９Ｂ７は２６Ｂ１１の結合を促進し、３９Ｅ１１の結合は促進しなかった。

ビオチニル化ｍｃＡｂの結合阻害は競合的な非標識ｍｃＡｂの濃度に依存してお り、さらに高濃度の非標識抗体でも維持される、最高値に達することが多い。２ 個の抗体間の増大は至適濃度の非標識抗体の存在下で起こり、促進性抗体の濃度 がそれ以上に増加しても促進されず、ビオチニル化抗体の結合の増大または阻害 が減少する場合も界面活性剤抽出物中のウィルス性糖タンパク質への２個の抗体 の同性接金 これらのｍｃＡｂによって認識される抗原性糖タンパク質は、通常、ウィルス中 でジスルフィド結合した糖タンパク質複合体として存在しているので、還元した 、または還元されていない界面活性剤抽出物を用い、特異的なｍｃＡｂと、それ らのエピトープとの結合における立体配座（フンホメーシ１ン）の役割を決定す るための競合的結合アッセイを行った。グループＩの抗体４１ｃ２および３９Ｅ １１と、グループ■の抗体９Ｂ７および３４Ｇ７を用いて試験した。これら対の 抗体は、なおも同じグループ内の他の抗体と、全ウィルスから抽出されたＯＣＡ との結合、または界面活性剤抽出物の還元およびアルキル化で得られた個々の糖 タンパク質との結合を相互に阻害し、ジスルフィド結合の再結合を阻害した。

次いで、還元した、または還元していないＨＣＭＶピリオンの界面活性剤抽出物 を用いてｍｃＡｂ４１　Ｃ２（グループ■）と９Ｂ７（グループ■）、および抗 体４１Ｃ２（グループＩ）と３４Ｇ７（グループ■）との競合結合を再検討した 。認識される抗原が非還元抽出物の形である場合、４１Ｃ２とそのエピトープと の結合に及ぼす９Ｂ７および３４Ｇ７の促進作用は、全ウィルスの場合と比較し て減少していた。還元された物質を試験すると、９Ｂ７および３４Ｇ７はもはや ４１Ｃ２の結合を増大しなかった。逆に、４１Ｃ２は全ウィルスの場合と同程度 に９８７と非還元抽出物との結合を増大し続けたが、この増大は還元によってジ スルフィド結合が破壊されると劇的に減少した。非還元および還元ウィルス抽出 物中のＯＣＡへの３４Ｇ７の結合に対する４１Ｃ２の促進効果は全ウィルスの場 合と比較して著しく減少していた。

抗体１８Ｆ９（グループ■）は３９Ｅ１１および２６Ｂ　１１と全ウィルス上の ＧＣＡとの結合を促進したが、３９Ｅ１１および２６Ｂ１１は１８Ｆ９の結合を 逆に阻害した。これら抗体の反応性を還元されていない抽出物を用いて再検査す ると、１８Ｆ９が３９Ｅ１１および２６Ｂ１１の結合を阻害するとは認められな かったが、３９Ｅｌｌおよび２６Ｂ１１はなおも１８Ｆ９の結合を阻害した。還 元した物質を用いると、２６Ｂ１１以外は相互に阻害し合った。実際には、２６ Ｂ１１は１８Ｆ９の結合に影響しなかった。抗体１１Ｂ４（グループｍ）はＨＣ ＭＶ　ＧＣＡが全ウィルス、または還元された、または還元されていないウィル ス抽出物のいずれに認識されても、依然として他の全ｍｃＡｂの結合を阻害した 。

このように、ある種の１ｃＡｂの、他のｍｃＡｂと非還元ＨＣＭＶ界面活性剤抽 出物との結合に対する増大作用は、同じｍｃＡｂと固有のウィルスとの結合に対 する増大作用に比べて減少している場合が多い。

しかも、大多数の場合、ジスルフィド結合の還元によりこれらｌ１ｌｃＡｂの増 大作用が減少し、それはＯＣＡ糖タンパク質複合体の立体配座構造が結合増大に 有意な役割を果たしていることを示唆するものである。

Ｄ、モノクローナル抗体の同時中和活性ｍｃＡｂ相互の協同的結合の生物学的な 重要性はそれらのＨＣＭＶＴ　ｏｗｍｅ株に対する中和活性で例示された。個々 のｍｃＡｂの中和活性はまず、ＩｇＧタンパク質濃度０．００１−１００μ９／ ウエルで、補体の存在下または非存在下に測定された。プラークの還元が５０％ 以上である場合にはＴ　ｏｗｍｅ株ＨＣＭＶに対する特異的中和活性と一致する とみなした。これらの結果を下記の表３にまとめて示す。

表３ 補体の存在下での個々の＋ｎｃＡｂの中和活性グループ　ｍｅＡｂ　　　中和活 性　　　５０％以上のプラーク還元を達成するタンパク濃度 Ｉ　　　　４１Ｃ２非中和 ２６Ｂ１１　　　　　±　　　　　　　６．５μ９／ウエル］１　　　　３４Ｇ ７　　　　　　　　　　　　　　５０μ９／ウエルオ１８Ｆ９　　　　　　＋　 　　　　　　　　５μｇ／ウェル＊：５０μ９／ウェル以上の場合、中和活性は 高濃度の１ｇＧの非特異的作用を反映しているかもしれない。

グループ１のｍｃＡｂ４１ｃ２はいずれのタンパク濃度でも中和活性を示さなか ったが、２６Ｂ１１および３９Ｅ１１はそれぞれ、６゜５μｇ／ウェルおよび０ ．５μｇ／ウェルのタンパク濃度でＨＣＭＶを中和した。グループ■のｍｃＡｂ の中では、３４Ｇ７は非中和性であり：９Ｂ７および１８Ｆ９０両者はそれぞれ 、補体の存在下、０゜５５μ９／ウエルおよび５μ９／ウエルの濃度でＨＣＭＶ を中和した。

グループ■の節ｃＡｂｌｌＢ４はＴｏ智ｎｅＨＣＭＶを中和しなかった。

これらのモノクローナル抗体の多数が同時２抗体結合検定において、ある程度の 相互作用を示したので、これらの相互作用が他の検定で検出され得るか否かを調 べることは興味深がった。これらの試験のために、イン・ビトロのプラーク減少 検定を使用した。これらのモノクローナル抗体の多数は、同時２−抗体結合検定 において他の抗体の結合をも増大した。したがって、これらの抗体がプラーク減 少検定において、中和に対する相乗効果を示すが否がを調べることは興味深かっ た。抗体を別個に使用した場合、０．５〜１．１μ９／ウエルの抗体濃度の抗体 ９Ｂ７で５０％より大きいプラーク減少の中和活性が示され、抗体４１Ｃ２およ び３４Ｇ７は１０μ９／ウエルまたはそれ以下の抗体濃度でＨＣＭＶ　Ｔｏｗｎ ｅ株を中和しなかった（第４ＡおよびＢ図）。相互作用的に増大する抗体ペア、 即ち９Ｂ７と４１Ｃ２および４１Ｃ２と３４０７を合することによって、両抗体 ベアについて、強い中和効果が観察された（第４ＡおよびＢ図）。

与えられた濃度で達成されたプラーク減少百分率が非常に上昇したことは、別個 に試験した各抗体より得られたプラーク減少百分率を合計することによっては説 明し得なかった。更に、全ての抗体は異なったサブクラスであったので、組み合 わせて使用した時にＨＣＭＶを中和する抗体の活性は、抗体のサブクラスに依存 するようではなかった。しかしながら、全ての場合において、補体が必要であっ た。

更に、他のＧＣＡ−特異抗体の中和活性を阻害する１１Ｂ４（ドメイン■）の活 性を調べた。同時２−抗体結合検定によって調べると、１１Ｂ４はその他の全て の０ＣＡ−特異抗体の結合を阻害し得、更に、非中和性であった（第４Ｃ図）。

次に、９Ｂ７の中和活性に対する１１Ｂ４の効果を調べた。補体の存在下、９Ｂ ７は１μ９／ウエルまたはそれ以上で有意な中和活性を示した（第４Ｂ図）。し がしながら、１１Ｂ４が同じウェル中に１μｇ／ウェルまたはそれ以上の濃度で 存在する時、９Ｂ７がｌＯμＶ／ウェルの濃度で存在しても、ＨＣＭＶを中和す る９Ｂ７の活性は非常に低下された（第４ｃ図）。

Ｅ、ＥＬＩＳＡによる上清中ウィルスの直接検出に対する、細胞変性効果（ＣＰ Ｅ）による組織培養中ＨＣＭＶの検出の結果線維芽細胞培養における細胞変性効 果（ＣＰＥ）の発現について、４週間の観察期間、合計３０人の患者の試料を同 時に調べ、５日後、二重抗体酵素−結合免疫吸着検定を使用しＥＬＩＳＡによっ て培養中の組織培養細胞単層リゼート中のウィルス性タンパクを検出した。

３０試料中２１試料がＥＬＩＳＡによってＨＣＭＶについて陰性であり、３０試 料中２０試料がＣＰＨについて陰性であった。３０試料中９試料がＥＬＩＳＡに よって陽性であり、３０試料中１０試料がＣＰＥを生じた。即ち、３０試料中２ 個の疑陰性と１個の疑陽性のＥＬＩＳＡ試験があったが、Ｅｌ、ＩＳＡとＣＰＨ の結果には優れた一致があった。ＣＰＨによって検出された組織培養中のＨＣＭ Ｖの存在は、前記ＥＬＩＳＡ検定におけるＨＣＭＶの検出のために使用されたの と同じＨＣＭＶ−特異的ｍｃＡｂ抗体を使用し、間接免疫蛍光検定によって確認 した。

ディスカッジョン 本発明者らは先に、ジスルフィド結合によって結合された少なくとも３種類の抗 原性関連糖タンパクで構成されたＨＣＭＶの主要な免疫原性エンベロープ糖タン パク複合体を単離し、特性化した。これらの糖タンパクは、１３０，０００，９ ３，０００および５０，０００−５２．０００ダルトンの分子量を有していた。

本発明者らは、この糖タンパク複合体およびその成分糖タンパクに反応的なｍｃ Ａｂを産生する１３種類のネズミＢ−細胞ハイブリドーマを製造した。

個々のＧＣＡ−特異的ｍｃＡｂは、ＧＣＡ−ｍｃＡｂのその他の同時結合を幾分 阻害するかまたは増大することが示され、これは糖タンパク複合体の３次構造に おいてきわめて接近して表される３個の別個のドメイン中の少なくとも７個の別 個の抗原性部位を示唆した。とりわけ興味深いことに、これらのｍｃＡｂのある 種のものは補体の存在下で糖タンパク複合体の中和部位と反応的であることが示 され、その他は単独で検定した時、中和しない。しかしながら、中和性および非 中和性抗体のベアが同時結合すると、全ての中和活性を著しく増大した。幾つか の場合、２種類の非中和性抗体を組み合わせても有意な中和活性を示した。

本特許出願に記載された全ての結果に基づ（と、７個の完全に特性化されたｍｃ ＡｂはＨＣＭＶ　ＧＣＡ上の３個の別個のドメイン内の抗原性部位を認識したら しい。１個のドメイン内のエピトープを認識するこれらのモノクローナルは物理 的に非常に接近しているらしい。この結論は、それらが結合部位に対して相互に 競合し得るが、別個のドメイン中にある場合は、別のドメイン中のエピトープに 対するモノクローナルの結合を増大する活性に基づき、より隔たった部位を認識 すると思われるということに基づくものである。（第３図、パネルＡ）別個のド メイン中のエピトープ間の物理的関係および各ドメイン内のエピトープ間の物理 的関係は、−次アミノ酸配列よりフンホメーション的構造に依存するらしい。な ぜなら、ジスルフィド結合の還元は多くの場合、結合の増大を廃棄するからであ る。ｍｃＡｂ間の結合の競合的阻害および／または増大のパターン、および補体 の存在下、単独でまたはその他のｍｃＡｂと組み合わせて、ＨＣＭＶを中和する その活性に基づくと、これらのモノクローナルによって認識されるエピトープは 、１またはそれ以上のジスルフィドブリッジによって結合されたペプチドバック ボーン中の陰窩の一部分として互いに関連していると思われる（第３Ｂ図）。ド メインＩ中のエピトープ４１Ｃ２と２６Ｂ１１およびドメイン■中の３４０７の 物理的接近は、ジスルフィド結合の還元によって変更され、これらのエピトープ を認識するモノクローナルの結合の相互作用的増大も還元によって排除される。

これと対照的に、ドメイン■のエピトープ３９Ｅ１１およびドメイン■の９Ｂ７ と１８Ｆ９は、還元によって変更されないペプチドバックボーンの直線構造上で 非常に接近している結果、結合を相互に阻害する。

この仮定モデルは、中和に応答し得るＧＣＡ上のエピトープは陰窩の基部に位置 していることを示唆する。なぜなら、モノクローナルはこれらのエピトープを認 識するが同一ドメイン内のその他のエピトープを認識せず、補体の存在下でＨＣ ＭＶを中和するからである。そのエピトープに対する中和性抗体の結合の増大は その生物学的活性を増大し得るようでもある。更に、２個の非中和性抗体の同時 結合によって起こる、いわゆる“非中和性”エピトープのコンホメーションにお ける変化は、これらの同じエピトープに関連し、有意なウィルス中和を生じるか もしれない。

抗体（１１Ｂ４）は、ドメイン■に配置された。この抗体は、試験したその他の 全ての抗体の結合を阻害する活性を有し、また、その逆の作用を受けた。ＯＣＡ を非イオン性洗浄剤で抽出した時、他の抗体の結合を阻害する１１Ｂ４の活性は 保持されたが、ジスルフィド結合の還元後、この活性は低下されるようであった 。１１Ｂ４によって認識されるエピトープの変性に対する感受性は、ウェスタン ・プロット・システムにおける１１Ｂ４の反応性の欠如（二も反映されていた。

モノクローナル抗体１１Ｂ４はＩｇＧ＊ｂサブクラスであった。このサブクラス は補体と結合することができる。しかしながら、た。１１Ｂ４は、中和性抗体３ ９Ｅ　１１．１８Ｆ９および９Ｂ７の結合を阻害した非中和性抗体であることに 注目するのは興味深い。

モノクローナル抗体１１Ｂ４は、プラーク減少検定において９Ｂ７の中和活性も 阻害した。本発明者らは最近、他の全てのＨＣＭＶＧＣＡ−特異抗体の結合を阻 害するその他のモノクローナル抗体（２３Ｂ１１）をも製造した。

これは、このタイプの抗体の生成が珍しくなく、イン・ビボでの感染からの保護 の低下と相互関係があるかもしれないことを示唆している。事実、この様な抗体 は感染を増大するかもしれない。１１Ｂ４によって認識されたエピトープがイン ・ビボで非保護的抗体の産生を誘導するか否かは知られていないが、１１Ｂ４が 非中和性であり、中和抗体の結合を阻害し、イン・ビトロで中和を妨害するとい う事実はその可能性に導く。

従って、本発明の種々の態様の有用性は、ＨＣＭＶの主要な免疫原性エンベロー プ糖タンパク上の抗原性部位の局所解剖学的分析によって支持される。１３ｍｃ Ａｂのパネルは、その組み合わせ物がウィルスに対して相乗効果的に結合し、単 独で使用したいずれのｍｃＡｂの生物学的活性よりも生物学的活性を高めること が示されている。

これは、各ｍｃＡｂ単独について必要な量では感受性が不足している、または商 業的生産において実用的な量以上に必要であるがもじれないことを仮定した上で 、診断および治療を目的としてＨＣＭＶ−特異的ネズミｍｃＡｂの臨床的有用性 を調べる場合、とりわけ重要である。

非競合的構成で別個のｍｃＡｂを使用することができるので、これらの種々のｍ ｃＡｂは、ウィルス診断試験の開発において重要な役割を果たす可能性がある。

例えば、ウィルスを捕捉し、濃縮するために各ＨＣＭＶタンパクの独特のエピト ープを認識する、あるｍｃＡｂを使用することができ、ウィルス性抗原の免疫学 的検出のために同一タンパクの別の非競合的エピトープを認識する第２のｌ１ｃ Ａｂを使用することもできる。更に、ウィルス性抗原の免疫学的検出の感受性を 高めるために、その特定の抗原部位に対する他の抗体の結合を相互作用的に増大 する２種のｍｃＡｂを使用することができる。この方法の有用性は、ＨＣＭＶ抗 原の代わりに捕捉されるマトリックスとしてニトロセルロース膜およびプラスチ ックプレートを使用した、基本型の診断試験を使用して証明された。本出願に記 載のＨＣＭＶ−特異的ｍｃＡｂを使用すると、これらの基本型はＨＣＭＶをナノ グラム量で検出することができる。

ＨＣＭＶに対するモノクローナル抗体は、免疫抑制された患者における生命に危 険を及ぼすかもしれない日和見的なＨＣＭＶ感染症の治療にも有用となり得る。

これらの患者には、器官移植患者、骨髄移植患者、先天性または後天性免疫欠乏 疾患に罹患している患者、免疫抑制剤を使用中の患者、先天性ＨＣＭＶ感染症に 罹患している患者がある。免疫治療におけるｍｃＡｂの使用は、高い危険率の患 者の予防的処置および重篤なＨＣＭＶ感染症に罹患している患者における特殊な 治療の両者において指示することができる。器官または骨髄移植に先立ち、免疫 抑制された患者に高免疫性ＨＣＭＶグロブリンを投与すると、移植後の時期にお ける生命に危険を及ぼすＨＣＭＶ感染症を弱めるかまたは予防し得るかもしれな いということを示唆する最近の証明がある。ＨＣＭＶ−特異的ｍｃＡｂは低コス トで大量に製造することができ、従って、嵩度免疫グロブリンに非常に好都合で ある。現実に感染症に罹患している患者へのＨＣＭＶ高度免疫グロブリンの治療 的投与も有用となり得るが、この場合、成功は現在まででは限られている。

本発明者らの研究で開発されたモノクローナル抗体は、イン・ビトロで７’　（ ｎｎｅ株ＨＣＭ　Ｖに対し、高特異的中和活性を有することがわかった。また、 同−糖タンパクの別個のエピトープに対して誘導された２またはそれ以上のモノ クローナル抗体を使用する相乗的中和活性は、個々のｍｃＡｂの使用で必要とさ れる量に比較して比較的低い量のｍｃＡｂ混合物で、高い治療活性を与えること ができる。また、相乗的中和活性はｍｃＡｂを増大させた広範な相対濃度で観察 される。これは、患者に所望の治療効果を示すであろう薬学的単位投与量の選択 を非常に容易にする。

ある種の非中和性０ＣＡ−特異的ｍｃＡｂ（即ち、１１Ｂ４）は、ＨＣＭＶを中 和するｍｃＡｂを含む、今まで試験したその他の全ての１ｌｃＡｂの結合を阻害 するらしい。従って、ＨＣＭＶ高度免疫グロブリンは、中和抗体と競合し、その 生物学的活性を変更し、それによってＨＣＭＶ感染を促進する可能性のあるある 種のＨＣＭＶ−特異抗体を含むかもしれない。また、これらのデータは、免疫治 療のために使用されるネズミまたはヒト８０閘Ｖ−特異的ｍｃＡｂが、他のＨＣ ＭＶ抗体の結合を増大し、活性を中和するその活性に基づいて選のＨＣＭＶ−特 異抗体の結合および／または活性の中和を阻害するかもしれないｍｃＡｂを排除 することが重要である。

本明細書に記載のＨＣＭＶモノクローナル抗体はネズミモノクローナルである。

これらはヒトにアレルギ一応答を生じさせることがある。しかしながら、重篤な ＨＣＭＶ感染症に罹患しているほとんどの患者は、ＨＣＭ　Ｖ−特異的ｌｌ１ｃ Ａｂで１または２回の治療するだけでよいことが多い。従って、１ｃＡｂに対す る有意なアレルギ一応答の危険は低減される。他のネズミｍｃＡｂを使用する臨 床試験では、過敏症反応は大きな問題を呈示しなかった。更に、ＦＤＡは、癌治 療のためにネズミ０ＫＴ３　ｍｃＡｂ（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ、０ｒｔｈ。

Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、）の使用を既に認可し、ネズミモノクロ ーナルは許容し得る治療形態となるであろうことを示している。以下は、ヒトの 治療のためのネズミ対ヒト１ｌｃＡｂの使用についての理論的根拠である： １、前記の様に、ネズミモノクローナルは現在ＦＤＡによって許可され、有効な 治療法であると考えられている。ヒトー抗マウス反応の結果のアレルギー反応は 大きな問題となると考えられない。

２、本発明のネズミｍｃＡｂは十分特性化され、適切な免疫原性応答を示す。従 って、本発明は、臨床試験で使用し得る組成物を提供する。

３、ヒト１ｃＡｂを製造するための別法には、ＥＢＶハイブリドーマ、ヒト−ヒ トハイブリドーマおよびヒト−マウス免疫グロブリン遺伝学的キメラがある。全 ての場合において、これらの方法は以下の理由で現在の時点では商業的に実施可 能であるとは考えられない：（ａ）安定なヒトハイブリドーマの頻度が非常に低 い、（ｂ）ヒト融合系を利用することができない、（Ｃ）ネズミの系の産生レベ ルに比較して、ヒトの系におけるヒ）＋ａｃＡｂ産生レベルが非常に低い（即ち 、ヒトハイブリドーマは１−１０１１９／ｌ（ｌ産生され、ネズミハイブリドー マは１１９／　＊Ｑ以上産生される）。

本発明は、ＨＣＭＶに罹患している患者の予防的および治療的治療のためのネズ ミ抗−ＨＣＭＶ　ＧＰＣｍｃＡｂの混合物を提供する。

ヒトハイブリドーマが安定でなく、ヒトｍｃＡｂの治療的量を得るために必要な 産生レベルが得られないので、ヒトモノクローナルを使用することは実用的でも 得策でもない。移植前および後の両者において免疫予防法を行うことは、移植患 者に対する慣例になってきた。

ＨＣＭＶグロブリン／血漿による現在の治療法は作用の特異性がなく、血液製剤 の危険性の全てを有し、さらに、この治療法は非常に費用がかかる。従って、ネ ズミモノクローナルはその抗原特異性のために、より有効である。これらは血液 製剤ではないので、これらは副作用の可能性がより低く、製造するために上記よ りずっと経費がかからない。

ｍｃＡｂ９Ｂ７．４１Ｃ２および３４Ｇ７を産生ずるハイブリドーマの試料は、 以下の第１表に示した様に、ドラフト・パテント・アンド・トレードマーク・オ フィス・デポジット・ポリシー・フォー・バイオロジカル・マテリアルズ、ＢＮ Ａ　ＰＩＣＪ、３λ、９０（１９８６）に従い、イン・ビトロ・インターナショ ナル、リンチクム、メリーランド、米国に寄託されている。

第１表−受託の情報 広径　　　ＩＶＩ受託コード　　　営粍旦９Ｂ７　　１ＶＩ−１０１１７１９８ ６年９月１０日４１Ｃ２１ＶＴ−１０１１９１９８６年９月１０日３４Ｇ７　　 ＩＶＩ−１０１４２１９８７年８月７日１１Ｂ４　　ＩＶＩ−１０１８１１９８ ８年７月３１日ＦＩＧ、　　２ ェじ！トーアｘ６ω （Ｉ）、αｎ、ｔｍｚ　　　　＄厘、かイン　　　ＩＩＩＩＩＩ”５０　１ｏ５ 　　　’０．５　０・’０．０５０ｏ’０．００５ｖｖｉ＋士　　　（月９２ 国際調査報告 １ｍｆｉａ＊ｔＭｌ　１１６ｍ＆ｌ１Ｍ　１＋ａ　ＰＣ”　；　’＋ｓ　ａ　ａ 　、’　Ｃ＆ε銭＝＋＠Ｌ１１６１＋・ＩＩ＠ｌ＾軸＋Ｃ１ｉ□ｌｌｌ１−・　 ＰＣ７”：Ｓ　　Ｅａｚ：二６４４国際調査報告

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＣＭＶに感染した生理学的物質の試料中のＨＣＭＶを検出する方法であっ て、 （ａ）該生理学的物質と、ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第１エピトープと結合する第１モ ノクローナル抗体とを反応させて該ＨＣＭＶ　ＧＰＡと該第１モノクローナル抗 体との複合体を形成させ、（ｂ）ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第２エピトープに対する第 ２モノクローナル抗体であって、第１モノクローナル抗体と第１エピトープとの 結合を促進し、かつ検出可能なラベルを有するか該ラベルとの結合部位を有して いる第２モノクローナル抗体と上記複合体を反応させて３重複合体を得、 （ｃ）該検出可能なラベルの存在を検出するか、または該結合部位と該検出可能 なラベルとを反応させてから該ラベルを検出し、該ラベルの濃度から該生理学的 物質中に存在するＨＣＭＶ　ＧＰＡの濃度を測定する検出方法。
2. ２．該生理学的物質が溶解したヒト線維芽細胞を含有するものである請求項１記 載の方法。
3. ３．第１モノクローナル抗体がインピトロで補体の存在下、ＨＣＭＶの感染性を 中和するものである請求項１記載の方法。
4. ４．第１モノクローナル抗体が９Ｂ７である請求項３記載の方法。
5. ５．第２モノクローナル抗体がインピトロで補体の存在下、ＨＣＭＶの感染性を 中和しないものである請求項３記載の方法。
6. ６．第２モノクローナル抗体が４１Ｃ２である請求項５記載の方法。
7. ７．本質的に、 （ａ）ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第１エピトープと結合する第１モノクローナル抗体で あって、補体の存在下インピトロでＨＣＭＶの感染性を中和する第１モノクロー ナル抗体；および（ｂ）ＨＣＭＶＧＰＡの第２エピトープと結合し、補体の存在 下にＨＣＭＶの感染性を中和しない第２モノクローナル抗体、の混合物からなる 組成物であって、該混合物の中和活性が第１モノクローナル抗体の中和活性より も大きい組成物。
8. ８．第１モノクローナル抗体が９Ｂ７である請求項７記載の組成物。
9. ９．第２モノクローナル抗体が４１Ｃ２である請求項８記載の組成物。
10. １０．ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第３のエピトープと結合し、補体の存在下または非存 在下でＨＣＭＶ感染性を中和しない、そして第１抗体と第２抗体との結合を阻害 するモノクローナル抗体を含有しない請求項７記載の組成物。
11. １１．ヒト患者血漿のＨＣＭＶに対する免疫原性を高める方法であって、ＨＣＭ Ｖにさらされた患者に、有効量の請求項７に記載の組成物と薬学的に許容し得る 担体とを含有する医薬製剤を投与することからなる方法。
12. １２．ＨＣＭＶの感染性が実質上、減少されている請求項１１記載の方法。
13. １３．製剤が非経口投与剤形である請求項１１記載の方法。
14. １４．製剤が静脈注入または注射により投与されるものである請求項１２記載の 方法。
15. １５．該患者に該製剤を複数回投与する請求項１１記載の方法。
16. １６．ＨＣＭＶをインピトロで中和する方法であって、一定量のＨＣＭＶを薬学 的に許容し得る担体内の、ＨＣＭＶの感染性を中和するのに有効な一定量の請求 項７記載の組成物で処理することからなる方法。
17. １７．ＨＣＭＶに感染した生理学的物質の試料中のＨＣＭＶを検出する方法であ って、 （ａ）ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第１エピトープに対する第１モノクローナル抗体であ って、検出可能なラベルまたは該ラベルのための結合部位を含有する第１モノク ローナル抗体と該生理学的物質を反応させてＨＣＭＶ　ＧＰＡと該第１モノクロ ーナル抗体との複合体を形成させ、 （ｂ）ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第２エピトープと結合する第２モノクローナル抗体で あって、第１モノクローナル抗体と第１エピトープとの結合を促進する第２モノ クローナル抗体と該複合体を反応させて３重複合体を形成し、 （ｃ）該ラベルの存在を検出するか、または該結合部位と検出可能なラベルとを 反応させてから該検出に付し、該ラベルの濃度から該生理学的物質中に存在する ＨＣＭＶ　ＧＰＡの濃度を測定する検出方法。
18. １８．該生理学的物質が溶解したヒト線維芽細胞を含有するものである請求項１ ７記載の方法。
19. １９．第１モノクローナル抗体がインピトロで補体の存在下、ＨＣＭＶの感染性 を中和するものである請求項１７記載の方法。
20. ２０．第１モノクローナル抗体が９Ｂ７である請求項１７記載の方法。
21. ２１．第２モノクローナル抗体がインピトロで補体の存在下、ＨＣＭＶの感染性 を中和しないものである請求項１７記載の方法。
22. ２２．第２モノクローナル抗体が４１Ｃ２である請求項１７記載の方法。
23. ２３．ＨＣＭＶに感染した生理学的物質の試料中のＨＣＭＶを検出する方法であ って、 （ａ）該生理学的物質と、（ｉ）ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第１エピトープに対する第 １モノクローナル抗体であって、検出可能なラベルまたは該ラベルのための結合 部位を含有する第１モノクローナル抗体と、（ｉｉ）ＨＣＭＶ　ＧＰＡの第２エ ピトープと結合する第２モノクローナル抗体であって、第１モノクローナル抗体 と第１エピトープとの結合を促進する第２モノクローナル抗体、とを同時に反応 させて３重複合体を形成し、 （ｂ）核ラベルの存在を検出するか、または該結合部位と検出可能なラベルとを 反応させてから該検出に付し、該ラベルの濃度から該生理学的物質中に存在する ＨＣＭＶ　ＧＰＡの濃度を測定する検出方法。
24. ２４．該生理学的物質が溶解したヒト線維芽細胞を含有するものである請求項２ ３記載の方法。
25. ２５．第１モノクローナル抗体がインピトロで補体の存在下、ＨＣＭＶの感染性 を中和するものである請求項２３記載の方法。
26. ２６．第１モノクローナル抗体が９Ｂ７である請求項２３記載の方法。
27. ２７．第２モノクローナル抗体がインピトロで補体の存在下、ＨＣＭＶの感染性 を中和しないものである請求項２３記載の方法。
28. ２８．第２モノクローナル抗体が４１Ｃ２である請求項２３記載の方法。