KR101356350B1 - 인간 사이토메갈바이러스 중화 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 사이토메갈바이러스 중화 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 hCMV 중화에 있어서 고효능을 가지는 중화 항체, 및 이의 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 항체 및 항체 단편은 hCMV 유전자 UL 산물 중 하나 또는 두 개 또는 그 이상의 조합에 특이적이다. 본 발명은 또한 항체 및 항체 단편을 만드는 불사화된 B 세포, 그리고 이와 같은 항체 및 항체 단편에 결합하는 에피토프에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스크리닝 방법뿐만 아니라 질환의 진단, 예방 및 치료에 항체, 항체 단편, 및 에피토프를 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

인간 사이토메갈바이러스 중화 항체 및 이의 용도{HUMAN CYTOMEGALOVIRUS NEUTRALIZING ANTIBODIES AND USE THEREOF}
본 출원은 2008년 7월 16일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/08l,334호의 우선권을 주장하며, 이 출원의 전문은 그 전체가 여기서 참고로 포함된다.
인간 사이토메갈바이러스 (hCMV)는 면역억제된 성인 및 태아에 감염된 경우 심각한 병인의 원인이 될 수 있는 널리 분포된 병인균이며, 또한 아테롬성 동맥경화증과 같은 만성 질환에 연루되어 있다. hCMV는 섬유아세포, 내피세포, 상피세포 및 조혈세포를 포함하는 다중 세포를 감염시킨다[1]. in vitro에서 후보 백신으로 개발되고 있는 hCMV의 번식된 감쇠된 균주들은 내피세포에 대한 친화성(tropism)을 상실하였으나, 섬유아세포를 감염시키는 능력은 보유하고 있다[2]. 두 가지 바이러스성 당단백질 복합체는 hCMV의 세포 친화성을 조절하는 것으로 여겨진다. 당단백질, 예를 들면 gH, gL 및 gO의 복합체는 섬유아세포의 감염에 필요한 것으로 보이며, gH, gL 및 UL131-UL128 유전자에 의해 인코드된 단백질의 복합체는 내피세포, 상피세포 및 수지상 세포의 감염에 연관되어 있다[2-8].
과면역(Hyperimmune) 글로블린은 이식과 연관된 hCMV 질환의 예방용으로 이미 시판되고 있으며, 또한 최근 증거자료에서 과면역 글로블린은 임산부에서 치료효과를 가진다는 것이 나타나 있다[9]. 이와 같은 치료 접근법은 전달되는 중화 항체의 적은 양으로 인하여 한계가 있으며, 이와 같은 이유로 높은 중화력을 가진 인간 항체 (가령, 인간 단클론 항체)의 이용성이 매우 바람직하다. gH, gB 그리고 UL128 및UL130 유전자 산물에 대한 일부 항체는 in vitro에서 중화 활성이 설명되어 있고[7, 10, 11], 또한 gH에 대한 항체는 임상 시험(치료 효과 부족으로 중단됨)에서 평가되었고, 지금까지 분리된 항체의 중화 효능은 중간정도다. 이들 항체에 의한 중화는 0.5 내지 20 ㎍/㎖ 범위의 항체에서 관찰되었다. 더욱이, 현행 방법은 일반적으로 표적 세포로 섬유아세포를 이용하여 항-hCMV 항체의 중화 효능을 측정한다. 그러나, hCMV는 다른 세포 타입 가령, 내피세포, 상피세포 및 백혈구를 감염시켜 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. UL128 및 UL130에 대한 공지의 항체는 내피세포 감염을 중화시키는데 매우 낮은 효능을 나타내며[7], 또한 비-섬유아세포 표적 세포의 감염을 높은 효율로 중화시킬 수 있는 이용가능한 임의의 단클론 항체는 없는 것으로 보인다.
따라서, hCMV 감염을 중화시키는, 특히 비-섬유아세포 표적 세포의 hCMV 감염을 높은 효능으로 중화시키는 항체가 필요하며, 뿐만 아니라 이와 같은 항체가 결합하는 표적을 밝힐 필요가 있다.
본 발명은 hCMV 감염을 높은 효능으로 중화시키는 신규한 항체 뿐만 아니라 본 발명의 항체가 결합하는 신규한 에피토프의 발견에 일부 근거한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 hCMV를 중화시키는데 높은 효능을 가진 항체 및 이의 항원 결합 단편들을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 hCMV UL128 단백질내 에피토프에 결합하는 단클론 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130, hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A, 또는 hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상보적 결정 부위 (“CDR”) 서열을 포함하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 서열은 서열 번호 188-193, 204, 205, 210, 174-177, 149, 178, 65-70, 81-86, 97-102, 129-134, 145-150, 113, 161-164, 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 또는 114-118 중 어느 하나에 최소 95% 서열 상동성을 가지며, 이때 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 188, 174, 65, 81, 97, 129, 145, 113, 1, 17, 33, 및 49로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열 번호 189, 204, 175, 66, 82, 98, 130, 146, 161, 2, 2, 18, 34, 50, 및 114로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 및 서열 번호 190, 205, 210, 176, 67, 83, 99, 131, 147, 162, 3, 19, 35, 51, 및 115로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3를 포함하며, 여기서, 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 이는 서열 번호 191, 177, 68, 84, 100, 132, 148 163, 4, 20, 36, 52, 및 116으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열 번호 192, 149, 69, 85, 101, 133, 5, 21, 37, 53, 및 117로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2, 그리고 서열 번호 193, 178, 70, 86, 102, 134, 150, 164, 6, 22, 38, 54, 및 118로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3를 포함하며, 여기서, 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서, 항체는 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하고; 또는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하며, 또한 여기서 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다.
본 발명의 추가 구체예에서, 본 발명은 내피세포, 상피세포, 망막 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 섬유아세포, 또는 간엽 기질 세포의 감염을 hCMV의 임상 분리체에 의해 중화시키는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서, hCMV의 90% 중화에 요구되는 항체의 농도는 1.2㎍/㎖ 또는 그 미만이 된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 내피세포, 상피세포 망막 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 섬유아세포, 또는 간엽 기질 세포의 감염을 hCMV의 임상 분리체를 이용하여 중화시키는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서, hCMV의 90% 중화에 요구되는 항체의 농도는 10 ㎍/㎖ 또는 그 미만이 되며, 여기서, 상기 항체는 MSL-109 또는 8F9는 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 이는 서열 번호 216-221, 232-235, 149, 236, 246-251, 278-283, 296-301, 312, 316-321, 332, 336-341, 352, 360, 361 또는 262-267 중 어느 하나에 적어도 95% 서열 상동성에서 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하며, 여기서, 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 이는 서열 번호 216, 232, 246, 278, 296, 316, 336, 352, 360 및 262으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1, 서열 번호 217, 233, 247, 279, 297, 312, 317, 337 및 263으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 그리고 서열 번호 218, 234, 248, 280, 298, 318, 332, 338, 및 264으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하며, 여기서, 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 이는 서열 번호 219, 235, 249, 281 , 299, 319, 339 및 265로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열 번호 220, 149, 250, 282, 300 320, 340 및 266으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2 및 서열 번호 221, 236, 251, 283, 301, 321, 341, 361 및 267으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하며, 여기서, 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서 상기 항체는 서열번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위및 서열번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 290의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 291의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 294의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 291의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 328의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 348의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 291의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 367의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 368의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하거나; 또는 서열번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위 및 서열번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하며, 또한 여기서, 상기 항체는 hCMV 감염을 중화시킨다.
본 발명은 불사화된 B 세포 클론 8I21, 2C12, 8C15, 4N10, 11B12, 3G16, 4H9, 6B4, 10C6, 또는 6L3 (2008년 7월 9일자로 부다페스트 조약에 의거하여 Advanced Biotechnology Center ( ABC ), Largo Rossana Bcnzi 10, 16132 Genoa ( Italy )에 기탁됨, 차례로 기탁번호 PD 08005, PD 08007, PD 08006, PD 08009, PD 08011, PD 08012, PD 08013, PD 08004, PD 08014, 및 PD 08010) 및 불사화된 B 세포 클론 7H3 (2008년 7월 16일자로 기탁됨, 기탁번호 PD 08017)에 의해 만들어진, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함한다. 기탁된 불사화된 B 세포로부터 발현되는 것과 동일한 아미노산 서열을 가지는 항체 및 이의 항원 결합 단편도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 hCMV 감염을 중화시키는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 발현시키는 세포를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프를 포함하는 분리 또는 정제된 면역원성 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 및 약리학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 포함한다. 본 발명은 또한 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 포함하는데, 여기서, 상기 제1 항체는 본 발명의 항체이며, 또한 제2 항체는 hCMV 감염을 중화시키는 항체다.
(i) hCMV 감염을 치료하기 위한 약물 제조, (ii) 백신, 또는 (ⅲ) hCMV 감염을 진단하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명의 핵산, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도도 또한 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 더욱이, 백신의 항원이 정확한 형태의 특정 에피토프를 포함하는지를 체크 함으로써 항-hCMV 백신의 품질을 모니터하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편의 용도도 또한 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 치료법, (ii) hCMV 감염 치료용 약물 제조, (iii) 백신, 또는 (iv) hCMV 감염을 중화시킬 수 있는 리간드를 스크리닝하는데 사용되는 본 발명의 임의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함한다.
도 1는 대표적인 단클론 항체 (15D8, 2C12 및 8I21)에 의해 hCMV UL128, UL130, UL131A, gH 및 gL 유전자, 단독 또는 상이한 조합이 형질감염된 HEK293T 세포를 나타낸다.
도 2는 크로스-경쟁 실험을 나타내는데, 여기서, hCMV gH로 형질감염된 HEK293T 세포(도 2A) 또는 gB 유전자로 형질감염된 HEK293T 세포(도 2B)를 라벨안된 경쟁 항체와 함께 항온처리하고(incubated), 이어서 바이오티닐화된 항-gH 또는 항-gB 항체로 착색시켰다.
도 3은 야생형 VR1814 UL128 유전자를 발현시키는 HEK293T 세포 또는 인간 단클론 항체 15D8 및 비-경쟁적 항-UL128 마우스 단클론 항체에 의해 범돌연변이된(pan-mutated) UL128 유전자를 발현시키는 HEK293T 세포의 착색을 나타낸다. 범돌연변이된 UL128 유전자는 다른 임상 분리체 및 hCMV의 실험실 균주에서 설명되는 공지의 변이체를 가진 야생형 VR 1814 서열의 치환체를 포함한다.
본 발명은 hCMV 감염을 높은 효능으로 중화시키는 신규한 항체 뿐만 아니라 본 발명의 항체가 결합하는 신규한 에피토프의 발견에 일부 근거한다. 이와 같은 항체는 주어진 양의 바이러스를 중화시키는데 매우 낮은 농도를 필요로 하기 때문에 바람직하다. 적은 양의 항체를 투여하면서 높은 보호수준을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 hCMV 감염의 중화에서 고효능을 가지는 중화 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 인간 단클론 항체 및 이와 같은 항체를 분비하는 불사화된 B 세포 클론도 본 발명의 범위내에 포함된다.
여기에서 사용되는 용어 "단편," "항원 결합 단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fab Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 사용되는 용어 "고효능(high potency)"은 약 2 ㎍/㎖ 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭할 때 이용된다(즉, hCMV의 임상 분리체의 90% 중화에 요구되는 항체의 농도는 약 2㎍/㎖ 또는 그 미만이다. 예를 들면, 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 또는 1.05 ㎍/㎖ 또는 그 미만). 한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 ㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90(즉, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.01 ㎍/㎖ 또는 그 미만)을 가진다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.16 ㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90(예를 들면, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002 ㎍/㎖ 또는 그 미만)을 가진다. 또 다른 구체예에서, 항체는 0.016 ㎍/㎖ 또는 그 미만(예를 들면, 0.015, 0.013, 0.01, 0.008, 0.005, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만)의 농도에서 hCMV 감염을 중화시킬 수 있다. 이것은 동일한 역가의 hCMV를 중화시키는데 요구되는 공지의 항체, 예를 들면, MSL-109, 8F9 또는 3E3의 농도와 비교하였을 때, in vitro에서 hCMV 임상 분리체의 90% 중화를 위하여 매우 낮은 항체의 농도가 요구된다는 것을 의미한다. 효능은 본 발명 기술 분야에 공지된 표준 중화 분석을 이용하여 측정할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 항체는, 예를 들면, hCMV UL 128 단백질 내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130 단백질 내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, hCMV 단백질 UL128, UL130, 및 UL131A 단백질 내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, hCMV 단백질 UL130, 및 UL131A 단백질내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, hCMV gH 단백질 내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, hCMV gB 단백질 내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면,hCMV 단백질 gM 및 gN 단백질내에 에피토프에 결합되며, 또한 약 2 ㎍/㎖ 미만, 예를 들면 1.9, 1.8, 1.75, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.25, 1.2, 1.15, 1.1, 1.05, 1, 0.95, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002, 0.001, 0.0005㎍/㎖ 또는 그 미만의 IC90으로 hCMV 감염을 중화시키는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 항체
본 발명은 hCMV의 중화에 특히 고효능을 가지는 항체를 제공한다. 여기에서 사용된 것과 같이, "중화시키는 항체"는 숙주에서 감염을 시작하기 위하여 또는 영속시키기 위하여 병원체, 예를 들면 hCMV의 능력을 방해, 감소, 지체 또는 간섭시키는 것이다. 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편들은 몇 가지 종류의 세포에서 hCMV 감염을 중화시킬 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 상피세포, 망막 세포, 내피세포, 골수 세포 및 수지상 세포의 감염을 중화시킨다. 본 발명의 항체는 섬유아세포 및 간엽 기질 세포의 hCMV 감염을 중화시킬 수도 있다. 이들 항체는 여기에서 설명된 것과 같이, 적절하게 조제되었을 때 예방 또는 치료제로 또는 진단 약제로 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 단클론 항체, 인간 항체, 또는 재조합 항체가 될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 단클론 항체, 예를 들면, 인간 단클론 항체다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 단편, 특히 항체의 항원-결합 활성을 보유하며 또한 hCMV 감염을 중화시키는 단편을 제공한다. 청구범위를 포함하는 명세서의 일부에서 항체 단편, 항체의 변이체 및/또는 이의 유도체를 명시적으로 언급하고 있더라도, 용어“항체” 또는 “본 발명의 항체”는 항체의 모든 부류, 즉, 항체 단편, 항체의 변이체 및 유도체를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편들은 하나 이상의 hCMV 단백질에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 단일 hCMV 단백질에 의해 또는 두 개 또는 그 이상의 hCMV 단백질의 조합에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있다. 예시적인 hCMV 단백질은 바이러스 유전자 UL55 (외피 당단백질 B, “gB”), UL75 (외피 당단백질 H, “gH”), UL1OO (당단백질 M,“gM”), UL73 (당단백질 N, “gN”), ULl15 (당단백질 L,“gL”), UL74 (당단백질 O, “gO”), UL128 (당단백질 UL128, "UL128"), UL130 (당단백질 UL130, "UL130") 또는 UL131A (당단백질 UL131A, "UL131A")를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일 hCMV 단백질에 의해 형성된 에피토프에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 2개, 3개, 또는 그 이상의 hCMV 단백질의 조합에 의해 형성된 에피토프에 결합한다.
예시적인 구체예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함하는데, 이들은 hCMV 단백질 UL128내의 에피토프에 결합하거나 또는 hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하거나, 또는 hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하거나, 또는 hCMV 단백질 gH, gL, UL128, 및 UL130에 의해 형성된 에피토프에 결합하거나, 또는 hCMV 단백질 gH내 에피토프에 결합하거나, 또는 hCMV 단백질 gB내 에피토프에 결합하거나 또는 hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 본 발명은 UL128내 에피토프에 결합하는 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프는 에피토프가 UL130 및 UL131A 단백질에 의해 형성될 수 있거나 또는 이들 두 단백질중 하나에 의해 형성될 수 있으며, 다른 단백질의 존재가 항체 결합에 필수적이라는 것을 의미한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프는 상기 에피토프가 세 가지 단백질 모두(UL128, UL130 및 UL131A)에 의해 형성될 수 있거나 또는 하나 또는 그 이상의 단백질에 의해 형성될 수 있으며, 다른 단백질의 존재가 항체 결합에 필수적이라는 것을 의미한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 gH, gL, UL128, 및 UL130에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, gH, gL, UL128, 및 UL130에 의해 형성된 에피토프는 상기 에피토프가 네 가지 단백질(gH, gL, UL128, 및 UL130) 모두에 의해 형성될 수 있거나 또는 하나 또는 그 이상의 단백질에 의해 형성될 수 있으며, 다른 단백질의 존재가 항체 결합에 필수적이라는 것을 의미한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, gM 및 gN 모두에 의해 형성된 에피토프는 상기 에피토프가 gM 및 gN 모두에 의해 형성될 수 있거나 또는 두 단백질 중 하나에 의해 형성될 수 있으며, 다른 단백질의 존재가 항체 결합에 필수적이라는 것을 의미한다.
본 발명의 몇 가지 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 서열, 각각은 중쇄 상에 세 개의 CDR 및 경쇄 상에 세 개의 CDR을 포함하는 것으로 결정되었다. CDR 아미노산의 위치는 IMGT 넘버링 시스템[12, 13, 14]에 따라 정의된다. CDR, 중쇄, 경쇄의 서열 뿐만 아니라, CDR, 경쇄, 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자의 서열은 서열 목록에 기술되어 있다. 표 1은 본 발명의 예시적인 항체의 6가지 CDR의 서열에 대한 서열 번호를 제공한다. 표 2 및 3은 차례로 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 서열 번호를 제공하며, 표 4는 항체의 CDR, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자의 서열에 대한 서열 번호를 제공한다.
[표 1]
Figure 112011005757909-pct00001

[표 2]
Figure 112011005757909-pct00002

[표 3]
Figure 112011005757909-pct00003

[표 4]
Figure 112011005757909-pct00004

한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본 발명의 예시적인 항체의 하나 또는 그 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 서열 번호: 188-193, 204-205, 210, 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 113-118, 65-70, 81-86, 97-102, 129-134, 145-150, 174-178, 및 161-164로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 188-190, 204, 205, 210, 1-3, 17-19, 33-35, 49-51, 113-115, 65-67, 81-83, 97-99, 129-131, 145-147, 174-176, 161 또는 162중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 중쇄 CDRH1에 대해 서열번호:188, CDRH2에 대해 서열 번호 189, CDRH3에 대해 서열 번호: 190; CDRH1에 대해 서열 번호:188, CDRH2에 대해 서열 번호: 204, CDRH3에 대해 서열 번호 205; CDRH1에 대해 서열 번호 188, CDRH2에 대해 서열 번호: 189, CDRH3에 대해 서열번호 210; CDRH1에 대해 서열 번호:1, CDRH2에 대해 서열 번호: 2, CDRH3에 대해 서열 번호: 3, CDRH1에 대해 서열 번호:17, CDRH2에 대해 서열 번호:18, CDRH3에 대해 서열 번호: 19, CDRH1에 대해 서열 번호:33, CDRH2에 대해 서열 번호:34, CDRH3에 대해 서열 번호:35, CHRH1에 대해 서열 번호:49, CHRH2에 대해 서열 번호:50, CDRH3에 대해 서열 번호:51, CDRH1에 대해 서열 번호:113, CDRH2에 대해 서열 번호:114, CDRH3에 대해 서열 번호:115, CDRH1에 대해 서열 번호:65, CDRH2에 대해 서열 번호:66, CDRH3에 대해 서열 번호:67; CDRH1에 대해 서열 번호:81, CDRH2에 대해 서열 번호:82, CDRH3에 대해 서열 번호:83, CDRH1에 대해 서열 번호:97, CDRH2에 대해 서열 번호:98, CDRH3에 대해 서열 번호:99, CDRH1에 대해 서열 번호:129, CDRH2에 대해 서열 번호:130, CDRH3에 대해 서열 번호:131, CDRH1에 대해 서열 번호:145, CDRH2에 대해 서열 번호:146, CDRH3에 대해 서열 번호:147, CDRH1에 대해 서열 번호:174, CDRH2에 대해 서열 번호:175, CDRH3에 대해 서열 번호:176, 그리고 CDRH1에 대해 서열 번호:113, CDRH2에 대해 서열 번호:161, CDRH3에 대해 서열 번호:162을 포함하는 중쇄를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 191-193, 4-6, 20-22, 36-38, 52-54, 116-118, 68-70, 84-86, 100-102, 132-134, 148-150, 177, 178, 163, 또는 164중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 CDRL1에 대해 서열 번호:191, CDRL2에 대해 서열 번호:192, CDRL3에 대해 서열 번호:193, CDRL1에 대해 서열 번호:4, CDRL2에 대해 서열 번호:5, CDRL3에 대해 서열 번호:6, CDRL1에 대해 서열 번호:20, CDRL2에 대해 서열 번호:21, CDRL3에 대해 서열 번호:22, CDRL1에 대해 서열 번호:36, CDRL2에 대해 서열 번호:37, CDRL3에 대해 서열 번호:38, CDRL1에 대해 서열 번호:52, CDRL2에 대해 서열 번호:53, CDRL3에 대해 서열 번호:54, CDRL1에 대해 서열 번호:116, CDRL2에 대해 서열 번호:117, CDRL3에 대해 서열 번호:118, CDRL1에 대해 서열 번호:68, CDRL2에 대해 서열 번호:69, CDRL3에 대해 서열 번호:70, CDRL1에 대해 서열 번호:84, CDRL2에 대해 서열 번호:85, CDRL3에 대해 서열 번호:86, CDRL1에 대해 서열 번호:100, CDRL2에 대해 서열 번호:101, CDRL3에 대해 서열 번호:102, CDRL1에 대해 서열 번호:132, CDRL2에 대해 서열 번호:133, CDRL3에 대해 서열 번호:134, CDRL1에 대해 서열 번호:148, CDRL2에 대해 서열 번호:149, CDRL3에 대해 서열 번호:150, CDRL1에 대해 서열 번호:177, CDRL2에 대해 서열 번호:149, CDRL3에 대해 서열 번호:178, CDRL1에 대해 서열 번호:163, CDRL2에 대해 서열 번호:149, 그리고 CDRL3에 대해 서열 번호:164를 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 200, 208, 212, 13, 29, 45, 61, 125, 77, 93, 109, 141, 157, 184, 또는 170의 서열과 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하고, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 항체는 hCMV UL128 단백질내 에피토프에 결합하고, 서열 번호 200, 208 또는 212의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 200, 208 또는 212에 인용된 서열을 가지는 중쇄를 포함하고, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 서열 번호: 13, 29, 45, 61 또는 125의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 13, 29, 45, 61 또는 125에 열거된 서열을 가지는 중쇄를 포함하고, 그리고 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 서열 번호: 77, 93, 109, 141, 157, 또는 170의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하고, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 77, 93, 109, 141, 157, 또는 170에 열거된 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
추가 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 184의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하고, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 184에 열거된 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 201, 213, 14, 30, 46, 62, 126, 78, 94, 110, 142, 158, 185, 또는 171의 아미노산 서열과 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
한 구체예에서, 상기 항체는 hCMV UL128 단백질내 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 201 또는 213의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 201 또는 213에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
한 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 14, 30, 46, 62 또는 126에 열거된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 14, 30, 46, 62 또는 126에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 서열 번호: 78, 94, 110, 142, 158, 또는 171의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 78, 94, 110, 142, 158, 또는 171에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
추가 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 18의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 185에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본 발명의 예시적인 항체의 하나 또는 그 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 서열 번호: 316-321, 332, 336-341, 278-283, 352, 296-301, 312, 232-236, 149, 216-221, 246-251, 360, 361 및 262-267로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 316-318, 332, 336-338, 278- 280, 352, 296-298, 312, 232-234, 216-218, 246-248, 360, 361 및 262-264의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 CDRH1에 대한 서열 번호: 316, CDRH2에 대한 서열 번호: 317, CDRH3에 대한 서열 번호: 318; CDRH1에 대한 서열 번호: 316, CDRH2에 대한 서열 번호: 317, 그리고 CDRH3에 대한 서열 번호: 332; CDRH1에 대한 서열 번호: 336, CDRH2에 대한 서열 번호: 337, CDRH3에 대한 서열 번호: 338; CDRH1에 대한 서열 번호: 278, CDRH2에 대한 서열 번호: 279, CDRHS에 대한 서열 번호: 280; CDRH1에 대한 서열 번호: 352, CDRH2에 대한 서열 번호: 279, CDRH3에 대한 서열 번호: 280; CDRH1에 대한 서열 번호: 296, CDRH2에 대한 서열 번호: 297, CDRH3에 대한 서열 번호: 298; CDRH1에 대한 서열 번호: 296, CDRH2에 대한 서열 번호: 312, CDRH3에 대한 서열 번호: 298; CDRH1에 대한 서열 번호: 232, CDRH2에 대한 서열 번호: 233, CDRH3에 대한 서열 번호: 234; CDRH1에 대한 서열 번호: 216, CDRH2에 대한 서열 번호: 217, CDRH3에 대한 서열 번호: 218; CDRH1에 대한 서열 번호: 246, CDRH2에 대한 서열 번호: 247, CDRH3에 대한 서열 번호: 248; 및 CDRH1에 대한 서열 번호: 360, CDRH2에 대한 서열 번호: 279, CDRH3에 대한 서열 번호: 280; 및 CDRH1에 대한 서열 번호: 262, CDRH2에 대한 서열 번호: 263, CDRH3 에 대한 서열 번호: 264을 포함하는 중쇄를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 319-321, 339-341, 281-283, 299-301, 149, 235, 236, 219-221, 249-251, 265-267 중 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 CDRL1에 대한 서열 번호:319, CDRL2에 대한 서열 번호:320, CDRL3에 대한 서열 번호:321; CDRL1에 대한 서열 번호:339, CDRL2에 대한 서열 번호:340, CDRL3에 대한 서열 번호:341; CDRLl에 대한 서열 번호:281, CDRL2에 대한 서열 번호:282, CDRL3에 대한 서열 번호:283; CDRL1에 대한 서열 번호:299, CDRL2에 대한 서열 번호:300, CDRL3에 대한 서열 번호:301; CDRL1에 대한 서열 번호:235, CDRL2에 대한 서열 번호:149, CDRL3에 대한 서열 번호:236; CDRL1에 대한 서열 번호:219, CDRL2에 대한 서열 번호:220, CDRL3에 대한 서열 번호:221; CDRL1에 대한 서열 번호:249, CDRL2에 대한 서열 번호:250, CDRL3에 대한 서열 번호:251; 및 CDRL1에 대한 서열 번호:281, CDRL2에 대한 서열 번호:282, CDRL3에 대한 서열 번호:361; 및 CDRL1에 대한 서열 번호:265, CDRL2에 대한 서열 번호:266, CDRL3에 대한 서열 번호:267을 포함하는 경쇄를 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 328, 334, 348, 290, 294, 357, 308, 314, 242, 228, 258, 367 또는 274의 아미노산 서열과 적어도 70% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 항체는 hCMV gB 단백질 내 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호 328, 334, 348, 290, 294, 308, 357, 314 또는 367의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 328, 334, 348, 290, 294, 308, 357, 314 또는 367에 열거된 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV gH 단백질 내 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 242, 228, 또는 258의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호 242, 228, 또는 258에 열거된 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 274의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 274에 열거된 서열을 가지는 중쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 329, 349, 291, 309, 243, 229, 259, 368 또는 275의 아미노산 서열에 적어도 70% 상동성을 가지는 아미노산을 가진 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
한 구체예에서, 상기 항체는 hCMV gB 단백질내 에피토프에 결합하고, 그리고 서열 번호: 329, 349, 291, 309, 또는 368의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 329, 349, 291, 309 또는 368에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV gH 단백질내 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 243, 229, 또는 259의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 243, 229, 또는 259에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 상기 항체는 hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합하고, 또한 서열 번호: 275의 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 아미노산 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 번호: 275에 열거된 서열을 가지는 경쇄를 포함하며, 또한 hCMV 감염을 중화시킨다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 MSL-109, 8F9, 3E3 또는 R551A가 아니다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 미국특허출원 제11/969,104호 및 제12/174,568호에 개시되어 있는 1F11, 2F4, 5A2 또는 6G4가 아니다.
본 발명의 예시적인 항체는 15D8, 4N10, 10F7, 10P3, 4122, 8L13, 2C12, 8C15, 916, 7B13, 8J16, 8121, 7113, 7H3, 6B4, 5F1, 10C6, 4H9, 2B11, 11B12, 13H11, 3G16 및 6L3를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
hCMV 감염을 중화시키는 15D8의 변이체들은 서열 번호: 208 ("15D8 변이체 1"), 및 서열 번호 212 ("15D8 변이체 2")에 열거된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 변이체, 및 서열 번호: 213 (15D8 변이체 2)에 열거된 아미노산 서열을 가지는 경쇄로 구성된다. 변이체 중쇄 변이체를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호:209 (15D8 변이체 1) 및 서열 번호:214 (15D8 변이체 2)에 열거된다. 변이체 경쇄를 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 215(15D8 변이체 2)에 열거된다. 따라서, hCMV 감염을 중화시키는, 15D8 변이체 중쇄(서열 번호: 208, 212) 및 변이체 경쇄 (서열 번호: 213)를 포함하는 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.
여기에서 사용되는 용어 "15D8"은 hCMV 감염을 중화시키는 15D8의 임의의 및/또는 모든 변이체들, 예를 들면, 서열 번호: 208 및 212에 대응하는 중쇄 및 서열 번호: 213에 대응하는 경쇄를 가진 항체를 언급하기 위하여 사용된다.
hCMV 감염을 중화시키는 7H3 변이체는 서열 번호: 334 ("7H3 변이체 1")에 열거된 아미노산 서열을 가지는 중쇄로 구성된다. 변이체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 335에 열거되어 있다. 따라서, hCMV 감염을 중화시키는 7H3 변이체 중쇄 (서열 번호: 334)를 포함하는 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.
여기에서 사용되는 용어“7H3”는 hCMV 감염을 중화시키는 7H3의 임의의 및/또는 모든 변이체, 예를 들면, 서열 번호: 334에 대응하는 중쇄를 가진 변이체를 언급하기 위하여 사용된다.
hCMV 감염을 중화시키는 5F1 변이체는 서열 번호: 294 에 열거된 아미노산 서열을 가진 중쇄로 구성된다(“5F1 변이체 1”). 변이체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 295에 열거된다. 따라서, hCMV 감염을 중화시키는 5F1 변이체 중쇄 (서열 번호 294)를 포함하는 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.
여기에서 사용되는 용어“5F1”은 hCMV 감염을 중화시키는 5F1의 임의의 및/또는 모든 변이체, 예를 들면, 서열 번호: 294에 대응하는 중쇄를 가진 변이체를 언급하기 위하여 사용된다.
hCMV 감염을 중화시키는 4H9의 변이체는 서열 번호: 314에 열거된 아미노산 서열을 가지는 중쇄로 구성된다(“4H9 변이체 1”). 변이체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 315에 열거된다. 따라서, hCMV 감염을 중화시키는 4H9 변이체 중쇄 (서열 번호: 314)를 포함하는 항체도 본원 발명의 범위에 포함된다.
여기에서 사용되는 용어“4H9”는 hCMV 감염을 중화시키는 4H9의 임의의 및/또는 모든 변이체, 예를 들면, 서열 번호: 314에 대응하는 중쇄를 가진 변이체를 언급하기 위하여 사용된다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 15D8의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 15D8 변이체 1의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 15D8 변이체 2의 모든 CDR를 포함하고, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 8I21 변이체 2의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 4N10의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 10F7의 모든 CDR를 포함하고, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 10P3의 모든 CDR를 포함하고, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 4I22의 모든 CDR를 포함하고, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 8L13의 모든 CDR를 포함하고, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 2C12의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 8C15의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 9I6의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 7B13의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 8J16의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 7I13의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 7H3의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 7H3 변이체 1의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 6B4의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 5F1의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 10C6의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 4H9의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 4H9 변이체 1의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 2B11의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 11B12의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 13H11의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 3G16의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 항체 6L3의 모든 CDR를 포함하며, 또한 인간 숙주에서 hCMV 감염을 중화시킨다.
본 발명은 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 또는 본 발명의 항체와 경쟁하는 항체를 더 포함한다
본 발명의 항체는 또한 본 발명의 항체로부터 하나 또는 그 이상의 CDR과 동일한 에피토프에 대한 또 다른 항체로부터 하나 또는 그 이상 CDR을 포함하는 하이브리드 항체 분자도 포함한다. 한 구체예에서, 이와 같은 하이브리드 항체는 본 발명의 항체로부터 세 개 CDR과 동일한 에피토프에 대한 또 다른 항체로부터 세 개 CDR을 포함한다. 예시적인 하이브리드 항체는 i)본 발명의 항체로부터 세 개 경쇄 CDR, 및 동일한 에피토프에 대한 또 다른 항체로부터 세 개의 중쇄 CDR, 또는 ii) 본 발명의 항체로부터 세 개 중쇄 CDR과 동일한 에피토프에 대한 또 다른 항체로부터 세 개의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 모든 경쇄 및 중쇄 CDR의 일부 또는 전부를 인코딩하는 핵산 서열도 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR를 인코드하는 핵산 서열을 가진다. 예를 들면, 본 발명에 따른 핵산 서열은 서열 번호: 7-12, 15, 16, 23-28, 31, 32, 39-44, 47, 48, 55-60, 63, 64, 71-76, 79, 80, 87-92, 95, 96, 103-108, 111, 112, 119-124, 127, 128, 135-140, 143, 144, 151-156, 159, 160, 165-169, 172, 173, 179-183, 186, 187, 194-199, 202, 203, 206, 207, 209, 211, 214, 215, 222-227, 210, 231, 237 241, 244, 245, 252 257, 260, 261, 268-273, 276, 277, 284 289, 292, 293, 295, 302-307, 310, 311, 313, 315, 322-327, 330, 331, 333, 335, 342-347, 350, 351, 353-356, 358, 359, 362-364, 365, 366, 369 및 370의 핵산 서열에 적어도 75% 상동성인 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 상기 열거된 서열 번호의 핵산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 서열을 포함한다.
유전자 코드의 중복성(redundancy)으로 인하여, 이들 서열의 변이체는 동일한 아미노산 서열을 인코드할 것이다. 이들 변이체들도 본 발명의 범위내에 포함된다.
hCMV 감염을 중화시키는 변이체 항체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 출원에 언급된 서열의 변이체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 이와 같은 변이체들은 면역 반응 동안 in vivo 체세포 돌연변이 또는 불사화된 B 세포 클론 배양시 in vitro에서 생성된 천연 변이체를 포함한다. 대안으로, 변이체들은 상기 언급된 것과 같이 유전자 코드의 축중(degeneracy)로 인하여 발생되거나 또는 전사 또는 해독시 오류로 인하여 생성될 수도 있다.
개선된 친화성 및/또는 효능을 가지는 항체 서열의 추가 변이체는 본 발명 분야에 공지된 방법들에 의해 수득될 수 있며, 또한 이는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, 더욱 개선된 친화성을 가지는 항체를 수득하기 위하여 아미노산 치환이 이용될 수 있다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화를 이용하여 항체 생산을 위한 발현계에 해독 효능을 개선할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 핵산 서열에 직접적인 진화 방법을 적용시켜 항체 특이성 또는 중화 활성에 최적화된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
한 구체예에서, hCMV 감염을 중화시키는 변이체 항체 서열은 본 출원에 언급된 서열과 70% 또는 그 이상 (예를 들면, 75%, 80%, 85% 90% 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 아미노산 서열 상동성을 공유할 수 있다. 일부 구체예에서, 이와 같은 서열 상동성은 기준 서열(예, 본 출원에 언급된 서열)의 전장에 대해 계산된다. 일부 추가 구체예에서, 여기에서 언급된 상동성 비율은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)가 명시된 디폴트 변수들을 이용하여 BLAST 버전 2.1.3을 이용하여 결정된다[Blosum 62 매트릭스, 갭 개방 페널티=11 및 갭 연장 페널티=1].
본 발명의 범위에는 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터도 포함된다. 이와 같은 벡터로 형질변환된 세포 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이와 같은 세포의 예로는 진핵 세포, 예를 들면, 이스트 세포, 동물 세포 또는 식물 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 세포는 포유류, 예를 들어 인간, CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, 골수종 또는 하이브리도마 세포가 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 에피토프에 결합되는 단클론 항체에 관한 것으로, 15D8, 4N10, 10F7, 10P3, 4I22, 8L13 2C12, 8C15 9I6 7B13, 8J16, 8I21, 7I13, 7H3, 6B4, 5F1, 10C6, 4H9, 11B12, 13H11, 3G16, 2B11 및 6L3으로 구성된 군으로부터 선택된 단클론 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
단클론 항체 및 재조합 항체들은 개별 폴리펩티드 또는 이에 대한 기타 항원의 동정 및 정제에 특히 유용하다. 본 발명의 항체는 면역학적 측정, 방사능면역분석(RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착분석(ELISA)에서 시약으로 이용될 수 있는 추가 용도를 가진다. 이들 용도에서, 항체는 분석학적으로-감지가능한 시약 가령, 방사능 동위원소, 형광 분자 또는 효소로 라벨될 수 있다. 항체는 또한 분자 동정 및 항원의 특징화(에피토프 메핑)에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 치료 부위로 운반되는 약물에 결합되거나 또는 감지가능한 라벨에 결합되어, 관심 세포를 포함하는 부위, 예를 들면, hCMV로 감염된 세포의 영상화를 실행할 수 있다. 항체를 약물 및 감지가능한 라벨에 결합시키는 방법들은 감지가능한 라벨을 이용한 영상화 방법으로 당해 분야에 공지되어 있다. 라벨된 항체는 다양한 라벨을 이용하는 다양한 분석에 이용될 수 있다. 본 발명의 항체와 관심 에피토프(hCMV 에피토프) 사이에 항체-항원 복합체의 형성은 항체에 감지가능한 물질을 부착시켜 수행할 수 있다. 적합한 탐지 수단은 방사능 핵종 효소, 코엔자임, 형광물질, 화학적 발광물질, 색원체, 효소 기질 또는 공-인자, 효소 저해물질, 보결기(prosthetic group) 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료, 및 기타 유사물질 등의 라벨을 사용하는 것을 포함한다. 적합한 효소는 양고추 냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결기 복합체는 스트렙타아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플로로레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플로로레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리틴을 포함하고; 발광 물질로는 루미놀을 포함하고; 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에퀴오린을 포함하고; 적합한 방사능 활성 물질예는 123I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다. 이와 같은 라벨된 시약은 공지의 다양한 분석, 예를 들면 방사능면역분석, 효소 면역분석, 예를 들어 ELISA, 형광 면역분석 및 이와 유사한 분석에 이용될 수 있다. 예를 들면, 참고문헌 15-18을 참고.
본 발명에 따른 항체는 치료 모이어티 예를 들면 사이토톡신, 치료제 또는 방사능활성 금속 이온 또는 방사능 동위원소에 콘쥬게이트될 수 있다. 방사성 동위원소의 예로는 I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 항체 콘쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 변화시키는데 이용될 수 있고, 약물 모이어티는 통상의 화학적 치료제로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 이와 같은 단백질은 예를 들면, 톡신 가령, 아브린, 리친 A, 뉴도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 톡신을 포함할 수 있다.
항체에 이와 같은 치료 모이어티를 콘쥬게이트시키는 기술은 공지되어 있다. 예를 들면, Arnon et al (1985) " Monoclonal Antibodies for Immunotargcting of Drugs in Cancer Therapy ," in Monoclonal Antibodies and Cancel Therapy , ed . Reisfeld et al ( Alan R Liss , Inc ), pp 243-256, ed Hellstrom et al (1987) "ANntibodies for Drug Delivery ," m Controlled Drug Deliven , ed Robinson et al (2d ed , Marcel Dekker , Inc ), pp 623-653, Thorpe (1985) " Antibodies Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy A Review ," in Monoclonal Antibodies '84 Biological and Clinical Applications , ed Pinchcra et al ., pp 475-506 ( Editrtcc Kurtis , Milano , Italy , 1985), " Analysis , Results , and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibodies in Cancer Therapy ," in Monoclonal Antibodies for Cancel Detection and Therapy , ed Baldwin et al ( Academic Press , New York , 1985), pp 303-316, and Thorpe et al (1982) Immunol Rev 62 119-158.
대안으로, 항체는 참고문헌 19에서 설명된 것과 같이, 제2항체에 콘쥬게이트되어, 항체-콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 그 외에, 라벨과 본 발명의 항체 사이에 링커가 이용될 수 있다[20]. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사능활성, 요오드, 인디움, 이트리움 또는 당해 분야에 공지된 다른 방사능활성 입자로 직접적으로 라벨될 수 있다[21]. 치료는 콘쥬게이트된 및 콘쥬게이트 안된 항체를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 복합 요법으로 구성된 수 있다[22, 23].
본 발명의 항체는 고형 서포트에 부착되어 있을 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 항체, 또는 이의 기능적 항체 단편은 폴리머에 공유적 콘쥬게이트에 의해 화학적으로 변형되어 이들의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리머의 예들, 및 이를 펩티드에 부착시키는 방법은 참고문헌 24-27에 나타나 있다. 일부 구체예에서, 폴리머는 폴리옥시에틸렌된 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)으로 구성된 군으로부터 선택할 수 있다. PEG는 실온에서 물에 용해가능하며, 일반식 R(O-CH2-CH2)n-OR이며, 여기서 R은 수소결합이 되거나, 알킬 또는 알카놀과 같은 보호기가 될 수 있다. 한 구체예에서, 보호기는 1 내지 8의 탄소 원자를 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 보호기는 메틸이다. 부호 n은 양수 정수가 된다. 한 구체예에서, n은 1 내지 1,000 사이의 정수이다. 또 다른 구체예에서 n은 2 내지 500 사이의 정수이다. 한 구체예에서, PEG는 1,000 내지 40,000 사이의 평균 분자량을 가진다. 추가 구체예에서, PEG는 2,000 내지 20,000 사이의 평균 분자량을 가진다. 또 다른 구체예에서, PEG는 3,000 내지 12,000 사이의 평균 분자량을 가진다. 한 구체예에서, PEG는 적어도 하나의 하이드록시기를 가진다. 또 다른 구체예에서, PEG는 말단 하이드록시기를 가진다. 또 다른 구체예에서, 이는 저해제에 있는 자유 아미노기와 반응하여 활성화된 말단 하이드록시기가 된다. 그러나, 반응기의 타입과 그 양은 본 발명의 공유적으로 콘쥬게이트된 PEG/항체를 얻기 위해 다양하게 변화될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
수용성 폴리옥시에틸화된 폴리올 또한 본 발명에서 유용하다. 여기에는 폴리옥시에틸화된 솔비톨, 폴리옥시에틸화된 글로코즈, 폴리옥시에틸화된 글리세롤 (POG), 이와 유사한 것들이 포함된다. 한 구체예에서. POG가 이용된다. 어떠한 이론에 구애됨이 없이, 폴리옥시에틸화된 글리세롤의 글리세롤 기본골격은 자연적으로 생성되는, 예를 들면, 동물 및 인간에서 생성되는 모노-, 디-, 트리글리세리드와 동일한 기본골격이기 때문에, 이와 같은 분지는 체내에서 외부 이물질로 나타나지 않을 것이다. 일부 구체예에서, POG는 PEG와 동일한 범위의 분자량을 가진다. POG의 구조는 참고문헌 28에서 나타나 있으며, 또한 POG/IL-2 콘쥬게이트에 대한 논의는 참고문헌 24에서 발견된다.
순환 반감기를 증가시키는데 이용될 수 있는 또 다른 약물전달계는 리포좀이다. 리포좀 운반계를 준비하는 방법은 참고문헌 29, 30 및 31에서 논의된다. 기타 약물 전달계는 당해 분야에 공지되어 있고, 또한 예를 들면, 참고문헌 32 및 33에서 논의된다.
본 발명의 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 일반적으로, 항체는 기타 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재하는데, 예를 들면, 조성물의 90% 미만(중량), 통상 60% 미만, 및 좀더 통상적으로는 50% 미만이 기타 폴리펩티드로 구성된다.
본 발명의 항체는 사람이 아닌 숙주, 가령, 마우스(또는 이형성) 숙주에서 면역원성이다. 특히, 항체는 인간이 아닌 숙주에서는 면역원성이나, 인간 숙주에서는 면역원성이 아닌 이디오토프를 가질 수 있다. 인간에 대한 본 발명의 항체는 숙주 예를 들면, 마우스, 염소, 토끼, 비-영장류 포유류 등과 같은 숙주로부터 용이하게 분리될 수 없는 것과, 그리고 인간화 또는 제노 마우스(xeno-mice)로부터 일반적으로 수득되지 않는 것도 포함된다.
본 발명의 항체는 임의의 이소타입 (예를 들면, IgA, IgG, IgM 즉 α, γ 또는 μ 중쇄)가 될 수 있지만, 일반적으로 IgG가 될 것이다. IgG 이소타입 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스가 될 수 있다. 본 발명의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다.
항체의 생산
본 발명에 따른 단클론 항체는 당해 분야에 임의의 공지된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여 단클론 항체를 제조하는 일반적인 방법도 잘 공지되어 있다[34, 35]. 바람직하게는 대안적인 EBV 불사화 방법(참고문헌 36에 설명되어 있음)이 이용된다.
참고문헌 36에서 설명되어 있는 방법을 이용하여, 본 발명의 항체를 생산하는 B 세포는 다클론성 B 세포 활성화물질의 존재하에 EBV로 형질변환될 수 있다. EBV를 이용한 형질변환은 표준 기술이며, 또한 다클론성 B 세포 활성화제를 포함하도록 용이하게 개조될 수 있다.
세포 성장 및 분화의 추가 자극제가 형질변환 단계 동안에 선택적으로 추가되어, 효능을 더욱 강화시킬 수 있다. 이와 같은 자극제는 사이토킨 예를 들어, IL-2 및 IL-15가 될 수 있다. 한 측면에서, IL-2가 불사화 단계에 추가되어, 불사화 효과를 더욱 개선하지만, 반드시 사용해야 하는 것은 아니다. 이들 방법에 의해 생성된 불사화된 B 세포는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있고, 이로부터 항체가 분리된다.
본 발명의 항체는 영국특허 출원 제0819376.5호에 설명되어 있는 방법을 이용하여 마이크로웰 배양 플레이트에서 단일 혈장 세포를 배양함으로써 만들 수 있다. 더욱이, 단일 혈장 세포 배양물로부터 RNA를 추출할 수 있으며, 또한 단일 세포 PCR은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 항체의 VH 및 VL 부위는 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있고, 서열화되고, 발현 벡터 내로 클론화 한 다음, HEK293T 세포 또는 다른 숙주로 형질전환 된다. 발현 벡터 내에 핵산의 클로닝, 숙주 세포의 형질전환, 형질전환된 숙주 세포의 배양 및 생성된 항체의 분리는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 행할 수 있다.
단클론 항체는 원하는 경우, 여과, 원심분리, 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들면, HPLC 또는 친화력 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제할 수 있다. 약학-등급의 항체를 생산하는 기술을 포함하는 단클론 항체의 정제 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 단클론 항체의 단편은 예를 들면 펩신 또는 파파인 등의 효소로 절단하는 방법에 의해 , 및/또는 화학적 환원에 의해 이황화 결합의 절단에 의해 단클론 항체로부터 수득할 수 있다. 대안으로, 단클론 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄의 서열 일부를 클로닝 및 발현시켜 수득할 수 있다. 항체 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유도된 단일-쇄 Fv 단편 (scFv)을 포함하한다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 항체의 CDR를 포함하는 scFv를 포함한다. 또한, 중쇄 또는 경쇄 단량체 및 이량체 뿐만 아니라 단일 쇄 항체, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결된 단일 쇄 Fv를 포함한다.
분자생물학의 표준기술들이 이용되어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA 서열을 만들 수 있다. 바람직한 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위-직접적인 돌연변이 및 폴리메라제 쇄 반응(PCR) 기술도 적절하게 이용될 수 있다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 DNA 서열의 발현에 이용할 수 있다. 박테리아, 예를 들면, 대장균(E. coli) 및 기타 미생물 시스템은 항체 단편 예를 들어 Fab 및 F(ab')2 단편, 및 특히 Fv 단편 및 단일 쇄 항체 단편, 예를 들면, 단일 쇄 Fvs의 발현에 부분적으로 이용할 수 있다. 진핵세포, 예를 들면 포유류, 숙주 세포 발현 시스템은 완전한 항체 분자를 포함하는 더 큰 항체 분자의 생산에 이용할 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하는데 적합한 조건하에 배양시킨 다음, 항체 분자를 분리하는 단계를 포함하는,본 발명에 따른 항체 분자의 제조방법을 제공한다.
상기 항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있는데, 이 경우에 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열은 숙주 세포를 형질감염시키는데 이용될 필요가 있다. 중쇄와 경쇄를 모두 포함하는 산물을 생산하는 경우, 세포 주는 두 개 벡터로 형질감염될 수 있는데, 제1 벡터는 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하고, 또한 제2 벡터는 중쇄 폴리펩티드를 인코딩한다. 대안으로, 단일 벡터가 이용될 수도 있고, 이 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다.
대안으로, 본 발명에 따른 항체는 i) 세포에서 본 발명에 따른 핵산 서열을 발현시키고, 그리고 ii) 발현된 항체 산물을 분리함으로써 생성될 수 있다. 그 외에, 이 방법은 iii)항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
B 세포의 스크리닝 및 분리
형질변형된 B 세포는 원하는 항원 특이성의 항체를 생산하기 위하여 스크리닝할 수 있는데, 개별 B 세포 클론은 포지티브 세포로부터 생산할 수 있다.
스크리닝 단계는 ELISA, 조직 또는 세포 (형질변환된 세포 포함)의 착색, 중화 분석 또는 원하는 항원 특이성을 동정하는데 공지된 기타 다수의 방법 중 하나에 의해 수행할 수 있다. 분석은 단순한 항원 인지에 기초하여 선택할 수 있거나 또는 원하는 기능을 추가적인 근거에 의거하여 선택하여, 예를 들면, 단순한 항원-결합 항체보다는 중화 항체를 선택하거나, 표적 세포의 특징, 예를 들면, 시그날링 캐스케이드, 이들의 형상, 이들의 성장 속도, 다른 세포에 영향을 주는 이들의 능력, 다른 세포들 또는 다른 시약들 또는 조건의 변화에 의한 영향에 대한 반응, 이들의 분화 상태 등을 변화시킬 수 있는 항체를 선택할 할 수 있다.
포지티브 세포의 혼합물로부터 개별 클론을 분리시키는 클론 단계는 제한 희석, 마이크로메뉴플레이션(micromanipulation), 세포 소팅(sorting)에 의한 단일 세포 침착 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 불사화된 B 세포 클론은 다양한 방법, 예를 들면, 연구를 위한 관심의 단클론 항체를 인코딩하는 핵산 (DNA 또는 mRNA)의 근원, 단클론 항체의 근원으로 이용할 수 있다.
본 발명은 불사화된 B 메모리 세포를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서, 이 세포는 hCMV에 특이적인 높은 중화 효능을 가진 항체를 생산하며, 또한 상기 항체는 하루에 세포당 ≥5pg으로 생산된다. 본 발명은 또한 불사화된 B 메모리 세포의 클론을 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 클론은 hCMV에 특이적인 높은 중화 효능을 가진 단클론 항체를 생산하며 또한 상기 항체는 하루에 세포당≥5pg으로 생산된다. 바람직하게는 상기 클론은 hCMV 감염을 중화시키는데 고효능을 가진 단클론 항체를 생산한다.
본 발명에 따른 예시적인 불사화된 B 세포 클론은 15D8, 4N10, 10F7, 10P3, 4I22, 8L13, 2C12, 8C15, 9I6, 7B13, 8J16, 8I21, 7I13, 7H3, 6B4, 5F1, 10C6, 4H9, 11B12, 13H11, 3G16, 2B11 및 6L3를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
에피토프
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체는 이들이 결합되는 에피토프를 메핑(map)하는데 사용할 수 있다. 본 발명자들은 내피세포, 상피세포, 망막 세포 및 수지상 세포의 hCMV 감염을 중화시키는 몇 가지 항체들이 hCMV UL128 단백질 내의 에피토프, hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프, hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프, hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130, gB, gH에 의해 형성된 에피토프, 또는 hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프로 향한다는 것을 발견하였다. 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 선형(연속성) 또는 입체적(conformational)(불연속성)일 수 있으며, 또한 단일 hCMV 단백질에 의해 또는 2개, 3개 또는 그 이상의 hCMV 단백질의 조합에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프는 다수의 용도를 가질 수 있다. 정제된 또는 합성 형태의 에피토프 또는 이의 미모토프(mimotopes)는 면역 반응을 일으키는데(예를 들면, 백신으로 또는 다른 용도의 항체 생산을 위하여) 사용하거나 또는 에피토프 또는 이의 미모토프와 면역 반응하는 항체에 대해 환자 혈청을 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 이와 같은 에피토프 또는 미모토프, 또는 에피토프 또는 미모토프를 포함하는 항원은 면역 반응을 일으키는 백신으로 이용할 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 단편은 또한 백신 품질을 모니터하는 방법에 이용할 수 있다. 특히, 상기 항체는 정확한 모양의 특정 면역원성 에피토프를 포함하는 백신에서 항원을 점검하는데 이용할 수 있다.
에피토프는 또한 이 에피토프에 결합하는 리간드를 스크리닝하는데 유용할 수 있다. 이와 같은 리간드는 낙타, 상어, 및 기타 종으로부터 항체, 항체 단편, 펩티드, 파지 디스플레이 기술 산물, 압타머, 에드넥틴 또는 에피토프를 차단하여 감염을 예방할 수 있는 다른 바이러스 또는 세포 단백질의 단편을 포함하나 이에 한정되지 않은 항체를 포함한다. 이와 같은 리간드도 본 발명의 범위에 포함된다.
재조합 발현
본 발명의 불사화된 B 메모리 세포는 후속적인 재조합 발현을 위한 항체 유전자의 클로닝을 위한 핵산 원료로 이용할 수 있다. 재조합 근원으로부터 발현은 B 세포 또는 하이브리도마로부터 발현을 목적으로 하는 것보다는 약학적 목적 예를 들면 안정성, 재생산성, 배양 용이성 등에 의해 좀 더 통상적인 것이다.
따라서 본 발명은 (i) 관심 항체를 인코딩하는 B 세포 클론으로부터 하나 또는 그 이상의 핵산(예, 중쇄 및/또는 경쇄 유전자)을 수득하고, 또한 (ii) 숙주 내에서 관심 항체의 발현이 가능하도록 발현 숙주 안으로 핵산을 삽입하는 단계를 포함하는, 재조합 세포의 제조방법을 제공한다.
유사하게, 본 발명은 (i) 관심 항체를 인코딩하는 B 세포 클론으로부터 핵산을 서열화시키고, 또한 (ii) (i) 단계의 서열 정보를 이용하여, 숙주 내에서 관심 항체의 발현이 가능하도록 발현 숙주 안으로 삽입될 핵산을 준비하는 단계를 포함하는, 재조합 세포의 제조방법을 제공한다. 제한효소 부위를 도입시키기 위하여, 코돈 용도를 변화시키기 위하여, 및/또는 전사 및/또는 해독 조절 서열을 최적화시키기 위하여 (i)와 (ii) 단계 사이에서 핵산을 조작할 수 있으나 반드시 필요한 것은 아니다.
본 발명은 또한 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 숙주 세포에 소요의 단클론 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 형질도입시키는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 본 발명에 따른 불사화된 B 세포 클론으로부터 유도된 핵산이 된다. 따라서 핵산을 우선 준비하고, 이를 이용하여 숙주 세포를 형질변환시키는 과정은 상이한 장소(예, 다른 나라)에서 다른 사람들에 의해 상이한 시간대에서 수행할 수 있다.
본 발명의 이들 재조합 세포는 발현 및 배양 목적으로 이용할 수 있다. 이는 특히 대규모의 약물 생산을 위한 항체 발현에 유용하다. 또한, 약학 조성물의 활성 성분으로 이용할 수 있다. 임의의 적합한 배양 기술이 이용될 수 있는데, 정적 배양(static culture) 롤러 보틀 배양(roller bottle culture), 복수액(ascites fluid), 중공-섬유 타입 바이오리엑터 카트릿지(bioreactor cartridge), 모듈라 미니발효기(modular minifermenter), 교류 탱크(stirred tank), 마이크로캐리어 배양기(microcarrier culture), 세라믹 코어 살수(ceramic core perfusion) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
B 세포로부터 면역글로블린 유사체를 수득하고 서열화시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.(참고문헌 37)
발현 숙주는 이스트, 동물 세포, 특히 포유류 세포 (예, CHO 세포, NSO 세포, 인간 세포 예를 들면 PER.C6 [Crucell, 참고문헌 38] 또는 HKB-11 [Bayer; 참고문헌 39 및 40] 세포, 골수종 세포 [41 및 42], 등), 뿐만 아니라 식물 세포를 포함하는 진핵세포가 바람직하다. 바람직한 발현숙주는 본 발명의 항체를 글리코실화시킬 수 있는데, 특히 인간에서 면역원성이 아닌 탄수화물 구조로 글리코실화시킬 수 있다. 한 구체예에서, 발현 숙주는 무-혈청 배지에서 생장할 수 있다. 추가 구체예에서, 발현 숙주는 동물에서 유도된 산물 없이 배양물에서 성장할 수 있다. 발현 숙주는 배양하여 세포 주를 제공할 수 있다.
본 발명은 소요의 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상 핵산 분자(예, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (i) 본 발명에 따른 불사화된 B 세포 클론을 준비하고, (ii) 소요의 항체를 인코딩하는 핵산을 B 세포 클론으로부터 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명은 소요의 항체를 인코딩하는 핵산 서열을 수득하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (i) 본 발명에 따른 불사화된 B 세포 클론을 준비하고, (ii) B 세포 클론으로부터 소요의 항체를 인코딩하는 핵산을 서열화하는 단계를 포함한다.
본 발명은 소요의 항체를 인코드하는 핵산 분자를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 따른 형질변환된 B 세포로부터 수득된 B 세포 클론으로부터 핵산을 수득하는 단계를 포함한다. 따라서, B 세포 클론을 우선 수득하고, 그 다음 이로부터 핵산을 준비하는 과정은 상이한 장소(예, 다른 나라)에서 다른 사람들에 의해 상이한 시간대에서 수행할 수 있다.
본 발명은 항체 (예, 약학적 용도)를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (i) 소요의 항체를 발현시키는 선택된 B 세포 클론으로부터 하나 또는 그 이상의 핵산(예, 중쇄 및 경쇄 유전자)을 수득하고/또는 서열화시키고, (ii) 소요의 항체를 발현시키는 발현숙주를 만들기 위해 핵산을 이용하거나 삽입시키고, (iii) 소요의 항체가 발현되는 조건하에 발현 숙주를 배양 또는 2차 배양(sub-culture)시키고, 또한 선택적으로 (iv) 소요의 항체를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 항체를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 소요의 항체가 발현되는 조건하에 발현 숙주 세포 집단을 배양 또는 2차 배양시키고, 또한 선택적으로 소요의 항체를 정제하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 발현 숙주 세포 집단은 (i) 상기에서 설명된 것과 같이 준비된 메모리 림프구 집단에 의해 생성되는 소요의 항체를 인코딩하는 핵산을 제공하고 (ii) 소요의 항체를 발현시킬 수 있는 발현 숙주 내로 핵산을 삽입하고; 또한 (iii) 삽입된 핵산을 포함하는 발현 숙주를 배양 또는 2차 배양시켜, 발현 숙주 세포 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 따라서, 재조합 발현 숙주를 우선 준비하고, 이를 배양시켜 항체를 발현시키는 과정은 상이한 장소(예, 다른 나라)에서 다른 사람들에 의해 상이한 시간대에서 수행할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 예시적인 항체 4N10, 2C12, 8C15, 8I21, 6B4, 10C6, 4H9, 11B12, 3G16, 및 6L3를 발현시키는 세포주는 2008년 7월 9일자로 부다페스트 조약에 의거하여 Advanced Biotechnology Center (ABC), Largo Rossana Benzi 10, 16132 Genoa (Italy)에 기탁되었고(차례로 기탁번호 PD 08009, PD 08007, PD 08006, PD 08005, PD 08004, PD 08014, PD 08013, PD 08011, PD 08012, 및 PD 08010) 그리고 7H3을 발현시키는 불사화된 B 세포는 2008년 7월 16일자로 기탁되었다 (기탁번호 PD 08017). 상기 세포부로부터 발현된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편 뿐만 아니라, 상기 세포주로부터 발현되는 것과 동일한 아미노산 서열을 가진 항체, 그리고 이의 항원 결합 단편들도 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
이들 기탁은 당업자의 편리를 위해 제공되며 또한 이와 같은 기탁이 본 발명의 실시에 요구되는 것을 허용하지 않거나 또는 본 발명의 내용에 근거하여 당해 기술분야에서 등가의 구체예가 있지 않다는 것은 아니다. 이들 기탁물의 공적인 사용은 본 출원 또는 임의의 기타 특허하에 기탁된 물질을 만들고, 이용하거나 또는 판매하는 것을 승인하는 것은 아니다. 기탁된 물질의 핵산 서열은 본 내용의 참고문헌으로 통합되며, 여기에서 설명된 임의의 서열과 충돌된다면 조정되어야 한다.
약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 항체 및/또는 항체 단편 및/또는 이와 같은 항체를 인코딩하는 핵산 및/또는 이와 같은 항체를 발현시키는 불사화된 B 세포 및/또는 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물을 투여하기 위하여 약리학적으로 허용가능한 담체를 또한 포함할 수 있다. 담체는 조성물을 제공받은 개체에 유해한 항체 생산을 유도하거나 독성이 있어서는 안된다. 적합한 담체는 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 비활성 바이러스 입자가 될 수 있다.
약리학적으로 허용가능한 염이 이용될 수 있는데, 예를 들면 미네랄산염, 예를 들면, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염 또는 유기산 염 예를 들면 아세테이트, 프로피오네이트 말로네이트 및 벤조에이트가 이용될 수 있다.
치료학적 조성물 내에 약리학적으로 허용가능한 담체는 추가로 액체 예를 들면 물, 염, 글리세롤 및 에탄올을 포함한다. 그 외에, 보조 물질 예를 들면 가습제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 조성물에 존재할 수 있다. 이와 같은 담체는 약학적 조성물을 환자가 복용하도록 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 조제될 수 있도록 한다.
본 발명의 범위 내에서, 투약 형태는 비경구 투여를 위해 적합한 형태, 예를 들면, 주사 또는 주입, 예를 들면, 정맥 주사 또는 연속 주입에 적합한 형태를 포함할 수 있다. 산물이 주사 또는 주입을 위한 경우, 오일 또는 수용성 비이클(vehicle) 내에 현택액, 용액, 에멸젼의 형태를 취할 수 있고, 예를 들면, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형이 포함될 수 있다. 대안으로, 항체 분자는 사용 전 적절한 멸균 액체로 재구성할 수 있도록 건조된 형태가 될 수도 있다.
일단 조제되면, 본 발명의 조성물은 개체에 직접 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 본 조성물은 인간에게 투여하기에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물은 임의의 다수의 경로, 경구, 정맥, 근육, 동맥내, 수질내, 복강내, 척추내, 심실내, 경피, 진피를 통하여, 경피, 국소, 피하, 비강, 장, 혀아래, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 경로를 통하여 바로 투여될 수 있다. 하이포스프레이(Hyposprays)를 이용하여 본 발명의 약학적 조성물을 투여할 수 있다. 일반적으로, 치료학적 조성물은 주사용으로 액체 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있다. 주사 전에 액체 비이클내에 용액에 적절한 또는 현탁액에 적절한 고형 제형으로 제조할 수도 있다.
본 조성물의 직접적인 운반은 피하, 복강, 정맥 또는 근육으로 주사에 의해 수행할 수 있거나 또는 조직의 세포 사이의 공간으로 운반될 수도 있다. 본 조성물은 또한 병소로 투여할 수도 있다. 치료 투약량은 단약 투약량 스케줄 또는 다중 투약량 스케줄이 될 수 있다. 공지의 항체 기본 제약은 투여 빈도에 대한 지침을 제공하는데, 예를 들면, 약물이 매일, 주 단위, 월 단위로 제공되어야 하는지에 대한 지침이 제공된다. 빈도 및 투약량은 증상의 중증도에 따라 달라질 수도 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 조제될 수 있다. 예를 들면, 본 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 주사액으로 제조될 수 있다. 주사전 액체 비이클에 용액 또는 현탁액에 적합한 고형이 준비될 수도 있다(예를 들면, 보존제를 포함하는 멸균수로 재구성시키기 위한 동결건조된 조성물 예를 들면, Synagis™ 및 Herceptm™) 조성물은 국소 투여용으로 준비될 수 있는데, 예를 들면, 연고, 크림 또는 분말로 준비될 수 있다. 본 조성물은 경구 투여용, 예를 들면, 정제 또는 캡슐, 스프레이 또는 시럽(선택적으로 향이 첨가된)으로 제조될 수 있다. 본 조성물은 폐 투여, 예를 들면, 미세 분말 또는 스프레이를 이용한 흡입기로 투여하기 위해 조제될 수 있다. 본 조성물은 좌약 또는 질 좌약으로 조제할 수 있다. 본 조성물은 비강, 귀, 안구 투여를 위해 드롭으로 조제할 수 있다. 본 조성물은 환자에게 투여하기 전, 복합된 조성물이 재구성되도록 고안된 키트 형태가 될 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 완충액과 함께 키트에 제공할 수 있다.
본 조성물 내에 활성 성분은 항체 분자, 항체 단편 또는 이의 변이체 및 유도체가 될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 경우, 위장관에서 분해되기 쉽다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용한 경로로 투여된다면, 본 조성물은 위장관에서 항체의 분해로부터 항체를 보호하고, 위장관에 일단 흡수되면 항체를 방출시킬 수 있는 물질을 포함해야 할 것이다.
약리학적으로 허용가능한 담체의 철저한 고찰은 Gennaro (2000) Remington The Science and Practice of Phai macy 20 th edition , ISBN 0683306472에서 이용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 5.5 내지 8.5 범위의 pH를 가지며, 일부 구체예에서, 이것은 6 내지 8의 범위가 될 수 있으며, 추가 구체예는 약 pH7이다. pH는 완충액을 이용하여 유지시킬 수 있다. 본 조성물은 멸균되거나 및/또는 발열원이 없을 수 있다. 본 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 밀봉된 용기로 공급된다.
약학적 조성물은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 항체 및/또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 불사화된 B 세포 및/또는 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 유효량을 포함할 것이며, 여기서 유효량은 원하는 질환 또는 상태를 치료, 경감 또는 예방하는데 충분한 양이거나 또는 감지가능한 치료 효과를 나타내는 양이다. 치료학적 치료 효과는 신체적 증상의 감소도 포함된다. 임의의 특정 개체에 대한 유효량은 신체 크기, 건강, 상태의 특징 및 정도, 투여를 위해 선택된 치료제 또는 치료제 조합에 따라 달라질 것이다. 주어진 상태에 대한 유효량은 통상적인 실험에 의해 결정되며, 또한 임상의사의 판단 범위 내에 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 일반적으로 투여되는 개체에서 본 발명의 조성물의 약 0.O1mg/kg 내지 약 50mg/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이 될 것이다. 공지의 항체 기본 약학에서는 이에 대한 지침을 제공하는데, 예를 들면, Herceptin™ 은 21 mg/㎖ 용액으로 정맥 주입에 의해 투여되는데, 초기 로딩 약량은 4mg/kg(체중)이며, 주간 유지 투약량은 2mg/kg(체중)이고, Rituxan™ 는 375mg/㎡으로 주간 투여된다.
한 구체예에서, 조성물은 하나 이상(예, 2, 3, 4, 5, 등)의 본 발명의 항체를 포함하여 부가적인 또는 시너지 치료 효과를 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 조성물은 하나 또는 그 이상 (예, 2, 3, 4, 5, 등)의 본 발명의 항체 및 hCMV 감염을 중화시키는 하나 또는 그 이상 (예, 2, 3, 4, 5, 등)의 추가적인 항체를 포함할 수 있다.
예를 들면, 한 항체는 hCMV UL128 단백질내 에피토프, hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프, hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프, hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성된 에피토프, hCMV gB 단백질내의 에피토프, hCMV gH 단백질내 에피토프, hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있는 반면, 또 다른 항체는 hCMV UL128 단백질 내 상이한 에피토프, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프, UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프, gH, gL, UL128 및 UL130, gB, gH, gL, gM, gN, gO에 의해 형성된 에피토프, 또는 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있다. 임의의 이론에 결부되지 않고, 한 항체는 섬유아세포의 감염을 중재하는 기전을 표적으로 하고, 다른 항체는 내피세포의 감염을 중재하는 기전을 표적으로 할 수 있다. 최적의 임상적 효과를 위하여, hCMV 감염 및 유지의 모든 기전을 해결하는 것이 유리할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데, 여기서 제1 항체는 제1 UL128 에피토프에 특이적이며, 또한 제2 항체는 제2 UL128, UL130 및 UL131A의 조합, UL128, UL130 및 UL131A의 조합, gH, gL, UL128 및 UL130, gB, gH, gL, gM, gN, gO의 조합, 또는 gM 및 gN의 조합에 특이적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데, 여기서, 제1 항체는 UL130 및 131A의 조합상의 제1 에피토프에 특이적이고, 또한 제2 항체는 UL128, UL130 및 131A의 조합상의 제2 에피토프, UL128, UL130 및 UL131A의 조합, gH, gL, UL128 및 UL130, gB, gH, gL, gM, gN, gO의 조합, 또는 gM 및 gN의 조합상에 특이적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기서 제1 항체는 UL128, UL130 및 131A의 조합상의 제1 에피토프에 특이적이며, 또한 제2 항체는 UL128, UL130 및 UL131A의 조합, UL128, UL130 및 131A의 조합상의 제 2 에피토프, gH, gL, UL128 및 UL130, gB gH, gL, gM, gN, gO의 조합, 또는 gM 및 gN의 조합에 특이적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기서, 제1 항체는 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131A의 조합상의 제 1 에피토프에 특이적이며, 그리고 제2 항체는 UL128, UL130 및 UL131A의 조합, UL128, UL130 및 131A의 조합, gH, gL, UL128 및 UL130, gB, gH, gL, gM, gN, gO의 조합상의 제 2 에피토프, 또는 gM 및 gN의 조합에 특이적이다.
추가 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서, 제1 항체는 제1 gB 에피토프에 특이적이며, 또한 제2 항체는 UL128, UL130 및 UL131A의 조합, UL128, UL130 및 UL131A의 조합, gH, gL, UL128 및 UL130, 제2 gB 에피토프, gH, gL, gM, gN, gO의 조합, 또는 gM 및 gN의 조합에 특이적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기서, 제1 항체는 제1 gH 에피토프에 특이적이며, 또한 제2 항체는 UL128, UL130 및 UL131A의 조합, UL128, UL130 및 UL131A의 조합, gH, gL, UL128 및 UL130, gB, 제2 gH 에피토프, gL, gM, gN, gO의 조합, 또는 gM 및 gN의 조합에 특이적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학 적 조성물을 제공하며, 여기서, 제1 항체는 gM 및 gN의 조합상의 제 1 에피토프에 특이적이며, 또한 제2 항체는 UL128, UL130 및 UL131A의 조합, UL128, UL130 및 UL131A의 조합, gH, gL, UL128 및 UL130, gB, gH, gL, gM, gN, gO의 조합, 또는 gM 및 gN 조합상의 제 2 에피토프에 특이적이다.
hCMV UL128 단백질 내에서 에피토프에 결합하는 약학적 조성물로 이용하기 위한, 본 발명의 예시적인 항체는 15D8를 포함하나 이에 한정되지 않는다. hCMV 단백질 UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 약학 조성물로 이용하기 위한, 본 발명의 예시적인 항체는 4N10, 10F7, 10P3, 4122, 8L13, 1Fl1, 2F4 및 5A2 (2008년 1월 3일자 미국출원 11/969,104호 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 약학 조성물로 이용하기 위한, 본 발명의 예시적인 항체는 2C12, 7B13, 7I13, 8C15, 8J16, 9I6, 및 6G4 (2008년 7월16일자 미국출원 제12/174,568호 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 약학 조성물로 이용하기 위한, 본 발명의 예시적인 항체는 8I21를 포함하나 이에 한정되지 않는다. hCMV 단백질 gB내 에피토프에 결합하는 약학 조성물로 이용하기 위한, 본 발명의 예시적인 항체는 7H3, 10C6, 5F1, 6B4, 4H9 및 2B11를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약학 조성물로 이용하기 위한, hCMV 단백질 gH내 에피토프에 결합하는 예시적인 본 발명의 항체는 11B12, 13H11, 그리고 3G16를 포함하나 이에 한정되지 않는다. hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프에 결합하는 약학 조성물로 이용하기 위한, 본 발명의 예시적인 항체는 6L3를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 두 개 또는 그 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공하는데, 여기서, 상기 제1 항체는 본 발명의 항체 또는 항체 단편이며, 또한 상기 제2 항체는 hCMV 감염을 중화시키는 현재 공지된 또는 나중에 개발될 항체가 된다. 이와 같은 항체의 예는 MSL-109, 8F9 또는 3E3를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 항체 15D8 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 15D8 변이체 1 또는 이의 항원 결합 단편 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 15D8 변이체 2 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 8I21 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 2C12 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 8C15 또는 이의 항원 결합 단편, 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 9I6 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 7B13 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 8J16 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 7I13 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 4N10 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 10F7 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 10P3 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 4T22 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 8L13 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 7H3 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 7H3 변이체 1 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 10C6 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 5F1 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 6B4 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 4H9 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 4H9 변이체 1 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 2B11 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체는 13H11 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 11B12 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 3G16 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 6L3 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 유일한 활성 성분으로 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편들을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 약학 조성물은 2개 또는 그 이상, 예, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 이상의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 여기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 hCMV 감염을 중화시키는 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 다른 치료법, 예, 화학요법 화합물, 방사능치료 등과 함께 투여(복합 또는 별도)될 수 있다. 바람직한 치료 화합물은 항-바이러스 화합물, 가령, 강시클로비르(ganciclovir), 포스카르네트(foscarnet) 및 치도포비르(cidofovir)를 포함한다. 이와 같은 복합 치료법은 단독으로 투여되었을 때 개별 치료물질과 비교하여 부가적인 또는 시너지 개선을 제공한다. "시너지(synergy)"는 두 개 또는 그 이상의 활성 물질의 조합 효과가 각 활성 물질의 개별 효과의 합보다 더 큰 경우에 조합 효과를 설명하기 위해 이용된다. 따라서, 두 개 또는 그 이상의 물질의 조합 효과가 활성 또는 과정의 “시너지 저해”를 초래하면, 활성 또는 공정의 저해는 각 활성 물질의 저해효과의 합보다 더 크다. "시너지 치료 효과"는 두 개 또는 그 이상의 치료법의 조합시에 관찰되는 치료 효과를 말하며, 여기서, 치료 효과(임의의 다수 변수들에 의해 측정되었을 때)는 각 개별 치료법에서 관찰되는 개별 치료 효과의 합보다 더 크다.
항체는 hCMV 감염 치료시 기존에 반응이 없었던, 즉 항-hCMV 치료에 저항성을 보인 환자들에게 투여될 수 있다. 이와 같은 치료에는 항-바이러스제를 이용한 기존 치료가 포함될 수 있다. 이것은 hCMV의 항-바이러스 저항성 균주로 인한 감염 때문일 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 본 발명의 조성물에서, 상기 항체는 조성물에서 전체 단백질의 적어도 50 중량% (예, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)으로 구성될 수 있다. 따라서, 항체는 정제된 형태다.
본 발명은 (i) 본 발명의 항체를 준비하고, (ii) 정제된 항체와 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 약제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 항체와 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 약제를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 항체는 본 발명의 형질변형된 B 세포로부터 수득된 단클론 항체이다. 따라서 단클론 항체를 우선 준비하고, 약제를 조제하는 과정은 상이한 장소(예, 다른 나라)에서 다른 사람들에 의해 상이한 시간대에서 수행할 수 있다.
치료 목적으로 항체 또는 B 세포를 운반하는 대안으로, 소요의 단클론 항체 (또는 이의 활성 단편)을 인코드하는 핵산(일반적으로 DNA)을 개체로 운반시키는 것이 가능하며, 이때 핵산은 개체에서 발현되어, 원하는 치료효과를 제공할 수 있다. 적합한 유전자 치료법 및 핵산 운반 벡터는 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 면역원성 조성물이며, 일부 구체예에서, hCMV UL128 단백질내 에피토프, hCMV 단백질 UL130 및 131A에 의해 형성된 에피토프, hCMV 단백질 UL128, UL130 및UL131A에 의해 형성된 에피토프, hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성된 에피토프, hCMV gB 단백질내 에피토프, hCMV gH 단백질내 에피토프, 또는 hCMV 단백질 gM 및 gN에 의해 형성된 에피토프를 포함하는 항원을 포함하는 백신 조성물이 될 수 있다. 대안 조성물은 (i) hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 의해 형성된 에피토프를 포함하는 항원, 그리고 (ii) gB, gH, gL, gM, gN, gO, UL128, UL130 또는 UL131A 또는 이의 복합에서 발견되는 에피토프를 포함하는 항원을 포함한다. 본 발명에 따른 백신은 예방(예, 감염 예방) 또는 치료 (예, 감염을 치료하기 위하여) 백신일 수 있다.
조성물은 다중 약량 포맷으로 포장되는 경우 항균제를 포함할 수 있다. 조성물은 계면활성제, 가령, Tween (폴리소르베이트), 가령, Tween 80을 포함할 수 있다. 계면활성제는 일반적으로 <0.01%의 낮은 수준으로 존재한다. 조성물은 강장성(tonicity)을 제공하기 위하여 나트륨염(예, 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 10±2mg/㎖ NaCl의 농도가 일반적이다.
조성물은 슈가 알코올(예, 만니톨) 또는 이사카라이드(예, 슈크로즈 또는 트레할로즈)를 대략 15-3Omg/㎖ (예 25 mg/㎖)으로 포함할 수 있으며, 특히, 조성물이 동결건조되거나 또는 동결건조된 물질로부터 재구성된 물질을 포함하는 경우에 포함할 수 있다. 재구성용 조성물의 pH는 재구성전 대략 6.1로 조정될 수 있다.
본 발명의 도메인은 또한 하나 또는 그 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 면역조절제는 어주번트를 포함한다.
본 발명의 에피토프 조성물은 세포 중개된 면역 반응 뿐만 아니라 체액 면역 반응을 모두 유도하여 hCMV 감염을 효과적으로 처리할 수 있다. 이와 같은 면역 반응은 hCMV에 노출시에 신속하게 반응하는 오래 유지되는 (예, 중화) 항체를 유도하고, 세포 중개된 면역성을 유도할 수 있다.
의학적 치료 및 용도
본 발명의 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체 및 변이체는 hCMV 감염의 치료, hCMV 감염의 예방 또는 hCMV 감염 진단용으로 이용될 수 있다.
진단 방법은 항체 또는 항체 단편을 시료와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이와 같은 시료는 예를 들면, 타액선, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 영양기관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌 또는 피부에서 취한 조직 시료가 될 수 있다. 진단 방법에는 항원/항체 복합체의 탐지가 포함될 수 있다.
따라서 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체, (ii) 본 발명에 따른 불사화된 B 세포 클론, (iii) 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 에피토프 또는 (iv) 치료에 이용되는 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프에 결합할 수 있는 리간드, 바람직하게는 항체를 제공한다.
또한, (i) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체 또는 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프에 결합할 수 있는 리간드, 바람직하게는 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자의 치료방법이 제공된다.
본 발명은 또한, hCMV 감염의 예방 또는 치료용 약물 제조에서 (i) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체, (ii) 본 발명에 따른 불사화된 B 세포 클론, (iii) 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프, 또는 (iv) 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 리간드, 바람직하게는 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 hCMV 감염의 예방 또는 치료용 약물로 사용되는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 환자의 치료 및/또는 환자의 진단을 위한 약물 제조에서 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 항체 및/또는 단백질의 용도를 제공한다. 또한, 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 치료방법도 제공된다. 일부 구체예에서, 개체는 인간일 수 있다. 치료 효과를 점검하는 한 가지 방법은 본 발명의 조성물을 투여한 후 질환 증상을 모니터하는 것을 포함한다. 치료는 단일 약량 일정 또는 다중 약량 일정이 될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체, 이의 항원-결합 단편, 본 발명의 에피토프 또는 조성물은 이와 같은 예방 또는 치료를 요하는 개체에게 투여할 수 있다. 이와 같은 개체는 특히 hCMV 감염에 위험하거나 또는 감염될 수 있는 개체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 개체는 면역절충된 개체 또는 hCMV-혈청음성 또는 최근에 hCMV 감염된 임산부를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 면역절충된 개체는 HIV에 감염된 또는 면역억제 치료법을 받고 있는 개체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 수동적 면역화에 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에서 설명된 것과 같이, 이들은 hCMV 감염 진단을 위한 키트에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체에 결합될 수 있는 에피토프, 예를 들면, 단클론 항체 15D8, 4N10, 10F7, 10P3, 4122, 8L13, 2C12, 8C15, 916, 7B13, 8J16, 8121, 7113, 7H3, 6B4, 5F1, 10C6, 4H9, 2B11, 11B12, 13H11, 3G16, 및 6L3은 보호성 항-hCMV 항체 존재를 감지함으로써 백신 접종 과정의 효과를 모니터하는 키트에 이용될 수 있다.
본 발명에서 설명된 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체들은 원하는 면역원성을 가진 백신 제조를 모니터하는 키트에 이용될 수 있다.
본 발명은 단클론 항체와, 하나 또는 그 이상 약제학적으로 허용가능한 담체들을 혼합하는 단계를 포함하는 약제를 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서, 단클론 항체는 본 발명의 발현 숙주로부터 수득된 단클론 항체다. 따라서, 단클론 항체를 우선 수득하고(예, 이를 발현시키고 및/또는 정제시키고) 이어서 이를 약제학적으로 담체와 혼합하는 과정은 상이한 장소(예, 다른 나라)에서 다른 사람들에 의해 상이한 시간대에서 수행할 수 있다.
본 발명의 형질변형된 B 세포로 시작되는, 배양, 2차 배양, 클로닝, 2차-클로닝, 서열화, 핵산 준비 등의 다양한 단계들은 각 단계에서 선택적으로 최적화시키면서 형질변형된 B 세포에 의해 발현되는 항체를 영속시키기 위하여 수행할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법들은 항체를 인코딩하는 핵산에 적용되는 최적화(예를 들면, 친화적 성숙 또는 최적화) 기술을 더 포함한다. 본 발명은 이와 같은 단계 중에 이용된 및 제조된 모든 세포, 핵산, 벡터, 서열, 항체 등을 포함한다.
이들 모든 방법에서, 발현 숙주에 이용된 핵산은 특정 핵산 서열에 삽입, 결손 또는 수정을 위해 조작될 수 있다. 이와 같은 조작에 의한 변화는 제한효소부위 도입, 코돈 용도 수정, 전사 및/또는 해독 조절 서열의 추가 또는 최적화 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 인코딩된 아미노산을 변형시키기 위하여 핵산을 수정시키는 것도 가능하다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상 (예, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개) 아미노산 치환, 결손 및/또는 삽입을 항체 아미노산 서열로 도입시키는 것도 유용하다. 이와 같은 점 돌연변이는 효과물질 기능, 항원-결합 친화력, 해독 후 변형, 면역원성 등을 수정할 수 있다. 면역원성 등은 공유기(라벨)의 부착을 위한 아미노산을 도입시키거나 또는 태그(정제 목적)를 도입시킬 수 있다. 돌연변이는 특정 부위로 도입되거나 또는 무작위로 도입된 후 선별(분자 발달)이 이어진다. 예를 들면, 본 발명 항체의 CDR 부위, 중쇄 가변 부위 또는 경쇄 가변 부위 중 임의의 것들 인코딩하는 하나 또는 그 이상 핵산은 무직위로 또는 직접적으로 돌연변이 되어 인코딩된 아미노산 내 상이한 성질이 도입될 수 있다. 이와 같은 변화는 반복적 과정의 결과일 수 있으며, 여기서, 초기 변화가 유지되며, 다른 뉴클레오티드 위치에서 새로운 변화가 도입된다. 더욱이, 별개의 단계로 이루어진 변화는 결합할 수 있다. 인코딩된 아미노산 내로 도입되는 상이한 성질은 강화된 친화성을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일반적 사항.
“포함하는(comprising)”는 “포함하는(including)” 뿐만 아니라, “구성된(consisting)" 예를 들면, X를 포함하는(comprising) 조성물은 배타적으로 X로 구성되거나 또는 추가적인 다른 것, 예를 들면, X+Y를 포함할 수 있다.
“실질적으로(substantially)”는 “완전하게(completely)”를 배제하지 않는데, 예를 들면, Y가 실질적으로 없는 조성물은 Y가 완전하게 없는 것일 수도 있다. 필요한 경우, “실질적으로”는 본 발명의 정의에서 생략할 수 있다.
수치 χ와 연관하여 용어 "약(about)”는 예를 들면, χ±10%를 의미한다.
여기에서 사용된 것과 같은, 용어“질환(disease)”은 “장애(disorder)”또는 " 증상(condition)"(의학적 증상)과 일반적으로 동의어이고, 호환적으로 사용되는데, 이들 모두 인간 또는 동물 신체에 비정상적인 상태 또는 정상 기능을 손상시키는 이의 일부를 말하는 것으로 일반적으로 구별가능한 징조 및 증후에 의해 전형적으로 나타나며, 인간 또는 동물의 수명을 단축시키거나 삶의 질을 저하시키는 원인이 된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 환자의 “치료(treatment)”는 예방 및 방지를 포함한다. 용어“환자”는 인간을 포함하는 모든 포유동물을 의미한다. 환자의 예로는 인간, 소, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지 및 토끼를 포함한다. 일반적으로 환자는 인간이다.
실시예
본 발명의 예시적인 구체예는 다음의 실시예에서 제공된다. 다음의 실시예들은 오로지 예시를 위해 제공되며, 본 발명을 이용하는 당업자를 지원하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다.
실시예 1: hCMV 중화 활성을 위한 B 세포 클로닝 및 스크리닝
혈청내에 높은 hCMV 중화 항체 역가를 가진 기증자들이 확인되었다. 메모리 B 세포가 분리되고, 참고문헌 36에서 설명된 것과 같은, EBV 및 CpG를 이용하여 불사화시켰다. 요컨대, 메모리 B 세포는 CD22 비드를 이용하여 네가티브 선별, 이어서 특이적 항체와 세포 소팅(sorting)을 이용하여 IgM+, IgD+, IgA+B 세포를 제거하여 분리하였다. 소트된 세포 (IgG+)는 CpG 2006 및 조사된(irradiated) 동종이계 단핵 세포의 존재하에 EBV로 불사화 시켰다. 50개 메모리 B 세포를 각 포함하는 복제 배양물(Replicate cultures)은 20개 96웰 U자형 바닥 플레이트에 셋업 하였다. 2주 후에, 배양 상층액을 수거하고, 별도의 분석에서 섬유아세포 또는 상피세포의 hCMV 감염을 중화시키는 능력에 대해 테스트 하였다. B 세포 클론은 참고문헌 36에서 설명된 것과 같이, 포지티브 다클론 배양물로부터 분리되었다. 선별된 클론의 상층액에 있는 IgG 농도는 IgG-특이적인 ELISA를 이용하여 측정되었다.
바이러스 중화 분석을 위하여 임상적인 hCMV 분리체의 역가 양을 동량의 배양 상층액과 혼합하거나 또는 중화항체를 포함하는 인간 혈청 희석물과 혼합하였다. 실온에서 1시간 배양한 후, 상기 혼합물은 96웰 편평 바닥 플레이트 내에서 내피세포 (예, HUVEC 세포 또는 HMEC-1 세포), 상피세포 (예, ARPE 망막 세포), 섬유아세포 (예, MRC-9 또는 간엽 기질 세포) 또는 골수 세포 (예, 단세포-유도된 수지상 세포)의 합류(confluent) 단층에 첨가하고, 2일간 37℃에서 배양하였다. 상층액은 버리고, 세포는 냉각 메탄올로 고정시키고, hCMV 초기 항원에 대한 마우스 단클론 항체 혼합물로 착색시키고, 이어서 형광-라벨된 염소 항-마우스 Ig로 착색시켰다. 플레이트는 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 중화 항체 부재하에, 감염된 세포는 100-1,000/field이며, 중화 항체 포화 농도 존재하에, 감염은 완전히 저해되었다. 중화 역가는 hCMV 감염의 50% 또는 90% 감소를 제공하는 항체의 농도 (㎍/㎖)로 나타낸다.
표 5A는 섬유아세포주(MRC-9)와 인간 망막 상피세포주(ARPE) 모두에서 hCMV 임상 분리체(VR1814)의 중화를 나타낸다. 일부 항체는 상피세포(ARPE)의 hCMV 감염을 중화시키지만, 섬유아세포 (MRC-9)의 감염은 중화시키지 못하였다. 이는 상이한 단백질이 특정 세포 타입에 대한 친화성(tropism)을 담당한다는 기존 데이터와 일치한다[7]. gH/gL/UL128/UL130/UL131A 단백질 복합체중 하나 또는 그 이상의 단백질에 특이적인 이들 항체의 대부분은 매우 낮은 농도 (0.01 ㎍/㎖ 내지 0.001 ㎍/㎖ 범위의 농도에서 hCMV 감염의 50% 감소)에서 상피세포의 hCMV 감염을 중화시켰다. hCMV 단백질 gB, gH 또는 gM 및 gN의 조합체에 특이적인 다른 항체들은 필적할 정도의 효능으로 섬유아세포 및 상피세포의 hCMV 감염을 중화시켰다. 이들 결과에서 hCMV 중화 항체들의 일부는 섬유아세포 및 상피세포 모두에 동등한 능력이 있지만, 다른 항체는 두 가지 세포 타입에 상이한 활성을 나타낸다.
표 5A에 나타낸 분석 결과에 근거하여, 항체들은 그룹 1 (섬유아세포 및 상피세포 모두의 hCMV 감염 중화) 및 그룹 2 (상피세포의 hCMV 감염 중화)로 나뉘었다. 표 5B는 정제된 항체를 이용하여 실시된 독립적인 실험을 나타낸다. 이들 결과에서, 그룹 2 항체는 0.007 ㎍/㎖ 내지 0.003 ug/㎖ 범위의 IC90 값(즉, 바이러스 감염의 90%를 감소시키는데 요구되는 항체의 농도)으로 상피세포의 감염을 중화시켰고, 그룹 1 항체는 0.1 ㎍/㎖ 내지 30 ㎍/㎖ 범위의 IC90 값으로 섬유아세포 및 상피세포의 감염을 모두 중화시켰다. 그룹 2 항체는 또한 내피세포 (HUVEC) 및 골수 세포 (단핵구 유도된 수지상 세포)의 감염도 중화시켰다(데이타 없음). 그룹 1 항체는 표 5C의 일부 대표적인 항체에 대해 나타낸 바와 같이, 내피세포 (HUVEC), 골수 세포 (단핵구-유도된 수지상 세포) 및 골수 간엽 기질 세포의 감염도 중화시켰다. 본 발명의 항체는 또한 상이한 hCMV 임상 분리체에 의한 내피세포(HUVEC) 감염도 중화시켰다: VR6952 (소변으로부터), VR3480B1 (혈액, 강시클로비어-저항성으로부터) 및 VR4760 (혈액, 강시클로비어-저항성 및 포스카르네트-저항성으로부터) (데이타 없음).
상이한 세포 타입이 감염 중에 제공되는 경우 상이한 세포 타입의 감염을 중화시키는 항체들은 조합되어 추가적 또는 시너지 중화 효과를 제공할 수 있는 것으로 기대된다. 하나의 실시예로서, 상피세포의 감염 중화에는 능력이 있지만, 섬유아세포 감염은 중화시키지 못하는 중화 항체, 예를 들면, 15D8는 섬유아세포에 바이러스 중화 활성을 가지는 3G16과 조합되어야 한다. 또 다른 실시예로서, 상피세포의 감염 중화에는 능력이 있지만, 섬유아세포 감염은 중화시키지 못하는 중화 항체, 예를 들면, 9I6는 섬유아세포에 바이러스 중화 활성을 가지는 6B4와 복합되어야 한다.
[표 5A]
Figure 112011005757909-pct00005
1) 섬유아세포 (예, MRC-9) 또는 상피세포 (예, ARPE 망막 세포)의 hCMV 감염의 50% 감소를 제공하는데 요구되는 항체의 농도를 나타내는 수치. 다음과 같은 농도: ++++ < 0.001 ㎍/㎖; +++ < 0.01 ㎍/㎖; ++ < 0.1 ㎍/㎖; + < 2 ㎍/㎖; - 테스트된 최대 농도(2 ㎍/㎖)에서 중화 안 됨.
2) 표 6에 정의된 바와 같은 특이성.
[표 5B]
Figure 112011005757909-pct00006
1) 섬유아세포 (예, MRC-9) 또는 상피세포 (예, ARPE 망막 세포)의 hCMV 감염의 90% 감소를 제공하는데 요구되는 항체의 농도(㎍/㎖)를 나타내는 수치.
2) 표 6에 정의된 바와 같은 특이성.
3) nn, 테스트된 최대 농도(10 ㎍/㎖)에서 중화 안 됨.
[표 5C]
Figure 112013046901019-pct00021
1) 1차 세포 HUVEC, 인간 배꼽 정맥 내피세포, Mo-DC, 단핵구-유도된 수지상 세포, BM-MSC, 간엽 골수 기질 세포 hCMV 감염의 50% 감소를 제공하는데 요구되는 항체의 농도(㎍/㎖)를 나타내는 수치.
실시예 2: 단클론 항체에 의해 인지되는 표적 항원들의 확인
hCMV 중화 항체의 특이성을 측량하기 위하여, HEK293T 세포는 전장의 hCMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH, gL, gB, gM, 및 gN를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 벡터로 형질변환시켰다. 36시간 후, 세포들은 고정되었고, 침투화시키고 (permeabilized), 그리고 인간 단클론 항체에 이어서, 염소 항-인간 IgG로 착색시켰다. 도 1은 하나 또는 그 이상의 hCMV 단백질을 발현시키는 HEK293T 세포에 대표적인 항체의 결합을 나타낸다. 표 6은 hCMV 유전자-형질감염된 HEK293T 세포에 상이한 모든 항체의 착색 패턴을 나타낸다. UL128-형질감염된 세포를 책색시키는 항체 15D8을 예외로, 모든 다른 그룹 2 항체는 단일 유전자 형질 감염체를 착색시키지 않는데, 이는 항체들이 하나 이상의 유전자 산물의 공동-발현을 요구하는 에피토프를 인지할 것이라는 것을 제안하는 것이다. 게다가, 5개의 항체 (4N10, 10F7, 10P3, 4T22 및 8L13)은 UL130 및 UL131A를 공동-발현시키는 세포를 착색시키고, 6개의 항체 (2C12, 7B13, 7I13, 8C15, 8J16 및 9I6)는 UL128, UL130 그리고 UL131A를 공동발현시키는 세포를 착색시키고, 그리고 한 개의 항체 (8I21)는 UL128 및 UL130 뿐만 아니라 gH 및 gL으로 형질감염된 세포를 착색시켰다. 이들 모든 항체들은 gH/gL/UL128-130 조합체를 형성하는 모든 유전자로 형질감염된 HEK293T 세포를 착색시켰다. 그룹 1 항체 중에서, 세개는(11B12, 13H11 및 3G16)는 hCMV 단백질 gH를 발현시키는 세포를 착색시켰고, 6개(7H3, 10C6, 5F1, 6B4, 4H9 및 2B11)는 hCMV 단백질 gB를 발현시키는 세포를 착색시켰고, 그리고 한 개 항체(6L3)는 hCMV 단백질 gM 및 gN를 발현시키는 세포를 착색시켰다.
[표 6]
Figure 112011005757909-pct00008

항체가 결합하는 항원 부위의 정체를 더 조사하기 위하여, 교차-경쟁 실험을 수행하였다. 여기에서, HEK293T 세포는 전장의 hCMV 단백질 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131A을 인코딩하는 벡터로 형질감염되었다. 세포에 바이오티닐화 된 항체를 추가하기 전에, 20배 과량의 경쟁적 hCMV 중화 항체를 세포와 함께 배양하였다. 이 과정은 상이한 경쟁 항체 및 바이오티닐화 된 항체를 이용하여 수차례 반복하였다. 이들 실험에는 특허출원 제11/969,104호에서 설명된 항체(11F11, 2F4 및 5A2) 그리고 특허출원 제12/174,56S호 (6G4)의 4개 항체가 포함되었다. 데이터는 표 7A 및 B에 나타내었다.
[표 7a]
Figure 112011005757909-pct00009

[표 7b]
Figure 112011005757909-pct00010
표 7A, B에 나타낸 데이터에 기초하여, 적어도 7가지 별개 항원 부위는 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성된 hCMV 복합체 상에서 구별될 수 있다(표 8) 부위 1은 UL128에 존재하며, 항체 15D8에 의해 한정되며, 부위 2 내지 4는 UL130 및 UL131A의 조합에 의해 형성되고, 그리고 차례로 항체 10F7 4I22, 8L 13, 1F11 및 2F4 (부위 2), 4N10 및 5A2 (부위 3), 그리고 10P3 (부위 4)에 의해 한정된다. 부위 5 및 6은 UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 의해 형성되고, 그리고 차례로 항체 2C12, 7B13, 8C 15, 8J16, 9I6 및 6G4 (부위 5)에 의해, 그리고 7I13 (부위 6)에 의해 한정된다. 마지막으로, 부위 7은 gH, gL, UL128 및 UL130에 의해 형성되고, 그리고 항체 8I21에 의해 한정된다. 부위 7과 부위 3을 한정하는 항체는 부분적으로 서로 경쟁하는데, 이는 이들 부위가 gH/gL/UL128-131A 복합체의 구조내에서 서로 근접하여 있다는 것을 제시하는 것이다.
동일한 표적 상에 상이한 에피토프를 표적으로 하는 중화 항체는 바이러스 감염의 강력한 중화를 얻기 위하여 조합되어, 예를 들면, 10F7 및 4N10의 조합 또는 8J16 및 7I13의 조합에 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 더욱이, 상이한 표적 분자 또는 표적 분자의 복합을 표적으로 하는 중화 항체는 강력한 바이러스 중화를 얻기 위해 함께 이용될 수 있는 것으로 예상된다. 하나의 실시예로써, 표 8에서는 15D8와 10F7, 15D8와 2C12, 또는 8J16와 8121가 조합되어, 부가적인 또는 시너지의 hCMV 중화 효과를 나타낸다는 것을 제안한다.
[표 8]
Figure 112011005757909-pct00011

표 7에서 설명된 것과 유사한 방식으로, HEK293T 세포는 전장의 gH를 인코딩하는 벡터로 형질감염시켜, 항-gH 항체의 교차-경쟁 결합을 검사하였다. 도 2A 및 표 9에서 볼 수 있는 것과 같이, 적어도 두 개의 상이한 결합 부위가 hCMV gH 단백질에서 확인되었다. 항체 3G16는 한 부위를 한정하고, 항체 11B12 및 13H11는 두 번째 부위를 한정한다. 끝으로, HEK293T 세포는 전장의 gB를 인코딩하는 벡터로 형질감염시켜, 항-gB 항체의 교차-경쟁 결합을 검사하였다. 도 2B 및 표 10에서 볼 수 있는 것과 같이, 적어도 세 개의 상이한 결합 부위가 hCMV gB 단백질에서 확인되었다. 항체 6B4는 한 부위를 한정하고, 7H3는 두 번째 부위를 한정하고, 10C6, 5F1, 4H9 및 2B11의 세트는 세 번째 부위를 한정한다. 항체 6B4 (gB 부위 1을 인지하는)는 ELISA에 의해 gB 69-78 펩티드와 반응한다(EC50는 0.044㎍/㎖). 동일한 표적 분자 상의 상이한 부위를 표적하는 항체는 강력한 바이러스 중화를 얻기 위해 조합되어 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 동일한 표적 분자 상의 상이한 부위를 표적하는 항체는 강력한 바이러스 중화를 얻기 위해 조합되어 사용될 수 있는 것으로 예상된.
[표 9]
Figure 112011005757909-pct00012
[표 10]
Figure 112011005757909-pct00013
요약하면, 15 D8는 UL128내 에피토프에 결합되는데, 이 에피토프는 2C12, 7B13, 6G4(이들 모두는 UL128, UL130 및 UL131A의 복합에 대해 특이적임)가 인지하는 에피토프와 구별되며, 또한 8I21(gH, gL, UL128 및 UL130의 조합에 대해 특이적)가 인지하는 에피토프와도 구별된다. 또한, 이의 에피토프에 15D8의 결합은 4N10, 10F7, 10P3 및 IF11(이들 모두는 UL130 및 UL131A 조합에 특이적임)에 의해 저해되지 않는다.
4 N10는 UL130 및 UL131A의 발현을 요구하고, 또한 5A2(UL130 및 UL131A의 조합에 특이적) 및 8I21(gH, gL, ULl 28 및 UL130의 조합에 특이적)가 인지하는 에피토프와 동일하거나 대개 겹치지는 에피토프에 결합하지만, 10F7, 4122, 1F11, 2F4 (UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적), 2C12 및 6G4 (UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적)이 인지하는 에피토프와는 구별되는 에피토프에 결합한다. 또한, 이의 에피토프에 4N10의 결합은 15D8 (UL128에 특이적)에 의해 저해되지 않는다.
10F7는 UL130 및 UL131A의 발현을 요구하며, 또한 4T22, 8L13, 1F11 및 2F4가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 4N10 및 5A2 (UL130 및 UL131A의 조합에 대해 모두 특이적)가 인지하는 에피토프와는 구별될 뿐만 아니라, 2C12 및 6G4 (UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적)이 인지하는 에피토프와 구별되는, 에피토프에 결합한다. 또한, 이의 에피토프에 10F7의 결합은 15D8 (UL128에 특이적) 또는 13H11(gH에 특이적)에 의해 저해되지 않는다.
4 I22는 UL130 및 UL131A의 발현을 요구하며, 또한 2F4, 1F11 및 10F7가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 4N10, 10P3 및 5A2 (UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적)가 인지하는 에피토프와는 구별될 뿐만 아니라, 2C12, 8C15, 8J16, 9I6, 6G4 (UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적) 및 8I21 (gH gL, UL128 및 UL130의 조합에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는 에피토프에 결합한다. 또한, 이의 에피토프에 4I22의 결합은 항체 15D8 (UL128에 특이적) 또는 13H11 (gH에 특이적)에 의해 저해되지 않는다.
2 C12는 hCMV UL128, UL130 및 UL131A 유전자 산물의 발현을 요구하며, 또한 7B13, 8C15, 8J16, 9I6 및 6G4가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 7I13 (UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적)가 인지하는 에피토프와 구별되며, 또한 15D8 (UL128에 특이적), 4N10, 10F7, 10P3, 4122, 8L13,1F11, 2F4, 5A2 (UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적) 및 8I21 (gH, gL, UL128 및 UL130의 조합에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는 에피토프에 결합한다. 또한, 이의 에피토프에 2C12의 결합은 항체 3G16(gH에 특이적) 또는 13H11 (gH에 특이적)에 의해 저해되지 않는다.
8 C15는 hCMV UL128, UL130 및 UL131A 유전자 산물의 발현을 요구하며, 또한 2C12, 7B13, 8J16, 9I6 및 6G4가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 7I13 (모두 UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 특이적)가 인지하는 에피토프와는 구별되는 에피토프에 결합한다.
8 J16는 hCMV UL128, UL130 및 UL131A 유전자 산물의 발현을 요구하며, 2C12, 7B13, 8C15, 9I6 및 6G4가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 7I13 (UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 대해 모두 특이적)가 인지하는 에피토프 및 4I22 (UL130 및 UL131A의 조합에 대해 특이적)가 인지하는 에피토프와는 구별되는, 에피토프에 결합한다.
9 I6는 hCMV UL128, UL130 및 UL131A 유전자 산물의 발현을 요구하며, 2C12, 7B13, 8C15, 8Jl6 및 6G4가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 7I13 (UL128, UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적)가 인지하는 에피토프 및 2F4 및 5A2 (UL130 및 UL131A의 조합에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는, 에피토프에 결합한다.
8 I21는 hCMV gH, gL, UL128 및 UL130 유전자 산물의 발현을 요구하며, 4N10 및 5A2 (둘다 UL130 및 UL131A에 특이적)가 인지하는 에피토프에 부분적으로 겹치는 에피토프에 결합하지만, 15D8 (UL128에 특이적), 10F7, 10P3, 4I22, 1F11, 2F4 (UL130 및 UL131A의 조합에 모두 특이적), 2C12, 7B13 7I13 8C15, 8J16, 9I6 및 6G4 (모두 UL128, UL130 및 UL131A에 특이적)이 인지하는 에피토프와는 구별되는 에피토프에 결합한다. 또한, 이의 에피토프에 8I21의 결합은 항체 3G16(gH에 특이적)에 의해 저해되지 않는다.
3 G16는 11B12 및 13H11 (모두 gH에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는, gH내의 에피토프에 결합한다.
11B12는 13H11가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지며 또한 3G16 (gH에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와 구별되는, gH내 에피토프에 결합한다.
13 H11는 11B12가 인지하는 동일한 또는 거의 겹쳐지며 또한 3G16 (gH에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는, gH내 에피토프에 결합한다.
6B4는 7H3, 4H9, 5F1, 10C6 및 2B11 (모두 gB에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는, gB내 에피토프를 인지한다.
7 H3는 6B4, 7H3, 4H9, 5F1, 10C6 및 2B11 (모두 gB에 특이적)에 의해 인지되는 에피토프와는 구별되는, gB내 에피토프에 결합한다.
10 C6는 5F1, 4H9 및 2B11에 의해 인지되는 에피토프와 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 7H3 및 6B4 (모두 gB에 특이적)에 의해 인지되는 것과는 구별되는, gB 내의 에피토프에 결합한다.
5F1는 10C6, 4H9 및 2B11에 의해 인지되는 에피토프와 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 6B4 및 7H3 (모두 gH에 특이적)에 의해 인지되는 것과는 구별되는, gB내의 에피토프에 결합한다.
4 H9는 5F1, 1OC6 및 2B11에 의해 인지되는 에피토프와 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 6B4 및 7H3 (모두 gH에 특이적)에 의해 인지되는 것과는 구별되는, gB내의 에피토프에 결합한다.
2B11는 5F1, 10C6 및 4H9에 의해 인지되는 에피토프와 동일한 또는 거의 겹쳐지는 에피토프에 결합하지만, 6B4 및 7H3 (모두 gH에 특이적)에 의해 인지되는 것과는 구별되는, gB내의 에피토프에 결합한다.
실시예 3: 항체 15 D8 의 중화 활성의 폭
UL128은 UL132-128 자리의 가장 보존된 유전자다. 그러나 몇 가지 임상 분리체로부터 유도된 서열을 VR1814 서열과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가진 10개 변이체가 존재하는 것을 밝혔다. 따라서, 본 발명자는 UL 128-특이적인 항체 15D8의 결합이 임의의 이들 돌연변이에 의해 영향을 받는지를 조사하였다. 이를 위하여, 임상 분리체 (VR4603-M, VR4836-M, VR5001-M, VR4254-M VR4969-M, VR4313-M, VR4116-M VR5235-T, VR5055-T, VR4168-A, VR1814-PCR)로부터 얻은 UL128의 변이체의 공지된 아미노산 서열과 실험실 균주(Towne, TB40/E, AD169, Merlin and Toledo)를 배열하였고, 그리고 설명된 모든 아미노산 치환을 포함할 뿐만 아니라, PCR 증폭시에 높은 빈도에서 생성된 추가적인 돌연변이(F33V)를 포함하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
Figure 112011005757909-pct00014
Figure 112011005757909-pct00015
HEK293T 세포는 VR1814의 고유 UL128로 또는 범돌연변이된 유전자(pan-mutatd gene)로 형질감염되었고, 15D8 항체의 연속 희석물로 착색되었다. 도 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 고유 및 범돌연변이된 UL128 단백질은 필적한 효능(~ 0.2 ㎍/㎖에서 포화된 착색)으로 15D8에 의해 인지되었다. 이들 발견은 15D8가 UL128 인코딩된 단백질 내에 매우 보존된 에피토프를 인지한다는 것을 나타낸다.
여기에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 그의 전문이 참고로 포함된다.
본 발명을 실시하는 대안이 있으며, 다양한 변형이 본 발명의 범주 및 사상을 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 주지해야 한다. 따라서, 본 발명의 구체예는 여기에서 제시되는 상세내용으로 제한되지 않으며, 청구범위 내에 그리고 이의 균등 범위 내에서 변형될 수 있다.
참고문헌
Figure 112011005757909-pct00016
Figure 112011005757909-pct00017
서열목록 전자파일 첨부

Claims (39)

  1. (a) 서열 번호: 336, 337, 및 338에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 그리고 서열 번호: 339, 340, 및 341에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (b) 서열 번호: 316, 317, 및 318에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 그리고 서열 번호: 319, 320, 및 321에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (c) 서열 번호: 316, 317, 및 332에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3와, 그리고 서열 번호: 319, 320, 및 321에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (d) 서열 번호: 278, 279, 및 280에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3와, 그리고 서열 번호: 281, 282, 및 283에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (e) 서열 번호: 352, 279, 및 280에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3와, 그리고 서열 번호: 281, 282, 및 283에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (f) 서열 번호: 296, 297, 및 298에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3와, 그리고 서열 번호: 299, 300, 및 301에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (g) 서열 번호: 296, 312, 및 298에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그리고 서열 번호: 299, 300, 및 301에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    또는
    (h) 서열 번호: 360, 279, 및 280에서 각각 제시된 중쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 그리고 서열 번호: 281, 282, 및 361에서 각각 제시된 경쇄 가변 부분 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 각각 서열 번호: 328 및 329; 서열 번호: 334 및 329; 서열 번호: 290 및 291; 서열 번호: 294 및 291; 서열 번호: 357 및 291; 서열 번호: 308 및 309; 서열 번호: 314 및 309; 서열 번호: 348 및 349; 또는 서열 번호: 367 및 368인 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 각각 서열 번호: 328 및 329; 또는 서열 번호: 334 및 329인 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. hCMV 감염을 중화시키고, 각각 서열 번호: 328 및 329; 서열 번호: 334 및 329; 서열 번호: 290 및 291; 서열 번호: 294 및 291; 서열 번호: 357 및 291; 서열 번호: 308 및 309; 서열 번호: 314 및 309; 또는 서열 번호: 367 및 368인 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하는, 제2항에 따른 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 상기 제2항에 따른 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. hCMV 감염을 중화시키고, 제3항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 hCMV의 gB 단백질에 결합에 대해 제3항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, hCMV의 90% 중화에 필요한 상기 항체의 농도가 10 ㎍/ml 이하인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, hCMV의 90% 중화에 필요한 상기 항체의 농도가 1.2 ㎍/ml 이하인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체, 단일 클론 항체, 단일 쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 부위 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 서열 번호: 330, 335, 331, 350, 351, 292, 295, 293, 358, 359, 310, 315, 311, 369, 또는 370인, 핵산 분자.
  11. 제9항 또는 제10항의 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 발현하는, 세포.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항 또는 제10항에 따른 핵산, 및 약리학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, hCMV 감염 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, hCMV 감염을 중화시키는 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제2 항체는 hCMV 단백질 UL128; hCMV 단백질 gH; hCMV 단백질 UL128, UL130 및 UL131A의 조합; hCMV 단백질 UL130 및 UL131A의 조합; hCMV 단백질 gH, gL, UL128 및 UL130의 조합; hCMV 단백질 gM 및 gN의 조합; 및 hCMV 단백질 gB의 제2 에피토프로 이루어진 군에서 선택된 단백질 또는 단백질 조합에 결합하는 것인, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 항체는 각각 서열 번호: 13 및 14; 서열 번호: 29 및 30; 서열 번호: 45 및 46; 서열 번호: 61 및 62; 서열 번호: 125 및 126; 서열 번호: 200 및 201; 서열 번호: 208 및 201; 서열 번호: 212 및 213; 서열 번호: 77 및 78; 서열 번호: 141 및 142; 서열 번호: 170 및 171; 서열 번호: 93 및 94; 서열 번호: 157 및 158; 서열 번호: 109 및 110; 서열 번호: 184 및 185; 서열 번호: 242 및 243; 서열 번호: 228 및 229; 서열 번호: 258 및 259; 또는 서열 번호: 274 및 275의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하는 것인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제9항 또는 제10항에 따른 핵산, 또는 제12항의 세포를 제공하는 단계를 포함하는, hCMV 감염을 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
  18. (i) 제12항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
    (ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
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