MX2011000542A - Citomegalovirus humano que neutraliza anticuerpos y su uso. - Google Patents

Abstract

La invención describe anticuerpos de neutralización que son específicos para citomegalovirus humano (hCMV), específicamente los anticuerpos de la invención son específicos para una combinación de proteínas de hCMV UL128, UL130 y UL131A. Anticuerpos de la invención neutralizan la infección con alta potencia. La invención también describe células B inmortalizadas que producen dichos anticuerpos, al epítope que los anticuerpos unen así como el uso de los anticuerpos y el epítope en los métodos de clasificación así como el diagnóstico y terapia de enfermedad.

Description

CITOMEGALOVIRUS HUMANO QUE NEUTRALIZA ANTICUERPOS Y SU USO Todos los documentos citados aquí se incorporan para referencia en su totalidad.

CAMPO TECNICO Esta invención se refiere a tener alta potencia en neutralizar citomegalovirus humano (hC V) y que es específico para una combinación de las proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A y células B inmortalizadas que producen dichos anticuerpos monoclonales . La invención se refiere también al epítope determinado por una combinación de las proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A que los anticuerpos se unen a, así como el uso de los anticuerpos y el epítope en métodos de selección, diagnóstico, profilaxis y terapia de la enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Citomegalovirus humano (hCMV) es un patógeno ampliamente distribuido que puede causar grave patología en adultos inmunodeprimidos y en la infección del feto y se ha implicado en enfermedades crónicas como la ateroesclerosis . hCMV infecta a múltiples tipos de célula, incluyendo los fibroblastos, células endoteliales , epiteliales y hematopoyéticas [1] . Cepas atenuadas propagadas in vi tro de hCMV, que se están desarrollando como vacunas candidato, han perdido el tropismo para las células endoteliales, mientras retiene la capacidad de infectar fibroblastos [2] . Dos complejos de glicoproteina viral se cree controlan el tropismo celular de hCMV. Un complejo de glicoproteínas como gH, gL y gO parece ser necesario para la infección de fibroblastos, mientras un complejo de gH, gL y proteínas codificadas por los genes de UL131-UL128 está implicado en la infección de las células endoteliales, células epiteliales y células dendríticas [2-8] .

Globulinas hiper-inmunes son ya comercializadas para la profilaxis de la enfermedad de hCMV asociada con el trasplante y evidencia reciente indica que tienen un efecto terapéutico en , mujeres embarazadas [9] . Este enfoque terapéutico se limita por la baja cantidad de anticuerpo de neutralización que se puede transferir y por ello la disponibilidad de anticuerpos humanos (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos) con alta capacidad de neutralización sería muy deseable. Sin embargo el objetivo de anticuerpos de neutralización de hCMV queda por establecerse. Aunque algunos anticuerpos contra gH, gB y productos génicos UL128 y UL130 han demostrado actividades de neutralización in vi tro [7, 10, 11] y un anticuerpo para gH se ha evaluado en ensayos clínicos que se discontinúan debido a la falta de efectos terapéuticos, la potencia neutralizante de los anticuerpos monoclonales aislados hasta la fecha es modesta, ya que se observa neutralización en concentraciones de anticuerpos que van de 0.5 a 20 microgramo/ml . Además, los métodos actuales por lo general miden la' potencia de neutralización de anticuerpos anti-hCMV utilizando fibroblastos como células objetivo. Sin embargo, hCMV también se conoce por causar patología por infectar a otros tipos de células, como las células endoteliales , epiteliales y leucocitos. Anticuerpos conocidos a UL128 y UL130 muestran muy baja potencia en la neutralización de infección de las células endoteliales [7] y no parece que sea cualquier anticuerpo monoclonal que sea capaz de neutralizar la infección de células objetivo no fibroblastos con alta potencia.

Por lo tanto, existe una necesidad de anticuerpos que neutralicen la infección de hCMV de células objetivo no fibroblasto con una potencia superior, así como el esclarecimiento del o los objetivos a los cuales dichos anticuerpos se unen.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION invención se basa, en parte descubrimiento de nuevos anticuerpos para neutralizar hCMV con alta potencia así como epítopes novedosos a los cuales los anticuerpos de la invención se unen. En consecuencia, en una modalidad, la invención comprende un anticuerpo de neutralización o un fragmento de anticuerpo con alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo o un fragmento de anticuerpo es específico para una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A.

En otra modalidad la invención consta de una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención.

Sin embargo en otra modalidad la invención comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención.

En una modalidad más la invención consta de una célula que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.

En otra modalidad la invención comprende un clon de célula B inmortalizada que expresa un anticuerpo con alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo es específico para una combinación de proteínas hCMV UL128, UL130 y UL1131A.

En otra modalidad la invención comprende un epítope que se une a un anticuerpo de la invención.

En una modalidad más la invención comprende un polipéptido inmunogénico que comprende un epítope que se une a un anticuerpo de la invención.

En otra modalidad la invención comprende un ligando que se une a un epítope que se une a un anticuerpo de la invención.

En una modalidad más la invención consta de un método para la producción de anticuerpos con alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo es específico para una combinación de las proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A. El método compone (i) cultivo de un clon de célula B inmortalizada que expresa un anticuerpo de la invención y (ii) aislar anticuerpos de células B.

En otra modalidad la invención comprende una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención, un ácido nucleico de la invención, un clon de células B inmortalizadas que expresan un anticuerpo de la invención, o un polipéptido inmunogénico que comprende un epítope que se une a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención.

En una modalidad más la invención comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que tiene alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo es específico para una combinación de proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo es específico para una combinación de proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A, un clon de células B inmortalizadas que expresa un anticuerpo que tiene alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo es específico para una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A o un polipéptido inmunogénico que comprende un epítope que se une a un anticuerpo que tiene alta potencia en la neutralización de hCMV, en donde dicho anticuerpo es específico para una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A para su uso en terapia o diagnóstico.

En otra modalidad la invención consta de un kit para el diagnóstico de la infección de hCMV que comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención, o un epítope que se une a un anticuerpo de la invención.

En otra modalidad la invención consta de un método para la preparación de una célula recombinante . El método comprende: (i) secuenciación de ácido nucleico de un clori de células B inmortalizadas que expresa un anticuerpo de la invención y (ii) uso de la información de secuencia obtenida de la etapa (i) para preparar ácido nucleico para insertar en un hospedero de expresión para permitir la expresión del anticuerpo de interés en ese hospedero.

En una modalidad adicional la invención consta de un método para la producción de anticuerpos con alta potencia en la neutralización de hCMV y específico para una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A. El método comprende el cultivo o sub-cultivo de un hospedero de expresión que se puede obtener mediante el método descrito anteriormente y, opcionalmente , la purificación del anticuerpo de interés.

En otra modalidad la invención comprende un método de selección de polipéptidos que pueden inducir una respuesta inmune contra hCMV, que comprende la selección de genotecas de polipéptido utilizando un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un análisis FACS que demuestra que el anticuerpo monoclonal humano (mAb) 6G4 reconoce un epítope determinado por una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A.

La figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 6G4. Las secuencias de CDR están en negritas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención se basa en la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan la infección de hCMV y que tienen una potencia particularmente alta en neutralizar la infección hCMV. Estos anticuerpos son deseables, como sólo bajas concentraciones se requieren a fin de neutralizar una determinada cantidad de virus. Esto facilita mayores niveles de protección mientras administran cantidades menores de anticuerpo. También se incluyen en el alcance de la invención anticuerpos humanos monoclonales y los clones de célula B inmortalizada que secretan dichos anticuerpos .

Los inventores han descubierto que los anticuerpos dirigidos a una combinación de las proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A son especialmente eficaces en la neutralización de hCMV. Sin estar sujeta a cualquier teoría, esta combinación puede ser un complejo preciso de UL128, UL130 y UL131A forman un único epítope reconocido por los anticuerpos .

La invención se refiere también a la caracterización del epítope al cual los anticuerpos se unen y el uso de ese epítope en el surgimiento de una respuesta inmune .

La invención también se refiere a diversos métodos y usos que involucran los anticuerpos de la invención y los epí opes a los cuales se enlazan.

Anticuerpos de la invención La invención proporciona anticuerpos monoclonales o recombinantes con potencia particularmente alta en la neutralización de hCMV. La invención proporciona también fragmentos de estos anticuerpos monoclonales o recombinantes, particularmente los fragmentos que mantienen la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos. En esta especificación, por "alta potencia en - neutralización de hCMV" se entiende que una molécula de anticuerpo de la invención neutraliza hCMV en un ensayo estándar a una concentración mucho menor que los anticuerpos conocidos en la técnica, por ejemplo en comparación con MSL-109, 8F9 o 3E3.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención puede neutralizar hCMV a una concentración de 0.16 g/ml o (es decir, 0.15, 0.125, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.02, 0.015, 0.0125, 0.01, 0.0075, 0.005, 0.004, 0.003, 0.002 o menores). En otra modalidad, el anticuerpo puede neutralizar hCMV en una concentración de 0.016 g/ml o menos (es decir, a una concentración de anticuerpos menor que, por ejemplo, 10"8 M, 10"9 M, 10"10 M, 10"11 M, 10"12 M, 10"13 M) . Esto significa que sólo muy bajas concentraciones de anticuerpos son necesarias para la neutralización del 50% de un aislado clínico de hCMV in vitro en comparación con la concentración de anticuerpos conocidos, por ejemplo, MSL-109, 8F9 o 3E3, necesarios para la neutralización del mismo título de hCMV. En una modalidad más, la concentración de anticuerpos de la invención necesaria para la neutralización de 50% de la infección de células endoteliales , células epiteliales y células dendríticas por un aislado clínico de hCMV in vitro es 10 veces o más (es decir, 25, 50, 75, 100, 150, 200 o más) menores a lo requerido por MSL-109, 8F9 o 3E3. Se puede medir la potencia utilizando un ensayo de neutralización estándar como se describe en la técnica.

Los anticuerpos de la invención son capaces de neutralizar la infección de hCMV de varios tipos de células. En una modalidad, un anticuerpo de acuerdo con la invención previene la infección de células endoteliales. Los anticuerpos de la invención también pueden prevenir la infección de células epiteliales, tales como las células retínales y células mieloides, tales como células dendríticas .

Estos anticuerpos se pueden utilizar como agentes terapéuticos o profilácticos durante una formulación adecuada, o como una herramienta de diagnóstico.

Un "anticuerpo de neutralización" es uno que puede neutralizar la capacidad de ese patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un hospedero. La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano de neutralización, en donde el anticuerpo reconoce un antígeno de hCMV.

En concreto, un anticuerpo de acuerdo con la invención tiene especificidad de una combinación de las proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A.

En una modalidad, un anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal se refiere en el presente documento como 6G4. Este anticuerpo, aislado de un donante infectado de hCMV, se produce por el clon de células B inmortalizadas referido como 6G4. Este anticuerpo neutraliza la infección de hCMV de células endoteliales , células epiteliales, tales como células retínales y células mieloides, tales como las células dendríticas.

La cadena pesada de 6G4 tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEQ ID NO: 7 y la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEQ ID NO: 8. La CDR de las cadenas pesadas de anticuerpos se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3 , respectivamente. Del mismo modo, la CDR de las cadenas ligeras de anticuerpos se denominan como CDRL1, CDRL2 y CDRL3, respectivamente. La posición de los aminoácidos de CDR se definen de acuerdo con el sistema de numeración de I GT [12, 13, 14] como: CDR1 - IMGT posiciones 27 a 38, CDR2 - IMGT posiciones 56 a 65 y CDR3 - IMGT posiciones 105 a 117.

Las secuencias de aminoácidos de la CDR de este anticuerpo se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 La invención también incluye un anticuerpo que comprende una cadena pesada integrada por una o más. (es decir, una, dos o las tres) CDR de cadena pesada de 6G4 (SEQ ID NO: 1-3) .

En una modalidad un anticuerpo de acuerdo con la invención comprende una cadena pesada que incluye (i) SEQ ID NO: 1 para CDRH1, SEQ ID NO: 2 para CDRH2 y SEQ ID NO: 3 para CDRH3.

En otra modalidad la invención incluye un anticuerpo que comprende una cadena ligera integrada por una o más (es decir, una, dos o las tres) CDR de cadena ligera de 6G4 (SEQ ID NOS: 4-6).

En otra modalidad la invención incluye un anticuerpo que comprende una cadena ligera que incluye (i) SEQ ID NO: 4 para CDRL1 , SEQ ID NO : 5 para CDRL2 y SEQ ID NO: 6 para CDRL3.

En una modalidad más un anticuerpo de acuerdo con la invención tiene carácter específico para una combinación de proteínas de hC V UL128, UL130 y UL131A y comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En una modalidad, un anticuerpo de acuerdo con la invención consta de una cadena pesada con la secuencia recitada en la SEQ ID NO: 7.

En otra modalidad, un anticuerpo de acuerdo con la invención tiene especificidad de una combinación de proteínas hCMV, UL128, UL130 y UL131A y comprende una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En aún otra modalidad un anticuerpo de acuerdo con la invención comprende una cadena ligera con la secuencia recitada en SEQ ID NO: 8.

Anticuerpos de la invención también incluyen moléculas de anticuerpos híbridos que comprenden una o varias CDR de 6G4 y uno o varios CDR de otro anticuerpo para el mismo epítope. En una modalidad, dichos anticuerpos híbridos comprenden tres CDR de 6G4 y tres CDR de otro anticuerpo para el mismo epítope. Por lo tanto, los anticuerpos híbridos preferidos comprenden i) las tres CDR de cadena ligera de 6G4 y las tres CDR de cadena pesada de otro anticuerpo para el mismo epítope, o ii) las tres CDR de cadena pesada de 6G4 y las tres CDR de cadena ligera de otro anticuerpo para el mismo epítope.

En otro aspecto, la invención también incluye secuencias de ácido nucleico que codifica parte o todas las cadenas ligeras y pesadas y CDR de los anticuerpos de la presente invención. En una modalidad, secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En otra modalidad, una secuencia de ácido nucleico de la invención tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9 (que codifica la región variable de cadena pesada 6G4) o SEQ ID NO: 10 (que codifica la región variable de cadena ligera 6G4) . En aún más modalidades, secuencias de ácido nucleico de la invención incluyen aquellas que codifican las diversas CDR incluyen SEQ ID NO: 11 (que codifican 6G4 CDRH1) , SEQ ID NO:12 (que codifica 6G4 CDRH2), SEQ ID NO:13 (que codifica 6G4 CDRH3 ) , SEQ ID NO:14 (que codifica 6G4 CDRL1), SEQ ID NO:15 (que codifica 6G4 CDRL2) y SEQ ID NO: 16 (que codifica 6G4 CDRL3) . Debido a la redundancia del código genético, existen variantes de estas secuencias que codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Estas variantes se incluyen dentro del alcance de la invención.

Anticuerpos variantes también se incluyen en el alcance de la invención. Por lo tanto, también se incluyen en el campo de la invención variantes de las secuencias recitadas en la solicitud. Esas variantes incluyen variante natural generada por mutación somática in vivo durante la respuesta inmune o in vitro durante el cultivo de clones de células B inmortalizadas. Por otra parte, las variantes pueden surgir debido a la degeneración del código genético, como se menciona anteriormente. De forma alternativa, se pueden producir variantes naturales debido a errores en la transcripción o la traducción.

Otras variantes de las secuencias de anticuerpo tienen afinidad mejorada y/o potencia mejorada se pueden obtener usando métodos conocidos en la técnica y se incluyen en el alcance de la invención. Por ejemplo, sustituciones de aminoácido se pueden utilizar para obtener anticuerpos con mayor afinidad mejorada. De forma alternativa, la optimización de codón de la secuencia de nucleótidos se puede utilizar para mejorar la eficacia de la traducción en sistemas de expresión para la producción de los anticuerpos. Además, los polinucleótidos que comprenden una secuencia optimizada para la especificidad de anticuerpos o neutralización de actividad mediante la aplicación de un método de evolución dirigida a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de la invención también están en el campo de la invención.

En una modalidad las secuencias de anticuerpo variante pueden compartir 70% o más (es decir, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias recitadas en la solicitud. En algunas modalidades dicha identidad de secuencia se calcula con respecto a toda la longitud de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia recitada en la solicitud) . En algunas otras modalidades, porcentaje de identidad, como se refieren en el presente, es como se determina usando BLAST versión 2.1.3 con los parámetros de falla especificados por el NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty= 11 y gap extensión penalty=l] .

Además incluidos dentro del alcance de la invención son vectores, por ejemplo los vectores de expresión, que comprenden una secuencia de ácido nucleico según la invención. Las células transformadas con dichos vectores también se incluyen en el alcance de la invención. Ejemplos de dichas células incluyen pero no se limitan a, células eucariotas, por ejemplo, células de levadura, células animales o células de plantas. En una modalidad, las células son mamíferos, por ejemplo, células de humano, CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, mieloma o hibridoma.

La invención se refiere también a los anticuerpos monoclonales que se unen a un epítope capaz de unir los anticuerpos de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a, el anticuerpo monoclonal 6G4.

Anticuerpos monoclonales y recombinantes son particularmente útiles en la identificación y purificación de los polipéptidos individuales o de otros antígenos contra los que se dirigen. Los anticuerpos de la invención tienen utilidad adicional ya que se emplean como reactivos en inmuno-ensayos , radio-inmunoensayos (RIA) o ensayos inmuno-absorbentes enlazados a enzima (ELISA) . En estas solicitudes, los anticuerpos se pueden marcar con un reactivo analíticamente detectable como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima. Los anticuerpos también se pueden utilizar para la identificación molecular y caracterización (mapeo de epítope) de antígenos.

Anticuerpos de la invención se pueden acoplar a un fármaco para la entrega a un sitio de tratamiento o acoplar a una marca detectable para facilitar la creación de imágenes de un sitio que comprende las células de interés, tal como las células infectadas con hCMV. Métodos para acoplamiento de anticuerpos a los fármacos y marcas detectables se conocen bien en la técnica, como métodos para creación de imágenes utilizando marcas detectables. Anticuerpos marcados se pueden emplear en una amplia variedad de otros ensayos, que emplean una amplia variedad de marcas. Detección de la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo de la invención y un epítope de interés (un epítope hCMV) se puede facilitar mediante la unión de una sustancia detectable al anticuerpo. Medios de detección adecuados incluyen el uso de marcas como radionuclidas , enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimio-luminiscentes , cromógenos, sustratos de enzima o co-factores, inhibidores de enzima, complejos de grupo prostético, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatase alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados son estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados son umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente es luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Tales reactivos marcados se pueden utilizar en una variedad de ensayos bien conocidos, tales como radio-inmunoensayos , inmuno-ensayos de enzima, por ejemplo, ELISA, inmuno-ensayos fluorescentes y similares. Por ejemplo, ver referencias 15-18.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención se puede conjugar a una porción terapéutica tal como un citotoxina, un agente terapéutico, o un ion de metal radiactivo o radioisótopo. Ejemplos de radioisótopos incluyen, pero no se limitan a, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 y lo similar. Tales conjugados de anticuerpos se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica determinada; la porción de fármaco no se debe construir como una limitación a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármacos puede ser una proteína o polipéptido que poseen una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina o toxina de la difteria.

Técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy, " in Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery, " in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2a ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review, " in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al . p . 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italia, 1985) ; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy, " in Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe et al. (1982) Immunol . Rev. 62:119-158.

De forma alternativa, se puede conjugar un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar una hetero-conjugado de anticuerpos como se describe en la referencia 19. Además, se pueden utilizar los enlazadores entre las marcas y los anticuerpos de la invención [20] . Anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno se pueden marcar directamente con yodo radiactivo, indio, itrio u otras partículas radiactivas conocido en la técnica [21] . El tratamiento puede consistir de una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados simultánea o posteriormente [22, 23].

En otra modalidad, los anticuerpos de la invención se pueden unir a un soporte sólido.

Además, anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpos funcional de los mismos, se pueden modificar químicamente por conjugación covalente a un polímero, por ejemplo, para aumentar su vida media de circulación. Se muestran ejemplos de polímeros y métodos para unirlos a péptidos, en referencias 24-27. En algunas modalidades se pueden seleccionar los polímeros de polioles polioxietilados y polietilen glicol (PEG) . PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R (0--CH2--CH2)n 0--R, donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector como un grupo alquilo o alcanól. En una modalidad el grupo protector puede tener entre 1 y 8 átomos de carbono . En una modalidad más el grupo protector es metilo. El símbolo n es un número entero positivo. En una modalidad n está entre l y 1, 000. En otra modalidad n está entre 2 y 500. En una modalidad el PEG tiene un peso molecular entre 1,000 y 40,000. En una modalidad adicional el PEG tiene un peso molecular entre 2,000 y 20,000. Sin embargo, en una modalidad más el PEG tiene un peso molecular de entre 3,000 y 12,000. En una modalidad PEG tiene al menos un grupo hidroxi . En otra modalidad el PEG tiene un grupo hidroxi terminal. En otra modalidad es el grupo hidroxi terminal que se activa para reaccionar con un grupo amino libre sobre el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que pueden variar el tipo y cantidad de los grupos reactivos para lograr un PEG/anticuerpo conjugado covalentemente de la presente invención.

Polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Incluyen sobitol polioxietilado, glucosa polioxietilado, glicerol polioxietilado (POG) , y lo similar. En una modalidad, se utiliza POG. Sin unirse a cualquier teoría, esto se puede deber a que la columna vertebral de glicerol de glicerol polioxietilado es la misma columna vertebral que se produce naturalmente en, por ejemplo, animales y seres humanos en mono-, di-, triglicéridos , esta ramificación, por tanto, no necesariamente se considera como un agente externo en el cuerpo. En algunas modalidades POG tiene un peso molecular en el mismo rango que PEG. En la referencia 28 se muestra la estructura de POG.

Otro sistema de suministro de fármacos que se puede utilizar para aumentar la vida media circulatoria es el liposoma. Métodos de preparación de sistemas de suministro de liposoma se tratan en las referencias 29, 30 y 31. Otros sistemas de suministro de fármacos se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, las referencias 32 y 33.

Anticuerpos de la invención se pueden proporcionar en forma purificada. Normalmente, el anticuerpo estará presente en una composición que es sustancialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo, donde menos del 90% (por peso) , por lo general menos del 60%, y más generalmente menos de un 50% de la composición se compone de otros polipéptidos.

Anticuerpos de la invención pueden ser inmunógenos en hospederos no humanos (o heterólogos) por ejemplo, en ratones. En particular, los anticuerpos pueden tener una idiotopo que es inmunogénico en hospederos no humanos, pero no en un hospedero humano. Anticuerpos de la invención de uso humano incluyen aquellos que no se pueden aislar fácilmente de los hospederos, como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc. y por lo general no se pueden obtener por la humanización o desde xeno-ratones.

Anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgA, IgG, IgM, es decir, una cadena pesada , ? o µ) , pero serán en general IgG. En el isotipo IgG, anticuerpos pueden ser la subclase IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4. Anticuerpos de la invención pueden tener una k o una cadena ligera ?.

Producción de anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención se puede hacer por cualquier método conocido en la técnica. La metodología general para la elaboración de anticuerpos monoclonales utilizando la tecnología de hibridoma es bien sabida [34, 35]. Preferiblemente, se utiliza el método alternativo de inmortalización de EBV descrito en la referencia 36.

Utilizando el método descrito en la referencia 36, las células B que producen el anticuerpo de la invención se pueden transformar con EBV en presencia de un activador policlonal de células B. Transformación con EBV es una técnica estándar y se puede adaptar fácilmente para incluir activadores policlonales de células B.

Opcionalmente se pueden añadir estimulantes adicionales del crecimiento celular y diferenciación durante la etapa de transformación para fortalecer aún más la eficiencia. Estos estimulantes pueden ser citoquinas como IL-2 e IL-15. En un aspecto, IL-2 se agrega durante la etapa de inmortalización para mejorar aún más la eficiencia de inmortalización, pero su uso no es esencial.

Las células B inmortalizadas producidas utilizando estos métodos entonces se pueden cultivar mediante métodos conocidos en la técnica y anticuerpos aislados de los mismos.

Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar aún más, si se desea, mediante filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como cromatografía HPLC o de afinidad. Técnicas para la purificación de anticuerpos monoclonales, incluyendo las técnicas para la producción de anticuerpos grado farmacéutico, son bien conocidas en la técnica.

Fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden obtener de los anticuerpos monoclonales por métodos que incluyen la digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o por escisión de enlaces disulfuro por reducción química. Como alternativa, los fragmentos de los anticuerpos monoclonales se pueden obtener por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesada o ligera. "Fragmentos" de anticuerpo pueden incluir Fab, Fab' , F(ab' )2 y fragmentos Fv. La invención abarca también fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) , derivados de las cadenas pesada y ligera de ""un anticuerpo monoclonal de la invención, por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende la CDR de un anticuerpo de la invención. También se incluyen monómeros de cadena pesada o ligera y dímeros, así como anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, Fv de cadena sencilla en donde los dominios variables de cadena pesada y ligera se unen mediante un enlazador de péptidos .

Se pueden utilizar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN de codificación para los anticuerpos o fragmentos de los anticuerpos de la presente invención. Secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar totalmente o en parte mediante técnicas de síntesis de oligonucleótidos . Se pueden utilizar técnicas de reacción en cadena de mutagénesis y polimerasa dirigida al sitio según sea necesario.

Cualquier sistema adecuado de célula hospedera/vector se puede utilizar para la expresión de las secuencias de ADN que codifican las moléculas de anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos . Sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos se pueden utilizar, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos como Fab y F(ab')2 y especialmente los fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpo de cadena simple, por ejemplo, cadena sencilla Fvs . Sistemas eucarióticos , por ejemplo, sistemas de expresión de célula de mamífero, de célula hospedero se pueden utilizar para la producción de moléculas de anticuerpos más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpo completo. Las células hospederas de mamífero, adecuadas incluyen células CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, mieloma o hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención que comprende el cultivo de una célula hospedera, que comprende un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para llevar a la expresión de proteínas de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede abarcar sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo una secuencia de codificación de polipéptido de cadena pesada o cadena ligera debe utilizarse para transfectar las células hospederas. Para la producción de productos que comprenden cadenas ligeras y pesadas, la línea de células se puede transfectar con dos vectores, un primer vector de codificación de un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector de codificación de un polipéptido de cadena pesada. De forma alternativa, un vector sencillo se puede utilizar, el vector incluyendo secuencias de codificación de polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.

Como alternativa, anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden producir por i) expresar una secuencia de ácido nucleico según la invención en una célula y ii) aislar el producto de anticuerpo expresado. Además, el método puede incluir iii) purificar el anticuerpo.

Selección y aislamiento de células B Las células B transformadas se pueden seleccionar para aquellas que producen anticuerpos de la especificidad de antígeno deseado y clones de célula B individuales, a continuación, se pueden producir a partir de las células positivas .

La etapa de selección puede llevarse a cabo por ELISA, por tinción de tejidos o células (incluyendo células transíectadas) , un ensayo de neutralización o uno de un número de otros métodos conocidos en la técnica para la identificación de especificidad de antígeno deseada. El ensayo se puede seleccionar en la base del reconocimiento de antígeno simple, o se puede seleccionar en la base adicional de una función deseada, por ejemplo, para seleccionar anticuerpos de neutralización en lugar de anticuerpos de unión al antígeno, para seleccionar anticuerpos que pueden cambiar las características de células objetivo, tales como sus cascadas de señalización, su forma, su tasa de crecimiento, su capacidad de influir en otras células, su respuesta a la influencia por otras células o por otros reactivos o por un cambio en las condiciones, en su estado de diferenciación, etc.

La etapa de clonación para separar los clones individuales de la mezcla de células positivas puede llevarse a cabo mediante dilución limitante, micro-manipulación, deposición de célula sencilla o por clasificación celular u otro método, conocido en la técnica.

Los clones de células B inmortalizadas de la invención se pueden utilizarse de varias maneras, por ejemplo, como una fuente de anticuerpos monoclonales , como una fuente de ácido nucleico (ADN o AR m) que codifica un anticuerpo monoclonal de interés, para investigación, etc.

La invención proporciona una composición que incluye linfocitos de memoria B inmortalizados, en donde los linfocitos producen anticuerpos con alta potencia de neutralización específicos para hCMV, y en donde se producen los anticuerpos en =5pg por célula por día. La invención también proporciona una composición que incluye clones de un linfocito de memoria B inmortalizado, en donde los clones producen un anticuerpo monoclonal con alta potencia neutralización específica para hCMV, y en donde se produce el anticuerpo en >5pg por célula por día. Preferiblemente dichos clones producen un anticuerpo monoclonal con una alta potencia en neutralizar la infección de hCMV. El clon de célula B inmortalizada preferido de acuerdo con la invención es 6G4.

Epítopes Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para trazar los epítopes a los que se enlazan. Los inventores han descubierto que el anticuerpo 6G4 que neutraliza la infección de hCMV de células endoteliales , células epiteliales, tales como células de la retina y células mieloides, tales como células dendríticas, se dirige hacia un epítope determinado por una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A. Aunque los inventores no desean ligarse por esta teoría, se cree que el anticuerpo 6G4 se enlaza a un epítope conformacional formado por estas tres proteínas.

El epítope reconocido por los anticuerpos de la presente invención puede tener un número de usos. El epítope y mimotopos del mismo en forma purificada o sintética se puede utilizar para aumentar las respuestas inmunes (es decir, como una vacuna, o para la producción de anticuerpos para otros usos) o para la selección de suero de paciente para anticuerpos que inmuno-reaccionan con el epítope o sus mimotopos. En una modalidad de tal epítope o mimotopo, o antígeno compuesto por tal epítope o mimotopo se puede utilizar como una vacuna para el surgimiento de una respuesta inmune. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención también se pueden utilizar en un método de control de calidad de las vacunas. En particular, los anticuerpos se pueden utilizar para comprobar que el antígeno en una vacuna contiene el epítope inmunogénico correcto en la conformación correcta .

El epítope también puede ser útil en la selección para ligandos que se unen a dicho epítope. Tales ligandos, incluyen pero no se limitan a anticuerpos; incluidos los de camellos, tiburones y otras especies, fragmentos de anticuerpos, péptidos, productos de tecnología de despliegue de fago, aptameros, adnectinas o fragmentos de otras proteínas virales o celulares, pueden bloquear el epítope y así prevenir la infección. Dichos ligandos se incluyen dentro del alcance de la invención.

Expresión recombinante Los linfocitos B inmortalizados de memoria de la invención se pueden usar como una fuente de ácido nucleico para la clonación de genes de anticuerpo para expresión recombinante consecutiva. Expresión de fuentes recombinantes es más común para propósitos farmacéuticos que la expresión de células B o hibridomas, por ejemplo, para razones de estabilidad, reproducibilidad, fácil cultivo, etc.

De esta manera la invención provee un método para preparar una célula recombinante , que comprende las etapas de: (i) obtener uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes de cadena pesada y/o ligera) del clon de célula B que codifica el anticuerpo de interés; y (ii) insertar el ácido nucleico en un huésped de expresión a fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en este huésped.

De manera similar, la invención provee un método para preparar una célula recombinante, que comprende las etapas de: (i) secuenciar ácidos nucleicos del clon de célula B que codifica el anticuerpo de interés; y (ii) usar la información de secuencia de la etapa (i) para preparar ácidos nucleicos para inserción en un huésped de expresión a fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en este huésped. El ácido nucleico puede, pero no necesita, ser manipulado entre las etapas (i) y (ii) para introducir los sitios de restricción, para cambiar el uso del codón, y/u optimizar la transcripción y/o traducción de secuencias reguladoras .

La invención también provee un método para preparar una célula recombinante, que comprende la etapa de transformar una célula huésped con uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo monoclonal de interés, en dónde los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos que se derivan de un clon de célula B inmortalizada de la invención. De esta manera, los procedimientos para primero preparar los ácidos nucleicos y después usarlos para transformar una célula huésped se puede realizar en diferentes tiempos por personas diferentes en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes ciudades) .

Estas células recombinantes de la invención después se pueden usar para expresión y propósitos de cultivo. Estos son útiles particularmente para expresión de anticuerpos para producción farmacéutica a gran escala. Esto también se puede usar como el ingrediente activo de una composición farmacéutica. Cualquiera de las técnicas de cultivo adecuadas se pueden usar, que incluyen pero no se limitan a cultivo estático, cultivo de botella rotatoria, fluido de ascitis, cartucho de biorreactor de tipo fibra hueca, mini- termentador modular, tanque agitado, cultivo microportador, perfusión de núcleo cerámico, etc.

Métodos para obtener y secuenciar genes de inmunoglobulina de células B son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase la referencia 37) .

La célula huésped es preferiblemente una célula eucariótica, que incluye levadura y células animales, particularmente células de mamífero (por ejemplo, células CHO, células NSO, células humanas tal como células PER.C6 [Crucell; referencia 38] o HKB-ll [Bayer; referencias 39 & 40], células de mieloma [41 & 42], etc.), así como células de planta. Huéspedes de expresión preferidos pueden glicosilar el anticuerpo de la invención, particularmente con estructuras de carbohidrato que no son por si mismas inmunogénicas en humanos. En una modalidad el huésped de expresión puede ser capaz de crecer en medio libre de suero. En "una modalidad adicional el huésped de expresión puede ser capaz de crecer en cultivo sin la presencia de productos derivados de animal .

El huésped de expresión se puede cultivar para proporcionar una línea celular.

La invención provee un método para preparar una o más moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, genes de cadena ligera y pesada) que codifican un anticuerpo de interés, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de célula B inmortalizada de acuerdo con la invención; (ii) obtener el ácido nucleico de clon de célula B que codifica el anticuerpo de interés . La invención también provee un método para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de célula B inmortalizada de acuerdo con la invención; (ii) secuenciar el ácido nucleico del clon de célula B que codifica el anticuerpo de interés.

La invención también provee un método para preparar moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de interés, que comprende la etapa de obtener el ácido nucleico de un clon de célula B que se obtiene de una célula B transformada de la invención. De esta manera los procedimientos para primero obtener el clon de célula B y después preparar ácidos nucleicos de este se pueden realizar en tiempos muy diferentes por personas diferentes en lugares diferentes (por ejemplo, en diferentes ciudades) .

La invención provee un método para preparar un anticuerpo (por ejemplo, para uso farmacéutico) , que comprende las etapas de: (i) obtener y/o secuenciar uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes de cadena pesada y ligera) del clon de célula B seleccionado que expresa el anticuerpo de interés; (ii) insertar los ácidos nucleicos en o usar los ácidos nucleicos para preparar un huésped de expresión que puede expresar el anticuerpo de interés (iii) cultivar o sub-cultivar el huésped de expresión bajo condiciones donde el anticuerpo de interés se expresa; y, opcionalmente , (iv) purificar el anticuerpo de interés.

La invención también provee un método para preparar un anticuerpo que comprende las etapas de: cultivar o sub-cultivar una población de célula huésped de expresión bajo condiciones donde el anticuerpo de interés se expresa y, opcionalmente, purificar el anticuerpo de interés, en donde dicha población de célula huésped de expresión se ha preparado por (i) proveer ácidos nucleicos que codifican una célula B seleccionada el anticuerpo de interés que se produce por una población de linfocitos de memoria B preparados como se describe anteriormente, (ii) insertar los ácidos nucleicos en un huésped de expresión que puede expresar el anticuerpo de interés, y (iii) cultivar o sub-cultivar huéspedes de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos insertados para producir dicha población de célula huésped de expresión. De esta manera los procedimientos para primero preparar el huésped de expresión recombinante y después cultivarlo para expresar anticuerpo se pueden realizar en tiempos muy diferentes por personas diferentes en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes ciudades) .

Composiciones farmacéuticas La invención provee una composición farmacéutica que contiene los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo de la invención y/o ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos y/o células B inmortalizadas que expresan dichos anticuerpos y/o los epítopes reconocidos por los anticuerpos de la invención. Una composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable para permitir la administración. El portador no debe inducir por si mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y no deben ser tóxicos. Portadores adecuados pueden ser grandes, macromoléculas metabolizadas lentamente tal como proteínas, polipéptidos , liposomas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y partículas de virus inactivas.

Sales farmacéuticamente aceptables se pueden usar, por ejemplo sales de ácido mineral, tal como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tal como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos .

Portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener de manera adicional líquidos tales como agua, salina, glicerol y etanol. De manera adicional, sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o de emulsionamiento o sustancias reguladoras de pH, pueden estar presentes en dichas composiciones. Dichos portadores permiten a las composiciones farmacéuticas ser formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para ingestión por el paciente.

Dentro del alcance de la invención, las formas de administración pueden incluir aquellas formas adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión, por ejemplo por inyección de bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tal como agentes de suspensión, conservadores, estabilización y/o dispersión. De manera alternativa, la molécula de anticuerpo puede ser en forma seca, para reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado .

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. En una modalidad las composiciones se adaptan para administración a sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de rutas que incluyen, pero no se limitan a, rutas oral, intravenosa, Intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal , intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. Hipo-rociadores también se puede usar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Usualmente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar.

Suministro directo de las composiciones generalmente será realizado mediante inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente , intravenosamente o intramuscularmente , o suministradas al espacio intersticial de un tejido.

Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. Tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiple. Farmacéuticos basados en anticuerpo conocidos proveen una guía en relación con la frecuencia de administración, por ejemplo, si un farmacéutico se debe suministrar diariamente, semanalmente, mensualmente, etc. La frecuencia y dosificación también puede depender de la severidad de los síntomas .

Composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (por ejemplo, una composición liofilizada, tipo Synagis™ y Herceptin™, para reconstitución con agua estéril que contiene un conservador) . La composición se puede preparar para administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral, por ejemplo, como una tableta o cápsula, como un rociador, o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un rociador. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede ser en forma de kit, diseñado tal que una composición combinada se reconstituye justo antes de la administración a un paciente. Por ejemplo, un anticuerpo liofilizado se puede proveer en forma de kit con un agua estéril o regulador de pH estéril.

Será apreciado que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y sus derivados. Como tal, será susceptible a degradación en el tracto gastrointestinal. De esta manera, si la composición es para ser administrada por una ruta usando el tacto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes los cuales protegen el anticuerpo ¦ de la degradación pero que liberan el anticuerpo una vez que ha sido absorbido del tracto gastrointestinal.

Una discusión a fondo de portadores farmacéuticamente aceptables es disponible de Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN: 0683306472.

Composiciones farmacéuticas de la invención generalmente tienen un pH entre 5.5 y 8.5, en algunas modalidades estas pueden estar entre 6 y 8, y en modalidades adicionales aproximadamente 7. El pH se puede mantener por el uso de un regulador de pH. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógeno. La composición puede ser isotónica con respecto a humanos. En una modalidad composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en contenedores sellados herméticamente.

Composiciones farmacéuticas incluirán una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención y/o una o más células B inmortalizadas de . la invención y/o un polipéptido que comprende un epítope que une un anticuerpo de la invención, es decir, una cantidad que es suficiente para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición deseada, o para exhibir un efecto terapéutico detectable . Efectos terapéuticos también incluyen la reducción en síntomas físicos. La cantidad efectiva precisa para cualquier sujeto particular dependerá de su tamaño y salud, la naturaleza y el grado de la condición, y los terapéuticos o combinación de terapéuticos seleccionados para administración. La cantidad efectiva para una situación dada se determina mediante experimentación de rutina y está dentro del juicio de un médico clínico. Para propósitos de la presente invención, una dosis efectiva generalmente será de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de las composiciones de la presente invención en el individuo al cual este se administra. Farmacéuticos basados en anticuerpo conocidos proveen la guía en este respecto, por ejemplo, Herceptin™ se administra por infusión intravenosa de una solución de 21 mg/ml, con una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de peso del cuerpo una dosis de mantenimiento semanalmente de 2 mg/kg de peso del cuerpo; Rituxan™ se administra semanalmente a 375 mg/m2; etc.

En una modalidad composiciones pueden incluir más de un anticuerpo (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) de la invención para proveer un efecto terapéutico aditivo o sinergístico . En una modalidad adicional la composición puede comprender uno o más anticuerpos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc . ) o fragmentos de anticuerpo de la invención y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) o fragmentos de anticuerpo contra hCMV. Por ejemplo, un anticuerpo puede unir al epítope determinado por una combinación de las proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A mientras otro puede unir a una proteína de hCMV adicional . Dentro de sus modalidades la proteína de hCMV puede ser gB, gH, gL, gM, gN, gO, UL128, UL130 o UL131A, o su combinación. En una modalidad adicional, el segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser específico para el epítope que se reconoce por MSL-109, 8F9 o 3E3. En aún una modalidad adicional, un anticuerpo se puede dirigir al mecanismo que media la infección de fibroblastos, mientras el otro anticuerpo puede ser dirigido al mecanismo que media la infección de células endoteliales . Para efecto clínico óptimo puede ser muy ventajoso para dirigir ambos mecanismos de infección y mantenimiento de hCMV.

Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden administrar (ya sea de manera combinada o separada) con otros terapéuticos, por ejemplo con compuestos quimioterapéuticos , con radioterapia, etc. Compuestos terapéuticos preferidos incluyen compuestos antivirales tal como ganciclovir, foscarnet y cidofovir. Dicha terapia de combinación provee un mejoramiento aditivo o sinergístico en eficacia terapéutica en relación con agentes terapéuticos individuales cuando se administran solos . El término "sinergia" se usa para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de efectos individuales de cada agente activo respectivo. De esta manera, cuando el efecto combinado de dos o más agentes resulta en "inhibición sinergística" de una actividad o procedimiento, se intenta que la inhibición de la actividad o procedimiento es mayor que . la suma de efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término "efecto terapéutico sinergístico" se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias en donde el efecto terapéutico (como se mide por cualquier número de parámetros) es mayor que la suma de efectos terapéuticos individuales observados con terapias individuales respectivas.

Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden administrar a aquellos pacientes que no han mostrado previamente respuesta al tratamiento para infección de hCMV, es decir, se ha mostrado que es refractivo a tratamiento anti-hCMV. Dicho tratamiento puede incluir tratamiento previo con un agente anti-viral. Esto puede ser debido a, por ejemplo, infección con una cepa resistente antiviral de hCMV.

En composiciones de la invención que incluyen anticuerpos de la invención, los anticuerpos pueden hacer al menos 50% en peso (por ejemplo, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) de la proteína total en la composición. Los anticuerpos son de esta manera en forma pura .

La invención provee un método para preparar un farmacéutico, que comprende las etapas de: (i) preparar un anticuerpo de la invención; y (ii) mezclar el anticuerpo purificado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables .

La invención también provee un método para preparar un f rmacéutico, que comprende la etapa de mezclar un anticuerpo con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se obtiene de una célula B transformada de la invención. De esta manera los procedimientos para primero obtener el anticuerpo monoclonal y después preparar el farmacéutico se puede realizar en tiempos muy diferentes por personas diferentes en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes ciudades) .

Como una alternativa para suministrar anticuerpos o células B para propósitos terapéuticos, es posible suministrar ácido nucleico (usualmente ADN) que codifica el. anticuerpo monoclonal (o su fragmento activo) de interés para un sujeto, tal que el ácido nucleico se puede expresar en el sujeto in situ para proveer un efecto terapéutico deseado. Terapia genética adecuada y vectores de suministro de ácido nucleico son conocidos en la técnica.

Composiciones de la invención pueden ser composiciones inmunogénicas , y en algunas modalidades pueden ser composiciones de vacuna que comprenden un antígeno que comprende un epítope encontrado en una combinación de proteínas de hCMV UL128, UL130 y UL131A. Composiciones alternativas pueden comprender (i) un antígeno que comprende un epítope formado por una combinación de proteínas de hCMV UL128, UL130 y UL131A, y (ii) un antígeno que comprende un epítope encontrado en proteínas de hCMV gB, gH, gL, gM, gN, gO, UL128, UL130 y UL131A, o su combinación. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección) .

Composiciones pueden incluir un anti-microbiano, particularmente si se empaca en un formato de dosis múltiple.

Composiciones pueden comprender detergente, por ejemplo un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. Detergentes están generalmente presentes en bajos niveles por ejemplo, <0.01%.

Composiciones pueden incluir sales sódicas (por ejemplo, cloruro de sodio) para proporcionar tonicidad. Una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl es usual.

Composiciones pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sucrosa o trehalosa) por ejemplo, en alrededor de 15-30 mg/ml (por ejemplo, 25 mg/ml) , particularmente si son liofilizados o si incluyen material que se ha reconstituido de material liofilizado. El pH de una composición para liofilización se puede ajustar a alrededor de 6.1 antes de la liofilización.

Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunoreguladores . En una modalidad, uno o más de agentes inmunoreguladores incluyen un adyuvante .

Las composiciones de epítope de la invención pueden provocar una respuesta inmune mediada por célula así como una respuesta inmune humoral a fin de dirigir efectivamente una infección de hCMV. Esta respuesta inmune puede inducir anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralización) y una inmunidad mediada por célula que puede responder rápidamente en la exposición a hCMV.

Tratamientos y usos médicos Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención, o derivados y variantes de los mismos se pueden usar para el tratamiento de infección de hCMV, para la prevención de infección de hCMV o para el diagnóstico de infección de hCMV.

Métodos de diagnóstico pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Dichas muestras pueden ser muestras de tejido tomadas de, por ejemplo, glándulas salivares, pulmón, hígado, páncreas, riñon, oído, ojo, placenta, tracto alimentario, corazón, ovarios, pituitaria, adrenales, tiroides, cerebro o piel. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir la detección de un complejo de antígeno/anticuerpo .

La invención por lo tanto provee (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o variantes y derivados de los mismos de acuerdo con la invención, (ii) un clon de célula B inmortalizada de acuerdo con la invención, (iii) un epítope capaz de unir un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 6G4 , o (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unir un epítope que une un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 6G4 , para uso en terapia.

También se provee un método para tratar a un paciente que comprende administrar a este paciente (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o variantes y sus derivados de acuerdo con la invención, (ii) un clon de célula B inmortalizada de acuerdo con la invención, (iii) un epítope capaz de unir un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 6G4, o (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unir un epítope que une un anticuerpo de la invención, por ej emplo 6G4.

La invención también provee el uso de (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o variantes y sus derivados de acuerdo con la invención, (ii) un clon de célula B inmortalizada de acuerdo con la invención, (iii) un epítope capaz de unir un anticuerpo de la invención, por ejemplo 6G4, o (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unir un epítope que une un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 6G4 en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de infección de hCMV.

La invención provee una composición de la invención para uso como un medicamento para la prevención o tratamiento de una infección de hCMV. También se provee el uso de un anticuerpo de la invención y/o una proteína que comprende un epítope al cual dicho anticuerpo se une en la fabricación de un medicamento para tratamiento de un paciente y/o diagnóstico en un paciente. También se provee un método para tratar un sujeto y/o realizar diagnóstico en un sujeto, que comprende la etapa de administrar a este una composición de la invención. En algunas modalidades el sujeto puede ser un humano. Una manera de verificar la eficacia de tratamiento terapéutico involucra monitorear síntomas de enfermedad después de la administración de la composición de la invención. El tratamiento puede ser un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiple.

En una modalidad, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, clon de célula B inmortalizada, epítope o composición de acuerdo con la invención se administra a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento. Dicho sujeto incluye, pero no se limita a, uno quien está particularmente en riesgo de o susceptible a infección de hCMV, que incluye, por ejemplo, un sujeto inmunocomprometido . Sujetos ejemplares incluyen aquellos que padecen de VIH o experimentan terapia inmunosupresora, tal como pacientes de transplante.

Anticuerpos de la invención se pueden usar en inmunización pasiva.

Anticuerpos y sus fragmentos como se describe en la presente invención también se pueden usar en un kit para el diagnóstico de infección de hCMV.

Epítopes capaces de unir un anticuerpo de la invención, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 6G4 , se puede usar en un kit para monitorear la eficacia de procedimientos de vacunación al detectar la presencia de anticuerpos anti-hC V protectores.

Anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o variantes y sus derivados, como se describe en la presente invención también se pueden usar en un kit para monitorear la fabricación de la vacuna con la inmunogenicidad deseada.

La invención también provee un método para preparar un farmacéutico, que comprende la etapa de mezclar un anticuerpo monoclonal con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal que se obtiene de un huésped de expresión de la invención. De esta manera los procedimientos para primero obtener el anticuerpo monoclonal (por ejemplo al expresarlo y/o purificarlo) y después mezclarlo con los portadores farmacéuticos se pueden realizar en tiempos muy diferentes por personas diferentes en lugares diferentes (por ejemplo, en diferentes ciudades) .

Iniciando con la célula B transformada de la invención, varias etapas de cultivo, sub-cultivo, clonación, sub-clonación, secuenciación, preparación de ácido nucleico etc. se puede realizar a fin de perpetuar el anticuerpo expresado por la célula B transformada, con optimización opcional en cada etapa. En una modalidad preferida, los métodos anteriores además comprenden técnicas de optimización (por ejemplo, maduración de afinidad u optimización) aplicadas a los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo.

La invención incluye todas las células, ácidos nucleicos, vectores, secuencias, anticuerpos, etc. usados y preparados durante cada una de las etapas .

En todos estos métodos, el ácido nucleico usado en el huésped de expresión se puede manipular para insertar, suprimir o enmendar ciertas secuencias de ácido nucleico. Cambios de dicha manipulación incluyen, pero no se limitan a, cambios para introducir sitios de restricción, para enmendar el uso de codón, añadir u optimizar la transcripción y/o traducción de secuencias reguladoras, etc. También es posible cambiar el ácido nucleico para alterar los aminoácidos codificados. Por ejemplo, pueden ser útil para introducir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) sustituciones de aminoácido, supresiones y/o inserciones en la secuencia de aminoácido de anticuerpo. Dichas mutaciones de punto pueden modificar funciones efectoras, afinidad de unión a antígeno, modificacionés post-translacionales , inmunogenicidad etc., pueden introducir aminoácidos para la unión de grupos covalentes (por ejemplo etiquetas) o pueden introducir marcadores (por ejemplo para propósitos de purificación) . Mutaciones se pueden introducir en sitios específicos o se pueden introducir en manera aleatoria, seguido por selección (por ejemplo, evolución molecular) .

General El término "que comprende" incluye "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo una composición que es "sustancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" se puede omitir de la definición de la invención.

El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

El término "enfermedad" como se usa aquí se destina a ser generalmente sinónimo, y se usa de manera intercambiable con, los términos "trastorno" y "condición" (como en condición médica) , en todo refleja una condición anormal del cuerpo humano o animal de una de sus partes que daña el funcionamiento normal, usualmente se manifiestan al distinguir los signos y síntomas y causa que el humano o animal tenga una duración o calidad de vida reducida.

Como se usa aquí, la referencia a "tratamiento" de un paciente se destina a incluir la prevención y profilaxis. El término "paciente" significa todos los mamíferos que incluyen humanos. Ejemplos de pacientes incluyen humanos, vacas, perros, gatos, caballos, cabras, ovejas, cerdos, y conejos. Generalmente, el paciente es un humano.

Los siguientes ejemplos se proveen a manera de ilustración solamente, y no se destinan a ser limitantes.

EJEMPLO 1 Clonación de células B y clasificación para actividad de neutralización de hCMV Un donador con titulaciones de anticuerpo de neutralización de hCMV alto en el suero se identifica. Las células B de memoria se aislan y se inmortalizan usando EBV y CpG como se describe en la referencia 36. Brevemente, las células B de memoria se aislan mediante selección negativa usando perlas de CD22, seguido por remoción de células B IgM+, IgD+, IgA+ que usan anticuerpos específicos y clasificación de célula. Las células clasificadas (IgG+) se inmortalizan con EBV en la presencia de CpG 2006 y células mononucleares alogenéicas irradiadas. Cultivos duplicados cada uno que contiene 50 células B de memoria se exponen en veinte placas de fondo U de 96 pozos. Después de dos semanas los sobrenadantes de cultivo se colectan y se analizan para su capacidad de neutralizar la infección de hCMV de cada uno de los fibroblastos o células epiteliales en ensayos separados. Los clones de célula B se aislan de cultivos policlonales positivos como se describe en la referencia 36.

Concentraciones de IgG en el sobrenadante de clones seleccionados se determina usando un ELISA específico de IgG.

Para el ensayo de neutralización viral una cantidad titulada de un aislado de hCMV clínico se mezcla con un volumen igual de sobrenadante de cultivo o con diluciones de suero humano que contiene anticuerpos de neutralización. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente la mezcla se añade a monocapas confluentes de células endoteliales (por ejemplo, células HMEC-1) , células epiteliales (por ejemplo, células retínales ARPE) o fibroblastos (por ejemplo, MRC-9 o células madre mesenquimales) en placas de fondo plano de 96 pozos y se incuban a 37°C durante dos días. El sobrenadante se desecha, las células se fijan con metanol frío y se tiñen con una mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón a antígenos tempranos de hCMV, seguido por Ig anti-ratón de cabra etiquetado con fluoresceína . Las placas se analizan usando un microscopio de fluorescencia. En la ausencia de anticuerpos de neutralización las células infectadas son ~1 , 000/campo, mientras en la presencia de concentraciones de saturación de anticuerpos de neutralización la infección es completamente inhibida. El ensayo de neutralización viral también se realiza usando células dendríticas como células objetivo. El valorador de neutralización se indica como la concentración de anticuerpo ^g/ml) que proporciona una reducción de 50% de infección de hCMV.

El cuadro 2 muestra que 6G4 , que se ha mostrado que es específico para una combinación de UL128, U1130 y U1131A, es capaz de neutralizar la infección de hCMV de células endoteliales , retínales y dendríticas en concentraciones muy bajas (es decir, con alta potencia) .

CUADRO 2 *Sin neutralización en la concentración más alta analizada (es decir, > 2µ9/p?1) . ACitotect (biotest) es una mezcla de IgG hiper-inmune de hCMV.

EJEMPLO 2 Identificación de antígenos objetivo reconocidos por los anticuerpos monoclonales Para planificar las especificidades del anticuerpo monoclonal humano 6G4 que neutraliza la infección de células endoteliales, vectores de expresión que codifican UL128, UL130, UL131A de longitud completa, gH y gL se construyen.

Células HEK293T se transfectan con estos vectores solos o en combinación. Después de 36 horas, las células se fijan, se permeabilizan y se tiñen con 6G4 seguido por IgG anti-humano de cabra. La figura 1 muestra que células teñidas con 6G4 de anticuerpo monoclonal co-expresan al menos UL128, UL130 y UL131A. La intensidad de teñido de 6G4 se incrementa cuando gH y gL se co- transfectan junto con UL128, UL130 y UL131A para reconstituir gCIII complejo de glicoproteína completo putativo. Estos datos sugieren que el anticuerpo monoclonal 6G4 es especifico para un epítope conformacional determinado por una combinación de proteínas de hCMV UL128, UL130 y UL131A. Más probablemente este epítope está en conformación propia solamente cuando UL128, UL130 y UL131A se montan en gCIII con gH y gL.

Será entendido que la invención se ha descrito a manera de ejemplo solamente y las modificaciones se pueden hacer mientras permanezcan dentro del alcance y esencia de la invención.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. - Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es específico para una combinación de proteínas hCMV UL128, UL130 y UL131A y neutraliza la infección de células endoteliales , células retínales, o células dendríticas por medio de citomegalovirus humano (hCMV) , en donde la concentración de anticuerpo requerida para un 50% de neutralización de hCMV es 0.1 µg/ml o menos.

2. - El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el epítope es un epítope conformacional formado por las tres proteínas .

3. - El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende secuencias de región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, respectivamente, o secuencias de región variable de cadena ligera CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se exponen en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, y SEQ ID NO: 6, respectivamente.

4. - El anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 7 y/o una región variable de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 8.

5. - El anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo de cadena sencilla, Fab, Fab' , F(ab')2/ Fv o scFv.

6. - Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la infección de hCMV y se une al mismo epítope como el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 4 o compite para la unión a hCMV con el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 4.

7. - Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 3-5.

8. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a cualquiera de SEQ ID Nos: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16.

9. - Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 o 8.

10. - Una célula que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 9.

11. - Una célula aislada que expresa el anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12.- Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o el ácido nucleico de la reivindicación 7 o 8, y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un segundo anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza infección de hC V.

13. - Uso del anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, el ácido nucleico de la reivindicación 7 o 8, o la célula de la reivindicación 10, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de infección de hCMV.

14. - Un método para producir el anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende (i) cultivar la célula de la reivindicación 10 y (ii) aislar el anticuerpo o fragmento.