JPH053794A - 抗サイトメガロウイルスヒトモノクローナル抗体およびその産生細胞 - Google Patents
抗サイトメガロウイルスヒトモノクローナル抗体およびその産生細胞Info
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- JPH053794A JPH053794A JP3183189A JP18318991A JPH053794A JP H053794 A JPH053794 A JP H053794A JP 3183189 A JP3183189 A JP 3183189A JP 18318991 A JP18318991 A JP 18318991A JP H053794 A JPH053794 A JP H053794A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 (1) 分子量78,000のサイトメガロウィルス抗
原蛋白、(2) 分子量80,000のサイトメガロウィルス抗原
蛋白、(3) 分子量56,000と85,000と120,000 のサイトメ
ガロウィルス抗原蛋白、または(4) 分子量52,000のサイ
トメガロウィルス抗原蛋白に対して反応性を有するヒト
モノクローナル抗体。上記のモノクローナル抗体を産生
する細胞。 【効果】 この抗体は、サイトメガロウィルス感染症に
たいする診断薬、予防薬または治療薬として有用であ
る。
原蛋白、(2) 分子量80,000のサイトメガロウィルス抗原
蛋白、(3) 分子量56,000と85,000と120,000 のサイトメ
ガロウィルス抗原蛋白、または(4) 分子量52,000のサイ
トメガロウィルス抗原蛋白に対して反応性を有するヒト
モノクローナル抗体。上記のモノクローナル抗体を産生
する細胞。 【効果】 この抗体は、サイトメガロウィルス感染症に
たいする診断薬、予防薬または治療薬として有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定の分子量のサイト
メガロウィルス抗原蛋白を認識するヒトモノクローナル
抗体およびその産生細胞に関する。
メガロウィルス抗原蛋白を認識するヒトモノクローナル
抗体およびその産生細胞に関する。
【０００２】
【従来技術】サイトメガロウィルス（cytomegalovirus,
以下ＣＭＶと略記する）はヘルペスウィルス属に属する
ウィルスの一種であり、ＤＮＡ、コア蛋白、キャプシド
とエンベロープからなる。成人の半数以上がこのウィル
スに感染しているが、多くの場合は不顕性感染であり特
に症状は現れない。近年、次の点によりＣＭＶ感染症が
注目されている。一つは、新生児にみられるＣＭＶ感染
症で、大部分は無症候性に経過するが、少数例において
中枢神経障害、黄疸、肝炎、肺炎などの症状が現れる。
また臓器移植に伴うＣＭＶ感染症も注目されている。移
植後の免疫抑制された患者においては発熱、白血球減
少、リンパ球増多、肺炎、肝炎などを起こし、しばしば
致命的な感染症を引き起こす。従って、ＣＭＶ感染症の
診断、予防および治療に有効な試薬および医薬品が強く
求められている。
以下ＣＭＶと略記する）はヘルペスウィルス属に属する
ウィルスの一種であり、ＤＮＡ、コア蛋白、キャプシド
とエンベロープからなる。成人の半数以上がこのウィル
スに感染しているが、多くの場合は不顕性感染であり特
に症状は現れない。近年、次の点によりＣＭＶ感染症が
注目されている。一つは、新生児にみられるＣＭＶ感染
症で、大部分は無症候性に経過するが、少数例において
中枢神経障害、黄疸、肝炎、肺炎などの症状が現れる。
また臓器移植に伴うＣＭＶ感染症も注目されている。移
植後の免疫抑制された患者においては発熱、白血球減
少、リンパ球増多、肺炎、肝炎などを起こし、しばしば
致命的な感染症を引き起こす。従って、ＣＭＶ感染症の
診断、予防および治療に有効な試薬および医薬品が強く
求められている。
【０００３】ＣＭＶのようなウィルスによる感染症の予
防、治療には、そのウィルスに特異的なモノクローナル
抗体が有効な手段であり、特にヒト由来であるヒトモノ
クローナル抗体が副作用の少ない点で望ましい。一般に
ヒトモノクローナル抗体は、マウスミエローマ細胞、ヒ
トミエローマ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞とヒト
リンパ球とを細胞融合して得られるハイブリドーマから
産生される。あるいはヒトリンパ球をエプスタイン−バ
ーウィルス（ＥＢウィルス）によって形質転換させたリ
ンパ芽球細胞からも産生される。これまでＣＭＶに対す
るヒトモノクローナル抗体を作製する種々の試みがなさ
れているが、それぞれに問題点があった。マウスミエロ
ーマ細胞とヒトリンパ球との細胞融合で得られたヒト−
マウスハイブリドーマはモノクローナル抗体の産生が不
安定である。ヒトミエローマ細胞とヒトリンパ球との細
胞融合は融合効率が低い。また、ＥＢウィルスにより形
質転換したリンパ芽球細胞はモノクローナル抗体の産生
量が少なく、安定に産生されない。
防、治療には、そのウィルスに特異的なモノクローナル
抗体が有効な手段であり、特にヒト由来であるヒトモノ
クローナル抗体が副作用の少ない点で望ましい。一般に
ヒトモノクローナル抗体は、マウスミエローマ細胞、ヒ
トミエローマ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞とヒト
リンパ球とを細胞融合して得られるハイブリドーマから
産生される。あるいはヒトリンパ球をエプスタイン−バ
ーウィルス（ＥＢウィルス）によって形質転換させたリ
ンパ芽球細胞からも産生される。これまでＣＭＶに対す
るヒトモノクローナル抗体を作製する種々の試みがなさ
れているが、それぞれに問題点があった。マウスミエロ
ーマ細胞とヒトリンパ球との細胞融合で得られたヒト−
マウスハイブリドーマはモノクローナル抗体の産生が不
安定である。ヒトミエローマ細胞とヒトリンパ球との細
胞融合は融合効率が低い。また、ＥＢウィルスにより形
質転換したリンパ芽球細胞はモノクローナル抗体の産生
量が少なく、安定に産生されない。
【０００４】ＣＭＶに対するヒトモノクローナル抗体に
関しては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマイトージェン存在下
に、ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは糖蛋白で感
作したヒトリンパ球と、マウスミエローマ細胞とを融合
させる方法によって、抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体
を得る方法がＷＯ８７／０３６０２（特願昭６１−５０
６２３３）に開示されている。
関しては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマイトージェン存在下
に、ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは糖蛋白で感
作したヒトリンパ球と、マウスミエローマ細胞とを融合
させる方法によって、抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体
を得る方法がＷＯ８７／０３６０２（特願昭６１−５０
６２３３）に開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、マウス
ミエローマ細胞とヒトリンパ球との細胞融合で得られた
ハイブリドーマはヒト抗体と共にマウスの蛋白質を合
成、分泌し、これらはヒトにとって異物として認識され
るため、ヒトへ投与するモノクローナル抗体の産生細胞
としては適当でない。また、ＣＭＶは多くの抗原物質に
よって構成されているが、前記のヒトモノクローナル抗
体は分子量約64,000の抗原蛋白と分子量約130,000 と分
子量約55,000の抗原蛋白を認識する２種類が確認されて
おり、このうち分子量約64,000の抗原蛋白を認識するヒ
トモノクローナル抗体はウィルス中和能を有しておら
ず、ＣＭＶ感染の予防および治療には不適当である。従
って、さらに多様なＣＭＶ抗原蛋白に対して反応するヒ
トモノクローナル抗体が要求されている。
ミエローマ細胞とヒトリンパ球との細胞融合で得られた
ハイブリドーマはヒト抗体と共にマウスの蛋白質を合
成、分泌し、これらはヒトにとって異物として認識され
るため、ヒトへ投与するモノクローナル抗体の産生細胞
としては適当でない。また、ＣＭＶは多くの抗原物質に
よって構成されているが、前記のヒトモノクローナル抗
体は分子量約64,000の抗原蛋白と分子量約130,000 と分
子量約55,000の抗原蛋白を認識する２種類が確認されて
おり、このうち分子量約64,000の抗原蛋白を認識するヒ
トモノクローナル抗体はウィルス中和能を有しておら
ず、ＣＭＶ感染の予防および治療には不適当である。従
って、さらに多様なＣＭＶ抗原蛋白に対して反応するヒ
トモノクローナル抗体が要求されている。
【０００６】本発明の目的は、従来の抗ＣＭＶヒトモノ
クローナル抗体が反応性を有していないＣＭＶ抗原蛋白
に対しても反応性を有するヒトモノクローナル抗体を提
供することである。さらに本発明の他の目的は、抗ＣＭ
Ｖヒトモノクローナル抗体を安定に産生する細胞株を提
供することである。
クローナル抗体が反応性を有していないＣＭＶ抗原蛋白
に対しても反応性を有するヒトモノクローナル抗体を提
供することである。さらに本発明の他の目的は、抗ＣＭ
Ｖヒトモノクローナル抗体を安定に産生する細胞株を提
供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく鋭意検討した結果、ヒトリンパ球または
ヒトリンパ芽球とＩＭ−９由来のヒポキサンチン−グア
ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損突然変異
株かつウアバイン耐性突然変異株とを細胞融合して得ら
れた細胞から従来の抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体で
は認識できなかったＣＭＶ抗原蛋白を認識する新規な抗
ＣＭＶヒトモノクローナル抗体が得られることを見出し
本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らはこれ
らの新規なヒトモノクローナル抗体の中のあるものは補
体を添加することによりＣＭＶに対する中和活性が増強
されることを見出した。
的を達成すべく鋭意検討した結果、ヒトリンパ球または
ヒトリンパ芽球とＩＭ−９由来のヒポキサンチン−グア
ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損突然変異
株かつウアバイン耐性突然変異株とを細胞融合して得ら
れた細胞から従来の抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体で
は認識できなかったＣＭＶ抗原蛋白を認識する新規な抗
ＣＭＶヒトモノクローナル抗体が得られることを見出し
本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らはこれ
らの新規なヒトモノクローナル抗体の中のあるものは補
体を添加することによりＣＭＶに対する中和活性が増強
されることを見出した。
【０００８】本発明の抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体
は次の特性を有するモノクローナル抗体から選ばれるも
のである。 (1) 分子量78,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 (2) 分子量80,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 (3) 分子量56,000と85,000と120,000 のサイトメガロウ
ィルス抗原蛋白に対して反応性を有するヒトモノクロー
ナル抗体。 (4) 分子量52,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。
は次の特性を有するモノクローナル抗体から選ばれるも
のである。 (1) 分子量78,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 (2) 分子量80,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 (3) 分子量56,000と85,000と120,000 のサイトメガロウ
ィルス抗原蛋白に対して反応性を有するヒトモノクロー
ナル抗体。 (4) 分子量52,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。
【０００９】また、本発明の抗ＣＭＶヒトモノクローナ
ル抗体を産生する細胞は、ヒトリンパ球またはヒトリン
パ芽球とＩＭ−９由来のヒポキサンチン−グアニン−ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ欠損突然変異株かつウ
アバイン耐性突然変異株とを細胞融合して得られた細胞
の中からＣＭＶに対するヒトモノクローナル抗体を産生
する細胞を選別して得られる。
ル抗体を産生する細胞は、ヒトリンパ球またはヒトリン
パ芽球とＩＭ−９由来のヒポキサンチン−グアニン−ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ欠損突然変異株かつウ
アバイン耐性突然変異株とを細胞融合して得られた細胞
の中からＣＭＶに対するヒトモノクローナル抗体を産生
する細胞を選別して得られる。
【００１０】本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＣＭ
Ｖおよび／またはＣＭＶ感染細胞に対して反応性を有す
る。本発明のヒトモノクローナル抗体のクラスはＩｇＧ
であり、サブクラスはＩｇＧ１とＩｇＧ３に分類され
る。
Ｖおよび／またはＣＭＶ感染細胞に対して反応性を有す
る。本発明のヒトモノクローナル抗体のクラスはＩｇＧ
であり、サブクラスはＩｇＧ１とＩｇＧ３に分類され
る。
【００１１】前記（１）〜（４）の特性を有する本発明
の抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体はそれぞれＥ４６、
Ｋ３５７、Ｋ６３３、Ｉ３５１と命名され、これらの抗
体の産生細胞はそれぞれ発酵研究所（ＩＦＯ）において
寄託番号ＩＦＯ ５０３３８、ＩＦＯ ５０３３９、Ｉ
ＦＯ ５０３３７、ＩＦＯ ５０３３６として寄託され
ている。
の抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体はそれぞれＥ４６、
Ｋ３５７、Ｋ６３３、Ｉ３５１と命名され、これらの抗
体の産生細胞はそれぞれ発酵研究所（ＩＦＯ）において
寄託番号ＩＦＯ ５０３３８、ＩＦＯ ５０３３９、Ｉ
ＦＯ ５０３３７、ＩＦＯ ５０３３６として寄託され
ている。
【００１２】上記ヒトモノクローナル抗体のうち、Ｅ４
６，Ｋ３５７，Ｋ６３３はＣＭＶを中和（不活化）する
能力を有する。またＥ４６，Ｋ３５７の２種は、補体非
存在下においても中和能を有することが特徴である。特
に、Ｅ４６は補体非存在下で中和活性を有し、かつ補体
によって中和活性が増強される。当該補体としては、ヒ
ト、モルモット、ウサギ起源のものが例示される。好適
な補体の種類はヒト補体である。当該補体は血清として
添加してもよい。
６，Ｋ３５７，Ｋ６３３はＣＭＶを中和（不活化）する
能力を有する。またＥ４６，Ｋ３５７の２種は、補体非
存在下においても中和能を有することが特徴である。特
に、Ｅ４６は補体非存在下で中和活性を有し、かつ補体
によって中和活性が増強される。当該補体としては、ヒ
ト、モルモット、ウサギ起源のものが例示される。好適
な補体の種類はヒト補体である。当該補体は血清として
添加してもよい。
【００１３】本発明のヒトモノクローナル抗体はいわゆ
る細胞融合によって得られた細胞、例えばヒト−ヒトハ
イブリドーマおよび／またはそれに由来する細胞等によ
って産生される。すなわち、抗ＣＭＶ抗体産生能を有す
るヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球と増殖能を有する
ヒト由来の細胞株とを細胞融合して得られる細胞をクロ
ーン化し、ＣＭＶに対し特異性を示す抗体を産生するク
ローンを選択することによって製造される。その操作
は、免疫用細胞として下記のものを使用する以外は、従
来既知の方法に準ずればよい。
る細胞融合によって得られた細胞、例えばヒト−ヒトハ
イブリドーマおよび／またはそれに由来する細胞等によ
って産生される。すなわち、抗ＣＭＶ抗体産生能を有す
るヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球と増殖能を有する
ヒト由来の細胞株とを細胞融合して得られる細胞をクロ
ーン化し、ＣＭＶに対し特異性を示す抗体を産生するク
ローンを選択することによって製造される。その操作
は、免疫用細胞として下記のものを使用する以外は、従
来既知の方法に準ずればよい。
【００１４】（１）抗体産生細胞
抗ＣＭＶ抗体産生能を有するヒトリンパ球またはヒトリ
ンパ芽球源としては、ヒト脾臓細胞、ヒトリンパ節細
胞、ヒト末梢血リンパ球、ヒトＢ−リンパ球が使用され
る。ヒトリンパ球は通常マイトージェンによって活性化
させた後に細胞融合に供する。マイトージェンとして
は、例えばポークウィードマイトージェン（ＰＷＭ）、
Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）、プロテインＡ、フィトヘ
ムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡなどが挙
げられる。
ンパ芽球源としては、ヒト脾臓細胞、ヒトリンパ節細
胞、ヒト末梢血リンパ球、ヒトＢ−リンパ球が使用され
る。ヒトリンパ球は通常マイトージェンによって活性化
させた後に細胞融合に供する。マイトージェンとして
は、例えばポークウィードマイトージェン（ＰＷＭ）、
Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）、プロテインＡ、フィトヘ
ムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡなどが挙
げられる。
【００１５】（２）増殖細胞
増殖能を有するヒト由来の細胞株としては、ＩＭ−９
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）由来のヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、Ｈ
ＧＰＲＴという）欠損突然変異株かつウアバイン耐性突
然変異株が使用される。この細胞株は免疫グロブリン非
産生株であり、融合効率が高く、融合して得られるハイ
ブリドーマの抗体産生能が優れていることが特徴であ
る。当該親細胞株は以下のようにして得られる。
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）由来のヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、Ｈ
ＧＰＲＴという）欠損突然変異株かつウアバイン耐性突
然変異株が使用される。この細胞株は免疫グロブリン非
産生株であり、融合効率が高く、融合して得られるハイ
ブリドーマの抗体産生能が優れていることが特徴であ
る。当該親細胞株は以下のようにして得られる。
【００１６】親細胞株の出発材料としてヒトリンパ芽球
細胞株ＩＭ−９の突然変異細胞株を使用する。ＩＭ−９
を８−アザグアニン耐性変異処理およびウアバイン耐性
変異処理してＨＰＬＯが分離される。免疫グロブリン非
合成の細胞は細胞膜上に免疫グロブリンが存在しないと
考えられるので、ＨＰＬＯを蛍光色素（ＦＩＴＣ）標識
免疫グロブリンで染色し、非染色性の細胞をセル・ソー
ターで濃縮し、更に限界希釈法でクローニングすること
によってヒト免疫グロブリン非産生株の単離を行う。最
後に８−アザグアニンとウアバインを含む培地への適応
を確認することによって免疫グロブリン非合成突然変異
株を得ることができる。得られた細胞株は、ＮＰ１０１
およびＮＰ１９７と命名され、それぞれ発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）において寄託番号ＩＦＯ ５０３４０およびＩＦ
Ｏ ５０３４１として寄託された。
細胞株ＩＭ−９の突然変異細胞株を使用する。ＩＭ−９
を８−アザグアニン耐性変異処理およびウアバイン耐性
変異処理してＨＰＬＯが分離される。免疫グロブリン非
合成の細胞は細胞膜上に免疫グロブリンが存在しないと
考えられるので、ＨＰＬＯを蛍光色素（ＦＩＴＣ）標識
免疫グロブリンで染色し、非染色性の細胞をセル・ソー
ターで濃縮し、更に限界希釈法でクローニングすること
によってヒト免疫グロブリン非産生株の単離を行う。最
後に８−アザグアニンとウアバインを含む培地への適応
を確認することによって免疫グロブリン非合成突然変異
株を得ることができる。得られた細胞株は、ＮＰ１０１
およびＮＰ１９７と命名され、それぞれ発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）において寄託番号ＩＦＯ ５０３４０およびＩＦ
Ｏ ５０３４１として寄託された。
【００１７】ＨＧＦＲＴ欠損株は、１０μg/mlから２０
μg/ml濃度の８−アザグアニンを培養液に添加して培養
することにより選択できる。また、ウアバイン耐性突然
変異株は、１μM から１０μM 濃度のウアバインを含む
培養液中で死滅しない細胞株を選択することにより得ら
れる。
μg/ml濃度の８−アザグアニンを培養液に添加して培養
することにより選択できる。また、ウアバイン耐性突然
変異株は、１μM から１０μM 濃度のウアバインを含む
培養液中で死滅しない細胞株を選択することにより得ら
れる。
【００１８】ヒト免疫グロブリン非産生株の単離は、培
養上清中に分泌されるヒト免疫グロブリン、及び細胞内
に合成される免疫グロブリン量の有無をしらべることに
よって行う。培養上清中のヒト免疫グロブリンの測定
は、一般のラジオイムノアッセイ法や酵素抗体法などに
より行うことができる。例えば、サンドイッチELISA 法
による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、
ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ
鎖）抗体〕を固定し、培養上清の一部を反応させる。次
に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応さ
せ、基質を加え、酵素反応により生じる呈色割合により
培養上清中のヒト免疫グロブリンの検出および量を測定
できる。
養上清中に分泌されるヒト免疫グロブリン、及び細胞内
に合成される免疫グロブリン量の有無をしらべることに
よって行う。培養上清中のヒト免疫グロブリンの測定
は、一般のラジオイムノアッセイ法や酵素抗体法などに
より行うことができる。例えば、サンドイッチELISA 法
による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、
ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ
鎖）抗体〕を固定し、培養上清の一部を反応させる。次
に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン〔例えば、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヒトγ鎖）抗体、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖）抗体〕を反応さ
せ、基質を加え、酵素反応により生じる呈色割合により
培養上清中のヒト免疫グロブリンの検出および量を測定
できる。
【００１９】一方、細胞内に合成される免疫グロブリン
の測定は、例えばミリタイターＳＶを用いる次のような
方法により行われる。細胞をミリタイターＳＶ上でＰＢ
Ｓ（−）または生理食塩水で数回洗浄後、0.3 ％H2O2／
メタノールで処理し、次に酵素標識抗ヒト免疫グロブリ
ン〔例えば、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヒト
γ鎖）抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒト
μ鎖）抗体〕を反応させ、基質を加え、酵素反応により
生じる呈色割合により測定することができる。
の測定は、例えばミリタイターＳＶを用いる次のような
方法により行われる。細胞をミリタイターＳＶ上でＰＢ
Ｓ（−）または生理食塩水で数回洗浄後、0.3 ％H2O2／
メタノールで処理し、次に酵素標識抗ヒト免疫グロブリ
ン〔例えば、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヒト
γ鎖）抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（ヒト
μ鎖）抗体〕を反応させ、基質を加え、酵素反応により
生じる呈色割合により測定することができる。
【００２０】ＮＰ１０１，ＮＰ１９７の培養は、無血清
培地または血清培地で行い得る。無血清培地としては、
例えばイスコフの変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｒ
ＩＴＣ５６−２等が例示される。また血清培地として
は、ＲＰＭＩ１６４０、ダルベッコの変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＩＴＣ５６−２等の基礎培
地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したものが例示
される。当該親細胞株は、前述の培地を用い継代培養を
行うことができ、一般に用いられる凍結保存液、例えば
２０％ＦＣＳ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）を含む培地を用いて長期凍結保存できる。
培地または血清培地で行い得る。無血清培地としては、
例えばイスコフの変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｒ
ＩＴＣ５６−２等が例示される。また血清培地として
は、ＲＰＭＩ１６４０、ダルベッコの変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、ＲＩＴＣ５６−２等の基礎培
地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したものが例示
される。当該親細胞株は、前述の培地を用い継代培養を
行うことができ、一般に用いられる凍結保存液、例えば
２０％ＦＣＳ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）を含む培地を用いて長期凍結保存できる。
【００２１】（３）細胞融合
細胞融合は公知の方法に従って行われる。たとえばジ
ー．ガルファ（G. Galfre)〔ネーチャー（Nature) 266,
550 (1977) 〕に記載の方法またはこれに準ずる方法に
よって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレング
リコール（平均分子量１，０００〜４，０００）を添加
したＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＰＢＳ（−）等の培
地用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応
させることによって行われる。また、上記細胞融合培地
には融合効率を高めるための補助剤として例えばジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を添加してもよい。細胞
融合においては、親細胞に対して１〜１０倍、好ましく
は２〜３倍の抗体産生細胞を用いることが望ましい。
ー．ガルファ（G. Galfre)〔ネーチャー（Nature) 266,
550 (1977) 〕に記載の方法またはこれに準ずる方法に
よって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレング
リコール（平均分子量１，０００〜４，０００）を添加
したＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＰＢＳ（−）等の培
地用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応
させることによって行われる。また、上記細胞融合培地
には融合効率を高めるための補助剤として例えばジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等を添加してもよい。細胞
融合においては、親細胞に対して１〜１０倍、好ましく
は２〜３倍の抗体産生細胞を用いることが望ましい。
【００２２】得られた細胞を選別用培地で培養して、モ
ノクローナル抗体産生細胞、例えばハイブリドーマの分
離を行う。選別用培地は、親細胞が死滅し、モノクロー
ナル抗体産生細胞のみが増殖し得る培地であり、通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培
地が使用される。
ノクローナル抗体産生細胞、例えばハイブリドーマの分
離を行う。選別用培地は、親細胞が死滅し、モノクロー
ナル抗体産生細胞のみが増殖し得る培地であり、通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培
地が使用される。
【００２３】（４）クローニング
細胞融合によって得られた細胞は目的とするヒトモノク
ローナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付
される。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレー
ト上で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の抗体
価を、例えば酵素抗体法、中和活性法などによって測定
し、抗ＣＭＶ抗体を産生しているウェルを得る。このよ
うなウェルからさらに例えば限界希釈法によってクロー
ニングを行なって抗ＣＭＶ抗体を産生するクローンを選
択する。クローニングによって選択された本発明の抗Ｃ
ＭＶヒトモノクローナル抗体を産生する細胞は、凍結保
存が可能であり、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ、１０％Ｆ
ＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０などの培地で継代培養を行う
ことができる。
ローナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付
される。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレー
ト上で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の抗体
価を、例えば酵素抗体法、中和活性法などによって測定
し、抗ＣＭＶ抗体を産生しているウェルを得る。このよ
うなウェルからさらに例えば限界希釈法によってクロー
ニングを行なって抗ＣＭＶ抗体を産生するクローンを選
択する。クローニングによって選択された本発明の抗Ｃ
ＭＶヒトモノクローナル抗体を産生する細胞は、凍結保
存が可能であり、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ、１０％Ｆ
ＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０などの培地で継代培養を行う
ことができる。
【００２４】（５）抗体の回収・精製
上記で得られたクローンは、例えばウシ血清アルブミン
（０．１〜１％）含有無血清培地中で増殖させることが
できる。すなわち、０．５％ウシ血清アルブミン含有無
血清培地（例えば、ＲＩＴＣ５５−９）などの培地中で
増殖させ、培養上清を集める。選ばれたクローンの産生
するヒトモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリン
の精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレング
リコール分画法、エタノール分画法、イオン交換クロマ
トグラフィー法を応用することで容易に達成される。
（０．１〜１％）含有無血清培地中で増殖させることが
できる。すなわち、０．５％ウシ血清アルブミン含有無
血清培地（例えば、ＲＩＴＣ５５−９）などの培地中で
増殖させ、培養上清を集める。選ばれたクローンの産生
するヒトモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリン
の精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレング
リコール分画法、エタノール分画法、イオン交換クロマ
トグラフィー法を応用することで容易に達成される。
【００２５】
【発明の効果】本発明の抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗
体は、ＣＭＶ感染症にたいする診断薬、予防薬または治
療薬として有用である。従来のＣＭＶ抗体では認識でき
なかったＣＭＶ抗原蛋白を認識するので、従来の抗体で
は効果のなかったＣＭＶ感染症に対しても有効である。
特にＣＭＶに対して中和活性を有するヒトモノクローナ
ル抗体は、ＣＭＶ感染症の予防薬、治療薬として利用で
きる。本発明のモノクローナル抗体は、補体（または血
清）の非存在下において中和活性を示すという特徴を有
する。さらに、補体（または血清）の存在下で中和活性
が増強され、補体（または血清）の添加により、より高
い効果が期待できる。本発明の抗ＣＭＶヒトモノクロー
ナル抗体を産生する細胞株によれば、上記のヒトモノク
ローナル抗体を安定して産生することができる。
体は、ＣＭＶ感染症にたいする診断薬、予防薬または治
療薬として有用である。従来のＣＭＶ抗体では認識でき
なかったＣＭＶ抗原蛋白を認識するので、従来の抗体で
は効果のなかったＣＭＶ感染症に対しても有効である。
特にＣＭＶに対して中和活性を有するヒトモノクローナ
ル抗体は、ＣＭＶ感染症の予防薬、治療薬として利用で
きる。本発明のモノクローナル抗体は、補体（または血
清）の非存在下において中和活性を示すという特徴を有
する。さらに、補体（または血清）の存在下で中和活性
が増強され、補体（または血清）の添加により、より高
い効果が期待できる。本発明の抗ＣＭＶヒトモノクロー
ナル抗体を産生する細胞株によれば、上記のヒトモノク
ローナル抗体を安定して産生することができる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例を挙げてさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。 実施例１ （１）ヒトリンパ球の活性化 癌患者脾臓由来のヒト脾臓細胞ＴＫ（胃癌）およびＹＦ
（胃癌）をヒトリンパ球源として用いた。凍結から溶解
したヒトリンパ球を、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭに１０
7 cell／mlになるように懸濁し、ポークウィードマイト
ージェン（ＰＷＭ）（ＧＩＢＣＯ社）を 0.025％(w/v)
、Staphylococcus aureus I（Ｚｙｍｅｄ社) を0.01
％(w/v) 添加し、６ウェルプレートに３mlずつ分注し
た。ＣＯ2 インキュベーター中で４日間培養し、新鮮培
地（１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ）３mlを追加し、さらに
２日培養後、細胞を回収した。
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。 実施例１ （１）ヒトリンパ球の活性化 癌患者脾臓由来のヒト脾臓細胞ＴＫ（胃癌）およびＹＦ
（胃癌）をヒトリンパ球源として用いた。凍結から溶解
したヒトリンパ球を、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭに１０
7 cell／mlになるように懸濁し、ポークウィードマイト
ージェン（ＰＷＭ）（ＧＩＢＣＯ社）を 0.025％(w/v)
、Staphylococcus aureus I（Ｚｙｍｅｄ社) を0.01
％(w/v) 添加し、６ウェルプレートに３mlずつ分注し
た。ＣＯ2 インキュベーター中で４日間培養し、新鮮培
地（１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ）３mlを追加し、さらに
２日培養後、細胞を回収した。
【００２７】（２）親細胞株（ＮＰ１０１株およびＮＰ
１９７株）の調製 ＩＭ−９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）の突然変異株から
ＨＧＰＲＴ欠損変異株かつウアバイン耐性変異株として
ＨＰＬＯが分離された。ＨＰＬＯを107 cell／15ｍｌ遠
沈管にとり、600rpmにて２分間遠心分離し、遠沈により
得られた細胞ペレットを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地10ｍｌに懸濁し、再び遠心分離し、回収した
細胞ペレットをＦＩＴＣ（蛍光色素）標識抗ヒト免疫グ
ロブリンまたは抗ヒトＩｇＧ／ＰＢＳ（−）（Ｔａｇｏ
社Ｎｏ．2193、又は4200を10倍希釈）300 μｌに懸濁し
た。その後、これを氷中にて20分間培養し、ＦＣＳ10ｍ
ｌを添加し、600rpmにて２分間遠心分離した。遠沈にて
回収した細胞ペレットを氷冷した血清不含ＲＰＭＩ１６
４０培地10ｍｌに懸濁し、600rpmにて２分間遠心分離し
た。さらに、この遠沈により回収した細胞ペレットの血
清不含培地への懸濁及び遠沈操作を２回繰り返し行い、
最終的に２ｍｌ血清不含培地に懸濁した。その後、当該
細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cel
l sorter）にかけ、セルソーティングを行った。その染
色パターンを調べた上で非染色性画分を継代培養してさ
らにセルソーティングを４回繰り返し、免疫グロブリン
非合成の細胞を選別分離した。４回のセルソーティング
によりＩｇＧ分泌量８ｎｇ／ｍｌ、ＩｇＭ分泌量検出限
界以下の細胞ＨＰＬＯ−Ｓ４が得られた。
１９７株）の調製 ＩＭ−９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）の突然変異株から
ＨＧＰＲＴ欠損変異株かつウアバイン耐性変異株として
ＨＰＬＯが分離された。ＨＰＬＯを107 cell／15ｍｌ遠
沈管にとり、600rpmにて２分間遠心分離し、遠沈により
得られた細胞ペレットを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０培地10ｍｌに懸濁し、再び遠心分離し、回収した
細胞ペレットをＦＩＴＣ（蛍光色素）標識抗ヒト免疫グ
ロブリンまたは抗ヒトＩｇＧ／ＰＢＳ（−）（Ｔａｇｏ
社Ｎｏ．2193、又は4200を10倍希釈）300 μｌに懸濁し
た。その後、これを氷中にて20分間培養し、ＦＣＳ10ｍ
ｌを添加し、600rpmにて２分間遠心分離した。遠沈にて
回収した細胞ペレットを氷冷した血清不含ＲＰＭＩ１６
４０培地10ｍｌに懸濁し、600rpmにて２分間遠心分離し
た。さらに、この遠沈により回収した細胞ペレットの血
清不含培地への懸濁及び遠沈操作を２回繰り返し行い、
最終的に２ｍｌ血清不含培地に懸濁した。その後、当該
細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cel
l sorter）にかけ、セルソーティングを行った。その染
色パターンを調べた上で非染色性画分を継代培養してさ
らにセルソーティングを４回繰り返し、免疫グロブリン
非合成の細胞を選別分離した。４回のセルソーティング
によりＩｇＧ分泌量８ｎｇ／ｍｌ、ＩｇＭ分泌量検出限
界以下の細胞ＨＰＬＯ−Ｓ４が得られた。
【００２８】上記のＨＰＬＯ−Ｓ４について、細胞を２
０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに懸濁し、マウス胸腺細胞をフィ
ーダー細胞として９６ウェルマイクロプレートに１．０
ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、５％炭酸ガス存
在下３７℃で培養する。４〜６週間後、単一のクローン
としてコロニーの増殖の認められたウェルは、２３８／
３８４（６２．０％）であった。それら増殖陽性ウェル
について、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＭ）の分
泌、及び産生の有無を調べた。上清中のヒト免疫グロブ
リンの有無は、ＥＩＡ用９６ウェルマイクロプレートを
用い、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔（抗ヒトＩｇＧ
（γ）（Ｔａｇｏ社製４１００）または、抗ヒトＩｇＭ
（μ）（Ｔａｇｏ社製４１０２）〕を固定し、酵素標識
抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）
（Ｔａｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）を使用
したＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。以下、ＥＬＩ
ＳＡ法の手技等は常法に従って行った。その結果、細胞
増殖の認められた２３８ウェルの内１６２ウェルの培養
上清については、免疫グロブリン分泌陰性（測定限界以
下）であった。
０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに懸濁し、マウス胸腺細胞をフィ
ーダー細胞として９６ウェルマイクロプレートに１．０
ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、５％炭酸ガス存
在下３７℃で培養する。４〜６週間後、単一のクローン
としてコロニーの増殖の認められたウェルは、２３８／
３８４（６２．０％）であった。それら増殖陽性ウェル
について、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ，ＩｇＭ）の分
泌、及び産生の有無を調べた。上清中のヒト免疫グロブ
リンの有無は、ＥＩＡ用９６ウェルマイクロプレートを
用い、固相に抗ヒト免疫グロブリン〔（抗ヒトＩｇＧ
（γ）（Ｔａｇｏ社製４１００）または、抗ヒトＩｇＭ
（μ）（Ｔａｇｏ社製４１０２）〕を固定し、酵素標識
抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）
（Ｔａｇｏ社製４５００）または、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０２）を使用
したＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。以下、ＥＬＩ
ＳＡ法の手技等は常法に従って行った。その結果、細胞
増殖の認められた２３８ウェルの内１６２ウェルの培養
上清については、免疫グロブリン分泌陰性（測定限界以
下）であった。
【００２９】一方、細胞内に合成される免疫グロブリン
の測定については、ミリタイターＳＶ（ミリボアー社Ｎ
ｏ．ＳＴＳＶ０９６１０，口径５μｍ）を用いて行っ
た。ミリタイターＳＶのプレートを２％スキムミルクで
室温、30分間ブロックした後、ＰＢＳ（−）または生理
食塩水で３回吸引洗浄を行い、細胞懸濁液を50〜200 μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、再びＰＢＳ（−）または生理食塩
水で３回吸引洗浄洗浄後、0.3 ％H2O2／メタノール50μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で30分間静置させた。続いて
ＰＢＳ（−）または生理食塩水で３回吸引洗浄を行い、
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社
製４５００）または、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫
グロブリン抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０
２）の各5000倍希釈液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−））を
50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間静置させた。0.
05％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で５回吸引洗浄し、
基質液（ＯＰＤ １ｍｇ／ｍｌ，H2O2 0.02 ％）を50μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、10〜20分間反応させ、４Ｎ H2SO4
を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、反応停止させた。反応液を
ＥＩＡ用プレート（コースタ社製Ｎｏ．３５９０）に移
し492 nmの吸光度を測定した。免疫グロブリン非産生の
もの２クローン、ＮＰ１０１株およびＮＰ１９７株を得
た。
の測定については、ミリタイターＳＶ（ミリボアー社Ｎ
ｏ．ＳＴＳＶ０９６１０，口径５μｍ）を用いて行っ
た。ミリタイターＳＶのプレートを２％スキムミルクで
室温、30分間ブロックした後、ＰＢＳ（−）または生理
食塩水で３回吸引洗浄を行い、細胞懸濁液を50〜200 μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、再びＰＢＳ（−）または生理食塩
水で３回吸引洗浄洗浄後、0.3 ％H2O2／メタノール50μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で30分間静置させた。続いて
ＰＢＳ（−）または生理食塩水で３回吸引洗浄を行い、
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ）（Ｔａｇｏ社
製４５００）または、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫
グロブリン抗ヒトＩｇＭ（μ）（Ｔａｇｏ社製４５０
２）の各5000倍希釈液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−））を
50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間静置させた。0.
05％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で５回吸引洗浄し、
基質液（ＯＰＤ １ｍｇ／ｍｌ，H2O2 0.02 ％）を50μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加し、10〜20分間反応させ、４Ｎ H2SO4
を50μｌ／ｗｅｌｌ添加し、反応停止させた。反応液を
ＥＩＡ用プレート（コースタ社製Ｎｏ．３５９０）に移
し492 nmの吸光度を測定した。免疫グロブリン非産生の
もの２クローン、ＮＰ１０１株およびＮＰ１９７株を得
た。
【００３０】（３）細胞融合
上記の活性化したヒトリンパ球ＴＫまたはＹＦ（それぞ
れ５．９×１０7個と５．８×１０7 個）と、ＮＰ１０
１株またはＮＰ１９７株（各３×１０7 個）とを２：１
の割合で混合し、ポリエチレングリコール（平均分子量
１，５００，ベーリンガーマンハイム社）存在下で２分
間反応させることにより、細胞融合を行った。反応液を
遠心分離により洗浄した後、ＨＡＴ培地（２０％ＦＣＳ
含有ＩＭＤＭ培地に１００μＭヒポキサンチン、０．４
μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンを添加）に懸濁
し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェル
ずつ分注した。３日後に１００μｌのＨＡＴ培地を添加
し、以後２回／週の頻度で、半量ずつＨＡＴ培地で培地
交換を行った。５６１６ウェルから１３５５の細胞増殖
ウェルを得た。
れ５．９×１０7個と５．８×１０7 個）と、ＮＰ１０
１株またはＮＰ１９７株（各３×１０7 個）とを２：１
の割合で混合し、ポリエチレングリコール（平均分子量
１，５００，ベーリンガーマンハイム社）存在下で２分
間反応させることにより、細胞融合を行った。反応液を
遠心分離により洗浄した後、ＨＡＴ培地（２０％ＦＣＳ
含有ＩＭＤＭ培地に１００μＭヒポキサンチン、０．４
μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンを添加）に懸濁
し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェル
ずつ分注した。３日後に１００μｌのＨＡＴ培地を添加
し、以後２回／週の頻度で、半量ずつＨＡＴ培地で培地
交換を行った。５６１６ウェルから１３５５の細胞増殖
ウェルを得た。
【００３１】（４）スクリーニング
細胞の増殖が観察されたウェルの上清中の抗ＣＭＶ抗体
価をＥＬＩＳＡ法と中和活性法により測定し、抗体陽性
ウェルから限界希釈法により、求める細胞のクローニン
グを行った。
価をＥＬＩＳＡ法と中和活性法により測定し、抗体陽性
ウェルから限界希釈法により、求める細胞のクローニン
グを行った。
【００３２】（ｉ）ＥＬＩＳＡ法
〔抗原プレート〕
ＣＭＶプレート
ＣＭＶ（ＡＤ１６９株）で感染させたＭＲＣ−５細胞の
培養上清を１５〜５０％のショ糖密度勾配で超遠心し
（２３０００ｒｐｍ，５０分間）、遠心管の底部に沈澱
した画分を炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、１０μ
ｇ／mlの濃度で５０μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティ
ングした。ブロッキングは３％スキムミルクで行った。
洗浄後、−２０℃で保存した。 ＣＭＶ感染細胞プレート ９６ウェルマイクロプレートにＭＲＣ−５細胞を播種
し、ＣＭＶを５×１０3 ＰＦＵ／ウェル加え（ｍｏｉ＝
０．２５）、４日後培養後、培地を全量交換しさらに４
日培養した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、メタノ
ールで１０分固定し、風乾後、−４０℃で保存した。 対照プレート ９６ウェルマイクロプレートにＭＲＣ−５細胞を播種
し、４日培養した後、と同様に固定した。 〔測定方法〕 抗体液５０μｌを抗原プレートの各ウェルに加え、４℃
で一晩反応させた後洗浄し、２０００倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとペルオキシダーゼ標識ヒ
トＩｇＭ（ＴＡＧＯ社製）の混合液５０μｌを加えて室
温で２時間反応させた。基質液を加えて１０〜２０分反
応させて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。対照の抗体
としては、静注用免疫グロブリン（商品名ヴェノグロブ
リン−Ｉ，ミドリ十字，10μｇ／ml）、ＨＰＬＯ（Ｉｇ
Ｇ）を用いた。
培養上清を１５〜５０％のショ糖密度勾配で超遠心し
（２３０００ｒｐｍ，５０分間）、遠心管の底部に沈澱
した画分を炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、１０μ
ｇ／mlの濃度で５０μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティ
ングした。ブロッキングは３％スキムミルクで行った。
洗浄後、−２０℃で保存した。 ＣＭＶ感染細胞プレート ９６ウェルマイクロプレートにＭＲＣ−５細胞を播種
し、ＣＭＶを５×１０3 ＰＦＵ／ウェル加え（ｍｏｉ＝
０．２５）、４日後培養後、培地を全量交換しさらに４
日培養した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、メタノ
ールで１０分固定し、風乾後、−４０℃で保存した。 対照プレート ９６ウェルマイクロプレートにＭＲＣ−５細胞を播種
し、４日培養した後、と同様に固定した。 〔測定方法〕 抗体液５０μｌを抗原プレートの各ウェルに加え、４℃
で一晩反応させた後洗浄し、２０００倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとペルオキシダーゼ標識ヒ
トＩｇＭ（ＴＡＧＯ社製）の混合液５０μｌを加えて室
温で２時間反応させた。基質液を加えて１０〜２０分反
応させて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。対照の抗体
としては、静注用免疫グロブリン（商品名ヴェノグロブ
リン−Ｉ，ミドリ十字，10μｇ／ml）、ＨＰＬＯ（Ｉｇ
Ｇ）を用いた。
【００３３】（ii）中和活性法
培養上清中の中和抗体価を補体存在下、非存在下で測定
した。測定方法は次の通りである。６ウェルマイクロプ
レートにＭＲＣ−５細胞を播種し、シート形成するまで
培養した。検体の抗体を１％ＦＣＳ−ＭＥＭを用いて４
-1〜４-8まで希釈した。各々の抗体希釈液２００μｌを
４８ウェルマイクロプレートに分注した。ＣＭＶ（ＡＤ
１６９株）をＭＥＭ培地および補体（low toxic gunea
pig complement CEDARLANE) を用いて2500PFU/mlまで希
釈した。この時補体量は２０％で、氷冷下で滅菌蒸留水
に溶解後ただちに０．４５μｍ濾過したものを添加し
た。補体非添加系では、ＭＥＭ培地のみで希釈した。Ｃ
ＭＶ液を調製後ただちに抗体希釈液に等量（２００μ
ｌ）分注混合し、室温で１時間反応させた。６ウェルマ
イクロプレートのＭＲＣ−５細胞の培養上清を除去し、
ＭＥＭ培地で洗浄後にＣＭＶ反応液１００μｌ／ウェル
を分注し、３７℃、５％ＣＯ2 下で１時間反応させた。
した。測定方法は次の通りである。６ウェルマイクロプ
レートにＭＲＣ−５細胞を播種し、シート形成するまで
培養した。検体の抗体を１％ＦＣＳ−ＭＥＭを用いて４
-1〜４-8まで希釈した。各々の抗体希釈液２００μｌを
４８ウェルマイクロプレートに分注した。ＣＭＶ（ＡＤ
１６９株）をＭＥＭ培地および補体（low toxic gunea
pig complement CEDARLANE) を用いて2500PFU/mlまで希
釈した。この時補体量は２０％で、氷冷下で滅菌蒸留水
に溶解後ただちに０．４５μｍ濾過したものを添加し
た。補体非添加系では、ＭＥＭ培地のみで希釈した。Ｃ
ＭＶ液を調製後ただちに抗体希釈液に等量（２００μ
ｌ）分注混合し、室温で１時間反応させた。６ウェルマ
イクロプレートのＭＲＣ−５細胞の培養上清を除去し、
ＭＥＭ培地で洗浄後にＣＭＶ反応液１００μｌ／ウェル
を分注し、３７℃、５％ＣＯ2 下で１時間反応させた。
【００３４】ＭＥＭ培地で洗浄後、４２〜４５℃の１０
％ＦＣＳ−０．５％アガロース−ＭＥＭ（ペニシリン・
ストレプトマイシン・ファンギゾンを含む）を４ml／ウ
ェル分注した。培地表面の水分を蒸発させた後、プレー
トを反転させて培養した。培養４日目、８日目に１０％
ＦＣＳ−０．５％アガロース−ＭＥＭ（ペニシリン・ス
トレプトマイシン・ファンギゾンを含む）を２ml／ウェ
ル重層した。培養１２日目に１０％ホルマリン液（ＰＢ
Ｓ希釈）を４ml／ウェル添加し、３７℃で一夜静置し
た。アガロースを除去し、０．０３％メチレンブルー液
で染色した後、プラーク数を計測した。中和抗体価はプ
ラーク減少率の５０％点で求め、その手法はもっとも一
般的に利用されるReed-Muench 法によって求めた。
％ＦＣＳ−０．５％アガロース−ＭＥＭ（ペニシリン・
ストレプトマイシン・ファンギゾンを含む）を４ml／ウ
ェル分注した。培地表面の水分を蒸発させた後、プレー
トを反転させて培養した。培養４日目、８日目に１０％
ＦＣＳ−０．５％アガロース−ＭＥＭ（ペニシリン・ス
トレプトマイシン・ファンギゾンを含む）を２ml／ウェ
ル重層した。培養１２日目に１０％ホルマリン液（ＰＢ
Ｓ希釈）を４ml／ウェル添加し、３７℃で一夜静置し
た。アガロースを除去し、０．０３％メチレンブルー液
で染色した後、プラーク数を計測した。中和抗体価はプ
ラーク減少率の５０％点で求め、その手法はもっとも一
般的に利用されるReed-Muench 法によって求めた。
【００３５】１次スクリーニングで、ＣＭＶに対する抗
体が陽性と判断された細胞は、さらにクローニングを繰
り返し抗ＣＭＶ抗体産生細胞を選別した。こうして、細
胞Ｅ４６、Ｋ３５７およびＩ３５１が樹立された。これ
らの細胞は安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶヒトモノクローナ
ル抗体を産生し続ける。細胞Ｅ４６、Ｋ３５７およびＩ
３５１は、発酵研究所において寄託番号ＩＦＯ ５０３
３８、ＩＦＯ ５０３３９およびＩＦＯ ５０３３６と
して寄託されている。
体が陽性と判断された細胞は、さらにクローニングを繰
り返し抗ＣＭＶ抗体産生細胞を選別した。こうして、細
胞Ｅ４６、Ｋ３５７およびＩ３５１が樹立された。これ
らの細胞は安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶヒトモノクローナ
ル抗体を産生し続ける。細胞Ｅ４６、Ｋ３５７およびＩ
３５１は、発酵研究所において寄託番号ＩＦＯ ５０３
３８、ＩＦＯ ５０３３９およびＩＦＯ ５０３３６と
して寄託されている。
【００３６】（５）モノクローナル抗体の回収、精製
上記のスクリーニングによって得られたクローン株を、
０．５％ウシ血清アルブミン含有無血清培地ＲＩＴＣ５
５−９中で１〜１００日培養した。その培養上清を集
め、０．９％ＮａＣｌ液を外液として透析した。透析終
了後、高速液体クロマトグラフィー（TSK-Gell G-3000S
W)を行い、免疫グロブリン分画を得、精製モノクローナ
ル抗体とした。
０．５％ウシ血清アルブミン含有無血清培地ＲＩＴＣ５
５−９中で１〜１００日培養した。その培養上清を集
め、０．９％ＮａＣｌ液を外液として透析した。透析終
了後、高速液体クロマトグラフィー（TSK-Gell G-3000S
W)を行い、免疫グロブリン分画を得、精製モノクローナ
ル抗体とした。
【００３７】実施例２
癌患者脾臓由来のヒト脾臓細胞ＳＮ（胃癌）をヒトリン
パ球源として用い、ＨＰＬＯ（前述）を親細胞株として
用いた以外は実施例１と同様にして細胞融合を行った。
得られた細胞の中から抗ＣＭＶモノクローナル抗体を産
生する細胞を実施例１と同様にして選択し細胞Ｋ６３３
が樹立された。この細胞は安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶヒ
トモノクローナル抗体を産生し続ける。細胞Ｋ６３３
は、発酵研究所において寄託番号ＩＦＯ ５０３３７と
して寄託されている。実施例１、２で得られた各抗体の
起源と中和活性を表１にまとめて示す。
パ球源として用い、ＨＰＬＯ（前述）を親細胞株として
用いた以外は実施例１と同様にして細胞融合を行った。
得られた細胞の中から抗ＣＭＶモノクローナル抗体を産
生する細胞を実施例１と同様にして選択し細胞Ｋ６３３
が樹立された。この細胞は安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶヒ
トモノクローナル抗体を産生し続ける。細胞Ｋ６３３
は、発酵研究所において寄託番号ＩＦＯ ５０３３７と
して寄託されている。実施例１、２で得られた各抗体の
起源と中和活性を表１にまとめて示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例３
抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体の中和抗体価の測定
Ｅ４６、Ｋ３５７およびＫ６３３の３種のヒトモノクロ
ーナル抗体についてＣＭＶ（ＡＤ１６９株）に対する中
和抗体価を補体存在下および非存在下で測定した。測定
方法は実施例１の方法に従った。結果を表２に示す。
ーナル抗体についてＣＭＶ（ＡＤ１６９株）に対する中
和抗体価を補体存在下および非存在下で測定した。測定
方法は実施例１の方法に従った。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】モノクローナル抗体Ｅ４６の中和活性が補
体添加により増強されることが確認された。
体添加により増強されることが確認された。
【００４２】実施例４
抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体が認識するＣＭＶ抗原
蛋白の同定 ヒトモノクローナル抗体が認識するウィルスの抗原蛋白
を同定するために、免疫沈降分析を行った。ＭＲＣ−５
細胞にＣＭＶ（ＡＤ１６９株）を感染させて、３５Ｓメ
チオニンでアイソトープ標識を行った。標識した細胞を
０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ１００、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）および１ｍＭフェニルメチルスルフォニルノルオラ
イド（ｐＨ７．４）を混合した溶解液にて溶解した。こ
れに抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体を加えて、抗原抗
体複合物を形成させ、さらにプロテインＧセファロース
４Ｂによって複合体を吸着精製した。これを０．１２５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、３％２−メルカプト
エタノールおよび１５％グリセリン（ｐＨ８．２）の混
合液中で３分間１００℃で処理し、その上清をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後ゲル
を乾燥させ、Ｘ線フィルムに−７０℃でさらした。この
結果、Ｅ４６は78,000に、Ｋ３５７は80,000に、Ｋ６３
３は56,000と85,000と120,000 にＩ３５１は52,000の分
子量をもつＣＭＶ抗原蛋白を認識することがわかった。
蛋白の同定 ヒトモノクローナル抗体が認識するウィルスの抗原蛋白
を同定するために、免疫沈降分析を行った。ＭＲＣ−５
細胞にＣＭＶ（ＡＤ１６９株）を感染させて、３５Ｓメ
チオニンでアイソトープ標識を行った。標識した細胞を
０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ１００、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）および１ｍＭフェニルメチルスルフォニルノルオラ
イド（ｐＨ７．４）を混合した溶解液にて溶解した。こ
れに抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体を加えて、抗原抗
体複合物を形成させ、さらにプロテインＧセファロース
４Ｂによって複合体を吸着精製した。これを０．１２５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、３％２−メルカプト
エタノールおよび１５％グリセリン（ｐＨ８．２）の混
合液中で３分間１００℃で処理し、その上清をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後ゲル
を乾燥させ、Ｘ線フィルムに−７０℃でさらした。この
結果、Ｅ４６は78,000に、Ｋ３５７は80,000に、Ｋ６３
３は56,000と85,000と120,000 にＩ３５１は52,000の分
子量をもつＣＭＶ抗原蛋白を認識することがわかった。
【００４３】実施例５
抗ＣＭＶヒトモノクローナル抗体のアイソタイプの同定
ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプの同定は以下の
ようにして行った。Ｈ鎖の同定は、ヒトＩｇＧ１，Ｉｇ
Ｇ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４に対するウサギ抗血清を用い
た免疫拡散法を用い、Ｌ鎖の同定はＡＤ１６９感染細胞
を抗原プレートとして、２次抗体にアルカリフォスファ
ターゼ標識したヤギ抗ヒトΚ鎖ないしはλ鎖を用いたＥ
ＬＩＳＡを行った。結果を表３に示す。
ようにして行った。Ｈ鎖の同定は、ヒトＩｇＧ１，Ｉｇ
Ｇ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４に対するウサギ抗血清を用い
た免疫拡散法を用い、Ｌ鎖の同定はＡＤ１６９感染細胞
を抗原プレートとして、２次抗体にアルカリフォスファ
ターゼ標識したヤギ抗ヒトΚ鎖ないしはλ鎖を用いたＥ
ＬＩＳＡを行った。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】実施例６
モノクローナル抗体産生細胞のセルタイプを細胞形態か
ら判断した。その結果、形態的には細胞株Ｉ３５１およ
びＫ３５７はハイブリドーマ型、細胞株Ｅ４６およびＫ
６３３は形質転換細胞型であった。
ら判断した。その結果、形態的には細胞株Ｉ３５１およ
びＫ３５７はハイブリドーマ型、細胞株Ｅ４６およびＫ
６３３は形質転換細胞型であった。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 15/07
Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｊ 9015−2Ｊ
33/577 Ｂ 9015−2Ｊ
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 柚木 幹弘
大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１
株式会社ミドリ十字中央研究所内
(72)発明者 森田 悦子
大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１
株式会社ミドリ十字中央研究所内
(72)発明者 鈴木 幸雄
大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１
株式会社ミドリ十字中央研究所内
(72)発明者 平間 稔
大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１
株式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 次の特性を有するモノクローナル抗体か
ら選ばれる抗サイトメガロウィルスヒトモノクローナル
抗体： (1) 分子量78,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 (2) 分子量80,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 (3) 分子量56,000と85,000と120,000 のサイトメガロウ
ィルス抗原蛋白に対して反応性を有するヒトモノクロー
ナル抗体。 (4) 分子量52,000のサイトメガロウィルス抗原蛋白に対
して反応性を有するヒトモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 サイトメガロウィルスに対して中和活性
を有する請求項１記載のヒトモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 中和活性が補体の添加により増強される
請求項２記載のヒトモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ヒトリンパ球またはヒトリンパ芽球とＩ
Ｍ−９由来のヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損突然変異株かつウアバイン耐
性突然変異株とを細胞融合して得られる請求項１記載の
ヒトモノクローナル抗体を産生する細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3183189A JPH053794A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | 抗サイトメガロウイルスヒトモノクローナル抗体およびその産生細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3183189A JPH053794A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | 抗サイトメガロウイルスヒトモノクローナル抗体およびその産生細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH053794A true JPH053794A (ja) | 1993-01-14 |
Family
ID=16131331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3183189A Pending JPH053794A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | 抗サイトメガロウイルスヒトモノクローナル抗体およびその産生細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH053794A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010516229A (ja) * | 2007-01-04 | 2010-05-20 | エイチユーエムエイビーエス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ヒトサイトメガロウイルス中和抗体およびその使用 |
| US8435524B2 (en) | 2008-07-16 | 2013-05-07 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9217028B2 (en) | 2007-01-04 | 2015-12-22 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
| US9346874B2 (en) | 2009-12-23 | 2016-05-24 | 4-Antibody Ag | Binding members for human cytomegalovirus |
-
1991
- 1991-06-26 JP JP3183189A patent/JPH053794A/ja active Pending
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9149524B2 (en) | 2007-01-04 | 2015-10-06 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
| US9611316B2 (en) | 2007-01-04 | 2017-04-04 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
| US8545848B2 (en) | 2007-01-04 | 2013-10-01 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
| JP2010516229A (ja) * | 2007-01-04 | 2010-05-20 | エイチユーエムエイビーエス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ヒトサイトメガロウイルス中和抗体およびその使用 |
| US9217028B2 (en) | 2007-01-04 | 2015-12-22 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof |
| JP2014141501A (ja) * | 2007-01-04 | 2014-08-07 | Inst Research In Biomedicine | ヒトサイトメガロウイルス中和抗体およびその使用 |
| US9365636B1 (en) | 2008-07-16 | 2016-06-14 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9796772B2 (en) | 2008-07-16 | 2017-10-24 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US8765132B2 (en) | 2008-07-16 | 2014-07-01 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9221897B2 (en) | 2008-07-16 | 2015-12-29 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9249213B2 (en) | 2008-07-16 | 2016-02-02 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US10889632B2 (en) | 2008-07-16 | 2021-01-12 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US8603480B2 (en) | 2008-07-16 | 2013-12-10 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9371372B2 (en) | 2008-07-16 | 2016-06-21 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9491906B2 (en) | 2008-07-16 | 2016-11-15 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9527902B2 (en) | 2008-07-16 | 2016-12-27 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US8435524B2 (en) | 2008-07-16 | 2013-05-07 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9725502B2 (en) | 2008-07-16 | 2017-08-08 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9796771B2 (en) | 2008-07-16 | 2017-10-24 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9127049B2 (en) | 2008-07-16 | 2015-09-08 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9803000B1 (en) | 2008-07-16 | 2017-10-31 | Institute of Research in Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US10040845B2 (en) | 2008-07-16 | 2018-08-07 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US10414817B2 (en) | 2008-07-16 | 2019-09-17 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof |
| US9346874B2 (en) | 2009-12-23 | 2016-05-24 | 4-Antibody Ag | Binding members for human cytomegalovirus |
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