JPWO2007094423A1 - ヒトサイトメガロウイルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分 - Google Patents
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Abstract
Description
HCMVは、種特異性が強いのでヒト以外の動物には感染しないが、ヒトには広く感染し、ヒトの体内においては広汎な組織に親和性がある。
しかも一度感染すると宿主の免疫が確立した後も排除されることなく終生維持されることとなる。
しかしながら、免疫不全状態にある血液透析者、癌患者、免疫抑制剤使用者、HIV感染者、骨髄移植や臓器移植を受けた患者などの免疫不全者が、このHCMVに感染すると、HCMVの再活性化が起こり、間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの致死的な病気が発症する。
又、妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症によって、流産、死産、生後間もない死亡を引き起こし、死亡しない場合も小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害などを引き起こす。
ガンシクロビルはDNAポリメラーゼを阻害することでウイルスDNAの合成を妨害する抗ウイルス薬で、主にエイズなど免疫不全状態におけるサイトメガロウイルス網膜炎の治療や、CD4リンパ球数100/mm3以下の進行したHIV感染症におけるサイトメガロウイルス網膜炎の発症抑制に使用されており、認可も受けている。
しかしながら、ガンシクロビルには造血阻害など種々の副作用があることが報告されており、その使用態様は上記の如く、極限られたものとなる。
又、動物実験では催奇形作用が報告されており、妊娠中は使用することができない。
その他、先天性HCMV感染症の重症例にガンシクロビルを使用することで、神経学的後遺症発現の減少や難聴の進行改善等の効果があるとされているが(非特許文献2)、やはりガンシクロビルの副作用である骨髄抑制、不妊症の問題については十分かつ慎重な検討が必要となる。
そこで、HCMVに結合し、その感染性を中和すること(その生物学的活性を喪失させること)のできる抗体(以下「抗HCMV抗体」と称す場合がある)は、HCMVによる致死的な病態の予防乃至治療薬として期待できるので、例えば、免疫不全状態において、HCMVが原因となって引き起こされる様々な疾病に対する予防乃至治療戦略上、有用である。
即ち、HCMVの活性を喪失させて疾病症状を予防、若しくは緩和するのに、HCMVに対して強い親和性及び中和能をもち、且つ拒絶反応を示さない抗HCMV抗体を、所謂「抗体医薬」として投与するのが有効であると考えられた。
その為、異物認識応答を起こさないヒトのモノクローナル抗体であって、HCMVに対する親和性、特異性及び中和能に優れ、予防乃至治療薬としてもその活用を期待することのできる抗HCMV抗体、並びにその抗原結合部分の開発が強く望まれていた。
請求項2に係る発明は、前記軽鎖(L鎖)及び/又は重鎖(H鎖)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第1項に記載の抗HCMVモノクローナル抗体に関する。
請求項3に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号3のアミノ酸配列で示される軽鎖可変部領域(LCVR)と、配列番号4のアミノ酸配列で示される重鎖可変部領域(HCVR)を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項4に係る発明は、前記軽鎖可変部領域(LCVR)及び/又は重鎖可変部領域(HCVR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第3項に記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項5に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号5〜10からなる群より選択される何れか一つ以上のアミノ酸配列で示される相補性決定領域(CDR)を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項6に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR1ドメインと、配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR2ドメインと、配列番号7のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR3ドメインとからなる群から選択されたCDRドメインを含むことを特徴とする、抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項7に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR1ドメインと、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR2ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR3ドメインとからなる群から選択されたCDRドメインを含むことを特徴とする、抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項8に係る発明は、前記相補性決定領域(CDR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第5〜7項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項9に係る発明は、HCMVに対する親和性(アフィニティー(M))が、Kd=1.0×10−11(M)〜1.3×10−11(M)であることを特徴とする請求の範囲第1〜8項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項10に係る発明は、約1μg/mLで、80%以上のHCMV感染阻止率を示すことを特徴とする請求の範囲第1〜9項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項11に係る発明は、抗体のクラス(サブクラス)がIgG1(κ)であることを特徴とする請求の範囲第1〜10項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項12に係る発明は、請求の範囲第1〜11項いずれか記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、HCMVにより引き起こされる疾病に対する予防乃至治療薬に関する。
請求項13に係る発明は、前記HCMVにより引き起こされる疾病が、(a)免疫不全状態におけるHCMVの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎、(b)妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、(c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、(d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害からなる群より選択される何れか一つである請求の範囲第12項に記載の予防乃至治療薬に関する。
請求項14に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードするDNAであって、配列番号1〜10からなる群から選択されたアミノ配列をコードする単離されたDNAに関する。
請求項15に係る発明は、請求の範囲第14項に記載のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたDNAに関する。
請求項16に係る発明は、請求の範囲第14項又は第15項に記載の単離DNAを組込んだベクター(植物発現ベクターを除く)に関する。
請求項17に係る発明は、内部に請求の範囲第16項の組換え発現ベクターが導入された、宿主細胞(植物細胞を除く)に関する。
HCMVが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、(a)エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態におけるHCMVの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの致死的な病気や、(b)妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、(c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、(d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害などの予防乃至治療薬として有用であると考えられる。
抗体の「抗原結合部分」(又は単に「抗体部分」)という用語は、抗原(例えばHCMV)に特異的に結合する能力を持つ1つ又は複数の抗体のフラグメントを指す。
「HCMV活性を中和し得る抗体」とは、HCMVに結合することによってHCMVの生物学的活性を阻害する抗体を指すものとする。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であれば、
軽鎖(L鎖)において、配列番号1のアミノ酸配列から一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれるし、
重鎖(H鎖)において、配列番号2のアミノ酸配列から一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗HCMVモノクローナル抗体も本願発明に含まれる。
各L鎖は、L鎖可変部領域(「LCVR」または「VL」と称す場合がある)とL鎖不変部領域(L鎖不変部領域は1つのドメインからなり、「CL」と称す場合がある)からなる。
特にHCVRおよびLCVRは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。
そのために、もとの抗体のものと同様な結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直す際に、特定の抗体の配列全体を得る必要はない。通常、可変部領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的にとって充分である。
HCVR及びLCVRは、それぞれ3つのCDRおよび4つのFRからなり、これらはFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であれば、前記相補性決定領域(CDR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれる。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であれば、前記軽鎖の相補性決定領域(CDR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれる。
HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であれば、前記重鎖の相補性決定領域(CDR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も本願発明に含まれる。
即ち、本願発明の抗体は、完全長の抗体又はその抗原結合部分であってもよく、可変部領域や、相補性決定領域(CDR)を示す、配列番号3〜10のアミノ酸配列をもとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、HCMVに特異的に結合し、その生物活性を中和し得る組換えヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を得ることができるが、これらは本願発明の技術的範囲内に属するものである。
代替的には、可変領域全体を一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、PCR増幅法で組み合わせて、完全に人工的な可変領域クローンを作製することもできる。
HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードするDNAであれば、前記DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたDNAも本願発明に含まれる。
但し、ここでいう組換え発現ベクターおよび宿主細胞は、本願発明の組換えヒト抗体を発現する為のものなので、動物細胞、特に哺乳動物細胞であるのが望ましく、植物発現ベクターや、植物細胞は除かれる。
該技術は、免疫を回避でき、さらに細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価されているが、本願明細書における配列番号1〜10のアミノ酸配列を参考に作製した特異抗体又はその抗原結合部分であれば、本願発明の技術的範囲内に属する。
ここで、或IgG抗体に対する「高親和性」とは、少なくとも約1×10−7(M)、好ましくは少なくとも約1×10−8(M)、より好ましくは少なくとも約1×10−9(M)、そしてさらにより好ましくは少なくとも約1×10−10(M)の結合親和性を言う。しかしながら、「高親和性」結合は他の抗体 アイソタイプでは様々であり、例えばIgMアイソタイプにとっての「高親和性」結合とは、少なくとも約1×10−7(M)の結合親和性を言う。
また、本発明に係る抗HCMV抗体またはその抗原結合部分は、通常、約1μg/mLで、80%以上の感染阻止率を示すので、有効な中和能を有するといえる。
IgGは物質として安定で、親和性が高いことが知られている。
一方、IgMはすぐに凝集しまい、親和性も低いことが知られている。
従って、HCMV活性が害となる疾患は、HCMV活性の阻害によってその疾患の症状および/または進行が緩和されることが予測される疾患である。
このような疾患は、例えば上述の抗HCMV抗体を使用して検出することが可能な、その疾患にかかっている被験対象の生物学的流体中のHCMV濃度を高める(例えば、被験対象の血清や血漿、滑液中のHCMVの濃度を高める)ことによって証明することができる。
その為、HCMVによる致死的な病態の発症を抑制、若しくはHCMVによる病態を緩和する為の抗体医薬として人体に投与したとしても、免疫原性を有さず、拒絶反応は見られないものと考えられる。
図1は、抗体産生細胞クローンの分離までのフローチャートである。
血清中の抗HCMV抗体が高値であるヒトの血液から単核球を分離した。
単核球からT細胞を除去し、その後EBVに感染させ増殖してきた細胞を抗体産生細胞ライブラリとした。
スクリーニングはHCMVの主要な中和エピトープの1つであるAD1に対する抗体をターゲットにし、GST融合HCMV−AD1をコートした96wellプレートを用いて、ELISA法により行った。
得られた抗体陽性細胞集団は新たな96wellプレートに細胞濃度を薄くして播種し、細胞増殖の助けとなるようにフィーダーセルを添加した。
3〜4週間培養した後に抗HCMV抗体の2ndスクリーニングを行った。
得られた抗体陽性細胞集団は新たな96wellプレートに限界希釈で播種し、この段階にも細胞増殖の助けとなるようにフィーダーセルを添加した。
3〜5週間培養した後に、抗HCMV抗体の3rdスクリーニングを行った。
得られた抗体陽性細胞集団は限界希釈による培養とスクリーニングを行い、well当たり1個まきのプレートから抗体陽性細胞が得られた。
分離した抗体産生細胞クローンについて産生する抗体のアイソタイプを確認した。確認の方法はスクリーニングと同様のELISAシステムを利用し、2次抗体としてそれぞれのアイソタイプに特異的な抗体を使用した。サンプルはクローン分離後の細胞培養上清を用いた。その結果、得られた抗HCMV抗体はIgG1、κであった(図2)。
抗HCMV抗体の精製はProteinAを用いたアフィニティー精製で行った。カラムはHiTrap rProtein A FF(Amersham)のプレパックカラム使用し、精製条件はカラムメーカーの推奨条件とした。
図3はSDS−PAGE結果である。
精製後、50kDaの抗体H鎖と25kDaの抗体L鎖が確認できた。
精製後の抗体はELISAでHCMV抗体活性が保持されていることを確認した。
抗HCMV抗体のスクリーニングにおいては対象抗原のエピトープ部分のみをGSTに融合させたGST融合タンパク質を抗原として使用していることから、完全なHCMV抗原に対する特異性を確認する必要がある。
そこで、精製した抗HCMV抗体がHCMV−AD1に特異的に結合するかどうかを、ウエスタンブロット法によるHCMV−AD1の検出により確認した。
HCMV−AD1はHCMV−AD2とともにgB(糖タンパク質B)を形成し、HCMVの主要なエンベロープタンパク質である。
HCMV感染細胞において、gBは細胞膜上に存在していることから、サンプルとしてHCMV感染細胞を用意することにした。細胞はヒト胎児肺線維芽細胞(HEL)を用い、HCMV(AD169株)を感染させ2日間培養した。
このHCMV感染細胞のライセートをSDS−PAGEにかけ、ニトロセルロースメンブレンにブロットした。1次抗体として精製HCMV抗体を2次抗体としてペルオキシダーゼ標識されたAnti-human IgG抗体(株式会社医学生物学研究所)を使用した。
検出にはECL試薬(アマシャム・バイオサイエンス株式会社)を用いた。
図4は、抗HCMV抗体の抗原特異性をウエスタンブロットで確認した結果である。
未感染HEL細胞では全くバンドが検出されなかったが、HCMV感染HEL細胞ではHCMV−AD1の分子量55kDaのところに特異的なバンドが検出された。
この結果から抗HCMV抗体(G3D No.9)はHCMV−AD1に対する特異性を持っていることが確認できた。
抗HCMV抗体のアフィニティー解析はビアコア株式会社に依頼した。
解析方法は抗原をセンサーチップに固定化し、抗原固定化表面に抗体を添加して相互作用を測定するものである。
抗原はGST融合HCMV−AD1を、コントロールとしてはGSTを使用した。
その結果、アフィニティーは解離定数として、1.16×10−11(M)であった。
抗HCMV抗体(G3D No.9)の有効性評価として中和活性を確認した。中和活性はHEL(ヒト胎児肺線維芽細胞)に対するHCMV(AD169株)感染の抗体による阻止率で評価した。方法はウイルス液と精製抗体(G3D No.9)に補体(5%)を加え37℃で1時間置き、その後、HEL細胞に接種(37℃、1時間)した。
細胞は洗浄後2日間培養し、HCMVの感染早期発現タンパク質であるpp65を細胞免疫染色により検出するものとした。
図5は、抗HCMV抗体の中和活性を評価した結果である。G3D No.9抗体は1μg/mlで80%以上の感染阻止率を示し、有効な中和活性を有することが確認できた。
抗体遺伝子のクローニングはPCR法により行った。抗HCMV抗体産生細胞クローンからtotal-RNAを抽出した。抽出したtotal-RNAからOligo-dT PrimerとReverse Transcriptaseを用いcDNA合成を行った。
抗体遺伝子はH鎖、L鎖の何れも5´末端側に可変領域をコードし、抗体によりシークエンスは多様である。3´末端側は定常領域であり、抗体遺伝子間でよく保存されている。抗体遺伝子シークエンスのデータベースをもとに、5´末端側は転写開始点を含むように、3´末端側は転写終結点を含むように以下、表1のprimerを設計し、合成したcDNAをテンプレートとして抗体遺伝子の増幅を行った。
抗体遺伝子の塩基配列はABIのシークエンサーを用いて行った。得られた塩基配列に基づく抗HCMV抗体のアミノ酸配列を配列番号1乃至10に示す。
得られた抗体遺伝子(H鎖・L鎖)のcDNAクローンをそれぞれプラスミドベクターpSG5に挿入した。両プラスミドを293T細胞に導入し、一過性での抗体発現の確認を行った。形質導入はリポフェクタミン(インビトロジェン株式会社)とプラス試薬(インビトロジェン株式会社)による方法を採用した。コントロールとしてpEGFPを形質導入し、GFP発現細胞を蛍光顕微鏡下で観察することで形質導入の効率を確認した。効率は50%〜60%であった。
図6は、形質導入から2日後の293T細胞のライセートを使用し、ヒト抗体を検出したウエスタンブロットの結果である。
検出にはペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG H+L(アマシャム・バイオサイエンス株式会社)を使用し、1ステップで検出した。その結果、形質導入した細胞においてヒト抗体のH鎖(50kDa)とL鎖(25kDa)を確認することができた(図6)。
形質導入から24時間後および48時間後の細胞培養上清を採取し、ELISAによるヒトIgG抗体の検出およびHCMV特異的抗体の検出を行った。
図7は、293T細胞への抗HCMV抗体遺伝子の導入による抗HCMV抗体産生をELISA法で確認した結果である。
ELISAのコントロールとして精製抗体の希釈系列を使用した。
形質導入のコントロールは上記と同様pEGFPを形質導入した細胞の培養上清を使用した。抗体遺伝子を一過性に発現させた細胞の培養上清からはいずれもヒトIgGが確認できた。また、分泌された抗体はいずれもHCMVに対する特異性を保持していることが確認できた(図7)。
以上の性質より、本発明に係る抗HCMV抗体またはその抗原結合部分は、HCMVが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば(a)エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態におけるHCMVの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの致死的な病気や、(b)妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、(c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、(d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害などの予防ないし治療薬として有用であると考えられる。
請求項3に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号3のアミノ酸配列で示される軽鎖可変部領域(LCVR)と、配列番号4のアミノ酸配列で示される重鎖可変部領域(HCVR)を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項5に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR1ドメインと、配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR2ドメインと、配列番号7のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR3ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR1ドメインと、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR2ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR3ドメインを有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項8に係る発明は、前記CDRドメインのいずれかにおいて、一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、約1μg/mLで、80%以上のHCMV感染阻止率を示すことを特徴とする請求の範囲第5項記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項9に係る発明は、HCMVに対する親和性(アフィニティー(M))が、Kd=1.0×10−11(M)〜1.3×10−11(M)であることを特徴とする請求の範囲第1,3,5,8項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項10に係る発明は、約1μg/mLで、80%以上のHCMV感染阻止率を示すことを特徴とする請求の範囲第1,3,5,9項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項11に係る発明は、抗体のクラス(サブクラス)がIgG1(κ)であることを特徴とする請求の範囲第1,3,5,8〜10項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
請求項12に係る発明は、請求の範囲第1,3,5,8〜11項いずれか記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、HCMVにより引き起こされる疾病に対する予防乃至治療薬に関する。
請求項13に係る発明は、前記HCMVにより引き起こされる疾病が、(a)免疫不全状態におけるHCMVの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎、(b)妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、(c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、(d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害からなる群より選択される何れか一つである請求の範囲第12項に記載の予防乃至治療薬に関する。
請求項14に係る発明は、HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードするDNAであって、配列番号1〜4のいずれか一つのアミノ酸配列又は配列番号5〜7の三つのアミノ酸配列又は配列番号8〜10の三つのアミノ酸配列をコードする単離されたDNAに関する。
請求項15に係る発明は、請求の範囲第14項に記載のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたDNAであって、発現ベクターに組み込まれ宿主細胞に導入された場合、該宿主細胞で生産される抗HCMVモノクローナル抗体が約1μg/mLで、80%以上のHCMV感染阻止率を示すことを特徴とする単離されたDNAに関する。
請求項16に係る発明は、請求の範囲第14項又は第15項に記載の単離DNAを組込んだベクター(植物発現ベクターを除く)に関する。
請求項17に係る発明は、内部に請求の範囲第16項の組換え発現ベクターが導入された、宿主細胞(植物細胞を除く)。
発明の効果
[0012]
本発明に係る抗HCMV抗体またはその抗原結合部分は、例えば免疫不全状態において、様々な疾病の原因となるHCMVに特異的に結合し、その生物活性を喪失
(中和)させ、(HCMVに対して)優れた親和性および中和能を発揮することができる。又、ヒトのモノクローナル抗体である為、免疫原性を有さず、拒絶反応も見られない。
[0013]
以上の性質より、本発明に係る抗HCMV抗体またはその抗原結合部分は、HCMVに対して強い親和性及び中和能をもつ上、拒絶反応も見られないので、
HCMVが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、(a)エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態におけるHCMVの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの致死的な病気や、(b)妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、(c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、(d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害などの予防乃至治療薬として有用であると考えられる。
発明を実施するための最良の形態
[0014]
以下に本願発明に係る抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分について説明する。
[0015]
本明細書で使用される「抗体」という用語は、4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖であってジスルフィド結合によって相互接続されたものからなる免疫グロブリン分子の他、2本のポリペプチド鎖、1本の重(H)鎖および1本の軽(L)鎖であってジスルフィド結合によって相互接続されたものからなる免疫グロブリン分子も指すものとする。
抗体の「抗原結合部分」(又は単に「抗体部分」)という用語は、抗原(例えばHCM
Claims (17)
- HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配列番号1のアミノ酸配列で示される軽鎖(L鎖)と、配列番号2のアミノ酸配列で示される重鎖(H鎖)を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体。
- 前記軽鎖(L鎖)及び/又は重鎖(H鎖)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第1項に記載の抗HCMVモノクローナル抗体。
- HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号3のアミノ酸配列で示される軽鎖可変部領域(LCVR)と、配列番号4のアミノ酸配列で示される重鎖可変部領域(HCVR)を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 前記軽鎖可変部領域(LCVR)及び/又は重鎖可変部領域(HCVR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第3項に記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号5〜10からなる群より選択される何れか一つ以上のアミノ酸配列で示される相補性決定領域(CDR)を有することを特徴とする抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR1ドメインと、配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR2ドメインと、配列番号7のアミノ酸配列を有する軽鎖(L鎖)CDR3ドメインとからなる群から選択されたCDRドメインを含むことを特徴とする、抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- HCMVに結合し、その生物活性を中和し得るヒトのモノクローナル抗体であって、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR1ドメインと、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR2ドメインと、配列番号10のアミノ酸配列を有する重鎖(H鎖)CDR3ドメインとからなる群から選択されたCDRドメインを含むことを特徴とする、抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 前記相補性決定領域(CDR)において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第5〜7項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- HCMVに対する親和性(アフィニティー(M))が、Kd=1.0×10−11(M)〜1.3×10−11(M)であることを特徴とする請求の範囲第1〜8項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 約1μg/mLで、80%以上のHCMV感染阻止率を示すことを特徴とする請求の範囲第1〜9項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体のクラス(サブクラス)がIgG1(κ)であることを特徴とする請求の範囲第1〜10項いずれか記載の抗HCMVモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 請求の範囲第1〜11項いずれか記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、HCMVにより引き起こされる疾病に対する予防乃至治療薬。
- 前記HCMVにより引き起こされる疾病が、(a)免疫不全状態におけるHCMVの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎、(b)妊婦から胎児へHCMV感染が波及することによる巨細胞封入体症、(c)前記巨細胞封入体症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、(d)前記巨細胞封入体症により死亡しない場合における小頭症、精神発育障害、知能発達遅延や聴覚障害からなる群より選択される何れか一つである請求の範囲第12項に記載の予防乃至治療薬。
- HCMVに結合し、その生物活性を中和し得る抗HCMVモノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードするDNAであって、配列番号1〜10からなる群から選択されたアミノ配列をコードする単離されたDNA。
- 請求の範囲第14項に記載のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたDNA。
- 請求の範囲第14項又は第15項に記載の単離DNAを組込んだベクター(植物発現ベクターを除く)。
- 内部に請求の範囲第16項の組換え発現ベクターが導入された、宿主細胞(植物細胞を除く)。
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