BRPI1013648B1 - Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, composição farmacêutica e método para produção do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno - Google Patents

Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, composição farmacêutica e método para produção do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno Download PDF

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Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL CAPAZ DE SE LIGAR AO EPITOPO DESCONTÍNUO ESPECÍFICO QUE OCORRE NA REGIÃO AD1 DA GLICOPROTEÍNA GB DO CITOMEGALOVÍRUS HUMANO, E FRAGMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DESTE A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para citomegalovírus humano HCMV que causa vários estados de doença, a composição compreendendo um anticorpo monoclonal e um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente à região AD1 da glicoproteína gB e que possui excelente capacidade neutralizante. A presente invenção fornrce: um anticorpo monoclonal e um fragmento de ligação de antígeno deste que possui capacidade neutralizante e capacidade de bloqueio da infecção de célula- para-célula excelentes e se liga . especificamente a uma sequência descontínua que ocorre na região AD1 de HCMV; uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou o fragmento deste; e semelhantes.

Description

CAMPO TÉCNICO
A presente invenção está relacionada a um anticorpo monoclonal que se liga ao citomegalovírus humano (daqui em diante, algumas vezes denominado “HCMV”), e um fragmento de ligação de antígeno deste. Mais particularmente, a presente invenção está relacionada a um anticorpo monoclonal humano que se liga à região AD1 da glicoproteína gB do HCMV e a um fragmento de ligação de antígeno deste.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
Juntamente com o herpesvírus humano-6 (HHV-6) e o herpesvírus humano-7 (HHV-7), o citomegalovírus humano (HCMV) pertence ao beta-herpesvírus de Herpesviridae. O HCMV é um vírus de DNA de fita dupla que é o maior entre os Herpesviridae, com um diâmetro de aproximadamente 180 nm, em que a sua cepa selvagem codifica 165 genes com um tamanho de genoma de aproximadamente 235 kbp (Documentos Não-Patente 1 e 2).
O HCMV é altamente espécie-específico e não infecta outros animais além do ser humano, mas infecta amplamente humanos e possui afinidade por tipos amplos de tecidos no corpo humano. Além disso, uma vez infectado, o HCMV não é eliminado nem mesmo após o estabelecimento de imunidade no hospedeiro e permanece por toda a vida.
Uma vez infectado, o HCMV permanece latente por toda a vida. Mais de 90% dos japoneses já estão infectados e carregam o vírus, embora o vírus raramente seja ativado e raramente produza doenças em pessoas saudáveis. No entanto, um estado de imunodeficiência em consequência da AIDS, de câncer, após transplante de órgão, após transplante de medula óssea, após hemodiálise ou semelhantes poderia causar reativação do HCMV latente, o que causa infecção por HCMV séria que pode ser fatal como, por exemplo, pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite, encefalite ou semelhantes (Documentos Não-Patente 3 e 4).
Além disso, quando uma mulher grávida apresenta infecção primária por HCMV durante o período fetal, a infecção por HCMV pode ser transmitida ao feto pela mulher grávida por meio da placenta, quando então o feto pode desenvolver infecção congênita por CMV (doença congênita por citomegalovírus: também denominada doença de inclusão citomegálica ou doença de inclusão citomegálica congênita), e pode resultar em abortamento, natimortos ou morte logo após o nascimento. Mesmo no caso de sobrevida, ela pode resultar em baixo peso ao nascimento, hepatoesplenomegalia, icterícia, púrpura trombocitopênica, microcefalia, distúrbio de desenvolvimento mental, retardo do desenvolvimento intelectual, coriorretinite, déficit auditivo, ou semelhantes. Além disso, até mesmo durante o período de recém-nascido ou infância, se o anticorpo contra HCMV transmitido pela mãe é insuficiente, a infecção por HCMV por meio do canal de parto, leite materno, urina, saliva ou semelhantes pode desenvolver anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial, mononucleose ou semelhantes (Documentos Não-Patente 3,4 e 5).
A infecção por HCMV se tornou um problema no mundo todo e fármacos profiláticos e terapêuticos que sejam capazes de suprimir os surgimentos de várias condições patológicas em função do HCMV descrito acima, ou que sejam capazes de aliviar essas condições patológicas, estão atualmente em desenvolvimento. Recentemente, ganciclovir (Documentos Não-Patente 6 e 7), foscarnet (Documento Não- Patente 8), valganciclovir (Documento Não-Patente 9) e semelhantes foram desenvolvidos como fármacos antivirais para supressão da proliferação do HCMV. O ganciclovir é um fármaco antiviral que bloqueia a síntese de DNA viral, que é ativada em trifosfato de ganciclovir nas células e antagoniza competitivamente com trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), ou seja, um substrato de DNA polimerase, inibindo, dessa forma, a DNA polimerase. Dessa forma, ele é usado para o tratamento de retinite por citomegalovírus em um estado de imunodeficiência, principalmente AIDS, ou usado para supressão do surgimento de retinite por citomegalovírus em infecção avançada por HIV com 100 ou menos linfócitos CD4/mm3, e aprovado como um produto farmacêutico. No entanto, foram relatados efeitos colaterais de diversos agentes antivirais como, por exemplo, ganciclovir, como, por exemplo, distúrbio hematopoiético, e seu modo de utilização tem sido muito limitado, como descrito acima.
O efeito colateral que ocorre mais freqüentemente e necessita de atenção entre os efeitos colaterais do ganciclovir consiste em distúrbios sangüíneos associados à supressão da medula óssea, em que os números de leucócitos, eritrócitos e plaquetas estão anormalmente diminuídos. Os sintomas iniciais incluem febre, dor de garganta, astenia anormal e tendência ao sangramento como, por exemplo, sangramento abaixo da pele. Em alguns casos, ele pode causar anormalidade no sistema psiconeurótico, resultando em dor de cabeça, tonteiras, insônia, dificuldade com o pensamento, sentimento de ansiedade, ou semelhantes. Além disso, teratogênese, mutagenicidade e carcinogenicidade foram relatados em experimentos em animais e, dessa forma, ele não pode ser usado durante a gravidez. Além disso, embora se acredite que o uso de ganciclovir em casos severos de infecção congênita por HCMV seja eficaz na diminuição do surgimento de efeitos colaterais neurológicos e na melhora da progressão da perda auditiva (Documento Não-Patente 10), problemas de supressão da medula óssea, teratogênese ou carcinogenicidade como efeitos colaterais do ganciclovir ainda necessitam de consideração suficiente e cuidadosa. O valganciclovir é o éster de L-valina de ganciclovir que é convertido em ganciclovir com esterases intestinais e hepáticas após administração oral. Conseqüentemente, seu mecanismo de ação e seus efeitos colaterais são iguais àqueles do ganciclovir e, dessa forma, associados a problemas de supressão da medula óssea, teratogênese e carcinogenicidade. No Japão, o valganciclovir é aprovado como um fármaco terapêutico para retinite por citomegalovírus em estados de imunodeficiência, principalmente AIDS. Enquanto isso, foscarnet é um análogo do ácido pirofosfórico e suprime a proliferação do HCMV por atuar diretamente no sítio de ligação de ácido pirofosfórico de DNA polimerase para inibir a DNA polimerase. Ele também é eficaz contra HCMV resistente ao ganciclovir. Os efeitos colaterais principais incluem sensação de doença, anemia, aumento da creatinina sérica, vômitos, hipomagnesemia, hipocalemia, sensação anormal, e semelhantes. Em particular, choque e dano renal freqüentemente ocorrem e, dessa forma, necessita de administração cuidadosa. No Japão, o uso de foscarnet só é permitido em pacientes diagnosticado de forma determinável como tendo retinite por HCMV ou pacientes altamente e clinicamente suspeitos de retinite por HCMV entre os pacientes com AIDS, e não deve ser usado com o objetivo de prevenção de infecção (Documento Não-Patente 8).
Dessa forma, o desenvolvimento de um fármaco capaz de evitar o surgimento de várias doenças em consequência do HCMV descrito acima ou aliviar sintomas destas sem nenhum efeito colateral era fortemente desejado. Sob as circunstâncias, foram realizados os desenvolvimentos clínicos de dois anticorpos anti-HCMV, em que um é o anticorpo anti-HCMV “C23” (também denominado TI-23 no momento do desenvolvimento), descrito no Documento de Patente 3, que é um anticorpo que reconhece a região AD2 da glicoproteína gB, e o outro é o anticorpo anti-HCMV “SDZ MSL 109”, descrito no Documento de Patente 4, que é um anticorpo monoclonal que reconhece a glicoproteína gH na superfície do HCMV. Particularmente, o desenvolvimento de C23 foi abandonado ao longo do caminho, apesar de sua atividade neutralizante elevada, ou seja, concentração inibidora de 50% de 0,5 μg/ml, como determinado pelo método de placa (Documento Não-Patente 11). Por enquanto, o desenvolvimento da vacina contra HCMV foi intensamente realizado, mas ainda não há nenhuma vacina disponível que possa tolerar o uso clínico. Uma formulação de gamaglobulina de titulação elevada anti-CMV derivada de humanos foi recentemente desenvolvida, que é aprovada nos
Estados Unidos no seu uso para prevenção do surgimento de infecção por HCMV associada ao transplante renal. No entanto, na medida em que a formulação de gamaglobulina de titulação elevada anti-CMV é uma preparação sangüínea derivada de humanos, ela possui vários problemas. Por exemplo, uma mistura de gamaglobulina derivada de humanos resulta em uma variação lote-a-lote significativa na atividade, baixa atividade e fornecimento limitado, além dos riscos constantes como, por exemplo, contaminação de vírus patogênicos ou patógenos desconhecidos.
Conseqüentemente, espera-se que um anticorpo monoclonal (daqui em diante, algumas vezes denominado um “anticorpo anti-HCMV”) que se liga ao HCMV e neutraliza sua infectividade (ou seja, que aniquila a sua atividade biológica) como um fármaco profilático ou terapêutico para várias condições patológicas causadas por HCMV seja útil, por exemplo, em termos de estratégia de prevenção ou tratamento contra várias doenças causadas por HCMV em um paciente com uma condição de imunodeficiência.
Especificamente, um anticorpo anti-HCMV derivado de humanos que possui forte afinidade e capacidade neutralizante elevada contra HCMV para aniquilar a atividade do HCMV para evitar o surgimento das doenças ou aliviar os sintomas e que não cause nenhuma reação alérgica pareceu ser eficaz para ser administrado como um denominado “fármaco de anticorpo”.
No entanto, os anticorpos inibidores do HCMV relatados até hoje (por exemplo, Documentos de Patente 1, 2, 3, 4 e 5) foram insuficientes em termos de afinidade, capacidade neutralizante e semelhantes contra HCMV e, dessa forma, houve pouca expectativa de que bloqueassem suficientemente as bioatividades do HCMV para evitar o surgimento de várias doenças causadas por HCMV ou para aliviar seus sintomas. Portanto, o desenvolvimento de um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste, que é um anticorpo monoclonal humano que não reconheça ou responda a uma substância estranha, que possua afinidade, especificidade e capacidade neutralizante para HCMV excelentes, e que possa se esperar seu uso como um fármaco profilático ou terapêutico, era fortemente desejado. Ultimamente, a fim de suprimir a proliferação do HCMV in vivo, não somente a atividade neutralizante, mas também a importância do bloqueio da infecção de célula-para-célula, foi mencionada (Documentos Não-Patente 12 e 13) e, dessa forma, um anticorpo anti-HCMV que também possua uma atividade para inibir a infecção de célula-para-célula era muito necessário.
DOCUMENTOS DA TÉCNICA ESTABELECIDA Documentos de Patente
Documento de Patente 1: Publicação de Pedido de Patente Japonesa N° 8-502403.
Documento de Patente 2: Publicação de Pedido de Patente Japonesa N° 8-506325.
Documento de Patente 3: WO 87/03602.
Documento de Patente 4: WO 93/021952.
Documento de Patente 5: WO 2007/094423.
Documentos Não-Patente
Documento Não-Patente 1: Davison, A.J. e cols., “The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome”. J. Gen. Virol., 2003; 84: páginas 17-28.
Documento Não-Patente 2: Dolan, A. e cols., “Genetic content of wild-type human cytomegalovirus”. J. Gen. Virol., 2004; 85: páginas 1.301-1.312.
Documento Não-Patente 3: Keiko TAYA, “Discussion of Infection: Cytomegalovirus Infection”, Infectious Diseases Weekly Report Japan. 2003; Semana 15: 10-14.
Documento Não-Patente 4: Griffiths, P.D., “The treatment of cytomegalovirus infection”. J. Anti. Chemo., 2002; 49: páginas 243-253.
Documento Não-Patente 5: Demmler, G.J., “Congential cytomegalovirus infection and disease”. “Seminars in Pediatric Infection Diseases”. Seminars in Pediatric Infectious Diseases, 1999; 10: páginas 195-200.
Documento Não-Patente 6: Freitas, V.R. e cols., “Activity of 9-(1,3-dihydroxy-2-Propoxymethel)guanine compared with that of acyclovir against human, monkey, and rodent cytomegaloviruses”. Anti. Agent Chemo., 1985; 28: páginas 240-245.
Documento Não-Patente 7: Bula para agente quimioterápico anti-citomegalovírus Denosina para infusão intravenosa, 500 mg, formulação de ganciclovir, Mitsubishi Tanabe Pharma (revisada em outubro de 2007).
Documento Não-Patente 8: Bula para agente antiviral para injeção em gotejamento, Foscavir, 24 mg/ml, injeção de hidrato de sódio de foscarnet, AstraZeneca (revisada em junho de 2007).
Documento Não-Patente 9: Bula para agente quimioterápico anti-citomegalovírus, comprimidos Valixa (4.500 mg), formulação de cloridrato de valganciclovir, Mitsubishi Tanabe Pharma (revisada em outubro de 2007).
Documento Não-Patente 10: Kimberlin, D.W.e cols., “Effect of ganciclovir therapy on hearing in symptomatic congental cytomegalovirus disease involving the central nervous system; randomized, controlled trial”. J. Pediatr., 2003; 143: 16-25.
Documento Não-Patente 11: Masuho, T.,e cols., “Human monoclonal antibodies neutralizing human cytomegalovirus”. J. Gen. Virol., 1987; 68: páginas 1.457-1.461.
Documento Não-Patente 12: Navarro, D. e cols., “Glycoprotein B of human cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells”. Virology, 1993; 197: páginas 143-158.
Documento Não-Patente 13: Ohizumi, Y., “Neutralizing mechanism of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein 130/55”. J. Gen. Virol., 1992; 73: páginas 2.705-2.707.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problemas a serem solucionados pela invenção
Dessa forma, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno que se ligue especificamente ao HCMV e que iniba suficientemente sua bioatividade parece ser útil contra várias doenças causadas por HCMV de uma perspectiva de estratégia de tratamento ou prevenção.
No momento, a maioria dos fármacos de anticorpo que são aprovados como produtos farmacêuticos precisa ser administrada em grande quantidade de vários mg a várias centenas de mg por dia e é cara. Muitos dos produtos biofarmacêuticos que estão disponíveis comercialmente até hoje diferentes de produtos farmacêuticos de anticorpo precisam ser administrados de várias dezenas de μg até 1 mg por dia. Em comparação, as dosagens diárias de produtos farmacêuticos de anticorpo variam acentuadamente de aproximadamente 10 a 1.000 vezes o produto biofarmacêutico convencional. O HCMV causa várias condições de doença, e os tratamentos dessas doenças possuem questões importantes como, por exemplo, atividade mais elevada, menos dose terapêutica e manutenção do custo de tratamento baixo, consideração dos possíveis efeitos sobre recém-nascidos, bebê e uma mulher grávida. Em outras palavras, não é desejado qualquer fármaco de anticorpo, mas sim um com bioatividade elevada, que seja mais útil com afinidade excelente e capacidade neutralizante maior como um produto farmacêutico em termos de gastos no sistema de saúde.
Embora a quantidade de produção dos produtos farmacêuticos de anticorpo precise ser acentuadamente crescente, as instalações de produção são insuficientes em termos globais. Sob tais circunstâncias, é desejado um anticorpo monoclonal anti-HCMV humano com afinidade e capacidade neutralizante mais elevadas, na medida em que um anticorpo com afinidade e capacidade neutralizante excelentes pode exercer seus efeitos com menor quantidade. Além disso, como o HCMV é fundamentalmente infeccioso para amplos tipos de tecidos e células no corpo (Sinzger, C. e cols., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2008; 325: páginas 63-83), é importante que o anticorpo anti-HCMV exerça seus efeitos clínicos para ter uma atividade neutralizante eficaz para qualquer um de células de fibroblasto, células epiteliais e células endoteliais como uma célula hospedeira a ser infectada.
Considerando a forma de disseminação da infecção por HCMV in vivo, um anticorpo anti-HCMV que não apenas possua capacidade neutralizante, mas também tenha capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula, é muito necessário. Além disso, em virtude da efetividade e segurança como um produto farmacêutico, é desejado o fornecimento de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal derivado de humanos ou um fragmento de ligação de antígeno deste que possua capacidade neutralizante e capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula elevadas contra HCMV que causa vários estados de doença.
Meios para solução dos problemas
A fim de adquirir o anticorpo descrito acima, os presentes inventores realizaram estudos apurados e atuaram com criatividade na obtenção de um anticorpo monoclonal humano que reconhece especificamente um epitopo descontínuo não relatado previamente presente na região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, que também possui capacidade neutralizante elevada e capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula elevada, obtendo, dessa forma, a presente invenção.
Dessa forma, a presente invenção está relacionada a um anticorpo monoclonal anti-HCMV ou um fragmento de ligação deste, DNA (polinucleotídeo) que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação, um vetor contendo o DNA e uma célula hospedeira contendo o vetor descrito abaixo. [1] Um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga à região AD1 da glicoproteína do citomegalovírus humano (HCMV) gB e que reconhece, como um epitopo, uma sequência descontínua que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 25, a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 6 e a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 27 presentes na região AD1. [2] Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à região AD1 da glicoproteína do citomegalovírus humano (HCMV) gB e que é capaz de neutralizar sua bioatividade, em que: (i) a região variável da cadeia pesada compreende: (a) uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13 e uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13; (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14 e uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14; e (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 15, uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 15, e a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22, e (ii) a região variável da cadeia leve compreende: (a) uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16 e uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16; (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 17 e uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 17; e (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve selecionada do grupo que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18 e uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18, ou um fragmento de ligação de antígeno deste. [3] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [2] acima, que se liga especificamente a um epitopo que compreende duas ou mais sequências descontínuas presentes em regiões de uma sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 23) que consiste nos resíduos de aminoácidos contínuos nas posições 549-580 e uma sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 24) que consiste nos resíduos de aminoácidos contínuos nas posições 596-640 da glicoproteína gB do HCMV. [4] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [2] acima, que reconhece, como um epitopo, uma sequência descontínua que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 25, a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 6 e a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 27 na região AD1 da glicoproteína gB do HCMV. [5] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com um de [3] e [4] acima, o anticorpo compreendendo: (i) (a) uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13 (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14; e (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22, e (ii) (a) uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16 (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 17; e (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18. [6] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [5] acima, o anticorpo compreendendo: (i) (a) uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13 (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14; e (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 15, e (ii) (a) uma sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16 (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 17; e (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18. [7] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [2] acima, que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10, uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) que consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12, uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12. [8] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [7] acima, que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12. [9] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [2] acima, que compreende: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6, uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6; e (b) uma cadeia leve (cadeia L) que possui a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8, uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8. [10] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com [9] acima, que compreende: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6; e (b) uma cadeia leve (cadeia L) que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8. [11] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer um de [1]-[10] acima, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano. [12] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer um de [1]-[11] acima, em que a classe (subclasse) do anticorpo é IgG1 (X). [13] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer um de [1]-[12] acima, cuja concentração inibidora de 50% para formação de placas é de 0,05 μg/ml (aproximadamente 0,3 nM) ou menos para a cepa laboratorial de HCMV (AD169) na presença de uma célula de fibroblasto humano. [14] O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer um de [1]-[13] acima, que possui capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula de 50% ou mais a 0,2 μg/ml (aproximadamente 1,3 nM) ou menos em uma linhagem de células de fibroblastos humanos (MRC-5) infectada com a cepa laboratorial de HCMV (AD169). [15] Uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença relacionada ao citomegalovírus humano (HCMV), que compreende o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer um de [1]-[14] acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. [16] A composição farmacêutica de acordo com [15] acima, em que: a doença relacionada ao HCMV é (a) pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite ou encefalite causada por reativação de HCMV em um estado de imunodeficiência, (b) infecção congênita por CMV em virtude da transmissão da infecção por HCMV de uma mulher grávida para um feto, (c) abortamento, natimortos ou morte logo após o nascimento causados pela infecção congênita por CMV descrita acima, (d) baixo peso ao nascimento, hepatoesplenomegalia, icterícia, púrpura trombocitopênica, microcefalia, distúrbio de desenvolvimento mental, retardo do desenvolvimento intelectual, coriorretinite ou déficit auditivo no caso de sobrevida por meio da infecção congênita por CMV descrita acima; ou (e) anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial ou mononucleose que é causada por infecção por HCMV durante o período de recém- nascido ou infância. [17] Um ácido nucléico que codifica um anticorpo monoclonal anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente à região AD1 da glicoproteína gB do HCMV e que é capaz de neutralizar sua bioatividade, em que: o ácido nucléico isolado é selecionado de ácidos nucléicos que codificam sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 e 22, e ácidos nucléicos que hibridizam para elas sob condições altamente rigorosas. [18] Um vetor que incorpora um ácido nucléico de acordo com [17] acima. [19] Uma célula hospedeira que incorpora o vetor de acordo com [18] acima. [20] Um método para produção do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer um de [1]-[14] acima, que compreende uma etapa de cultivo da célula hospedeira de acordo com [19] acima.
EFEITOS DA INVENÇÃO
Um anticorpo anti-HCMV da presente invenção, em particular, um anticorpo que se liga especificamente à região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, ou um fragmento de ligação de antígeno deste, pode se ligar especificamente ao HCMV que é a causa de várias doenças, por exemplo, em um estado de imunodeficiência, e aniquila (neutraliza) a bioatividade do HCMV, exercendo, dessa forma, excelente capacidade neutralizante contra HCMV. Além disso, uma modalidade em que o anticorpo anti-AD1 da glicoproteína gB do HCMV da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano é vantajosa, na medida em que ele não possui imunogenicidade e pelo fato de que não produz nenhuma resposta imune.
Uma modalidade do anticorpo anti-HCMV da presente invenção possui capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula elevada ou atividade inibidora de infecção de célula-para-célula contra HCMV. Considerando o modo da disseminação da infecção por HCMV in vivo, é vantajoso que o anticorpo anti-HCMV possua não apenas capacidade neutralizante, mas também capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula.
Um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste da presente invenção possui capacidade neutralizante elevada e atividade inibidora contra a disseminação da infecção por HCMV. Como um anticorpo monoclonal humano não possui imunogenicidade, é provável que seja útil como um fármaco profilático ou terapêutico para várias doenças causadas por HCMV, por exemplo: (a) doenças como, por exemplo, pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite, encefalite, e semelhantes, em função da reativação do HCMV em estados de imunodeficiência como, por exemplo, AIDS, câncer, após transplante de órgão, após transplante de medula óssea e após hemodiálise; (b) infecção congênita por CMV em virtude da transmissão da infecção por HCMV de uma mulher grávida para um feto; (c) abortamento, natimortos e morte logo após o nascimento causada pela infecção congênita por CMV descrita acima; (d) baixo peso ao nascimento, hepatoesplenomegalia, icterícia, púrpura trombocitopênica, microcefalia, distúrbio de desenvolvimento mental, retardo do desenvolvimento intelectual, coriorretinite e déficit auditivo no caso de sobrevida por meio da infecção congênita por CMV descrita acima; e (e) anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial e mononucleose em decorrência de infecção por HCMV durante o período de recém-nascido ou infância (Documentos Não-Patente 3, 4 e 5).
Além disso, uma composição farmacêutica contendo um anticorpo monoclonal humano da presente invenção particularmente preferível é eficaz com uma quantidade extremamente pequena.
Recentemente, foram realizados estudos para um anticorpo anti-HCMV contra vários antígenos de superfície diferentes da glicoproteína gB, por exemplo, gH, gL ou semelhantes. No entanto, considerando as circunstâncias mencionadas em (1)-(3) abaixo, um anticorpo que se liga especificamente à glicoproteína gB, particularmente à região AD1 desta, e que possui atividade neutralizante elevada, como o anticorpo da presente invenção, é altamente útil como um fármaco profilático ou terapêutico para infecção por HCMV. (1) A fim de suprimir proliferação viral, por exemplo, de HCMV, in vivo, foi ressaltada a importância não somente da atividade neutralizante, mas também de bloqueio da infecção de célula-para-célula (Documentos Não-Patente 12 e 13). Enquanto isso, estudos recentes sobre a glicoproteína gB mostram que gB tem um papel importante na entrada de partículas virais em células e na infecção de célula-para- célula (Isaacson, M.K. e cols., “Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress”. J. Virology, 2009; 83: páginas 3.891-3.903). Dessa forma, é muito provável que um anticorpo contra gB também contribua para a inibição da infecção de célula-para-célula. (2) Entre as glicoproteínas gB essenciais para infecção por HCMV, a região AD1 é um pré-requisito para funções e formação da conformação de gB (Qadri, I. e cols., “Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus”. J. Gen. Virol.,1992; 73; páginas 2.913-2.921; e Britt, W.J. e cols., “Antigenic domain is required for oligomerization of human cytomegalovirus glycoprotein B”. J. Virol., 2005; 79: páginas 4.066-4.079), e também é conhecida como uma parte com menos mutação de uma cepa do vírus isolada clinicamente. Dessa forma, um anticorpo contra AD1 possivelmente possui um amplo espectro. (3) Um anticorpo de AD1 que reconhece epitopos descontínuos por uma região mais longa em gB, quando comparado com um anticorpo contra a região AD2, possui especificidade mais elevada e, dessa forma, parece ter menos possibilidade de causar efeitos colaterais inesperados por reatividade cruzada com outras molécula biológica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um fluxograma que mostra um procedimento para separação de um clone de célula produtora de anticorpo para produção de um anticorpo anti-HCMV de acordo com a presente invenção.
A Figura 2 mostra a avaliação das capacidades de sequências de 16 resíduos de aminoácidos que formam CDR-H3 de EV2038 para se ligar à AD1, quando submetidas às substituições de aminoácidos não conservadoras. (4) Figura 3 mostra a avaliação das capacidades da sequência para se ligar à AD1, quando submetida às substituições conservadoras de aminoácidos nas posições 121, 123, 124 e 126 da cadeia H de EV2038.
A Figura 4 mostra a avaliação das capacidades da sequência para se ligar à AD1 quando prolina na posição 125 da cadeia H de EV2038 é substituída com todos os aminoácidos diferentes de prolina e arginina.
A Figura 5 mostra a avaliação das capacidades da sequência para se ligar à AD1 quando submetida às substituições conservadoras de aminoácidos dos resíduos de aminoácidos entre os aminoácidos que formam CDR-H3 de EV2038 cujas capacidades de ligação à AD1 não diminuíram quando submetida às substituições de aminoácidos não conservadoras mostradas na Figura 2.
A Figura 6 mostra a avaliação das capacidades de ligação de variantes à AD1. Um total de quatro tipos de variantes foi preparado por substituição simultânea de dois ou quatro dos resíduos de aminoácidos que mostraram capacidades de ligação à AD1 reduzidas mediante substituições de aminoácidos não conservadoras entre os aminoácidos que formam CDR-H3 de EV2038 diferentes de prolina na posição 125 (especificamente, total de quatro resíduos nas posições 121, 123, 124 e 126) (produtos com dois aminoácidos substituídos: I124V/G126A e I124V/G126S; produtos com quatro aminoácidos substituídos: L121I/W123Y/I124V/G126A e L121I/W123Y/I124V/G126S).
A Figura 7 mostra a avaliação das capacidades de ligação de variantes à AD1. Cada uma das variantes por deleção e inserção (E122del e G126_D127insE) para os resíduos de aminoácidos nas posições 121, 123, 124 e 126 (prolina na posição 125 foi excluída), ou seja, quatro resíduos no total, nos aminoácidos que formam CDR-H3 de EV2038, a substituição de aminoácidos não conservadora que mostrou capacidades de ligação à AD1 reduzidas, foi preparada e submetida à avaliação.
A Figura 8 mostra a avaliação da capacidade de ligação à AD1 de uma variante que possui mutação no 79° resíduo de aminoácido da região CDR-H2 de EV2038.
A Figura 9(A) mostra uma visão de clones dos mutantes com região AD1 da glicoproteína gB deletada usados para análise de regiões de epitopo, enquanto a Figura 9(B) é uma visão que mostra resultados de análise Western blot usando esses mutantes por deleção.
A Figura 10(A) mostra os resultados de mapeamento de epitopo de EV2038 usando um arranjo de peptídeos. A Figura 10(B) mostra os resultados da análise mencionada acima juntamente com a sequência de aminoácidos da glicoproteína gB, bem como os resultados de uma análise que utiliza o mutante por deleção de EV2038 e sequência relatada previamente do epitopo de ITC52.
A Figura 11 é um gráfico que mostra resultados da avaliação da atividade neutralizante de um anticorpo anti- HCMV da presente invenção. A Figura 11(A) é um gráfico que mostra as atividades neutralizantes de um anticorpo monoclonal humano (hIgG) como um controle negativo que não possui especificidade para HCMV e EV2001 como um anticorpo anti-AD1 (revelado no Documento de Patente 5), contra citomegalovírus humano (cepa AD169) na presença de um complemento; a Figura 11(B) é um gráfico que mostra as atividades neutralizantes de hIgG e anticorpos monoclonais anti-HCVM (EV2038 e HCMV16), contra citomegalovírus humano (cepa AD169) na presença de um complemento; a Figura 11(C) é um gráfico que mostra as atividades neutralizantes de hIgG como um controle negativo e EV2001, contra citomegalovírus humano (cepa AD169) na ausência de um complemento; e a Figura 11(D) mostra as atividades neutralizantes de hIgG e anticorpos anti-HCMV monoclonais (EV2038 e HCMV16), contra citomegalovírus humano (cepa AD169) na ausência de um complemento.
MODALIDADE PARA REALIZAR A INVENÇÃO 1. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção
De acordo com uma modalidade da presente invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente à glicoproteína gB do citomegalovírus humano (HCMV) e que é capaz de neutralizar sua bioatividade. De acordo com uma modalidade mais específica, é fornecido um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente a um epitopo descontínuo presente na região AD1 da glicoproteína gB do HCMV e que é capaz de neutralizar a bioatividade da proteína. “Glicoproteína gB do citomegalovírus humano (HCMV)” (ou “glicoproteína gB do HCMV” ou “glicoproteína gB do HCMV”) é uma das glicoproteínas principais que formam o envelope do HCMV, que sabidamente contribui para a entrada de partículas virais nas células, fusão de células e a infecção de célula-para-célula por um vírus. A sequência de aminoácidos da glicoproteína gB do HCMV (sequência de aminoácidos da cepa AD169 como uma cepa representativa do vírus HCMV) está disponível como a sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 137) da proteína de N° de Acesso: P06473 de uma base de dados de sequências disponível ao público (Swiss-Prot). “Região AD1 da glicoproteína gB do citomegalovírus humano (HCMV)” ou “região AD1 da glicoproteína gB do HCMV” refere-se a uma região que consiste em resíduos de aminoácidos contínuos nas posições 552-635 da sequência de aminoácidos da glicoproteína gB do HCMV (Wagner e cols., Journal of Virology, Vol. 66, N° 9, Setembro de 1992, páginas 5.290-5.297).
Aqui, o termo “epitopo” é usado em um sentido geral no campo da técnica e se refere a uma pequena estrutura parcial de uma molécula de antígeno como um parceiro de ligação de um anticorpo (“Iwanami Biological Dictionary”, 4a Edição (1a Edição publicada em 1996)).
De acordo com uma modalidade ainda mais específica da invenção, um epitopo descontínuo presente na região AD1 existe na sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos contínuos nas posições 549-580 (ID. DE SEQ. N°: 23) e na sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos contínuos nas posições 596-640 (ID. DE SEQ. N°: 24) da glicoproteína do citomegalovírus humano (HCMV) gB. Ainda mais especificamente, o epitopo descontínuo consiste na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 25, na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 6 e na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 27.
De acordo com uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste da presente invenção inclui: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) que contém a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6; e (b) uma cadeia leve (cadeia L) que contém a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno se liga especificamente à glicoproteína gB do citomegalovírus humano e é capaz de neutralizar sua bioatividade.
Alternativamente, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste da presente invenção inclui: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que contém a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) que contém a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12, em que ela se liga especificamente à glicoproteína gB do citomegalovírus humano e é capaz de neutralizar sua bioatividade.
Alternativamente, um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno da presente invenção se liga especificamente à glicoproteína gB do citomegalovírus humano e é capaz de neutralizar sua bioatividade, em que: (i) as sequências de aminoácidos da CDR (região determinante de complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada incluem: (a) a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13; (b) a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14; e (c) a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 15, respectivamente, e (ii) as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve incluem: (a) a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16; (b) a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 17; e (c) a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18, respectivamente.
Um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno deste também compreende um equivalente funcional do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno descrito acima, que se liga especificamente à glicoproteína gB do citomegalovírus humano e é capaz de neutralizar sua bioatividade. Estas incluem, por exemplo: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) mostrada por uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 ou 6; e (b) uma cadeia leve (cadeia L) mostrada por uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 4 ou 8.
Alternativamente, um equivalente funcional do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno descrito acima também inclui: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que compreende uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12, ou uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de 95% ou mais com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12.
Alternativamente, um equivalente funcional do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno descrito acima ainda inclui: (i) (a) CDR1 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que possuem deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13, (b) CDR2 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que possuem deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 14, e (c) CDR3 da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que possuem deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 15 e a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22; e (ii) (a) CDR1 da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que possuem deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 16, (b) CDR2 da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que possuem deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 17, e (c) CDR3 da cadeia leve selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos que possuem deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 18. O limite superior do número de mutações contidas na sequência de aminoácidos do equivalente funcional descrito acima pode ser determinado com base em se o equivalente pode se ligar especificamente à glicoproteína gB do HCMV e é capaz de neutralizar sua bioatividade. A atividade neutralizante de HCMV pode ser avaliada, por exemplo, de acordo com métodos descritos nos Exemplos 9 e 10 abaixo. A capacidade para bloqueio da infecção de célula-para-célula pode ser avaliada de acordo com um método descrito no Exemplo 11 abaixo.
O termo “anticorpo”, como aqui usado, refere-se a uma molécula de imunoglobulina que consiste em quatro cadeias polipeptídicas, ou seja, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), que estão mutuamente conectadas por meio de ligações dissulfeto. Um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção também consiste em uma molécula de imunoglobulina contendo duas de cada uma das cadeias leves (cadeias L) e cadeias pesadas (cadeias H). Cada uma das cadeias H consiste em uma região variável da cadeia H (algumas vezes denominada “HCVR” ou “VH”) e uma região constante da cadeia H (a região constante da cadeia H consiste em três domínios, que algumas vezes podem ser denominados “CH1”, “CH2” e “CH3” (coletivamente denominados CH)). Cada uma das cadeias L consiste em uma região variável da cadeia L (algumas vezes denominada “LCVR” ou “VL”) e uma região constante da cadeia L (a região constante da cadeia L consiste em um único domínio, que algumas vezes pode ser denominado “CL”).
Em particular, HCVR e LCVR são importantes na medida em que são responsáveis pela especificidade de ligação de um anticorpo. Como um anticorpo interage com um antígeno- alvo principalmente por meio dos resíduos de aminoácidos de LCVR e HCVR, a sequência de aminoácidos dentro da região variável varia acentuadamente entre vários anticorpos em relação à sequência fora da região variável. HCVR e LCVR podem ainda ser classificadas em uma região denominada região framework (FR) e uma região hipervariável denominada região determinante de complementaridade (CDR), que são mais constantes entre vários anticorpos. Cada HCVR e LCVR consiste em três CDRs e quatro FRs, que estão seqüencialmente alinhadas na ordem de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 do terminal amino ao terminal carbóxi.
O termo “fragmento de ligação de antígeno” (ou simplesmente “fragmento de anticorpo”) de um anticorpo se refere a um fragmento de um ou mais anticorpos capaz de se ligar a um antígeno (por exemplo, HCMV). Nesse caso, esse fragmento deve conter um peptídeo que possui uma sequência de aminoácidos mínima que se liga especificamente ao antígeno. Além disso, um anticorpo de fita simples (scFV), um antígeno biespecífico, um antígeno poliespecífico, e semelhantes, que possui a região variável ou a região determinante de complementaridade do anticorpo que se liga especificamente ao antígeno, também são incluídos nos “fragmentos de ligação de antígeno”. Aqui, para simplificar, “um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno” pode ser simplesmente denominado um “anticorpo”.
Um “anticorpo capaz de neutralizar a bioatividade de HCMV” refere-se a um anticorpo que inibe a bioatividade de HCMV por ligação ao HCMV ou a uma célula infectada pelo HCMV. “Bioatividade de HCMV” típica inclui, sem limitação, atividades de HCMV que causam as doenças (a)-(e) seguintes exemplificadas abaixo, e incluem atividades de HCMV que induzem várias doenças causadas pela ação do HCMV ativado: (a) várias doenças como, por exemplo, pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite ou encefalite causada por reativação de HCMV em um estado de imunodeficiência como, por exemplo, AIDS, câncer, após transplante de órgão, após transplante de medula óssea ou após hemodiálise; (b) infecção congênita por CMV em virtude da transmissão da infecção por HCMV de uma mulher grávida para um feto; (c) abortamento, natimortos ou morte logo após o nascimento causados pela infecção congênita por CMV descrita acima; (d) baixo peso ao nascimento, hepatoesplenomegalia, icterícia, púrpura trombocitopênica, microcefalia, distúrbio de desenvolvimento mental, retardo do desenvolvimento intelectual, coriorretinite ou déficit auditivo no caso de sobrevida por meio da infecção congênita por CMV descrita acima; ou (e) anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial ou mononucleose que é causada por infecção por HCMV durante o período de recém-nascido ou infância (Documentos Não-Patente 3, 4 e 5).
O termo “doença causada por HCMV”, como aqui usado, inclui, além de outras doenças, uma doença que supostamente ou que parece ser causada porque um indivíduo-alvo que sofre daquela doença tem o HCMV como a causa das condições patológicas daquela doença ou como uma causa da piora daquela doença. Portanto, doenças causadas por bioatividade de HCMV são aquelas cujos sintomas e/ou progressão supostamente são aliviados por inibição da bioatividade do HCMV. Os sintomas dessas doenças podem ser aliviados ou tratados, por exemplo, pela utilização do anticorpo anti- HCMV descrito acima. Especificamente, a doença mencionada acima pode ser comprovada por aumento do nível de anticorpo anti-HCMV no fluido biológico do indivíduo-alvo que sofre daquela doença (por exemplo, por aumento do nível de anticorpo anti-HCMV no soro, plasma ou fluido sinovial do indivíduo-alvo).
Os termos “efeito inibidor”, “inibição”, “supressão” e “capaz de inibir”, como aqui usados, referem-se à redução da bioatividade resultante do antígeno (HCMV) por aproximadamente 5-100%, preferivelmente 10-100%, mais preferivelmente 20-100%, mais preferivelmente 30-100%, mais preferivelmente 40-100%, mais preferivelmente 50-100%, mais preferivelmente 60-100%, mais preferivelmente 70-100% e ainda mais preferivelmente 80-100%.
Como a sequência de aminoácidos da região variável é responsável pela maior parte da interação antígeno- anticorpo, um anticorpo recombinante que replica uma propriedade de um anticorpo de ocorrência natural em particular pode ser expresso por construção de um vetor de expressão que contém uma sequência da região variável ou uma sequência da porção da CDR derivada do anticorpo de ocorrência natural em particular, enxertada em uma região constante ou uma sequência framework derivada de um anticorpo diferente que possui uma propriedade diferente.
Conseqüentemente, a fim de refazer um anticorpo recombinante intacto que possui a mesma característica de ligação que aquela do anticorpo original, não há necessidade de obter toda a sequência do anticorpo em particular. A sequência da região variável ou a porção da CDR das cadeias pesadas e leves do anticorpo pode ser suficiente para essa finalidade.
Os IDS. DE SEQ. Nos: 13, 14 e 15 representam sequências de aminoácidos que correspondem à CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, respectivamente. Os IDS. DE SEQ. Nos: 16, 17 e 18 são sequências de aminoácidos que correspondem à CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, respectivamente. Portanto, um anticorpo da presente invenção preferível possui CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve que correspondem aos IDS. DE SEQ. Nos: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, respectivamente. No entanto, CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve podem não necessariamente corresponder aos IDS. DE SEQ. Nos: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, respectivamente, desde que o anticorpo monoclonal se ligue especificamente ao HCMV e seja capaz de neutralizar sua bioatividade. CDR-3 da cadeia pesada, em particular, pode ser uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo da sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 22. Além disso, a sequência da CDR pode ser uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários (especificamente, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1) resíduos de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, desde que possua a atividade neutralizante descrita acima.
A sequência de aminoácidos diferente da CDR não é particularmente limitada, e um denominado anticorpo com enxerto de CDR no qual a sequência de aminoácidos diferente da CDR é derivada de outro anticorpo, em particular, um anticorpo de outra espécie, também é englobado pela presente invenção. A sequência de aminoácidos diferente da CDR é preferivelmente um anticorpo derivado de humanos, mas, se necessário, a região framework (FR) pode incluir deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários (o número específico sendo o mesmo mencionado acima) resíduos de aminoácidos. Esses anticorpos podem ser preparados de acordo com um método conhecido (Riechmann L., e cols., “Reshaping human antibodies for therapy”, Nature, 332: 323327, 1988). De acordo com a presente invenção, um anticorpo humano completo, evidentemente, é favorável.
A deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um ou mais resíduos de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de uma proteína da presente invenção significa que deleção, substituição, inserção e adição de um ou vários resíduos de aminoácidos estão presentes em qualquer uma ou mais posições da mesma sequência de aminoácidos, em que duas ou mais das deleções, substituições, inserções e adições podem ocorrer simultaneamente.
Aminoácidos que formam proteínas de ocorrência natural podem ser classificados de acordo com as propriedades de suas cadeias laterais. Por exemplo, exemplos de grupos de aminoácidos que possuem propriedades similares incluem aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptofano), aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico, ácido glutâmico), aminoácidos neutros (serina, treonina, asparagina, glutamina), aminoácidos que possuem uma cadeia hidrocarboneto (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina) e outros (glicina, metionina, cisteína).
Resíduos de aminoácidos mutuamente substituíveis que incluem aminoácidos não nativos também podem ser classificados, por exemplo, da seguinte forma, em que resíduos de aminoácidos no mesmo grupo podem ser mutuamente substituíveis uns com os outros. Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanóico, metionina, o-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina; Grupo B: ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido isoaspártico, ácido isoglutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminossubérico; Grupo C: asparagina, glutamina; Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanóico, ácido 2,3- diaminopropiônico; Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4- hidroxiprolina; Grupo F: serina, treonina, homoserina; e Grupo G: fenilalanina, tirosina, triptofano.
De acordo com a presente invenção, anticorpos mais preferíveis incluem: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) mostrada: pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10; uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários (especificamente, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1) resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10; ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de 95% ou mais (preferivelmente, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais ou 99,5% ou mais) com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10, e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) mostrada: pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 12; uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações de um a vários (o número específico sendo o mesmo mencionado acima) resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12; ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de 95% ou mais (a percentagem específica sendo a mesma mencionada acima) com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12.
Aqui, a identidade de uma sequência de aminoácidos ou de uma sequência de nucleotídeos pode ser determinada por emprego do algoritmo BLAST por Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 2.264-2.268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5.873, 1993). Programas denominados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base no algoritmo BLAST (Altschul SF, e cols.: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). A fim de analisar uma sequência de nucleotídeos com uso de BLASTN, parâmetros são ajustados, por exemplo, em pontuação = 100 e comprimento da palavra = 12. A fim de analisar uma sequência de aminoácidos com o uso de BLASTX, os parâmetros são ajustados, por exemplo, em pontuação = 50 e comprimento de palavra = 3. No caso de utilização dos programas BLAST e Gapped BLAST, são usados os parâmetros-padrão para cada programa.
De acordo com a presente invenção, anticorpos ainda mais preferíveis incluem: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) representada pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 10 e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) representada pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12.
De acordo com a presente invenção, anticorpos ainda mais preferíveis incluem: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) mostrada: pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 6; uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários (o número específico sendo o mesmo mencionado acima) resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 6; ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de 95% ou mais (a percentagem específica sendo a mesma mencionada acima) com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 6, e (b) uma cadeia leve (cadeia L) mostrada: pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8; uma sequência de aminoácidos que possui deleção, substituição, inserção, adição ou uma combinação de duas ou mais dessas mutações para um a vários (o número específico sendo o mesmo mencionado acima) resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8; ou uma sequência de aminoácidos que possui identidade de 95% ou mais (a percentagem específica sendo a mesma mencionada acima) com a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8.
O anticorpo mais preferível de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal humano completo que inclui uma cadeia pesada (cadeia H) representada pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 6 e uma cadeia leve (cadeia L) representada pela sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 8. Além disso, a classe (subclasse) de um anticorpo preferível da invenção é IgG1(X).
O anticorpo anti-HCMV descrito acima ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção se liga especificamente ao HCMV causador de várias doenças, neutraliza sua bioatividade e possui capacidade neutralizante bem maior do que aquela de um anticorpo anti- HCMV convencional.
A frase “se liga especificamente a”, como aqui usada, significa que reconhece e se liga a um antígeno predeterminado.
Tipicamente, uma constante de dissociação (valor Kd) entre HCMV (especialmente, HCMV humano) e um anticorpo da invenção é preferivelmente de 1 x 10-7 M ou menos, mais preferivelmente 1 x 10-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 1 x 10-9 M ou menos e, principalmente, 1 x 10-10 M ou menos. Uma constante de dissociação entre um anticorpo e HCMV pode ser determinada de acordo com um método conhecido. Por exemplo, um anticorpo anti-HCMV imobilizado em um chip pode ser usado para determinação usando um analisador de interação de proteínas como, por exemplo, BIACORET100 (marca registrada).
A capacidade neutralizante de um anticorpo anti-HCMV pode ser avaliada por determinação de uma taxa de bloqueio de infecção ou uma taxa de bloqueio de formação de placas por imunocoloração. Especificamente, uma cepa de HCMV típica, por exemplo, a cepa AD169 e a cepa Towne, é colocada em contato com vários níveis de anticorpos anti- HCMV por um tempo predeterminado antes de sua inoculação em um sistema de cultura de células infectáveis.
Subseqüentemente, elas são inoculadas nas células. Vinte e quatro horas após a infecção, o número de células infectadas pelo HCMV pode ser contado por imunocoloração para determinar a taxa de bloqueio de infecção, ou o número de placas formadas 5-6 dias após a infecção pode ser contado para determinar sua taxa de bloqueio e, portanto, a determinação da atividade neutralizante do anticorpo anti- HCMV.
Um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção possui aproximadamente 50% de capacidade de bloqueio da formação de placas, ou seja, uma atividade neutralizante contra a cepa AD169, preferivelmente a 1 μg/ml (aproximadamente 7 nM) ou menos, mais preferivelmente a 0,1 μg/ml (aproximadamente 0,7 nM) ou menos, ainda mais preferivelmente a 0,05 μg/ml (aproximadamente 0,3 nM) ou menos e, principalmente, aproximadamente a 0,03 μg/ml (aproximadamente 0,2 nM) ou menos.
Além disso, como uma capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula, um efeito inibidor para infecção de célula-para-célula pode ser avaliado por cultivo de uma célula infectada pelo HCMV por um tempo predeterminado e depois adição de vários níveis de anticorpos anti-HCMV àquele sistema de cultura de células.
Um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção possui 50% ou mais de capacidade de bloqueio da infecção de célula- para-célula em uma concentração final de preferivelmente 2 μg/ml (aproximadamente 13 nM) ou menos, mais preferivelmente 0,5 μg/ml (aproximadamente 3 nM) ou menos e, ainda mais preferivelmente, 0,2 μg/ml (aproximadamente 0,13 nM) ou menos.
Um anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo monoclonal humano recombinante, um anticorpo monoclonal (incluindo anticorpo quimérico e anticorpo humanizado) ou um fragmento de ligação de antígeno deste que pode se ligar especificamente ao HCMV e é capaz de neutralizar sua bioatividade, que pode ser obtido de acordo com uma metodologia bem conhecida na técnica com base em um anticorpo de comprimento total, um fragmento de ligação de antígeno deste, ou uma sequência de aminoácidos de uma região variável do ID. DE SEQ. N°: 6, 8, 10 ou 12, e uma sequência de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade (CDR) representada por qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 13-18. Esses anticorpos serão englobados pelo escopo técnico da presente invenção.
Por exemplo, sequências sinalizadoras de cadeias pesadas e leves são clivadas na evolução do amadurecimento da proteína e, dessa forma, elas não contribuem para a propriedade do anticorpo final. A fim de adicionar a sequência ausente, uma sequência de cDNA clonada pode ser combinada com um oligonucleotídeo sintético por ligação ou amplificação por PCR.
Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada por combinação de um conjunto de oligonucleotídeos superpostos curtos por amplificação por PCR, preparando, dessa forma, um clone completamente artificial da região variável.
2. Ácido nucléico que codifica anticorpo ou semelhantes da presente invenção
De acordo com outra modalidade da presente invenção, é fornecido um ácido nucléico isolado que codifica um anticorpo monoclonal anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga especificamente ao HCMV e que é capaz de neutralizar sua bioatividade, em que o ácido nucléico é selecionado de ácidos nucléicos que codificam uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 e 22, e ácidos nucléicos que hibridizam com esses ácidos nucléicos sob condições altamente rigorosas.
De preferência, o ácido nucléico descrito acima é DNA ou RNA e, mais preferivelmente, DNA.
Um ácido nucléico isolado que codifica um anticorpo monoclonal anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste que se liga ao HCMV e que é capaz de neutralizar sua bioatividade, que possui identidade elevada com um ácido nucléico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 e 22, também é englobado pela presente invenção. A frase “que possui identidade elevada”, como aqui usada, refere-se à identidade de sequência que é suficiente para hibridizar para uma sequência de ácidos nucléicos predeterminada sob condições altamente rigorosas, o que significa, por exemplo, identidade de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais.
O termo “condições altamente rigorosas” significa, por exemplo, condições de 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt, SDS 0,5% e formamida 50% a 50°C (veja, por exemplo, J. Sambrook e cols., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), em particular, seção 11.45 “Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”). Sob essas condições, espera-se que uma temperatura maior gere eficientemente um polinucleotídeo (por exemplo, DNA) com identidade maior.
No entanto, parece haver vários fatores que influenciam o rigor da hibridização como, por exemplo, temperatura, concentração da sonda, comprimento da sonda, força iônica, tempo e concentração de sal, e aqueles habilitados na técnica devem ser capazes de selecionar adequadamente esses fatores para perceber rigor similar.
Exemplos de ácidos nucléicos submetidos à hibridização sob as condições altamente rigorosas descritas acima incluem ácidos nucléicos que possuem identidade de, por exemplo, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais ou 99% ou mais para um ácido nucléico que codifica uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 e 22.
A identidade de uma sequência de nucleotídeos pode ser determinada por utilização do algoritmo de pesquisa de identidade descrito acima (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2.264-2.268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5.873, 1993).
Um ácido nucléico preferível de acordo com a presente invenção é DNA que codifica ambas as sequências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 10 e 12 e, mais preferivelmente, DNA que codifica ambas as sequências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 6 e 8. Um ácido nucléico ainda mais preferível é DNA que codifica ambas as sequências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2 e 4.
Um ácido nucléico ainda mais preferível é um ácido nucléico que contém ambos os ácidos nucléicos dos IDS. DE SEQ. Nos: 5 e 7, e um ácido nucléico ainda mais preferível é um ácido nucléico que contém ambos os ácidos nucléicos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 3.
3. Vetor, célula hospedeira e método para preparação do anticorpo da invenção
A presente invenção também está relacionada a um vetor que incorpora o ácido nucléico descrito acima, uma célula hospedeira introduzida com o vetor e um método para preparação de um anticorpo com sua utilização.
Um anticorpo da presente invenção também pode ser preparado como um anticorpo humano recombinante de acordo com um método conhecido (veja Nature, 312: 643, 1984, Nature, 321: 522, 1986 etc.). Por exemplo, um anticorpo da presente invenção pode ser preparado por cultivo de uma célula hospedeira introduzida com um vetor da invenção, e purificação do anticorpo produzido do sobrenadante da cultura ou semelhantes. Mais especificamente, um anticorpo pode ser preparado por inserção de cDNAs que codificam VH e VL em vetores de expressão de célula animal contendo genes que codificam CH de anticorpo humano e/ou CL de anticorpo humano preparada pela mesma célula ou diferentes células humanas para a construção de um vetor de expressão de anticorpo humano e introdução do vetor em uma célula animal para expressão. Vetores nos quais ácidos nucléicos que codificam VH ou VL do anticorpo da presente invenção são incorporados não são necessariamente limitados, mas são preferivelmente vetores geralmente usados para a expressão de um gene de proteína ou semelhantes e, particularmente, um vetor ou um vetor de expressão elevada que é adequado para expressão de um gene de anticorpo. Exemplos preferíveis incluem vetores que contêm um promotor EF e/ou um intensificador de CMV. Em geral, cada um dos vetores de expressão que incorpora um ácido nucléico que codifica VH ou VL é preparado e usado para cotransfecção de uma célula hospedeira, mas os ácidos nucléicos também podem ser incorporados em um único vetor de expressão.
A célula hospedeira para introdução do vetor de expressão não é necessariamente limitada, mas é preferivelmente uma célula que é geralmente usada para a expressão de um gene de proteína ou semelhantes e, particularmente, uma célula que é adequada à expressão de um gene de anticorpo. Exemplos incluem uma bactéria (E. coli etc.), actinomicetos, uma levedura, uma célula de inseto (SF9 etc.), e uma célula de mamífero (COS-1, CHO, célula de mieloma ou semelhantes).
A fim de produzir industrialmente um anticorpo recombinante, geralmente é utilizada uma cepa de célula animal recombinante, por exemplo, uma cepa de célula CHO que é altamente e estavelmente produtora do anticorpo. Métodos conhecidos de amplificação e seleção de genes podem ser empregados para preparação, clonagem e expressão elevada de uma cepa de célula recombinante desse tipo (por exemplo, veja Omasa T.: J. Biosci. Bioeng., 94, 600-605, 2002 etc.).
Além de um anticorpo que consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, a presente invenção também compreende um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção. Exemplos de fragmentos de ligação de antígeno incluem Fab (fragmento de ligação de antígeno), Fab’ e F(ab’)2. Exemplos destes obtidos por ligação dos fragmentos ativos do anticorpo por meio de um vinculador ou semelhantes incluem um anticorpo de cadeia simples (Fv de cadeia simples: scFv) e um anticorpo estabilizado por dissulfeto (Fv estabilizado por dissulfeto: dsFv). Um exemplo de um peptídeo que contém um fragmento ativo do anticorpo inclui um peptídeo que contém CDR. Este pode ser produzido de acordo com um método conhecido como, por exemplo, um método no qual o anticorpo da presente invenção é tratado com uma enzima proteolítica apropriada ou uma técnica de recombinação de genes.
A purificação do anticorpo pode ser realizada pela utilização de uma técnica de purificação conhecida como, por exemplo, método de retirada de sal, filtração em gel, cromatografia por troca iônica ou cromatografia por afinidade.
Além disso, genes de VH e VL podem ser embaralhados artificialmente para expressar um anticorpo scFv diversificado (fragmento de cadeia simples da região variável) como uma proteína de fusão de fago por uma técnica de apresentação em fago de anticorpo recentemente desenvolvida na qual um anticorpo recombinante é expresso na superfície de um fago por uma técnica de engenharia genética, obtendo, dessa forma, um anticorpo específico. Essa técnica é altamente considerada por ser capaz de escapar do sistema imune e ainda como uma técnica para a preparação de um anticorpo humanizado como uma alternativa ao método de fusão de células. Um anticorpo específico ou um fragmento de ligação de antígeno deste preparado com o uso dessa técnica com relação à sequência de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 e 22 aqui apresentados pertence ao escopo técnico da presente invenção.
Além disso, um anticorpo obtido por aplicação da técnica Potelligent desenvolvida recentemente na qual a atividade de ADCC de um anticorpo é acentuadamente aumentada por modificação da porção de cadeia de açúcar do anticorpo pode ser aplicado a um anticorpo da presente invenção (veja Niwa R., e cols., Clin. Cancer Res., 10, 6.248-6.255 (2004)), e um anticorpo obtido por aplicação da técnica Complegnent que aumenta a atividade de CDC a um anticorpo da presente invenção (veja Kanda S., e cols., Glycobiology, 17, 104-118 (2007)) também é englobado pelo escopo técnico da presente invenção.
Um anticorpo geralmente é preparado por obtenção de um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal por utilização de um animal experimental como, por exemplo, um camundongo, um coelho, uma cabra ou semelhantes. Como um anticorpo desse tipo possui uma sequência que é característica da espécie de animal usada, ele seria reconhecido como uma substância estranha pelo sistema imune humano se administrado diretamente, o que pode resultar em uma resposta de anticorpo humano anti-animal (em outras palavras, é produzido um anticorpo contra um anticorpo).
Um anticorpo monoclonal anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção pode ser obtido por uma célula produtora de anticorpo derivada do sangue de um humano saudável, que é um anticorpo humano completo. Quando esse anticorpo humano completo é administrado a um ser humano como um fármaco de anticorpo, ele não possui imunogenicidade e, dessa forma, não deve apresentar nenhuma resposta imune.
Como um anticorpo monoclonal anti-HCMV da presente invenção possui uma capacidade neutralizante mais elevada do que aquela de um anticorpo monoclonal anti-HCMV convencional, pode ser esperado um nível similar do efeito terapêutico com menos dosagem.
A seguir, será descrito um procedimento para obtenção de um anticorpo monoclonal anti-HCMV e um fragmento de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção, mas um procedimento para obtenção de um anticorpo ou semelhantes da presente invenção não deve ser limitado por essas descrições, e qualquer modificação geralmente realizada na técnica pode ser efetuada.
Um anticorpo monoclonal anti-HCMV e um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção pode ser obtido por: separação de um clone de célula que produz o anticorpo do sangue de um humano saudável por meio de várias etapas; coleta do anticorpo do sobrenadante da cultura do clone de célula produtora de anticorpo; e realização de purificação por afinidade no anticorpo obtido.
1) Separação do clone de célula que produz anticorpo humano completo contra HCMV
Linfócitos B são separados do sangue do humano saudável para indução de proliferação dos linfócitos B. Um método para indução de proliferação é conhecido per se, e pode ser realizado, por exemplo, por um método de transformação usando o vírus de Epstein-Barr (vírus EB) (daqui em diante, denominado EBV) como um fator indutor de câncer (D. Kozbor e cols.).
Especificamente, os linfócitos B mencionados acima são infectados com EBV para indução de proliferação, e as células proliferadas são usadas como uma biblioteca de células produtoras de anticorpo.
2) Coleta do anticorpo monoclonal da biblioteca de células produtoras de anticorpo
Um anticorpo monoclonal pode ser coletado de células com proliferação induzida de acordo com um método bem conhecido comumente usado para a preparação de um anticorpo monoclonal.
A partir da biblioteca de células produtoras de anticorpo descrita acima, um clone de linfócito que produz um anticorpo que se liga ao HCMV é separado, e o anticorpo é removido do sobrenadante da cultura. Especificamente, uma população de células (clones) que produz um anticorpo de ligação de HCMV é selecionada da biblioteca de células produtoras de anticorpo descrita acima pelo método de diluição limitante.
A fim de detectar um clone que se liga ao HCMV, ELISA com o uso de um antígeno derivado de HCMV e um anticorpo de camundongo marcado anti-IgG humana é preferivelmente empregado.
Por repetição do cultivo e seleção da população de células anticorpo-positivas selecionada, pode ser obtida uma população de células (clones) que produz apenas o anticorpo de interesse.
Um fluxograma que indica as etapas até a separação de um clone de uma célula produtora de anticorpo é mostrado na Figura 1.
3) Purificação por afinidade usando Proteína A ou G
A fim de purificar o anticorpo anti-HCMV, as célula selecionadas podem ser proliferadas em uma garrafa agitada, um frasco Spinner de 2 litros, ou outro sistema de cultura.
O sobrenadante da cultura resultante é filtrado para ser concentrado e depois submetido à cromatografia por afinidade com proteína A ou proteína G-sefarose (GE Healthcare) ou semelhantes, purificando, dessa forma, a proteína. O tampão pode ser substituído com PBS para determinar a concentração por OD280 ou preferivelmente por análise em nefelômetro.
O isótipo pode ser examinado por um método específico para o antígeno do isótipo.
Como o anticorpo anti-HCMV assim obtido é um anticorpo humano completo preparado por um linfócito B sensibilizado em um corpo humano, a probabilidade de causar resposta imune contra o anticorpo é baixa.
Essa preparação de um clone de célula produtora de anticorpo também é caracterizada pelo uso do vírus de EB que é ativo na infecção e indução de proliferação do linfócito B.
As vantagens do método do vírus de EB são que um anticorpo natural feito no corpo humano pode ser preparado e que um anticorpo com afinidade elevada pode ser obtido. Por exemplo, foi verificado que um anticorpo humano contra HCMV possui uma afinidade que é aproximadamente 10-100 vezes maior do que aquela de um anticorpo feito por imunização artificial de um camundongo.
Uma população de linfócitos B proliferada por infecção com o vírus de EB pode ser uma biblioteca de células produtoras de anticorpo.
Um clone específico de células produtoras de anticorpo pode ser separado dessa biblioteca para obter um anticorpo humano.
4. Composição farmacêutica que contém o anticorpo da invenção
A seguir, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de uma doença associada ao citomegalovírus humano (HCMV), que compreende o anticorpo descrito acima, ou um sítio de ligação de antígeno deste, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Como um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção possui capacidade neutralizante mais elevada contra HCMV do que aquela de um anticorpo anti-HCMV convencional, ele é útil como um fármaco profilático ou terapêutico para uma doença relacionada ao HCMV (várias doenças causadas por HCMV). Uma doença causada por HCMV é uma doença cujos sintomas e/ou progressão supostamente serão aliviados por inibição da atividade de HCMV.
O termo “doença relacionada ao HCMV”, como aqui usado, compreende, além de outras doenças, uma doença que supostamente ou que parece ser causada porque um indivíduo- alvo que sofre daquela doença tem o HCMV como a causa das condições patológicas daquela doença ou como uma causa da piora daquela doença. Em outras palavras, como um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção possui uma capacidade neutralizante elevada contra HCMV, pode-se esperar que ele seja um fármaco profilático ou terapêutico para várias doenças causadas por HCMV, por exemplo: (a) doenças como, por exemplo, pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite, encefalite, e semelhantes, em função da reativação do HCMV em estados de imunodeficiência como, por exemplo, AIDS, câncer, após transplante de órgão, após transplante de medula óssea, após hemodiálise; (b) infecção congênita por CMV em virtude da transmissão da infecção por HCMV de uma mulher grávida para um feto; (c) abortamento, natimortos e morte logo após o nascimento causada pela infecção congênita por CMV descrita acima; (d) baixo peso ao nascimento, hepatoesplenomegalia, icterícia, púrpura trombocitopênica, microcefalia, distúrbio de desenvolvimento mental, retardo do desenvolvimento intelectual, coriorretinite e déficit auditivo no caso de sobrevida por meio da infecção congênita por CMV descrita acima; e (e) anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial e mononucleose em decorrência de infecção por HCMV durante o período de recém-nascido ou infância (Documentos Não-Patente 3, 4 e 5).
Um “veículo aceitável como um produto farmacêutico” aqui usado compreende qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente isotônico, retardante da absorção fisiologicamente adaptável, e semelhantes.
Exemplos de veículos aceitáveis como produtos farmacêuticos incluem um ou mais, ou uma combinação de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes. Para uso como um agente injetável ou semelhantes, um regulador do pH ou um agente isotônico, por exemplo, açúcar ou poliálcool como, por exemplo, manitol e sorbitol ou cloreto de sódio, está preferivelmente contido na composição. Um veículo aceitável como um produto farmacêutico pode ainda conter uma pequena quantidade de substâncias auxiliares para aumentar a propriedade conservadora ou a efetividade do anticorpo ou da porção de anticorpo como, por exemplo, um agente umidificante, um emulsificante, um agente anti-séptico, um tampão, um estabilizante, ou semelhantes.
Uma composição da presente invenção pode ser feita em várias formas de dosagem. Exemplos dessas composições incluem formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas como, por exemplo, uma solução (por exemplo, uma solução injetável e passível de infusão), uma dispersão, uma suspensão, um comprimido, uma cápsula, um tablete, uma pílula, um pó, um lipossomo, um supositório, e semelhantes. A forma preferível difere, dependendo do modo de administração desejado e do tratamento aplicado. Uma composição geralmente preferível está em uma forma de solução injetável ou passível de infusão como, por exemplo, uma composição similar àquelas usadas para imunizar passivamente um ser humano com outro anticorpo. Um modo de administração preferível é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular). De acordo com uma modalidade preferível, o anticorpo é administrado por infusão intravenosa ou injeção intravenosa. De acordo com outra modalidade preferível, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou injeção subcutânea.
Um anticorpo e um fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada à administração parenteral. Quando um único tipo de anticorpo ou porção de anticorpo é usado, ele é preferivelmente preparado como uma formulação injetável que contém o anticorpo a 0,1-250 mg/ml. Por outro lado, quando vários tipos de anticorpos são usados como uma mistura, esses são preferivelmente preparados como uma formulação injetável que contém o anticorpo a 0,001-100 mg/ml.
A proporção de mistura dos vários tipos de anticorpos pode ser determinada de acordo.
Uma formulação injetável pode ser um produto obtido por dissolução do componente eficaz em um líquido ou um produto liofilizado do componente eficaz, que é colocado em um frasco de sílex ou ocre, uma ampola ou uma seringa pré- preenchida. O tampão pode ser L-histidina (1-50 mM) em pH 5,0-7,0 (otimamente pH 6,0), e otimamente 5-10 mM de L- histidina. Exemplos de outros tampões adequados incluem, sem limitação, succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. A fim de alterar a pressão osmótica de uma solução em uma concentração de 0300 mM (otimamente 150 mM no caso de uma forma de dosagem líquida), cloreto de sódio pode ser usado. A forma de dosagem liofilizada pode conter um crioprotetor, principalmente 0-10% (otimamente 0,5-5,0%) de sacarose. Outros crioprotetores apropriados incluem manitol, trehalose e lactose. A forma de dosagem liofilizada pode conter um enchimento, principalmente 1-10% (otimamente 24%) de manitol. Tanto para formas de dosagem líquidas quanto para as liofilizadas, um estabilizante, principalmente 1-50 mM (otimamente 5-10 mM) de L-metionina, pode ser usado. Outros estabilizantes apropriados incluem glicina, arginina e polissorbato 80, e semelhantes. No caso de polissorbato 80, ele pode estar contido a 0-0,05% (otimamente 0,005-0,01%). Outros tensoativos incluem, sem limitação, polissorbato 20 e tensoativo BRIJ.
Essa composição farmacêutica deve geralmente ser estéril e estável sob as condições de produção e armazenamento. Essa composição pode ser formulada em outra estrutura ordenada que é apropriada para uma solução, uma microemulsão, uma dispersão, um lipossomo ou uma concentração elevada de fármaco. Uma solução injetável estéril pode ser preparada por mistura de uma quantidade necessária de composto ativo (ou seja, o anticorpo ou a porção de anticorpo) com um solvente apropriado e, se necessário, com qualquer um ou em combinação com os componentes descritos acima, e depois a submissão do resultante à esterilização por filtração. Em geral, uma dispersão é preparada por mistura do composto ativo com um meio de dispersão básico e um veículo estéril que contém outros componentes necessários selecionados entre os componentes listados acima. Um método preferível para preparação de uma formulação em pó estéril usada para uma preparação de uma solução injetável estéril compreende a submissão da solução filtrada estéril descrita acima à secagem por vácuo-congelamento e atomização, obtendo, dessa forma, uma composição que contém qualquer outro componente desejado, bem como o pó do componente ativo. Uma fluidez apropriada da solução pode ser mantida pela utilização, por exemplo, de um agente de revestimento como, por exemplo, lecitina, por manutenção do tamanho de partícula necessário, no caso da dispersão, ou pela utilização de um tensoativo. A absorção de longa duração da composição injetável pode ser efetuada por adição de um agente que pode retardar a absorção, por exemplo, monoestearato ou gelatina à composição.
A composição farmacêutica da invenção também pode conter um composto ativo suplementar. De acordo com uma modalidade, um anticorpo ou uma porção de anticorpo da presente invenção é formulado junto com um ou mais outros fármacos terapêuticos que são úteis para tratamento de uma doença causada por HCMV, ou administrado com esse outro fármaco terapêutico. Por exemplo, um anticorpo anti-HCMV ou uma porção de anticorpo da presente invenção pode ser formulado junto com um ou mais outros anticorpos que se ligam ao outro alvo (por exemplo, um anticorpo que se liga ao outro sítio de ligação de HCMV), ou simultaneamente administrado com esse outro anticorpo. Além disso, um ou mais anticorpos da presente invenção podem ser usados por combinação de dois ou mais tipos dos fármacos terapêuticos descritos acima. Essa terapia combinada pode vantajosamente utilizar doses menores dos fármacos terapêuticos administrados e, dessa forma, a possível toxicidade ou complicações associadas às várias terapias únicas podem ser evitadas.
Aqui, os relacionamentos entre os nucleotídeos ou as sequências de aminoácidos com os números de sequências mencionados na presente especificação são os seguintes.
O ID. DE SEQ. N°: 1 representa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia H de um anticorpo contra a região AD1 da glicoproteína gB do HCMV (daqui em diante, “anticorpo anti-AD1”) (EV2038) com uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 2 representa uma sequência de aminoácidos de uma cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) com uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 3 representa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia L de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) com uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 4 representa uma sequência de aminoácidos de uma cadeia L de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) com uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 5 representa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) sem uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 6 representa uma sequência de aminoácidos de uma cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) sem uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 7 representa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia L de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) sem uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 8 representa uma sequência de aminoácidos de uma cadeia L de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) sem uma sequência sinalizadora.
O ID. DE SEQ. N°: 9 representa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia H de anticorpo anti-AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 10 representa uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 11 representa uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia L de um anticorpo anti-AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 12 representa uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia L de um anticorpo anti-AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 13 representa uma sequência de aminoácidos de uma CDR1 da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 14 representa uma sequência de aminoácidos de uma CDR2 da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 15 representa uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 16 representa uma sequência de aminoácidos de uma CDR1 da cadeia L de um anticorpo anti- AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 17 representa uma sequência de aminoácidos de uma CDR2 da cadeia L de um anticorpo anti- AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 18 representa uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 da cadeia L de um anticorpo anti- AD1 (EV2038).
O ID. DE SEQ. N°: 19 representa uma sequência de nucleotídeos do iniciador 38 Hind-S usado para produção de uma variante de CDR-H3 de EV2038 em um exemplo de trabalho.
O ID. DE SEQ. N°: 20 representa uma sequência de nucleotídeos do iniciador 38 Not-A usado para produção de uma variante de CDR-H3 de EV2038 em um exemplo de trabalho.
O ID. DE SEQ. N°: 21 representa uma sequência de nucleotídeos de um iniciador para verificação de uma sequência de nucleotídeos usada para produção de variante de CDR-H3 de EV2038 em um exemplo de trabalho.
O ID. DE SEQ. N°: 22 representa uma sequência de aminoácidos de consenso na sequência de aminoácidos de CDR- H3 de um anticorpo anti-AD1.
O ID. DE SEQ. N°: 23 representa uma sequência de aminoácidos que possui resíduos de aminoácidos nas posições 549-580 da região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, que foi identificada como uma região em que existe um epitopo por uma técnica de mutação por deleção descrita no exemplo.
O ID. DE SEQ. N°: 24 representa uma sequência de aminoácidos que possui resíduos de aminoácidos nas posições 596-640 da região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, que foi identificada como uma região em que existe um epitopo por uma técnica de mutação por deleção descrita no exemplo.
O ID. DE SEQ. N°: 25 representa uma sequência de aminoácidos que possui resíduos de aminoácidos nas posições 549-560 da região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, que foi identificada como uma região de epitopo por uma técnica de arranjo de peptídeos descrita no exemplo.
O ID. DE SEQ. N°: 26 representa uma sequência de aminoácidos que possui resíduos de aminoácidos nas posições 569-576 da região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, que foi identificada como uma região de epitopo por uma técnica de arranjo de peptídeos descrita no exemplo.
O ID. DE SEQ. N°: 27 representa uma sequência de aminoácidos que possui resíduos de aminoácidos nas posições 625-632 da região AD1 da glicoproteína gB do HCMV, que foi identificada como uma região de epitopo por uma técnica de arranjo de peptídeos descrita no exemplo.
O ID. DE SEQ. N°: 28 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que valina (V) foi substituída com lisina (K) na posição 117 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 29 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que treonina (T) foi substituída com triptofano (W) na posição 118 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 30 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que arginina (R) foi substituída com valina (V) na posição 119 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 31 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com isoleucina (I) na posição 120 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 32 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com ácido glutâmico (E) na posição 121 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 33 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido glutâmico (E) foi substituído com leucina (L) na posição 122 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 34 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que triptofano (W) foi substituído com treonina (T) na posição 123 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 35 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com ácido aspártico (D) na posição 124 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 36 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com arginina (R) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 37 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que glicina (G) foi substituída com fenilalanina (F) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 38 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com isoleucina (I) na posição 127 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 39 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que tirosina (Y) foi substituída com asparagina (N) na posição 128 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 40 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que tirosina (Y) foi substituída com asparagina (N) na posição 129 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 41 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que metionina (M) foi substituída com glutamina (Q) na posição 130 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 42 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com isoleucina (I) na posição 131 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 43 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que valina (V) foi substituída com lisina (K) na posição 132 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 44 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com isoleucina (I) na posição 121 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 45 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com valina (V) na posição 121 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 46 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com alanina (A) na posição 121 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 47 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com fenilalanina (F) na posição 121 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 48 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com prolina (P) na posição 121 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 49 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que triptofano (W) foi substituído com tirosina (Y) na posição 123 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 50 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que triptofano (W) foi substituído com fenilalanina (F) na posição 123 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 51 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que triptofano (W) foi substituído com prolina (P) na posição 123 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 52 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que triptofano (W) foi substituído com leucina (L) na posição 123 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 53 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que triptofano (W) foi substituído com isoleucina (I) na posição 123 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 54 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com leucina (L) na posição 124 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 55 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com metionina (M) na posição 124 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção. O ID. DE SEQ. N°: 56 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com prolina (P) na posição 124 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 57 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com valina (V) na posição 124 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 58 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com alanina (A) na posição 124 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 59 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que glicina (G) foi substituída com prolina (P) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 60 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que glicina (G) foi substituída com alanina (A) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 61 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que glicina (G) foi substituída com serina (S) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 62 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que glicina (G) foi substituída com asparagina (N) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 63 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que glicina (G) foi substituída com treonina (T) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 64 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com glicina (G) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção. ID. DE SEQ. N°: 65 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com isoleucina (I) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 66 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com alanina (A) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 67 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com leucina (L) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 68 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com valina (V) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 69 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com serina (S) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 70 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com treonina (T) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 71 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com asparagina (N) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 72 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com glutamina (Q) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 73 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com ácido aspártico (D) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 74 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com ácido glutâmico (E) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 75 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com lisina (K) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção. ID. DE SEQ. N°: 76 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com histidina (H) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 77 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com cisteína (C) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 78 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com metionina (M) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 79 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com tirosina (Y) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 80 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com triptofano (W) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 81 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que prolina (P) foi substituída com fenilalanina (F) na posição 125 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 82 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que valina (V) foi substituída com leucina (L) na posição 117 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 83 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que valina (V) foi substituída com isoleucina (I) na posição 117 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 84 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que treonina (T) foi substituída com serina (S) na posição 118 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 85 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que treonina (T) foi substituída com lisina (K) na posição 118 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 86 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que arginina (R) foi substituída com lisina (K) na posição 119 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 87 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que arginina (R) foi substituída com treonina (T) na posição 119 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 88 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com ácido glutâmico (E) na posição 120 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 89 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com alanina (A) na posição 120 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 90 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido glutâmico (E) foi substituído com ácido aspártico (D) na posição 122 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 91 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido glutâmico (E) foi substituído com alanina (A) na posição 122 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 92 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com ácido glutâmico (E) na posição 127 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 93 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com alanina (A) na posição 127 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 94 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que tirosina (Y) foi substituída com fenilalanina (F) na posição 128 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 95 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que tirosina (Y) foi substituída com triptofano (W) na posição 128 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 96 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que tirosina (Y) foi substituída com fenilalanina (F) na posição 129 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 97 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que tirosina (Y) foi substituída com triptofano (W) na posição 129 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 98 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que metionina (M) foi substituída com fenilalanina (F) na posição 130 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 99 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que metionina (M) foi substituída com isoleucina (I) na posição 130 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 100 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com ácido glutâmico (E) na posição 131 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti- AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 101 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido aspártico (D) foi substituído com alanina (A) na posição 131 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 102 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que valina (V) foi substituída com tirosina (Y) na posição 132 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 103 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que valina (V) foi substituída com serina (S) na posição 132 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 104 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com valina (V) na posição 124 e glicina (G) foi substituída com alanina (A) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 105 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que isoleucina (I) foi substituída com valina (V) na posição 124 e glicina (G) foi substituída com serina (S) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 106 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com isoleucina (I) na posição 121, triptofano (W) foi substituído com tirosina (Y) na posição 123, isoleucina (I) foi substituída com valina (V) na posição 124, e glicina (G) foi substituída com alanina (A) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 107 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que leucina (L) foi substituída com isoleucina (I) na posição 121, triptofano (W) foi substituído com tirosina (Y) na posição 123, isoleucina (I) foi substituída com valina (V) na posição 124, e glicina (G) foi substituída com serina (S) na posição 126 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 108 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido glutâmico (E) na posição de 122 foi deletado da sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 109 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que ácido glutâmico (E) foi inserido entre glicina (G) na posição 126 e ácido aspártico (D) na posição 127 na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 110 representa uma sequência de aminoácidos de um mutante em que asparagina (N) na posição 79 foi substituída com glutamina (Q) na sequência de aminoácidos da cadeia H de um anticorpo anti-AD1 (EV2038) da presente invenção.
O ID. DE SEQ. N°: 111 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 1 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 112 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 2 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 113 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 3 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 114 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 4 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 115 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 5 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 116 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 6 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 117 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 7 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 118 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 8 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 119 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 9 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 120 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 10 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 121 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 11 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 122 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 12 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 123 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 13 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 124 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 14 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 125 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 15 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 126 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 16 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 127 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 17 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 128 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 18 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 129 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 19 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 130 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 20 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 131 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 21 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 132 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 22 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 133 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 23 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 134 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 24 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 135 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 25 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 136 representa uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sintético (Peptídeo 26 na Tabela 5) preparado e usado no Exemplo 8.
O ID. DE SEQ. N°: 137 representa uma sequência de aminoácidos da glicoproteína gB do citomegalovírus humano (HCMV) (Swiss-Prot: P06473).
Aqui, os relacionamentos entre as sequências de nucleotídeos ou as sequências de aminoácidos que aparecem nos Exemplos 1-6 do presente pedido e os números de sequências são como mostrado na Tabela 1 abaixo. Tabela 1
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A seguir, a presente invenção será descrita mais especificamente por meio de exemplos, embora a presente invenção não deva, de modo algum, ser limitada a esses exemplos.
A menos que estabelecido de forma diferente, os procedimentos usados nos exemplos podem ser consultados em “Molecular Cloning: A Laboratory Manual ” (Terceira Edição) (Sambrook e cols., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001).
EXEMPLOS Exemplo 1. Separação de clone de célula que produz anticorpo humano completo contra HCMV
Um fluxograma de etapas para a separação de um clone de célula produtora de anticorpo é mostrado na Figura 1.
Os linfócitos B foram separados do sangue periférico humano cujo nível de anticorpo anti-HCMV no soro é elevado, e foram infectados com EBV. As células infectadas foram semeadas em uma placa de 96 poços. Após aproximadamente 3 semanas de cultivo, foi realizada seleção de um anticorpo anti-HCMV no sobrenadante da cultura (seleção primária). A seleção foi realizada pelo método ELISA usando uma placa de 96 poços revestida com HCMV-AD1 fundida à GST ou HCMV-AD2 fundida à GST, direcionando anticorpos para os epitopos neutralizantes principais AD1 e AD2 de HCMV (J. Virol., 65, 138-146 (1991), J. Gen. Virol., 73, 2.375-2.383 (1992), J. Virol., 66, 5.290-5.297 (1992), J. Virol., 67, 703-710 (1993)). As células em cada poço que foram confirmadas quanto à produção de anticorpo anti-HCMV foram diluídas, e semeadas em uma nova placa de 96 poços. Após aproximadamente 3 semanas de cultivo, foi realizada a seleção secundária para a produção de anticorpo anti-HCMV. As células nos poços anticorpo-positivos resultantes foram semeadas em uma nova placa de 96 poços a 1-30 células/poço. Em consequência dessa manipulação de clonagem por cultivo de diluição limitante, foi obtido um clone de células que produzem um anticorpo de interesse.
Exemplo 2: Identificação do isótipo e da subclasse de anticorpo
O sobrenadante da cultura do clone de células produtoras de anticorpo separado foi usado para identificar o isótipo do anticorpo produzido pelo método ELISA (referência da literatura: veja Curr. Protoc. Immunol. 2001 May; Capítulo 2: Unidade 2.2). Para ELISA, foi usada uma placa de 96 poços revestida com HCMV-AD1 ou AD2 fundida à GST e um anticorpo específico para cada um dos isótipos e subclasses como o anticorpo secundário. Os resultados do isótipo e da subclasse do anticorpo anti-HCMV resultante são mostrados na Tabela 2. Tabela 2
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Exemplo 3. Clonagem do DNA que codifica o anticorpo anti- HCMV
cDNA foi obtido do RNA total da célula produtora de anticorpo por transcrição reversa usando iniciadores Oligo- dT, e foi usado como um modelo em um método de PCR para amplificar o gene do anticorpo. Os iniciadores usados para PCR foram projetados com base em base de dados de cDNAs que codificam cadeias H e L do anticorpo IgG humano. A fim de amplificar cDNA da cadeia H e cDNA da cadeia L de comprimento total, iniciadores terminais 5’ e 3’ tinham um sítio de iniciação da tradução e um sítio de terminação da tradução, respectivamente.
Exemplo 4. Determinação da sequência de aminoácidos de anticorpo com base em sequência de nucleotídeos
cDNAs das cadeias H e L do anticorpo amplificados pelo método de PCR foram inseridos em um vetor de plasmídeo para identificar cada uma das sequências de nucleotídeos com o seqüenciador ABI. A partir das sequências de nucleotídeos resultantes, a sequência sinalizadora e as sequências de aminoácidos das cadeias H e L do anticorpo foram determinadas.
Além disso, a região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo foi analisada de acordo com o método de Kabat (www.bioinf.org.uk:Dr.Andrew C.R. Martin’s Group, Antibodies: General Information). As sequências de CDR do anticorpo anti-HCMV resultante (EV2038) são dos IDS. DE SEQ. Nos: 13-18. Especificamente, sequências de aminoácidos da CDR1 da cadeia H, CDR2 da cadeia H, CDR3 da cadeia H, CDR1 da cadeia L, CDR2 da cadeia L e CDR3 da cadeia L de EV2038 são dos IDS. DE SEQ. Nos: 13, 14, 15, 16, 17 e 18, respectivamente.
A fim de examinar a similaridade com anticorpos monoclonais previamente relatados como anticorpos de AD1, as sequências de CDR de EV2038 foram comparadas com anticorpos cujas sequências de aminoácidos das regiões variáveis foram registradas com GenBank ou semelhantes. Cada tipo de sequência de CDR de anticorpos de AD1 derivados de humanos ou camundongos conhecidos foi identificado pelo método de Kabat, e comparado com a sequência da CDR de EV2038 similarmente identificada. Na Tabela 3, a homologia (%) de CDR individual foi determinada com base no número de resíduos de aminoácidos do alvo para comparação (denominador) e no número de resíduos de aminoácidos cujas posições e tipos correspondem àqueles de EV2038 na porção CRD (numerador). O total (%) foi determinado pela soma dos números de resíduos de aminoácidos como denominador e dos números de resíduos de aminoácidos como numerador obtidos pela comparação de CDR individual, ou seja, obtenção da homologia total (%) do número total resultante de resíduos de aminoácidos do denominador e do numerador. Como pode ser observado na Tabela 3, EV2038 não possui homologia elevada com anticorpos de AD1 conhecidos, mostrando que há uma grande diferença nas sequências de CDR dos anticorpos de AD1 relatados previamente. Tabela 3
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* Referência: WO 2007/094423.
Exemplo 5. Determinação de se o gene de anticorpo resultante codifica ou não o anticorpo anti-HCMV
Cada um dos cDNAs da cadeia H e da cadeia L resultantes foi inserido em vetores de expressão e depois simultaneamente introduzido em uma célula 293T. A transferência gênica foi realizada com Lipofectamina (Invitrogen) e reagente PLUS (Invitrogen) sob as condições recomendadas pelo fabricante (Catálogo Invitrogen: N° de Catálogo 18324-111, N° de Catálogo 18324-012 ou N° de Catálogo 18324-020). Dois dias mais tarde, o sobrenadante da cultura foi coletado e submetido ao método ELISA usando uma placa de 96 poços revestida com anticorpo anti-IgG humana e HCMV-AD1 fundida à GST para avaliar se o anticorpo no sobrenadante da cultura é um anticorpo IgG humano e se ele se liga à HCMV-AD1.
Exemplo 6. Produção de proteína de anticorpo
O plasmídeo que expressa o anticorpo anti-HCMV resultante foi introduzido em uma célula CHO. A transferência gênica foi realizada por emprego do mesmo método descrito acima para células 293T. O cultivo foi realizado na presença de um marcador de seleção para obter um clone de célula CHO que produzia constantemente o anticorpo.
A mesma célula CHO que produzia estavelmente o anticorpo foi cultivada em um meio isento de soro, e o sobrenadante da cultura foi coletado. Esse sobrenadante da cultura foi adicionado a uma coluna de Proteína A e submetido à purificação por afinidade para obter um anticorpo purificado. A coluna usada era uma coluna pré- compactada de rProteína A FF HiTrap (GE Healthcare), enquanto as condições de purificação foram aquelas recomendadas pelo fabricante da coluna. Após a purificação, a propriedade de ligação à HCMV-AD1 ou à HCMV-AD2 do anticorpo foi verificada por ELISA. Além disso, a cadeia H do anticorpo de aproximadamente 50 kDa e a cadeia L do anticorpo de aproximadamente 25 kDa foram verificadas por SDS-PAGE.
Exemplo 7. Preparação de variantes e suas atividades de ligação
A fim de estudar as sequências de aminoácidos que influenciam a propriedade do anticorpo da presente invenção ou o fragmento de ligação deste, a região CDR-H3 (aminoácidos 117-132) foi particularmente estudada. Aqui, os números dos resíduos de aminoácidos de CDR-H3 são numerados seqüencialmente partindo do terminal N (metionina) da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, incluindo a sequência sinalizadora do ID. DE SEQ. N°: 2.
Enquanto isso, aminoácidos que constituem proteínas na natureza podem ser agrupados de acordo com as propriedades de suas cadeias laterais. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem a mesma propriedade incluem aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptofano), aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico, ácido glutâmico), aminoácidos neutros (serina, treonina, asparagina, glutamina), aminoácidos que possuem uma cadeia hidrocarboneto (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina) e outros (glicina, metionina, cisteína).
Nesta seção, o termo “substituição conservadora de aminoácidos” refere-se à substituição entre aminoácidos com propriedades similares, ou seja, substituição de aminoácidos principalmente entre os aminoácidos que pertencem ao mesmo grupo mencionado acima. Acredita-se que essa substituição não tenha influência ou alteração significativa na propriedade da proteína original. Por outro lado, o termo “substituição não conservadora de aminoácidos” difere da substituição acima pelo fato de que ele se refere à substituição com um aminoácido cuja propriedade difere acentuadamente daquela do aminoácido original.
(1) Preparação de variantes de CDR-H3 de EV2038
Para os 16 resíduos de aminoácidos que constituem CDR- H3 de EV2038, cada um deles foi submetido à substituição não conservadora de aminoácidos pelo método de PCR em 2 etapas para preparar variantes (V117K, T118W, R119V, D120I, L121E, E122L, W123T, I124D, P125R, G126F, D127I, Y128N, Y129N, M130Q, D131I e V132K). Primeiro, a primeira metade do fragmento gênico foi obtida com um par de 38Hind-S (CACCAAGCTTTGTGCAAGAACATGAAGCATC: ID. DE SEQ. N°: 19) e um iniciador reverso para o sítio de substituição, e a última metade do fragmento gênico foi obtida com um par de iniciadores diretos para o sítio de substituição e 38Not-A (ATAAGAATGCGGCCGCGCCGTCGCACTCATTTACC: ID. DE SEQ. N°: 20).
A segunda PCR foi realizada usando estes como modelos para obter um gene de anticorpo variante de comprimento total. Subseqüentemente, o gene de anticorpo foi processado com a enzima de restrição NotI para produzir extremidades pegajosas e depois inserido em um plasmídeo produtor de anticorpo. A sequência de nucleotídeos de cada variante foi verificada usando um iniciador para verificação de uma sequência de nucleotídeos (ACCAGACATAATAGCTGACAG: ID. DE SEQ. N°: 21) com o Analisador Genético 3130 (ABI) de acordo com um protocolo sugerido.
(2) Demonstração da expressão de anticorpo de variantes da CDR-H3 de EV2038
O plasmídeo variante resultante (cadeia H) e o plasmídeo da cadeia L original foram cotransferidos em células CHO de acordo com o protocolo sugerido de Lipofectamina LTX (Invitrogen). Quarenta e oito horas mais tarde, o sobrenadante da cultura foi coletado. Foi permitido que os sobrenadantes da cultura diluídos serialmente reagissem com anticorpos anti-IgG humana de fase sólida (0,25 μg/poço) em Immuno Plate (Maxi sorp, Nunc) em temperatura ambiente por uma hora. Como anticorpo secundário, foi permitido que gama anti-imunoglobulina G humana e lambda anti-imunoglobulina G humana (MBL) reagissem em temperatura ambiente por 11 horas. Cinqüenta μl/ml de Azul Sure (MPL) contendo substrato TMB como um agente produtor de cor foram adicionados, deixados em repouso em temperatura ambiente por 30 minutos, e depois adicionados com uma quantidade igual de ácido fosfórico 1,5 M para determinar a absorção em um comprimento de onda de 450 nm usando uma leitora de microplacas (680XR, BIO-RAD). A verificação da presença ou ausência e a quantificação do anticorpo foram realizadas com base na absorbância das cadeias gama e lambda.
(3) Avaliação de capacidade de ligação das variantes da CDR-H3 de EV2038 à AD1 por ELISA
Foi permitido que um anticorpo ajustado até uma concentração de 1 μg/ml com base na cadeia lambda reagisse em séries de diluição com 5 μg/ml de AD1 de fase sólida em Immuno Plate (Poly sorp, Nunc). Subseqüentemente, ELISA foi realizada como descrito acima. As capacidades de ligação das variantes ao antígeno de AD1 foram avaliadas pelas absorbâncias a 450 nm das variantes resultantes e EV2038 (original). Como resultado, a substituição não conservadora de aminoácidos dos resíduos 121-126 da CDR-H3 de EV2038, exceto o resíduo 122, reduziu significativamente a capacidade de ligação à AD1 e, dessa forma, foi sugerido que esses resíduos são importantes como paratopos de AD1 (Figura 2).
(4) Preparação de variantes da CDR-H3 de EV2038 (2)
Entre os cinco resíduos de aminoácidos cujas capacidades de ligação à AD1 diminuíam mediante substituição não conservadora de aminoácidos, os quatro resíduos de aminoácidos, 121, 123, 124 e 126, foram substituídos com aminoácidos com propriedades similares. Cinco tipos de aminoácidos foram usados para cada resíduo. Especificamente, as variantes mostradas na Figura 3 foram preparadas. A Prolina na posição 125 foi substituída com todos os aminoácidos naturais diferentes do aminoácido original (Figura 4). As variantes foram preparadas como descrito acima.
(5) Avaliação das capacidades de ligação das variantes de CDR-H3 de EV2038 à AD1 por ELISA
Foi permitido que um anticorpo ajustado até uma concentração de 1 μg/ml com base na cadeia lambda reagisse em séries de diluição com 5 μg/ml de AD1 de fase sólida em Immuno Plate (Poly sorp, Nunc). Subseqüentemente, ELISA foi realizada como descrito acima para avaliar as capacidades de ligação das variantes à AD1. Como para os aminoácidos nas posições 121, 123, 124 e 126, a maioria das substituições de aminoácidos para aminoácidos conservadores manteve capacidades de ligação à AD1 (Figura 3). No entanto, prolina na posição 125 não tinha capacidade de ligação à AD1 mediante substituição com quaisquer outros aminoácidos naturais (19 tipos) (Figura 4). Dessa forma, em CDR-H3 de EV2038 de acordo com a presente invenção, prolina na posição 125 demonstrou ser um aminoácido essencial para a propriedade de ligação à AD1 do anticorpo.
(6) Preparação de variantes de CDR-H3 de EV2038 (3)
A substituição conservadora de aminoácido também foi realizada para os resíduos de aminoácidos cujas capacidades de ligação à AD1 não se reduziram mediante substituição não conservadora de aminoácidos (total de 11 resíduos nas posições 117-120, 122 e 127-132) de acordo com o mesmo método para realizar avaliação das capacidades de ligação à AD1. Como resultado, verificou-se que as variantes com substituição conservadora de aminoácidos nessa região (V117L, V117I, T118S, T118K, R119K, R119T, D120E, D120A, E122D, E122A, D127E, D127A, Y128F, Y128W, Y129F, Y129W, M130F, M130I, D131E, D131A, V132Y e V132S) retêm as capacidades de ligação à AD1, como a substituição não conservadora de aminoácidos (Figura 5).
(7) Preparação de variantes de CDR-H3 de EV2038 (4)
Um total de quatro tipos de variantes foi preparado por substituição simultânea de dois ou quatro resíduos de aminoácidos entre os resíduos de aminoácidos cujas capacidades de ligação à AD1 diminuíram mediante substituição não conservadora de aminoácidos diferente de prolina na posição 125 (total de quatro resíduos nas posições 121, 123, 124 e 126) (produtos com dois aminoácidos substituídos: I124V/G126A e I124V/G126S, produtos com 4 aminoácidos substituídos: L121I/W123Y/I124V/G126A e L121I/W123Y/I124V/G126S) para avaliar suas capacidades de ligação à AD1. Como resultado, verificou-se que todas essas variantes multissubstituídas retêm capacidades de ligação à AD1 (Figura 6).
(8) Preparação de variantes de CDR-H3 de EV2038 (5)
Uma de cada uma das variantes deletadas e inseridas (E122del e G126_D127insE) foi preparada visando os resíduos de aminoácidos cujas capacidades de ligação à AD1 diminuíram mediante substituição não conservadora de aminoácidos diferente de prolina na posição 125 (total de quatro resíduos nas posições 121, 123, 124 e 126) para avaliar suas capacidades de ligação à AD1. Como resultado, as capacidades de ligação à AD1 foram completamente eliminadas tanto para E122del quanto para G126_D127insE. Dessa forma, foi sugerido que o número de resíduos de aminoácidos nesse sítio (posições 121-126) (6 resíduos) é importante para a ligação à AD1 (Figura 7).
Em resumo, uma sequência de aminoácidos de CDR-H3 de EV2038 pode ser uma sequência de consenso seguinte. XnXnXnXnX1XnX2X3PX4XnXnXnXnXnXn (ID. DE SEQ. N°: 22) em que, Xn = qualquer aminoácido natural X1 = L, I, V, F ou A X2 = W, Y ou F X3 = I, V, L ou M X4 = G, S, A ou T
(9) Preparação de variantes de CDR-H2 de EV2038
A fim de estudar se a substituição conservadora diferente de CDR-H3 possui influência sobre a capacidade de ligação à AD1, uma variante na qual N79 posicionado em CDR- H2 de EV2038 foi alterada para N79Q foi preparada de acordo com o mesmo método para preparação de outras variantes para avaliar a capacidade de ligação à AD1. A partir dos resultados, também foi provado que a capacidade de ligação à AD1 não estava eliminada na variante que possui N79 em CDR-H2 alterada para N79Q (Figura 8).
Os números de sequências das sequências de aminoácidos de cadeias H (incluindo sequência sinalizadora) das variantes preparadas nessa seção estão listados na Tabela 4. Tabela 4
Figure img0006
Figure img0007
Exemplo 8. Mapeamento de epitopos de anticorpo anti-AD1 de HCMV
A fim de determinar o sítio na glicoproteína gB ligado por esses anticorpos de AD1, um vetor de expressão clonado com AD1 de gB de HCMV foi introduzido com mutação por deleção por método de PCR para preparar uma série de mutantes E. coli que expressam proteínas que possuem vários sítios deletados em AD1. Esses mutantes de E. coli foram cultivados e induzidos à expressão. A seguir, foi realizada análise Western blot padronizada usando o lisado de células como um antígeno. EV2038 e dois tipos de variantes com diferentes sítios de substituição que possuem capacidades de ligação à AD1 foram selecionados como controles. Uma das variantes selecionadas era uma forma com aminoácido substituído de forma conservadora I124V que passou por substituição da porção isoleucina na posição 124 (um dos sítios cuja atividade de ligação à AD1 não era reconhecida mediante substituição não conservadora de aminoácidos) acima da estrutura em alça de CDR-H3 (Shirai, H., e cols., FEBS Letters, 1996; 399: páginas 1-8). A outra era uma forma com aminoácido substituído de forma não conservadora V132K que passou por substituição de valina na posição 132 na raiz da estrutura em alça de CDR-H3. EV2038, I124V e V132K se ligam aos números de clone #0, #12, #13, #14, #15 e #19, enquanto foi verificado que EV2038 e suas variantes possuem epitopos entre os resíduos de aminoácidos 549-580 (SCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVI: ID. DE SEQ. N°: 23) e 596-640 (EDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSS: ID. DE SEQ. N°: 24) (Figuras 9 e 10). Aqui, a sequência de aminoácidos de gB da cepa de HCMV AD169 como antígeno é numerada partindo do códon de iniciação, ou seja, metionina, com referência à sequência de Número de Acesso P06473.
Além disso, o epitopo foi determinado mais especificamente para EV2038 com um arranjo de peptídeos. Vinte e seis tipos de peptídeos foram sintetizados por mudança de quatro resíduos de cada vez em um peptídeo de 12 resíduos dentro de uma faixa dos resíduos de aminoácidos 548-641 (Tabela 5). Cada peptídeo possui seu terminal C ligado à superfície da membrana de celulose derivatizada para síntese em fase sólida como um spot individual de 3,7 mm x 3,7 mm (método SPOTs, Sigma Genosys). O peptídeo ligado por EV2038 foi determinado por síntese dot blot padronizada. EV2038 ligados aos números de peptídeos 3, 7, 8, 21 e 22 (Figura 10) e os epitopos foram determinados como sendo os resíduos de aminoácidos 549-560 (SCVTINQTSVKV: ID. DE SEQ. N°: 25), resíduos de aminoácidos 569-576 (SPGRCYSR: ID. DE SEQ. N°: 26) e resíduos de aminoácidos 625-632 (YEYVDYLF: ID. DE SEQ. N°: 27).
Como para os anticorpos que reconhecem a região AD1, ITC52 e semelhantes que reconhecem um epitopo descontínuo de resíduos de aminoácidos 570-579 e 606-619 (WO 93/21952 e J. Virol., 67; páginas 703-710 (1993)) foram relatados. No entanto, além dos resíduos de aminoácidos 569-576 (SPGRCYSR: ID. DE SEQ. N°: 26), pelo menos duas das porções da sequência de epitopo não haviam sido relatadas previamente, mostrando que EV2038 é um anticorpo que reconhece uma sequência descontínua que difere daquelas previamente relatadas para anticorpos de AD1 (Figura 10).
Como para os anticorpos que reconhecem a região AD1, ITC52 e semelhantes que reconhecem um epitopo descontínuo de resíduos de aminoácidos 570-579 e 606-619 (WO 93/21952 e J. Virol., 67; páginas 703-710 (1993)) foram relatados. No entanto, além dos resíduos de aminoácidos 569-576 (SPGRCYSR: ID. DE SEQ. N°: 26), pelo menos duas das porções da sequência de epitopo não haviam sido relatadas previamente, mostrando que EV2038 é um anticorpo que reconhece uma sequência descontínua que difere daquelas 5 previamente relatadas para anticorpos de AD1 (Figura 10). Tabela 5
Figure img0008
Figure img0009
Exemplo 9. Avaliação da atividade neutralizante (1) Imunocoloração
A fim de avaliar a efetividade do anticorpo anti-HCMV (EV2038), atividade neutralizante foi determinada. A atividade neutralizante foi avaliada como uma taxa de bloqueio, pelo anticorpo, de infecção por HCMV (cepa AD169) em uma célula de fibroblasto normal derivada de pulmão de feto humano (MRC-5: Riken BRC N° RCB0211). O procedimento seguiu o método de Abai e cols. (Journal of Immunological Methods 322, 2007, 82-93). Resumidamente, o procedimento foi o seguinte. Complemento (5%) foi adicionado à solução de vírus e ao anticorpo purificado e deixado por uma hora. A seguir, o resultante foi usado para inocular células MRC- 5 (37°C, 1 hora). As células foram lavadas duas vezes, cultivadas por 20 horas, e depois IE1, ou seja, a proteína precoce imediata de HCMV, foi detectada por coloração imunofluorescente. As células infectadas pelo HCMV foram contadas com um software de análise de imagens Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). A Figura 11 mostra os resultados da avaliação da atividade neutralizante do anticorpo anti-HCMV. Um anticorpo monoclonal humano (hIgG) que não possui especificidade para HCMV foi usado como um controle negativo, enquanto um anticorpo monoclonal de camundongo (nome do clone: HCMV16, AbD serotec: 2470-5437) que se liga à glicoproteína H (gH), ou seja, um dos epitopos neutralizantes de HCMV, foi usado como um controle positivo. A taxa de bloqueio da infecção por HCMV de cada anticorpo foi indicada em percentagem com relação à taxa de bloqueio de infecção obtida mediante adição de uma concentração igual de hIgG. A concentração de 50% de inibição (IC50) mediante adição do complemento foi de 0,58 μg/ml para EV2038, demonstrando que ele possui uma atividade neutralizante eficaz em uma concentração menor do que EV2001. Na ausência do complemento, a atividade neutralizante eficaz não foi obtida para EV2001, enquanto a IC50 de EV2038 foi de 0,57 μg/ml, demonstrando que ele possui atividade neutralizante igual ao caso na presença do complemento (Tabela 6). Tabela 6
Figure img0010
n.d.: não determinado
(2) Método de placa
EV2038, que mostrou atividade neutralizante elevada mediante a avaliação descrita acima, foi ainda avaliado quanto à sua atividade de bloqueio de infecção por um método de placa (Masuho, Y. e cols., J. Gen. Virol., 1987; 68: páginas 1.457-1.461). Foram usadas, como cepas do vírus, cepas laboratoriais de HCMV AD169 típicas, cepas Towne, Davis e Merlin, bem como cepas de HCMV isoladas clinicamente T-137 e MDU-1. O método foi realizado resumidamente da forma seguinte. Uma solução de vírus de 50-100 PFU e um anticorpo purificado serialmente diluído em uma concentração predeterminada foram misturados, incubados a 37°C por uma hora, e usados para inocular uma célula de fibroblasto (MRC-5) ou uma célula do epitélio pigmentar da retina (ARPE-19) que foram unilaminadas em microplacas de 48 poços. Após a inoculação, o resultante foi incubado a 37°C por 2 horas e depois o sobrenadante da cultura foi removido. Após lavagem duas vezes, o resultante foi cultivado a 37°C em um meio-padrão contendo FCS 2%. O cultivo continuou com uma cepa laboratorial por 5-6 dias ou com uma cepa isolada clinicamente por 10-12 dias até que a formação de placas fosse nitidamente confirmada por morte das células infectadas com vírus. Subseqüentemente, formalina 5% foi adicionada para imobilizar as células, e a coloração foi realizada com violeta cristal 0,025%. Após a coloração, o número de placas por placa foi contado para calcular a taxa de bloqueio de infecção do anticorpo anti- HCMV.
A Tabela 7 são os resultados da avaliação da atividade neutralizante de EV2038 pelo método de placa. Um anticorpo monoclonal humano (hIgG) que não possui especificidade para HCMV foi usado como um controle negativo, enquanto a formulação de imunoglobulina anti-CMV de titulação elevada CytoGam (CSL Behring, globulina imune intravenosa de citomegalovírus CytoGam, Informações para Prescrição. (revisadas em julho de 2008)) aprovada nos Estados Unidos para ser aplicada para prevenção do desenvolvimento de infecção por HCMV associada ao transplante renal foi usada como um controle positivo. Há relatos de que HCMV possui um mecanismo de entrada diferente entre o modo de infecção para uma célula de fibroblasto e os modos de infecção para células epiteliais e endoteliais (Sinzger, C. e cols., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2008; 325: páginas 63-83). Em muitas das cepas laboratoriais, como tipificadas pelas cepas AD169 e Towne, acredita-se que a infectividade para células epiteliais e endoteliais seja eliminada por várias vezes de passagem com células de fibroblasto (Dai Wang, e cols., J. Virol., 2005; 79: páginas 10.330-10.338). Por outro lado, o HCMV intrinsicamente possui infectividade para vários tecidos e tipos de célula in vivo (Sinzger, C. e cols., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2008; 325: páginas 63-83). Dessa forma, para que um anticorpo anti-HCMV exiba um efeito clínico, pode ser importante que o anticorpo possua uma atividade neutralizante eficaz tanto para células do tipo fibroblasto quanto para células do tipo epitelial/endotelial que são usadas como células hospedeiras infectadas.
Foi demonstrado que os anticorpos anti-HCMV (EV2038) da presente invenção tinha uma IC50 de 0,012-0,037 μg/ml para infecção de uma célula de fibroblasto com a cepa laboratorial. Com a cepa isolada clinicamente (MDU-1), que retém infectividade para células epiteliais/endoteliais, a IC50 foi de 0,044 μg/ml para infecção de uma célula de fibroblasto e de 0,040 μg/ml para infecção de células de fibroblastos e epiteliais, confirmando que possui atividade neutralizante excelente igualmente para células do tipo fibroblasto e células do tipo epitelial/endotelial. Além disso, EV2038 foi altamente ativo contra a cepa AD169 por aproximadamente 2.000 vezes, quando comparado com uma formulação de imunoglobulina anti-CMV de titulação elevada disponível comercialmente CytoGam, e altamente ativo por aproximadamente 20 vezes, quando comparado com os valores relatados de C23 clinicamente desenvolvido e comprovado (Masuho, Y. e cols., J. Gen. Virol., 1987; 68: páginas 1.457-1.461). Tabela 7
Figure img0011
N.D.: não determinada (na tabela, os valores entre parênteses são concentrações em mol (nM) calculadas, desde que o peso molecular do anticorpo seja de 150 kDa)
Exemplo 10. Avaliação da atividade neutralizante do anticorpo variante de EV2038
Dois tipos de variantes com diferentes sítios de substituição foram selecionados entre as variantes de EV2038 para avaliar suas atividades neutralizantes. Uma era uma forma de aminoácido substituído de forma conservadora I124V que passou por substituição da porção isoleucina na posição 124 (acima da estrutura em alça de CDR-H3) cuja atividade de ligação à AD1 não era reconhecida mediante substituição não conservadora de aminoácidos. A outra era uma forma de aminoácido substituído de forma não conservadora V132K que passou por substituição de valina na posição 132 (na raiz da estrutura em alça de CDR-H3) que tinha atividade de ligação à AD1 igual à forma original mediante substituição não conservadora de aminoácidos. O procedimento seguiu o método de Abai e cols. descrito acima (Journal of Immunological Methods 322, 2007, 82-93). Um anticorpo monoclonal humano (hIgG) que não possui especificidade para HCMV foi usado como um controle negativo, enquanto um anticorpo monoclonal de camundongo (nome do clone HCMV16, AbD serotec: 2470-5437) que se liga à glicoproteína H (gH), ou seja, um dos epitopos neutralizantes de CMV, foi usado como um controle positivo.
A taxa de bloqueio da infecção por HCMV de cada anticorpo foi indicada em percentagem com relação à taxa de bloqueio de infecção obtida mediante adição de uma concentração igual de hIgG. A concentração de 50% de inibição (IC50) foi de 0,45 μg/ml para I124V e de 1,20 μg/ml para V132K, e ambos demonstraram ter atividade quase igual àquela de EV2038.
Exemplo 11. Avaliação da capacidade de bloqueio da infecção de célula-para-célula
Além disso, como uma avaliação da efetividade de EV2038, uma célula de fibroblasto normal derivada de pulmão de feto humano infectada por HCMV (MRC-5) foi usada para avaliar a atividade de bloqueio da infecção de célula-para- célula de EV2038. O método de avaliação se baseou no método de Navarro e cols. (Virology. 1993; 197: páginas 143-158).
Especificamente, foi usada MRC-5 que havia sido infectada com HCMV (AD169) por 24 horas, à qual o anticorpo foi adicionado em uma série de diluições de 4 vezes, partindo de 10 mg/ml (aproximadamente 67 nM). A célula foi imobilizada 6 dias após a infecção, e a expressão da proteína de infecção precoce IE1 foi detectada por imunocoloração. As células infectadas pelo HCMV foram contadas com o software de análise de imagens Image J. Como resultado, foi verificado que a adição de anticorpo anti- AD1 EV2038 às células infectadas pode inibir significativamente a infecção de célula-para-célula do vírus (Tabela 8).
Na tabela, (1) +++, (2) ++, (3) +, (4) ± e (5) - representam 100-75% de inibição, 75-50% de inibição, 50-25% de inibição, 25-0% de inibição e nenhum efeito inibidor contra a disseminação da infecção, respectivamente.
O relato por Navarro e cols. (Virology. 1993; 197: páginas 143-158) mostrou um caso exemplar em que os anticorpos com a maior atividade (CH177-3, CH244-4 etc.) exibiram 100-75% de inibição em uma concentração de 10 mg/ml. Com EV2038, no entanto, pode ser observado 100-75% de infecção das células em uma faixa de concentração de 100,63 μg/ml e, além disso, um efeito inibidor de infecção de célula-para-célula de 75-50% a 0,16 μg/ml (1,07 nM). Tabela 8
Figure img0012
A partir das propriedades descritas acima, um anticorpo anti-HCMV ou um fragmento de ligação de antígeno deste de acordo com a presente invenção parece fornecer uma nova dimensão como um fármaco profilático ou terapêutico para várias doenças causadas por HCMV, por exemplo, doenças como, por exemplo, pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite ou encefalite, em um paciente com imunodeficiência, ou anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial ou mononucleose que se desenvolve em consequência da infecção por HCMV durante o período de recém-nascido ou infância.
Até agora, a presente invenção foi especificamente descrita de acordo com modalidades específicas. Essas modalidades, no entanto, são fornecidas unicamente para descrição, e não são restritivas. O escopo da presente invenção pode ser alterado ou modificado em qualquer forma dentro das exigências do escopo das reivindicações, que se enquadram no escopo técnico da presente invenção.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Espera-se que um anticorpo anti-HCMV da presente invenção e uma composição farmacêutica contendo o anticorpo sejam usados como um fármaco profilático ou terapêutico para várias doenças causadas por HCMV, por exemplo: (a) doenças como, por exemplo, pneumonia intersticial, retinite, gastrenterite, encefalite, e semelhantes, causadas por reativação do HCMV em estados de imunodeficiência como, por exemplo, AIDS, câncer, após transplante de órgão, após transplante de medula óssea e após hemodiálise; (b) infecção congênita por CMV em virtude da transmissão da infecção por HCMV de uma mulher grávida para um feto; (c) abortamento, natimortos e morte logo após o nascimento causada pela infecção congênita por CMV descrita acima; (d) baixo peso ao nascimento, hepatoesplenomegalia, icterícia, púrpura trombocitopênica, microcefalia, distúrbio de desenvolvimento mental, retardo 5 do desenvolvimento intelectual, coriorretinite e déficit auditivo no caso de sobrevida por meio da infecção congênita por CMV descrita acima; e (e) anormalidade da função hepática, pneumonia intersticial e mononucleose em decorrência de infecção por HCMV durante o período de 10 recém-nascido ou infância.

Claims (7)

1. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno caracterizado por se ligar especificamente à glicoproteína do citomegalovírus humano gB, especificamente no domínio AD1, e que é capaz de neutralizar sua bioatividade, em que: (i) as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada incluem: (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; e (c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, respectivamente, e (ii) as sequências de aminoácidos da CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve incluem: (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e (c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, respectivamente.
2. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: (a) uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (b) uma região variável da cadeia leve (LCVR) que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou 6; e (b) uma cadeia leve (cadeia L) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 8.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender: (a) uma cadeia pesada (cadeia H) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e (b) uma cadeia leve (cadeia L) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a subclasse do anticorpo ser IgG1 (X).
6. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. Método para produção do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender uma etapa de cultivo de uma célula hospedeira.
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201270662A1 (ru) 2009-12-23 2013-01-30 4-Антибоди Аг Связывающие элементы для человеческого цитамегаловируса
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US20140154270A1 (en) * 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
TW201348246A (zh) * 2012-05-21 2013-12-01 Abbvie Inc 利用蛋白質ａ親和性層析之人類、人類化或嵌合抗體之新穎純化
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US20150259402A1 (en) 2012-10-19 2015-09-17 Evec Inc. Human antibody specific to toxin produced from clostridium difficile, or antigen-binding fragment thereof
WO2014143205A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
CN112898414A (zh) * 2019-12-04 2021-06-04 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 抗人巨细胞病毒抗体及其用途
RU2738001C1 (ru) * 2020-03-23 2020-12-07 Борис Сергеевич Першин Способ определения риска развития цитомегаловирусного (ЦМВ) ретинита после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide
WO2023039242A2 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Achelois Biopharma, Inc. Multivalent interferon particles compositions and methods of use
CN114853886B (zh) * 2022-05-23 2023-11-28 南昌大学 一种高亲和力抗人巨细胞病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN116162154A (zh) * 2022-10-21 2023-05-26 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 抗人巨细胞病毒抗体及其用途

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3650032T2 (de) 1985-12-06 1995-03-09 Teijin Ltd Anticytomegaloviraler menschlicher monoklonaler antikörper und dessen herstellung.
SE9201281L (sv) 1992-04-23 1993-10-24 Bioinvent Int Ab Nya humana monoklonala antikroppar och förfarande för framställning därav
GB9221654D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant human anti-cytomegalovirus antibodies
US5750106A (en) 1993-01-28 1998-05-12 Novartis Ag Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
WO1994016730A1 (en) 1993-01-28 1994-08-04 Sandoz Pharmaceutical Corporation Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
JPH0859509A (ja) * 1994-08-16 1996-03-05 Teijin Ltd サイトメガロウイルス抗原血症治療剤およびサイトメガロウイルス感染症治療剤
AUPR593101A0 (en) * 2001-06-26 2001-07-19 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Cytomegalovirus t cell epitopes
RU2239453C2 (ru) * 2002-12-03 2004-11-10 Федеральное государственное унитарное предприятие " Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам " Микроген" Препарат иммуноглобулина человека против цитомегаловируса и способ его получения
EP1966241A2 (en) * 2005-12-05 2008-09-10 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
JPWO2007094423A1 (ja) * 2006-02-15 2009-07-09 株式会社イーベック ヒトサイトメガロウイルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分
GB0700133D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Humabs Llc Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
US8202518B2 (en) 2007-07-04 2012-06-19 Ribovax Biotechnologies S.A. Antibodies against human cytomegalovirus (HCMV)
US20110171233A1 (en) 2007-08-22 2011-07-14 Ribovax Biotechnologies S.A. Antibodies Against Human Cytomegalovirus (HCMV)

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