CN116162154A - 抗人巨细胞病毒抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种抗人巨细胞病毒抗体及其用途。所述抗人巨细胞病毒抗体能够结合CMV三聚体和/或五聚体复合物，特别是完全靶向五聚体与细胞受体结合区域的抗体，其能够完全阻断病毒与细胞的结合，具有重要的临床意义。

Description

抗人巨细胞病毒抗体及其用途

技术领域

本公开涉及对人巨细胞病毒具有特异性并以高亲和力结合的抗体或其抗原结合片段，以及产生这种抗体的制备方法。发明的抗体还具有中和感染的高效力。本发明还涉及所述抗体所结合的表位，以及所述抗体在感染个体中诊断、预防以及治疗的应用。

背景技术

人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是一种无处不在的病原体，属于疱疹病毒科的β-疱疹病毒亚科，也被称为人类疱疹病毒5(HHV5)，通常主要在免疫功能正常的人群中表现为无症状感染，仅在免疫功能低下的人群中引起严重并发症。CMV感染在成人中的发病率差异很大，在发达国家占人口的36％到77％，而在发展中国家一般高于90％(1)。在免疫力低下的人群中，CMV的再感染或再活化可引起严重的并发症，甚至危及生命(2,3)。此外，先天性HCMV感染是造成0.7％的新生儿视力/听力缺陷或智力低下的主要原因(4,5)。

人类疱疹病毒的膜融合是一个复杂的过程，需要高度保守的包膜糖蛋白gB和gH/gL以及多种糖蛋白复合物来介导病毒对宿主细胞的附着、融合或内吞作用(6,7)。目前，HCMV糖蛋白gB的功能被认为是介导病毒与受感染细胞的膜融合的主要融合物，它是在三聚体或五聚体复合物与受体结合后触发的(8-10)。HCMV编码的两个关键的含gH/gL的复合物是进入细胞的必要条件。HCMV三聚体复合物由gH/gL/gO形成，其中gL-Cys144与gO-Cys351通过二硫键连接，HCMV五聚体复合物含有5个不同的亚单位gH/gL/UL128/UL130/UL131A，gL-Cys144通过二硫键与UL128-Cys162结合。因为三聚体中的gO-Cys351和五聚体中的UL128-Cys162与gL-Cys144有相同的结合点，所以五聚体和三聚体的形成是相互排斥的(11)。此外，病毒膜表面的五聚体和三聚体的比例受UL148和US16的调节(12,13)，最近显示UL116在感染细胞中gH复合物的组装和成熟过程中充当gH伴侣也影响gH复合物的形成(14,15)。遗传学研究明确阐明，五聚体是进入上皮细胞和内皮细胞所必需的，但不是进入成纤维细胞所必需的，更重要的是五聚体中的UL128/UL130/UL131A能维持HCMV对非成纤维细胞的趋向性(16,17)。相反，三聚体被认为足以介导CMV进入成纤维细胞。一些研究表明，gO是维持无细胞病毒感染性的必要条件，gO缺失的病毒既不感染成纤维细胞也不感染上皮和内皮细胞(18-20)。

HCMV于1956年首次被分离出来(21)，虽然实验性疫苗和治疗性单克隆抗体(mAb)已进入临床试验，但目前仍没有批准用于临床的预防疫苗或治疗性单克隆抗体。到目前为止，CMV gB蛋白作为免疫原，MF59作为佐剂(gB/MF59)是临床试验中表现最好的CMV候选疫苗，在实体器官移植受者(SOT)的II期临床试验中，保护率为43％至50％(22)。化学药物如GCV、Letermovir、MBV和CMV超免疫球蛋白(CMVIG)对HCMV表现出疗效(23-25)。CMVIG在SOT或异体造血细胞移植后显示出良好的效果(26-28)。在怀孕前三个月的初次感染后，每两周一次的CMVIG有效地防止了母婴HCMV的传播(29)。然而，目前的治疗方法由于毒性或对化学药物的耐药性以及血源性CMVIG产品的缺点而受到严重限制(30,31)。基于MAb的治疗具有克服目前现有药物局限性的优势，可以成为一种有效的临床替代方法。五聚体特异性mAbs可以阻断HCMV对滋养细胞祖细胞的感染(32)，孕妇感染HCMV后30天内靶向pUL128L的抗体水平增加与病毒传播给胎儿的风险降低有关(33)。此外，具有中和上皮细胞中CMV能力的mAbs可以保护实体器官移植受者(34)。同时，gH特异性mAbs显示出抑制病毒感染和传播的广谱特性(35)。最近的一项II期临床试验表明，在高风险的肾移植受者中，用基因泰克公司的RG7667(包括五聚体特异性和抗GH抗体)接种疫苗可以推迟CMV病毒的出现时间，并且与安慰剂相比，CMV疾病更少(36)。因此，由五聚体特异性和gH特异性mAbs组成的抗体鸡尾酒疗法可能会导致CMV免疫疗法的突破。然而，目前仍然没有获准的预防疫苗或治疗性单克隆抗体(mAb)用于临床防治HCMV感染。

HCMV五聚体主要介导病毒感染上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞等非成纤维细胞。针对五聚体的中和性抗体在抑制病毒感染非成纤维细胞的效果要强于针对gB蛋白的中和性抗体。因此未来将针对五聚体的中和性抗体与针对gB蛋白的中和性抗体进行联合用药，高效阻断病毒感染多种细胞类型，具有更大的潜在临床价值。

MSL-109是II期临床失败的针对HCMV gH/gL复合物的单克隆抗体，该抗体不能结合游离病毒，在临床上不能缓解CMV病毒血症(37)。抗体8I21在五聚体上的结合表位与五聚体与细胞相关受体结合的区域只有部分重叠(43)，8I21不能完全阻断病毒与细胞受体的结合，存在病毒突破感染的可能性。因此开发一个完全靶向五聚体与细胞受体结合区域的抗体，完全阻断病毒与细胞的结合，具有重要的临床意义。

发明内容

本公开鉴定和表征了一组8个HCMV五聚体反应的抗体，根据它们对CMV三聚体和五聚体的反应性，可以分为2组。第一组中的抗体PC0004、PC0010、PC0012、PC0014、PC0035和PC0037同时结合三聚体和五聚体。实验证明，第1组的6个抗体中的3个(PC0012、PC0014和PC0035)可以中和HCMV，并识别三聚体(trimer)和五聚体(pentamer)中gH/gL蛋白上的一个高度保守的结构域。这些抗体中和HCMV不是通过阻断CMV与宿主细胞的结合，而是通过抑制病毒进入宿主细胞的吸附后过程。第二组的抗体PC0031和PC0034只与五聚体结合。发明人发现2个五聚体特异性抗体中的一个(PC0034)通过阻断病毒对宿主细胞的吸附来中和HCMV。进一步的分析表明，在NCBI数据库目前收集的214个CMV基因组序列中，抗体PC0034针对的抗原位点在UL128和UL131A蛋白中是100％保守的。

本公开揭示了这两组强效中和抗体所针对的抗原表位上的关键残基，并为设计和开发三聚体和/或五聚体作为CMV疫苗提供了关于三聚体或五聚体复合物上中和表位的重要信息。本公开提供的强效中和mAbs可以作为开发预防和治疗HCMV感染的“鸡尾酒”抗体疗法的有吸引力的候选抗体。

在一方面，本公开提供了一种抗人巨细胞病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的重链和轻链的CDR组合：

(1)分别包含SEQ ID NO.3-5的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.8-10的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(2)分别包含SEQ ID NO.13-15的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.18-20的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(3)分别包含SEQ ID NO.23-25的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.28-30的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(4)分别包含SEQ ID NO.33-35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.38-40的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(5)分别包含SEQ ID NO.43-45的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.48-50的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(6)分别包含SEQ ID NO.53-55的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.58-60的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(7)分别包含SEQ ID NO.63-65的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.68-70的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；和

(8)分别包含SEQ ID NO.73-75的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.78-80的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。

在另一方面，本公开提供了编码前述抗体或其抗原结合部分的核酸。

在另一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。

在另一方面，本公开提供了包含前述核酸或载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体和/或细胞。

在另一方面，本公开提供了免疫缀合物，其包含前述抗体或其抗原结合片段和标记。

在另一方面，本公开提供了一种生成前述抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养包含编码前述核酸或表达载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物用于制备检测、治疗、预防和/或减轻CMV感染或CMV相关疾病的药物组合物或试剂盒中的用途。

在另一方面，本公开提供了一种在人类个体中预防或治疗HCMV感染或HCMV相关疾病的方法，包括向需要治疗的个体给予有效量的前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物。

在另一方面，本公开提供了一种提高、增强或刺激感染HCMV的人类个体的抗性的方法，包括向有需要的个体给予有效量的前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物。

在另一方面，本公开提供了一种中和个体或样品中HCMV的方法，其包括将前述抗体或其抗原结合片段与个体或样品接触，并且测试前述抗体或其抗原结合片段结合以中和HCMV的能力。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本说明书的实施例，并与说明书一起用于解释本说明书的原理。

图1示出了CMV三聚体复合物和五聚体复合物采用高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测的检测结果，其中，A.高效液相色谱检测结果；B.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。

图2示出了特异性结合五聚体复合物的抗体的ELISA检测结果。

图3示出了与CMV三聚体和五聚体复合物结合的抗体的结合结果。

图4示出了与CMV五聚体特异性结合的抗体的中和活性，其中；A.在人胚肺成纤维细胞(MRC-5)中抗体中和HCMV病毒株Towne的结果；B.A.在人胚肺成纤维细胞(MRC-5)中抗体中和HCMV病毒株BE13/2012的结果；C.在基于ARPE-19上皮细胞中的中和HCMV病毒株VR1814、NR和AD169 FIX。

图5示出了与CMV三聚体和五聚体复合物特异性结合的抗体的结合结果，其中，A.中和抗体与五聚体结合的结果；B.中和抗体与三聚体结合的结果。A图中最高响应值曲线对应6μg/mL或4μg/mL的五聚体浓度，最低响应值曲线对应0.375μg/mL或0.25μg/mL的五聚体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的五聚体浓度。B图中最高响应值曲线对应4μg/mL的三聚体浓度，最低响应值曲线对应0.25μg/mL的三聚体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的三聚体浓度。

图6示出了中和抗体与CMV五聚体的交叉竞争性阻断结合的结果。

图7示出了中和抗体与五聚体突变体的结合结果，其中，A.中和抗体与五聚体突变体的结合结果；B.中和抗体对CMV病毒粘附宿主细胞的影响；C.中和抗体对CMV感染细胞的影响；D.中和抗体对CMV扩散传播的影响。

图8示出了抗体PC0034阻断HCMV五聚体与上皮和内皮细胞的结合，其中，A.抗体PC0034以及9I6与HCMV五聚体的结合结果。图中最高响应值曲线对应4μg/mL的五聚体浓度，最低响应值曲线对应0.25μg/mL的五聚体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的五聚体浓度。B.抗体PC0034以及9I6的SPR分析结果；C.HCMV五聚体与上皮细胞(APRE-19)和内皮细胞(HUVEC)的结合；D.抗体PC0034可抑制五聚体与上皮细胞和内皮细胞的结合。

图9示出了抗体与HCMV五聚体突变体的结合结果，其中，A.抗体PC0034与五聚体突变体UL131A_E23A的结合结果。图中最高响应值曲线对应80μg/mL的五聚体突变体浓度，最低响应值曲线对应5μg/mL的五聚体突变体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的五聚体突变体浓度。B.抗体PC0034与五聚体突变体UL131A_K27A的结合结果。图中最高响应值曲线对应40μg/mL的五聚体突变体浓度，最低响应值曲线对应2.5μg/mL的五聚体突变体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的的五聚体突变体浓度。C.抗体PC0034与五聚体突变体UL128_K47A的结合结果。图中最高响应值曲线对应60μg/mL的五聚体突变体浓度，最低响应值曲线对应3.75μg/mL的五聚体突变体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的的五聚体突变体浓度。D.抗体PC0034与五聚体突变体UL128_T94A的结合结果。图中最高响应值曲线对应40μg/mL的五聚体突变体浓度，最低响应值曲线对应2.5μg/mL的五聚体突变体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的的五聚体突变体浓度。E.抗体PC0034与五聚体的结合结果。图中最高响应值曲线对应20μg/mL的五聚体浓度，最低响应值曲线对应1.25μg/mL的五聚体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的的五聚体浓度。F.五聚体突变体与上皮细胞的结合结果。图中最高响应值曲线对应20μg/mL的五聚体浓度，最低响应值曲线对应1.25μg/mL的五聚体浓度，中间响应值曲线对应两倍倍比稀释的的五聚体浓度。G.五聚体突变体与上皮细胞的结合结果；H和I.亚基UL131A上K27位点，亚基UL128上T94和K47位点在五聚体复合物上的分布。

具体实施方式

I.定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

“人巨细胞病毒”(human Cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒乙亚科的巨细胞病毒属的DNA双螺旋病毒，又称为人疱疹病毒5型(Human herpersvirus 5，HHV-5)。如本文所用，“人巨细胞病毒”、“HCMV”、“人疱疹病毒5型”、“HHV-5”均可通用。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体可以是人源化或人抗体和单结构域抗体，如VH、VHH或VL。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies for CancerTherapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p3-25,Kipriyanov)。上述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。

术语“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”，是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。

本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案：Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)),而Chothia指的是结构环的位置(Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883),AbMCDR是Kabat CDR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用，“接触性”(Contact)CDR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。根据不同的CDR确定方案，这些CDR中的每一个的残基如下所示。

表1 CDR残基方案

CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。

在一个实施方案中，本发明抗体的CDR通过IMGT规则确定边界，例如利用IMGT数据库确定边界。

应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

与抗体相关的术语“变体”在本文中指，包含已经通过至少1个氨基酸残基(例如1-30，或1-20或1-10个，例如1或2或3或4或5个氨基酸残基)取代、缺失和/或插入，或通过化学衍生化一个或多个氨基酸残基而具有氨基酸改变的目标抗体区域(例如重链可变区或轻链可变区或重链CDR区或轻链CDR区)的抗体，其中变体基本上保留改变之前的抗体分子的生物学特性。在一方面，本公开涵盖在本文中提及的任何抗体的变体。在一个实施方案中，抗体变体保持改变前抗体的至少60％、70％、80％、90％,或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。可以理解的，抗体的重链可变区或轻链可变区、或各CDR区可以单独改变或组合改变。在一些实施方案中，在一个或多个或全部三个重链CDR中的氨基酸改变不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。优选地，上述氨基酸改变为氨基酸取代，优选保守取代。在一些实施方案中，抗体变体与亲本抗体在目的抗体序列区域上具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

术语“保守取代”是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表2所示：

表2氨基酸保守取代

如本文所用，术语“中和”是指中和病原体在宿主中开始和/或保持感染的能力。

如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，HCMV的gB糖蛋白)中与抗体分子特异性相互作用的部分。蛋白抗原内的表位可以从连续的氨基酸(通常为线性表位)或通过蛋白的三级折叠而并列的不连续氨基酸(通常为构象表位)形成。由连续的氨基酸形成的表位通常(但并非总是如此)对变性溶剂保持暴露，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。

与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。

与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：ELISA、SPR、固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)(参见例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。

抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。

与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG1形式的抗体是指其重链恒定区Ig结构域为IgG1的IgG3结构域。

“人”抗体(HuMAb)指具有其中框架区和CDR区域均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。

“人源化”抗体指这样的抗体，所述抗体中一些、大部分或所有非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR结构域外面的氨基酸被来源于人免疫球蛋白的相应氨基酸所替代。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外部的一些、大部分或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸所替代，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸没有改变。氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修改是容许的，只要它们没有消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保留与原始抗体类似的抗原特异性。

如本文所用，“嵌合抗体”指这样的抗体，其中可变区来源于一个物种且恒定区来源于另一物种，诸如其中可变区来源于小鼠抗体且恒定区来源于人抗体的抗体。

如本文所用，“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。如本文所用，术语“抗原结合片段”如本文所用指保留特异性结合抗原(例如，人HCMV的gB糖蛋白)的能力的抗体的一种或多种片段。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体(例如scFv)、单结构域抗体、双价或双特异性抗体或其片段、骆驼科抗体，和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。

如本文所用，“多特异性”是指特异性结合至少两个不同抗原或抗原内两个不同表位，例如三个、四个或五个不同的抗原或表位的抗体。

如本文所用，“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可对其它相关抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。

“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于标记)缀合的抗体。

本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体进行的一级抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。

术语“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

术语“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用平衡解离常数(KD)来表述。平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。KD越小说明解离越小，代表抗体与抗原间的亲和力越强。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，例如，使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的KD。通常，抗体(例如，本公开的中和抗体TRN1021)以不高于1×10^-5M，例如小于大约1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M或1×10^-10M或更小的平衡解离常数(KD)与抗原解离。

术语“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于载体缀合的抗体。术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用上述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药用载体”指与治疗剂一起施用的不干扰活性成分的生物活性的一种或多种非毒性材料，包括但不限于缓冲液、防腐剂、相容的载体、稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、媒介物以及任选地其他添加剂或包封物质。适用于本公开的药用载体可以是常规的药物制剂辅料；以及适用于递送所公开中和抗体的组合物和制剂。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“有效量”指本发明的抗体或片段或缀合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的个体，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人自身免疫疾病或炎症中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数的能力。

“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在个体中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

本文所述的“个体”或“受试者”可以互换使用，包括哺乳动物，例如人。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。

术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包含至少一种在动物中诱导免疫应答的免疫原性组合物的组合物。

术语“受试者”或“个体”是灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

II.具体实施方案详述

在一方面，本公开提供了一种抗人巨细胞病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的重链和轻链的CDR组合：

(1)分别包含SEQ ID NO.3-5的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.8-10的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(2)分别包含SEQ ID NO.13-15的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.18-20的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(3)分别包含SEQ ID NO.23-25的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.28-30的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(4)分别包含SEQ ID NO.33-35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.38-40的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(5)分别包含SEQ ID NO.43-45的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.48-50的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(6)分别包含SEQ ID NO.53-55的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.58-60的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(7)分别包含SEQ ID NO.63-65的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.68-70的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；和

(8)分别包含SEQ ID NO.73-75的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.78-80的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。

在一些实施方案中，前述抗体或其抗原结合部分包含自下列的重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)重链可变区包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或同一性的氨基酸序列或由其组成；

(2)重链可变区包含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包99％含与SEQ ID NO.1 6所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(3)重链可变区包含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.26所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(4)重链可变区包含与SEQ ID NO.31所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.36所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(5)重链可变区包含与SEQ ID NO.41所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.46所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(6)重链可变区包含与SEQ ID NO.51所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.56所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(7)重链可变区包含与SEQ ID NO.61所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.66所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(8)重链可变区包含与SEQ ID NO.71所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区包含与SEQ ID NO.76所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，前述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型抗体。

在一些实施方案中，前述抗体是IgG1型抗体。

在一些实施方案中，前述重链的恒定区包含与SEQ ID NO.81所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，前述轻链的恒定区包含与SEQ ID NO.89或91所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，前述核酸分子包含选自SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、72或其任何变体的抗体重链可变区核酸序列，和选自SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、77或其任何变体的抗体轻链可变区核酸序列。

在另一方面，本公开提供了编码前述抗体或其抗原结合部分的核酸。

在另一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。

在另一方面，本公开提供了包含前述核酸或载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体和/或细胞。

在另一方面，本公开提供了免疫缀合物，其包含前述抗体或其抗原结合片段和标记。

在另一方面，本公开提供了一种生成前述抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养包含编码前述核酸或表达载体的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物用于制备检测、治疗、预防和/或减轻CMV感染或CMV相关疾病的药物组合物或试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，CMV是HCMV。

在另一方面，本公开提供了一种在人类个体中预防或治疗HCMV感染或HCMV相关疾病的方法，包括向需要治疗的个体给予有效量的前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物。

在另一方面，本公开提供了一种提高、增强或刺激感染HCMV的人类个体的抗性的方法，包括向有需要的个体给予有效量的前述抗体或其抗原结合部分、核酸、载体、宿主细胞、或免疫缀合物。

在一些实施方案中，个体是HCMV感染者。

在另一方面，本公开提供了一种中和个体或样品中HCMV的方法，其包括将前述抗体或其抗原结合片段与个体或样品接触，并且测试前述抗体或其抗原结合片段结合以中和HCMV的能力。

前述抗人巨细胞病毒抗体能够结合CMV三聚体和/或五聚体复合物，特别是完全靶向五聚体与细胞受体结合区域的抗体，其能够完全阻断病毒与细胞的结合，具有重要的临床意义。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

实施例

实施例1 CMV重组抗原蛋白的表达纯化及鉴定

选取NCBI GenBank中VR1814(GU179289.1)毒株的UL74(gO)、UL75(gH)、UL115(gL)、UL128、UL130、UL131A基因序列并进行密码子优化，其中UL75(gH)基因截短为1-715氨基酸以去除跨膜区及胞内段，用于表达可溶性五聚体(pentamer)蛋白。其中，UL74(gO)抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示；UL75(gH)截短抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示；UL115(gL)抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示；UL128抗原的氨基酸序列如SEQID NO.86所示；UL130抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.87所示；UL131A抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.88所示。

所有抗原蛋白羧基端都带有6个组氨酸标签并分别单独构建到pcDNA3.1真核表达载体中，gH/gL/UL128/UL130/UL131A五聚体复合物(各亚基质粒质量比为1:0.8:0.6:0.6:0.6)和gH/gL/gO三聚体复合物(各亚基质粒质量比为1:1:1)各亚基的编码基因混合瞬时共转染293i细胞，培养5天后收集细胞上清液用Ni-NTA方式进行纯化，用高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测(图1A和1B)，确定获得的重组蛋白复合物具有完整的五聚体和三聚体结构。

实施例2 CMV五聚体和三聚体反应性抗体的获取

在获得实施例1制备的重组抗原蛋白后，用ELISA方法筛选了健康志愿者的血液标本，以确定与纯化的重组五聚体复合物具有高抗体滴度的样本。用双色荧光标记的五聚体作为探针，对高抗体滴度的血液样本的PBMC进行流式细胞分选，获得单个五聚体特异性的记忆B淋巴细胞。

通过RT/巢式PCR从分选的单个B细胞中扩增出重链和轻链基因段的免疫球蛋白(Ig)可变区(VHDJH和VLJL)，用overlapping PCR的方法构建抗体的线性表达载体，瞬时转转293T细胞获得重组表达的抗体(38)。ELISA结合实验共鉴定出16个与五聚体特异性结合的抗体(图2)。这些抗体的体细胞突变范围分别为VH基因的2.01-15.38％和VL基因的6.47-19.93％。这16个抗体来自11个不同的Ig基因克隆系，其中8个(PC0004、PC0031、PC0010、PC0012、PC0014、PC0034、PC0035和PC0037)代表8个不同的克隆系，被选为生产纯化抗体以进一步表征(表1)。可见，本实施例从志愿者血液样本中分离出了特异性结合HCMV五聚体和三聚体抗体。

表1.特异性结合HCMV五聚体和三聚体抗体基因的V(D)J区重排

表2抗人巨细胞病毒抗体可变区

PC0004

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码核酸如SEQ ID NO.2所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。

VH氨基酸序列：

EVQLVESGGAMIQPGGSLRLSCAASGFSFDDYTMYWVRQTPGTGLEWVALITWNGVTTRYADSVQGRFTISRDNRKNSLSLQMNSLRPGDSGLYYCARDIGPLRDSDYYYYGVGVWGLGTTVTVSS

VH核酸序列：

GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGCCATGATACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTGATGATTATACCATGTATTGGGTCCGGCAGACTCCGGGGACGGGTCTGGAGTGGGTCGCTCTCATTACTTGGAATGGTGTCACGACAAGATATGCAGACTCTGTGCAGGGCCGATTTACCATCTCCAGAGACAACAGGAAAAACTCTCTGTCTCTGCAAATGAATAGCCTGAGACCTGGGGACAGCGGCTTATATTACTGTGCAAGAGATATCGGCCCCCTACGAGACAGTGACTACTATTACTACGGTGTGGGCGTCTGGGGCCTAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，其编码核酸如SEQ ID NO.7所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.8、9、10所示。VL氨基酸序列：

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHINGYNYLHWYLQKPGQSPQLLIYFGSNRASGVSDRFSGSGSGTEFTLKISKVEPEDVGTYYCMQGLQTPLTFGGGTRVEIK

VL核酸序列：

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATATTAATGGATACAACTATTTGCATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTCGGTTCCAATCGGGCCTCCGGGGTCTCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGAGTTCACACTGAAAATTAGTAAAGTTGAGCCTGAGGATGTTGGGACCTATTATTGCATGCAAGGTCTACAAACTCCCCTCACTTTCGGCGGGGGGACGAGGGTGGAGATCAAA

PC0010

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码核酸如SEQ ID NO.12所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.13、14、15所示。VH氨基酸序列：

QVQLQESGPGLVRPSETLSLMCTVSGASISNTKYYWGWIRQPPGKRLEWVGSLYFSGTTYYNPSLQSRLTMSVDTSKNQFSLNLRSVTAADTAVYYCARRPFVMSRGVRSDPWGQGILVSVST

VH核酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAGGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCATGTGCACTGTCTCTGGTGCCTCCATCAGCAATACAAAATACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGCGACTGGAGTGGGTTGGAAGTCTCTACTTTAGTGGGACCACCTACTACAACCCGTCCCTCCAGAGTCGACTCACCATGTCCGTAGACACGTCGAAGAACCAGTTCTCCCTCAACCTGAGGTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTCTACTATTGTGCGCGACGCCCTTTTGTTATGAGTCGGGGAGTGAGGTCCGACCCCTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCTCCGTCTCCACA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，其编码核酸如SEQ ID NO.17所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.18、19、20所示。VL氨基酸序列：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQSLLQSNGYTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGPGTRVDIK

VL核酸序列：

GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCACGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCAAAGTAATGGATACACCTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCCAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGTAGACTGGAGGCCGAGGATGTTGGAGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAGAGTGGACATCAAA

PC0012

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，其编码核酸如SEQ ID NO.22所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.23、24、25所示。

VH氨基酸序列：

EVQLVESGSELKKPGASVKLSCKTSGYSFTTYAISWVRQAPGQGLEWLGRINTFTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVTTAYLEISSLKAEDTAVYFCARGASHLSGLDSWGQGGLVSVSS

VH核酸序列：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCGGGGGCCTCTGTGAAGCTTTCCTGCAAGACCTCTGGATACTCCTTCACTACTTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGCTGGGAAGGATCAACACCTTCACTGGAAACCCAACCTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCACCACGGCATATCTGGAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACCGCCGTCTATTTCTGTGCGAGGGGGGCGTCCCACCTAAGCGGCTTAGACTCCTGGGGCCAGGGAGGCCTGGTCAGCGTCTCCTCA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，其编码核酸如SEQ ID NO.27所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.28、29、30所示。

VH氨基酸序列：

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHNIGNWLAWYQQKPGQAPNLLIFKASNLEYGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSETYPWTFGQGTRVEVK

VL核酸序列：

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCACAACATTGGTAACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAAGCCCCTAACCTCCTCATCTTTAAGGCGTCTAATTTAGAATATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGTCTGAGACTTATCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTGGAAGTCAAA

PC0014

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，其编码核酸如SEQ ID NO.32所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.33、34、35所示。

VH氨基酸序列：

QVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFGNNYWNWIRQPPGEGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADAAVYFCARREQLLLPDVFDIWGLGTRVAVSS

VH核酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCGGTAATAACTACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGGAGGGGCTGGAATGGATTGGCGAAATCAATCATCGTGGAAGCACCAACTCCAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCGGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCGGACGCGGCTGTCTATTTCTGTGCGAGACGAGAGCAGCTCCTATTGCCTGATGTCTTTGATATCTGGGGCCTCGGGACAAGGGTCGCCGTCTCTTCC

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，其编码核酸如SEQ ID NO.37所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.38、39、40所示。

VL氨基酸序列：

DIQLTQSPSSLSASVGDSVTITCRASQRMSSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIASLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKLEIK

VL核酸序列：

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGAATGAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCATAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCGCCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAACTGGAGATCAAA

PC0031

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，其编码核酸如SEQ ID NO.42所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.43、44、45所示。

VH氨基酸序列：

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFTKYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIRSDGINKYYGDSVKGRFTISRDNSKSTVDLQMLSLRGEDTAVYYCAKGEGYTDYSTMYYYNGMDVWGQGTTVRVSS

VH核酸序列：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCGTCTGGATTTAGTTTCACAAAATATGCAATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGGCTGGAATGGGTGGCAGTTATTCGGAGTGATGGAATTAATAAATATTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAAAGCACAGTGGACCTGCAAATGCTCAGCCTGAGAGGCGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAGGGCTACACTGACTACTCCACCATGTACTATTACAATGGAATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCAGAGTCTCCTCA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.46所示，其编码核酸如SEQ ID NO.47所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.48、49、50所示。

VL氨基酸序列：

QAVLTQPPSLSVSPGQTARISCSARELPNQYSHWYQQRPGQAPVLLIFKDTERPPGIPERFSGSSSGTTVTLTISRIQPDDEADYYCQSSDNDGTHWVFGGGTHLTVRS

VL核酸序列：

CAGGCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGCTGTCAGTGTCCCCAGGCCAGACGGCCAGGATCTCCTGCTCTGCACGTGAATTGCCAAACCAATATTCTCATTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTATTGTTGATTTTCAAAGACACTGAGAGGCCCCCAGGCATCCCCGAGCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAACAACAGTCACGTTGACCATCTCTAGAATCCAACCAGACGACGAGGCTGACTATTATTGTCAATCATCAGACAACGATGGTACCCACTGGGTCTTCGGCGGGGGGACGCACTTAACCGTCCGCAGT

PC0034

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示，其编码核酸如SEQ ID NO.52所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.53、54、55所示。

VH氨基酸序列：

QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSGISGRASPTYYADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKDYSGSDYDILPGITALDFWGRGTLVTVSS

VH核酸序列：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGGTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACGTTTAGCAGCTATGCCATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTCGTGCAAGTCCCACATACTACGCAGACTCCGTAAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACCCTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTTTATTATTGTGTGAAAGATTATAGCGGCTCGGATTACGATATTTTGCCTGGAATCACCGCCCTTGACTTCTGGGGCCGGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCTCA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.56所示，其编码核酸如SEQ ID NO.57所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.58、59、60所示。

VL氨基酸序列：

QSALTQPPSVSAAPGETARITCGGKNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIHYDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISTVSAGDEADYYCQVWDSGSDHVVFGGGTKLTVL

VL核酸序列：

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCAGCGGCCCCAGGAGAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAAGAACATTGGAAGTAAAAGTGTTCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTACTGGTCATCCATTATGATACCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCCGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCTTGACCATCAGCACGGTCTCAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATTCAGGTAGTGATCATGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA

PC0035

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示，其编码核酸如SEQ ID NO.62所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.63、64、65所示。

VH氨基酸序列：

QVQLVQSGSELMKPGASVKVSCKASGYTFSYYAINWVRQVPGQGLEWMGWINTNTGKPSYARGLTGRFVFSLDTSVNTAFLQISSLLPDDSAIYYCARGNLVRSLRGATGRNWIDPWGLGTLVTVSS

VH核酸序列：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGTCTGAGTTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCCTCTGGATACACTTTTAGTTATTATGCTATAAATTGGGTGCGACAGGTCCCTGGACAAGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAAACCAAGTTATGCCCGGGGCCTCACAGGACGATTTGTCTTCTCCTTGGACACGTCTGTCAACACGGCTTTTCTGCAGATCAGTAGCCTATTGCCTGACGACTCTGCCATTTATTACTGTGCGCGGGGTAATTTGGTTCGTTCGCTTCGGGGAGCCACGGGGCGCAACTGGATCGACCCCTGGGGCCTGGGAACTCTGGTCACCGTCTCCTCA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.66所示，其编码核酸如SEQ ID NO.67所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.68、69、70所示。

VL氨基酸序列：

QSALTQPASVSGSPGESITVSCTGSTSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVSHRPAGVSSRFSASKSGNTASLTISWLQADDEGDYYCSSYTSSNSYVFGTGTSVTVL

VL核酸序列：

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGAGAGTCGATCACCGTCTCCTGCACTGGAAGCACCAGTGACGTTGGTGGATACAACTATGTCTCCTGGTACCAGCAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCTTGATCTATGATGTCAGTCATCGGCCCGCAGGAGTTTCTAGTCGCTTCTCTGCGTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTTGGCTCCAGGCTGACGACGAGGGTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAATTCCTATGTCTTCGGCACTGGGACTTCGGTCACCGTCCTG

PC0037

VH氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示，其编码核酸如SEQ ID NO.72所示，其HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO.73、74、75所示。

VH氨基酸序列：

QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGYGYNFATNWIGWVRQVPGKGLEWMGIIFPADSDTRYSPSFQGQVTISADKSTATAYLQWRGLKASDTAVYYCAKQSIPGWRWLDSWGQGALVTVSS

VH核酸序列：

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCCCTGAAGATCTCTTGTAAGGGTTATGGATACAACTTTGCCACGAACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGTGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATATTTCCTGCTGACTCTGACACCAGATATAGTCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATATCAGCCGACAAGTCAACCGCCACCGCCTACCTCCAGTGGCGTGGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCGTGTATTATTGTGCGAAACAGTCAATACCTGGATGGAGGTGGCTTGACTCATGGGGCCAGGGGGCCCTGGTCACCGTCTCCTCA

VL氨基酸序列如SEQ ID NO.76所示，其编码核酸如SEQ ID NO.77所示，其LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO.78、79、80所示。

VL氨基酸序列：

SYELTQPPSVSVSAGQTARITCSGDALPKQHAHWYHQKPGQAPVLVMYKETERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISAVRAEDEGDYYCQSEDSSATYLIFGGGTTLTVV

VL核酸序列：

TCTTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCGCAGGACAGACGGCCAGGATCACCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAGCAACATGCTCATTGGTATCATCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGGTGATGTATAAAGAGACTGAGAGGCCGTCAGGGATACCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAGTTCAGGGACAACAGTCACGTTGACAATCAGCGCAGTCCGGGCAGAGGACGAGGGCGACTATTACTGTCAATCAGAAGACAGCAGCGCCACTTATCTGATTTTTGGCGGAGGGACCACGCTGACCGTCGTA

上述8个抗体都是IgG1亚型，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.81所示，其编码核酸如SEQ ID NO.82所示。

重链恒定区氨基酸序列：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

重链恒定区核酸序列：

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

上述8个抗体中，PC0004、PC0010、PC0012和PC0014的轻链是κ轻链，κ轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.89所示，其编码核酸如SEQ ID NO.90所示。

κ轻链恒定区氨基酸序列

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

κ轻链恒定区核酸序列

CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

上述8个抗体中，PC0031、PC0034、PC0035和PC0037的轻链是λ轻链，λ轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.91所示，其编码核酸如SEQ ID NO.92所示。

λ轻链恒定区氨基酸序列如下：

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

λ轻链恒定区核苷酸序列如下：

GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA

实施例3与CMV三聚体和五聚体复合物结合的抗体的反应性

为了确定被分离的五聚体反应性抗体识别的CMV五聚体复合物中的蛋白成分，本实施例生产、纯化了重组CMV三聚体和五聚体复合物(图1A)，并通过已知的CMV gH/gL反应性和五聚体特异性中和抗体进行验证(图3)。用8I21(基因合成，序列来源于PDB数据库5VOC)和9I6(基因合成，序列来源于PDB数据库5VOD)作为CMV五聚体特异性抗体和MSL-109抗体(基因合成，序列来源于PDB数据库4LRI)作为对照，在ELISA中测试8种纯化的抗体与重组CMV三聚体和五聚体复合物的结合。结果发现，根据对CMV三聚体和五聚体的反应性，测试的8个抗体可以分为2组。第1组的抗体PC0004、PC0010、PC0012、PC0014、PC0035和PC0037与对照抗体MSL-109都能同时结合五聚体和三聚体，但PC0004与CMV三聚体的结合力较弱(图3)。MSL-109结合CMV三聚体和五聚体复合物中的gH/gL亚单位。第2组的PC0031和PC0034与对照抗体8I21和9I6都只能与CMV五聚体结合(图3)。由于CMV三聚体和五聚体复合物中都有gH/gL，这些结果表明，第1组的抗体可能识别复合物中的gH/gL，而第2组的两个抗体可能识别pUL128/130/131A(图3)，两组抗体识别不同的亚基或者不同的抗原表位反映两组抗体具有不同的抗病毒活性。这对于开发一个完全靶向五聚体与细胞受体结合区域的抗体，完全阻断病毒与细胞的结合，具有重要的临床意义。

实施例4与CMV五聚体特异性结合的抗体的中和活性

所有8个纯化的抗体都在人胚肺成纤维细胞(MRC-5，购自ATCC，货号：CCL-171)中测试了中和CMV的能力。结果发现，第1组6个抗体中的3个抗体PC0012、PC0014和PC0035与对照抗体MSL-109一起中和了HCMV实验室标准Towne株，EC50s为0.648-0.938μg/mL，也中和了HCMV野生型株BE13/2012，EC50s为0.299-1.480μg/mL(图4A和4B)。在基于成纤维细胞的中和试验中，第2组中的两个五聚体特异性抗体PC0031和PC0034没有中和CMV Towne株(图4A)，也没有中和临床分离株BE13/2012(数据未显示)，这与已知的五聚体特异性中和抗体8I21和9I6表现一样(39)。然而，在2种五聚体特异性抗体中，只有PC0034在基于ARPE-19上皮细胞的中和试验中被证明可以中和2个测试的HCMV野生株，包括VR1814(GenBank:GU179289.1)(40)、NR(GenBank:KX544831.1)(40)和重组HCMV株AD169 FIX(在标准毒株AD169(GenBank:FJ527563.1)上嵌合表达完整五聚体膜蛋白)(40)，EC50s分别为0.068、0.070和0.079μg/ml(图4C)。

实施例5抗体的结合能力以及中和CMV的机制

(1)中和抗体的结合和交叉反应性

通过SPR测定这两组HCMV中和抗体与纯化的gH/gL/gO三聚体和gH/gL/UL128/UL130/UL131A五聚体的结合亲和力，并与已知中和抗体MSL-109进行比较。三种gH/gL结合的中和抗体PC0012、PC0014和PC0035与五聚体结合的亲和力很高，KD分别为2.85×10^-10M、3.23×10^-10M和1.83×10^-10M(图5A)，与三聚体结合的亲和力KD分别为9.38×10^-11M、1.00×10^-9M和1.01×10^-10M(图5B)。抗体PC0012、PC0014和PC0035与五聚体的结合亲和力比抗体MSL-109高约4-7倍(图5A和表2)，与三聚体的亲和力比抗体MSL-109高约20-230倍(图5B和表2)。

表2.抗体PC0012,PC0014 and PC0035结合HCMV五聚体和三聚体的亲和力

为了深入了解抗体PC0012、PC0014和PC0035与已知中和抗体MSL-109相比所识别的抗原表位的关系，通过SPR和ELISA测定这些抗体与CMV五聚体的交叉竞争性阻断结合(图6)。结果发现，第1组的抗体没有与第2组的抗体竞争结合，反之在ELISA检测中也是如此(图6)。在第1组新分离的3种gH/gL结合的中和抗体中，PC0012阻断了抗体PC0014和PC0035与CMV五聚体的结合，而PC0014只是部分阻断，PC0035根本没有阻断PC0012与CMV五聚体的结合。PC0014和PC0035没有相互阻断与CMV五聚体的结合(图6)。PC0012和PC0035完全阻断了MSL-109与CMV五聚体的结合，而MSL-109没有阻断PC0012与CMV五聚体的结合，但可以阻断PC0035与CMV五聚体的结合。PC0014和MSL-109没有相互阻断与CMV五聚体的结合(图6)。

已有研究表明，在MSL-109抗性的病毒突变体中，gH亚单位的W168C/R、P171H/S和D446N突变导致了病毒对抗体MSL-109的耐受，同时抗体MSL-109与W168C/R突变的gH/gL不结合(41)。为了评估抗体PC0012、PC0014和PC0035对五聚体的结合是否受gH亚单位上这3个位点突变的影响，重组表达了针对这三个位点的五聚体突变体。实验结果显示，抗体PC0012、PC0014和PC0035与这3个五聚体突变体强烈结合(图7A)，而抗体MSL-109没有与这些突变体结合或结合很弱(图7A)。因此，抗体PC0012、PC0014和PC0035识别类似区域的抗原表位，并且它们的表位与抗体MSL-109的表位不同，但可能部分重叠或接近。

(2)gH/gL结合的抗体中和CMV的机制

据报道，gH/gL和gB结合的中和性抗体在病毒粘附宿主细胞后发挥中和作用(35,41)。为了阐明抗体PC0012、PC0014和PC0035是如何影响病毒感染细胞的，首先将抗体PC0012、PC0014和PC0035与病毒的复合物孵育4℃预冷的MRC-5细胞。结果发现，抗体PC0012、PC0014和PC0035与抗体MSL-109和无关抗体TRN006(专利：CN103910796B)都没有降低细胞膜表面的CMV病毒量，而阳性对照肝素几乎检测不到病毒DNA拷贝(图7B)。随后，研究了抗体PC0012、PC0014和PC0035是否能干扰附着在细胞膜表面的病毒感染细胞。将CMV病毒在4℃下预先接种到MRC-5细胞中孵育30分钟，然后加入抗体PC0012、PC0014和PC0035。结果发现抗体PC0012、PC0014和PC0035以及抗体MSL-109都能阻断CMV感染细胞(图7C)。因此，抗体PC0012、PC0014和PC0035以及抗体MSL-109不阻断病毒对细胞的黏附，而是阻断病毒粘附后的入侵过程。

HCMV也通过介导合胞体形成而在细胞之间进行扩散传播(42)。发明人评估了抗体PC0012、PC0014和PC0035对HCMV细胞间扩散传播的影响。在病毒接种5天后，通过检测CMV病毒特异性CMV IE1/IE2蛋白的表达判断HCMV感染的情况。与没有添加抗体(仅有病毒)或用阴性对照抗体TRN006处理的病毒感染细胞中看到的较大和较多数量的棕色染色卫星复制中心，而抗体PC0012、PC0014、PC0035或MSL-109处理的感染细胞中可以观察到均匀分散的较小尺寸和较少数量的棕色染色卫星病毒复制中心(图7D)。这些结果表明，抗体PC0012、PC0014和PC0035以及MSL-109能够抑制HCMV在成纤维细胞中的细胞间的扩散传播。

实施例6抗体PC0034阻断HCMV五聚体与上皮和内皮细胞的结合

CMV中和抗体9I6被明确定义为识别五聚体特异性位点并阻断CMV五聚体与细胞表面受体Nrp2的结合(43)。抗体PC0034与CMV五聚体结合的亲和力为1.05×10^-10M，而抗体9I6与五聚体结合的亲和力略低，KD为4.84×10^-10M，比PC0034低(图8A)。SPR分析表明，抗体PC0034与9I6能够完全相互阻断与CMV五聚体的结合(图8B)。重组表达的HCMV五聚体蛋白能与上皮细胞(APRE-19，购自ATCC，货号：CRL-2302)和内皮细胞(HUVEC，购自ATCC，货号：CRL-1730)结合，且存在剂量反应关系(图8C)。抗体PC0034与HCMV五聚体蛋白结合后，抗体PC0034可抑制五聚体与上皮细胞和内皮细胞的结合(图8D)。因此，这些数据表明，抗体PC0034阻断五聚体与细胞表面受体的结合而发挥抗病毒活性。

实施例7抗体PC0034识别的表位研究

图9示出了抗体PC0034与HCMV五聚体突变体的结合结果。通过SPR评估抗体PC0034对这4个五聚体突变体的亲和力变化，其中UL131A_E23A减少了9.96倍，UL131A_K27A减少了33.93倍，UL128_K47A减少了9.33倍，UL128_T94A减少了81.06倍(图9A至9D及表3)。抗体PC0034对五聚体的亲和力与五聚体上的2个位点(UL128_T94和UL131A_K27)密切相关，但抗体9I6对这2个位点的五聚体突变体的亲和力变化不明显。因此，抗体PC0034的结合表位与9I6的表位不同。同时，在五聚体蛋白与细胞结合的实验中发现，五聚体突变体(UL128_T94A和UL131A_K27A)与上皮细胞的结合显著降低(图9F和9G)。这些结果表明，抗体PC0034在五聚体上的结合表位与五聚体与细胞表面受体的结合表位重叠。

表3.抗体结合HCMV五聚体和五聚体突变体的亲和力

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Claims (13)

1.一种抗人巨细胞病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的重链和轻链的CDR组合：

(1)分别包含SEQ ID NO.3-5的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ ID NO.8-10的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(2)分别包含SEQ ID NO.13-15的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.18-20的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(3)分别包含SEQ ID NO.23-25的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.28-30的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(4)分别包含SEQ ID NO.33-35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.38-40的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(5)分别包含SEQ ID NO.43-45的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.48-50的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(6)分别包含SEQ ID NO.53-55的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.58-60的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；

(7)分别包含SEQ ID NO.63-65的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.68-70的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；和

(8)分别包含SEQ ID NO.73-75的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO.78-80的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。

2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其包含选自下列的重链可变区和轻链可变区的组合：

(1)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或同一性的氨基酸序列或由其组成；

(2)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包99％含与SEQ ID NO.1 6所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(3)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.21所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.26所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(4)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.31所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.36所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(5)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.41所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.46所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(6)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.51所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.56所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(7)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.61所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.66所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(8)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.71所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.76所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。

3.根据权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型抗体；

优选地，所述抗体是IgG1型抗体；

优选地，所述重链的恒定区包含与SEQ ID NO.81所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

优选地，所述轻链的恒定区包含与SEQ ID NO.89或91所示氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。

4.编码根据权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分的核酸；

优选地，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO.2、12、22、32、42、52、62、72或其任何变体的抗体重链可变区核酸序列，和选自SEQ ID NO.7、17、27、37、47、57、67、77或其任何变体的抗体轻链可变区核酸序列。

5.包含权利要求4所述核酸的载体。

6.包含权利要求4所述的核酸或权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的载体和/或权利要求6所述的细胞。

8.免疫缀合物，其包含权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段和标记。

9.一种生成权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养包含编码权利要求4的核酸或权利要求5的表达载体的宿主细胞。

10.权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求4的核酸、权利要求5的载体、权利要求6的宿主细胞、或权利要求8的免疫缀合物用于制备检测、治疗、预防和/或减轻CMV感染或CMV相关疾病的药物组合物或试剂盒中的用途；

优选地，所述CMV是HCMV。

11.一种在人类个体中预防或治疗HCMV感染或HCMV相关疾病的方法，包括向需要所述治疗的个体给予有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求4的核酸、权利要求5的载体、权利要求6的宿主细胞、权利要求7的药物组合物或权利要求8的免疫缀合物；

优选地，所述个体是HCMV感染者。

12.一种提高、增强或刺激感染HCMV的人类个体的抗性的方法，包括向有需要的个体给予有效量的根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求4的核酸、权利要求5的载体、权利要求6的宿主细胞、权利要求7的药物组合物或权利要求8的免疫缀合物；

优选地，所述个体是HCMV感染者。

13.一种中和个体或样品中HCMV的方法，其包括将权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段与个体或样品接触，并且测试所述抗体或其抗原结合片段结合以中和HCMV的能力。

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