MX2011010382A - Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a epitopo discontinuo especifico que ocurre en la region ad1 de la glicoproteina gb de citomegalovirus humano y fragmento de union a antigeno del mismo. - Google Patents

Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a epitopo discontinuo especifico que ocurre en la region ad1 de la glicoproteina gb de citomegalovirus humano y fragmento de union a antigeno del mismo.

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Abstract

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el citomegalovirus humano HCMV causante de varios estados de enfermedad, la composición que comprende un anticuerpo monoclonal y un fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente a la región AD1 de la glicoproteína gB y que tiene una capacidad neutralizante excelente. La presente invención proporciona: un anticuerpo monoclonal y un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene una capacidad de neutralización excelente y una capacidad de bloqueo de infección de célula a célula y que une específicamente a una secuencia discontinua que se encuentra en la región ADI de HCMV; una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo; y similares.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL CAPAZ DE UNIRSE A EPITOPO DISCONTINUO ESPECIFICO QUE OCURRE EN LA REGION AD1 DE LA GLICOPROTEINA GB DE CITOMEGALOVIRUS HUMANO Y FRAGMENTO DE UNION A ANTIGENO DEL MISMO Campo de la Invención La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que une al citomegalovirus humano (más adelante, designado ocasionalmente como "HCMV" por sus siglas en inglés), y un fragmento de unión a antígeno del mismo. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un anticuerpo monoclonal humano que une a la región AD1 de la glicoproteína GB de HCMV y un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Antecedentes de la Invención Junto con el herpesvirus-6 humano (HHV-6 por sus siglas en inglés) y herpesvirus-7 humano (HHV-7 por sus siglas en inglés), el citomegalovirus humano (HCMV) pertenece al beta-herpesvirus de Herpesviridae. HCMV es un virus de ADN de bicatenario que es el Herpesviridae más grande con un diámetro de aproximadamente 180 nm, donde la cepa silvestre del mismo codifica 165 genes con un tamaño del genoma de aproximadamente 235 kbp (Documentos no relacionados con patente 1 y 2).
HCMV es una especie altamente específica y no infecta animales distintos del humano pero infecta extensamente humanos y tiene afinidad para tipos amplios de tejidos en el cuerpo humano.
Por otra parte, una vez que está infectado, HCMV no se elimina incluso después del establecimiento de inmunidad en el huésped y permanece de por vida.
Una vez infectado, HCMV permanece latente durante toda la vida. Más del 90% de adultos japoneses están ya infectados y llevan el virus, aunque el virus se active raramente y produzca raramente enfermedades en gente sana.
Sin embargo, un estado de inmunodeficiencia debido al SIDA, debido al cáncer, después del trasplante de órganos, después del trasplante de médula ósea, después de hemodiálisis o similares podría causar la reactivación del HCMV latente, que puede causar infección por HCMV seria que puede ser fatal tal como pulmonía intersticial, retinitis, gastroenteritis, encefalitis o similares (Documentos no relacionados con patente 3 y 4).
Además, cuando una mujer embarazada experimenta la infección primaria por HCMV durante el período fetal, la infección por HCMV puede transmitirse al feto de la mujer embarazada vía la placenta, en este caso el feto puede desarrollar la infección por CMV congénita (enfermedad de citomegalovirus congénita: también llamada enfermedad de inclusión citomegálica o enfermedad de inclusión citomegálica congénita), y puede dar lugar al aborto espontáneo, muerte del feto o muerte poco después del nacimiento. Incluso en el caso de supervivencia, puede dar lugar a bajo peso al nacer, a hepatoesplenomegalia, ictericia, púrpura trombocitopénica, microcefalia, trastorno del desarrollo mental, retraso del desarrollo intelectual, coriorretinitis, deterioro de oído o similares. Además, incluso durante el período de recién nacido o infancia, si el anticuerpo de HCMV transmitido de la madre es insuficiente, la infección por HCMV vía el canal de nacimiento, leche materna, orina, saliva o similares puede desarrollar anormalidad de función hepática, pulmonía intersticial, mononucleosis o similares (Documentos no relacionados con patente 3, 4 y 5).
La infección por HCMV se ha convertido en una asunto mundial y los fármacos profilácticos y terapéuticos que son capaces de suprimir los inicios de varias condiciones patológicas debido a los HCMV descritos antes, o que son capaces de aliviar tales condiciones patológicas están presente bajo desarrollo. Recientemente, el ganciclovir (Documentos no relacionados con patente 6 y 7), foscarnet (Documento no relacionado con patente 8), valganciclovir (Documento no relacionado con patente 9) y similares se ha desarrollado como fármacos antivirales para suprimir la proliferación de HCMV.
El ganciclovir es un fármaco antiviral que bloquea la síntesis del ADN viral, que es activado por trifosfato de ganciclovir en células y competitivamente se antagoniza con trifosfato de deoxiguanosina (dGTP por sus siglas en inglés), es decir, un sustrato de la polimerasa de ADN, de tal modo que inhibe la polimerasa de ADN. Por lo tanto, se utiliza para tratar la retinitis de citomegalovirus en un estado de inmunodeficiencia, principalmente SIDA, o se utiliza para suprimir el inicio de la retinitis de citomegalovirus en la infección de VIH avanzada con 100 o menos linfocitos CD4/mm3, y aprobado como un producto farmacéutico.
Los agentes antivirales tal como ganciclovir, sin embargo, se han reportado de varios efectos secundarios tal como trastorno hematopoyético, y su modo de uso ha sido muy limitado como se describe anteriormente.
El efecto secundario que ocurre más frecuentemente y que requiere atención entre los efectos secundarios del ganciclovir es trastornos de sangre asociados con la supresión de médula ósea, donde los números de leucocitos, eritrocitos y plaquetas se disminuyen anormalmente. Los síntomas tempranos incluyen fiebre, garganta adolorida, lentitud anormal y tendencia de sangrado tal como sangrado debajo de la piel. En algunos casos, puede causar anormalidad en el sistema psiconeurótico, dando por resultado dolor de cabeza, vértigos, insomnio, dificultad para pensar, sensación de ansiedad o similares.
Además, la teratogénesis, mutagenicidad y carcinogenicidad se han reportado en experimentos con animales, y no pueden utilizarse así durante el embarazo.
Además, aunque el uso de ganciclovir en casos severos de infección por HCMV congénita se cree que es probablemente efectivo en la disminución del inicio de efectos secundarios neurológicos y que mejora la progresión de la pérdida del oído (Documento no relacionado con patente 10), problemas de supresión de médula ósea, teratogénesis o carcinogenicidad como efectos secundarios del ganciclovir todavía requiere suficiente consideración y estudio.
El valganciclovir es éster de L-valina de ganciclovir que se convierte a ganciclovir con esterasas intestinales y hepáticas después de la administración oral. Por consiguiente, su mecanismo de acción y efectos secundarios son los mismos que los de ganciclovir y así asociados con los problemas de la supresión de médula ósea, teratogénesis y carcinogenicidad. En Japón, el valganciclovir es aprobado como un fármaco terapéutico para la retinitis de citomegalovirus en estados de inmunodeficiencia, principalmente SIDA.
Mientras tanto, el foscarnet es un análogo del ácido pirofosforico y suprime la proliferación de HCMV actuando directamente en el sitio de unión del ácido pirofosforico de la polimerasa de ADN para inhibir la polimerasa de ADN. Es también efectivo contra HCMV resistente a ganciclovir. Los efectos secundarios principales incluyen sensación de enfermedad, anemia, incremento en creatinina de suero, vómito, hipomagnesemia, hipocalemia, sensación anormal y similares. Particularmente, choque y daño del riñon ocurren frecuentemente y requieren así la administración cuidadosa. En Japón, el uso de foscarnet se permite solamente en pacientes determinablemente d i agnosticados que tienen reti nitis por H CMV o pacientes alta y cl ínicamente sospechoso de retinitis por HCMV entre los pacientes de S I DA, y no para utilizarse con el propósito de prevenir la infección (Documento no relacionado con patente 8 ).
Así, el desarrollo de un fármaco capaz de prevenir el inicio de varias enfermedades debido al HCMV descrito antes o aliviar síntomas de las mismas sin ni ngún efecto secundario se ha deseado fuertemente. Bajo ci rcunstancias, desarrollos cl ínicos de dos anticuerpos anti-HCMV se han realizado, donde uno es el anticuerpo anti-HCMV "C23 (también l lamado TI-23 al momento del desarrollo)" descrito en el Documento de Patente 3 que es un anticuerpo que reconoce la región AD2 de la glicoproteína GB , y el otro es el anticuerpo anti-HCMV "S DZ M SL 1 09" descrito en el Documento de Patente 4 que es un anticuerpo monoclonal que reconoce la gl icoproteína g H en la superficie del HCMV. Particularmente, el desarrollo de C23 se abandonó a lo largo de la trayectoria a pesar de su alta actividad neutral izante , es decir 50% de concentración inhi bidora de 0.5 pg/ml como se determi nó por el método de placa (Documento no relacionado con patente 1 1 ).
Por el momento , el desarrol lo de la vacuna de HCMV se ha conducido profundamente pero no hay vacuna todavía disponible que pueda soportar el uso cl ínico . Una formulación de gamaglobuli na de título alto anti-CMV derivada de humano se desarrolló recientemente, q ue se aprobó en los Estados U nidos para su uso para preveni r el i nicio de la infección por HCMV asociada con trasplante de riñon. Si n embargo, puesto q ue una formulación de gamaglobulina de título alto anti-CMV es una preparación de sangre derivada de humano, tiene varios problemas . Por ejemplo , una mezcla de gamaglobuli na derivada de h umano da l ugar en variación de lote a lote significativa en la actividad , actividad baja y suministro limitado , así como riesgos constantes tal como contaminación del virus patogénico o patógeno desconocido.
Por consiguiente, ya que un anticuerpo monoclonal (más adelante, designado ocasionalmente como un "anticuerpo anti-H CMV") que une a HCMV y neutraliza la i nfectividad del mismo (es deci r, eli mina la actividad biológica del mismo) puede esperarse como un fármaco profiláctico o terapéutico para varias condiciones patológicas causadas por HCMV, es útil , por ejemplo, en térmi nos de estrategia de prevención o tratamiento contra varias enfermedades causadas por HCMV en un paciente con u na condición de i nm unodeficiencia .
Específicamente , un anticuerpo anti-HCMV derivado de hu mano que tiene fuerte afi nidad y capacidad de alta neutralización contra HCMV para aniquilar la actividad de HCMV para prevenir el inicio de las enfermedades o aliviar los síntomas y que no causa ninguna reacción alérg ica parecía ser efectivo admi nistrarse como un así llamado "fármaco anticuerpo" .
Sin embargo, los anticuerpos inhibidores de HCMV reportados hasta ahora (por ejemplo, Documentos de Patente 1, 2, 3, 4 y 5) fueron escasos en términos de afinidad, capacidad neutralizante y similares contra HCMV, y fueron así cortos de espera bloquear suficientemente bioactividades de HCMV para prevenir el inicio de varias enfermedades causadas por HCMV o para aliviar síntomas de los mismos.
Por lo tanto, el desarrollo de un anticuerpo anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es un anticuerpo monoclonal humano que no reconoce ni responde a una sustancia extranjera, que tiene afinidad excelente, especificidad y capacidad de neutralización para HCMV, y que puede esperarse de su uso como un fármaco profiláctico o terapéutico, se ha deseado fuertemente. Últimamente, para suprimir la proliferación de HCMV in vivo, no sólo la actividad neutralizante sino también la importancia de bloquear la infección de célula a célula se han mencionado (Documentos no relacionados con patente 12 y 13), y así un anticuerpo anti-HCMV que también tiene una actividad para inhibir la infección de célula a célula ha sido muy necesario.
Documentos de la Técnica Anterior Documentos de Patente Documento de Patente 1: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No. 8-502403 Documento de Patente 2: Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No.8-506325 Documento de Patente 3: WO87/03602 Documento de Patente 4: WO93/021952 Documento de Patente 5: WO2007/094423 Documentos no relacionados con patente Documento no relacionado con patente 1: Davison, A.J. y colaboradores, The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J. Gen. Virol., 2003;84: páginas 17-28 Documento no relacionado con patente 2: Dolan, A. y colaboradores, Genetic content of wild-type human cytomegalovirus. J. Gen. Virol., 2004; 85: páginas 1301-1312 Documento no relacionado con patente 3: Keiko TAYA, Discussion of Infection: Cytomegalovirus infection, Infectious Diseases Weekly Report Japan.2003; Week 15:10-14 Documento no relacionado con patente 4: Griffiths, P.D., The treatment of cytomegalovirus infection. J. Anti. Chemo., 2002; 49: páginas 243-253 Documento no relacionado con patente 5: Demmler, G.J., Congential cytomegalovirus infection and disease. Seminars in Pediatric Infection Diseases. Seminars in Pediatric Infectious Diseases, 1999; 10: páginas 195-200 Documento no relacionado con patente 6: Freitas, V.R. y colaboradores, Activity of 9-(1 ,3-dihydroxy-2- Propoxymethel)guanine compared with that of acyclovir against human, monkey, and rodent cytomegaloviruses. Anti. Agent Chemo., 1985; 28: páginas 240-245 Documento no relacionado con patente 7: Package insert for anti-cytomegalovirus chemotherapeutic agent, Denosine for intravenous infusión, 500 mg, ganciclovir formulation, Mitsubishi Tanabe Pharma (revisado en octubre de 2007) Documento no relacionado con patente 8: Package insert for antiviral agent for drip injection, Foscavir, 24 mg/ml, foscarnet sodium hydrate injection, AstraZeneca (revisado en junio de 2007) Documento no relacionado con patente 9: Kimberlin.D.W.y colaboradores, Effect of ganciclovir therapy on hearing in symptomatic congenial cytomegalovirus disease involving the central nervous system; randomized, controlled trial. J. Pediatr., 2003; 143: 16-25 Documento no relacionado con patente 10: Kimberlin, D.W. y colaboradores, Effect of ganciclovir therapy on hearing in symptomatic congenial cytomegalovirus disease involving the central nervous system; randomized, controlled trial. J. Pediatr., 2003; 143: 16-25 Documento no relacionado con patente 11: Masuho,T.,y colaboradores, Human monoclonal antibodies neutralizing human cytomegalovirus. J.Gen.Virol, 1987; 68: páginas 1457-1461 Documento no relacionado con patente 12: Navarro, D.y colaboradores, Glycoprotein B of human cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusión of infected cells. Virology, 1993; 197: 197: páginas 143-158 Documento no relacionado con patente 13: Ohizumi, Y., Neutralizing mechanism of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein 130/55. J. Gen. Virol., 1992; 73: páginas 2705-2707 Breve Descripción de la Invención Problemas a Solucionarse por la Invención Así, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que une específicamente a HCMV y que inhibe suficientemente la bioactividad del mismo parece ser útil contra varias enfermedades causadas por HCMV desde una perspectiva estratégica de tratamiento o prevención.
En el momento, la mayor parte de los fármacos de anticuerpo que se aprueban como productos farmacéuticos necesitan administrarse en una gran cantidad de varios mg a varios centenares de mg por día y son costosos. Muchos de los productos biofarmacéuticos que están comercialmente disponibles hasta ahora distintos de los productos farmacéuticos de anticuerpo necesitan administrarse de varias decenas de yig a 1 mg por día. En comparación, las dosificaciones diarias de productos farmacéuticos de anticuerpo varían enormemente de aproximadamente 10 a 1000 veces el producto biofarmacéutico convencional. HCMV lleva a varias condiciones de enfermedad, y los tratamientos de estas enfermedades tienen problemas i mportantes tal como actividad mayor, menos dosis terapéutica y mantener el tratamiento a bajo costo , considerando el efecto posible en recién nacidos, i nfantes y una mujer embarazada . En otras palabras, ningún fármaco de anticuerpo sino uno con alta bioactividad se desea, que es más útil con una afinidad más excelente y capacidad neutralizante mayor como un prod ucto farmacéutico en términos de gasto de asistencia médica.
Aunque la cantidad de prod ucción de los productos farmacéuticos de anticuerpo necesaria se incrementa mayormente, las instalaciones de producción son i nsuficientes sobre una base global . Bajo tales ci rcunstancias , un anticuerpo monoclonal anti-HCMV humano con mayor afinidad y capacidad de neutralización se desea puesto que un anticuerpo con afi nidad excelente y capacidad neutralizante puede ejercer efectos con menos cantidad . Lo que es más, puesto que HCMV es fundamental contagioso para ti pos amplios de tej idos y cél ulas en los cuerpos (Si nzger, C. y colaboradores , Curr Top icrobiol I mmunol . , 2008; 325 : páginas 63-83), es importante para que el anticuerpo anti-HCMV ejerza efectos cl ínicos tener una actividad neutralizante efectivo para cualq uiera de cél ula de fi broblasto , célula epitelial y célula endotelial como una célula hospedadora a i nfectarse.
Dada la manera de proliferación de la infección por HCMV in vivo, un anticuerpo anti-HCMV que no sólo tiene capacidad neutralizante si no también tiene capacidad de bloqueo de la infección de célula a célula es muy necesario. Por otra parte, en vista de la efectividad y seguridad como un producto farmacéutico, se desea la disposición de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal derivado de humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tenga la capacidad neutralizante mayor y capacidad de bloqueo de infección de célula a célula contra HCMV que ocasiona varios estados de enfermedad.
Medios para Solucionar los Problemas Para adquirir el anticuerpo descrito antes, los presentes inventores han conducido estudios profundos y logros con ingenio en la obtención de un anticuerpo monoclonal humano que reconoce específicamente un epítopo discontinuo no reportado previamente presente en la región AD1 de la glicoproteína GB de HCMV, que también tiene la alta capacidad neutralizante y alta capacidad de bloqueo en la infección de célula a célula, de tal modo logran la presente invención.
Así, la presente invención se relaciona con un anticuerpo monoclonal anti-HCMV o un fragmento de unión del mismo, el ADN (polinucleótido) que codifica el anticuerpo o fragmento de unión, un vector que contiene el ADN, y una célula hospedadora que contiene el vector descrito más adelante. [1] Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a la región AD1 de la glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV), y que reconoce, como un epítopo, una secuencia discontinua que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26 y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27 presente en la región AD1. [2] Un anticuerpo monoclonal que une específicamente a la región AD1 de la glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV) y que es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma, en donde (i) la región variable de la cadena pesada comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 y una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13; (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14 y una secuencia de aminoácido que tiene la eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, una secuencia de aminoácido que tiene la eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22, y (ii) la región variable de la cadena ligera comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 y una secuencia de aminoácido que tiene la eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16; (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17 y una secuencia de aminoácido que tiene la eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18 y una secuencia de aminoácido que tiene la eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. [3] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [2] anterior, que une específicamente a un epítopo que comprende dos o más secuencias discontinuas presentes en regiones de una secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 23) que consisten de los residuos de aminoácido continuos en las posiciones 549-580 y una secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 24) que consiste de los residuos continuos del aminoácido en las posiciones 596-640 de HCMV-glicoproteína gB. [4] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [2] anterior, que reconoce, como un epítopo, una secuencia discontinua que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26 y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27 en la región AD1 de HCMV-glicoproteína gB. [5] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de [3] y [4] anterior, el anticuerpo que comprende: (i) (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22, y (i¡) (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18. [6] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [5] anterior, el anticuerpo que comprende: (i) (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, y (¡i) (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18. [7] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [2] anterior, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR por sus siglas en inglés) que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; y (b) una región variable de cadena ligera (HCVR por sus siglas en inglés) que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12, una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12. [8] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [7] anterior, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12. [9] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [2] anterior, que comprende: (a) una cadena pesada (cadena H) que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6, una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 o 6; y (b) una cadena ligera (cadena L) que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8, una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8. [10] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con [9] anterior, que comprende: (a) una cadena pesada (cadena H) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6; y (b) una cadena ligera (cadena L) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8. [11] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de [1 ]-[10] anterior, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano. [12] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de [1 ]-[ 11 ] anterior, en donde la clase (subclase) del anticuerpo es I g G 1 (?). [13] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de [1 ]-[12] anterior, cuyo 50% de concentración inhibidora para la formación de placas es 0.05 Mg/ml (aproximadamente 0.3 nM) o menor para la cepa de laboratorio de HCMV (AD169) en presencia de una célula de fibroblasto humana. [14] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de [ 1 ]-[ 13] anterior, que tiene capacidad de bloqueado de infección de célula a célula del 50% o mayor en 0.2 pg/ml (aproximadamente 1.3 nM) o menor en una línea celular de fibroblasto humana (MRC-5) infectada con cepa de laboratorio de HCMV (AD169). [15] Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad relacionada con citomegalovirus humano (HCMV), que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de [1 ]-[14] anterior y un portador farmacéuticamente aceptable. [16] La composición farmacéutica de acuerdo con [15] anterior, en donde la enfermedad relacionada con HCMV es (a) pulmonía intersticial, retinitis, gastroenteritis o encefalitis causada por la reactivación de HCMV en un estado de inmunodeficiencia, (b) infección por CMV congénita debido a la transmisión de la infección por HCMV de una mujer embarazada a un feto, (c) aborto espontáneo, muerte del feto o muerte poco después del nacimiento causado por la infección por CMV congénita descrita antes, (d) bajo peso al nacer, hepatoesplenomegalia, ictericia, púrpura trombocitopénica, microcefalia, trastorno del desarrollo mental, retraso del desarrollo intelectual, coriorretinitis o deterioro de oído en el caso de supervivencia a través de infección por CMV congénita descritos antes; o (e) anormalidad de la función hepática, pulmonía intersticial o mononucleosis que son causadas por la infección por HCMV en el nacimiento o infancia. [17] Un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo monoclonal anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente a la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV y que es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma, en donde el ácido nucleico aislado se selecciona de ácidos nucleicos que se codifican para las secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de las SECS ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 y 22, y ácidos nucleicos que se hibridizan con los mismos bajo altas condiciones rigurosas. [18] Un vector que incorpora un ácido nucleico de acuerdo con [17] anterior. [19] Una célula hospedadora que incorpora el vector de acuerdo con [18] anterior. [20] Un método para producir el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de [1 ]-[14] anterior, que comprende una etapa de cultivar la célula hospedadora de acuerdo con [19] anterior.
Efectos de la Invención Un anticuerpo anti-HCMV de la presente invención, en particular, un anticuerpo que une específicamente a la región AD1 de la HCMV-glicoproteína gB, o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede unir específicamente a HCMV que es causante de varias enfermedades, por ejemplo, en un estado de inmunodeficiencia, y aniquila (neutraliza) la bioactividad de HCMV, de tal modo ejerciendo excelente capacidad neutralizante contra HCMV. Además, una modalidad donde el anticuerpo de anti-HCMV-glicoproteína gB AD1 de la presente invención es un monoclonal anticuerpo humano es ventajoso en que no tiene ninguna inmunogenicidad y en que no produce ninguna inmunorespuesta.
Una modalidad del anticuerpo anti-HCMV de la presente i nvención tiene alta capacidad de bloqueo de infección de célula a cél ula o actividad i nhibidora de infección de célula a cél ula contra HCMV. En vista del modo de proliferación de infección por HCMV in vivo, es ventajoso que el anticuerpo anti-HCMV no sólo tiene capacidad neutralizante sino también tiene capacidad de bloqueo de infección de célula a cél ula .
U n anticuerpo anti-HCMV o un fragmento de u nión a antígeno del mismo de la presente invención tiene alta capacidad neutralizante y actividad i nhibidora de proliferación de infección contra HCMV. Puesto que un anticuerpo monoclonal humano no tiene ni nguna inmunogenicidad , es probable ser útil como un fármaco profiláctico o terapéutico para varias enfermedades causadas por HCMV, por ejem plo: (a) enfermedades tal como pul mon ía intersticial , retinitis, gastroenteritis , encefalitis y similares debido a la reactivación de HCMV en estados de inmunodeficiencia tal como SI DA, cáncer, después del trasplante de órganos , después del trasplante de médula ósea, y después de hemodiálisis; (b) i nfección por CMV congénita debido a transmisión de la infección por HCMV de una mujer embarazada a un feto ; (c) aborto espontáneo , muerte del feto y muerte poco después de nacer causada por la infección por CMV congénita descrita antes; (d ) bajo peso al nacer, hepatoesplenomegal ia, ictericia , púrpura trom bocitopénica, microcefalia , trastorno del desarrollo mental , retraso del desarrol lo intelectual , coriorretinitis y deterioro de oído en el caso de supervivencia a través de infección por CMV congénita descrita antes; y (e) anormalidad de la función hepática, pulmonía intersticial y mononucleosis debido a infección por HCMV en bebés o infantes (Documentos no relacionados con patente 3, 4 y 5).
Además, una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal humano particularmente preferible de la presente invención es efectiva con una cantidad extremadamente pequeña. Últimamente, los estudios para un anticuerpo anti-HCMV se han conducido contra varios antígenos superficiales diferente de la glicoproteína gB, por ejemplo, gH, gl_ o similares. Sin embargo, dadas las circunstancias mencionadas en (1) - (3) mas adelante, un anticuerpo que une específicamente a la glicoproteína gB, particularmente región AD1 del mismo, y que tiene alta actividad neutralizante, como el anticuerpo de la presente invención, es altamente útil como un fármaco profiláctico o terapéutico para la infección por HCMV.
Con el fin de suprimir la proliferación viral tal como HCMV in vivo, la importancia no sólo de neutralizar la actividad sino también el bloqueo de la infección de célula a célula se ha señalado (Documentos no relacionados con patente 12 y 13). Mientras tanto, los estudios de glicoproteína gB recientes muestran que gB desempeña un papel importante en la entrada de partículas virales en células y la infección de célula a célula (Isaacson, M.K. y colaboradores, Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J.Virology, 2009; 83: páginas 3891-3903). Por lo tanto, un anticuerpo contra gB es muy probable también contribuir a la inhibición de ia infección de célula a célula. (2) Entre la glicoproteína gB esencial para la infección por HCMV, la región AD1 es indispensable para las funciones y formación de la conformación de gB (Qadri, I. y colaboradores, Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus. J.Gen.Virol, 1992; 73; p2913-2921; and Britt, W.J. y colaboradores, Antigenic domain is required for oligomerization of human cytomegalovirus glycoprotein B. J.Virol., 2005; 79: páginas 4066-4079), y también se conoce como una parte con menos mutación de una cepa de virus clínicamente aislada. Así, un anticuerpo contra AD1 tiene posiblemente un espectro amplio. (3) Un anticuerpo AD1 que reconoce epítopos discontinuos a través de una región más larga en el gB con respecto a un anticuerpo contra la región AD2, tiene mayor especificidad y parece así tener menos posibilidad en causar efectos secundarios inesperados por reactividad cruzada con la otra molécula biológica.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para separar un clon de célula que produce anticuerpos para producir un anticuerpo anti-HCMV de acuerdo con la presente invención.
La Figura 2 muestra la evaluación de las capacidades de secuencias de 16 residuos de aminoácido que forman EV2038 CDR-H3 para unir a AD1, cuando se somete a sustituciones de aminoácido no conservadoras.
La Figura 3 muestra la evaluación de las capacidades de la secuencia para unir a AD1, cuando se somete a sustituciones de aminoácido conservadoras en las posiciones 121, 123, 124 y 126 de la cadena H EV2038.
La Figura 4 muestra la evaluación de las capacidades de la secuencia para enlazar a AD1 cuando la prolina en la posición 125 de la cadena H EV2038 se sustituye con todos los aminoácidos diferente de la prolina y arginina.
La Figura 5 muestra la evaluación de las capacidades de la secuencia para enlazar a AD1 cuando se somete a sustituciones del aminoácido conservadoras de los residuos de aminoácido entre los aminoácidos que forman EV2038 CDR-H3 cuyas capacidades de enlace a AD1 no disminuyeron cuando se someten las sustituciones del aminoácido no conservadoras mostradas en la Figura 2.
La Figura 6 muestra la evaluación de las capacidades de enlace de variantes a AD1. Un total de cuatro tipos de variantes se prepararon por dos o cuatro sustituciones simultáneamente de los residuos de aminoácido que mostraron reducir las capacidades de enlace a AD1 sobre las sustituciones del aminoácido no conservadoras entre los aminoácidos que formaron EV2038 CDR-H3 diferente de la prolina en la posición 125 (a saber, el total de cuatro residuos en las posiciones 121, 123, 124 y 126) (productos de dos-aminoácido-sustituidos: I124V/G126A e 1124V/G126S, productos de cuatro-aminoácido-sustituidos: L121I/W123Y/I124V/G126A y L1211/W123Y/1124V/G126S).
La Figura 7 muestra la evaluación de las capacidades de enlace de variantes a AD1. Una de cada una de las variantes de eliminación e inserción (E122del y G126_D127insE) para los residuos de aminoácido en las posiciones 121, 123, 124 y 126 (prolina en la posición 125 se excluyó), es decir, cuatro residuos en total, en los aminoácidos que forman EV2038 CDR-H3, la sustitución del aminoácido no conservadora que mostró las capacidades de enlace reducidas a AD1, se prepararon y sometieron a la evaluación.
La Figura 8 muestra la evaluación de la capacidad de enlace a AD1 de un variable que tiene mutación en el 79vo residuo del aminoácido de región EV2038 CDR-H2.
Figura 9(A) muestra una vista de clones de mutantes de región suprimida de glicoproteína gB AD1 usados para analizar regiones de epítopo, mientras que la Figura 9(B) es una vista que muestra los resultados del análisis Western blot utilizando estos mutantes de eliminación.
La Figura 10(A) muestra los resultados del mapeado de epítopo de EV2038 utilizando un arreglo de péptido. La Figura 10(B) muestra los resultados anteriormente mencionados del análisis junto con la secuencia de aminoácido de la glicoproteína gB, así como los resultados de un análisis que utiliza el mutante de eliminación de EV2038 y la secuencia del epítopo previamente reportada de ITC52.
La Figura 11 es una gráfica que muestra los resultados para evaluar la actividad neutralizante de un anticuerpo anti-HCMV de la presente invención. La Figura 11(A) es una gráfica que muestra las actividades neutralizantes de un anticuerpo monoclonal humano (hlgG) como un control negativo que no tiene ninguna especificidad a HCMV y EV2001 como un anticuerpo anti-AD1 (descrito en el Documento de Patente 5), contra citomegalovirus humano (cepa AD169) en presencia de un complemento; La Figura 11(B) es una gráfica que muestra las actividades neutralizantes de hlgG y los anticuerpos monoclonales antis-HCVM (EV2038 y HCMV16), contra el citomegalovirus humano (cepa AD169) en presencia de un complemento; La Figura 11(C) es una gráfica que muestra las actividades neutralizantes de hlgG como un control negativo y EV2001, contra el citomegalovirus humano (cepa AD169) en ausencia de un complemento; y La Figura 11(D) muestra las actividades neutralizantes de hlgG y los anticuerpos monoclonales antis-HCMV (EV2038 y HCMV16), contra el citomegalovirus humano (cepa AD169) en ausencia de un complemento.
Descripción Detallada de la Invención 1. Anticuerpo o Fragmento de unión a antíqeno del mismo de acuerdo con la presente invención De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente a la glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV) y que es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma. De acuerdo con una modalidad más específica, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente a un epítopo discontinuo presente en la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV y que es capaz de neutralizar la bioactividad de la proteína.
La "glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV)" (o "glicoproteína gB de HCMV" o "HCMV-glicoproteína gB") es una de las glicoproteínas principales que forman la cubierta de HCMV, que es conocida para contribuir con la liberación de partículas virales en las células, la fusión celular y la infección de célula a célula por un virus. La secuencia de aminoácido de la glicoproteína gB de HCMV (secuencia de aminoácido de la cepa AD169 como una cepa representativa del virus de HCMV) está disponible como la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 137) de la proteína de Acceso No: P06473 de una base de datos de secuencia disponible al público (Suizo-Prot).
"La región AD1 de la glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV)" o "región de glicoproteína gBAD1 de HCMV" se refiere a una región que consiste de residuos de aminoácido continuos en las posiciones 552-635 de la secuencia de aminoácido de la glicoproteína gB (Wagner y colaboradores, Journal of Virology, Vol. 66, No. 9, Sept. 1992, páginas 5290-5297.
En la presente, el término "epítopo" se utiliza en un significado general en el campo de la técnica y se refiere a una pequeña estructura parcial de una molécula del antígeno como un asociado de unión de un anticuerpo (Iwanami Biological Dictionary, 4a Ed. (1a Ed. publicado en 1996)).
De acuerdo con una modalidad aún más específica de la invención, un epítopo discontinuo presente en la región AD1 existe en la secuencia de aminoácido de residuos de aminoácido continuos en las posiciones 549-580 (SEC ID NO: 23) y la secuencia de aminoácido de residuos de aminoácido continuos en las posiciones 596-640 (SEC ID NO: 24) de la glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV). Aún más específicamente, el epítopo discontinuo consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26 y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27.
De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo la presente invención incluye: (a) una cadena pesada (cadena H) que contiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6; y (b) una cadena ligera (cadena L) que contiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno une específicamente a la glicoproteína gB del citomegalovirus humano y es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma.
Alternativamente, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención incluye: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que contiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que contiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12, donde une específicamente a la glicoproteína gB del citomegalovirus humano y es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma.
Alternativamente, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la presente invención une específicamente a la glicoproteína gB del citomegalovirus humano y es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma, donde (i) las secuencias de aminoácido de CDR (Región Determinante de la Complementariedad) 1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada incluyen: (a) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13; (b) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, respectivamente, y (ii) las secuencias de aminoácido de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera incluyen: (a) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16; (b) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18, respectivamente.
Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo también comprende un equivalente funcional del anticuerpo descrito antes o fragmento de unión a antígeno, que une específicamente a la glicoproteína gB del citomegalovirus humano y es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma. Éstos incluyen, por ejemplo: (a) una cadena pesada (cadena H) mostrada por una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6; y (b) una cadena ligera (cadena L) mostrada por una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8.
Alternativamente, un equivalente funcional del anticuerpo descrito antes o fragmento de unión a antígeno también incluye: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12.
Alternativamente, un equivalente funcional del anticuerpo descrito antes o fragmento de unión a antígeno incluye además: (i) (a) CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consisten de secuencias de aminoácido que tienen eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13, (b) CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido que tienen eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14, y (c) CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido que tienen eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22; y (ü) (a) CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido que tienen eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16, (b) CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consisten de secuencias de aminoácido que tienen eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17, (c) CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consisten de secuencias de aminoácido que tienen eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de cualquiera de estas mutaciones para uno a varios residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18.
El límite superior del número de mutaciones contenido en la secuencia de aminoácido del equivalente funcional descrito antes puede determinarse basado en si el equivalente puede enlazar específicamente a la glicoproteína gB de HCMV y es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma. La actividad neutralizante de HCMV puede evaluarse, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 9 y 10 más adelante. La capacidad para bloquear la infección de célula a célula puede evaluarse de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo 11 más adelante.
El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste de cuatro cadenas de polipéptido, es decir, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), que están conectadas mutuamente vía enlaces de disulfuro. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención también consiste de una molécula de inmunoglobulina que contiene dos de cada una de las cadenas ligeras (cadenas L) y cadenas pesadas (cadenas H). Cada una de las cadena Hs consiste de una región variable de cadena H (referida ocasionalmente como "HCVR" o "VH") y una región constante de cadena H (región constante de cadena H consiste de tres dominios, que pueden referirse ocasionalmente como "CH1", "CH2" y "CH3" (colectivamente llamada CH)). Cada una de la cadena L consiste de una región variable de cadena L (referida ocasionalmente como "LCVR" o "VL") y una región constante de cadena L (región constante de cadena L consiste de un solo dominio, que puede referirse ocasionalmente como "CL").
En particular, HCVR y LCVR son importantes en que son responsables de la especificidad de unión de un anticuerpo. Puesto que un anticuerpo interactúa con un antígeno objetivo principalmente vía los residuos de aminoácido de LCVR y HCVR, la secuencia de aminoácido dentro de la región variable varía mayormente entre varios anticuerpos que la secuencia produce de la región variable. HCVR y LCVR pueden clasificarse además en una región llamada región de marco (FR) y una región hipervariable llamada región que determina la complementariedad (CDR), que son más constantes entre varios anticuerpos. HCVR y LCVR cada uno consisten de tres CDRs y cuatro FRs, que se alinean secuencialmente en orden de FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 del término amino al término carboxi.
El término "fragmento de unión a antígeno" (o simplemente "fragmento de anticuerpo") de un anticuerpo se refiere a un fragmento de uno o más anticuerpos capaces específicamente de enlazar a un antígeno (por ejemplo, HCMV). En este caso, este fragmento debe contener un péptido que tiene una secuencia de aminoácido mínima que une específicamente al antígeno. Además, un anticuerpo de una sola hebra (scFV), un antígeno biespecífico, un antígeno poliespecífico y similares que tiene la región variable o la complementariedad que determina la región del anticuerpo que une específicamente al antígeno también se incluyen en "fragmentos de unión a antígeno". En la presente, en aras de simplicidad, "un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno" puede referirse simplemente como un "anticuerpo".
Un "anticuerpo capaz de neutralizar la bioactividad de HCMV" se refiere a un anticuerpo que inhiba la bioactividad de HCMV uniendo a HCMV o a una célula infectada por HCMV.
La "bioactividad de HCMV" general incluye, pero no se limita a, actividades de HCMV que causan las siguientes enfermedades (a)-(e) ejemplificadas más adelante, e incluye actividades de HCMV que inducen a varias enfermedades causadas por la acción del HCMV activado: (a) varias enfermedades tal como pulmonía, retinitis, gastroenteritis o encefalitis intersticial causada por la reactivación de HCMV en un estado de inmunodeficiencia tal como SIDA, cáncer, después del trasplante de órganos, después del trasplante de médula ósea o después de hemodiálisis; (b) infección por CMV congénita debido a la transmisión de infección por HCMV de una mujer embarazada a un feto; (c) aborto espontáneo, muerte del feto o muerte poco después de nacer causada por la infección por CMV congénita descrita antes; (d) bajo peso al nacer, hepatoesplenomegalia , ictericia , púrpura trombocitopénica, microcefalia, trastorno del desarrollo mental , retraso del desarrollo intelectual , coriorretinitis o deterioro de o ído en el caso de su pervivencia a través de la infección por CMV congénita descrita antes; o (e) anormalidad de la función hepática , pulmon ía intersticial o mononucleosis que es causada debido a la infección por HCMV en bebés o i nfantes ( Documentos no relacionados con patente 3, 4 y 5).
El término "enfermedad causada por HCMV" como se uti liza en la presente incluye, así como otras enfermedades, una enfermedad que se encuentra por ser o que parece ser causada debido a que un sujeto objetivo que sufre de tal enfermedad tiene HCMV como la causa de las condiciones patológicas de esta enfermedad o como una causa de empeorar esta enfermedad . Por lo tanto , las enfermedades causadas por bioactividad de HCMV son aquellas cuyos síntomas y/o progresiones se espera sean aliviadas por la inhibición de la bioactividad de HCMV. Los síntomas de tales enfermedades pueden aliviarse o tratarse, por ejem plo , utilizando el anticuerpo anti-HCMV descrito antes. Específicamente , la enfermedad mencionada anteriormente puede preveni rse i ncrementando el nivel del anticuerpo anti-H CMV en el fluido biológico del sujeto objetivo que sufre de esta enfermed ad (por ejemplo, incrementando el nivel del anticuerpo anti-HCMV en el suero, plasma o fluido sinovial de sujeto objetivo).
Los términos tal como "efecto inhibidor", "inhibición", "supresión" y "capaz de inhibir" como se utiliza en la presente se refieren para reducir la bioactividad que resulta del antígeno (HCMV) por aproximadamente 5-100%, preferiblemente 10-100%, más preferiblemente 20-100%, más preferiblemente 30-100%, más preferiblemente 40-100%, más preferiblemente 50-100%, más preferiblemente 60-100%, más preferiblemente 70-100% y aún más preferiblemente 80-100%.
Puesto que la secuencia de aminoácido de la región variable es responsable la mayor parte de la interacción del anticuerpo-antígeno, un anticuerpo recombinante que repliega una característica de un anticuerpo que ocurre naturalmente particular puede expresarse construyendo un vector de expresión que contenga una secuencia de la región variable o una secuencia de la porción de CDR derivada del anticuerpo que ocurre naturalmente particular, injertado a una región constante o una secuencia de marco derivada de un diferente anticuerpo que tiene una diferente característica.
Por consiguiente, para rehacer un anticuerpo recombinante intacto que tiene la misma característica de unión como el del anticuerpo original, no hay necesidad de obtener la secuencia entera del anticuerpo particular. La secuencia de la región variable o la porción de CDR de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo puede ser suficiente para este fin.
Las SECS ID NOS: 13, 14 y 15 representan secuencias de aminoácido que corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, respectivamente. Las SECS ID NOS: 16, 17 y 18 son secuencias de aminoácido que corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera, respectivamente. Por lo tanto, un anticuerpo preferible de la presente invención tiene CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que corresponde a las SECS ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17 y 18, respectivamente. Sin embargo, CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera pueden no corresponder necesariamente a las SECS ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17 y 18, respectivamente, siempre y cuando el anticuerpo monoclonal una específicamente a HCMV y sea capaz de neutralizar la bioactividad del mismo. CDR-3 de la cadena pesada, particularmente, puede ser una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22. Por otra parte, la secuencia de CDR puede ser una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para una a varios (específicamente, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ó 1) residuos de aminoácido en una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácido de las SECS ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17 y 18, siempre y cuando tenga la actividad neutralizante descrita antes.
La secuencia de aminoácido diferente de CDR no está particularmente limitada, y un anticuerpo de inserción de CDR así llamado en el cual la secuencia de aminoácidos que no sea CDR se deriva de otro anticuerpo, particularmente, un anticuerpo de otra especie, también está comprendido por la presente invención. La secuencia de aminoácido diferente de CDR es preferiblemente un anticuerpo derivado de humano, pero si es necesario, la región de marco (FR) puede incluir eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios (número específico que es el mismo como se mencionó anteriormente) residuos de aminoácido. Tales anticuerpos pueden prepararse de acuerdo con un método conocido (Riechmann L, y colaboradores, Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 332:323-327, 1988). De acuerdo con la presente invención, un anticuerpo humano completo, por supuesto, es favorable.
La eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno o más residuos de aminoácido en una secuencia de aminoácido de una proteína de la presente invención significa que la eliminación, sustitución, inserción y adición de uno o varios residuos de aminoácido están presentes en cualquiera de una o más posiciones de la misma secuencia de aminoácido, donde dos o más de la eliminación, sustitución, inserción y adición pueden ocurrir simultáneamente.
Los aminoácidos que forman las proteínas que ocurren naturalmente pueden clasificarse de acuerdo con las propiedades de sus cadenas laterales. Por ejemplo, los ejemplos de los grupos del aminoácido que tienen propiedades similares incluyen aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano), aminoácidos básicos (lisina, arginina, histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico, ácido glutámico), aminoácidos neutrales (serina, treonina, asparagina, glutamina), aminoácidos que tienen una cadena de hidrocarburo (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina) y otros (glicina, metionina, cisteína).
Los residuos de aminoácido mutuamente reemplazables que incluyen aminoácidos no nativos pueden también clasificarse, por ejemplo, como sigue, donde los residuos de aminoácido en el mismo grupo pueden ser mutuamente reemplazables entres sí. Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanino, ácido 2-aminobutanoico, metionina, o-metillserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina; Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminosubérico; Grupo C: asparagina, glutamina; Grupo D: lisina, arginina, ornitina, 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropionico; Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina; Grupo F: serina, treonina, homoserina; y grupo G: fenilalanina, tirosina, triptófano.
De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos más preferibles incluyen (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) mostrada por: la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios (específicamente, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ó 1) residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; o una secuencia de aminoácido que tiene identidad del 95% o mayor (preferiblemente, 96% o mayor, 97% o mayor, 98% o mayor, 99% o mayor o 99.5% o mayor) con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, y (b) una región variable de cadena ligera mostrada por: la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12; una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones de uno a varios (número específico que es el mismo como se menciona anteriormente) residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12; o una secuencia de aminoácido que tiene identidad del 95% o mayor (porcentaje específico que es el mismo como se menciona anteriormente) con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12.
En este caso, la identidad de una secuencia de aminoácido o una secuencia de nucleotido puede determinarse utilizando el algoritmo de BLAST por Karlin y Altschul (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Nati Acad Sci USA 90: 5873, 1993). Los programas llamados BLASTN y BLASTX se han desarrollado basados en el algoritmo de BLAST (Altschul SF, y colaboradores: J Mol Biol 215: 403, 1990). Para analizar una secuencia de nucleótido utilizando BLASTN, los parámetros se determinan, por ejemplo, para conteo = 100 y longitud de palabra = 12. Para analizar una secuencia de aminoácido utilizando BLASTX, los parámetros se determinan, por ejemplo, para conteo = 50 y largo de expresión = 3. En el caso de utilizar BLAST y los programas Gapped BLAST, los parámetros de defecto para cada programa se utilizan.
De acuerdo con la presente invención, aún el anticuerpo más preferible incluye (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10 y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12.
De acuerdo con la presente invención, aún el anticuerpo más preferible incluye (a) una cadena pesada (cadena H) mostrada por: la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6; una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios (número específico que es el mismo como se menciona anteriormente) residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6; o una secuencia de aminoácido que tiene identidad del 95% o mayor (porcentaje específico que es el mismo como se menciona anteriormente) con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6, y (b) una cadena ligera (cadena L) mostrada por: la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8; una secuencia de aminoácido que tiene eliminación, sustitución, inserción, adición o una combinación de dos o más de estas mutaciones para uno a varios (número específico que es el mismo como se menciona anteriormente) residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8; o una secuencia de aminoácido que tiene identidad del 95% o mayor (porcentaje específico que es el mismo como se menciona anteriormente) con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8.
El anticuerpo más preferible de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano completo que incluye una cadena pesada (cadena H) representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6 y una cadena ligera (cadena L) representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8. Por otra parte, la clase (subclase) de un anticuerpo preferible de la invención es I gG 1 (?).
El anticuerpo anti-HCMV descrito antes o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención une específicamente a HCMV causante de varias enfermedades, neutraliza la bioactividad del mismo, y tiene capacidad neutralizante mucho mayor que el de un anticuerpo anti-HCMV convencional.
La frase "específicamente unido a" como se utiliza en la presente significa que reconoce y une a un antígeno predeterminado.
Normalmente, una disociación constante (valor Kd) entre HCMV (especialmente, HCMV humano) y un anticuerpo de la invención es preferiblemente 1 x 10"7M o menos, más preferiblemente 1 x 10"8M o menos, aún más preferiblemente 1 x 10"9M o menos, y más preferiblemente 1 x 10"10M o menos. Una disociación constante entre un anticuerpo y un HCMV puede determinarse de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, un anticuerpo anti-HCMV inmovilizado en una pieza puede utilizarse para determinación utilizando un analizador de interacción de proteína tal como BIACORET100 (marca registrada).
La capacidad neutralizante de un anticuerpo anti-HCMV puede evaluarse determinando una velocidad de bloqueo de infección o una velocidad de bloqueo de formación de placas mediante inmunomanchado. Específicamente, una cepa de HCMV normal tal como la cepa AD169 y al cepa de Towne se lleva en contacto con varios niveles de anticuerpos antis-HCMV por un tiempo predeterminado antes de inocularlo en un sistema de cultivo celular infectable. Posteriormente, se inoculan en células. Veinticuatro horas después de la infección, el número de células infectadas por HCMV puede contarse mediante inmunomanchado para determinar la velocidad de bloqueo de infección, o el número de placas formado 5-6 días después de la infección puede contarse para determinar la velocidad de bloqueo del mismo, de tal modo determinando la actividad neutralizante del anticuerpo anti-HCMV.
Un anticuerpo anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención tiene aproximadamente 50% de capacidad de bloqueo de formación de placas, es decir, una actividad neutralizante contra la cepa AD169, preferiblemente en 1 g/ml (aproximadamente 7 nM) o menor, preferiblemente en 0.1 pg/ml (aproximadamente 0.7 nM) o menor, aún más preferiblemente en 0.05 pg/ml (aproximadamente 0.3 nM) o menor y más preferiblemente de manera aproximada en 0.03 Mg/ml (aproximadamente 0.2 nM) o menor.
Además, como una capacidad de bloqueo de infección de célula a célula, un efecto inhibidor para la infección de célula a célula puede evaluarse cultivando una célula Infectada por HCMV por un tiempo predeterminado y después agregando varios niveles de anticuerpos antis-HCMV a este sistema de cultivo celular.
Un anticuerpo anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención tiene 50% o mayor de capacidad de bloque de infección de célula a célula en una concentración final de preferiblemente 2 pg/ml (aproximadamente 13 nM) o menor, preferiblemente 0.5 pg/ml (aproximadamente 3 nM) o menor, y aún más preferiblemente 0.2 pg/ml (aproximadamente 0.13 nM) o menor.
Un anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano recombinante, un anticuerpo monoclonal (incluyendo anticuerpo quimérico y anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo que puede unir específicamente a HC V y es capaz de neutralizar la bioactividad del mismo, que puede obtenerse de acuerdo con una técnica bien conocida en la técnica basada en un anticuerpo de longitud completa, un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una secuencia de aminoácido de una región variable de la SEC ID NO: 6, 8, 10 ó 12, y una secuencia de aminoácido de una región determinante de complementariedad (CDR) representada por cualquiera de la SEC ID NO: 13-18. Estos anticuerpos caen dentro del alcance técnico de la presente invención.
Por ejemplo, las secuencias de señal de cadenas pesada y ligera se dividen en el curso de la maduración de proteína, y no contribuyen así a la propiedad del anticuerpo final. Para agregar la secuencia faltante, una secuencia de ADNc clonada puede combinarse con un oligonucleótido sintético por ligadura o amplificación de PCR.
Alternativamente, la región variable entera puede sintetizarse combinando un conjunto de oligonucleótidos traslapados cortos mediante amplificación de PCR, de tal modo preparando un clon totalmente artificial de la región variable. 2. Codificación del ácido nucleico para el anticuerpo o similares de la presente invención De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un a ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo monoclonal anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente a HCMV y que es capaz de neutralizar la bioactividad del mismo, donde el ácido nucleico se selecciona de ácidos nucleicos que se codifican para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SECS DI NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 y 22 y ácidos nucleicos que se hibridizan con estos ácidos nucleicos bajo condiciones altamente rigurosas.
Preferiblemente, el ácido nucleico descrito antes es ADN o ARN, y más preferiblemente ADN.
Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo monoclonal anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une a HCMV y que es capaz de neutralizar la bioactividad del mismo, que tiene alta identidad con un ácido nucleico que se codifica para una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 y 22 también se comprende por la presente invención. La frase "que tiene alta identidad" como se utiliza en la presente se refiere a la identidad de secuencia que es suficiente para hibridizar a una secuencia del ácido nucleico predeterminada bajo condiciones altamente rigurosas, significa, por ejemplo, identidad del 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o mayor.
"Condiciones altamente rigurosas", significa por ejemplo, condiciones de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, 0.5% de SDS y 50% de formamida a 50°C (ver, por ejemplo, J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Bajo estas condiciones, se espera una temperatura mayor para dar eficientemente un polinucleótido (por ejemplo, ADN) con una mayor identidad. Ahí, sin embargo, parece haber factores múltiples que influyen en la severidad de la hibridación tal como temperatura, concentración de prueba, longitud de prueba, fuerza iónica, tiempo y concentración de sal, y los expertos en la técnica deben poder seleccionar apropiadamente estos factores para realizar la severidad similar.
Los ejemplos de los ácidos nucleicos sometidos a hibridación bajo las condiciones altamente rigurosas descritas antes incluyen ácidos nucleicos que tienen identidad de, por ejemplo, 70% o mayor, 80% o mayor, 90% o mayor, 95% o mayor, 97% o mayor o 99% o mayor a un ácido nucleico que se codifica para una secuencia de aminoácido de las SECS ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 y 22.
La identidad de una secuencia de nucleótido puede determinarse utilizando el algoritmo de búsqueda de identidad descrito antes (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Nati Acad Sci USA 90: 5873, 1993).
Un ácido nucleico preferible de acuerdo con la presente invención es ADN que se codifica para ambas secuencias de aminoácido de las SECS ID NOS: 10 y 12, y más preferiblemente ADN que se codifica para ambas secuencias de aminoácido de las SECS ID NOS: 6 y 8. Un ácido nucleico aún más preferible es ADN que se codifica para ambas secuencias de aminoácido de las SECS ID NOS: 2 y 4.
Un ácido nucleico todavía más preferible es un ácido nucleico que contiene ambos ácidos nucleicos de las SECS ID NOS: 5 y 7, y un ácido nucleico todavía aún más preferible es ácido nucleico que contiene ambos ácidos nucleicos de las SECS ID NOS: 1 y 3. 3. Vector, célula hospedadora v método para preparar el anticuerpo de la invención La presente invención también se relaciona con un vector que incorpora el ácido nucleico descrito antes, una célula hospedadora introducida con el vector, y un método para preparar un anticuerpo utilizando el mismo.
Un anticuerpo de la presente invención puede también prepararse como anticuerpo humano recombinante de acuerdo con un método conocido (ver Nature, 312:643, 1984, Nature, 321:522, 1986, etc.). Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención puede prepararse cultivando una célula hospedadora introducida con un vector de la invención, y purificando el anticuerpo producido del sobrenadante de cultivo o similares. Más específicamente, un anticuerpo puede prepararse insertando ADNcs que se codifican para VH y VL en los vectores de expresión de células animales que contienen genes que se codifican para el CH de anticuerpo humano y/o CL de anticuerpo humano preparado de la misma célula o diferentes células humanas para construir un vector de expresión de anticuerpo humano y que introducen el vector en una célula animal para expresión.
Los vectores en los cuales los ácidos nucleicos que se codifican para VH o Vu del anticuerpo de la presente invención se incorporan no son necesariamente limitados, sino ellos son vectores preferiblemente de manera general utilizados para la expresión de un gene de proteína o similares, y particularmente un vector o un vector de alta expresión que sea adecuado para la expresión de un gene de anticuerpo. Los ejemplos preferibles incluyen vectores que contienen un promotor de EF y/o un mejorador de CMV. En general, la expresión vectores de cada incorporación de un ácido nucleico que se codifica para VH o VL se prepara y utiliza para cotransfectar una célula hospedadora, pero los ácidos nucleicos pueden también incorporarse en un solo vector de expresión.
La célula hospedadora para introducir el vector de expresión no está necesariamente limitada, sino que es preferiblemente una célula que se utiliza generalmente para la expresión de un gen de proteína o similares, y particularmente una célula que es adecuada para la expresión de un gen de anticuerpo. Los ejemplos incluyen una bacteria (E.coli, etc.), actinomicetos, levadura, célula de insecto (SF9, etc.), y una célula de mamífero (COS-1, CHO, célula de mieloma o similares).
Para producir industrialmente un anticuerpo recombinante, una cepa de célula animal recombinante tal como cepa de célula CHO que es alta y establemente productiva del anticuerpo se utiliza generalmente. Los métodos de amplificación y selección de gen conocidos pueden utilizarse para preparación, clonación y alta expresión de una cepa de célula recombinante (por ejemplo, ver Omasa T.: J. Biosci. Bioeng., 94, 600-605, 2002, etc.).
Con excepción de un anticuerpo que consiste de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, la presente invención también comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab (fragmento de unión a antígeno), Fab' y F(ab')2. Los ejemplos de éstos obtenidos ligando los fragmentos activos del anticuerpo vía un enlazador o similares incluyen un anticuerpo de cadena sencilla (Fv de cadena sencilla: scFv) y un anticuerpo estabilizador de disulfuro (Fv estabilizador de disulfuro: dsFv). Un ejemplo de un péptido que contiene un fragmento activo del anticuerpo incluye un péptido que contiene CDR. Éstos pueden producirse de acuerdo con un método conocido tal como un método en el cual el anticuerpo de la presente invención se trata con una enzima proteolítica apropiada o una técnica de recombinación de gen.
La purificación del anticuerpo puede realizarse utilizando una técnica de purificación conocida tal como método de salinización, filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad.
Además, los genes VH y VL pueden separarse artificialmente para expresar un anticuerpo de scFv diversificado (Fragmento de cadena sencilla de región variable) como una proteína de fusión de fago por una técnica de anticuerpo de exhibición de fago desarrollada recientemente en la cual un anticuerpo recombinante es expresado en una superficie de fago por una técnica de ingeniería genética, de tal modo obteniendo un anticuerpo específico. Esta técnica es muy apreciada por ser capaz de escapar del sistema inmune y además como una técnica para preparar un anticuerpo humanizado como una alternativa al método de fusión celular. Un anticuerpo específico o un fragmento de unión a antígeno del mismo preparado utilizando esta técnica con respecto a la secuencia de aminoácido de las SECS ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 y 22 en la presente pertenece al alcance técnico de la presente invención.
Por otra parte, un anticuerpo obtenido aplicando la técnica de Potelligent recientemente desarrollada en la cual la actividad de ADCC de un anticuerpo es mejorada enormemente modificando la porción de la cadena de azúcar del anticuerpo puede aplicarse a un anticuerpo de la presente invención (ver Niwa R., y colaboradores, Clin. Cáncer Res., 10,6248-6255 (2004)) y un anticuerpo obtenido aplicando la técnica de Complegnent que mejora la actividad de CDC a un anticuerpo de la presente invención (ver Kanda S., y colaboradores, Glycobiology, 17, 104- 1 1 8 (2007)) también cae dentro del alcance técnico de la presente invención .
Un anticuerpo es preparado general mente obteniendo un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal que utiliza un animal experi mental tal como un ratón , conejo , cabra o si milares . Puesto que tal anticuerpo tiene una secuencia que es característica de la especie de animal usada, se reconocerá como una sustancia extranjera por el sistema i nmune humano si se ad mi nistra di rectamente, que puede dar lugar a la respuesta del anticuerpo anti-an imal humano (en otras palabras, un anticuerpo se produce contra un anticuerpo).
Un anticuerpo monoclonal anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención puede obtenerse de una célula que produce anticuerpos derivada de sangre de un humano sano , que es un anticuerpo humano completo . Cuando este anticuerpo humano completo se administra a un humano como un fármaco de anticuerpo , no tiene ninguna inmunogenicidad y no debe mostrar así ninguna in munorespuesta.
Puesto que un anticuerpo monoclonal anti-HCMV de la presente invención tiene una capacidad neutralizante mayor que la de un anticuerpo monoclonal anti-HCMV convencional , un nivel si milar del efecto terapéutico puede esperarse con menos dosificación .
Más adelante, un procedi miento para obtener u n anticuerpo monoclonal anti-HCMV y un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente i nvención será descrito, pero un procedimiento para obtener un anticuerpo o similares de la presente invención no debe limitarse a estas descri pciones y es evidente que cualquier modificación que se conduzca generalmente en la técnica puede realizarse.
U n anticuerpo monoclonal anti-HCMV y un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse por: separar un clon de cél ula que prod uce el anticuerpo de sangre de un humano sano a través de varias etapas; recolectar el anticuerpo del sobrenadante de cultivo del clon de cél ula que produce anticuerpos; y realizar la purificación de afinidad al anticuerpo obtenido . 1 ) Separación del clon de célula que produce el anticuerpo humano completo contra HCMV El li nfocito B se separa de la sangre humana sana para i nducir la proliferación del l infocito B . Un método para ind uci r la proliferación se conoce per se , y puede realizarse, por ejemplo , por un método de transformación utilizando el "vi rus de Epstei n-Barr (virus del EB)" (más adelante, referido como EBV) como u n factor ind uctor de cáncer ( D . Kozbor y colaboradores).
Específicamente, el linfocito B anteriormente mencionado se infecta con EBV para ind ucir la proliferación , y las células prol iferadas se utilizan como una biblioteca de cél ula que prod uce anticuerpos. 2) Recolección de anticuerpo monoclonal de la biblioteca de célula que produce anticuerpos U n anticuerpo monoclonal puede recolectarse de células inducidas por proliferación de acuerdo con un método bien conocido de uso general para la preparación de un anticuerpo monoclonal .
De la bi blioteca de célula que produce anticuerpos descrita antes, un clon de linfocito que produce un anticuerpo q ue une a HCMV es clasificado , y eliminado el anticuerpo del sobrenadante de cultivo del mismo . Específicamente, u na población cel ular (clones) que produce un anticuerpo de unión a HCMV es seleccionada de la biblioteca de célula que produce anticuerpos descrita antes l i mitando un método de dilución .
Para detectar un clon que une a HCMV, a EL ISA uti liza un antígeno derivado de HCMV y un anticuerpo de IgG anti-hu mano de ratón etiquetado se utiliza preferiblemente .
Repitiendo el cultivo y análisis de la población cel ular de anticuerpo positiva seleccionada , una población celular (clones) que prod uce solamente el anticuerpo de i nterés puede obtenerse .
U n diagrama de flujo que i ndica las etapas hasta la separación de un clon de una célula que produce anticuerpos se muestra en la Figura 1 . 3) Pu rificación de afinidad util izando la Proteína A o G Para purificar el anticuerpo anti-HCMV, la clasificación de célula puede proliferarse en una botel la con rodillo, un matraz de 2 I Spinner, u otro sistema de cultivo.
El sobrenadante de cultivo resultante se filtró para concentrarse y después se sometió a cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G-sefarosa (GE Healthcare) o similares, de tal modo purificando la proteína. El amortiguador puede sustituirse por PBS para determinar la concentración por OD2eo o preferiblemente por análisis con nefelómetro.
El isotipo puede examinarse por un método específico al antígeno de isotipo.
Puesto que el anticuerpo anti-HCMV así obtenido es un anticuerpo humano completo preparado de un linfocito B sensibilizado en un cuerpo humano, la posibilidad de provocar la inmunorespuesta contra el anticuerpo es baja.
Esta preparación de un clon de célula que produce anticuerpos también es caracterizada por el uso del virus del EB que es activo en infectar e inducir la proliferación del linfocito B.
Las ventajas del método del virus del EB son que un anticuerpo natura hecho en el cuerpo humano puede prepararse y que un anticuerpo con alta afinidad puede obtenerse. Por ejemplo, un anticuerpo humano contra HCMV se encuentra por tener una afinidad que es aproximadamente 10-100 veces mayor que el de un anticuerpo hecho por inmunizando artificialmente un ratón.
Una población de linfocito B proliferada por infección del virus del EB puede ser una biblioteca de células que produce anticuerpos.
U n clon de cél ula que prod uce anticuerpos específicos puede separase de esta biblioteca para obtener un anticuerpo humano . 4. Composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de la invención Después , la presente invención proporciona una composición farmacéutica para preveni r o tratar u na enfermedad asociada con el citomegalovi rus humano (HCMV), que comprende el anticuerpo descrito antes o un sitio de unión a antígeno del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable .
Puesto que un anticuerpo anti-HCMV o u n fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente i nvención tiene mayor capacidad de neutralización contra H CMV que el de u n anticuerpo anti-HCMV convencional , es útil como un fármaco profi láctico o terapéutico para una enfermedad relacionada con HCMV (varias enfermedades causadas por HCMV). U na enfermedad causada por HCMV es una enfermedad cuyos síntomas y/o progresión se espera que sea aliviada por la inhibición de la actividad de H CMV.
El térmi no "enfermedad relacionada con HCMV" como se utiliza en la presente comprende , así como otras enfermedades, una enfermedad que se encuentre por ser o que parezca ser causada debido a que un sujeto objetivo que sufre de esta enfermedad tiene HCMV como la causa de las condiciones patológicas de esta enfermedad o como una causa de empeorar esta enfermedad. En otras palabras, puesto que un anticuerpo anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención tiene una alta capacidad neutralizante contra HCMV, puede esperarse como un fármaco profiláctico o terapéutico para varias enfermedades causadas por HCMV, por ejemplo: (a) enfermedades tal como pulmonía intersticial, retinitis, gastroenteritis, encefalitis y similares debido a la reactivación de HCMV en estados de inmunodeficiencia tal como SIDA, cáncer, después del trasplante de órganos, después del trasplante de médula ósea, después de hemodiálisis; (b) infección por CMV congénita debido a la transmisión de la infección por HCMV de una mujer embarazada a un feto; (c) aborto espontáneo, muerte del feto y muerte poco después de nacer causada por la infección por CMV congénita descrita antes; (d) bajo peso al nacer, hepatoesplenomegalia, ictericia, púrpura trombocitopénica, microcefalia, trastorno del desarrollo mental, retraso del desarrollo intelectual, coriorretinitis y deterioro de oído en el caso de la supervivencia con la infección por CMV congénita descrita antes; y (e) anormalidad de la función hepática, pulmonía intersticial y mononucleosis debido a la infección por HCMV en bebés o infantes (Documentos no relacionados con patente 3, 4 y 5).
Un "portador aceptable como un producto farmacéutico" utilizado en la presente comprende cualquiera fisiológicamente adaptable o cualquier solvente, medio de dispersión, recubrimiento, agente isotónico, retardador de absorción y similares.
Ejemplos de portadores aceptables como productos farmacéuticos incluyen uno o más, o una combinación de agua, solución salina, salina amortiguada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. Para el uso como un agente inyectable o similares, un regulador de pH o un agente isotónico, por ejemplo, azúcar o pohalcohol tal como manitol y sorbitol o cloruro sódico se contiene preferiblemente en la composición. Un portador aceptable como un producto farmacéutico puede contener además una pequeña cantidad de sustancia auxiliar para mejorar la propiedad conservadora o efectividad del anticuerpo o la porción de anticuerpo tal como un agente humectante, un emulsificador, un agente antiséptico, un amortiguador, un estabilizador o similares.
Puede hacerse una composición de la presente invención en varias formas de dosificación. Los ejemplos de tales composiciones incluyen formas de dosificación líquida, semisólida y sólida tal como una solución (por ejemplo, una solución inyectable e infusible), una dispersión, suspensión, tableta, cápsula, pastilla, pildora, polvo, liposoma, supositorio y similares. La forma preferible difiere dependiendo del modo de administración y tratamiento deseados aplicados. Una composición generalmente preferible es en una forma de solución inyectable o infusible tal como una composición similar a las usadas para inmunizar pasivamente a humanos con otro anticuerpo. Un modo de administración preferible es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal o intramuscular). De acuerdo con una modalidad preferible, el anticuerpo es administrado mediante infusión intravenosa o inyección intravenosa. De acuerdo con otra modalidad preferible, el anticuerpo es administrado mediante inyección intramuscular o inyección subcutánea.
Un anticuerpo y un fragmento del anticuerpo de acuerdo con la presente invención pueden incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. Cuando un solo tipo de anticuerpo o porción de anticuerpo se utiliza, se prepara preferiblemente como una formulación inyectable que contiene el anticuerpo por 0.1-250 mg/ml. Por una parte, cuando los tipos múltiples de anticuerpos se utilizan como una mezcla, se preparan preferiblemente como una formulación inyectable que contiene el anticuerpo por 0.001-100 mg/ml. La proporción de mezcla de los tipos múltiples de anticuerpos puede determinarse por consiguiente.
Una formulación inyectable puede ser un producto obtenido disolviendo el componente efectivo en un líquido o un producto liofilizado del componente efectivo, que se coloca en un pedernal o frasco oscuro, una ampolla o una jeringa prerellenada. El amortiguador puede ser L-histidina (1-50 mM) a pH 5.0-7.0 (óptimamente pH 6.0), y óptimamente 5-10 mM de L-histidina. Los ejemplos de otros almacenadores adecuados incluyen, pero no se limita a, succcinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Para alterar una presión osmótica de una solución en una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM en el caso de una forma de dosificación líquida), el cloruro sódico puede utilizarse. La forma de dosificación liofilizada puede contener un crioprotector, principalmente 0-10% (óptimamente 0.5-5.0%) de sucrosa. Otros crioprotectores apropiados incluyen manitol, trehalosa y lactosa. La forma de dosificación liofilizada puede contener, un relleno, principalmente 1-10% (óptimamente 2-4%) de manitol. Para ambas formas de dosificación líquidas y liofilizadas, un estabilizador, principalmente 1-50 mM (óptimamente 5-10 mM) de L-metionina, puede utilizarse. Otros estabilizadores apropiados incluyen glicina, arginina y polisorbato 80 y similares. En el caso del polisorbato 80, puede contenerse por 0-0.05% (óptimamente 0.005-0.01%). Otros tensioactivos incluyen, pero no se limita a, polisorbato 20 y el tensioactivo de BRIJ.
Esta composición farmacéutica debe generalmente ser estéril y establo bajo las condiciones de producción y almacenamiento. Esta composición puede formularse en otra estructura ordenada que es apropiada para una solución, microemulsión, dispersión, liposoma o alta concentración de fármaco. Una solución inyectable estéril puede prepararse mezclando una cantidad requerida del compuesto activo (es decir, el anticuerpo o la porción de anticuerpo) con un solvente apropiado, y en caso de ser necesario, con cualquiera de o en combinación con los componentes descritos antes, y después de someter el resultado a esterilización por filtración. En general, una dispersión es preparada mezclando el compuesto activo con un medio de dispersión básico y un vehículo estéril que contienen otros componentes necesarios seleccionados entre los componentes anteriormente mencionados. Un método preferible para preparar una formulación en polvo estéril usada para preparar una solución inyectable estéril comprende someter la solución filtrada estéril descrita anteriormente a secado por congelación al vacío y secado por aspersión, de tal modo obteniendo una composición que contiene cualquier otro componente deseado así como el polvo de componente activo. Una fluidez apropiada de la solución puede mantenerse utilizando, por ejemplo, a agente de recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión, o usando un tensioactivo. La absorción de larga duración de la composición inyectable puede observarse agregando un agente que pueda retrasar la absorción, por ejemplo, monoestearato o gelatina a la composición.
La composición farmacéutica de la invención puede también contener un compuesto activo complementario. De acuerdo con una modalidad, un anticuerpo o una porción del anticuerpo de la presente invención es formulada junto con uno o más otros fármacos terapéuticos que sean útiles para tratar una enfermedad causada por HCMV, o administrados con tal otro fármaco terapéutico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-HCMV o una porción del anticuerpo de la presente invención puede formularse junto con uno o más otros anticuerpos que une al otro objetivo (por ejemplo, un anticuerpo que une al otro sitio de unión de HCMV), o administrado simultáneamente con tal otro anticuerpo. Además, uno o más anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse combinando dos o más tipos de los fármacos terapéuticos descritos antes. Tal terapia combinada puede utilizar ventajosamente dosis bajas de los fármacos terapéuticos administrados y así la toxicidad posible o complicación asociada con varias terapias sencillas puede evitarse.
En este caso, las relaciones entre los nucleótidos o secuencias de aminoácido con los números de secuencia mencionados en la presente especificación son como sigue.
SEC ID NO: 1 representa una secuencia de nucleótido que se codifica para una cadena H de un anticuerpo contra la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV (más adelante, "anticuerpo anti-AD1") (EV2038) con una secuencia de señal.
SEC ID NO: 2 representa una secuencia de aminoácido de una cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) con una secuencia de señal.
SEC ID NO: 3 representa una secuencia de nucleótido que se codifica para una cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) con una secuencia de señal.
SEC ID NO: 4 representa una secuencia de aminoácido de una cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) con una secuencia de señal SEC ID NO: 5 representa una secuencia de nucleótido que se codifica para una cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) sin una secuencia de señal.
SEC ID NO: 6 representa una secuencia de aminoácido de una cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) sin una secuencia de señal.
SEC ID NO: 7 representa una secuencia de nucleótido que se codifica para una cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) sin una secuencia de señal.
SEC ID NO: 8 representa una secuencia de aminoácido de una cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) sin una secuencia de señal.
SEC ID NO: 9 representa una secuencia de nucleótido que se codifica para una región variable de cadena H del anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 10 representa una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 11 representa una secuencia de nucleótido que se codifica para una región variable de cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 12 representa una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 13 representa una secuencia de aminoácido de un CDR1 de cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 14 representa una secuencia de aminoácido de un CDR2 de cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 15 representa una secuencia de aminoácido de un CDR3 de cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 16 representa una secuencia de aminoácido de un CDR1 de cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 17 representa una secuencia de aminoácido de un CDR2 de cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 18 representa una secuencia de aminoácido de un CDR3 de cadena L de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038).
SEC ID NO: 19 representa una secuencia de nucleótido del cebador 38 Hind-S usado para producir una variante CDR-H3 de EV2038 en un ejemplo de trabajo.
SEC ID NO: 20 representa una secuencia de nucleótido del cebador 38 Not-A usado para producir una variante CDR-H3 de EV2038 en un ejemplo de trabajo.
SEC ID NO: 21 representa una secuencia de nucleótido de un cebador para verificar una secuencia de nucleótido usada para producir la variante CDR-H3 de EV2038 en un ejemplo de trabajo.
SEC ID NO: 22 representa una secuencia de aminoácido de consenso en la secuencia de aminoácido de CDR-H3 de un anticuerpo anti-AD1.
SEC ID NO: 23 representa una secuencia de aminoácido que tiene residuos de aminoácido en las posiciones 549-580 de la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV, que se ha identificado como una región existente en el epítopo por una técnica de mutación de eliminación descrita en el ejemplo.
SEC ID NO: 24 representa una secuencia de aminoácido que tiene residuos de aminoácido en las posiciones 596-640 de la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV, que se ha identificada como una región existente en el epítopo por una técnica de mutación de eliminación descrita en el ejemplo.
SEC ID NO: 25 representa una secuencia de aminoácido que tiene residuos de aminoácido en las posiciones 549-560 de la región AD1 de glicoproteína gB de HCMV, que ha sido identificada como una región del epítopo por una técnica de arreglo del péptido descrita en el ejemplo.
SEC ID NO: 26 representa una secuencia de aminoácido que tiene residuos de aminoácido en las posiciones 569-576 de la región AD1 de glicoproteína gB de HCMV, que ha sido identificada como una región del epítopo por una técnica de arreglo del péptido descrita en el ejemplo.
SEC ID NO: 27 representa una secuencia de aminoácido que tiene residuos de aminoácido en las posiciones 625-632 de la región AD1 de glicoproteína gB de HCMV, que ha sido identificada como una región del epítopo por una técnica de arreglo del péptido descrita en el ejemplo.
SEC ID NO: 28 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la valina (V) se ha sustituido con Usina (K) en la posición 117 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 29 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la treonina (T) se ha sustituido con triptófano (W) en la posición 118 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 30 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la arginina (R) se ha sustituido con valina (V) en la posición 119 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 31 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 120 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 32 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con ácido glutámico (E) en la posición 121 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 33 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido glutámico (E) se ha sustituido con leucina (L) en posición 122 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 34 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el triptófano (W) se ha sustituido con treonina (T) en la posición 123 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 35 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con ácido aspártico (D) en la posición 124 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 36 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con arginina (R) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 37 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la glicina (G) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 38 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 127 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 39 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la tirosina (y) se ha sustituido con asparagina (N) en la posición 128 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 40 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la tirosina (Y) se ha sustituido con asparagina (N) en la posición 129 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 41 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la metionina (M) se ha sustituido con glutamina (Q) en la posición 130 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 42 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 131 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 43 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la valina (V) se ha sustituido con Usina (K) en la posición 132 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 44 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 121 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 45 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con valina (V) en la posición 121 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 46 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 121 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 47 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 121 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 48 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con prolina (P) en la posición 121 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 49 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el triptofano (W) se ha sustituido con tirosina (Y) en la posición 123 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 50 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el triptofano (W) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 123 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 51 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el triptofano (W) se ha sustituido con prolina (P) en la posición 123 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 52 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el triptofano (W) se ha sustituido con leucina (L) en la posición 123 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención .
SEC ID NO: 53 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el triptofano (W) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 123 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 54 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con leucina (L) en la posición 124 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 55 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con metionina (M) en la posición 124 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 56 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con prolina (P) en la posición 124 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 57 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con valina (V) en la posición 124 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 58 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 124 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 59 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la glicina (G) se ha sustituido con prolina (P) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 60 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la glicina (G) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente Invención.
SEC ID NO: 61 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la glicina (G) se ha sustituido con serina (S) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 62 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la glicina (G) se ha sustituido con asparagina (N) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 63 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la glicina (G) se ha sustituido con treonina (T) en posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 64 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con glicina (G) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 65 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 66 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 67 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con leucina (L) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 68 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con valina (V) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 69 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con serina (S) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 70 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con treonina (T) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 71 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con asparagina (N) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 72 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con glutamina (Q) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 73 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con ácido aspártico (D) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 74 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con ácido glutámico (E) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 75 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con lisina (K) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 76 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con histidina (H) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 77 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con cisteína (C) en la posición en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 78 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con metionina (M) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 79 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con tirosina (Y) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 80 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con triptófano (W) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 81 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la prolina (P) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 125 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 82 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la valina (V) se ha sustituido con leucina (L) en la posición 117 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 83 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la valina (V) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 117 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 84 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la treonina (T) se ha sustituido con serina (S) en la posición 118 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 85 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la treonina (T) se ha sustituido con Usina (K) en la posición 118 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 86 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la arginina (R) se ha sustituido con Usina (K) en la posición 119 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 87 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la arginina (R) se ha sustituido con treonina (T) en la posición 119 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 88 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con ácido glutámico (E) en la posición 120 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 89 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 120 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 90 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido glutámico (E) se ha sustituido con ácido aspártico (D) en la posición 122 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 91 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido glutámico (E) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 122 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 92 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con ácido glutámico (E) en la posición 127 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 93 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 127 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 94 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la tirosina (Y) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 128 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 95 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la tirosina (Y) se ha sustituido con triptófano (W) en la posición 128 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 96 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la tirosina (Y) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 129 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 97 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la tirosina (Y) se ha sustituido con triptófano (W) en la posición 129 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 98 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la metionina (M) se ha sustituido con fenilalanina (F) en la posición 130 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 99 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la metionina (M) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 130 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 100 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con ácido glutámico (E) en la posición 131 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 101 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido aspártico (D) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 131 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 102 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la valina (V) se ha sustituido con tirosina (Y) en la posición 132 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 103 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la valina (V) se ha sustituido con serina (S) en la posición 132 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 104 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con la valina (V) en la posición 124 y (G) de la glicina se ha sustituido con alanina (A) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 105 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la isoleucina (I) se ha sustituido con valina (V) en la posición 124 y (G) de la glicina se ha sustituido con la serina (S) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 106 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 121, el triptófano (W) se ha sustituido con tirosina (Y) en la posición 123, la isoleucina (I) se ha sustituido con valina (V) en la posición 124, y la glicina (G) se ha sustituido con alanina (A) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 107 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la leucina (L) se ha sustituido con isoleucina (I) en la posición 121, el triptófano (W) se ha sustituido con tirosina (Y) en la posición 123, la isoleucina (I) se ha sustituido con valina (V) en la posición 124, y la glicina (G) se ha sustituido con serina (S) en la posición 126 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 108 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido glutámico (E) en la posición de 122 se ha eliminado de la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 109 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde el ácido glutámico (E) se ha insertado entre la glicina (G) en la posición 126 y el ácido aspártico (D) en la posición 127 en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 110 representa una secuencia de aminoácido de un mutante donde la asparagina (N) en la posición 79 se ha sustituido con glutamina (Q) en la secuencia de aminoácido de la cadena H de un anticuerpo anti-AD1 (EV2038) de la presente invención.
SEC ID NO: 111 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 1 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 112 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 2 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 113 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 3 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 114 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 4 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 115 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 5 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 116 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 6 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 117 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 7 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 118 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 8 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 119 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 9 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 120 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 10 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 121 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 11 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 122 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 12 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 123 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 13 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 124 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 14 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 125 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 15 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 126 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 16 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 127 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 17 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 128 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 18 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 129 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 19 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 130 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 20 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 131 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 21 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 132 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 22 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 133 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 23 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 134 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 24 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 135 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 25 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 136 representa una secuencia de aminoácido de un péptido sintético (Péptido 26 en la Figura 5) se preparó y utilizó en el ejemplo 8.
SEC ID NO: 137 representa una secuencia de aminoácido de la glicoproteína gB del citomegalovirus humano (HCMV) (Swiss- Prot: P06473).
En este caso, las relaciones entre las secuencias de nucleótido o secuencias de aminoácido que aparecen en los Ejemplos 1-6 de la presente solicitud y los números de secuencia son como se muestran en la Figura 1 a continuación.
Aquí , las relaciones entre las secuencias de nucleótido o secuencias de aminoácido que aparecen en los ejemplos 1 -6 de la presente solicitud y los números de serie, son según lo mostrado en la sig uiente tabla 1 .
Tabla 1 Con Sin Región secuencia secuencia CDR1 CDR2 CDR3 variable de señal de señal No. de secuencia 1 5 9 - - - de Cadena nucleótido H No. de secuencia 2 6 10 13 14 15 de aminoácido No. de secuencia 3 7 11 - - - de Cadena nucleótido L No. de secuencia 4 8 12 16 17 18 de aminoácido Más adelante, la presente invención será descrita más específicamente por medio de ejemplos, aunque la presente invención no se debe de ninguna manera limitar a estos ejemplos.
A menos que se indique de otra manera, los procedimientos usados en los ejemplos se pueden referir a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Tercera edición) (Sambrook y colaboradores, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001).
Ejemplos Ejemplo 1. Separación del clon de célula que produce el anticuerpo humano completo contra HCMV Un diagrama de flujo de las etapas a la separación de un clon de célula de producción de anticuerpos se muestra en la Figura 1.
El linfocito B fue separado de la sangre periférica humana cuyo nivel de anticuerpo anti-HCMV en el suero es alto, y fue infectado con EBV. La célula infectada fue sembrada en una placa de 96 pozos. Después de aproximadamente 3 semanas de cultivo, el análisis fue conducido para un anticuerpo anti-HCMV en el sobrenadante de cultivo (análisis primario). El análisis fue conducida por el método ELISA usando una placa de 96 pozos recubierta con HCMV-AD1 fusionado a GST o HCMV-AD2 fusionado a GST, los anticuerpos dirigidos para los epítopos de neutralización principales AD1 y AD2 de HCMV (J. Virol., 65, 138- 146 (1991), J. Gen. Virol., 73, 2375-2383 (1992), J. Virol., 66, 5290-5297 (1992), J. Virol., 67, 703-710 (1993)). Se diluyeron las células en cada pozo que habían sido confi rmadas de la producción de anticuerpo anti-HCMV, y sembradas en una nueva placa de 96 pozos. Después de aproxi madamente 3 semanas de cultivo , fue cond ucido el anál isis secundario para la prod ucción del anticuerpo anti-HCMV. Las cél ulas en los pozos positivos de anticuerpo resultantes fueron sembradas en una nueva placa de 96 pozos a 1 -30 cél ulas/pozo. Como resultado de esta manipulación de clonación limitando el cultivo de dilución , fue obtenido un clon de célula de producción de anticuerpo de interés.
Ejemplo 2. Identificación del isotipo y subclase del anticuerpo El sobrenadante de cultivo del clon de cél ula de prod ucción de anticuerpo fue util izado para identificar el isotipo del anticuerpo prod ucido por el método ELI SA (referencia de l iteratura : ver Curr Protoc I mmunol . mayo 2001 ; cap ítulo 2 : unidad 2.2). Para EL I SA, fue utilizada una placa de 96 pozos recubierta con HCMV-AD1 o AD2 fusionado a GST y un anticuerpo específico para cada uno de los isotipos y subclases como anticuerpo secundario. Los resultados del i sotipo y subclase del anticuerpo anti-HCMV resultante se muestran en la tabla 2.
Tabla 2 Número de anticuerpo Antigéno objeto Subclase EV2038 AD1 IgGIA Ejemplo 3. Clonación de ADN que codifica el anticuerpo anti-HCMV El ADNc fue obtenido del ARN total de la célula de producción de anticuerpo por la transcripción inversa usando los moldes Oligo-dT y fue utilizado como molde en un método de PCR para amplificar el gen de anticuerpo. Los cebadores usados para PCR fueron diseñados basado en la base de datos de ADNcs que codifica las cadenas H y L de anticuerpo IgG humano. Para amplificar el ADNc de cadena H integral y ADNc de cadena L, los cebadores de terminal 5' y 3' tienen un sitio de inicio de traslación y un sitio de terminación de traslación, respectivamente.
Ejemplo 4. Determinación de la secuencia de aminoácido de anticuerpo basado en la secuencia de nucleótido Los ADNcs de las cadenas H y L de anticuerpo amplificadas por el método de PCR fueron insertados en un vector de plásmido para identificar cada una de las secuencias de nucleótido con el secuenciador ABI. De las secuencias de nucleótido resultantes, fue determinada la secuencia de señal y las secuencias de aminoácido de las cadenas H y L de anticuerpo.
Además, la región de determinación de complementariedad (CDR) del anticuerpo fue analizada de acuerdo con el método de Kabat (www.bioinf.org.uk: Dr.Andrew C.R. Martin's Group, Antibodies: General Information). Las secuencias de CDR del anticuerpo anti-HCMV resultante (EV2038) son de las SEC ID NOS:13-18. Específicamente, las secuencias de aminoácido de CDR1 de cadena H, CDR2 de cadena H, CDR3 de cadena H, CDR1 de cadena L, CDR2 de cadena L y CDR3 de cadena L de EV2038 son de las SEC ID NOS:13, 14, 15, 16, 17 y 18, respectivamente.
Para examinar la semejanza a los anticuerpos monoclonales que habían sido reportados previamente como anticuerpos AD1, las secuencias de CDR de EV2038 fueron comparadas con los anticuerpos cuyas secuencias de aminoácido de las regiones variables habían sido registradas con GenBank o similares. Cada tipo de secuencias de CDR de los anticuerpos AD1 derivados de humano o ratón conocidos fue identificado por el método de Kabat, y comparados con la secuencia CDR identificada similarmente de EV2038. En la tabla 3, la homología (%) de CDR individual fue determinada basado en el número de residuos de aminoácido del objetivo para la comparación (denominador) y el número de residuos de aminoácido cuyas posiciones y los tipos que corresponden a los de EV2038 en la porción de CRD (numerador). El total (%) fue determinado sumando los números de residuos de aminoácido mientras como el denominador y los números de residuos de aminoácido como el numerador obtenido por la comparación de CDR individual, es decir, obteniendo la homología total (%) del número total resultante de residuos de aminoácido del denominador y numerador. Como puede ser apreciado de la tabla 3, EV2038 no tiene ninguna homología alta con los anticuerpos AD1 conocidos, que muestran que hay una gran diferencia en las secuencias de CDR de los anticuerpos AD1 previamente reportados.
Tabla 3 Homología de CDR de Homología de CDR de Acceso No. Total Anticuerpo Fuente cadena H(%) cadena M%) (%) (HCVR/LCVR) CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ITC63B L26539/L26540 Humano 20 24 32 31 57 27 31 ITC52 L26537/L26538 Humano 40 24 39 23 14 9 25 ITC48 L26535/L26536 Humano 80 56 6 24 29 9 29 ITC39 L26533/L26534 Humano 20 24 25 38 43 36 30 ITC33 L26531/L26532 Humano 20 24 25 50 43 18 30 7-17 U39898/U39901 Ratón 20 35 25 25 29 18 26 27-156 U39899/U39902 Ratón 40 24 25 35 29 9 26 27-287 U39900/U39903 Ratón 20 24 19 27 14 9 20 EV2001 * Humano 20 24 19 25 43 9 22 ?Referencia: WO2007/094423 Ejemplo 5. Valoración de si o no el gen de anticuerpo resultante codifica el anticuerpo anti-HCMV Los ADNcs de cadena H y de cadena L resultantes cada uno fueron insertados en vectores de expresión y después introducidos simultáneamente en una célula 293T. La transferencia del gen fue conducida con Lipofectamina (Invitrogen) y reactivo PLUS (Invitrogen) bajo las condiciones recomendadas por el fabricante (catálogo de Invitrogen: Cat.
No .1 8324-1 1 1 , Cat. No .1 8324-01 2 o Cat. No .1 8324-020). Dos d ías después, el sobrenadante de cultivo fue recolectado , y sometido al método EL ISA usando una placa de 96 pozos recubierta con el anticuerpo IgG anti-humano y HCMV-AD 1 fusionado a GST para determi nar si el anticuerpo en el sobrenadante de cultivo es un anticuerpo IgG humano y si une a HCMV-AD 1 .
Ejemplo 6. Producción de proteína de anticuerpo El plásmido de expresión de anticuerpo anti-HCMV resultante fue introducido en una cél ula CHO . La transferencia del gen fue conducida uti lizando el mismo método que el descrito anteriormente para las células 293T. El cultivo fue real izado en presencia de un marcador de selección para obtener un clon de célula CHO que produjo constantemente el anticuerpo .
La misma célula CHO que produjo establemente el anticuerpo fue cultivada en un med io sin suero, y el sobrenadante de cultivo fue recolectado . Este sobrenadante de cultivo fue agregado a una col umna de proteína A y sometido a la purificación de afinidad para obtener un anticuerpo purificado . La columna usada fue una col umna llenada previamente de HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare), mientras que las cond iciones de pu rificación fueron las recomendadas por el fabricante de la columna . Después de la purificación , la propiedad de unión a HCMV-AD 1 o HCMV-AD2 del anticuerpo fue verificada por ELI SA. Además, la cadena H de anticuerpo de aproxi madamente 50 kDa y la cadena L de anticuerpo de aproximadamente 25k Da fueron verificadas por SDS-PAGE.
Ejemplo 7. Preparación de las variantes y actividades de unión de las mismas Para estudiar las secuencias de aminoácido que alteran la propiedad del anticuerpo de la presente invención o el fragmento de unión del mismo, la región CDR-H3 (aminoácidos 117-132) fue estudiada particularmente. Aquí, los números de los residuos de aminoácido de CDR-H3 se numeran secuencialmente de terminal N (metionina) de la secuencia de aminoácido de cadena pesada que incluyen la secuencia de señal de la SEC ID NO: 2.
Mientras tanto, los aminoácidos que constituyen las proteínas en la naturaleza se pueden agrupar de acuerdo con las propiedades de sus cadenas laterales. Los ejemplos de los grupos de aminoácido que tienen la misma característica incluyen los aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano), aminoácidos básicos (Usina, arginina, histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico, ácido glutámico), aminoácidos neutrales (serina, treonina, asparragina, glutamina), los aminoácidos que tienen una cadena de hidrocarburo (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina) y (glicocola, metionina, cisteína).
En esta sección, el término "sustitución de aminoácido conservadora" se refiere a la sustitución entre los aminoácidos con las características similares, es decir, sustitución de aminoácido principalmente entre los aminoácidos que pertenecen al mismo grupo mencionado anteriormente. Tal sustitución se piensa para que no tenga ninguna influencia significativa o que cambie la característica de la proteína original. Por otra parte, el término "sustitución de aminoácido no conservadoras" es diferente de la sustitución mencionada anteriormente en que se refiere a la sustitución con un aminoácido cuya característica es mayormente diferente de la del aminoácido original. (1) Preparación de las variantes de CDR-H3 de EV2038 Para los 16 residuos de aminoácido que constituyen CDR-H3 de EV2038, cada uno de ellos fue sometido a la sustitución de aminoácido no conservadora por el método de PCR de 2 etapas para preparar las variantes (V117K, T118W, R119V, D120I, L121E, E122L, W123T, I124D, P125R, G126F, D127I, Y128N, Y129N, 130Q, D131I y V132K). Primero, la primera mitad del fragmento de gene fue obtenida con un par de 38Hind-S (CACCAAGCTTTGTGCAAGAACATGAAGCATC: SEC ID NO: 19) y un cebador inverso para el sitio de sustitución y la última mitad del fragmento de gene fueron obtenidos con un par de una cebador delantero para el sitio de sustitución y el 38Not-A (ATAAGAATGCGGCCGCGCCGTCGCACTCATTTACC: SEC ID NO: 20). La segunda PCR fue realizada usando éstos como moldes para obtener un gen de anticuerpo variable integral. Posteriormente, el gen de anticuerpo fue procesado con la enzima de restricción Notl para producir los extremos adhesivos y después insertarse en un plásmido de producción de anticuerpo. La secuencia de nucleótido de cada variante fue verificada usando un cebador para verificar una secuencia de nucleótido (ACCAGACATAATAGCTGACAG: SEC ID NO: 21) con el analizador genético 3130 (ABL) de acuerdo con un protocolo sugerido. (2) Demostración de la expresión de anticuerpo de las variantes de CDR-H3 de EV2038 El plásmido variable resultante (cadena H) y el plásmido original de la cadena L fue cotransferido a la célula CHO de acuerdo con el protocolo sugerido de Lipofectamine LTX (Invitrogen). Cuarenta y ocho horas después, el sobrenadante de cultivo fue recolectado. Los sobrenadantes de cultivo diluidos serialmente se dejaron reaccionar con los anticuerpos IgG antihumano de fase sólida (0.25 pg/pozo) en la Immuno Píate (Maxi sorp, Nunc) a temperatura ambiente durante una hora. Como un anticuerpo secundario, la inmunoglobulina G gamma anti-humana y la inmunoglobulina G lambda anti-humana (MBL) se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 11 horas. Cincuenta µ?/ml de Sure Blue ( PL) que contiene el sustrato de TMB como agente de producción de color fueron agregados, dejados asentarse a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después agregados con una cantidad igual de 1.5 M ácido fosfórico para determinar la absorción a una longitud de onda de 450 nm usando un lector de microplacas (680XR, BIO-RAD). La verificación de la presencia o ausencia y cuantificación del anticuerpo fueron conducidas basado en la absorbancia de las cadenas gamma y lambda. (3) Evaluación de la capacidad de unión de las variantes de CDR-H3 de EV2038 a AD1 por ELISA Un anticuerpo ajustado a una concentración de 1 pg/ml basado en la cadena lambda se dejo reaccionar en series de dilución con 5 pg/ml de AD1 de fase sólida en Immuno Píate (Poly sorp, Nunc). Posteriormente, el ELISA fue realizado como se describe anteriormente. Las capacidades de unión de las variantes al antígeno AD1 fueron evaluadas por las absorbancias a 450 nm de las variantes resultantes y EV2038 (originales). Consecuentemente, la sustitución de aminoácido no conservadora de los residuos 121-126 de CDR-H3 de EV2038 excepto el residuo 122 redujo significativamente la capacidad de unión a AD1, y estos residuos fueron sugeridos así como importantes como parátopes de AD1 (Figura 2). (4) Preparación de las variantes de CDR-H3 de EV2038 (2) Entre los cinco residuos de aminoácido cuyas capacidades de unión a AD1 disminuidas durante la sustitución de aminoácido no conservadora, los cuatro residuos de aminoácido 121, 123, 124 y 126 fueron sustituidos con aminoácidos con características similares. Cinco tipos de aminoácidos fueron utilizados para cada residuo. Específicamente, las variantes mostradas en la Figura 3 fueron preparadas. La prolina en la posición 125 fue sustituida con todos los aminoácidos naturales distintos del aminoácido original (Figura 4). Las variantes fueron preparadas como se describe anteriormente. (5) Evaluación de las capacidades de unión de las variantes de CDR-H3 de EV2038 a AD1 por ELISA Un anticuerpo ajustado a una concentración de 1 Mg/ml basado en la cadena lambda se dejo reaccionar en series de dilución con 5 Mg/ml de AD1 de fase sólida en Immuno Píate (Poly sorp, Nunc). Posteriormente, el ELISA fue realizado como se describe anteriormente para evaluar las capacidades de unión de las variantes a AD1. En cuanto a los aminoácidos en las posiciones 121, 123, 124 y 126, la mayor parte de las sustituciones de aminoácido para los aminoácidos conservadores mantuvieron las capacidades de unión a AD1 (Figura 3). Sin embargo, la prolina en la posición 125 no tuvo ninguna capacidad de unión a AD1 durante la sustitución con ningún otro aminoácido natural (19 tipos) (Figura 4). Por lo tanto, en CDR-H3 de EV2038 de acuerdo con la presente invención, la prolina en la posición 125 fue mostrada como un aminoácido indispensable para la característica de unión a AD1 del anticuerpo. (6) Preparación de las variantes de CDR-H3 de EV2038 (3) La sustitución de aminoácido conservadora también fue realizada para los residuos de aminoácido cuyas capacidades de unión a AD1 no redujeron durante la sustitución de aminoácido no conservadora (total de 11 residuos en las posiciones 117-120, 122 y 127-132) de acuerdo con el mismo método para conducir la evaluación de las capacidades de unión a AD1. Consecuentemente, fue encontrado que las variantes con la sustitución de aminoácido conservadora en esta región (V117L, V117I, T118S, T118K, R119K, R119T, D120E, D120A, E122D, E122A, D127E, D127A, Y128F, Y128W, Y129F, Y129W, 130F, M130I, D131E, D131A, V132Y y V132S) conservaron las capacidades de unión a AD1, similar a la sustitución de aminoácido no conservadora (Figura 5). (7) Preparación de las variantes de CDR-H3 de EV2038 (4) El total de cuatro tipos de variantes fue preparado sustituyendo simultáneamente dos o cuatro residuos de aminoácido entre los residuos de aminoácido cuyas capacidades de unión a AD1 disminuidas durante la sustitución de aminoácido no conservadora distintos e prolina en la posición 125 (total de cuatro residuos en las posiciones 121, 123, 124 y 126) (productos sustituidos con dos aminoácidos: I124V/G126A e 1124V/G126S, productos sustituidos con 4 aminoácidos: L1211/W123Y/I124V/G126A y L1211/W123Y/I124V/G126S) para evaluar sus capacidades de unión a AD1. Consecuentemente, todas estas variantes sustituidas múltiples veces fueron encontradas como conservadoras de sus capacidades de unión a AD1 (Figura 6). (8) Preparación de las variantes de CDR-H3 de EV2038 (5) Cada una de las variantes suprimidas e insertadas (E122del, y G126_D127insE) fueron preparadas seleccionando los residuos de aminoácido cuyas capacidades de unión a AD1 disminuyeron durante la sustitución de aminoácido no conservadora distintos de prolina en la posición 125 (total de cuatro residuos en las posiciones 121, 123, 124 y 126) para evaluar sus capacidades de unión a AD1. Consecuentemente, las capacidades de unión a AD1 fueron eliminadas totalmente para E122del y G126_D127insE. Por lo tanto, el número de residuos de aminoácido en este sitio (posiciones 121-126) (6 residuos) fue sugerido como importante para la unión a AD1 (Figura 7).
En conclusión, una secuencia de aminoácido de CDR-H3 de EV2038 puede ser la siguiente secuencia de consenso.
XnXnXnXnXlXn 2X3PX4XnXnXnXnXnXn (SEC ID NO: 22) en donde, Xn = cualquier aminoácido natural X-i = L, I , V, F o A X2 = W, Y o F X3 = I, V, L o M X4 = G, S, A o T (9) Preparación de las variantes de CDR-H2 de EV2038 Para estudiar si la sustitución conservadora distinta de CDR-H3 tiene influencia sobre la capacidad de unión a AD1, una variante en la cual N79 ubicada en CDR-H2 de EV2038 fue alterada a N79Q fue preparada de acuerdo con el mismo método para preparar otras variantes para evaluar la capacidad de unión a AD1. De los resultados, la capacidad de unión a AD1 también fue mostrada como no eliminada en la variante que tuvo N79 en CDR-H2 alterado a N79Q (Figura 8).
Los números de secuencia de las secuencias de aminoácido de cadenas H (incluyendo la secuencia de señal ) de las vari antes preparadas en esta sección se enumeran en la tabla 4.
Tabla 4 Nombre Nombre Nombre SEC ID SEC ID de de de SEC ID NO NO NO variante variante variante V117K 28 I124A 58 D120E 88 T118W 29 G126P 59 D120A 89 R119V 30 G126A 60 E122D 90 D120I 31 G126S 61 E122A 91 L121E 32 G126N 62 D127E 92 E122L 33 G126T 63 D127A 93 W123T 34 P125G 64 Y128F 94 I124D 35 P125I 65 Y128W 95 P125R 36 P125A 66 Y129F 96 G126F 37 P125L 67 Y129W 97 D127I 38 P125V 68 M130F 98 Y128N 39 P125S 69 M130I 99 Y129N 40 P125T 70 D131E 100 M130Q 41 P125N 71 D131A 101 D131 I 42 P125Q 72 V132Y 102 V132K 43 P125D 73 V132S 103 L121 I 44 P125E 74 I124V/G126A 104 L121V 45 P125K 75 I124V/G126S 105 Nombre Nombre Nombre SECID SECID de de de SEC ID NO NO NO variante variante variante L121A 46 P125H 76 L121 l/W 123Y/1124V/G 126A 106 L121F 47 P125C 77 L1211/W123Y/1124V/G126S 107 L121P 48 P125 78 E122del 108 W123Y 49 P125Y 79 G126_D127¡nsE 109 W123F 50 P125W 80 N79Q 110 W123P 51 P125F 81 W123L 52 V117L 82 W123I 53 V117I 83 I124L 54 T118S 84 I124M 55 T118K 85 I124P 56 R119K 86 I124V 57 R119T 87 Ejemplo 8. Trazado de epítopo del anticuerpo anti-HCMV AD1 Para determinar el sitio en la glicoproteína gB unida por estos anticuerpos AD1, un vector de expresión clonado con AD1 de HCMV gB fue introducido con la mutación de eliminación por el método de PCR para preparar la serie mutante de E. coli que expresa las proteínas que tienen varios sitios suprimidos en AD1. Estos mutantes de E. coli fueron cultivados e inducidos para la expresión. Después, el análisis estándar Western Blot fue realizado usando el lisado celular como antígeno. EV2038 y dos tipos de variantes con diferentes sitios de sustitución que tienen capacidades de unión a AD1, fueron seleccionados como controles. Una de las variantes seleccionadas fue una forma sustituida de aminoácido conservadora I124V que fue sometida a la sustitución de la porción de isoleucina en la posición 124 (uno de los sitios cuya actividad de unión a AD1 no fue reconocida durante la sustitución de aminoácido no conservadora) corriente arriba a la estructura de bucle de CDR-H3 (Shirai, H., y colaboradores, FEBS Letters, 1996; 399: p1-8). La otra fue una forma sustituida de aminoácido no conservadora V132K que fue sometida a través de la sustitución de valina en la posición 132 en la raíz de la estructura de bucle de CDR-H3.
EV2038, I124V y V132K todas unidas a los números de clon #0, #12, #13, #14, #15 y #19, mientras que EV2038 y las variantes del mismo fueron todos encontrados como que tienen epítopos entre los residuos de aminoácido 549-580 (SCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVI: SEC ID NO: 23) y 596-640 (EDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRM I DLSS: SEC ID NO: 24) (Figuras 9 y 10). Aquí, la secuencia de aminoácido de gB de la cepa HCMV AD169 como antígeno se numera a partir del codón de inicio, es decir, metionina, con referencia a la secuencia de número de acceso P06473.
Además, el epítopo fue determinado más específicamente para EV2038 con una matriz de péptidos. Veintiséis tipos de péptidos fueron sintetizados cambiando cuatro residuos a la vez en un péptido de 12 residuos dentro de una gama de los residuos de aminoácido 548-641 (tabla 5). Cada péptido tiene su terminal C unida a la superficie de la membrana de celulosa derivada para la síntesis de fase sólida como punto individual de 3.7 mm x 3.7 mm (método SPOTs, Sigma Genosys). El péptido unido por EV2038 fue determinado por la síntesis estándar Dot Blot. EV2038 unido a los números de péptido 3, 7, 8, 21 y 22 (Figura 10) y los epítopos fueron determinados como residuos de aminoácido 549-560 (SCVTINQTSVKV: SEC ID NO: 25), residuos de aminoácido 569-576 (SPGRCYSR: SEC ID NO: 26) y residuos de aminoácido 625-632 (YEYVDYLF: SEC ID NO: 27).
En cuanto a los anticuerpos que reconocen la región AD1, han sido reportados ITC52 y similares que reconocen un epítopo discontinuo de los residuos de aminoácido 570-579 y 606-619 (W093/21952 y J. Virol, 67; p703-710 (1993)). Sin embargo, con excepción de los residuos de aminoácido 569-576 (SPGRCYSR:SEC ID NO: 26), por lo menos dos de las porciones de epítopo-secuencia no han sido previamente reportados, mostrando que EV2038 es un anticuerpo que reconoce una secuencia discontinua que difiere de las reportadas previamente para los anticuerpos AD1 (Figura 10).
En cuanto a los anticuerpos que reconocen la región AD1, han sido reportados ITC52 y similares que reconocen un epítopo discontinuo de los residuos de aminoácido 570-579 y 606-619 (W093/21952 y J. Virol, 67; p703-710 (1993)). Sin embargo, con excepción de los residuos de aminoácido 569-576 (SPGRCYSR:SEC ID NO: 26), por lo menos dos de las porciones de epítopo-secuencia no han sido previamente reportados, mostrando que EV2038 es un anticuerpo que reconoce una secuencia discontinua que difiere de las reportadas previamente para los anticuerpos AD1 (Figura 10).
Tabla 5 Número de Secuencia de aminoácido SEC ID NO péptido 1 MGDVLGLASCVT 111 2 LGLASCVTINQT 112 3 SCVTINQTSVKV 113 4 INQTSVKVLRDM 114 5 SVKVLRDMNVKE 115 6 LRDMNVKESPGR 116 7 NVKESPGRCYSR 117 8 SPGRCYSRPVVI 118 9 CYSRPVVIFNFA 119 10 PVVIFNFANSSY 120 11 FNFANSSYVQYG 121 12 NSSYVQYGQLGE 122 Número de Secuencia de aminoácido SEC ID NO péptido 13 VQYGQLGEDNEI 123 14 QLGEDNEILLGN 124 15 DNEILLGNHRTE 125 16 LLGNHRTEECQL 126 17 HRTEECQLPSLK 127 18 ECQLPSLKIFIA 128 19 PSLKIFIAGNSA 129 20 I FIAGNSAYEYV 130 21 GNSAYEYVDYLF 131 22 YEYVDYLFKRMI 132 23 DYLFKRM IDLSS 133 24 KRMIDLSSISTV 134 25 DLSSISTVDSMI 135 26 ISTVDSMIALDI 136 Ejemplo 9. Evaluación de la actividad neutralizante (1) Inmunotinción Para evaluar la efectividad del anticuerpo anti-HCMV (EV2038), la actividad neutralizante fue determinada. La actividad neutralizante fue evaluada como índice de obstrucción, por el anticuerpo, de la infección por HCMV (cepa AD169) en una célula de fibroblasto normal derivado de pulmón de feto humano (MRC-5: Riken BRC No. RCB0211). El procedimiento seguido del método de Abai y colaboradores (Journal of Immunological ethods 322 2007 82-93). Brevemente, el procedimiento fue como sigue. El complemento (5%) fue agregado a la solución de virus y al anticuerpo purificado y se dejaron en reposo durante una hora. Entonces, el resultado fue utilizado para inocular la célula MRC-5 (37°C, 1 hora). La célula fue lavada dos veces, cultivada durante 20 horas, y entonces IE1, es decir, la proteína inmediata temprana de HCMV, fue detectada por la coloración inmunofluorescente. Las células infectadas con HCMV fueron contadas con software de análisis de imagen Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
La Figura 11 muestra los resultados para evaluar la actividad neutralizante del anticuerpo anti-HCMV. Un anticuerpo monoclonal humano (hlgG) que no tuvo ninguna especificidad a HCMV fue utilizado como control negativo mientras que un anticuerpo monoclonal de ratón (clon HCMV16 conocido, AbD serotec: 2470-5437) que une a la glicoproteína H, es decir, uno de los epítopos de neutralización de HCMV, fue utilizado como control positivo. El índice de bloqueo de la infección por HCMV de cada anticuerpo fue indicado en porcentaje con respecto al índice de bloqueo de infección obtenida durante la adición de una concentración igual de hlgG. La concentración de inhibición del 50% (Cl50) durante la adición del complemento fue de 0.58 pg/ml para EV2038, mostrando que tiene una actividad neutralizante efectiva a una concentración más baja que EV2001. En ausencia del complemento, la actividad neutralizante efectiva no fue obtenida para EV2001 mientras que CI5o de EV2038 fue de 0.57 pg/ml, mostrando que tiene una actividad neutralizante igual al caso en la presencia del complemento (tabla 6).
Tabla 6 Nombre de Antígeno CI50 (pg/ml) anticuerpo objeto Cp + Cp- hlgG - n.d. n.d.
EV2001 AD1 3.08 n.d.
EV2038 AD1 0.58 0.57 HC V16 9H 0.87 2.15 n.d.: no determinado (2) Método de placa EV2038 que demostró una actividad neutralizante alta durante la evaluación descrita antes, fue evaluada adicionalmente para determinar su actividad de bloqueo de infección por un método de placa (Masuho, Y. y colaboradores, J. Gen. Virol., 1987; 68: p1457-1461). Como cepas de virus, las cepas de laboratorio de HCMV AD169 comunes, las cepas Towne, Davis y Merlin así como las cepas de HCMV aisladas clínicamente T-137 y MDU-1 fueron utilizadas. El método fue realizado brevemente como sigue. Una solución de virus de 50-100 PFU y un anticuerpo purificado diluido en serie a una concentración predeterminada fueron mezclados, incubaron a 37°C durante una hora, y utilizados para inocular una célula de fibroblasto (MRC-5) o una célula epitelial de pigmento retiniano (ARPE-19) que había sido deslaminada en microplacas de 48 pozos . Después de la i noculación, el resultado fue incubado a 37° C durante 2 horas y entonces el sobrenadante de cultivo fue retirado. Después de lavarse dos veces, el resultado fue cultivado a 37°C en un medio estándar que contuvo 2% de FCS . El cultivo conti nuó con una cepa de laboratorio d urante 5-6 días o con una cepa cl ínicamente aislada durante 1 0-1 2 d ías hasta que la formación de placas fuera confi rmada claramente por la muerte de las células infectadas con el virus. Posteriormente, 5% de formal ina fue agregado para inmovil izar las células, y la coloración fue realizada con 0.025% de violeta cristalina . Después de la coloración , el número de placas por pozo fue contado para calcular el índice de bloqueo de infección del anticuerpo anti-HC V.
La tabla 7 es los resultados de la evaluación de la actividad neutralizante de EV2038 por el método de placa . Un anticuerpo monoclonal humano (h lgG) que no tiene ninguna especificidad con H CMV fue utilizado como control negativo, mientras que la formulación de i nmunoglobuli na de título alto anti-CMV CytoGam (CSL Behring , CytoGam Cytomegalovi rus immune globulin i ntravenous, Prescribing information . (Revised July 2008)) aprobada en los Estados U nidos de Norteamérica que se aplicará para prevenir el desarrollo de la infección por HCMV asociada al trasplante de riñon , fue utilizada como control positivo.
H CMV se ha reportado como que tiene diferente mecan i smo de li beración entre el modo de infección a una célula de fibroblasto y los modos de infección a las células epiteliales y endoteliales (Sinzger, C. y colaboradores, Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83). En muchas de las cepas de laboratorio según lo caracterizado por las cepas de AD169 y Towne, contagiosidad a las células epiteliales y endoteliales probablemente se elimina a través de varias veces del paso con las células de fibroblasto (Dai Wang, y colaboradores, J. Virol., 2005; 79: p10330-10338). Por una parte, HCMV tiene intrínsecamente contagiosidad a los tipos amplios de tejidos y células in vivo (Sinzger, C. y colaboradores, Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83). Por lo tanto, para que un anticuerpo anti-HCMV exhiba un efecto clínico, puede ser importante que el anticuerpo tenga una actividad neutralizante efectiva para el tipo de célula de fibroblasto y el tipo de célula epitelial/endotelial que se utiliza como células hospedadoras infectadas.
Fue demostrado que los anticuerpos anti-HCMV (EV2038) de la presente invención tuvieron una Cl50 de 0.012-0.037 pg/ml para la infección de una célula de fibroblasto con la cepa de laboratorio. Con la cepa clínicamente aislada (MDU-1) que conserva la contagiosidad para las células epiteliales/endoteliales, la Cl50 fue de 0.044 pg/ml para la infección de una célula de fibroblasto y 0.040 g/ml para la infección de fibroblasto y células epiteliales, confirmando que tiene una actividad neutralizante excelente igualmente para el tipo de célula de fibroblasto y para los tipos de células epiteliales/endoteliales. Por otra parte, EV2038 fue altamente activo contra la cepa AD169 aproximadamente 2000 veces con respecto a una formulación inmunoglobulina de título alto anti-C V CytoGam comercialmente disponible, y altamente activa aproximadamente 20 veces con respecto a los valores reportados de C23 desarrollado y probado clínicamente (Masuho, Y. y colaboradores, J. Gen. Virol., 1987; 68: p1457- 1461 ).
Tabla 7 CI50 (pg/ml) Cepa de laboratorio de HCMV Cepa de HCVM aislada clínicamente Nombre AD169 Towne Merlin Davis T-137 MDU-1 de Célula de Célula de Célula de anticuerpo Célula de fibroblasto fibroblasto fibroblasto fibroblasto hlgG >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 0.027 0.025 0.012 0.037 0.07 0.044 0.04 EV2038 (0.18) (0.17) (0.08) (0.25) (0.47) (0.29) (0.27) CytoGam 57.6 N.D. N.D. N.D. 33 51 3.8 N.D.: no determinado (En la tabla, los valores entre paréntesis son concentraciones molares (nm) calculadas a condición de que el peso molecular del anticuerpo sea de 150 kDa) Ejemplo 10. Evaluación de la actividad neutralizante del anticuerpo de variante de EV2038 Dos tipos de variantes con diferentes sitios de sustitución fueron seleccionados entre las variantes de EV2038 para evaluar las actividades neutralizantes de las mismas. Una fue una forma sustituida con aminoácido conservador I124V que pasó a través de la sustitución de la porción de isoleucina en la posición 124 (corriente arriba de la estructura de bucle de CDR-H3) cuya actividad de unión a AD1 no fue reconocida durante la sustitución de aminoácido no conservadora. La otra fue una forma sustituida con aminoácido no conservador V132K que pasó a través de la sustitución de valina en la posición 132 (en la raíz de la estructura de bucle de CDR-H3) que tuvo una actividad de unión a AD1 igual a la forma original durante la sustitución de aminoácido no conservadora. El procedimiento seguido del método descrito antes de Abai y colaboradores (Journal of Immunological ethods 322 2007 82-93). Un anticuerpo monoclonal humano (hlgG) que no tiene ninguna especificidad con HCMV fue utilizado como control negativo mientras que un anticuerpo monoclonal de ratón (clon HCMV16 conocido, AbD serotec: 2470-5437) que une a la glicoproteína H (gH), es decir, uno de los epítopos de neutralización de CMV, fue utilizado como control positivo. El índice de bloqueo de infección por HCMV de cada anticuerpo fue indicado en porcentaje con respecto al índice de bloqueo de infección obtenido durante la adición de una concentración igual de hlgG. La concentración de inhibición de 50% (Cl50) fue de 0.45 pg/ml para I124V y 1.20 pg/ml para V132K, y ambos mostraron para tener una actividad casi igual a la de EV2038.
Ejemplo 11. Evaluación de la capacidad de bloqueo de infección de célula a célula Además, como una evaluación de la efectividad de EV2038, una célula de fibroblasto normal derivada de pulmón de feto humano infectada con HCMV (MRC-5) fue utilizada para evaluar la actividad de bloqueo de infección de célula a célula de EV2038. El método de evaluación fue basado en el método de Navarro y colaboradores (Virology. 1993; 197: p143-158). Específicamente, fue utilizado MRC-5 que había sido infectado con HCMV (AD169) durante 24 horas, al cual el anticuerpo fue agregado por dilución en serie cuatro veces a partir de 10 mg/ml (aproximadamente 67 nM). La célula fue inmovilizada 6 días después de la infección, y la proteína de expresión de infección temprana IE1 fue detectada por inmunotinción. Las células infectadas con HCMV fueron contadas con el software de análisis de imagen Image J. Consecuentemente, fue encontrado que la adición de anticuerpo anti-AD1 EV2038 a la célula infectada puede inhibir significativamente la infección de virus de célula a célula (tabla 8).
En la tabla, (1) + + + , (2) + + , (3) +, (4) ± y (5) - representan la inhibición de 100-75%, inhibición de 75-50%, inhibición de 50-25%, inhibición de 25-0% y ningún efecto inhibidor contra la proliferación de la infección, respectivamente.
El reporte de Navarro y colaboradores (Virology. 1993; 197: p143-158) mostró un caso ejemplar donde los anticuerpos con la actividad más alta (CH177-3, CH244-4, etc.) exhibieron la inhibición de 100-75% a una concentración de 10 mg/ml. Con EV2038, sin embargo, la inhibición de la infección de célula de 100-75% se puede observar en un intervalo de concentración de 10-0.63 pg/ml, y además el efecto inhibidor de infección de célula a célula de 75-50% a 0.16 Mg/ml (1.07nM).
Tabla 8 Concentración durante la adición (Mg/ml) Sin 10 2.5 0.63 0.18 0.04 0.01 adición EV2038 +++ +++ +++ ++ + - - De las propiedades descritas anteriormente, un anticuerpo anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención parece proporcionar una nueva dimensión como fármaco profiláctico o terapéutico para varias enfermedades causadas por HCMV, por ejemplo, enfermedades tal como pulmonía intersticial, retinitis, gastroenteritis o encefalitis en un paciente con inmunodeficiencia, o anormalidad de la función hepática, pulmonía intersticial o mononucleosis que se desarrollan debido a la infección por HCMV al nacer o en la infancia.
Hasta aquí, la presente invención se ha descrito específicamente de acuerdo con las modalidades específicas. Estas modalidades, sin embargo, se proporcionan solamente para la descri pción y no son restrictivas . El alcance de la presente invención se puede alterar o modificar de cualquier manera dentro de los requisitos del alcance de las reivi ndicaciones, que se encuentran dentro del alcance técnico de la presente invención .
Apl icabil idad Ind ustrial Se espera que un anticuerpo anti-HCMV de la presente i nvención y una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo sean utilizados como fármaco profiláctico o terapéutico para varias enfermedades causadas por HCMV, por ejemplo: (a) enfermedades tal como pulmon ía intersticial , retinitis, gastroenteritis, encefalitis y similares causadas por la reactivación de HCMV en estados de inmunodeficiencia tal como S I DA, cáncer, después de trasplante de órganos , después de trasplante de médula ósea y después de hemodiálisis; (b) i nfección por CMV congénita debido a la transmisión de la i nfección por HCMV de una mujer embarazada a un feto; (c) aborto espontáneo, muerte del feto y muerte poco después de nacer causada por la infección por CMV congénita descrita anteriormente; (d ) bajo peso al nacer, hepatoesplenomegal ia , ictericia , púrpura trombocitopénica, microcefalia , trastorno de desarrollo mental , retraso de desarrollo intelectual , coriorretinitis y deterioro del oído en el caso de la supervivencia con infección por la CMV congénita descrita anteriormente; y (e) anormalidad de la función hepática , pulmon ía intersticial y mononucleosis debido a la infección por HCMV al nacer o en la infancia .

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal que une específicamente a la región AD1 de la glicoproteína gB de citomegalovirus humano (HCMV) y que es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma, en donde (i) la región variable de cadena pesada comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 y una secuencia de aminoácido que tiene sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13; (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 y una secuencia de aminoácido representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22 y que tiene las sustituciones para uno a cuatro residuos de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, y (ii) la región variable de cadena ligera comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16; (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde (i) la región variable de cadena pesada comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 y una secuencia de aminoácido que tiene sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13; (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 y una secuencia de aminoácido representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22 y que tiene las sustituciones para uno a cuatro residuos de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, y (ii) la región variable de cadena ligera comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16; (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde (i) la región variable de cadena pesada comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13; (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14 y una secuencia de aminoácido que tiene las sustituciones de aminoácido conservadoras para uno a cuatro residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15 y una secuencia de aminoácido representada por la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 22 y que tiene las sustituciones para uno a cuatro residuos de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, y (ii) la región variable de cadena ligera comprende: (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16; (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende: (i) (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, o una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 incluida en una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 28.31, 33, 38-47, 49, 50, 54, 55, 57, 60, 61 , 63 y 82-107, y (ii) (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 (b) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende: (i) (a) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 13 (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 14; y (c) una secuencia de aminoácido de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 15, y (i¡) (a) una secuencia de aminoácido de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 16 (b) una secuencia de aminoácido de CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 17; y (c) una secuencia de aminoácido de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 18.
6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12.
7. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10; y (b) una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12.
8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) una cadena pesada (cadena H) que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6; y (b) una cadena ligera (cadena L) que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8, o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad del 98% o más con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8.
9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende: (a) una cadena pesada (cadena H) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó 6; y (b) una cadena ligera (cadena L) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8.
10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano.
11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la clase (subclase) del anticuerpo es lgG1 (?).
12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 11, cuya concentración inhibidora del 50% para la formación de placas es de 0.05 pg/ml (aproximadamente 0.3 nM) o menos para la cepa de laboratorio de HCMV (AD169) en presencia de una célula de fibroblasto humana.
13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 12, que tiene la capacidad de bloqueo de infección de célula a célula del 50% o mayor a 0.2 pg/ml (aproximadamente 1.3 nM) o menos en una línea celular de fibroblasto humana (MRC-5) infectada con la cepa de laboratorio de HCMV (AD169).
14. Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad relacionada con el citomegalovirus humano (HCMV), que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 13 y un portador farmacéuticamente aceptable.
15. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la enfermedad relacionada con HCMV es (a) pulmonía intersticial, retinitis, gastroenteritis o encefalitis causada por la reactivación de HCMV en un estado de inmunodeficiencia, (b) infección por CMV congénita debido a la transmisión de la infección por HCMV de una mujer embarazada a un feto, (c) aborto espontáneo, muerte del feto o muerte poco después del nacimiento causado por la infección por CMV congénita, (d) bajo peso al nacer, hepatoesplenomegalia, ictericia, púrpura trombocitopénica, microcefalia, trastorno de desarrollo mental, retraso de desarrollo intelectual, coriorretinitis o deterioro del oído en el caso de supervivencia con la infección por CMV congénita; o (e) anormalidad de la función hepática, pulmonía intersticial o mononucleosis que son causadas por la infección por HCMV durante el nacimiento o infancia.
16. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal anti-HCMV o un fragmento de unión a antígeno del mismo que une específicamente a la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV y que es capaz de neutralizar la bioactividad de la misma, en dondel ácido nucleico aislado se selecciona de los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18, 28-31, 33, 38-47, 49, 50, 54, 55, 57, 60, 61, 63, 82-107 y 110, y ácidos nucleicos que se hibridizan con las mismas bajo condiciones altamente rigurosas.
17. Un vector que incorpora un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Una célula hospedadora que incorpora el vector de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Un método para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende una etapa de cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 19.
20. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10, o una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena pesada (HCVR) incluida en una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 28-31, 33, 38-47, 49, 50, 54, 55, 57, 60, 61, 63, 82-107 y 110; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 12.
21. El anticuerpo o fragmento de unión antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende: (a) una cadena pesada (cadena H) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC IS NO: 2 ó 6, o una secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 28-31, 22, 38-47, 49, 50, 54, 55, 57, 60, 61, 63, 82-107, 110 o cualquiera de estas secuencias sin una secuencia de señal; y (b) una cadena ligera (cadena L) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4 u 8.
22. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13, 20 y 21, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo une específicamente a un epítopo que comprende do o más secuencias discontinuas presentes en una región de la secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido continuos 549 a 580 (es decir, SEC ID NO: 23) y la secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido continuos 596 a 640 (es decir las SEC ID NO: 24) de la glicoproteína gB de HC V.
23. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13, 20 y 21, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce como un epítopo una secuencia discontinua que está presente en la región AD1 de la glicoproteína gB de HCMV y comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 25, la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 26, y la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 27.
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