CN101808663B

CN101808663B - 抗rsv g蛋白抗体

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Publication number: CN101808663B
Application number: CN200880117420.0A
Authority: CN
Inventors: L·M·高瓦; E·J·科拉瑞尼; B·基特; O·福德
Original assignee: Trellis Bioscience Inc
Current assignee: Trellis Bioscience Inc
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2028-10-24
Also published as: ZA201003131B; US7736648B2; EP2214711A2; EP2214711B1; US8273354B2; MX2010004482A; RU2010120879A; US9321830B2; JP2011500091A; CN101808663A; AU2008316703B2; JP2015078231A; KR20100091195A; AU2008316703A1; WO2009055711A2; IL205257A; AU2008316703A2; BRPI0819210A2; US20090130120A1; NZ585589A

Abstract

能与RSV G蛋白的保守表位结合并且在给予人类对象时免疫原性很小的各种单克隆抗体和片段，可用于治疗RSV感染。

Description

抗RSV G蛋白抗体

相关申请的交叉参考

本申请要求申请日为2007年10月25日的美国临时申请61/000,469和申请日为2008年8月15日的美国临时申请61/089,401的优先权。这些文献的内容已纳入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及可与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白所包含的具有重要功能的表位产生免疫反应的抗体，当给予人类对象时其免疫原性很小。这些抗体可用于增强人类对象抗RSV感染的耐受性以及降低已感染的个体体内的感染水平或减轻RSV感染所引起的症状。

背景领域

从全球来说，其中包括美国、欧洲、澳大利亚和日本，长期以来RSV感染都是一个大问题。对于早产儿、幼儿和老年人来说，RSV感染尤其麻烦，对于那些免疫系统功能下降的成年人来说也是如此。据估计，1岁以下的儿童中至少约有2/3，1-4岁的几乎所有儿童都至少感染过一次RSV，其中大多数都会康复，无需继续医学观察。然而，5-10％的患者会发生慢性严重感染，这个因素被认为可在后期诱发儿童出现喘鸣和哮喘样症状。RSV有两个主要的表面糖蛋白，F和G。目前唯一上市的抗RSV单克隆抗体只被批准用于预防早产儿感染RSV，是抗F蛋白的抗体。该抗体的名称是帕利珠单抗( MedImmune制造)，其作用广谱，因为不同病毒株之间的F蛋白的序列是保守的。但是，G蛋白是相当易变的，除了中央“CX3C”区之外，该区在近100个测序的病毒株中几乎不发生变异。该区包含一个已被证明可与CX₃C趋化因子(fractalkine)受体相互作用的基序。这种相互作用被认为是导致RSV感染病程延长的原因，其机制是通过抑制抗病毒的有效免疫反应：Tripp，R.A等，Nature Immunology (2001)2：732-738。研究证明，该区Toll-样受体4的拮抗剂，这被认为也会抑制有效免疫反应：Polack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2005)102：8996-9001；Shingai等，Int’l Immunology(2008)电子版，7月8日。

人们起初试图通过疫苗免疫的方式预防RSV感染，结果适得其反。用甲醛灭活的RSV或用RSV G糖蛋白作为疫苗免疫以后，疾病和肺嗜酸性粒细胞增多症症状加重，这是由上面所提到的G蛋白上被称为CX3C区的保守序列引起的，该区可模拟趋化因子CX₃C趋化因子的作用。(Haynes，L.M等，J.Virol.(2003)77：9831-9844.)。利用抗G蛋白的抗体诱导获得性免疫通常被认为不现实，因为该蛋白的序列在不同病毒株之间缺乏保守性

后来同一研究小组证实，RSV感染或疫苗免疫引起的抗G蛋白抗体反应和G蛋白与CX₃C趋化因子CX3C受体的结合被抑制以及和RSV G蛋白介导的白细胞趋化作用的调节有关(Harcourt，J.L等，J.I.D.(2004)190：1936-1940)，这种结合被抑制后会对T细胞反应产生不良影响(Harcourt，J.L等，J.Immunol.(2006)176：1600-1608)。最近研制的疫苗研究已避免了甲醛固定疫苗相关疾病发生恶化的情况，但是研究发现新疫苗所产生的免疫反应很快就会消退(数周到数月)，这与对天然RSV的免疫记忆能力差是一致的：Yu等，J.Virol.(2008)82：2350-2357。这种病毒与其他病毒不同，通常会重复感染。G蛋白的免疫抑制特性可能是产生这种现象的原因。

抗G蛋白的单克隆抗体已有20多年的历史。Anderson，L.J.等，J.Virol.(1988)62：4232-4238描述了F和G蛋白单克隆抗体(mAb)混合物以及单一mAb中和RSV的能力。后来Sullender，W.，Virol.(1995)209：70-79通过抗原性分析研究了结合G蛋白相关的mAb，被称为131-2G。研究发现，这个抗体既可以结合A型RSV，也可以结合B型RSV，这是RSV的两个主要病毒株。

另外，Mekseepralard，C.等，J.Gen.Virol.(2006)87：1267-1273总结了较早发表的文章，结果发现给予抗F和G蛋白的抗体可在啮齿类动物模型中产生抗实验性感染的获得性保护作用。这些文章包括Routledge等，J.Gen.Virol.(1988)69：293-303；Stott，E.J.等，J.Virol.(1986)60：607-613；Taylor，G.等，Immunol.(1994)52：137-142；以及Walsh，E.E.等，Infect.Immun.(1984)43：756-758。在后续文章中，Mekseepralard等人发现抗G蛋白的特异性单克隆抗体(1C2)需要糖基化才能在体外存在补体的情况下或者在用于小鼠体内时中和病毒。作者注意到G蛋白的173-186位氨基酸是保守的，1C2就是抗这个保守区的；但是制备无免疫原性抗体的方法，即将小鼠Fab嵌合到人Fc区，还是相当不成熟的。

另外，Corbeil，S.等，Vaccine(1996)14：521-525证明，补体系统参与用小鼠单克隆抗体18A2B2被动免疫小鼠再感染RSV之后产生的保护作用，尽管这种抗体在体外没有显示出中和能力。

PCT出版物WO 00/43040描述了抗P物质抗体在减轻RSV感染相关的呼吸道炎症中的应用。P物质是一种已知的促炎症反应介导因子，给予RSV的G蛋白可提高其产生量，无G蛋白或中央保守区带有功能缺陷点突变的RSV突变株缺乏P物质的产生：Haynes等，J Virol(2003)77：9831-9844。

美国专利出版物2006/0018925描述了能够阻断G蛋白CX3C区与其受体相互作用的抗体和小肽，并要求了二者的权利。这些组合物被认为可用于调节RSV感染和诱导免疫。尽管该专利也建议利用人源化的小鼠抗体来证明这些抗体的治疗和预防价值，但是实际上这种人源化形式的抗体还未被制备和描述出来。

PCT出版物WO2007/101441描述了一种用于治疗RSV感染的重组多克隆抗体，被称为Symphogen。重组多克隆抗体由分离自人血清的不同单克隆抗体组成。该出版物的表5描述了据说可与位于A亚型RSV G蛋白的164-176位氨基酸位置上的“保守区”结合的12种单克隆抗体。根据检测结果，其中5种抗体与G蛋白有亲和性，亲和性的大小在100-500pM范围内。这些抗体中有两个抗体经蚀斑减少中和试验(PRNT)检测发现具有中和能力；其中一个的EC₅₀值约为2.5μg/ml，另一个根本没有显示出中和特性。

发明内容

从最近感染过RSV的人类供者中已经鉴定出了可与RSV G蛋白而不是F蛋白发生特异性免疫反应的抗体，其中包括与A型和B型病毒株都发生免疫反应的那些抗体。另外，最初由Anderson等，J.Virol.(1988)62：4232-4238描述的小鼠抗G蛋白抗体经过改造后可使其在给予人类对象时产生免疫排斥的几率达到最低。本发明的抗体可用于治疗药物，也可用于提高人类对象对RSV 的耐受性。更特殊的是，抗A亚型G蛋白160-176位内保守基序的抗体是有治疗效果的，可将已感染的对象体内的病毒清除，并且能够减轻RSV感染所导致的呼吸道炎症，以及可用于预防。

因此，在一个方面，本发明涉及能结合A型RSV G蛋白约160-176位内的表位的单克隆抗体或其免疫反应性片段，该抗体在给予人类对象时免疫原性很小。这些抗体在标准蚀斑形成试验中显示出中和RSV的中和能力，在这种试验中的EC₅₀＜500ng/ml，优选＜200ng/ml，更优选的是＜100ng/ml。本发明的抗体还与RSV-A2的G蛋白有亲和性，亲和性＜1nM，优选＜500pM，更优选的是＜100pM。在一个实施方式中，本发明的抗体可与RSV G蛋白所包含的CX3C趋化因子基序的30个以内的残基结合，或者直接与趋化因子基序的至少一部分结合，该区在RSV的多个病毒株之间具有高度的氨基酸一致性。CX3C趋化因子基序处于RSV-A2病毒株的约182-186位氨基酸以及其他病毒株G蛋白的相应位置上。研究发现，本发明的抗体可与之结合的相关区包含在RSV-A2G蛋白的160-176位残基之内或其他病毒株G蛋白的相应位置内。这个区在A病毒株内是高度保守的，A和B病毒株之间也仅有几个氨基酸的差异。一个特别保守的区的序列是HFEVFNFVPCSIC，处于RSV A2的164-176位置内。优选的是，本发明的抗体可结合包含序列FEVFNF或序列VFNFVPCSIC的表位。在一个实施方式中，本发明的抗体与保守氨基酸的这个区有免疫反应性，因此与该病毒的A型和B型病毒株的G蛋白有免疫反应性，因而也与大多数病毒株的G蛋白有免疫反应性。

为了能用于本发明的治疗RSV感染或增强对RSV的耐受性的方法，本发明的单克隆抗体或其片段可与A型和B型的多个病毒株有免疫反应性，单个单克隆抗体也足以产生理想的效果。另外，需要治疗的对象或者需要产生耐受性的对象可接受多种单克隆抗体，特别是当方案中的一种抗体与A型病毒株具有更高的反应性，而另一种抗体与B型病毒株有更高的反应性时。

本发明还包括用于预防或治疗的药物组合物，其中包括降低炎症反应，该组合物包含本发明的单个抗体或免疫反应性片段作为活性剂，或者本发明的不超过两个抗体或片段作为活性剂。

本发明的其他方面包括使用抗体治疗人类对象RSV感染或诱导这些对象对RSV耐受的方法。

本发明的单克隆抗体可利用重组方法制备，因此本发明还包括用于制备单克隆抗体的重组材料以及用于制备这些抗体的细胞系或永生细胞以及非人多细胞有机体或其细胞或微生物细胞。在一个实施方式中，来源于人类对象的细胞被改造成“永生化”的形式，其中这些细胞已经过修饰使其分泌抗体的时间足够长，从而能被鉴定并克隆相关的编码序列。

附图简述

图1显示的是直方图，说明了人类对象体内抗各种RSV抗原的抗体以ppm计的频度。理想的非病毒株依赖性的抗G表型(Gab)是相当稀有的，总体上看约占百万分之十(ppm)，某些对象甚至低于1ppm。“混合”是指抗体既结合F又结合G；F和G没有序列同源性，结合可能是因为它们有相同的糖链决定簇。

图2A是RSV G蛋白的示意图，图中显示的是CX3C区和保守二硫键的位置。图例对所有病毒株都一样，尽管不同病毒株之间位置的特殊编号可能有些许不同。

图2B显示的是RSV感染对象来源的血清抗体与一组重叠的12-聚RSV G蛋白来源的肽的结合情况，说明中央保守区的免疫原性很低。

图2C显示的是一组超过75个RSV病毒株G蛋白功能位置的多态性频度，说明中央保守区是非常保守的，在替代剪接位点可形成可溶性形式的G蛋白。

图3显示的是针对重叠序列肽阵列的示例性鼠单克隆抗体(131-2G)的探测结果。该工作鉴定出了mAb结合的表位。在所描述的例子中，表位位于CX3C基序的30个残基之内。

图4A-4D：图A和图B分别代表两个供者血样的总结图。图A显示的是具有有用的Ga/Gb交叉反应性克隆频率的供者。图B显示的是没有该特征的供者。图中的各点代表与三个探针的相对结合，其中的探针用于单个克隆分泌抗体足迹。图C是单一EBV转化B细胞的分泌蛋白足迹的定量模式。图D显示的是转化抗体基因的HEK193细胞的4个子代细胞的模式，其中抗体基因来源于图C的细胞。这个模式与图C中的模式一致，分析的精确度根据图D的重复数据定义。

图5A-5B显示的本发明的代表性抗体的重链(A区)和轻链(B区)的序列。

图6A-6F显示的是确定本发明两种抗体的亲和力的Biacore结果。如图E和图F所示，抗体3D3可结合G蛋白，且未显示恰好可检测的关闭率。图A和图D显示的是抗体与传感器表面的结合。图B和图E显示的是当Ga蛋白流过表面时传感器信号增强，Ga蛋白可被结合抗体捕获，当用缓冲液洗涤表面时结合的Ga蛋白从表面去吸附，此时信号减弱。同样，图C和图F显示了Ga蛋白的开放率(on-rate)和关闭率(off-rate)。

图7是本发明的各种抗体与 F蛋白结合抗体相比较的结合曲线，结果是利用活病毒包被的微孔板通过ELISA试验确定的。

图8是X轴上G蛋白的亲和力对Y轴上与病毒的结合能力所做的曲线图。两种能力是相关联的，虽然3D3与活病毒的亲和力略低于预测值。

图9A和9B显示的是几种抗体与A2和A5病毒株结合能力的比较。

图10显示的是中和试验的结果。结果以蚀斑数对抗体μg值作图的方式显示。

图11显示的是本发明的抗体3G12与在中和RSV病毒株B的能力方面的比较。

图12显示的是本发明的两种抗体与商用抗体在预防活性方面的比较。

图13A-13C显示的是mAb 131-2G在RSV感染后小鼠模型中的治疗效果(在感染后第3天治疗)，其中包括病毒载量(A区)以剂量依赖性的方式降低，以及显示肺部炎症减轻的其他指标：NK细胞和PMN细胞(B区)以及干扰素γ(IFNγ)(C区)。

图14显示的是以低剂量的3G12、3D3或抗体治疗后小鼠模型内病毒滴度的时程，说明了本发明的高亲和力抗体的巨大优势。

图15是根据抗体对RSV感染小鼠肺内RSV拷贝数的效应而绘制的剂量/效应曲线，其中小鼠在感染后第3天进行治疗。

图16显示的是 3D3和3G12在感染后期以及感染后第3天进行治疗后降低病毒载量的能力比较。

图17显示的是对照抗体、抗F抗体和抗G抗体对RSV感染小鼠肺内的BAL 细胞的效应。在感染后第3天进行治疗。

图18A和18B显示的是当感染后第3天给予抗体时，抗G mAb的F(ab’)₂免疫特异性片段在抑制RSV感染小鼠的炎症方面与完整mAb一样有效，但是却不能降低病毒载量。

图19A-19C显示的是在给予抗体后的不同时间点，从预防性给药(-1天)到感染后第3天和第5天，抗G mAb对BAL内IFNγ的影响。

图20显示的是感染RSV的老年患者体内的抗RSV G蛋白中央保守区的抗体滴度。根据临床体征和症状的严重程度来筛选患者，分为重度或轻度。疾病严重的患者检测不到抗中央保守区的抗体。

实现本发明的模式

在本文中，术语“治疗”是指减轻已感染RSV的对象体内的病毒负担，或者缓解该患者的疾病症状。这种症状包括支气管炎、呼吸道炎症、肺阻塞和呼吸困难。

术语“赋予耐受性”是指预防性效应，其中一旦感染RSV，病毒感染的严重程度至少可降低。

“永生化细胞”是指传代次数明显高于未修饰原代分离细胞时还能存活的细胞。当用于本发明时，“永生化”并不一定意味着细胞能在一个很长的时期内持续分泌抗体，只表示细胞的存活时间长于原代细胞培养物。抗体分泌的持续时间只需足以完成其鉴定和编码核苷酸序列的回收就可以。

术语“给予人类对象时免疫原性很低”是指给予人时的反应与人抗体或人源化抗体给予这类人时产生的反应类似。已知人抗体或人源化抗体可在5-10％的被治疗人群内激发反应。即使抗体来源于人也会发生这种情况，因为所激发的免疫反应中存在一定水平的背景“噪音”。免疫反应可以是体液免疫，也可以是细胞免疫，或者二者都存在。更特别的是，研究发现在这部分个体中细胞因子的水平升高。

术语“RSV G蛋白的保守区”是指包含CX3C区任何一侧的50个氨基酸以内的氨基酸序列，优选30个氨基酸，更优选的是20个氨基酸，在图2A中说明了特殊病毒株的保守区。保守区大多位于G蛋白CX3C特异区的上游部分。因此，以病毒株A2的RSV G蛋白为例来说，可用于本发明抗体的保守区从约160位残基开始延伸到188位残基，优选160-176。

本发明的抗体有多种理想特性。首先，它们能与多种RSV病毒株来源的G蛋白产生免疫反应，通常与A型和B型病毒株来源的G蛋白都能产生免疫反应。其次，它们与G蛋白有相当高的亲和力，其中有些抗体的亲和力范围＜2pM。因此，本发明的抗体的亲和力至少10nM，优选1nM，更优选的是500pM，更优选的是100pM、50pM、10pM或1pM，以及这些优选范例点之间的所有数值。是一种抗F蛋白的商品化抗体，其亲和力约为5nM。据估计，具有较高亲和力的抗F蛋白抗体Numax^TM(莫它维珠单抗(motavizumab))的亲和力约为50pM。本发明的抗体显示出了作为治疗药物的优越能力，并且显示能够在感染高峰时降低肺内的病毒计数。它们在感染按照自有时程发展时也显示出了这种能力。这一点对于RSV感染恢复期的对象来说尤其重要，因为此时对象依然能够继续散发病毒，因此能够在临床治疗后感染其他对象。抗体及其片段也可用于治疗感染症状，其中包括肺内的炎症。

本发明的抗体通过两种典型方式获得。在一种方法中，首先测定现有的上述单克隆抗体131-2G的序列，已知该抗体与G蛋白的保守区是免疫反应性的，然后通过将人恒定区与经过修饰的人可变区(重链和轻链)融合在一起。根据与131-2G抗体可变区的高同源性来选择可变区，然后进行修饰以插入131-2G的超级可变区氨基酸。一般来说，当可以确定如何正确选择替代氨基酸时使用这种人源化方法。对于131-2G来说，原始杂交瘤细胞系表达一个以上的轻链，因此需要确定实际上哪一个轻链负责结合RSV保守基序。本发明的发明者已对此进行了确认，在一个实施方式中，本发明抗体的例子是人源化形式的mAb131-2G。

在另一种方法中，本发明的抗体回收自感染RSV的人类供者，使用的方法为US 7,413,868、PCT出版物WO 2005/045396和WO 2008/008858所描述的专利性CellSpot^TM方法，本文已纳入作为参考。

在这个方法中，共分析了40例RSV感染供者的样品，每个血样得到约500,000个抗体产生细胞。因此，共分析了约20,000,000个不同的B细胞，检测它们是否能够分泌G蛋白保守区特异性的抗体。其中只有约10％的供者具有可用频度的Ga/Gb特异性克隆(即，病毒株非依赖性的)，即使最高频度的样品，这种克隆的含量也只有约1/50,000细胞。总之，理想细胞的频度约为0.003％，这种频度太低，无法通过标准方法回收，但是利用CellSpot^TM可以很容易地做到。图1显示的是24位供者对RSV抗原的反应性光谱。如该图所示，即使体内的抗体与A和B病毒株来源的G蛋白都有交叉反应的那些个体，这些抗体的发生率也远远低于与F蛋白或与Ga或Gb单独有免疫反应性的抗体。有奇高数量的克隆既识别F蛋白又识别G蛋白(被称为“混合物”)，这可能是因为它们都识别共有的糖类决定簇。这种抗糖类抗体的亲和力通常都很低，因此被排除在进一步考虑之外。这个队列的供者体内所发现的最高亲和力的抗体来自一个供者，其亲和力为1pM，该供者的Ga/Gb特异性克隆频度极低，约为1ppm。也就是说，如果不全面筛选所有供者的所有细胞根本不可能发现这个极佳克隆。

为了执行这种筛选，用EB病毒使B细胞永生化，并根据上述方法(参见实施例2的详细描述)进行评价。鉴定出成功的B细胞，获得编码已鉴定的单克隆抗体的核苷酸序列并测序。然后通过重组方法操作这些序列，用于在哺乳动物细胞系内生产抗体。

G蛋白功能的一个重要方面在于分泌形式的蛋白质s(G)，是通过50位残基附近的另一剪接位点产生的。病毒经过改造后不表达s(G)会导致肺浸润性细胞的水平下降(Maher等，Microbes Infect.(2004)6：1049-1055)。与此相反，用s(G)刺激小鼠可提高IL-5的产生和肺嗜酸性粒细胞增多(Johnson等，J Virol(1998)72：2871-2880)。相应的，抑制s(G)的活性对于有效治疗RSV是非常重要的。要达到此目的需要高亲和力的抗体，这在本领域是大家所熟知的(例如，美国专利7,083,950)。由于中央保守区与s(G)作为免疫调节因子的功能有特殊关系，因此抗s(G)的有效抗体应该以此基序为靶位。

我们在检测RSV感染对象来源的人B细胞群时，我们无偏向地搜索了能结合A病毒株和B病毒株来源的G蛋白的抗体(Ga/Gb交叉反应性抗体)。由于检测是全面的(40例对象，每例检测了约500,000B细胞)，一个明显的现象是所有能结合适于作图的线性表位的Ga/Gb交叉反应性抗体都能识别中央保守区内彼此几个残基内的表位。已知这个区是弱免疫原性的，如图2B所总结的那样(Plotnicky-Gilquin等，Virology(2002)303：130-137)，这与本文所报道的该区高亲和力克隆的低频度相一致。我们通过检查已发表的来源于75个以上的RSV分离株的G蛋白序列对该区的特征进行了进一步的鉴定。蛋白质的大多数残基在这个集合中都显示出了数种到多种多态性。其中有两个区明显没有多态性：能产生s(G)的另一剪接位点和所有Ga/Gb交叉反应性抗体都能结合的中央保守区(图2C)。也就是说，我们发现高度保守的区对于功能性来说是关键的，也是低免疫原性的。有多种机制造成了这种低免疫原性，例如，缺少适于有效提呈该区给组织相容性抗原以便于展示给免疫系统其余组分的临近蛋白酶催化裂解位点。无论何种机制，这个意外的结果是清楚的：那些能够存活的病毒显示出对该区的低免疫原性。因此我们预测，通过被动转移合适的抗体来激发免疫系统产生抗该区的活性将会成功，这在我们的动物模型中已经得到验证。另一剪接位点虽然同样保守，但是其免疫原性通常不低，这说明其重要性仅仅与s(G)的产生有关，因此它不适于用作获得性免疫治疗的靶位。

本发明的人抗体或人源化抗体可通过常规重组技术制备，例如用中国仓鼠卵巢细胞或其他真核细胞系制备，如昆虫细胞。另外，也可利用已知的技术在植物和转基因动物中制备重组材料，其中包括抗体，例如在牛奶中，或者在微生物中或在植物或昆虫来源的单细胞系统中。

另外，由于编码抗体的核苷酸序列是可用的，因此也可以利用重组方法(或通过蛋白酶催化处理蛋白本身)制备能结合相同表位的相关片段如Fab、F(ab’)₂或F_v片段，抗体可以制备成单链形式。生产重组抗体所用的许多技术都是本领域熟知的。

为了用于治疗，重组制备的抗体或片段可用合适的赋形剂制成药物组合物，并按照标准方法给药。药物组合物可包含本发明的单克隆抗体或片段作为唯一活性成分，尤其是与A和B病毒株来源的G蛋白都有交叉反应性的单克隆抗体或片段。另外，仅有的活性成分也可以是两种单克隆抗体，其中一种与A病毒株G蛋白有更强的反应性，而另一种与B病毒株G蛋白有更强的反应性。在所有这些例子中，也可以包含其他治疗因子，其中包括一种或多种与F蛋白有免疫反应性的抗体，或者能有效抗RSV或炎症的其他治疗因子。因此，组合物中也可以包含抗炎症药物如甾体类和非甾体类抗炎症化合物。另外，化合物可包括营养物质如维生素或抗体之外的其他任何有益化合物。

在一个实施方式中，在需要给予制剂以提高对感染的耐受性时，可以使用完整抗体，其中包括含补体的Fc区。一般来说，人类对象的抗体给药剂量为0.01-20mg/kg，或者在0.01-5mg/kg范围内，或者这些范围内的中间剂量。在一个实施方式中，给药剂量范围为0.1-1.0mg/kg。分数天、数周或数月重复给药也是有益的。也可以在1、2、5或10年后提供加强免疫。

在另一实施方式中，为了获得疗效以降低病毒载量，也可以使用完整抗体，其中包括含补体的Fc区。这种方案的给药剂量为0.001-50mg/kg，或者该范围内的中间值，如0.01、1或10mg/kg。也可以采用重复给药的方式。治疗药物应在确诊感染后立刻给予，虽然在数天内给药也包括在本发明的范围内。也可以采用重复给药的方式。为了减轻肺内的炎症反应，可以只给予抗体的免疫特异性片段。其剂量与完整抗体相同。给予免疫特异性片段和完整抗体的混合物也包括在本发明的范围内。

本发明的抗体组合物通常通过注射给药，一般来说是静脉注射。因此优选胃肠外途径给药。但是任何可行的给药模式都包括在内。

用于抗体组合物给药的制剂可利用本领域熟知的常见方式制备。标准处方集中可以找到合适的制剂，如《雷明顿药学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)，最新版，宾西法尼亚州默克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA)，本文已纳入作为参考。制剂通常是适于胃肠外途径给药的那些制剂，如等渗溶液，其中包含缓冲液、抗氧化剂等，以及包含转移载体如脂质体、微粒和纳米颗粒的乳化剂。

理想的方案和制剂依赖于参与医师的判断以及对象的特定状况。给药剂量取决于对象的年龄、一般健康状况和感染的严重程度，如果有感染的话。

下面所提供的实施例是用于说明而不是限制本发明。

实施例1

131-2G的克隆和人源化

mAb 131-2G的克隆和测序。按照厂家的说明书从131-2G杂交瘤中提取总mRNA(RNeasy^TM试剂盒：加拿大QSC公司(Qiagen Santa Clarita，Ca))。设计7 个家族特异性5’VγFR1引物用于靶向Ig的VH1到VH7基因家族，其中一个共有的3’Cγ1引物用于扩增131-2G的重链可变区并测序。一个共有的5’Vk引物用于扩增Vk家族的每一个成员，一个κ恒定区特异性的反向引物用于扩增κ轻链并测序。利用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)从100ng总RNA中扩增VH和VL转录子。

131-2G杂交瘤需要两个PCR反应：一个反应用于轻链κ(κ)，一个反应用于γ重链(r)。一步RT-PCR试剂盒用于扩增(恰根公司(Qiagen)，目录号210212)。利用恒定区特异性的引物对提取的PCR产物直接测序。利用V-BASE2比较衍生序列与已知种系Ig V-和J-区的DNA序列，并将VH和VL基因与小鼠种系基因数据库进行比对。序列分析：从核苷酸序列信息中获得131-2G重链和轻链的V和J基因有关的数据。根据序列数据设计131-2G Ig VH和VK链前导序列特异性的新引物对。V基因的用途和序列分析：131-2G的重链基因来源于VH1种系基因家族，D区的种系基因是DSP2.2，J区来源于JH3种系。轻链基因来源于Vκ1(κ1A5)和Jκ4种系基因家族。

131-2G使用了IgH-VJ558VH1家族的V区段：

M G W S W I F L F L L S G T A G V H S E

1 ATGGGATGGA GCTGGATCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT CCACTCTGAG

V Q L Q Q S G P E L V K P G T S V K I S

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C K A S G Y S F T G F T M N W V K Q S H

121 TGCAAGGCTT CTGGTTATTC ATTCACTGGC TTCACCATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT

G K N L E W F G L I N P F N G N T G Y N

181 GGAAAGAACC TTGAGTGGTT TGGACTTATT AATCCTTTCA ATGGTAATAC TGGCTACAAC

Q K F K G K A T L T V D K S S S T A F M

241 CAGAAGTTCA AGGGCAAGGC CACATTAACT GTAGACAAGT CTTCCAGCAC AGCCTTCATG

E L L S L T S E D S A V Y Y C A R S G K

301 GAGCTCCTCA GTCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG ATCGGGAAAA

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361 TCCTATGATT ACGAGGCCTG GTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT

A

421 GCA

131-2G使用Igκv1亚组的V区段：

D I V M T Q T T L S L P V S L G N Q A S

1 GATATTGTGA TGACACAAAC TACACTCTCC CTGCCTGTCA GTCTTGGAAA TCAAGCCTCC

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181 TCTGGGGTCC CAGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAT ACTCAATATC

S R V E A E D L G V Y Y C F Q G S H V P

241 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TCTGGGAGTT TATTACTGCT TTCAAGGTTC ACATGTTCCA

F T F G S G T K L E I K R

301 TTCACGTTCG GCTCGGGGAC AAAGTTGGAA ATAAAACGGA

mAb 131-2G的人源化。抗体(Ab)与其同种抗原(Ag)的结合是高特异性的相互作用。这种特异性取决于Ab结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。组成Ab结合位点的残基主要来自于超级可变区和补体决定区(CDR)；有时候来自于非超级可变区(框架区)的残基会影响整个区的结构，因此也会影响结合位点。

小鼠VH基因区段群的容量二倍于人，与人IgH位点相比其中包含更多的功能基因。小鼠位点和人位点之间没有很大的相似性。VH和VL区头两个CDR的主链构型形成一小群结构，被称为极限结构。特定极限结构的存在主要是由CDR的长度以及序列特定位点上的关键残基决定的。在人VH1和小鼠VH1家族之间，VH1家族(VH11-2)具有共同的极限结构。根据131-2G重链和轻链的序列分析结果和131-2G使用IgH-VJ558家族和Igκ1家族的V区段的事实，将两个链进行比对并与人VH1和Vκ1家族的成员比较。结果发现与人VH1-8和Vκ1-18的种系序列分别有70％和77％的序列一致性。这些种系用作人源化131-2G mAb的人框架。

mAb 1312G表位定位。RSV裂解物和纯化Ga蛋白的蛋白质印迹分析结果显示131-2G可识别线性表位。利用一组RSV-GA2蛋白序列来源的重叠肽对131-2G的结合区进行表位定位。图2A是G蛋白序列的示意图，其中包括保守CX3C基序的定位。为了获得精细的表位定位图，对一个Ga来源的12-聚肽家族进行逐个碱基扫描。这种肽的阵列可与1μg/ml的131-2G mAb杂交。通过过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体染色然后利用超级信号化学发光检测系统(美国皮尔斯公司(Pierce，Rockford IL，USA))来检测131-2G的结合。如图3所示，131-2G抗体可与RSV-Ga蛋白上的8个连续肽反应，其位置为157-176。131-2G识别的表位在肽序列(157)SKPNNDFHFEVF(169)和(169)HFEVFNFVPCSI(176)内。根据8个肽的共有序列，可以将131-2G的结合区定位在164-168位残基。

有三种方法可用于确定131-2G及其人mAb类似物的亲和力特征。第一种方法是利用ELISA测定固定量的抗体与系列稀释的抗原的结合信号。这种滴定曲线的中点就是亲和力的近似值。对于131-2G来说，中点为4nM。第二种方法是在商业分析实验室中通过Biacore分析测定131-2G的亲和力；根据开放率和关闭率的比值，经过计算得出亲和力为7nM。第三种方法是，用血清白蛋白稀释CellSpot^TM磁珠上的Ga蛋白可降低多拷贝蛋白与抗体足迹相互作用的机会。根据所得到的原始信号多齿亲和力效应的抑制作用可以分析出一组克隆相对于已知标准品的亲和力大小次序。这种亲和力数值可用于比较人抗体和131-2G以及有效筛选高亲和力的克隆。如果有来源一致的G蛋白抗原，所有这些方法都可以得到改进。在我们最初的研究中，抗原是从病毒感染的细胞中提取的。由于用这种方法制备出的抗原质量差异较大，因此我们开发出了一种重组表达系统用于制备G蛋白，结果证明这种系统更可靠。

实施例2

分泌抗RSV-Ga/Gb抗体的人B细胞的分离

来自于40位确诊感染RSV的成人的外周血单个核细胞用于筛查产生抗病毒抗体的人B细胞。具有抗RSV附着G蛋白的理想抗体的对象用于抗RSV-G特异性mAb的克隆。筛查的结果是约有10％的对象所包含的理想细胞的频度超过1/100,000。然而，即使频度更低的那些对象也是有意义的，事实上，所鉴定出的具有最高亲和力的抗体来自于一个理想B细胞频度极低的供者，其频度约为1ppm。

为了完成稀有理想细胞的筛查和回收，我们使用了以前所描述的CellSpot^TM技术。CellSpot^TM分析方法通过捕获单个细胞分泌的IgG作为细胞附近的足迹从而有效地将ELISA等价分析方法缩小成一个临近单细胞维度的虚拟孔。这样就可以很容易地分析数百万个细胞。另外，利用显微复合试剂(组合染色的荧光胶乳微球，参见US 6,642,062)可以确定每一个克隆所分泌的抗体足迹的详细特征，其中包括利用多种生化探针确定特异性和/或亲和力。定量分析的保真度足以确保从筛查群体中回收到极其稀有的理想细胞，克隆的表达细胞所具有的表型与最初的鉴定结果一致。

筛选标准是：与被称为Ga和Gb的两个主要病毒株来源的G蛋白家族都能结合，但是不与F蛋白(另一种主要病毒包被蛋白)结合。克隆的亲和力大小次序可通过用血清白蛋白稀释磁珠上的抗原来确定。这种稀释将降低与分泌的IgG足迹多齿结合的机会(“亲和力”效应)，因此可用于筛选较高的内在亲和力。 G蛋白从感染两种RSV病毒株中的一种或另一种的Vero细胞中纯化。

在用于人B细胞时，方法始于用标准磁珠分离方法耗竭PBMC内的非B细胞。细胞以10⁶/ml的浓度重悬在IMDM/20％HI-FCS中；添加1∶100稀释度的EBV(从感染的B95-8细胞上清中得到的沉淀物)，细胞在37℃孵育2小时。洗去过量的病毒，以2×10⁶/ml的浓度培养细胞，培养基为IMDM、20％HI-FCS、20％巨细胞瘤条件培养基、2μg/ml CpG(ODN2006)和10ng/ml IL-10，细胞只用于筛查，或者利用磁珠阳性筛选方法筛选表面IgG。细胞接种到照射的人肺细胞(MRC-5，5000个细胞/孔)上，密度为200-300细胞/孔，培养基为IMDM、20％HI-FCS、20％巨细胞瘤条件培养基、2μg/ml CpG(ODN2006)和10ng/mlIL-10。培养基每2-3天更换一次。在第6天时，孔内的一半内容物用于CellSpot^TM分析。通过筛查结果呈现阳性的少数孔内的剩余细胞稀释到10、5、1和0.5个细胞/孔，滋养细胞和培养条件同上。4-5天后这些有限稀释的培养板再用ELISA或CellSpot^TM分析。

有限稀释的阳性孔的内容物利用RT-PCR处理以回收编码抗体重链和轻链的多聚核苷酸。从解冻PBMC到通过RT-PCR回收编码mRNA序列需要10-12天。

图4显示的是该试验的示例性数据。A区和B区分别说明了理想和非理想供者血样的CellSpot^TM模式。初次检测时得到的理想克隆的模式显示在C区，D区显示的是HEK293细胞分泌的抗体重复模式，其中细胞转化了该细胞来源的cDNA克隆抗体。在分析精确度内模式是一致的，这说明已经成功地回收了理想克隆。

如图1所示，大多数抗RSV抗体是针对F蛋白的，或者针对F和G共有的抗原决定簇(最大的可能是糖类，因为两个蛋白没有序列同源性)。大多数G蛋白特异性抗体只结合Ga或只结合Gb，这与已知的G蛋白的高序列变异性相一致。总共筛查了约2千万个B细胞。通过RT-PCR回收12个最有希望的抗体。总体来说，理想克隆的频度低于百万分之一，需要5千万次以上的ELISA等价分析才能发现那些稀有克隆。因此，CellSpot^TM技术能更全面地筛查克隆，更有实用性。得到的克隆的质量优于更有限筛选所发现的那些克隆，高质量组的共有特征显示出了理想抗体的意外特性。

实施例3

抗RSV-Ga/Gb人抗体的克隆

利用半巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增阳性ELISA孔的重排Ig重链和Ig轻链基因。为了扩增推测的未知V基因重排序列，构建家族特异性V基因引物的集合，这些引物可识别人Ig位点内的几乎所有V基因区段。5’引物与Cγ、Cκ和Cλ基因区段特异性引物的混合物一起使用。通过比较不同子代细胞的V基因扩增序列可以确定有限稀释的RSV-G特异性B细胞的克隆形成能力，扩增出的全长V基因重排序列克隆到IgG表达载体内。这种方法还可用于解决其他问题，例如，V-、D-和J-基因的用途和体细胞突变是否存在以及体细胞突变的模式。

方法。利用商用RNA纯化试剂盒(RNeasy^TM；恰根公司(德国))从人分离的B细胞提取总mRNA。利用总RNA制备物和寡核苷酸引物进行反转录PCR。每个样品运行三个PCR反应：一个用于扩增轻链κ(κ)，一个用于扩增轻链λ(λ)，一个用于扩增γ重链(γ)。一步RT-PCR试剂盒用于扩增(恰根公司，目录号210212)。在偶联RT-PCR反应中，利用RT酶的独特混合物(Omniscript^TM和Sensiscript^TM)合成cDNA，引物为C-κ、C-λ相应的或Cγ基因的CH1区共有序列相应的反义序列特异性的引物，RT在50℃运行1小时，随后用高特异性和高敏感性的HotStarTaq DNA聚合酶PCR扩增cDNA。所有PCR反应都用5’正义引物的混合物。引物序列根据VH、VK和VL前导序列设计。PCR反应在95℃运行15分钟进行初始热启动，然后运行20个循环，每个循环包括95℃运行30秒(变性)、60℃运行45秒(复性)、72℃运行1分钟(延伸)。

用于检测可变区Ig片段并将其克隆到表达载体内的巢式PCR。在第二轮中，使用一管5μl第一扩增反应产物。所用的引物包含5’BglII和3’XbaI限制性酶切位点。PCR运行30个循环。第一轮和第二轮扩增所用的条件一致。用1％琼脂糖凝胶分离反应产物，每种产物上载5μl，然后用溴化乙锭染色。据估计，扩增VH和VL重排片段得到的V-C PCR产物分别为500bp和450bp。在凝胶上出现约500bp大小的PCR条带说明结果是阳性的。纯化PCR产物(Qiagen凝胶纯化试剂盒，目录号28704)，提取出的PCR产物用恒定区特异性的引物直接测序。克隆片段的序列通过测定为重组生产而制备的质粒的序列来确定。

图5A显示的分离自人类对象的本发明抗体的重链氨基酸序列和人源化131-2G的氨基酸序列，其中包括可变区、D和J结合区、框架区(FR)和补体决定区(CDR)。图中所列的所有抗体与来源于A病毒株和B病毒株的G蛋白都有免疫反应性，只有抗体3F9除外，这个抗体只和来源于A病毒株的G蛋白有免疫反应性。图5B显示的是这些抗体的轻链具有相似的序列信息。序列表中的破折线代表不同长度的基因序列的排列校正。

消化上述PCR片段，然后克隆到携带人γ1的恒定区或者人κ或λ的恒定区的各个表达载体内，用于在体外用哺乳动物细胞生产抗体。编码重链和轻链的表达载体共转染到293(人肾)细胞系(因维曲根公司(Invitrogen))内。表达质粒用阳离子脂质转染试剂(293fectin^TM；因维曲根公司)转导。每一个转染反应用20μg纯化质粒，40μL 293fectin^TM与1mL (因维曲根公司)混合，混合前在室温下孵育5分钟，在室温下放置20分钟使其形成复合物。DNA-293fectin复合物添加到3×10⁶细胞内，细胞接种到90mm培养皿内，在37℃、8％CO2中培养。在最后阶段，转染后72小时收获上清，通过离心(3,000g，15min，4℃0回收分泌的抗体。

实施例4

本发明抗体的表位作图和亲和力测定

利用实施例1所描述的在先领域131-2G抗体表位作图有关的技术可以确定本发明抗体的相应表位。利用实施例1所描述的mAb 131-2G有关的方法确定本发明抗体的亲和力。

如下面的表1所示，三个抗体可与构型表位结合，即，通过结合重叠肽无法对其定位。表中还列出了定位到特异性序列上的本发明的抗体。表中还列出了亲和力常数，该常数是利用重组Ga和Gb蛋白有关的标准Biacore分析确定的，根据测定的开放率和关闭率计算出来，表示为pM。这些抗体中的两个抗体的数据显示在图6中。A、B和C区显示的是3G12的结合数据，D、E和F区显示3D3的数据。第一行显示的是用抗体加载生物传感器芯片，中间行显示的Ga蛋白流过芯片然后用缓冲液洗涤产生的信号，下一行显示的是Gb蛋白的信号。信号的增强程度可用于计算开放率，而洗涤期间信号的下降程度可用于计算关闭率。开放率和关闭率的比值为亲和力常数Kd。

表1

*与131-2G相同的表位

实施例5

与G蛋白结合和与病毒颗粒结合的比较

图7显示的是使用活病毒进行ELISA所得到的结果以及利用标准辣根过氧化物酶试验评价结合活性所得到的结果。各种来源的病毒制备物用于包被培养板，病毒制备物用pH9.6的碳酸盐缓冲液配制，包被量为10⁵PFU/孔，在4℃过夜。在室温下培养板用PBST配制的5％牛奶(mik)封闭1小时。抗体的系列稀释液添加到孔内，抗体用封闭缓冲液稀释，在室温下作用1小时。为了检测，用封闭缓冲液按1∶2000稀释羊抗鼠Fcγ-HRP(杰克逊免疫公司(Jackson Immuno.))，添加到孔内，室温下作用1小时。培养板用PBST全面洗涤。在450nm处测定底物TMB的生成物。如图7所示，3D3能与活病毒良好结合，本发明的其他多种抗体也是如此。抗体的亲和力较弱，结果显示即使是10⁴ng/ml的抗体与活病毒也没有结合。图8显示的是抗体与重组蛋白的结合能力和与活病毒的结合能力的相关性。

图9A和9B是两张图，证明本发明的抗体与A2病毒株和A5病毒株的结合能力是相似的，其结果来自于上述分析方法。图9A显示的是3D3和3G12与相比，与病毒株A2能良好结合。PAB是商品化的抗所有RSV蛋白的多克隆羊抗体(开米肯公司(Chemicon)，目录号AB1128)。

图9B显示的是这些抗体也能与病毒株A5结合；需要说明的是，其X轴上的单位与图9A是不同的。同样的试验显示本发明的抗体可与多种临床分离株结合。

实施例6

中和试验

本发明所选择的抗体在体外中和病毒的能力利用标准蚀斑试验测定。HEp2细胞以2×10⁵细胞/孔的浓度接种到12-孔板上。第二天，用培养基制备系列稀释的抗体。将约200PFU/孔的RSV添加到抗体内，同时加入兔补体血清，室温孵育1小时。然后将200μl/孔抗体-病毒混合物添加给HEp2细胞，室温孵育2小时使其感染。感染期过后，去除培养基，所有孔内都添加包含1％甲基纤维素的培养基。培养板在35℃孵育6天，然后按如下方法固定细胞并染色，计数蚀斑数：从细胞培养层上吸去甲基纤维素，用100％甲醇在室温下固定细胞30分钟。然后用PBS配制的5％牛奶洗涤培养板三次。添加1∶500稀释的一抗(羊抗RSV多克隆抗体(开米肯公司，目录号AB1128))，抗体用PBS+5％乳蛋白的稀释，孵育1小时。然后加入1∶500稀释的二抗(ImmunoPure的兔抗羊抗体IgG(H+L)，标记有过氧化物酶)(TS公司(Thermo Scientific)，目录号31402)，抗体用含5％乳蛋白的PBS稀释，孵育1小时。培养板用1x PBS洗涤三次。加入一步氯化萘酚底物(1-Step Chloronaphthol substrate)(皮尔斯公司，目录号34012)后可以看到蚀斑，200μL/孔，反应10分钟。培养板用水漂洗，在空气中干燥。计数每个孔内的蚀斑数。

图10显示的是每微克(μg)人抗体所对应的蚀斑的绝对数的结果，其中也包括抗体的结果。这些数据说明在被检测的抗体中，3D3的活性最高。3G12的IC₅₀为15ng/ml，对应于这个试验其亲和力为100pM，而商用抗体的IC₅₀为300ng/ml，对应的亲和力为2nM。结果还显示和本发明的抗G抗体在这些条件下没有协同效应。

图11显示的是3G12抗体与相比对B病毒株的中和作用。中和数据(对照的％)是根据每个试验的160-180个蚀斑绝对数计算出来的。体外亲和力为1pM到5nM(表1)的本发明的抗体的EC₅₀值在10-100ng/ml之间。

实施例7

抗G抗体在小鼠体内的预防效应

我们检测了本发明的抗体、以及人IgG1预防小鼠感染RSV的能力。在感染前的-1天，对照组小鼠腹腔注射培养基和PBS。实验组小鼠分别注射0.15、1.5和15mg/kg抗体hIgG1(无免疫性的同种型对照抗体)或3G12、3D3或这个剂量约等于3μg、30μg和300μg/小鼠。

在第0天，小鼠通过鼻内给药接种1×10⁶pfu RSV长病毒株。在第0天和第5天，收集支气管肺泡灌洗液(BAL)和血清，同时测定体重、肺重量、肺叶切片内的pfu、病毒载量(通过qPCR测定)、肺组织学、总白细胞数、FACS和肺内的IFNγ。

图12显示的是利用上述蚀斑试验所得到的肺内病毒载量的结果。图12的数据说明在该试验中，3G12和3D3与一样有效。( 用于人时的剂量通常为15mg/kg)。

实施例8

抗RSV-Ga/Gb抗体的治疗效果

试验证明，针对RSV-G保守基序的抗体具有治疗效果。在第0天，小鼠鼻内给予10⁶pfu RSV，然后在第3天时腹腔注射3mg/kg的抗体，在第5天和第7天检测支气管肺泡灌洗液内的病毒载量。在这个模型中，感染比在人体内更容易被自然清除。然而，与不能结合RSV的对照抗体相比，抗体治疗可以剂量依赖性的方式导致病毒被加速清除(图13A)。每个治疗组包含5只动物，结果是有统计学意义的。

如WO 00/43040所述，抗P物质的抗体在减轻RSV导致的肺部炎症方面是有益的，在动物模型中病程延长，这是RSV感染的一个重要临床特征。P物质的表达上调依赖于活化的G蛋白(Haynes，L.M.等，J.Virol.(2003)77：9831-9844)。我们还观察到用本发明的抗体治疗后肺部感染的指标下降，其中包括炎症性NK和PMN细胞数量减少(图13B)以及细胞因子如IFNγ含量降低(图13C)。

在另一个试验中，小鼠通过鼻内给药接种10⁶pfu RSV A-型长病毒株。

在第3天，包含4-5只小鼠的各组进行如下处理：

第1组：在第0天未进行病毒感染的对照组用PBS处理。

第2组：在第0天接种RSV的阴性对照组在第3天时用PBS处理。

第3组：在第0天接种RSV，腹腔注射用生理盐水配制的抗体，剂量为1、10或100μg/只，或者0.05、0.5或5mg/kg。

第4组：在第0天接种RSV，使用与第3组相同的方案给予mAb 3D3。

第5组：在第0天接种RSV，使用与第3和4组相同的方案给予mAb 3G12。

在第0、3、5、7和10天收集肺和BAL液。另外，测定体重、肺重量、肺叶切片内的pfu、通过qPCR测定病毒载量、肺组织学、总白细胞数、FACS和BAL内的IFNγ。10μg mAb给药组的qPCR结果显示在图14中。

如图所示，用剂量相对较低的抗体处理时， -处理组和未处理组小鼠的病毒滴度是相似的，而在第5天感染达到峰值时，3D3处理组和3G12处理组小鼠的病毒滴度却大大降低。这个试验证明体外的高亲和力与体内的高活性是相关的。

图15显示的是剂量反应曲线，证明在第7天时浓度比更低的3G12和3D3能够降低RSV拷贝数，结果是通过qPCR测定的。3D3的活性尤其高，这与其在体外具有较高的亲和力是一致的。

同样，在第10天通过qPCR测定病毒数时，虽然在这个时间点病毒滴度很低，这是因为有小鼠免疫系统的自然清除作用，但是各个剂量浓度的3D3的活性都比高约100倍，如图16所示。这个试验证明了高亲和力抗体的实用性，即使在抗原浓度下降时这种抗体也是有效的。该疾病在人体内的病程要远远长于在小鼠体内的病程，这样就更有必要在延长的期间内使用抗体继续中和病毒。

在其他试验中，小鼠分为抗G mAb处理组和抗F mAb处理组，每组4只小鼠，每个试验重复三次。在第0天免疫小鼠，在第3天用抗体治疗小鼠，在第3、5和7天时测定各项疗效指标。

支气管肺泡灌洗液(BAL)内的炎症细胞数是一项疗效指标，三组的测量结果显示在图17中。Y轴上的点代表每个肺内的BAL细胞数，从0到140×10³。结果显示，与同种型对照非免疫抗体相比，在第5天时抗F mAb能降低BAL细胞数/肺，而抗G mAb能够更明显地降低BAL细胞计数。到第7天时，感染按自己本身的进程发展。

图18A和18B显示的是抗G mAb(小鼠131-2G)和抗G F(ab’)₂的疗效比较，其中抗G F(ab’)₂是通过用胃蛋白酶裂解该抗体并利用固化的蛋白A去除Fc段而获得的。试验证明，补体对抗G抗体的体外抗病毒效应是十分重要的，这在图18A中得到了确认，其中抗病毒效应表示为pfu/g肺组织。试验按实施例6所述进行。抗G抗体的F(ab’)₂片段缺少补体介导活性所必须的IgG的Fc段，在降低病毒载量方面不如对照有效，而抗G mAb是非常有效的。然而，当以炎症作为结果的测定值时，如图18B所示，抗G mAb的F(ab’)₂片段与完整抗体一样有效。这个试验说明对G蛋白的中和作用是减轻呼吸道炎症的关键。由于病毒可主动分泌可溶性的G蛋白，并且对于可溶性因子的中和来说高亲和力结合是十分重要的，因此，预计本发明的高亲和力抗体尤其可用于抗炎治疗。

图19A、B和C显示的是在给予抗G mAb后，抗G mAb对BAL内IFNγ表达量的影响，该细胞因子可作为呼吸道炎症的标志物。在所有例子中，无免疫性的对照抗体不能使抑制伴随呼吸道炎症反应而导致的IFNγ分泌量升高。但是如果在第-1天(A区)、第3天(B区)甚至第5天(C区)给予抗G mAb，则在给药后第7天使IFNγ的水平明显降低。这个试验说明可利用抗RSV G蛋白保守基序的抗体治疗病毒载量峰值过后的炎症反应。

实施例9

感染对象的内源性抗体的特异性

利用如下合成肽检测血清样品的免疫反应性，其中血清样品来自于4位患严重

(二硫键如图所示)

这个肽代表了RSV A2病毒株G蛋白的保守区。试验利用实施例5所描述的ELISA方法完成。抗体与该肽的免疫反应性水平与疾病的严重程度相关，疾病较轻的对象所显示的病毒滴度要高于病情严重的对象(参见图20)。这些结果说明与G蛋白这个部分有免疫反应性的抗体可有效减轻感染。

Claims

1.一种分离的单克隆抗体(mAb)或至少包含该抗体之可变区的免疫反应性片段，所述抗体：

(a)能结合呼吸道合胞病毒(RSV)A2病毒株G蛋白160-176位残基之内的表位，

(b)是一种人抗体或其片段，

(c)与Ga和Gb都有反应性，

(d)在蚀斑减少中和试验(PRNT)试验中的EC₅₀小于500ng/ml，以及

(e)以开放率/关闭率的比值所测得与RSV A2的G蛋白的亲和力低于1nM；

所述抗体或片段包含：

由EHAMH(SEQ ID NO：31的31-35位)组成的重链CDR1区，由GISWNSGSVGYADSVKG(SEQ ID NO：31的50-66位)组成的重链CDR2区，和由MVATTKNDFHYYKDV(SEQ ID NO：31的99-113位)组成的重链CDR3区，以及由KASQSVSNHLA(SEQ ID NO：45的24-34位)组成的轻链CDR1区，由ESTNRAT(SEQ ID NO：45的50-56位)组成的轻链CDR2区，和由QQRNNWYT(SEQ ID NO：45的89-96位)组成的轻链CDR3区(3D3)，或

由SSNYYWG(SEQ ID NO：29的31-37位)组成的重链CDR1区，由SIHDSGSIYYNPSLRS(SEQ ID NO：29的52-67位)组成的重链CDR2区，和由HLVWFGELRNNWFDP(SEQ ID NO：29的100-114位)组成的重链CDR3区，以及由RASQSVNSNLA(SEQ ID NO：43的24-34位)组成的轻链CDR1区，由GASTRAT(SEQ ID NO：43的50-56位)组成的轻链CDR2区，和由QQYNNWPL(SEQ ID NO：43的89-96位)组成的轻链CDR3区(3G12)，或

由TYPIS(SEQ ID NO：33的31-35位)组成的重链CDR1区，由RIIPDPPMANIAQKFQG(SEQ ID NO：33的50-66位)组成的重链CDR2区，和由EILQSPPFAVDV(SEQ ID NO：33的99-110位)组成的重链CDR3区，以及由TGSSSDVGGYSHVS(SEQ ID NO：47的23-36位)组成的轻链CDR1区，由EVSNRPS(SEQ ID NO：47的52-58位)组成的轻链CDR2区，和由GSYASTNILH(SEQ ID NO：47的91-100位)组成的轻链CDR3区(2B11)，或

由TYYIH(SEQ ID NO：37的31-35位)组成的重链CDR1区，由VINPSGGSTTYAQKFQD(SEQ ID NO：37的50-66位)组成的重链CDR2区，和由VHKGRAEQWQLLHGHFDL(SEQ ID NO：37的99-116位)组成的重链CDR3区，以及由KSSQSVLYSSNNKTYLA(SEQ ID NO：51的24-40位)组成的轻链CDR1区，由WASTRES(SEQ ID NO：51的56-62位)组成的轻链CDR2区，和由QQYYTTP(SEQ ID NO：51的95-101位)组成的轻链CDR3区(1D4)，或

由SGQYYWA(SEQ ID NO：38的31-37位)组成的重链CDR1区，由SIHYSGSTYQNPSLKS(SEQ ID NO：38的52-67位)组成的重链CDR2区，和由QQLSLSPVENWFDP(SEQ ID NO：38的100-113位)组成的重链CDR3区，以及由RASRSVGSRLA(SEQ ID NO：52的24-34位)组成的轻链CDR1区，由AASTRES(SEQ ID NO：52的50-56位)组成的轻链CDR2区，和由QQYKEWPL(SEQ ID NO：52的89-96位)组成的轻链CDR3区(1G8)，或

由GYAMH(SEQ ID NO：40的31-35位)组成的重链CDR1区，由VISFDGSNNYYADSVKG(SEQ ID NO：40的50-66位)组成的重链CDR2区，和由PDVIAVAGTALSNPFDL(SEQ ID NO：40的99-115位)组成的重链CDR3区，以及由RASQSVRSNLV(SEQ ID NO：54的23-33位)组成的轻链CDR1区，由GASTRAT(SEQ ID NO：54的49-55位)组成的轻链CDR2区，和由QQNNNWPP(SEQ ID NO：54的87-95位)组成的轻链CDR3区(10C6)。

2.如权利要求1所述的mAb或片段，其中，所述可变区

包含重链序列EEQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGLRFEEHAMHWVRQAPGRGLEWVSGISWNSGSVGYADSVKGRFTTSRDNAKDILFLEMNTLRSEDTALYFCAIMVATTKNDFHYYKDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：31)和轻链序列QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASQSVSNHLAWYQQKPGQAPRLLIYESTNRATGIPPRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNNWYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：45)(MAB 3D3)，或

包含重链序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYYWGWIRQPPGKGLEWIASIHDSGSIYYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHLVWFGELRNNWFDPWGQGTLVTVASA(SEQ ID NO：29)和轻链序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVNSNLAWYQHKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLFGPGTKVDLKR(SEQ ID NO：43)(MAB 3G12)，或

包含重链序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVPCKASGGTFSTYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPDPPMANIAQKFQGRVSFSADKSTTIVYMELSSLRSEDTAVYFCAREILQSPPFAVDVWGQGTMVAVSS(SEQ ID NO：33)和轻链序列QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYSHVSWYQQHPGKVPKLIISEVSNRPSGISNRFSGSKSANTASLTISGLQPEDEADYYCGSYASTNILHYVFGTGTKVTVLS(SEQ ID NO：47)(MAB 2B11)，或

包含重链序列QVQLLQSGAELKKPGASVKVSCQASIDTFSTYYIHWVRQAPGQGLEWLGVINPSGGSTTYAQKFQDRITLTTDTSTRTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARVHKGRAEQWQLLHGHFDLWGRGSLVTVSS(SEQ ID NO：37)和轻链序列DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKTYLAWYQQKPRQPPELLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTNFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：51)(MAB 1D4)，或

包含重链序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGQYYWAWIRQAPGKGLEWIGSIHYSGSTYQNPSLKSRLTISVDTSRDQISMKLSSVTVAESAVYYCAKQQLSLSPVENWFDPWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO：38)和轻链序列EIVVTQSPVTLSVSPGESAALSCRASRSVGSRLAWYQQKPGQPPRLLIFAASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLIISGLQSEDYAVYYCQQYKEWPLFTFGPGTTVDSKR(SEQ ID NO：52)(MAB 1G8)，或

包含重链序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCEASGFTFSGYAMHWVRQAPAKGLEWVAVISFDGSNNYYADSVKGRFTISRDNSKNMLFLQMNSLRAEDTAVYYCVRPDVIAVAGTALSNPFDLWGLGTMVTVSSAS(SEQ ID NO：40)和轻链序列EIVMTQSPATLSVSPGERALSCRASQSVRSNLVWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFALYFCQQNNNWPPTFGQGTRLEIKR(SEQ ID NO：54)(MAB 10C6)。

3.如权利要求1或2所述的mAb，其为完整抗体的形式。

4.一种或多种核酸分子，其包含编码如权利要求1-3中任一项所述的mAb或片段的第一核苷酸序列，或者一种或多种核酸分子，其包含与所述第一核苷酸序列的全长互补的第二核苷酸序列。

5.产生如权利要求1-3中任一项所述的mAb或片段的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是哺乳动物细胞、微生物细胞、昆虫细胞或植物细胞。

6.一种制备mAb或其免疫反应性片段的方法，该方法包括培养如权利要求5所述的细胞以及回收所述mAb或片段。

7.一种药物组合物，其包含如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体或片段以及药学上可接受的赋形剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，还包含RSV免疫反应性抗体之外其他药物以及药学上可接受的赋形剂；或者

还包含与RSV的F蛋白有免疫反应性的一种或多种单克隆抗体或其片段。

9.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或片段或者如权利要求7或8所述的组合物在制备治疗感染RSV的人类对象中的RSV所用药物中的应用。

10.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或片段或者如权利要求7或8所述的组合物在制备减轻感染RSV的人类对象的呼吸道炎症所用药物中的应用。

11.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或片段或者如权利要求7或8所述的组合物在制备提高人类对象对RSV感染的耐受性所用药物的应用。