PT705109E - Adjuvantes para vacinas contra virus sinciciais respiratorios - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

" ADJUVANTES PARA VACINAS CONTRA VÍRUS SINCICIAIS RESPIRATÓRIOS "

Antecedentes da Invenção 0 Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é uma das principais causas da doença do tracto respiratório inferior em recém-nascidos e na primeira infanda (Mclntosh e Chanock, 1985, em Virology, Fields, B. (ed), Raven, NY, páginas 1285-1304). Em todas as áreas geográficas, é a principal causa de bronqueolite e pneumonia em recém-nascidos e crianças jovens. O agente reinfe-cta frequentemente durante a infância, mas a doença provocada por reinfecção é geralmente mais leve do que a associada à infecção inicial e raramente provoca problemas graves. O vírus RS é um vírus revestido com RNA da família Paramyxo viridae e do género Pneumovirus. As duas principais proteínas de revestimento são a proteína G, que é responsável pela fixação do vírus à membrana celular do hospedeiro, e a proteína de fusão (proteína F), que é responsável pela fusão do vírus com as membranas celulares. A fusão vírus-célula é um passo necessário para a infecção. A proteína de fusão também é necessária para a fusão célula-célula que constitui outra forma de disseminar a infecção de uma célula infectada para uma célula não-infectada.

Os anticorpos dirigidos contra a proteína de fusão ou contra a proteína G podem neutralizar o vírus. Contudo, só anticorpos contra a proteína de fusão bloquearão a disseminação do vírus entre células, i.e., terão actividade anti-fusão. Assim, anticorpos contra a proteína de fusão protegerão contra vírus circulante ao mesmo tempo que inibem a disseminação, entre células, de uma infecção instalada. Verificou-se que os anticorpos contra a proteína de fusão (tanto anti-soros policlonais contra proteína de fusão purificada como anticorpos monoclonais que contêm actividade neutralizante e anti-fusão) são protectores contra infecção em modelos animais (Walsh et al., 1984, Infect. Immun. 43:756-758).

Um meio prático para protecção de recém-nascidos e crianças jovens contra doenças respiratórias do tracto superior e inferior seria a vacinação protectora contra vírus RS. A vacinação de grávidas (imunização activa) protegeria crianças jovens por transferência passiva de imunidade, quer através da placenta, quer através do leite materno. São possíveis várias abordagens para uma vacina contra o vírus RS, mas no passado algumas delas têm provado não terem êxito. A vacinação com vacina de vírus RS mortos foi testada e verificou-se que era ineficaz (Kim et al., 1969, Am. J. Epid. 89:422). Não só as crianças não ficam protegidas, mas nalguns casos, infecções subsequentes com vírus RS resultaram em doença atípica e mais grave do que nos controlos não-imunizados. Este fenómeno não é único do vírus RS e foi também observado em vacinas de paramyxovirus mortos tais como as do sarampo. Foi sugerido que a razão para o insucesso da vacina de vírus RS inactivados anterior era devida à inactivação dos epitopos biologicamente funcionais em uma ou em ambas as glicoproteínas do envelope virai. Quer isto dizer, os epitopos de neutralização e de fusão da vacina de vírus mortos estavam "desnaturados". Como resultado, o indivíduo vacinado não experimentava os epitopos de neutralização e de fusão biologicamente funcionais. Portanto, quando o indivíduo vacinado se deparava com um vírus vivo, a resposta de anticorpos resultante não proporcionava imunidade protectora. 3_ i/lMj

Em vez disso, havia uma resposta inflamatória mediada pelos anticorpos que frequentemente resultava numa doença muito mais grave (Choppin e Scheid, 1980, Rev. Inf. Dis. 2:40-61).

Uma segunda abordagem a uma vacina contra o vírus RS foi atenuar o vírus vivo. Mutantes sensíveis à temperatura (Wright et al, 1982, Infect. Immun. 37:397-400) e vírus de passagem atenuados (Belshe et al., 1982, J. Inf. Dis. 145:311-319) mostraram ser fracamente infecciosos e não eficazes na prevenção da doença quando utilizados como imunogénios em vacinas contra vírus RS. Contudo, nestes casos, não ocorria doença atípica como resultado da vacinação.

Com base no nosso conhecimento corrente da estrutura do vírus RS e da resposta imune à infecção, é claro que uma vacina útil para este vírus tem de ser eficaz na indução da produção de anticorpos contra a proteína de fusão e/ou a proteína G. De importância particular para a imunidade protectora é a produção de anticorpos que inibem a fusão e, portanto, podem parar a disseminação do vírus entre células no tracto respiratório. Adicionalmente, é útil induzir uma resposta imune mediada por células, incluindo a estimulação de células T citotóxicas (CTLs) que são úteis contra células infectadas por vírus RS. As várias formulações de vacinas da presente invenção são dirigidas para cumprir ambos estes objectivos.

Sumário da Invenção

Esta invenção relaciona-se com a descoberta de certos adjuvantes que são capazes de aumentar a resposta imunológica a proteínas de revestimento de vírus sincicial respiratório, especificamente à glicoproteína F de RSV e à glicoproteína G de RSV. Em particular, mostra-se aqui que o adjuvante QS-21, ou altemativamente, 3D-monofosforil lípido A mais alúmen, aumenta -4- signifícativamente a capacidade de anticorpos produzidos contra glicoproteínas F e/ou G de RSV para neutralizar o vírus bem como para proporcionar uma protecção imunológica através da resposta medida por células contra o vírus. Adicionalmente, mostrou-se que estes adjuvantes impedem a formação de sincicia em células infectadas por vírus. Com base nestas descobertas, podem ser feitas formulações compreendendo proteína(s) de revestimento de RSV e um adjuvante seleccionado de QS-21, 3D-MPL e suas combinações. A formulação opcionalmente pode conter alúmen. A adição de alúmen pode aumentar mais ainda a resposta imunológica ao(s) antigénio(s) de RSV quando administrado com estes adjuvantes. A presença destes adjuvantes proporciona imuno-genicidade acrescida ao antigénio por aumento da resposta imune, em particular, complementa a neutralização por redução de placas quando comparada com alúmen. Adicionalmente, a presença de adjuvantes permite que seja feita uma vacina com uma quantidade reduzida de antigénio(s).

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1. ilustra os resultados de citotoxicidadade mediada por células das experiências do Exemplo 5, que é aqui discutido.

Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção relaciona-se com formulações de vacinas e suas utilizações terapêuticas para prevenção da infecção por RSV. A formulação de vacina da presente invenção compreende (a) uma proteína virai sincicial respiratória (RSV) seleccionada do grupo que consiste em (i) glicoproteína G de RSV, (ii) glicoproteína F de RSV, (iii) um polipéptido quimérico compreendendo pelo menos um fragmento imunogénico de ambas as glicoproteínas F e G de RSV, e (iv) suas combinações, e (b) um adjuvante que se demonstrou aumentar a resposta imunológica à proteína de RSV. O adjuvante é seleccionado de QS-21, -5- monofosforil lípido A 3-desacilado e suas combinações, e opcionalmente alúmen. A presença de alúmen na vacina actua sinergicamente com 3D-MPL para produzir uma resposta de neutralização ao RSV.

Numa forma de realização da invenção, QS-21 é formulada com proteína G e/ou F de revestimento de RSV. QS-21 é uma saponina que é purificada a partir de extracto em crú de Quillaja saponaria e foi descrita por Kensil e Marciani, Patente U.S. 5,057,540. Os anticorpos produzidos contra formulações contendo QS-21 e proteína F de RSV ou proteína G e F de RSV podem neutralizar o vírus RS. A imunogenicidade de proteínas F e G de RSV é muito aumentada utilizando QS-21 como o adjuvante em comparação com formulações que não têm adjuvantes ou que contêm outros adjuvantes conhecidos, tais como alúmen quando utilizado unicamente como o adjuvante.

Outro aspecto da presente invenção é que os adjuvantes podem ser utilizados numa vacina com proteína G ou proteína F de RSV para produzir uma resposta imune, tais como resposta de anticorpos, que neutraliza tanto o subgrupo A como o subgrupo B dos vírus RSV. Esta é uma descoberta significativa uma vez que se verificou que outros adjuvantes, especificamente alúmen, com proteína G neutralizam só o subgrupo a partir do qual é purificada a proteína.

Noutra forma de realização, 3D-MPL pode ser utilizado em combinação com alúmen para produzir uma formulação de vacina que pode aumentar a estimulação de anticorpos neutralizantes dependentes de complemento contra RSV. A imunogenicidade de componentes de subunidades de RSV é grandemente acrescida com este adjuvante em comparação com formulações sem adjuvantes ou que contêm alúmen como o único adjuvante.

As proteínas e polipéptidos relacionados com o(s) epitopo(s) de neutralização e/ou fusão da proteína de fusão e/ou da proteína G do vírus RS são

Uuj úteis como imunogénios numa vacina subunitária para proteger contra doenças respiratórias do tracto inferior e outros sintomas de doença da infecção por vírus RS e podem ser formuladas nas vacinas da presente invenção. As vacinas subunitárias compreendem o material imunogénico relevante necessário para imunizar o hospedeiro e os adjuvantes, aqui identificados como imuno-moduladores potentes. As vacinas preparadas a partir de imunogénios produzidos por engenharia genética, imunogénios obtidos por síntese química e/ou imunogénios compreendendo proteína de fusão de vírus RS autêntica substancialmente pura ou seus fragmentos só ou em combinação com proteína G de vírus RS preparada de modo semelhante ou seus fragmentos, que são capaze de produzir uma resposta imune protectora são particularmente vantajosas porque não há risco de infecção para quem as recebe. Os polipéptidos quiméricos compreendendo pelo menos um fragmento imunogénico de ambas as proteínas F e G de RSV também podem ser utilizados nas formulações de vacinas desta invenção. Esses polipéptidos quiméricos foram descritos por Wathen, Patente U.S. 5,194,595. A proteína de fusão e/ou a proteína G de vírus RS e os polipéptidos podem ser purificados a partir de recombinantes que exprimem os epitopos de neutralização e/ou fusão. Esses recombinantes incluem quaisquer transformadores bacterianos, transformadores de leveduras, células de insectos cultivadas infectadas com bacilovírus recombinantes ou células de mamíferos cultivadas tal como conhecido na arte, por exemplo, tais como células de ovário de cobaio Chinês que exprimem os epitopos da proteína de fusão do vírus RS. A proteína ou polipéptidos recombinantes podem compreender cópias múltiplas do epítopo de interesse. A proteína relacionada com a proteína de fusão do vírus RS e/ou a proteína G ou polipéptido podem ser sintetizados quimicamente. Alternativa-mente, a proteína relacionada com a proteína de fusão do vírus RS ou polipéptido -Ί

ου. proteína relacionada com G podem ser isoladas na forma substancialmente pura a partir do vírus RS ou de culturas de células infectadas com vírus RS e formuladas com os novos adjuvantes como uma vacina contra RSV.

Independentemente do método de produção, a proteína de fusão ou a proteína G do vírus RS, a proteína relacionada ou polpéptido é ajustada para uma concentração apropriada e pode ser formulada com um adjuvante seleccionado de QS-21 ou 3D-MPL mais alúmen. O MPL 3-desacilado (3D-MPL) pode ser co-formulado com TDM e esqualeno e utilizado em formulações de vacinas da presente invenção. O 3D-MPL pode ser obtido de acordo com os métodos descritos na Patente Britânica N° 2220211 (Ribi Immunochem.). A quantidade de proteína em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos secundários adversos significativos. Essa quantidade variará dependendo do imunogénio utilizado. Geralmente cada dose compreenderá desde cerca de 0,1 até cerca de 100 pg de proteína, sendo preferidos cerca de 5 até cerca de 50 pg e altemativamente preferidos desde cerca de 5 até cerca de 25 pg/dose. A quantidade de adjuvante será a quantidade que induzirá uma resposta imuno-moduladora sem efeito secundário adverso significativo. Uma quantidade opcional para uma vacina particular pode ser determinada por estudos correntes envolvendo a observação dos títulos dos anticorpos da vacina e âs suas capacidades de neutralização do vírus. A quantidade de adjuvante será desde cerca de 1 até cerca de 100 pg/dose, sendo preferidos cerca de 5 até cerca de 50 pg/dose, e sendo altemativamente preferidos desde cerca de 20 até cerca de 50 pg/dose. A imunopotência de vacinas contendo a proteína de fusão e a proteína G do vírus RS ou os seus fragmentos imunológicos e suas misturas genéticas ou físicas pode ser determinada por monitorização da resposta imune de animais de ensaio após imunização com a proteína purificada, péptido sintético -8- ou proteína recombinante. Os ensaios podem incluir mas não se limitam a ratinhos, ratos, coelhos, primatas, e eventualmente seres humanos. Os métodos para a introdução do imunogénio podem incluir as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal ou qualquer outra via corrente de imunizações. A resposta imune dos indivíduos de teste pode ser analisada por abordagens múltiplas: (a) a reactividade do soro imune resultante a antigénios virais RS autênticos, tal como determinada através de técnicas conhecidas, e.g., ensaio de enzima ligado a imunossorvente (ELISA), "immunoblots", radioimunoprecipitações, etc., (b) a capacidade do soro imune para neutralizar a infectividade por vírus RS in vitro, (c) a capacidade do soro imune para inibir a fusão do vírus in vitro, a capacidade dos animais imunizados para produzir actividade de linfocitos citotóxicos T (CTL) dependentes de antigénio e (e) protecção contra a infecção por vírus RS.

Podem ser utilizados muitos métodos para administrar as formulações de vacinas aqui descritas a seres humanos para fins profiláticos. Estes incluem, mas não estão limitados a: vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea e intranasal. Os anticorpos secretores de IgA produzidos pelo tecido linfóide associado às mucosas podem desempenhar um papel principal na protecção contra a infecção por vírus RS impedindo a interacção inicial dos agentes patogénicos com a superfície das mucosas, ou por neutralização de epitopos importantes dos agentes patogénicos que estão envolvidos na infecção/ou disseminação da doença. A estimulação de respostas imunes das mucosas, incluindo a produção de anticorpos secretores de IgA pode ser de importância principal em conferir protecção contra infecção do tracto respiratório inferior e superior.

Os polipéptidos e proteínas podem geralmente ser formulados numa concentração na gama desde cerca de 0,1 pg até cerca de 100 pg por dose. -9-

Como veículos podem ser utilizados meios fisiologicamente aceitáveis. Estes incluem, mas não se limitam a: água estéril, soro fisiológico, soro tamponado com fosfato e outros semelhantes. Outros adjuvantes adequados podem ser adicionados às novas formulações de vacinas desta invenção e incluem geles minerais, e.g., hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, etc. O imunogénio também pode ser incorporado em lipossomas ou conjugado com polissacáridos e/ou outros polímeros para utilização numa formulação de vacina.

Os polipéptidos e proteínas que podem ser incorporados em formulações de vacinas da presente invenção podem estar ligados a um veículo macromolecular solúvel. Preferencialmente, o veículo e os polipéptidos e proteínas estão num excesso de cinco mil dalton após ligação, e mais preferencialmente, o veículo está num excesso de cinco quilodalton. Preferencialmente, o veículo é um poli amino ácido, quer natural quer sintético, que é imunogénico em animais, incluindo seres humanos. O modo de ligação é convencional. Muitas técnicas de ligação estão descritas na Patente U.S. N° 4,629,783. Muitos agentes de reticulação estão descritos em 1986-87 Handbook and General Catalog, Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois), páginas 311-340. São preparados vírus recombinantes que exprimem epitopos relacionados com a proteína de fusão e/ou proteína G do vírus RS. Estes vírus podem ser utilizados para preparar vacina virais recombinantes inactivadas para proteger contra infecções do tracto respiratório inferior e outros sintomas de doença do vírus RS.

As vacinas inactivadas estão "mortas" no sentido em que a sua infectividade foi destruída, geralmente por tratamento químico (e.g., formaldeído). Idealmente, a infectividade do vírus é destruída sem afectar as proteínas que estão relacionadas com a imunogenicidade do vírus. De forma a preparar vacinas inactivadas, têm de ser produzidas em cultura grandes - 10- quantidades do vírus recombinante que exprime a proteína de fusão e/ou proteína G do vírus RS, proteínas relacionadas ou polipéptidos para fornecer a quantidade necessária de antigénios relevantes. Pode ser utilizada uma mistura de vírus inactivados que exprime diferentes epitopos para a formulação de vacinas "multivalentes". Em certos casos, estas vacinas inactivadas "multivalentes" podem ser preferíveis a formulações de vacinas vivas devido às dificuldades potenciais com a interferência mútua de vírus vivos administrados conjuntamente. Em qualquer dos casos, o vírus recombinante inactivado ou mistura de vírus pode ser formulado com o adjuvante desta invenção de forma a aumentar a resposta imunológica aos antigénios.

As vacinas desta invenção podem ser administradas a um indivíduo para prevenir uma infecção ou sintomas de doenças associadas ao RSV. Essa administração pode ser realizada por uma dose única ou por doses múltiplas para produzir uma resposta imune primária no indivíduo. Tipicamente a vacinação múltipla será dada três vezes essencialmente a dois meses de intervalo para seres humanos. Podem ser dadas doses de reforço para estimular uma resposta imune existente proveniente de vacinação anterior ou de infecção natural.

Os Exemplos seguintes são apresentados para efeitos de ilustração da presente invenção e não têm a intenção de limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplificação

Exemplo 1: Preparação de Proteínas de RSV A. Proteína 1 de fusão por imunoafínidade (PFP-lj A PFP-1 é preparada pelo procedimento de Walsh et al., J. Gen.

Virol. 66:409-415 (1985) com as modificações seguintes. Faz-se passar o material eluído por imunoafinidade por uma coluna de DEAE e o eluído é recolhido, dialisado contra PBS/0,1% de Triton® X-100 e filtrado em condições estéreis através de um filtro de 0,2 pm. B. Proteína 2 de fusão por permuta iónica (1F1 A IF é preparada por passagem de lisado clarificado de células infectadas por RSV por uma coluna de DEAE. O eluído é recolhido e passado através de uma coluna de hidroxi-apatite (HA). Após a eluição em HA, a proteína F eluída é dialisada contra PBS/0,1% de Triton® X-100, e filtrada em condições estéreis através de um filtro de 0,2 pm. C. Proteína G por imunoafinidade (G) A proteína G é preparada pelo procedimento de Walsh et al., J. Gen. Virol. 66:761-767 (1984) com as modificações seguintes. Após a eluição, faz-se passar a proteína G numa coluna de imunoafinidade específica para a proteína F de RSV. O eluído é recolhido, dialisado contra PBS/0,1% de Triton® X-100, e filtrado em condições estéreis através de um filtro de 0,2 pm. D. Proteína F/G Quimérica A proteína F/G quimérica é preparada pela Patente U.S. N° 5,194,595 e fornecida por Upjohn Corporation.

Exemplo 2: Imunoensaio enzimático (EIA1 O título de anticorpos em amostras de soro é determinado - 12-

utilizando um Imunoensaio Enzimático (EIA) realizado como se segue: A proteína de fusão do vírus RS é diluída para 200 ng/mL em tampão de carbonato-bicarbonato, pH 9,6. Cem pL do antigénio diluído são adicionados a cada poço das filas B-G de uma placa de ensaio NUN™ com 96 poços, de fundo plano. Nas filas A e H, adiciona-se 100 pL de tampão carbonato-bicarbonato apenas a cada poço. A placa é coberta e incubada durante 2 horas a 37°C com agitação e guardada de um dia para o outro a 4°C para imobilizar o antigénio.

Os sobrenadantes são removidos da placa de ensaio NUNC™ e a placa é lavada com 0,1% de Tween/PBS pH 7,4 e seca.

Em cada placa são testadas três amostras de anticorpo. Cada amostra é primeiramente diluída para uma diluição primária com 0,2% de Tween, 0,01 M de EDTA/PBS pH 7,5 (0,2% de TWN). As diluições primárias são adicionalmente diluídas em série como se segue numa placa FALCON™ com 96 poços de fundo em U: (a) As diluições primárias das amostras são inoculadas na fila 2 a 200 pL/poço. A Amostra 1 é inoculada em triplicado, e.g., nos poços A2, B2 e C2; a Amostra 2 em duplicado, e.g., nos poços D2, E2; a Amostra 3 em triplicado e.g., nos poços F2, G2 e H2. (b) Inoculou-se 100 pL de 0,2% de TWN em cada poço das filas 3-12. (c) Criou-se diluições em série por transferência sequencialmente de 100 pL de um poço na fila 2 para o correspondente poço na fila 3 (e.g., B2 para B3; C2 para C3), de um poço na fila 3 para o correspondente poço na fila 4, até se atingir a fila 12. 13 l/Lfaj <~2aÀ^. (d) Na fila 1, adicionou-se 100 pL de 0,2% de TWN a cada poço como controlo.

Cem pL das diluições primárias são transferidos de cada poço da placa FALCON™ para o correspondente poço na placa NUNC™, e.g., A2 (FALCON™) para A2 (NUNC™). A placa de ensaio NUNC™ é coberta e incubada durante uma hora a 37°C com agitação. Os sobrenadantes são removidos da placa de ensaio, e a placa é lavada com 0,1% de Tween/PBS e seca.

Dilui-se conjugado de fosfatase alcalina de IgC anti-ratinho de cabra (TAGO™) com 0,3% de Tween/PBS pH 7,0 (0,3% de TWN) para uma diluição de trabalho, e.g., 1:1500. O conjugado diluído (100 pL) é adicionado a cada poço nas filas 2-12. Na fila 1, adiciona-se 100 pL de 0,3% de TWN a cada poço como controlo. A placa é coberta e incubada durante uma hora a 37°C com agitação. Os inóculos são então removidos, e a placa é lavada com 0,1% de Tween/PBS pH 7,4 e seca. A cada um e todos os poços, adiciona-se 100 pL de solução de substrato, 1 mg/mL em tampão de dietanolamina pH 9,8 (SIGMA-104™). Deixa-se que a reacção enzimática decorra à temperatura ambiente durante 1 hora. A reacção é parada por adição de 100 pL de NaOH 3 N a cada poço. A extensão da reacção enzimática é determinada por leitura da densidade óptica a 410 nm.

As filas A e H servem como controlos negativos porque não está presente antigénio; a fila 1 também serve como controlo negativo porque não estão presentes anticorpos. 14

Exemplo 3: Ensaio de Neutralização do Vírus (Ensaio de Neutralização por Redução de Placas. PRNT)

Amostras de soro de ensaio que são diluída em série e o soro de controlo positivo são inactivadas pelo calor a 56°C durante 30 min. Todos os soros são então diluídos com igual volume contendo cerca de 30 unidades formadoras de placas (PFU) de vírus RS, e incubadas a 37°C durante uma hora, com (C' mais PRNT) ou sem (PRNT) a adição de 5% de complemento de coelho. Uma combinação de soros de seres humanos adultos que tinham sido previamente caracterizados por imunoensaio enzimático, ensaios de neutralização e antifusão é utilizado como controlo positivo. Soros que tinham sido previamente caracterizados e se sabia serem não-imunes são utilizados como controlo negativo.

Gada mistura de soro-vírus incubada é inoculada em células HEp-2 (ATCC N° CCL23) em poços separados de placas com 96 poços e deixa-se que a absorção do vírus decorra durante 2 horas a 37°C. Os inóculos são removidos. As monocamadas de células são lavadas e cobertas com meio de Eagle modificado mais 5% de soro fetal de bovino e 1% de SEPHADEX®, e incubadas a 37°C durante 3 dias. O meio de cobertura é removido e as células são lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). 200 pL de solução de PBS-metanol (1:5) gelada são adicionados a cada poço, e as células são fixadas durante 30 min à temperatura ambiente. O fixador de PBS-metanol é removido, adiciona-se 200 pL por poço de 5% de leite instantâneo CARNATION® em PBS, pH 6,8 (BLOTTO). A placa é incubada durante 30 minutos a 37°C.

Remove-se o BLOTTO. Adiciona-se 50 pL por poço de anticorpos

monoclonais contra o vírus RS (previamente titulados e diluídos com BLOTTO para uma concentração de trabalho), e a placa é incubada a 37pC durante 1 hora. Os anticorpos são retirados, e as células fixadas são lavadas duas vezes com BLOTTO, 30 minutos de cada vez.

Adiciona-se 50 pL/poço de IgG anti-ratinho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (diluído 1:250 em BLOTTO) e a placa é incubada durante 1 hora a 37°C. Os anticorpos de cabra são removidos, e a células fixadas são de novo lavadas duas vezes com BLOTTO, 30 minutos de cada vez.

Adiciona-se 50 pL/poço de uma solução de substrato de peroxidase (0,05% de 4-cloro-l-naftol, 0,09% de H202 em PBS pH 6,8), e deixa-se desenvolver a cor durante 15-30 minutos à temperatura ambiente. A solução de substrato é removida, e os poços são lavados com água e secos ao ar. Determina-se o número de placas em cada poço. A capacidade de neutralização de uma amostra de soro de teste é expressa como a diluição que resulta numa redução de 60% da formação de placas quando comparada com soro de controlo não-imune. Os resultados estão tabelados nas Tabelas 1-4.

Os resultados nas Tabelas 1, 2, 3 e 4 representando os resultados do Ensaio EIA e de Neutralização por Redução de Placas mostram o melhoramento na resposta imune biológica com a utilização destes novos adjuvantes quando comparados com alúmen só. As formulações de vacinas de proteína de fusão, proteína G do vírus RS, suas misturas e proteína F/G Quimérica com os novos adjuvantes (com ou sem alúmen adicional) foram significativamente melhoradas quando comparadas com as formulações contendo só alúmen. - 16

Títulos Serológicos por Ensaicr e Tempo

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-Μη ^ ΐΜ—~η 1. Ratinhos Wesbter Suíços seronegativos foram imunizados (100 pL) com proteína F de RSV purificada por permuta iónica (IF) ou PBS em vários adjuvantes às semana 0 e semana 3. Os ratinhos foram sangrados para selorologia às semanas 0, 3 e 6. 2. Ensaios serológicos: EIA-F (imunoensaio enzimático específico para proteína F), EIA-Ga (imunoensaio enzimático específico para proteína Ga), PRNT (ensaio de neutralização por redução de placas) contra uma estirpe de RSV do subgrupo A (i.e. A2) e uma estirpe de RSV do subgrupo B (i.e. 18537). Também foram realizados C'-PRNT (ensaio de neutralização por redução de placas com 5% de complemento) contra estirpes A2 e 18537 de RSV. Foram realizados ensaios EIA em soros individuais e foram calculadas e registadas as médias geométricas dos títulos (GMT). Foram realizados ensaios PRNT e C'-PRNT em soros combinados (uma combinação por grupo, n-5). 3. A proteína F purificada por permuta iónica (IF) foi administrada com os seguintes adjuvantes: alúmen - 1 mg/mL de hidróxido de alumínio, OS-21 = 200 pg/mL de OS-21, 3D-MPL = 250 pg/mL de 3D-MPL, 3D-MPL + alúmen = uma mistura de 250 pg/mL de 3D-MPL mais 1 mg/mL de hidróxido de alumínio. ND = não realizado -23

EIA-F GMT(xlOOO) BTA-G GMTÍxlOOO) PRNT-RSVÍA2) PRNT-RSVÍ18537) Imonusénio^ Adjuvante semana 3 semana 6 semana 3 semana 6 semana 3 semana 6 semana 3 semana 6 * \Ú \Tí H O 0% n H O H V o rH V ro f* o\ (N CN U> ÍN O H V O H V m H OD LD Cl O H V O H V o H V O H V O H V O H V O H V VP CP Cí rô in H H O V «H O V H O V n vl * n rt O V rt õ V H O V r» .-í 1/) Π t- ^1* tn c» <N o (Λ O «O H O V H O r* m H H M «f C* H H O V s 03 E 3 ‘s H M 1 co O C 03 E 2 Ί3 H 01 O H n co O \ Cu H Ol a. H *. M en =L H 01 a λ

I 1. Ratinhos seronegativos foram imunizados (100 μL, IM) com 1 pg de proteína com adjuvante alúmen (Al(OB)3, 1 mg/mL> ou OS-21 (250 μg/mL) às semanas 0 e 3. Os ratinhos foram sangrados para serologia às semanas 0, 3, 6. 2. Ensaios serológicos: EIA-F (imunoensaio enzimático específico para proteína F), PRNT (ensaio de neutralização por redução de placas) contra uma estirpe de RSV do subgrupo A (i.e. A2) e uma estirpe de RSV do subgrupo B (i.e. 18537) com a adição de 5% de complemento de coelho. Foram realizados ensaios EIA em soros individuais e foram calculadas e descritas (#ratinhos/grupo) as médias geométricas dos títulos (GMT). 3. Proteína F purificada por permuta iónica (lise com Triton X-100) combinada com igual quantidade de proteína G purificada por afinidade (lise com Triton X-100/desoxicolato). 4. Proteína F purificada por permuta iónica.

Exemplo 4 Vírus e Linhas Celulares. São utilizadas as estirpes A2 e 18573 de RSV e são cultivadas provisões de vírus em células Vero [American Type Culture Collection (ATCC) N° CCL 81] ou HEp-2 (ATCC N° CCL 23) seguindo procedimentos correntes, purificadas sobre gradientes de densidade de sorbitol e armazenadas a -70°C até à utilização. A linha celular BCH4 infectada persistentemente com a estirpe Long de RSV e a linha celular BALB/c não-infectada (para ambas as linhas celulares ver Femie et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1981, 167:83-86) são oferta do Dr. Bruce F. Femie. Estas últimas linhas celulares são mantidas em meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) com 10% (v/v) de FBS inactivado pelo calor (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT). -25-

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Exemplo 5

Determinação da subclasse de anticorpos anti-proteína F. Os títulos da subclasse de anticorpos anti-proteína F de ratinhos tratados com 5 pg de proteína F misturada com QS-21, ALOH ou infecção natural são determinados por ELISA. Resumidamente, são preparadas placas com 96 poços com 20 ng de proteína F ou 5 ug de RSV A2 como se segue. Reveste-se proteína F purificada (200 ng/mL) ou RSV A2 (50 pg/mL) em tampão de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) em placas com 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante 2 h a 37°C e guarda-se de um dia para o outro a 4°C. Em seguida, as placas são lavadas 5 vezes com PBS/0,05% de Tween® 20 (Sigma) seguidas por 2 lavagens adicionais só com PBS. Diluições de 3 vezes em série de soro preparadas em tampão de PBS/0,3% de Tween® 20/0,01 M de EDTA (pH 7,0) são então adicionadas aos poços e incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem 5 vezes com PBS/0,1% de Tween® 20, adiciona-se 100 uL de IgG anti-ratinho de cabra tinilada (1:4000, Kirkegaard and Perry Laboratories), IgGl (1:3000, Zymed), ou IgG2a (1:5000, Zymed) e as placas são incubadas 1 h à temperatura ambiente. Após outra série de lavagens, adicionou-se 100 uL de estrepavidina conjugada com peroxidase de rábano (diluição de 1:10000 em PBS/0,3% de Tween® 20, Zymed) aos poços e são incubados à temperatura ambiente durante mais 30 minutos. Adicionou-se substrato de peroxidase (2,2'-azino-di[3-etil-benztiazolino sulfonato (6)], Kirkegaard and Perry Laboratories) aos poços após lavagem e incubou-se à temperatura ambiente durante 20 minutos altura em que a reacção foi parada com 100 uL de 1% de dodecanal sulfato de sódio (Pierce, Rockford, IL). Os títulos dos pontos finais são determinados a 410 nM. O Ensaio de Neutralização do Vírus (PRNT) foi realizado como no

Exemplo 3. -26-

Os títulos acrescidos de anticorpos neutralizantes no soro assistido por complemento induzidos por F/QS-21 correlacionaram com a indução de anticorpos anti-proteína F da subclasse IgG2a (Tabela 5). Três semanas após a imunização primária, há um aumento relacionado com a dose de QS-21 em IgG2a específico de proteína bem como de anticorpos IgGl. Em comparação, uma única injecção de proteína F misturada só com soro fisiológico ou F/ALOH induz primariamente anticorpos específicos de proteína da subclasse IgGl (Tabela 5). Os resultados indicam que F/QS-21 induz respostas imunes humorais que são semelhantes às produzidas por infecção experimental e consistem tanto em anticorpos IgG2a fixadores de complemento como em IgGl.

Exemplo 6

Determinação dos Títulos de Anticorpos Neutralizantes Cruzados e da Infectividade por RSV. A titulação de anticorpo neutralizante de soro é realizada em duplicado em monocamadas de células HEp-2 em placas de cultura de tecidos com 96 poços tal como descrito no Exemplo 3.

Neste exemplo, tal como ilustrado na tabela a seguir, observa-se que um adjuvante pode fazer com que proteína de RSV induza uma resposta a anticorpos IgG dependente de complemento que neutraliza vírus de ambos o subgrupo A e subgrupo B (sendo estes subgrupos identificados como A2 e 18537, respectivamente na tabela a seguir). Esta resposta imune neutralizante cruzada de vírus RS de subtipos heterólogos não foi conseguida anteriormente utilizando só proteína G purificada. Uma vacina formulada com adjuvante QS-21 e proteína G de vírus RS provoca uma resposta de anticorpos neutralizantes heterotípica desejável que é substancialmente maior do que a que é induzida por alúmen só ou por uma infecção natural.

Tabela 6: Resposta de Anticorpos Neutralizantes Heterotípica Induzida por Proteína G de RSV Com Adjuvante QS-211

Imunogénio (με)1 Adiuvante2 PRNT2 A2 18537 Proteína G (2,5) QS-21 7940 6039 Proteína G (1,2) QS-21 >10.240 5154 Proteína G (0,6) QS-21 2092 719 Proteína G (0,3) QS-21 308 1906 Controlos: Proteína G (2,5) alúmen 212 <10 Proteína G (2,5) nenhum <10 <10 PBS QS-21 <10 <10 1. Ratinhos BALB/c seronegativos foram imunizados (0,1 mL, I.M.) às semanas 0 e 3 com proteína G de RSV nas doses indicadas acima. Os animais foram desafiados (0,1 mL, I.N.) com 6 logio de PFU de estirpe A2 de RSV à semana 6 e sangrados para serologia aos 4 dias pós-desafío. 2. PRNT = ensaio de neutralização por redução de placas realizado contra uma estirpe de um subgrupo A (A2) e de um subgrupo B (18537) de RSV. Os ensaios foram realizados em soros combinados (n=5) na presença de 5% de complemento de coelho. 1

Imunogénio: Proteína G de RSV é purificada por imunoafinidade a partir de 2 lisados de células Vero infectadas com estirpe A2 de RSV. Esta proteína purificada é adicionalmente processada por cromatografia de imunoafinidade para reduzir o nível de proteína F residual. Não são induzidos por estes -28-imunogénios anticorpos específicos para proteína F detectáveis (tal como medidos por EIA). 4. Adjuvantes: QS-21 (200 pg/mL) ou hidróxido de alumínio (alúmen, 1 mg/mL) são misturados com proteína G de RSV ou PBS 24 horas antes da utilização.

Exemplo 7: Comparação de QS-21 vs. ALOH quanto à capacidade de induzir actividade local de células letais dependente de proteína F A capacidade de QS-21 para induzir actividade local de células letais dependente de proteína F também foi examinada e comparada com a citotoxicidade mediada por células por imunização com F/ALOH ou infecção experimental.

Isolamento de Células Mononucleares Pulmonares (PMC). As PMC são isoladas dos pulmões após a digestão de colagenase (ver Hancock et al., Vaccine, 12:267-274, 1994 e Anderson et al, J. Gen. Virol., 71:1561-1570, 1990). Resumidamente, pulmões dissecados são colocados em DMEM frio e lavados para remover o sangue periférico. Os pulmões são então triturados em DMEM fresco, transferidos para um tubo de centrífuga de 50 mL e nutados a 37°C na presença de colagenase (colagenase de tipo IV, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a uma concentração final de 2 mg/mL, 10 mM de tampão HEPES, e 1% (v/v) de FBS inactivado pelo calor. Após 90 minutos de incubação, os fragmentos são passados através de um peneiro para cultura de tecidos em aço inoxidável de 100 mesh (Sigma). A suspensão resultante é peletizada (400 g), ressuspensa em metrizamida (16%, p/v, Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY), coberta com uma camada de RPMI 1640 (Gibco BRL) contendo 10% de FBS inactivado pelo calor, e centrifugada (150 g) durante 20 minutos a 5°C. As camadas de PMC são então recolhidas, lavadas para remover o gradiente, e ensaiadas ex vivo quanto à sua capacidade citolítica. 29. Uuj

Determinação da Citotoxicidade Percentual. A citotoxicidade celular dependente de antigénio é determinada num ensaio de libertação de 51 Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) de 4 h. Resumidamente, 50 uL (5000 células) de controlo marcado com 51 Cr singeneico ou linhas celulares alvo (BCH4) infectadas com RSV são incubadas (37°C, 5% de CO2) em triplicado em micro-poços de fundo em V (Costar, Cambridge, MA) com 100 uL de células mononucleares de baço ou de pulmão (diluídas 2 vezes em série em RPMI 1640 contendo 10% de FBS inactivado pelo calor, v/v). O volume final é de 150 uL por poço. Após a incubação, os sobrenadantes são recolhidos (Skatron Harvester, Skatron Inc., Sterling, VA), medidos quanto à libertação de 51 Cr num contador ClinGamma (Pharmacia LKB), e comparados com a libertação espontânea (alvos incubados só com meio, 20-25%) e libertação total (alvos incubados em meio de cultura com 1,0% de Triton® X-100, v/v em PBS). A percentagem de libertação específica é calculada por: 100 x [(cpm experimental média) - (cpm de libertação espontânea média)]/ [(cpm de libertação total média) - (cpm de libertação espontânea média)].

Estudos de Bloqueamento de Anticorpos. Anticorpos monoclonais purificados dirigidos contra o complexo de histocompatilidade principal (MHC) de antigénios H2Kd (clone SF1-1.1, IgG 2a), H-2Dd (clone AF4-62.4, IgG 2b), e H-2Kb (clone AF6-88.5, IgG2a) são adquiridos a PharMingen, San Diego, CA. Um anticorpo monoclonal (E37-10, IgG 2b) dirigido contra antigénio de difteria toxóide serve como controlo de subclasse. O anticorpo monoclonal dirigido contra moléculas superficiais C8 murinas (53-6.72, ATCC N° TIB 105) é purificado a partir de sobrenadantes de cultura de hibridoma numa coluna de proteína G recombinante (Pharmacia). IgG de rato purificada é adquirida a Calbiochem (San Diego, CA). Para bloquear a citólise mediada por células, adiciona-se 50 pL de anticorpo a 50 uL de células efectoras antes da adição de 50 uL de células alvo. A proporção final de efector para alvo era de 60:1. -30-

Ratinhos Balb/c são vacinados às semanas 0 e 3 com 5 μg de proteína F misturada com ou 20 pg de QS-21 ( ) ou 100 pg de ALOH (D) e comparados com ratinhos imunizados por infecção experimental (?). Duas semanas após a imunização secundária, os ratinhos são desafiados com vírus. Quatro dias após o desafio, a PMC de ratinhos Balb/c vacinados com F/QS-21 são capazes de matar alvos infectados com RSV (linhas a cheio na Figura) de um modo dependente de antigénio (ver Figura IA). Digno de nota especial, esta actividade citotóxica é tão potente como a de PMC de ratinhos previamente infectados com RSV e quase 3 vezes superior à actividade induzida na PMC de ratinhos vacinados com F/ALOH. Os alvos singeneicos de controlo (linhas a tracejado) não infectados com RSV não são mortos (Figura IA). A actividade é local porque as células de baço dos mesmos ratinhos não são citolíticas.

Os resultados sugerem adicionalmente que a actividade local de células letais induzida pela vacina de F/QS-21 é mediada por células T do fenotipo CD8. A citólise foi inibida quando foram adicionadas à mistura de ensaio doses crescentes de anticorpo monoclonal dirigido contra células portadoras de determinantes superficiais CD8 (símbolo a cheio) (Figura 1B). Analogamente, concentrações crescentes de anticorpos monoclonais anti-H2Dd e H2Kd (símbolo a cheio) bloqueiam a citólise (Figura 1C). A imunoglobulina de controlo (símbolos abertos) é não inibidora (Figura 1 B&C).

Lisboa, 16 de Novembro de 2000

Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (7)

1. - 1 -

   REIVINDICAÇÕES 1. Formulação de vacina compreendendo (a) uma proteína virai sincicial respiratória (RSV) seleccionada do grupo que consiste em (i) glicoproteína G de RSV, (ii) glicoproteína F de RSV, (iii) um polipéptido quimérico compreendendo pelo menos um fragmento imunogénico de ambas as glicoproteínas F e G de RSV, e (iv) suas combinações, e (b) um adjuvante seleccionado do grupo que consiste em QS-21, monofosforil lípido A 3-desacilado e suas combinações, num veículo fisiologicamente aceitável.
2. 2. Formulação de vacina compreendendo (a) uma proteína virai sincicial respiratória (RSV) seleccionada do grupo que consiste em (i) glicoproteína G de RSV, (ii) glicoproteína F de RSV, (iii) um polipéptido quimérico compreendendo pelo menos um fragmento imunogénico de ambas as glicoproteínas F e G de RSV, e (iv) suas combinações, e (b) QS-21, num veículo fisiologicamente aceitável.
3. 3. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 1 adicionalmente compreendendo alúmen.
4. 4. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 2 adicionalmente compreendendo alúmen.
5. 5. Formulação de vacina compreendendo (a) uma proteína virai sincicial respiratória (RSV) seleccionada do grupo que consiste em (i) glicoproteína G de RSV, (ii) glicoproteína F de RSV, (iii) um polipéptido quimérico compreendendo pelo menos um fragmento imunogénico de ambas as glicoproteínas F e G de RSV, e (iv) suas combinações, e (b) alúmen e -2- monofosforil lípido A 3-desacilado, num veículo fisiologicamente aceitável.
6. 6. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 para utilização para proteger contra doença do tracto respiratório inferior e outros sintomas de doença de infecção por RSV.
7. 7. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 para utilização no fabrico de um medicamento para proteger contra doença do tracto respiratório inferior e outros sintomas de doença de infecção por RSV. Lisboa, 16 de Novembro de 2000 (yLusj LUIS SILVA CARVALHO ' Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VfCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA