CN108025052B - 抗疟疾组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了多层膜，其包含来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的经修饰多肽表位，特别是经修饰T*表位。所述多层膜在施用于宿主后能够在所述宿主中引起免疫应答。所述多层膜可包含至少一种经设计肽，其包含来自疟原虫(Plasmodium)原生动物的经修饰T*多肽表位。

Description

抗疟疾组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月16日提交的美国临时申请62/219,260的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及用于预防疟疾感染的组合物和方法，特别是包含抗原表位的多层膜组合物。
背景技术
疟疾是全世界热带和亚热带地区最普遍的感染之一。疟疾感染导致全世界数亿个体的严重疾病，导致数百万个体死亡，每年主要发生在发展中国家和新兴国家。疟疾的广泛发生和高发病率是耐药性寄生虫和耐杀虫剂性寄生虫载体数量提高的结果。其他因素包括环境和气候变化、内乱以及提高的人口流动性。
疟疾由属于疟原虫属(genus Plasmodium)的蚊媒血液原生动物寄生虫(mosquito-borne hematoprotozoan)引起。疟原虫原生动物(Plasmodium protozoa)的四个种(恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae))是人中疾病的病因；许多其他种引起动物中的疾病，例如小鼠中的约氏疟原虫(P.yoelii)和伯氏疟原虫(P.berghei)。恶性疟原虫占人感染的大部分，且是最致死的类型，有时称为“热带疟疾”。疟疾寄生虫具有由数个阶段组成的生命周期。每个阶段都能够诱导针对相应的发生阶段特异性抗原的特异性免疫应答。目前的重点领域是开发引起针对子孢子(sporozoite)阶段病原体之免疫的疫苗。子孢子在被感染的蚊子的唾液中生长，并在蚊子叮咬期间被转移至人。子孢子经过血流到达肝，在肝中其进入肝细胞并繁殖。子孢子被环子孢子外壳蛋白(circumsporozoite coat protein，CS)的许多拷贝覆盖。与CS蛋白结合的抗体可中和生物体并预防肝侵袭，因此预期引起强大且持久的抗CS应答的药剂是可用的疟疾疫苗。
目前在临床试验中有两种试图通过CS中和机制预防疟疾感染的疫苗。RTS，S是在病毒样颗粒上呈现多个CS拷贝的病毒样颗粒疫苗。其已被证明保护成人和儿童二者免受感染，但由于有效性低于50％，因此其效用仍然是存在争议的问题。Sanaria Inc.已经提出使用死子孢子作为有效的疫苗，但生产方法涉及解剖宿主蚊子唾液腺，该过程繁琐且可能无法扩展至实际数量。因此，需要引起识别和中和疟疾生物体之免疫应答的改进抗原组合物。
发明内容
在一个方面中，分离的肽包含SEQ ID NO：5的序列。
在另一个方面中，组合物包含：
包含多个带相反电荷的聚电解质层的第一多层膜，其中所述多层膜中所述聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，
其中所述第一抗原性聚电解质包含SEQ ID NO：5的经修饰恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)环子孢子T*表位，并且
其中所述多层膜中的所述聚电解质包含分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。
在另一个实施方案中，在脊椎动物生物体中引起免疫应答的方法包括向所述脊椎动物生物体施用上述多层膜组合物。
附图说明
图1示出恶性疟原虫CS蛋白的表位，示出了T1、B和T*表位的位置和序列。
图2示出在第49天从用在针对T1B肽的ELISA中测试的T1BT*微米颗粒构建体免疫接种的C57BL/6J小鼠收集的血清的结果。
图3示出来自用以1∶250测试的T1BT*微米颗粒构建体免疫接种的C57BL/6J小鼠的血清，其中用同种型特异性检测抗体对板进行探查。
图4示出在第49天从用T1BT*微米颗粒构建体免疫接种的C57BL/6J小鼠收获并在IFNγ和IL-5 ELISPOT板中用T1B肽再刺激的脾细胞的结果。
图5示出在第59天从用T1BT*微米颗粒构建体免疫接种的C57BL/6J小鼠收获并在针对T1B肽的ELISA中测试的血清的结果。
图6示出在第59天从用T1BT*微米颗粒构建体免疫接种的C57BL/6J小鼠收获并在IFNγ和IL-5ELISPOT板中用T1B肽再刺激的脾细胞。
图7示出来自用T1BT*微米颗粒构建体免疫接种并随后在第63天用PfPb攻击并在40小时后处死的C57BL/6J小鼠的结果。通过qPCR测量肝中的寄生虫负荷。
图8示出在多种储存条件之后，T1BT*-K20肽(SEQ ID NO：10)在214nm处的HPLC色谱图。A)纯化的肽是单峰。B)在室温在pH约5的溶液中16天之后。C)在室温在pH 7.4溶液中2.7天之后。D)在室温在pH 7.4溶液中16天之后。E)在-20℃下作为冷冻溶液储存4年之后。
图9示出T1BT*-K20肽(SEQ ID NO：10)混合物在280nm处记录的HPLC色谱图。A)在室温在约pH 5溶液中16天之后。B)在用二硫苏糖醇处理后。
图10示出T1BT*-K20肽(SEQ ID NO：10)混合物在214nm处的HPLC色谱图。A)新鲜溶解的样品。B)在室温下在pH 7.4溶液中孵育5天之后。C)在用二硫苏糖醇处理之后。
图11示出T1BT*-K20肽(SEQ ID NO：17)混合物在214nm处的HPLC色谱图。A)新鲜溶解的样品。B)在室温下在pH 7.4溶液中孵育5天之后。
图12示出纯化的Pam3Cys-T1BT*-K20肽(SEQ ID NO：13)在214nm(顶部)和280nm(底部)处的C4HPLC色谱图。
图13示出纯化的Pam3Cys-T1BT*-K20肽(SEQ ID NO：13)的电喷雾质谱。
本领域技术人员将通过以下详细描述、附图和所附权利要求书认识和理解上述和其他特征。
具体实施方式
本文中公开了包含来自疟原虫原生动物的经修饰多肽表位的多层膜，其中所述多层膜在施用于宿主后能够在宿主中引起免疫应答。特别地，所述膜包含一种或更多种恶性疟原虫环子孢子蛋白抗原，其中所述环子孢子蛋白抗原包含经修饰T*表位或经修饰T1BT*表位。
如本文中所用，恶性疟原虫环子孢子蛋白抗原是：
T1：DPNANPNVDPNANPNV(SEQ ID NO：1)
B：NANPNANPNANP(SEQ ID NO：2)
T*：EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：3)
T1BT*：DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：4)
在一个方面中，经修饰T*表位是：
EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(SEQ ID NO：5)或
EYLNKIQNSLSTEWSPASVT(SEQ ID NO：6)。
在一个相关方面中，经修饰T1BT*表位是：
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(SEQ ID NO：7)或
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPASVT(SEQ ID NO：8)。
在用于包含在多层膜中的经设计肽的生产期间，存在的问题是在肽合成或膜生产期间可能形成链间二硫键。SEQ ID No.5和6的经修饰T*表位被设计成修饰野生型T*表位中的未配对Cys残基，以在经设计肽和多层膜的制造过程期间提供显著的优势。当在动物模型中测试含有具有SEQ ID No.5和6的经修饰T*表位的经设计T1BT*肽的微米颗粒时，发现在包含SEQ ID NO：5的肽引起对野生型T1B肽(SEQ ID NO：4)特异的T细胞应答时，包含SEQ IDNO：6的肽无法引起对野生型T1B肽特异的T细胞应答。完全出乎意料的是，Ser残基的替换是可耐受的，而Ala替换是不可耐受的。
特别地，多层膜包含带相反电荷的聚电解质的交替层，其中所述层之一包含经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽，特别是SEQ ID NO：5(经修饰T*表位)或SEQ ID NO：7(经修饰T1BT*表位)。任选地，聚电解质中的一种或更多种(特别是包含经修饰T*或经修饰T1BT*肽的聚电解质)是多肽。在某些实施方案中，多层膜包含来自疟原虫原生动物的多种表位。例如，第一和第二疟原虫原生动物多肽表位可与相同或不同的聚电解质连接，和/或可存在于相同或不同的多层膜中。
在一个方面中，经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽与分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料共价连接。聚阳离子或聚阴离子材料提供足够的电荷以用于将经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽沉积到多层膜的层中。
在另一个方面中，经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽与该多肽的C-末端和/或N-末端处的一个或两个表面吸附区共价连接，其中所述表面吸附区中至少一个包含5个或更多个，例如10至20个带负电荷或带正电荷的氨基酸残基。表面吸附区域提供足够的电荷以用于将经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽沉积到多层膜的层中。在一个实施方案中，抗原性多肽(包含T*表位和表面吸附区)在pH 7.0下每个残基的净电荷大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。
在一个实施方案中，组合物包含含有多个带相反电荷的聚电解质层的第一多层膜，其中所述多层膜中的聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中第一抗原性聚电解质包含经修饰恶性疟原虫环子孢子T*表位，并且其中所述多层膜中的聚电解质包含分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。在另一个实施方案中，组合物包含含有多个带相反电荷的聚电解质层的第一多层膜，其中所述多层膜中的聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，其中所述第一抗原性聚电解质包含经修饰恶性疟原虫环子孢子T1BT*表位，并且其中所述多层膜中的聚电解质包含分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。在一个方面中，经修饰T*表位具有SEQ ID NO：5。在另一个方面中，经修饰T1BT*表位具有SEQ ID NO：7。
在一个实施方案中，第一抗原性聚电解质以任意顺序包含两种恶性疟原虫环子孢子表位，例如T1T*、BT*，其中T*表位是经修饰T*表位。表位可在多肽链上邻接，或者被间隔区间隔开。类似地，表位可在多肽的N-末端处、多肽的C-末端处或者其间的任何位置。在另一个实施方案中，第一聚电解质是包含恶性疟原虫环子孢子T1、B和经修饰T*表位全部三者的多肽。T1、B和经修饰T*表位可在多肽的邻接部分中，或者所述表位的任一种或所有可被间隔区间隔开。
在一个方面中，多层膜中的经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽与分子量大于1,000且每分子具有至少有5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料共价连接。聚阳离子或聚阴离子材料提供足够的电荷以用于将经修饰T*肽或含有经修饰T*表位之T1BT*肽沉积到多层膜的层中。
在一个方面中，为了便于将经修饰T*或经修饰T1BT*表位沉积到多层膜中，肽例如在N-末端、C-末端或这二者处包含一个或更多个高度带电荷的表面吸附区。在一个方面中，表面吸附区中至少一个包含5个或更多个带负电荷或带正电荷的氨基酸残基。包含抗原肽和一个或更多个表面吸附区的肽在本文中表示为经设计多肽(designed polypeptide，DP)。
注意到当第一抗原性聚电解质是多肽时，多肽含有足够的电荷以用于沉积到多肽多层膜中。在一个实施方案中，在pH 7.0时，多肽每个残基的净电荷大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5，如本文中所述。
在另一个实施方案中，代替恶性疟原虫环子孢子T1、B和经修饰T*表位在相同聚电解质上，两种或三种表位可呈现在分开的聚电解质上，并成层为相同的多层膜。在一个实施方案中，第一多层膜还包含含有与第二聚电解质共价连接的恶性疟原虫环子孢子T1、B或经修饰T*表位的第二抗原性聚电解质，其中第一和第二抗原性聚电解质包含不同的恶性疟原虫环子孢子表位。在另一个实施方案中，第一多层膜还包含含有与第三聚电解质共价连接的恶性疟原虫环子孢子T1、B或经修饰T*表位的第三抗原性聚电解质，其中第一、第二和第三抗原性聚电解质包含不同的恶性疟原虫环子孢子表位。在一个实施方案中，第一、第二和/或第三聚电解质是多肽。
在一个实施方案中，第一、第二和任选的第三聚电解质存在于分开的多层膜中，例如两个或三个单独的经包被核心群体，每个群体包含不同的多层膜。因此，在一个实施方案中，组合物包含如上所述的第一多层膜和包含多个带相反电荷的聚电解质层的第二多层膜，其中第二多层膜中的层中之一包含第二抗原性聚电解质，其中第二抗原性聚电解质包含与第二聚电解质共价连接的恶性疟原虫环子孢子T1、B或经修饰T*表位，其中第一和第二抗原性聚电解质包含不同的恶性疟原虫环子孢子表位。在另一个实施方案中，组合物还包含含有多个带相反电荷的聚电解质层的第三多层膜，其中第三多层膜中的层之一包含第三抗原性聚电解质，其中第三抗原性聚电解质包含与第三聚电解质共价连接的恶性疟原虫环子孢子T1、B或经修饰T*表位，其中第一、第二和第三抗原性聚电解质包含不同的恶性疟原虫环子孢子表位。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三聚电解质是多肽。在一些实施方案中，将第一、第二和第三多层膜在分开的核心颗粒上成层，使得组合物包含两个或三个不同的颗粒群体。
在某些实施方案中，多层膜还包含toll样受体配体。如本文中所用，toll样受体配体或TLR配体是与TLR结合并活化或抑制TLR受体的分子。通过识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和模拟物活化TLR信号传导导致编码促炎细胞因子、趋化因子和共刺激分子的基因的转录活化，这可控制抗原特异性适应性免疫应答的活化。TLR已成为用于多种炎性疾病和癌症的潜在治疗靶标。活化后，TLR诱导许多蛋白质家族的表达，包括炎性细胞因子、I型干扰素和趋化因子。TLR受体配体可用作免疫应答的佐剂。
示例性TLR配体包括TLR1配体、TLR2配体、TLR3配体、TLR4配体、TLR5配体、TLR6配体、TLR7配体、TLR8配体、TLR9配体、及其组合。
示例性TLR1配体包括细菌脂肽。示例性TLR2配体包括脂肽，例如Pam3Cys([N-棕榈酰基-S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸])和Pam2Cys([S-[2，3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸])。示例性TLR6配体是二酰基脂肽。TLR1和TLR6需要与TLR2异二聚化以识别配体。TLR1/2被三酰基脂蛋白(或脂肽，例如Pam3Cys肽)活化，而TLR6/2被二酰基脂蛋白(例如，Pam2Cys)活化，尽管可存在一些交叉识别。
示例性TLR3配体是聚(I：C)。示例性TLR4配体是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和单磷脂A(monophospholipid A，MPLA)。示例性TLR5配体是鞭毛蛋白(flagellin)。示例性TLR7配体是咪喹莫特。示例性TLR8配体是单链RNA。示例性TLR9配体是未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸DNA。
在一个实施方案中，第一、第二或第三抗原性聚电解质(例如，抗原性多肽)具有与其共价连接的TLR配体。例如，Pam3Cys可通过标准多肽合成化学与多肽链共价偶联。
在另一个实施方案中，在沉积聚电解质层之前，基底(例如模板核心)已在其上沉积有TLR配体。在另一个实施方案中，在多层膜的组装期间，TLR配体与一个或更多个聚电解质层共沉积。
在一个实施方案中，多层膜沉积在核心颗粒(例如核心纳米颗粒或核心微米颗粒)上。示例性核心包括CaCO3纳米颗粒和微米颗粒、胶乳颗粒和铁颗粒。直径约为5纳米(nm)至500微米(μm)的粒度是可用的。直径为0.05至20μm的颗粒优选用于疫苗目的。直径约为1约至10μm的颗粒作为疫苗是特别可用的。也可使用由其他材料制成的颗粒作为核心，前提是其为生物相容性的，具有可控的尺寸分布并且具有足够的表面电荷(正的或负的)以结合聚电解质肽。实例包括由例如以下材料制成的纳米颗粒和微米颗粒：聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、壳聚糖、透明质酸、明胶、或其组合。核心颗粒也可由被认为不适合人使用的材料制成，前提是它们可在膜制造之后被溶解并与多层膜分离。模板核心物质的实例包括有机聚合物，例如胶乳或无机材料(如二氧化硅)。
聚电解质多层膜是由带相反电荷的聚电解质的交替层构成的薄膜(例如，几纳米至微米厚)。这样的膜可通过在适当的基底上逐层组装来形成。在静电逐层自组装(“LBL”)中，聚电解质缔合的物理基础是静电吸引。由于在连续层沉积时膜的表面电荷密度的符号反转，所以可形成膜。LBL膜工艺的普遍性和相对简单性允许将许多不同类型的聚电解质沉积到许多不同类型的表面上。多肽多层膜是聚电解质多层膜的子集，其包含至少一个包含带电多荷多肽的层，本文中称为经设计多肽(DP)。多肽多层膜相对于由其他聚合物制成的膜的关键优势在于其生物相容性。
LBL膜也可用于其他材料的包封。多肽膜和微米胶囊的应用包括例如纳米反应器、生物传感器、人造细胞和药物递送载剂。
术语“聚电解质”包含分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料和聚阴离子材料。合适的聚阳离子材料包括例如多肽和多胺。多胺包括例如多肽，例如聚-L-赖氨酸(PLL)或聚-L-鸟氨酸、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵)、壳聚糖、以及包含前述聚阳离子材料中一种或更多种的组合。合适的聚阴离子材料包括例如多肽，例如聚-L-谷氨酸(PGA)和聚-L-天冬氨酸、核酸寡聚体(例如DNA和RNA)、藻酸类、角叉菜胶、叉红藻胶(furcellaran)、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖和交联羧甲基纤维素、含侧链羧基的合成聚合物和共聚物、以及包含前述聚阴离子材料中一种或更多种的组合。在一个实施方案中，疟原虫原生动物表位与聚电解质具有相同的电荷符号。在另一个实施方案中，疟原虫原生动物表位与聚电解质具有相反的电荷符号。
在一个实施方案中，任选地包含含有疟原虫原生动物表位的聚电解质的膜的一个或更多个聚电解质层是经设计多肽。在一个实施方案中，适用于静电逐层沉积的多肽的设计原理在美国专利公开No.2005/0069950中阐明，对于其多肽多层膜的教导通过引用并入本文。简言之，主要设计关注点是多肽的长度和电荷。静电是最重要的设计关注点，因为它是LBL的基础。没有合适的电荷性质，多肽可在pH 4至10下的水溶液中基本上不溶，并且不能容易地用于通过LBL制造多层膜。其他设计关注点包括多肽的物理结构，由多肽形成的膜的物理稳定性，以及膜和组分多肽的生物相容性和生物活性。
经设计多肽意指具有足够电荷以用于与带相反电荷的表面稳定结合的多肽，即可沉积到多层膜的层中的多肽，其中用于成膜的驱动力是静电吸引。短稳定膜是这样的膜：一旦形成，在37℃下在PBS中孵育24小时后保留其多于一半的组分的膜。在一些特定实施方案中，经设计多肽的长度为至少15个氨基酸，并且多肽的每个残基在pH 7.0下的净电荷的大小大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在pH 7.0下带正电荷的(碱性)天然氨基酸是精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、鸟氨酸(Om)和赖氨酸(Lys)。在pH 7.0下带负电荷的(酸性)天然氨基酸残基是谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。可使用具有相反电荷的氨基酸残基的混合物，只要总净电荷比符合规定标准即可。在一个实施方案中，经设计多肽不是均聚物。在另一个实施方案中，经设计多肽是非支化的。
带相反电荷的聚电解质之间的静电引通常足以产生在环境条件(例如，在中性pH和体温下)下稳定的膜。然而，膜稳定性可通过在膜形成之后在层之间设计共价键而提高。该交联过程赋予膜额外的稳定性，并且可使其承受更严格的条件，例如更高的温度或大pH变化。可用于交联的共价键的实例包括二硫键、硫醚键、酰胺键等。对于由多肽构成的膜，产生酰胺键的化学物质是特别地可用的。在适当的偶联试剂的存在下，酸性氨基酸(具有含羧酸基团的侧链的那些，例如天冬氨酸和谷氨酸)将与侧链含有胺基团的氨基酸(例如赖氨酸和鸟氨酸)反应以形成酰胺键。在生物条件下，酰胺键比二硫键更稳定，且酰胺键不会发生交换反应。许多试剂可用于活化多肽侧链以用于酰胺键合。碳化二亚胺试剂例如水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)在微酸性pH下将与天冬氨酸或谷氨酸反应，形成将与胺不可逆地反应以产生酰胺键的中间产物。常常向反应添加添加剂(例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))以加速酰胺形成的速率和效率。在交联之后，通过例如离心和抽吸从纳米颗粒或微米颗粒中除去可溶性试剂和副产物。或者，可溶性试剂可例如通过切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)过滤颗粒来除去。其他偶联试剂的实例包括二异丙基碳化二亚胺、HBTU、HATU、HCTU、TBTU和PyBOP。其他添加剂的实例包括磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、1-羟基苯并三唑和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑。酰胺交联的程度可通过调节偶联试剂的化学计量、反应时间或反应温度来控制，并且可通过例如傅里叶变换-红外光谱(FT-IR)的技术来监测。
共价交联的LBL膜具有期望的性质，例如提高的稳定性。更大的稳定性允许在纳米颗粒、微米颗粒、纳米胶囊或微米胶囊制造期间使用更严格的条件。严格条件的实例包括高温、低温、深冷温度(cryogenic temperature)、高离心速度、高盐缓冲液、高pH缓冲液、低pH缓冲液、过滤和长期储存。在一个方面中，多层膜的除了包含第一抗原性聚电解质的层之外的至少两个聚电解质层共价交联。共价交联键是例如涉及氨基酸侧链官能团的酰胺键。
制备聚电解质多层膜的方法包括在基底上沉积带相反电荷的化学物质的多个层。在一个实施方案中，至少一个层包含经设计多肽。相继沉积的聚电解质将具有相反的净电荷。在一个实施方案中，聚电解质的沉积包括将基底暴露于包含处于其对LBL具有合适净电荷的PH下的聚电解质的水溶液。在另一些实施方案中，聚电解质在基底上的沉积通过连续喷射带相反电荷的多肽的溶液来实现。在另一些实施方案中，在基底上沉积通过同时喷射带相反电荷的聚电解质的溶液来进行。
在形成多层膜的LBL方法中，相邻层的相反电荷提供用于组装的驱动力。相对层中的聚电解质具有相同的净线性电荷密度不重要，只有相对层具有相反的净电荷是重要的。一种通过沉积的标准膜组装程序包括在聚电解质被离子化的pH(即，pH 4至10)下形成聚电解质的水溶液，提供带有表面电荷的基底，并且将基底交替浸入带电荷的聚电解质溶液中。在沉积交替层之间任选地洗涤基底以除去未结合的聚电解质。
适用于聚电解质的沉积的聚电解质的浓度可容易地由本领域普通技术人员确定。示例性浓度是0.1至10mg/mL。
此外，形成稳定的聚电解质多层膜所需的层数将取决于膜中的聚电解质。对于仅包含低分子量多肽层的膜，膜通常将具有带相反电荷的多肽的两个或更多个双层。研究已表明聚电解质膜是动态的。当悬浮在聚电解质溶液中时，包含在膜中的聚电解质可在层之间迁移，并且可与具有相同电荷的可溶性聚电解质交换。此外，聚电解质膜可响应于环境变化(例如悬浮缓冲液的温度、pH、离子强度或氧化电位)而解体或溶解。因此，一些聚电解质且特别是肽聚电解质显示瞬时稳定性。肽聚电解质膜的稳定性可如下监测：在受控条件下将膜在合适的缓冲液中悬浮一段固定的时间，并随后用合适的测定(例如氨基酸分析、HPLC测定或荧光测定)测量膜内肽的量。肽聚电解质膜在与其储存和用作疫苗相关的条件下，例如在中性缓冲液和环境温度(例如4℃至37℃)下是最稳定的。在这些条件下，稳定的肽聚电解质膜将保留其大部分组分肽至少24小时并且经常长达14天及更长。
在一个实施方案中，经设计多肽包含与一个或更多个疟原虫原生动物表位共价连接的一个或更多个表面吸附区。如本文中所用，表面吸附区是经设计多肽的带电区域，其有利地提供足够的电荷，使得包含来自疟原虫原生动物的表位的肽例如可被沉积到多层膜中。所述一个或更多个表面吸附区和一个或更多个疟原虫原生动物表位可具有相同或相反的极性。在另一个实施方案中，经设计多肽在pH 4至10下的溶解度大于或等于约0.1mg/mL。在另一个实施方案中，经设计多肽在pH 4至10下的溶解度大于或等于约1mg/mL。溶解度是促进多肽从水溶液中沉积的实际限制。
示例性表面吸附区包含20个连续赖氨酸残基(K20或K20Y)。例如，当疟原虫原生动物表位是SEQ ID NO：7的经修饰T1BT*表位时，例如，优选的是表面吸附区包含5至20个带正电荷的氨基酸残基，或5至20个带负电荷的氨基酸残基。
在一个实施方案中，经设计多肽包含侧接两个表面吸附区、N-末端表面吸附区和C-末端表面吸附区的单个抗原疟原虫原生动物表位。在另一个实施方案中，经设计多肽包含侧接与疟原虫原生动物表位的N-末端连接的一个表面吸附区的单个抗原疟原虫原生动物表位。在另一个实施方案中，经设计多肽包含侧接与疟原虫原生动物表位的C-末端连接的一个表面吸附区的单一抗原疟原虫原生动物表位。
经设计多肽的每个独立区域(例如，疟原虫原生动物表位和表面吸附区)可通过溶液相肽合成、固相肽合成、或合适宿主生物体的基因工程分开合成。可使用溶液相和固相方法的组合来合成相对长的肽以及甚至小的蛋白质。肽合成公司具有以服务费为基础合成困难肽的专业知识和经验。合成在良好的生产规范(GMP)条件下，并且以适用于临床试验和商业药物发布的规模进行。
或者，多种独立区域可通过溶液相肽合成、固相肽合成、或合适宿主生物体的基因工程一起作为单一多肽链合成。在任何特定情况下，方法的选择将是方便或经济的问题。
如果多种疟原虫原生动物表位和表面吸附区分开合成，则一旦例如通过离子交换色谱或高效液相色谱进行纯化，它们就可通过肽键合成来连接。也就是说，表面吸附区的N-末端与一个或更多个疟原虫原生动物表位的C-末端共价连接以产生经设计多肽。或者，表面吸附区的C-末端与疟原虫原生动物表位的N-末端共价连接以产生经设计多肽。单个片段可通过固相方法合成并且作为完全保护、完全未保护或部分保护的区段获得。所述区段可在溶液相反应或固相反应中共价连接。如果一个多肽片段包含半胱氨酸作为其N-末端残基而另一个多肽片段在其C-末端残基处包含硫酯或硫酯前体，则这两个片段将作为天然的半胱氨酸连接通过本领域技术人员通常已知的特定反应在溶液中自发地偶联。天然半胱氨酸连接对经设计肽的合成是特别有吸引力的选择，因为它可以在水溶液中和稀浓度下用完全脱保护或部分保护的肽片段进行。
在一个实施方案中，如美国专利No.7,723,294中所述，疟原虫原生动物表位和/或表面吸附区通过肽或非肽键连接，对于其使用非肽键连接用于多层膜的多肽区段的教导通过引用并入本文。合适的非肽接头包括例如烷基接头，例如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2至20。烷基接头任选地被非空间位阻基团(例如低级烷基(例如，C1-C6)、低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH2、苯基等)取代。另一种示例性非肽接头是聚乙二醇接头，例如-NH-(CH2-CH2-O)n、-C(O)-，其中n使得接头具有约100至约5000Da的分子量。本文中所述的许多接头可以以适合用于固相肽合成的形式从商业供应商处获得。
在一个实施方案中，来自疟原虫原生动物的多肽表位中的一种或更多种通过共价键共价与一种或更多种聚电解质(例如多肽或其他聚电解质)连接。合适共价键的实例包括酰胺、酯、醚、硫醚和二硫化物。本领域技术人员可利用见于表位肽中的一系列官能团来构建与合适电解质的键。例如，表位肽中的羧酸可见于氨基酸天冬氨酸或谷氨酸的C-末端处或侧链上。羧酸可用合适的肽偶联试剂(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC))来活化，以用于与见于肽聚电解质(例如聚-L-赖氨酸)中的伯胺或仲胺反应。所得酰胺键在环境条件下是稳定的。相反，肽聚电解质中的酸基团可用EDC活化以用于与表位肽中的胺基团反应。可用的胺基团可见于表位肽的N-末端处或赖氨酸残基的侧链上。
表位肽也可通过硫醚键与聚电解质连接。合成的表位肽可用合适的亲电试剂(例如与巯基特异性反应的卤代乙酰基)来合成。例如，在其N-末端处包含氯乙酰基的表位肽将与带有巯基的聚电解质形成稳定的键。
表位肽还可通过双官能接头分子与聚电解质共价连接。双官能接头通常包含可与存在于表位肽或聚电解质分子上的亲核体反应的两个亲电基团。两类接头分子在商业上出售，同双官能接头和异双官能接头。同双官能接头包含由非反应性间隔子连接的亲电基团的两个拷贝。通常亲电体是与亲核胺反应的活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(磺基-NHS)。同双官能NHS酯的实例包括双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯、二硫代双(琥珀酰亚胺基)丙酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯。有时亲电体是与表位和聚电解质分子上的亲核胺形成酰亚胺的醛基。酰亚胺键瞬时稳定，但可用还原剂(例如硼氢化钠)或催化氢化转化为稳定结构。最常用的同双官能醛接头是戊二醛。
其他常用的同双官能接头包含与亲核硫醇特异性反应的亲电体，其可用于如上所述将含半胱氨酸的表位肽与含巯基的聚电解质连接。巯基特异性同双官能接头的实例包括1,4-双马来酰亚胺丁烷、1，4双马来酰亚胺基-2，3-二羟基丁烷、双-马来酰亚胺己烷、双马来酰亚胺乙烷、1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)-丙酰氨基]丁烷、二硫代-双马来酰亚胺乙烷、1，6-己烷-双-乙烯基砜。
虽然包含游离半胱氨酸残基的经设计多肽可用于与其他分子共价连接，但游离巯基可以以多种方式氧化，这可能是有问题的。例如，两个含游离半胱氨酸的肽可发生氧化偶联并且变得通过二硫键共价连接。当游离半胱氨酸肽相同时，产物称为对称二硫化物或二硫化物二聚体。二硫化物二聚化可在温和条件下发生，例如在环境温度下或者甚至在冷藏期间。所需要的只是短时间暴露于温和氧化剂，例如空气氧气或其他温和氧化剂。此外，当游离半胱氨酸肽作为固体(例如作为干粉或以溶液形式，例如在中性pH下作为1mg/mL的水溶液)储存时，可发生二聚化。在游离半胱氨酸肽倾向于自缔合的情况下，基本上所有的单体游离半胱氨酸肽都可转化为二聚体。即便采取谨慎措施以排除暴露于氧化剂(例如在惰性气体气氛中工作或对溶剂和缓冲液脱气)时，也可形成痕量或不需要的二硫化物产物。
出于多种原因，二硫化物二聚化是疫苗组合物的关注点。首先，如果游离半胱氨酸肽是药物物质的一部分，则二硫化物二聚体将被视为杂质，并且需要频繁监测、定量，并且如果存在足够量的话，则需要去除和/或表征可能的毒性。其次，由于二硫化物二聚体可随时间累积，所以游离半胱氨酸肽药物物质可能具有比缺乏游离半胱氨酸的肽更短的保质期。第三，如果半胱氨酸是重要抗体或T细胞表位的一部分或在其附近，则二聚化可掩盖该表位，从而弱化期望的免疫应答。并且最后，二聚化可产生与保护无关的新抗体表位，并因此稀释期望的免疫应答。显然，优选避免在药物物质中使用游离半胱氨酸肽，除非半胱氨酸发挥重要功能，例如，如果它是抗体或T细胞表位的关键组分，或者将如以上所述那样用于缀合或连接。
在实施例5中，使含有游离半胱氨酸的T1BT*-K20经设计肽(SEQ ID NO：10)经历多种储存条件，并且色谱监测肽的纯度。所有的储存条件都产生了可从起始单体游离半胱氨酸肽中分离出来的新物质。这个新的峰可能是半胱氨酸氧化的结果，推断是对称的二硫化物二聚体，这一结论得到了观察结果的支持，即用还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理引起新峰恢复为原来的游离半胱氨酸肽。可以预测，这种现象可能会发生在含有游离半胱氨酸的所有T1BT*肽中。因此，需要控制或防止这种不期望副反应发生。
引起保护性免疫应答的表位可以以多种方式鉴定。推定的抗体表位可通过在例如ELISA的测定中测试针对病原体蛋白质的亚单位、缺失突变体或点突变体的免疫血清或单克隆抗体来鉴定。推定的T细胞表位可通过在例如ELISPOT的测定中测试针对跨越病原体蛋白质长度的重叠肽的免疫外周血单个核细胞来鉴定。在每种情况下，使用多个重叠和部分冗余的亚基分析物可允许本领域技术人员鉴定被保护性免疫组分识别的推定表位，无论其是抗体还是T细胞。然后可通过用定义的表位免疫接种首次用于实验的动物
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并用目标病原体攻击以确定表位限制性免疫应答是否保护宿主免受感染或病理状况，从而验证推定的保护性表位。
在鉴定了抗体或T细胞表位之后，可能替换一个或更多个单个氨基酸残基而不丧失功能。遗憾的是，很难预测哪些残基可被替换，哪些其他残基可作为合适的替代物。因此，必须在动物模型中或在预测期望的体内结果的体外替代测定中制备和测试具有潜在允许的替代残基的新类似物。可使用肽阵列合成技术制备大量肽类似物，但是在动物模型中筛选这些肽类似物可以是时间和成本过高的(time and cost prohibitive)。在这样的资源限制下，可通过将替代限制为具有相似大小和/或功能的那些残基来降低准备和筛选的类似物的数量。具有相似大小和功能并且是替换的良好候选者的氨基酸残基对的实例是：丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)、异亮氨酸/缬氨酸(Ile/Val)、苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr)、异亮氨酸/亮氨酸(Ile/Leu)、天冬酰胺/谷氨酰胺(Asn/Gln)、天冬酰胺/天冬氨酸(Asn/Asp)、谷氨酰胺/谷氨酸(Gln/Glu)、天冬氨酸/谷氨酸(Asp/Glu)和精氨酸/赖氨酸(Arg/Lys)。甘氨酸和脯氨酸在结构上与其他天然氨基酸不同，因此找到这些残基不允许的替换是不足为奇的。
由于其高反应性、氢键合性质和氧化倾向，半胱氨酸在天然氨基酸中是独特的。尽管半胱氨酸含有与丝氨酸相同数量的重(非氢)原子，但其侧链巯基比丝氨酸的羟基酸性更强，并且在中性pH下部分电离。因此，鉴定肽表位内半胱氨酸残基的替代物的最佳方法是制备数种合适的类似物并在预测测定(例如小鼠免疫接种模型)中测试它们。
已发现疟疾CS蛋白中的T*表位是基于肽的候选疟疾疫苗的重要组分。它包含一个半胱氨酸残基(Cys334)，其在折叠的CS蛋白中与位于T*区之外的残基(Cys369)键合。作为T细胞表位，包含T*的免疫组合物被抗原呈递细胞摄取，加工成更短的线性肽区段，并以线性构象与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合。然后肽：MHC复合物转位至细胞表面并将肽呈递至经由T细胞受体(TCR)识别肽：MHC复合物的T细胞。在T*表位的情况下，抗原呈递细胞的细胞内加工将降低天然二硫键，使Cys334作为游离半胱氨酸离开。从理论上讲，应该有可能用另一个残基替代Cys334，前提是保留对T细胞的MHC结合和识别至关重要的相互作用。
含有T*半胱氨酸替换的经设计肽的合成描述于实施例1中，并且它们制造成疟疾疫苗微米颗粒描述于实施例2中。经设计肽Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys-＞Ser，SEQ ID NO：1)和Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys-＞Ala，SEQ ID NO：14)分别包含Cys334的丝氨酸和丙氨酸替换。如实施例3和实施例4中所述，使用包含这些经设计肽的微米颗粒疫苗以及包含天然游离半胱氨酸经设计肽Pam3Cys-T1BT*-K20(SEQ ID NO：11)的微米颗粒免疫接种小鼠。免疫接种后，动物为用被遗传工程改造以表达来自人疟疾生物体恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum，Pf)的环子孢子(CS)外壳蛋白的T1B重复元件的小鼠疟疾生物体伯氏疟原虫(Plasmodium bergheii，Pb)的杂合形式感染的蚊子进行攻击。PfPb转基因生物体使得能够在小鼠的攻击实验中测试针对PfCS蛋白的疫苗。在实施例3中描述的实验中，所有小鼠组群都对具有强抗-T1B多克隆抗体应答的免疫接种作出应答(图5)。除基底层交联和T*表位中第334位的残基之外，这是预期的结果，因为多个疫苗批次在所有方面都相似。对数据进行更仔细的检查表明，丝氨酸置换(SEQ ID NO：13)引起具有等于含半胱氨酸序列(SEQ IDNO：11)的抗T1B滴度的小鼠血清，而丙氨酸置换(SEQ ID NO：14)引起更低滴度的抗T1B血清。该结果是出入意料的，因为替换发生在T*区域，但看来对针对T1B表位的抗体应答有影响。因此，T*表位看来影响T1B特异性抗体应答的量级，并且对天然半胱氨酸的非最佳替代降低了应答的量级。
在实施例4中，从用具有经修饰T*表位的疫苗微米颗粒构建体免疫的小鼠收集T-细胞。当在T1B肽特异性T细胞测定中进行测试时，只有具有天然半胱氨酸残基或替代丝氨酸残基的构建体才引起强烈应答。用丙氨酸替换构建体处理的小鼠细胞产生差的T细胞应答(图6)。此外，当用PbPf杂合生物体攻击动物时，用含有丝氨酸突变体的微米颗粒免疫接种的动物相对于用丙氨酸构建体免疫接种的小鼠表现出提高的保护水平(图7)。不受理论限制，据信T*肽的丝氨酸突变体保留了与MHC呈递分子或T细胞受体或这二者的重要分子相互作用，而丙氨酸突变体缺乏一种或更多种相互作用。缺失的相互作用的功能结果是较弱的T细胞特异性应答和对活PfPb生物体较低水平的保护。
通过蛋白质晶体学的实践，对MHC-抗原肽-TCR相互作用系统已有很多了解。然而，从蛋白质一级序列准确预测MHC结合肽尚未被缩减为精确科学。因此，T细胞表位仍需要通过经验方法进行鉴定和验证。同样，对经鉴定的T细胞表位的可接受的修饰需要凭经验进行测试。与野生型天然序列相比，具有单一点替换的表位可保留完全的免疫活性，或表现出降低的免疫活性、消除的免疫活性或提高的免疫活性。具有单点替换的表位可表现出与野生型序列定性地不同的活性，例如改变Th1和Th2表型之间诱导的T细胞应答。尽管可预测合适的替换，但它们必须通过经验方法进行测试和验证。
本文中进一步公开了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含含有两个或更多个聚电解质层的多层膜，其中相邻层包含带相反电荷的聚电解质，其中一个层包含疟原虫原生动物表位。免疫原性组合物任选进一步包含一个或更多个包含经设计多肽的层。
在一个实施方案中，免疫原性组合物除了经经修饰T*或经经修饰T1BT*表位之外还在相同或不同的经设计多肽上进一步包含第二疟原虫原生动物表位。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含多种独特的抗原性聚电解质。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含多种免疫原性聚电解质，其在每种聚电解质内包含多种疟原虫原生动物表位。这些免疫原性组合物的优势在于单个合成疫苗颗粒中可存在多种抗原决定簇或单个线性抗原决定簇的多种构象。具有多种抗原决定簇的此类组合物可潜在地产生针对多种表位的抗体，从而提高例如生物体的免疫系统产生的至少一些抗体将中和病原体或癌症细胞上靶标特异性抗原的几率。
免疫原性组合物的免疫原性可以以多种方式增强。在一个实施方案中，多层膜任选地包含一种或更多种另外的免疫调节性生物活性分子。尽管不是必需的，但所述一种或更多种另外的免疫调节性生物活性分子通常将包含一种或更多种另外的抗原决定簇。合适的另外的免疫调节性生物活性分子包括例如药物、蛋白质、寡核苷酸、核酸、脂质、磷脂、碳水化合物、多糖、脂多糖、低分子量免疫刺激分子或包含一种或更多种前述生物活性分子的组合。其他类型的另外的免疫增强子包括功能性膜片段、膜结构、病毒、病原体、细胞、细胞聚集体、细胞器或包含一种或更多种前述生物活性结构的组合。
在一个实施方案中，多层膜/免疫原性组合物引起免疫系统对病原体的应答。在一个实施方案中，疫苗组合物包含与可药用载体组合的免疫原性组合物。因此，针对致病性疾病的疫苗接种方法包括向需要疫苗接种的对象施用有效量的免疫原性组合物。
可药用载体包括但不限于大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、无活性病毒颗粒等。可药用盐也可用于该组合物中，例如无机盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐；以及有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。该组合物还可包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇，以及例如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂的物质。脂质体也可用作载体。
在脊椎动物中引起针对疾病或病原体的免疫应答的方法(例如，疫苗接种)包括施用包含含有疟原虫原生动物表位的多层膜的免疫原性组合物。在一个实施方案中，含有疟原虫原生动物表位的聚电解质位于多层膜的最外部或溶剂暴露的层中。免疫原性组合物可以通过很多种途径施用，包括经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、腹膜内、舌下、皮内、经肺或透皮途径。免疫原性组合物可以以单一剂量或通过随时间推移的多个剂量施用以实现最佳应答和保护。通常来说，组合物以与剂型相容的方式施用，并且以将是预防和/或治疗有效的量施用。待施用的免疫原性组合物的精确量取决于从业者的判断，并且可以是每个对象特有的。对本领域技术人员显而易见的是，免疫原性组合物的治疗有效量将尤其取决于给药方案、所施用抗原的单位剂量、组合物是否与其他治疗剂组合施用、以及接受者的免疫状态和健康状况。如本领域中公知的，基于患者特征(年龄、体重、性别、状况、并发症、其他疾病等)，普通医疗技术人员可确定治疗有效剂量。此外，随着进一步的常规研究的进行，关于治疗多种患者的多种病症的适当剂量水平将出现更具体的信息，并且考虑到接受者的治疗背景、年龄和一般健康状况，普通技术人员能够确定适当的剂量。
免疫原性组合物任选地包含佐剂。佐剂通常包含以非特异性方式加强宿主免疫应答的物质。佐剂的选择取决于待接种疫苗的对象。优选使用可药用佐剂。例如，人疫苗应避免使用油或烃乳剂佐剂，包括弗氏完全佐剂和不完全佐剂。适用于人的佐剂的一个实例是明矾(alum)(氧化铝凝胶)。然而，动物疫苗可含有不适用于人的佐剂。
考虑免疫应答可通过呈现能够引起这种应答的任何蛋白质或肽来引起。在一个实施方案中，抗原是关键表位，其对传染性疾病的特定试剂(即免疫显性表位)产生强烈的免疫应答。如果期望的话，免疫原性组合物中可包含多于一种的抗原或表位，以提高免疫应答的可能性。
由于经设计肽的带电荷表面吸附区与膜的带相反电荷的表面之间的静电吸引，经设计肽吸附于LBL膜的表面。吸附效率在很大程度上取决于表面吸附区的组成。预期具有不同表位但具有相似表面吸附区的经设计肽以相似的效率吸附。为了制造含有各自以1∶1的摩尔比的两种不同经设计多肽的膜，可以以该摩尔比混合肽并将其同时沉积在特定层上。或者，可将各个肽分别沉积在不同的层上。所吸附肽的摩尔比将主要反映它们被成层的相对浓度或它们被并入的成层步骤的数量。
并入到LBL膜中经设计多肽的量可以以多种方式测量。定量氨基酸分析(aminoacid analysis，AAA)特别适合于该目的。通过用浓盐酸(6M)处理并通常在115℃下加热15小时，将包含DP的膜分解为它们的组成氨基酸。然后使用本领域技术人员公知的色谱技术测量每种氨基酸的量。仅在膜中一种经设计肽中出现的氨基酸可用作该肽的示踪剂。当经设计肽缺乏独特的氨基酸时，可在合成期间将非天然氨基酸(例如，氨基丁酸或高缬氨酸(homovaline))并入经设计肽中。这些示踪剂氨基酸在AAA实验期间容易被鉴定，并可对膜中肽的量进行定量。
如本文中所用，特异性T细胞应答是对目标表位(特别是疟原虫原生动物表位)特异性的应答。特异性T细胞应答表现为由来自免疫软管(immunized hose)的T细胞分泌IFNγ和/或IL-5。
如本文中所用，特二异性抗体应答是对目标表位特异性的应答，特别是如本文中所公开的疟原虫原生动物表位。
如本文中所用，“层”意指在吸附步骤之后，例如在用于成膜的模板上的厚度增量。“多层”意指多个(即，两个或更多个)厚度增量。“聚电解质多层膜”是包含聚电解质的一个或更多个厚度增量的膜。在沉积之后，多层膜的层可不保留为离散层。事实上，可能存在显著的物种混合，特别是在厚度增量的界面处。可通过例如表面电位测量和X射线光电子能谱的分析技术监测混合或不存在混合。
“氨基酸”意指多肽的结构单元(building block)。如本文中所用，“氨基酸”包括20种常见的天然L-氨基酸、所有其他天然氨基酸、所有非天然氨基酸和所有氨基酸模拟物，例如N-烷基甘氨酸氨基酸，通常称为作为类肽。
“天然氨基酸”意指甘氨酸加上20种常见的天然L-氨基酸，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。
“非天然氨基酸”意指除20种常见天然L-氨基酸中的任一种之外的氨基酸。非天然氨基酸可具有L-或D-立体化学。
“类肽”或N-取代的甘氨酸意指相应氨基酸单体的类似物，其具有与相应的氨基酸相同的侧链，但侧链添加至氨基的氮原子而不是残基的α-碳。因此，多肽中单体之间的化学连接不是肽键，这可用于限制蛋白水解消化。
“氨基酸序列”和“序列”意指长度至少为两个氨基酸残基的多肽链的连续长度。
“残基”意指聚合物或寡聚体中的氨基酸；它是形成聚合物的氨基酸单体的残基。多肽合成涉及脱水，即在向多肽链添加氨基酸时单个水分子“丢失”。
如本文中所用，“肽”和“多肽”全都是指通过相邻氨基酸的α-氨基和α-羧基之间的肽键彼此相互连接的一系列氨基酸，并且可含有或没有例如糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰，前提是这样的修饰或缺乏修饰不破坏免疫原性。如本文中所用，术语“肽”意指肽和多肽或蛋白质二者。
“经设计多肽”意指具有足够电荷以用于与带相反电荷的表面稳定结合的多肽，即可沉积到多层膜的层中的多肽，其中用于成膜的驱动力是静电。在一些具体的实施方案中，经设计多肽的长度为至少15个氨基酸，并且在pH 7.0下多肽的每个残基的净电荷量大于或等于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5。在一个实施方案中，相同极性的带电荷残基数量减去相反极性残基数量后与多肽中残基总数之比在pH 7.0下大于或等于0.2。尽管多肽的长度没有绝对的上限，但通常来说，适用于LBL沉积的经设计多肽的实际上限长度为1,000个残基。经设计多肽可包含见于自然界中的序列，例如疟原虫原生动物表位以及为肽提供功能的区域，例如带电区，其在本文中也称为表面吸附区，其允许经设计多肽沉积到多肽多层膜中。
“一级结构”意指多肽链中氨基酸的连续线性序列，且“二级结构”意指通过非共价相互作用(通常为氢键)稳定的多肽链中的或多或少的规则类型的结构。二级结构的实例包括α-螺旋、β-折叠和β-转角。
“多肽多层膜”意指包含如上定义的一种或更多种经设计多肽的膜。例如，多肽多层膜包含含有经设计多肽的第一层和含有与经设计多肽具有相反极性净电荷的聚电解质的第二层。例如，如果第一层具有净正电荷，则第二层具有净负电荷；并且如果第一层具有净负电荷，则第二层具有净正电荷。第二层包含其他经设计多肽或其他聚电解质。
“基底”意指具有用于从水溶液中吸附聚电解质的合适表面的固体材料。基底的表面可具有基本上任何形状，例如平面、球形、立方体、杆状或其他形状。基底表面可以是平滑的或粗糙的、规则的或不规则的。基底可以是晶体。基底可以是生物活性分子。基底的尺寸范围为纳米尺寸至宏观尺寸。而且，基底任选地包含数个小的亚颗粒。基底可由有机材料、无机材料、生物活性材料或其组合制成。基底的非限制性实例包括硅晶片；带电荷的胶体颗粒，例如CaCO3或三聚氰胺甲醛的微米颗粒；生物细胞，例如红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞；有机聚合物晶格，例如聚苯乙烯或苯乙烯共聚物晶格；脂质体；细胞器；以及病毒。在一个实施例中，基底是例如人造起搏器、耳蜗植入物或支架的医疗装置。
当在成膜期间或之后将基底分解或以其他方式除去时，将其称为“模板”(用于成膜)。模板颗粒可溶解在适当的溶剂中或通过热处理除去。如果使用例如部分交联的三聚氰胺-甲醛模板颗粒，则可通过温和的化学方法(例如在DMSO中)或通过pH值改变来分解模板。在模板颗粒溶解后，保留由交替聚电解质层构成的空心多层壳。
“胶囊”是中空壳或围绕核心的涂层形式的聚电解质膜。核心包含多种不同的包封剂，例如蛋白质、药物或其组合。直径小于约1μm的胶囊被称为纳米胶囊。直径大于约1μm的胶囊被称为微米胶囊。
“交联”意指形成共价键、或者数个键、或两个或更多个分子之间的许多个键。
“生物活性分子”意指具有生物学效应的分子、大分子或其复合物。可在合适的测定中测量特定的生物学效应并且相对于生物活性分子的每单位重量或每个分子进行标准化。生物活性分子可被包封、保留在聚电解质膜后面或包封在聚电解质膜内。生物活性分子的非限制性实例是药物、药物晶体、蛋白质、蛋白质功能片段、蛋白质复合物、脂蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖。如本文所用的“生物活性分子”还涵盖生物活性结构，例如功能膜片段、膜结构、病毒、病原体、细胞、细胞聚集体和细胞器。可被包封或保留在多肽膜后面的蛋白质的实例是血红蛋白；酶，例如葡萄糖氧化酶、脲酶、溶菌酶等；细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白；以及抗体。可以包封或保留在聚电解质膜之后的细胞的实例是移植的胰岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母细胞。
“生物相容性”是指在口服摄取、局部应用、透皮应用、皮下注射、肌内注射、吸入、植入或静脉内注射后不造成实质的不利健康影响。例如，生物相容性膜包括当与例如人的免疫系统接触后不引起实质性免疫应答的那些。
“免疫应答”意指细胞或体液免疫系统对身体任何地方的物质的存在的应答。可以以多种方式表征免疫应答，例如，通过血流中识别某种抗原之抗体数量的提高。抗体是由B细胞分泌的蛋白质，并且免疫原是引起免疫应答的实体。
“抗原”意指当引入到易感脊椎动物生物体组织中后引起免疫应答(例如，产生特异性抗体分子)的外来物质。抗原含有一种或更多种表位。抗原可以是纯物质、物质的混合物(包括细胞或细胞碎片)。术语抗原包含合适的抗原决定簇、自体抗原(auto-antigen)、自身抗原(self-antigen)、交叉反应抗原、同种异型抗原、耐受原、变应原、半抗原和免疫原、或其一部分、及其组合，并且这些术语可互换使用。抗原通常具有高分子量并且通常是多肽。据称诱发强免疫应答的抗原是强免疫原性的。互补抗体可特异性结合的抗原上的位点称为表位或抗原决定簇。
“抗原”是指组合物产生对组合物特异性的抗体或产生细胞介导的免疫应答的能力。
如本文中所用，术语“表位”和“抗原决定簇”可互换使用，并且意指被抗体或T细胞识别的抗原的结构或序列。表位的实例包括蛋白质和经设计多肽内的序列。通常来说，抗体表位将位于蛋白质的表面上。“连续表位”是包含来自一段线性肽序列的数个或更多个氨基酸残基的表位。“构象表位”包含通过其三维折叠而发生空间接触的来自肽蛋白的线性序列的不连续跨度的氨基酸残基。构象表位还可包含来自不同肽或蛋白质亚单位的不连续肽区段，其通过亚单位四元组装(quatemary assembly)发生空间接触。为了在抗原和抗体之间发生高效的相互作用，表位必须容易地用于结合。因此，抗体表位或抗原决定簇通常位于蛋白质表面上或被掩埋并由于结构重排而变得表面暴露。
如本文中所用，“疫苗组合物”是当施用于哺乳动物后引起免疫应答并且该应答保护哺乳动物免受随后的免疫接种剂或免疫交叉反应剂攻击的组合物。与未接种疫苗的生物体相比，对于降低症状或感染，保护可以是完全的或部分的。免疫交叉反应剂可以是例如产生亚基肽以用作免疫原的全蛋白质。或者，免疫交叉反应剂可以是不同的蛋白质，其完全或部分地被由免疫接种剂引起的抗体识别。
如本文中所用，“免疫原性组合物”旨在涵盖在其所施用的生物体中引起免疫应答并且可以或不可以保护经免疫哺乳动物免受随后用免疫接种剂攻击的组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗组合物。
通过以下非限制性实施例进一步举例说明本发明。
实施例
测试方案
小鼠和免疫接种：从Jackson Laboratories获得6至8周龄的雌性C57BL/6J，并且饲养在NorthEast Life Sciences，New Haven。使用前，使小鼠适应环境至少一周。将微米颗粒重悬于PBS中至期望的DP浓度(例如，10μg/100μl/注射)并在注射器装载和免疫接种之前立即超声处理10分钟。在第0天、第21天和第42天在后足垫中用悬浮液免疫接种小鼠。通过在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)中的DP在d0或在不完全弗氏佐剂(imcomplete Freund’s adjuvant，IFA)中的DP在(d21、d42)天通过皮下(s.c.)注射免疫接种阳性对照小鼠；阴性对照小鼠用PBS进行模拟免疫接种。
ELISA：在第49天(第二次加强后)对小鼠取血，并收获血清用于使用用T1B肽包被的ELISA板分析抗体应答。用HRP标记的山羊抗小鼠IgG检测抗体结合。
ELISPOT：在第49天处死小鼠，并收集脾脏并加工成(teased into)单细胞悬浮液，其通过氯化铵渗透休克消耗红细胞。使用市售试剂(BD Biosciences)和板(MilliporeCorporation)并遵循制造商的说明书，用在IFNγ或IL-5ELISPOT板中的T1B肽再次刺激耗尽红细胞的脾细胞。每个平板上的斑点数量在AID Viruspot Reader中计数。
PfPb攻击：在第49天对小鼠取血，并如上所述通过ELISA测量抗体滴度。在抗体测量之后，用PfPb(进行了恶性疟原虫CS基因T1BT*亚基转基因的伯氏疟原虫)攻击小鼠。通过麻醉小鼠并让感染PfPb的蚊子对它们进食10分钟而完成攻击。攻击后两天，经攻击小鼠被取血并处死，提取肝RNA用于通过qPCR分析寄生虫负荷。
实施例1：示例性肽设计和合成
经设计多肽基于恶性疟原虫CS的T1BT*多价肽。将表面吸附区K20(SEQ ID NO：9)或K20Y(SEQ ID NO：16)添加至C-末端以产生用于并入LbL颗粒的经设计多肽(DP)(图1)。当Pam3Cys与DP缀合时，还添加接头序列SKKKK。使用标准固相肽化学方法合成肽并将其制备为C-末端酰胺。简言之，使用制造商的合成方案，用CEM Liberty微波肽合成仪将芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸双偶联至Rink MBHA酰胺树脂，其中对偶联温度进行微小改变。肽合成后，通过手动偶联Pam3Cys-OH或自动偶联Fmoc-Pam2Cys-OH，然后去除Fmoc和用棕榈酸进行最后的加帽步骤，将Pam3Cys组添加至树脂。通过用三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷/酚/水混合物处理将肽从树脂上切下并用醚沉淀。通过使用水(0.1％TFA)/乙腈梯度的C18HPLC或通过使用水(0.1％TFA)/异丙醇梯度的用于Pam3Cys肽的C4HPLC纯化粗制肽。纯化的肽通过280nm处的UV吸光度或通过氨基酸分析进行定量，等分，冻干，并于-20℃下储存。图12中显示了SEQ ID NO：13的典型C4分析HPLC色谱图，并且电喷雾质谱显示于图13中。SEQ ID NO：13的计算的平均MW＝9486.27，实测MW＝9485.6
T1BT*-K20：(SEQ ID No：10)
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY
Pam3Cys-T1BT*-K20：(SEQ ID NO：11)
Pam3CysSKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY
T1BT*-K20(Cys-＞Ser)：(SEQ ID NO：12)
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys-＞Ser)：(SEQ ID NO：13)
Pam3CysSKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
T1BT*-K20(Cys-＞Ala)：(SEQ ID NO：14)
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPASVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys-＞Ala)：(SEQ ID NO：15)
Pam3CysSKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPASVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
T1BT*-K20(Cys-＞Ser)：(SEQ ID NO：17)
SKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
实施例2：疫苗微米颗粒的LBL制造
LBL用配备有20cm2，500kD(MWCO)
Figure BDA0001599299210000251
mPES过滤器模块的来自SpectrumLabs(Rancho Dominiguez，CA)的
Figure BDA0001599299210000252
Research IIi切向流过滤系统进行。聚-L-谷氨酸钠盐(PGA)和聚-L-赖氨酸氢溴酸盐(PLL)获自Sigma-Aldrich，USA(目录号分别为P4636和P6516)。使用Volodkin等人报道的方法的改进版本，用1.0mg/mL PGA从0.33MCaCl2和0.33M Na2CO3中共沉淀球形、介孔CaCO3核心(2至5μm)。(D.V. Volodkin等Adv.Funct.Mater.2012，1)。所有步骤均在室温下进行。
TFF装置中装有20mL的3％CaCO3(干重)微米颗粒悬浮液，其在处理期间以40mL/分钟保持恒定循环。通过用100mL 10mM HEPES缓冲液pH 7.4渗透来洗涤颗粒。关闭渗透阀并在单次推注中添加5.0mL等份试样的6.3mg/mL PLL。使颗粒循环5分钟，然后打开渗透阀以将悬浮液浓缩回到20mL体积。打开缓冲液进料阀，并随后通过用100mL HEPES缓冲液渗透洗涤颗粒。关闭渗透阀，并在单次推注中添加5.0mL等份试样的5.0mg/mL PGA。使颗粒循环5分钟，浓缩，并随后通过用100mL HEPES缓冲液渗透进行洗涤。重复先前的步骤直至在最外层上制造具有PGA的七层基底膜(base film)。
通过用200mM EDC和50mM磺基-NHS在200mM磷酸盐缓冲液pH 6.5中处理，从TFF设备中除去洗过的微米颗粒悬浮液，并任选地将基底层膜酰胺交联(bXL＝基底层交联)30分钟。通过低速旋转使颗粒沉淀，抽吸，并用10mM HEPES缓冲液洗涤两次以除去任何残留的试剂。然后将微米颗粒(nXL或XL)浸入0.5mg/mL的T1BT*DP溶液中5分钟，同时温和混合。然后将颗粒低速旋转，并用新鲜的HEPES缓冲液洗涤以提供最终的8肽层微米颗粒疫苗构建体。通过定量氨基酸分析测量DP载量，并随后将颗粒悬浮于包含5％甘露醇和0.2％羧甲基纤维素钠的HEPES缓冲液中。将悬浮液以方便的体积(例如125μg总DP)等分，在液氮中快速冷冻并冻干。所得的干燥甘露醇饼储存在4℃并稳定至少6个月。
Figure BDA0001599299210000261
实施例3：通过用T1BT*微米颗粒免疫接种引起的免疫表型。
在第0、21和42天用指定的构建体免疫接种C57BL/6J小鼠。如图2中所示在针对T1B肽的ELISA中测试在第49天收集的血清。结果显示每组10只小鼠的平均值±SD。如图3中所示，以1∶250测试血清并且用同种型特异性检测抗体对板进行探查。结果显示每组10只小鼠的平均值±SD。在第49天收获脾细胞，并在IFNγ和IL-5 ELISPOT平板中用T1B肽再刺激，如图4中所示。数据描绘了每组3只小鼠的平均值±SD。nXL＝无交联，bXL＝基底层交联。
这些结果证明，装载有包含恶性疟原虫环子孢子蛋白的T1BT*亚基肽的经设计肽的LBL微米颗粒引起针对包含的抗原表位的体液和细胞免疫应答。结果进一步表明，通过使基底层交联修饰微米颗粒提高了疫苗的效价(图2中显示的更高的抗体滴度)。通过在DP上包含TLR2激动剂Pam3Cys修饰微米颗粒也提高其效价，但也改变了免疫应答的表型(图3中显示的提高的IgG2c抗体同种型和图4中显示的降低的IL-5应答)。图2中显示的抗体滴度进一步证明，在相同微米颗粒中包含这两种修饰导致疫苗效价的相加效益。
实施例4：T1BT*LbL-MP的免疫原性和效力。
用指定的构建体在第0、28和42天免疫接种小鼠。1236和1237在T*中具有C→A替换，而1238和1239在T*中具有C→S替换。如图5中所示在第59天收获血清并在针对T1B肽的ELISA中进行测试。结果显示每组10只小鼠的平均值±SD。在第59天收获脾细胞并在IFNγ和IL-5ELISPOT板中用T1B肽再刺激，如图6中所示。数据描绘了每组3只小鼠的平均值±SD。小鼠在第63天用PfPb攻击并在40小时后处死，如图7中所示。通过qPCR测量肝中的寄生虫负荷。结果显示每组10只小鼠的平均值±SD。插图显示受保护小鼠的数量(与PBS对照相比18S基因表达降低＞90％)。
这些结果显示所有构建体都引起了对T1B肽的抗体应答，但交联修饰再次提供了对疫苗效价的改善。出乎意料的是，ACT-1236和-1237(T*中的C→A替换)无法诱导针对T1B肽的IFNγ和IL-5T细胞应答，而ACT-1238和-1239(T*中的C→S替换)诱导这两种T细胞应答。这种活性差异是令人惊讶的，因为这些构建体中的替换是在ELISPOT测定中不存在的T*表位中。没有理由预期C→S替换保留活性而C→A替换失去活性。
实施例5：在多种储存条件下包含半胱氨酸的T1BT*肽的降解。
如实施例1中所述合成包含半胱氨酸的T1BT*经设计肽SEQ ID NO：10，并且通过C18 HPLC(图8A)判断纯化至>95％纯度。将样品溶于水或缓冲液中，并在以下条件下储存：室温在pH约5溶液中16天(图8B)，室温在pH 7.4溶液中2.7天(8℃)，室温在pH 7.4溶液中16天(8D)，作为冷冻溶液在-20℃至-10℃下储存4年(8E)。在20分钟中使用Waters X-bridgeC18柱和100％水/(0.075％三氟乙酸(TFA))至50％水/乙腈(0.075％TFA)的梯度对这些样品进行分析HPLC。色谱图显示保留时间12.6分钟时的原始单体肽和在13.3分钟出现的新峰，其是推断的二硫化物二聚体。
实施例6：在pH 5下氧化T1BT*经设计肽并用DTT还原
制备水中T1BT*经设计肽SEQ ID NO：10的1.0mg/mL溶液，并且通过pH纸评估pH为约pH 5。使溶液在室温下静置16天，随后保留时间略长的第二个峰出现在C18色谱图中，并被推断为二硫化物二聚体(图9A)。通过添加1M Tris缓冲液将pH调节至7.4，并将样品与新鲜制备的1mg/mL二硫苏糖醇(DTT)溶液1∶1混合。5分钟后，用HPLC进行的第二次进样显示后来的洗脱峰几乎消失，与还原至单体肽一致。
实施例7：在pH 7.4下氧化T1BT*经设计肽并用DTT还原
制备水中T1BT*经设计肽SEQ ID NO：10的1.0mg/mL溶液，并通过添加1M Tris缓冲液将pH调节至7.4。将溶液在室温下静置5天，此时大部分肽已经转化为二聚体，如通过C18HPLC色谱图所判断的(图10B)。然后将样品与新鲜制备的1mg/mL DTT溶液1∶1混合，并在5分钟后将样品进样到HPLC上。色谱图显示几乎完全转化回单体肽(图10C)。
实施例8：包含丝氨酸的经设计肽SEQ ID NO：17的稳定性
制备水中T1BT*经设计肽SEQ ID NO：17的1.0mg/mL溶液，并通过添加1M Tris缓冲液将pH调节至7.4。将溶液在室温下静置5天并通过HPLC监测。色谱图显示小卫星峰的出现(图11B)，但与实施例7中含半胱氨酸的肽相比，大部分经设计肽保持完整。
除非本文中另有说明或者与上下文明显矛盾，否则没有数量词修饰的名词(尤其是在所附权利要求书的上下文中)表示一个/种或更多个/种。本文中使用的术语第一、第二等并不意指表示任何特定的排序，而仅是为了方便表示多个例如层。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另有指示，否则数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的数值被合并到说明书中，如同其在本文中单独记载。所有范围的终点均包含在该范围内并可独立地组合。除非本文中另有指示或者与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法可以以合适的顺序进行。除非另外声明，否则任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的语言均不应被解释为表示任何未要求保护的要素对于本文中所用的本发明的实践是必不可少的。
虽然已经参考示例性实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的范围的情况下可进行多种改变并且可用等价方案替换其要素。另外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可进行许多修改以使特定情况或材料适应本发明的教导。因此，本发明不旨在限于作为用于实施本发明的最佳方式而公开的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。除非本文中另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变化形式中的上述要素的任何组合。
序列表
<110> 人工细胞科技公司
<120> 抗疟疾组合物和方法
<130> ATE0038US2
<150> 62/219,260
<151> 2015-09-16
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
<400> 1
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
<210> 2
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<212> PRT
<213> 恶性疟原虫
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰T*表位
<400> 5
Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Val Thr
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 经修饰T*表位
<400> 6
Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ser Val Thr
20
<210> 7
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰T1BT*表位
<400> 7
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ser Ser Val Thr
35 40 45
<210> 8
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰T1BT*表位
<400> 8
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ala Ser Val Thr
35 40 45
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表面吸附区
<400> 9
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys
20
<210> 10
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 10
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr
35 40 45
Ser Gly Asn Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Tyr
65 70
<210> 11
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 11
Pro Ala Met Cys Tyr Ser Ser Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Asn
1 5 10 15
Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asn Ala Asn Pro Asn
20 25 30
Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser
35 40 45
Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr Ser Gly Asn Gly Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65 70 75 80
Lys Lys Lys Tyr
<210> 12
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 12
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ser Ser Val Thr
35 40 45
Ser Gly Asn Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65 70
<210> 13
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 13
Pro Ala Met Cys Tyr Ser Ser Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Asn
1 5 10 15
Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asn Ala Asn Pro Asn
20 25 30
Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser
35 40 45
Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ser Ser Val Thr Ser Gly Asn Gly Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65 70 75 80
Lys Lys Lys
<210> 14
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 14
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn
20 25 30
Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ala Ser Val Thr
35 40 45
Ser Gly Asn Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65 70
<210> 15
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 15
Pro Ala Met Cys Tyr Ser Ser Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Asn
1 5 10 15
Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asn Ala Asn Pro Asn
20 25 30
Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser
35 40 45
Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ala Ser Val Thr Ser Gly Asn Gly Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65 70 75 80
Lys Lys Lys
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表面吸附区
<400> 16
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys Tyr
20
<210> 17
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经设计肽
<400> 17
Ser Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn
1 5 10 15
Ala Asn Pro Asn Val Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn
20 25 30
Pro Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser
35 40 45
Pro Ser Ser Val Thr Ser Gly Asn Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65 70 75

Claims (11)

1.组合物，其包含：
包含多个带相反电荷的聚电解质层的第一多层膜，其中所述多层膜中所述聚电解质层之一包含第一抗原性聚电解质，
其中所述多层膜中的聚电解质包含分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，并且
其中所述第一抗原性聚电解质包含SEQ ID NO: 7所示的经修饰恶性疟原虫环子孢子T1BT*表位。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述第一多层膜沉积在核心纳米颗粒或核心微米颗粒上，或者为通过溶解所述核心纳米颗粒或核心微米颗粒而制备的纳米胶囊或微米胶囊的形式。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述多层膜还包含toll样受体配体。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述toll样受体配体与所述第一抗原性聚电解质共价连接。
5.权利要求1所述的组合物，其中SEQ ID NO: 7所示的经修饰恶性疟原虫环子孢子T1BT*表位与分子量大于1,000且每分子具有至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料共价连接。
6.权利要求1所述的组合物，其中SEQ ID NO: 7所示的经修饰恶性疟原虫环子孢子T1BT*表位与该表位的C-末端和/或N-末端处的一个或两个表面吸附区共价连接，其中所述表面吸附区中至少一个包含5个或更多个带负电荷或带正电荷的氨基酸残基。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述第一抗原性聚电解质包含第一抗原性多肽，所述第一抗原性多肽为SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13。
8.权利要求1所述的组合物，其中除了包含所述第一抗原性聚电解质的层之外，所述多层膜中的至少两个聚电解质层共价交联。
9.权利要求8所述的组合物，其中共价交联是涉及氨基酸侧链官能团的酰胺键。
10.权利要求1所述的组合物在制备用于在哺乳动物生物体中引起免疫应答的药物中的用途。
11.权利要求10所述的用途，其中所述组合物向宿主生物体的施用产生表位特异性T细胞应答，其中所述T细胞应答是IFNγ T细胞应答、IL-5 T细胞应答或这二者。
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