JP2018529684A - 抗マラリア組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

Plasmodium falciparumに由来する改変ポリペプチドエピトープ、詳細には、改変T*エピトープを含む多層フィルムが記載される。多層フィルムは、宿主に投与されると、宿主において免疫応答を誘発することができる。多層フィルムは、Plasmodium属の原生動物に由来する改変T*ポリペプチドエピトープを含む少なくとも1つの設計されたペプチドを含むことができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2015年9月16日に出願された米国仮出願第62/219,260号に対する優先権を主張する。
本開示の分野
本開示は、マラリア感染症の予防のための組成物および方法、詳細には、抗原エピトープを含有する多層フィルム組成物に関する。
マラリアは、世界全体の熱帯および亜熱帯地域において最も流行している感染症の1つである。マラリア感染は、世界中で数億人に重病をもたらし、主に開発途上国や新興国で、毎年、数百万人に死をもたらしている。マラリアの広範囲にわたる発生および発生率の上昇は、薬物耐性寄生虫および殺虫剤耐性寄生虫媒介生物の数が増加した結果である。他の因子として、環境および気候の変化、紛争、および集団移動の増加が挙げられる。
マラリアは、Plasmodium属に属する、蚊媒介性の血液寄生性原生動物(hematoprotozoan)寄生虫により引き起こされる。4種のPlasmodium属の原生動物(P. falciparum、P. vivax、P. ovaleおよびP. malariae)が、ヒトにおける疾患の原因となり、マウスにおけるP. yoeliiおよびP. bergheiのような他の多くの種が動物において疾患を引き起こす。P. falciparumは、ヒト感染の大部分を占め、最も致死的な種類であり、「熱帯マラリア」と呼ばれることもある。マラリア寄生虫は、いくつかの段階からなる生活環を有する。各段階は、対応して生じる段階特異的抗原に対する特異的免疫応答を誘導することができる。現在注目されている領域は、スポロゾイト段階の病原体に対して免疫を誘発するワクチンの開発である。スポロゾイトは感染した蚊の唾液中で成長し、蚊の咬みつきの間にヒトへ移行される。スポロゾイトは、血流を通って肝臓へ伝わり、肝臓で、肝細胞に侵入して増殖する。スポロゾイトは、スポロゾイト周囲コートタンパク質(CS)の多くの複製で被覆される。CSタンパク質に結合する抗体は、その生物体を中和し、肝臓への侵入を妨げるため、有効で持続性のある抗CS応答を誘発する薬剤は、有用なマラリアワクチンとなることが期待される。
現在、CS中和機序を介してマラリア感染の予防を図る、臨床試験中の2つのワクチンが存在する。RTS,Sは、ウイルス様粒子上にCSの多くの複製を提示するウイルス様粒子ワクチンである。RTS,Sは、成人と小児の両方を感染から保護することが示されたが、有効性が50%未満であるため、その利用については依然として議論すべき事項である。Sanaria Inc.は、有効なワクチンとして死滅したスポロゾイトの使用を提案してきたが、製造方法には宿主の蚊の唾液腺の解剖、すなわち、面倒で、実用量に拡張できないかもしれないプロセスが含まれている。よって、マラリアという生物を認識し、中和する免疫応答を誘発する抗原組成物の改良が必要とされている。
一態様では、単離されたペプチドは、配列番号5の配列を含む。
別の態様では、組成物は、
複数の逆荷電した多価電解質層を含む第1の多層フィルムであって、多層フィルム中の多価電解質層のうちの1つが第1の抗原性多価電解質を含む、第1の多層フィルム
を含み、
第1の抗原性多価電解質は、配列番号5の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T*エピトープを含み、
多層フィルム中の多価電解質は、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む。
別の実施形態では、脊椎動物における免疫応答を誘発する方法であって、脊椎動物に上記の多層フィルム組成物を投与することを含む方法。
図１は、T1、B、およびT*エピトープの位置および配列を示す、P. falciparum CSタンパク質のエピトープを示す図である。
図２は、T1BT*微粒子構築物で免疫化したC57BL/6Jマウスから49日目に採取した血清に関し、T1Bペプチドに対してELISAで試験した結果を示す。
図３は、T1BT*微粒子構築物で免疫化したC57BL/6Jマウスからの血清を1:250で試験し、プレートをアイソタイプ特異的検出抗体でプローブしたものを示す。
図４は、T1BT*微粒子構築物で免疫化したC57BL/6Jマウスから49日目に回収し、IFNγおよびIL-5 ELISPOTプレートにおいてT1Bペプチドで再刺激した脾臓細胞についての結果を示す。
図５は、T1BT*微粒子構築物で免疫化したC57BL/6Jマウスから59日目に回収し、T1Bペプチドに対してELISAで試験した血清についての結果を示す。
図６は、T1BT*微粒子構築物で免疫化したC57BL/6Jマウスから59日目に回収し、IFNγおよびIL-5 ELISPOTプレート中でT1Bペプチドで再刺激した脾臓細胞を示す。
図７は、T1BT*微粒子構築物で免疫化し、次いで、63日目にPfPbでチャレンジし、40時間後に屠殺したC57BL/6Jマウスからの結果を示す。肝臓に寄生した寄生虫をqPCRによって測定した。
図８は、種々の保存条件後のT1BT*-K20ペプチド(配列番号10)の、214nmにおけるHPLCクロマトグラムを示す。A)精製したペプチドは単一のピークである。B)およそpH5の溶液中、室温で16日間後。C) pH7.4の溶液中、室温で2.7日間後。D) pH7.4の溶液中、室温で16日間後。E)凍結溶液として-20℃で4年間保存後。
図９は、T1BT*-K20ペプチド(配列番号10)混合物の、280nmで記録したHPLCクロマトグラムを示す。A)およそpH5の溶液中、室温で16日間後。B)ジチオトレイトールで処理後。
図１０は、T1BT*-K20ペプチド(配列番号10)混合物の、214nmにおけるHPLCクロマトグラムを示す。A)新しく溶解したサンプル。B) pH7.4の溶液中で、室温で5日間インキュベーション後。C)ジチオトレイトールで処理後。
図１１は、T1BT*-K20ペプチド(配列番号17)混合物の、214nmにおけるHPLCクロマトグラムを示す。A)新しく溶解したサンプル。B) pH7.4の溶液中で、室温で5日間インキュベーション後。
図１２は、精製したPam3Cys-T1BT*-K20ペプチド(配列番号13)に関する214nm(上)および280nm(下)におけるC4 HPLCクロマトグラムを示す。
図１３は、精製したPam3Cys-T1BT*-K20ペプチド(配列番号13)に関するエレクトロスプレー質量スペクトルを示す。
上述および他の特徴は、以下の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲から、当業者によって認識され理解される。
詳細な説明
本明細書では、Plasmodium属の原生生物に由来する改変ポリペプチドエピトープを含む多層フィルムであって、宿主に投与されると、宿主において免疫応答を誘発することができる多層フィルムが開示される。詳細には、多層フィルムは、改変T*エピトープまたは改変T1BT*エピトープを含む1つまたは複数のPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲タンパク質抗原を含む。
本明細書で使用する場合、Plasmodium falciparumスポロゾイト周囲タンパク質抗原は、
T1:DPNANPNVDPNANPNV(配列番号1)
B:NANPNANPNANP(配列番号2)
T*:EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(配列番号3)
T1BT*:DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(配列番号4)
である。
一態様では、改変T*エピトープは、
EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(配列番号5)、または
EYLNKIQNSLSTEWSPASVT(配列番号6)
である。
関連する態様では、改変T1BT*エピトープは、
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(配列番号7)、または
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPASVT(配列番号8)
である。
多層フィルムに含むように設計されたペプチドを製造する際に、ペプチド合成またはフィルム生成中に鎖間ジスルフィド結合が形成されるという懸念があった。野生型T*エピトープにおける対合していないCys残基を改変するように配列番号5および6の改変T*エピトープを設計することにより、設計されたペプチドおよび多層フィルムの製造プロセスにおいて顕著な利益がもたらされた。設計されたT1BT*ペプチドを配列番号5および6の改変T*エピトープと共に含有する微粒子を動物モデルで試験した場合に、配列番号5を含有するペプチドは、野生型T1Bペプチド(配列番号4)に特異的なT細胞応答を誘発したが、配列番号6を含有するペプチドは、野生型T1Bペプチドに特異的なT細胞応答を誘発できなかったことが見出された。Ser残基の置換が許容された一方、Alaの置換が許容されなかったのは、完全に予想外であった。
具体的には、多層フィルムは、反対に荷電した（逆荷電した）多価電解質の交互層を含み、層のうちの1つは、改変T*ペプチド、または改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチド、具体的には配列番号5(改変T*エピトープ)または配列番号7(改変T1BT*エピトープ)を含む。任意選択で、1つまたは複数の多価電解質、具体的には、改変T*または改変T1BT*ペプチドを含む多価電解質はポリペプチドである。ある特定の実施形態では、多層フィルムは、Plasmodium属の原生生物の複数のエピトープを含む。例えば、第1のおよび第2のPlasmodium属の原生生物ポリペプチドのエピトープは、同一または異なる多価電解質に結合されていることができ、かつ/または同一のまたは異なる多層フィルム中に存在することができる。
一態様では、改変T*ペプチド、または改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチドは、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料に共有結合により連結される。ポリカチオン材料またはポリアニオン材料は、改変T*ペプチドまたは改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチドの多層フィルムの層への堆積に十分な電荷をもたらす。
別の態様では、改変T*ペプチドまたは改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチドは、ポリペプチドのC末端および/またはN末端の1つまたは2つの表面吸着領域に共有結合により連結しており、表面吸着領域のうちの少なくとも1つは、5つ以上の、例えば10から20個の負または正に荷電したアミノ酸残基を含む。表面吸着領域は、改変T*ペプチドまたは改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチドの多層フィルムの層への堆積に十分な電荷をもたらす。一実施形態では、抗原ポリペプチド(T*エピトープおよび表面吸着領域を含む)の残基あたりの正味の電荷は、pH7.0で、0.1、0.2、0.3、0.4、または0.5以上である。
一実施形態では、組成物は、複数の逆荷電した多価電解質層を含む第1の多層フィルムを含み、多層フィルム中の多価電解質層の1つは、第1の抗原性多価電解質を含み、第1の抗原性多価電解質は、改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T*エピトープを含み、多層フィルム中の多価電解質は、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む。別の実施形態では、組成物は、複数の逆荷電した多価電解質層を含む第1の多層フィルムを含み、多層フィルム中の多価電解質層の1つは、第1の抗原性多価電解質を含み、第1の抗原性多価電解質は、改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1BT*エピトープを含み、多層フィルム中の多価電解質は、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む。別の態様では、改変T*エピトープは配列番号5を有する。別の態様では、改変T1BT*エピトープは配列番号7を有する。
一実施形態では、第1の抗原性多価電解質は、任意の順番に、2つのPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲エピトープ、例えば、T1T*、BT*を含み、T*エピトープは改変T*エピトープである。エピトープは、ポリペプチド鎖上で連続していてもよく、またはスペーサー領域で間隔をあけられていてもよい。同様に、エピトープは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、またはその間の任意の場所に存在することができる。さらに別の実施形態では、第1の多価電解質は、Plasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1、B、および改変T*エピトープの3つすべてを含むポリペプチドである。T1、B、および改変T*エピトープは、ポリペプチドの連続部分にあってもよく、またはエピトープのいずれかまたはすべては、スペーサー領域によって分離されていてもよい。
一態様では、多層フィルム中の、改変T*ペプチド、または改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチドは、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料に共有結合により連結される。ポリカチオン材料またはポリアニオン材料は、改変T*ペプチドまたは改変T*エピトープを含有するT1BT*ペプチドの多層フィルムの層への堆積に十分な電荷をもたらす。
一態様では、改変T*または改変T1BT*エピトープの多層フィルムへの堆積を促進するために、ペプチドは、1つまたは複数の高荷電表面吸着領域、例えば、N末端、C末端、または両方を含む。一態様では、表面吸着領域のうちの少なくとも1つは、5つ以上の負または正に荷電したアミノ酸残基を含む。抗原ペプチドおよび1つまたは複数の表面吸着領域を含有するペプチドは、本明細書において、設計されたポリペプチド(DP: designed polypeptides)と表示される。
第1の抗原性多価電解質がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、ポリペプチド多層フィルムへの堆積に十分な電荷を含有することに留意されたい。一実施形態では、ポリペプチドの残基あたりの正味の電荷は、本明細書で説明されているように、pH7.0で、0.1、0.2、0.3、0.4または0.5以上である。
別の実施形態では、Plasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1、Bおよび改変T*エピトープが同じ多価電解質上にある代わりに、2つまたは3つのエピトープは、別の多価電解質上に存在し、同じ多層フィルムに層形成することができる。一実施形態では、第1の多層フィルムは、第2の多価電解質に共有結合により連結しているPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1、B、または改変T*エピトープを含む第2の抗原性多価電解質をさらに含み、第1および第2の抗原性多価電解質は、異なるPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲エピトープを含む。さらなる実施形態では、第1の多層フィルムは、第3の多価電解質に共有結合により連結しているPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1、B、または改変T*エピトープを含む第3の抗原性多価電解質をさらに含み、第1、第2および第3の抗原性多価電解質は、異なるPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲エピトープを含む。一実施形態では、第1、第2および/または第3の多価電解質はポリペプチドである。
一実施形態では、第1、第2および任意選択で第3の多価電解質は、別の多層フィルム、例えば、被覆されたコアの2つまたは3つの個別の集団(各集団は異なる多層フィルムを含む)に存在する。したがって、一実施形態では、組成物は、上述の第1の多層フィルムおよび複数の逆荷電した多価電解質層を含む第2の多層フィルムを含み、第2の多層フィルム中の層のうちの1つは、第2の抗原性多価電解質を含み、第2の抗原性多価電解質は、第2の多価電解質に共有結合により連結しているPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1、Bまたは改変T*エピトープを含み、第1および第2の抗原性多価電解質は異なるPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲エピトープを含む。さらなる実施形態では、組成物は、複数の逆荷電した多価電解質層を含む第3の多層フィルムをさらに含み、第3の多層フィルムの層のうちの1つは、第3の抗原性多価電解質を含み、第3の抗原性多価電解質は、第3の多価電解質に共有結合により連結しているPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1、B、または改変T*エピトープを含み、第1、第2および第3の抗原性多価電解質は異なるPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲エピトープを含む。ある特定の実施形態では、第1、第2および第3の多価電解質はポリペプチドである。一部の実施形態では、第1、第2および第3の多層フィルムは、別のコア粒子上に層形成され、そのため、組成物は、2種または3種の異なる粒子の集団を含む。
ある特定の実施形態では、多層フィルムは、トール様受容体リガンドをさらに含む。本明細書で使用する場合、トール様受容体リガンド、すなわちTLRリガンドは、TLRに結合し、TLR受容体を活性化するかまたは抑制する分子である。病原体関連分子パターン(PAMP)および模倣体の認識を介したTLRシグナル伝達の活性化は、抗原特異的適応免疫応答の活性化を制御することのできる炎症誘発性サイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子をコードする遺伝子の転写活性化を導く。TLRは、種々の炎症性疾患およびがんに対する有効な治療標的として追跡されている。活性化の後、TLRは、炎症性サイトカイン、I型インターフェロン、およびケモカインを含むいくつかのタンパク質ファミリーの発現を誘導する。TLR受容体リガンドは、免疫応答に対するアジュバントとして機能することができる。
例示的なTLRリガンドとして、TLR1リガンド、TLR2リガンド、TLR3リガンド、TLR4リガンド、TLR5リガンド、TLR6リガンド、TLR7リガンド、TLR8リガンド、TLR9リガンドおよびその組合せが挙げられる。
例示的なTLR1リガンドとして、細菌リポペプチドが挙げられる。例示的なTLR2リガンドとして、Pam3Cys（[N-パルミトイル-S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン]）およびPam2Cys（[S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システイン]）などのリポペプチドが挙げられる。例示的なTLR6リガンドは、ジアシルリポペプチドである。TLR1およびTLR6は、リガンドを認識するためにTLR2とのヘテロ二量体化を要する。一部の交差認識はあるが、TLR1/2は、トリアシルリポタンパク質(または、Pam3Cysペプチドなどのリポペプチド)によって活性化され、一方、TLR6/2は、ジアシルリポタンパク質(例えば、Pam2Cys)によって活性化される。
例示的なTLR3リガンドは、ポリ(I:C)である。例示的なTLR4リガンドは、リポ多糖(LPS)およびモノリン脂質A(MPLA)である。例示的なTLR5リガンドは、フラジェリンである。例示的なTLR7リガンドは、イミキモドである。例示的なTLR8リガンドは、一本鎖RNAである。例示的なTLR9リガンドは、メチル化されていないCpGオリゴデオキシヌクレオチドDNAである。
一実施形態では、第1、第2、または第3の抗原性多価電解質、例えば、抗原ポリペプチドは、それと共有結合したTLRリガンドを有する。例えば、Pam3Cysは、標準のポリペプチド合成化学によってポリペプチド鎖に共有結合によりカップリングすることができる。
別の実施形態では、鋳型コアなどの基質上に、多価電解質層の堆積前にTLRリガンドが堆積されている。別の実施形態では、TLRリガンドは、多層フィルムの積層中に1つまたは複数の多価電解質層と共堆積される。
一実施形態では、多層フィルムは、コア粒子、例えば、コアナノ粒子またはコアマイクロ粒子上に堆積される。例示的なコアとして、CaCO3ナノ粒子およびマイクロ粒子、ラテックス粒子、および鉄粒子が挙げられる。直径5ナノメートル(nm)から500マイクロメートル(μm)のオーダーの粒径が有用である。0.05〜20μmの直径を有する粒子は、ワクチンの目的に好ましい。およそ直径1〜10μmの粒子は、ワクチンとして特に有用である。生体適合性であり、制御可能なサイズ分布を有し、かつ多価電解質ペプチドと結合するのに十分な表面電荷(正または負のいずれか)を有することを条件として、他の材料から作製された粒子もコアとして使用することができる。例として、ポリ乳酸(PLA)、ポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)、ポリエチレングリコール(PEG)、キトサン、ヒアルロン酸、ゼラチン、またはその組合せなどの材料から作製されたナノ粒子およびマイクロ粒子が挙げられる。コア粒子は、フィルム製作後に溶解でき多層フィルムから分離できるものであることを条件に、ヒトへの使用に不適当であると考えられる材料からも作製することができるであろう。鋳型コア基質の例として、ラテックスなどの有機重合体またはシリカなどの無機材料が挙げられる。
多価電解質多層フィルムは逆荷電した多価電解質の交互層から構成される薄膜(例えば、数ナノメートルからマイクロメートル厚さ)である。このようなフィルムは、適切な基質上に交互積層法によって形成することができる。静電気的自己交互積層法(「LBL」)では、多価電解質の会合の物理的基礎は、静電引力である。フィルムの表面電荷密度の符号が、連続した層の堆積で逆転するため、フィルムの構築が可能となる。LBLフィルムプロセスが一般的かつ比較的簡素であることにより、多くの異なる種類の表面に多くの異なる種類の多価電解質を堆積させることが可能となる。ポリペプチド多層フィルムは、本明細書において、設計されたポリペプチド(DP)と称される荷電したポリペプチドを含む少なくとも1つの層を含む多価電解質多層フィルムの一種である。他の重合体から作製されたフィルムと比べたポリペプチド多層フィルムの重要な利点は、その生体適合性である。
LBLフィルムは、他の材料のカプセル化にも使用することができる。ポリペプチドフィルムおよびマイクロカプセルの用途として、例えば、ナノリアクター、バイオセンサー、人工細胞、および薬物伝達ビヒクルが挙げられる。
用語「多価電解質」は、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む。適切なポリカチオン材料として、例えば、ポリペプチドおよびポリアミンが挙げられる。ポリアミンとして、例えば、ポリ-L-リシン(PLL)またはポリ-L-オルニチンなどのポリペプチド、ポリビニルアミン、ポリ(アミノスチレン)、ポリ(アミノアクリレート)、ポリ(N-メチルアミノアクリレート)、ポリ(N-エチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノアクリレート)、ポリ(アミノメタクリレート)、ポリ(N-メチルアミノ-メタクリレート)、ポリ(N-エチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノメタクリレート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)、ポリ(N,N,N-トリメチルアミノアクリレートクロリド)、ポリ(メチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド)、キトサンおよび前記カチオン材料の1つまたは複数の組合せが挙げられる。適切なポリアニオン材料として、例えば、ポリ-L-グルタミン酸(PGA)およびポリ-L-アスパラギン酸などのポリペプチド、DNAおよびRNAなどの核酸オリゴマー、アルギン酸、カラギーナン、ファーセルラン、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリ(メタ)アクリル酸、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、酸性多糖、およびクロスカルメロース、ペンダントカルボキシル基を含有する合成重合体および共重合体、および前記ポリアニオン材料の1つまたは複数を含む組合せが挙げられる。一実施形態では、Plasmodium属の原生動物のエピトープおよび多価電解質は、同一の電荷の符号を有する。別の実施形態では、Plasmodium属の原生動物のエピトープおよび多価電解質は、逆の電荷の符号を有する。
一実施形態では、Plasmodium属の原生動物のエピトープを含む多価電解質を任意選択で含む、フィルムの1つまたは複数の多価電解質層は、設計されたポリペプチドである。一実施形態では、静電交互積層法に適するポリペプチドに対する設計方針は、参照によりそのポリペプチド多層フィルムの教示が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0,069,950号に説明されている。簡単にいうと、主要な設計上の関心事は、ポリペプチドの長さと電荷である。静電気学は、LBLの基礎であるため、最も重要な設計上の関心事である。適切な電荷特性がなければ、ポリペプチドは、pH4から10の水溶液中に実質的に可溶性でない場合があり、LBLによる多層フィルムの製作に容易に使用することができない。他の設計上の関心事として、ポリペプチドの物理的構造、ポリペプチドから形成されたフィルムの物理的安定性、ならびにフィルムおよび構成ポリペプチドの生体適合性および生理活性が挙げられる。
設計されたポリペプチドは、逆荷電した表面への安定な結合のために十分な電荷を有するポリペプチド、すなわち、フィルム形成のための駆動力が静電引力である、多層フィルムの層に堆積されうるポリペプチドを意味する。短期間安定なフィルムは、一旦形成されると、PBS中で、37℃で24時間インキュベーション後にその成分の過半量を保持するフィルムである。具体的な実施形態では、設計されたポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、ポリペプチドの残基あたりの正味の電荷の大きさは、pH7.0で0.1、0.2、0.3、0.4または0.5以上である。pH7.0で正に荷電した(塩基性の)天然に存在するアミノ酸は、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)、オルニチン(Orn)、およびリシン(Lys)である。pH7.0で負に荷電した(酸性の)天然に存在するアミノ酸残基は、グルタミン酸(Glu)およびアスパラギン酸(Asp)である。全体の正味の荷電率が特定の基準と合致する限り、逆荷電したアミノ酸残基の混合物を用いることができる。一実施形態では、設計されたポリペプチドは、ホモポリマーではない。別の実施形態では、設計されたポリペプチドは、分岐していない。
逆荷電した多価電解質間の静電引力は、通常、周囲条件下で、例えば、中性pHかつ体温で安定であるフィルムを製造するのに十分である。しかし、フィルムの安定性は、フィルムが形成された後の層間の共有結合を工学的に操作することによって高めることができる。この架橋プロセスは、フィルムにさらなる安定性を与え、フィルムが、高温またはpHの大きな変化のようなより厳しい条件に耐えることを可能としうる。架橋に対して有用な共有結合の例として、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、アミド結合などがある。ポリペプチドから構成されるフィルムに関して、アミド結合を生じる化学は特に有用である。適当なカップリング試薬の存在下で、酸性のアミノ酸(アスパラギン酸およびグルタミン酸などのカルボン酸基を含有する側鎖を有するもの)は側鎖がアミン基(例えば、リシンおよびオルニチン)を含有するアミノ酸と反応して、アミド結合を形成する。アミド結合は、生物学的条件下でジスルフィド結合よりも安定であり、アミド結合は交換反応を受けない。多くの試薬を使用して、アミド結合のためにポリペプチド側鎖を活性化することができる。カルボジイミド試薬、例えば、水溶性1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)は、やや酸性のpHで、アスパラギン酸またはグルタミン酸と反応して、不可逆的にアミンと反応してアミド結合を生じる中間体生成物を形成する。N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)などの添加剤を反応物に添加して、アミド形成の速度および効率を加速させることも多い。架橋後に、可溶性試薬および副産物を、例えば、遠心分離および吸引によって、ナノ粒子またはマイクロ粒子から除去する。あるいは、可溶性試薬は、粒子の濾過によって、例えば、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって除去することができる。他のカップリング試薬の例として、ジイソプロピルカルボジイミド、HBTU、HATU、HCTU、TBTU、およびPyBOPが挙げられる。他の添加剤の例として、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド(スルホ-NHS)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、および1-ヒドロキシ-7-アザ-ベンゾトリアゾールが挙げられる。アミド架橋の程度は、カップリング試薬の化学量論、反応時間、または反応温度を調節することによって制御することができ、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)などの技術によってモニタリングすることができる。
共有結合により架橋したLBLフィルムは、安定性の増大などの望ましい特性を有する。安定性が高まると、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセル、またはマイクロカプセルの製作中に、より厳しい条件を使用することが可能となる。厳しい条件の例として、高温、低温、極低温、高速遠心分離、高塩濃度緩衝液、高pH緩衝液、低pH緩衝液、濾過、および長期保存が挙げられる。一態様では、第1の抗原性多価電解質を含有する層以外の、多層フィルムの少なくとも2つの多価電解質層が共有結合により架橋している。共有結合による架橋結合は、例えば、アミノ酸側鎖官能基を含むアミド結合である。
多価電解質多層フィルムを作製する方法は、逆荷電した化学種の複数の層を基質上に堆積させることを含む。一実施形態では、少なくとも1つの層は、設計されたポリペプチドを含む。連続して堆積された多価電解質は、逆の正味の電荷を有することになる。一実施形態では、多価電解質の堆積は、基質を、LBLに適切な正味の電荷を有するpHで多価電解質を含む水溶液に曝露することを含む。他の実施形態では、基質上での多価電解質の堆積は、逆荷電したポリペプチドの溶液の連続した噴霧によって達成される。さらに他の実施形態では、基質上の堆積は、逆荷電した多価電解質の溶液の同時噴霧によるものである。
多層フィルムを形成するLBL方法では、隣接する層の逆荷電が積層に対する駆動力をもたらす。向かい合う層における多価電解質が、同じ正味の線形電荷密度を有することは重要ではなく、向かい合う層が正味の逆荷電を有することのみが重要である。堆積による1つの標準的なフィルム積層手順には、イオン化されるpH(すなわち、pH4〜10)で多価電解質の水溶液を形成すること、表面電荷を保有する基質を準備すること、および荷電した多価電解質溶液に基質を交互に浸漬することが含まれる。基質は、交互の層の堆積の間に任意選択で洗浄され、結合していない多価電解質を除去する。
多価電解質の堆積に適切な多価電解質の濃度は、当業者によって容易に決定されうる。例示的な濃度は0.1から10mg/mLである。
さらに、安定な多価電解質多層フィルムを形成するために必要な層の数は、フィルム中の多価電解質に応じて変わる。低分子量のポリペプチド層のみを含むフィルムでは、フィルムは、典型的に、逆荷電したポリペプチドの2つ以上の二重層を有する。研究により、多価電解質フィルムが動的であることが示された。フィルム内に含有された多価電解質は層間を移動することができ、多価電解質溶液に懸濁された場合に、同様の電荷の可溶性多価電解質と交換することができる。さらに、多価電解質フィルムは、懸濁緩衝液の温度、pH、イオン強度、または酸化電位などの環境における変化に応じて分解または溶解する場合がある。したがって、一部の多価電解質および特定のペプチド多価電解質は、一時的な安定性を示す。ペプチド多価電解質フィルムの安定性は、フィルムを、制御された条件下で、固定された期間、適切な緩衝液中に懸濁し、次いで、アミノ酸分析、HPLCアッセイ、または蛍光アッセイなどの適切なアッセイを用いてフィルム内のペプチドの量を測定することによってモニタリングすることができる。ペプチドの多価電解質フィルムは、ワクチンとしての保存および利用に関する条件下、例えば、中性の緩衝液中で4℃から37℃のような周囲温度で最も安定である。これらの条件下で、安定なペプチド多価電解質フィルムは、少なくとも24時間、しばしば14日以上まで、その構成ペプチドのほとんどを保持することになる。
一実施形態では、設計されたポリペプチドは、1つまたは複数のPlasmodium属の原生動物のエピトープに共有結合により連結している1つまたは複数の表面吸着領域を含む。本明細書で使用する場合、表面吸着領域は、例えば、Plasmodium属の原生動物由来のエピトープを含有するペプチドが、多層フィルムに堆積されうるような十分な電荷を提供するのに都合のよい設計されたポリペプチドの荷電領域である。1つまたは複数の表面吸着領域および1つまたは複数のPlasmodium属の原生動物のエピトープは、同一または反対の極性を有することができる。別の実施形態では、pH4から10での設計されたポリペプチドの溶解度は、約0.1mg/mL以上である。別の実施形態では、pH4から10での設計されたポリペプチドの溶解度は、約1mg/mL以上である。溶解度は、水溶液からのポリペプチドの堆積を促進する実用上の限定である。
例示的な表面吸着領域は、20個の連続するリシン残基(K20またはK20Y)を含む。例えば、Plasmodium属の原生動物のエピトープが、配列番号7の改変T1BT*エピトープである場合、表面吸着領域が、5から20個の正に荷電したアミノ酸残基、または5から20個の負に荷電したアミノ酸残基を含むことが好ましい。
一実施形態では、設計されたポリペプチドは、2つの表面吸着領域、すなわち、N末端表面吸着領域とC末端表面吸着領域に近接する単一のPlasmodium属の原生動物の抗原エピトープを含む。別の実施形態では、設計されたポリペプチドは、Plasmodium属の原生動物のエピトープのN末端に連結された1つの表面吸着領域に近接する、単一のそのPlasmodium属の原生動物の抗原エピトープを含む。別の実施形態では、設計されたポリペプチドは、Plasmodium属の原生動物のエピトープのC末端に連結した1つの表面吸着領域に近接する、単一のそのPlasmodium属の原生動物の抗原エピトープを含む。
設計されたポリペプチドの独立した領域(例えば、Plasmodium属の原生動物のエピトープおよび表面吸着領域)のそれぞれは、溶液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、または適切な宿主生物の遺伝子工学によって別々に合成することができる。溶液相と固相の方法の組合せを使用して、相対的に長いペプチドとさらに小さいタンパク質を合成することができる。ペプチド合成会社は、専門知識と経験を有しており、出来高払いで困難なペプチド合成を行う。合成は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準(GMP)条件下で、かつ臨床試験および薬物の商業的発売に適する規模で実施される。
あるいは、種々の独立した領域は、溶液相ペプチド合成、固相ペプチド合成または適切な宿主生物の遺伝子工学によって一本鎖ポリペプチドとして一緒に合成することができる。任意の特定の場合では、手法の選択は、利便性または経済の問題となる。
種々のPlasmodium属の原生動物のエピトープおよび表面吸着領域が別々に合成される場合、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによって、または高速液体クロマトグラフィーによって一旦精製されると、それらは、ペプチド結合合成によって接合することができる。すなわち、表面吸着領域のN末端とPlasmodium属の原生動物のエピトープの1つまたは複数のC末端が共有結合により接合されて、設計されたポリペプチドを生じる。あるいは、表面吸着領域のC末端とPlasmodium属の原生動物のエピトープのN末端が共有結合により接合されて、設計されたポリペプチドが生じる。個々の断片は固相方法によって合成され、十分に保護されたか、十分に保護されていないか、または部分的に保護されたセグメントとして得ることができる。セグメントは、溶液相反応または固相反応において共有結合により接合されうる。1つのポリペプチド断片がシステインをそのN末端残基として含有し、もう一方のポリペプチド断片がそのC末端残基としてチオエステルまたはチオエステル前駆体を含有する場合、2つの断片は、ネイティブシステインライゲーションとして当業者に通常知られている特異的反応によって、溶液中で自然にカップリングする。ネイティブシステインライゲーションは、水溶液中で、かつ希釈濃度で、十分に脱保護されたか、または部分的に保護されたペプチド断片を用いて実施することができるため、設計されたペプチド合成に対して特に魅力的な選択肢である。
一実施形態では、Plasmodium属の原生動物のエピトープおよび/または表面吸着領域は、参照により、非ペプチド連結を使用して多層フィルムで使用するためのポリペプチドのセグメントを接合することについての教示が本明細書に組み込まれる米国特許第7,723,294号に記載されているペプチドまたは非ペプチド連結によって接合される。適切な非ペプチドリンカーとして、例えば、-NH-(CH2)s-C(O)-(式中、s=2〜20)などのアルキルリンカーが挙げられる。アルキルリンカーは、非立体傷害性の基、例えば、低級アルキル(例えば、C1〜C6)、低級アシル、ハロゲン(例えば、Cl、Br)、CN、NH2、フェニルなどによって任意選択で置換される。別の例示的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカー、例えば、-NH-(CH2-CH2-O)n,-C(O)-（式中、nは、リンカーが約100から約5000Daの分子量を有するようなものである）である。本明細書に記載されているリンカーの多くは、固相ペプチド合成での使用に適する形態で商業的供給業者から入手可能である。
一実施形態では、Plasmodium属の原生動物由来のポリペプチドエピトープのうちの1つまたは複数は、共有結合を介して、1つまたは複数の多価電解質、例えばポリペプチドまたは他の多価電解質の1つまたは複数に共有結合する。適切な共有結合の例として、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、およびジスルフィドが挙げられる。当業者は、適切な電解質への結合を工学的に操作するために、エピトープペプチド内で見出されたある範囲の官能基を利用することができる。例えば、エピトープペプチドにおけるカルボン酸は、アミノ酸であるアスパラギン酸またはグルタミン酸のC末端または側鎖のいずれかで見出すことができる。カルボン酸は、ポリ-L-リシンなどのペプチド多価電解質で見出される第一級または第二級アミンと反応するために、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)などの適切なペプチドカップリング試薬で活性化されうる。得られたアミド結合は、周囲条件下で安定である。逆に、ペプチド多価電解質における酸性基は、エピトープペプチドにおけるアミン基と反応するために、EDCで活性化されうる。有用なアミン基は、エピトープペプチドのN末端またはリシン残基の側鎖上で見出すことができる。
エピトープペプチドは、チオエーテル結合を介しても多価電解質に結合されうる。合成エピトープペプチドは、スルフヒドリルと特異的に反応するハロアセチル基などの適当な求電子剤を伴わせて合成することができる。例えば、N末端にクロロアセチルを含有するエピトープペプチドは、スルフヒドリルを保有する多価電解質に対する安定な結合を形成する。
エピトープペプチドは、二官能性リンカー分子を介して多価電解質に共有結合することもできる。二官能性リンカーは、通常、エピトープペプチドまたは多価電解質分子のいずれかに存在する、求電子剤と反応することができる2つの求電子基を含有する。2つのクラスのリンカー分子、ホモ二官能性リンカーとヘテロ二官能性リンカーが市販されている。ホモ二官能性リンカーは、非反応性スペーサーによって接合した求電子基の2つの複製を含有する。求電子剤は、求核アミンと反応するN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルまたはスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(スルホ-NHS)などの活性エステいるであることが多い。ホモ二官能性NHSエステルの例として、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジチオビス(スクシンイミジル)プロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタータレートが挙げられる。求電子剤は、エピトープおよび多価電解質分子上の求核アミンとイミドを形成するアルデヒド基であることもある。イミド結合は、一時的に安定であるが、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤または接触水素化を用いて安定な構造に変換することができる。最も一般的に使用されるホモ二官能性アルデヒドリンカーは、グルタルアルデヒドである。
他の通常使用されるホモ二官能性リンカーは、上述のように、システイン含有エピトープペプチドをスルフヒドリル含有多価電解質に連結させるために使用することのできる、求核チオールと特異的に反応する求電子剤を含有する。スルフヒドリル特異的ホモ二官能性リンカーの例として、1,4-ビスマレイミドブタン、1,4ビスマレイミジル-2,3-ジヒドロキシブタン、ビスマレイミドヘキサン、ビス-マレイミドエタン、1,4-ジ-［3’-(2’-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド］ブタン、ジチオ-ビスマレイミドエタン、1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホンが挙げられる。
遊離のシステイン残基を含有する設計されたポリペプチドは、他の分子との共有結合による連結に有用であるが、遊離のスルフヒドリル基は、問題を含みうる様々な態様で酸化され得る。例えば、2つの遊離システイン含有ペプチドが酸化カップリングを受け、ジスルフィド結合を介して共有結合により連結されるようになる。これらの遊離システインペプチドが全く同じである場合、生成物は対称的なジスルフィドまたはジスルフィド二量体と称される。ジスルフィド二量体化は、穏やかな条件下、例えば、周囲温度または冷却保存中であっても起こりうる。要求されることのすべては、空気中の酸素などの穏やかな酸化剤または別の穏やかな酸化剤にしばらく曝露することである。さらに、遊離システインペプチドが、固体として、例えば、乾燥粉末として、または溶液形態で、例えば、中性pHの水中1mg/mL溶液として保存される場合に、二量体化が起こりうる。遊離システインペプチドが自己会合する傾向にある場合、本質的にすべてのモノマー遊離システインペプチドが二量体に変換されうる。例えば、不活性ガス雰囲気中での作業または溶媒および緩衝液の脱気など、酸化剤への曝露を排除するために、注意深い工程が行われた場合でさえ、微量または不要なジスルフィド生成物が形成されうる。
ジスルフィド二量体化については、いくつかの理由のためにワクチン組成物についても懸念がある。第一に、遊離システインペプチドが薬物物質の一部である場合、ジスルフィド二量体は不純物であるとみなされ、度々モニタリングすること、定量することが求められ、十分量で存在する場合には、可能な毒性に関する除去および/または特徴付けが求められる。第二に、ジスルフィド二量体は経時的に蓄積する場合があることから、遊離システインペプチド薬物物質は、遊離システインを欠くペプチドよりも貯蔵寿命が短い傾向にある。第三として、システインが、重要な抗体エピトープまたはT細胞エピトープの一部であるかまたはその付近にある場合、二量体化によってエピトープが隠れ、従って所望の免疫応答を弱める場合がある。最後に、二量体化によって、保護とは関係なくそれゆえ所望の免疫応答を希薄にする新たな抗体エピトープが創出される場合がある。明らかに、システインが重要な機能(例えば、システインが、抗体エピトープまたはT細胞エピトープの重要な構成成分であるか、または上述のようにコンジュゲーションまたは連結のために使用される場合)を果たさない限り、薬物物質中で遊離システインペプチドを使用することは避けることが好ましい。
実施例5では、遊離システインを含有する設計されたT1BT*-K20ペプチド(配列番号10)が種々の保存条件に供され、ペプチドの純度がクロマトグラフィーによりモニタリングされた。すべての保存条件により、出発モノマー遊離システインペプチドから分離することができる新たな種が生じた。この新たなピークは、システイン酸化（おそらく、対称的なジスルフィド二量体への酸化）の結果である可能性が高く、この結論は、還元剤であるジチオトレイトール(DTT)を用いる処理によってその新たなピークが元の遊離システインペプチドに戻るという観察によって支持されている。この現象は、遊離システインを含有するすべてのT1BT*ペプチドで起こりやすいことが予想される。したがって、この望ましくない副反応を制御し、または、この副反応が起こるのを妨げる必要がある。
保護的免疫応答を誘発するエピトープは、いくつかの方法で特定することができる。推定上の抗体エピトープは、ELISAなどのアッセイにおいて、病原体タンパク質のサブユニット、欠失突然変異体、または点突然変異体に対する免疫血清またはモノクローナル抗体を試験することによって特定することができる。推定上のT細胞エピトープは、ELISPOTなどのアッセイにおいて、病原体タンパク質の長さにわたってオーバーラップする複数のペプチドに対して免疫末梢血単核細胞を試験することによって特定することができる。それぞれの場合で、重複し部分的に冗長となる多数のサブユニット分析物を使用することによって、抗体であろうとT細胞であろうと保護的免疫の構成成分によって認識される推定上のエピトープを当業者が特定することが可能となる。推定上の保護エピトープは、次いで、定義されたエピトープでナイーブ動物を免疫化することおよび目的の病原体でチャレンジすることによって評価され、エピトープ制限された免疫応答が宿主を感染または病理から保護するか否かを決定することができる。
抗体またはT細胞のエピトープが特定された後、機能を失うことなく個々のアミノ酸残基のうちの1つまたは複数を置換することが可能である場合がある。不運にも、どの残基が置換されうるか、および他のどの残基が適切な代替物としての役目を果たすことができるかを予想することは困難である。したがって、潜在的に許容される代替の残基を有する新たな類似体が調製され、動物モデルで、または所望のin vivoでの結果を予想するサロゲートin vitroアッセイで試験されなければならない。ペプチドアレイ合成技術を使用して多数のペプチド類似体を調製することができるが、これらを動物モデルでスクリーニングすることは、法外な時間と費用がかかり得る。このような供給源の制限下で、調製する類似体の数を低減して、同様のサイズおよび/または官能性の残基に置換を限定することによってスクリーニングを行い得る。同様のサイズおよび官能性を有し、置換に関して良い候補であるアミノ酸残基対の例は、セリン/トレオニン(Ser/Thr)、イソロイシン/バリン(Ile/Val)、フェニルアラニン/チロシン(Phe/Tyr)、イソロイシン/ロイシン(Ile/Leu)、アスパラギン/グルタミン(Asn/Gln)、アスパラギン/アスパラギン酸(Asn/Asp)、グルタミン/グルタミン酸(Gln/Glu)、アスパラギン酸/グルタミン酸(Asp/Glu)、およびアスパラギン/リシン(Arg/Lys)である。グリシンおよびプロリンは、他の天然アミノ酸と構造的に異なるため、これらの残基に対する許容可能な置換基を見出せないことは驚くべきことではない。
その高い反応性、水素結合特性、および酸化する傾向のために、システインは、天然アミノ酸の中で独特である。システインは、セリンと同じ数の重原子(非水素)を含有するが、システインの側鎖スルフヒドリル基は、セリンのヒドロキシル基よりずっと酸性であり、中性pHで部分的にイオン化される。したがって、ペプチドエピトープ内のシステイン残基のための置換基を特定するための最もよい方法は、いくつかのセンシブルな類似体を作製し、それらを、マウスの免疫化モデルなど予想的アッセイで試験することである。
マラリアCSタンパク質におけるT*エピトープは、ペプチドベースのマラリアワクチン候補の重要な構成成分であることが見出された。それは、折り畳まれたCSタンパク質においてT*領域の外側にある残基(Cys369)にジスルフィド結合するシステイン残基(Cys334)を含有する。T細胞のエピトープとして、T*を含有する免疫組成物は、抗原提示細胞によって取り込まれ、より短い直鎖状ペプチドセグメントへとプロセスされ、直鎖状構造において主要組織適合複合体(MHC)分子に結合する。次いで、ペプチド:MHCの複合体は、細胞表面へと位置を変え、T細胞受容体(TCR)を介してペプチド:MHC複合体を認識するT細胞にペプチドを提示する。T*エピトープの場合では、抗原提示細胞による細胞内プロセッシングは、天然のジスルフィド結合を還元して、遊離システインとしてCys334を残す。理論上は、MHC結合およびT細胞による認識にとって重要な相互作用が保存されることを条件として、Cys334を別の残基で置き換えることが可能であるはずである。
T*システイン置換を含有する設計されたペプチドの合成については実施例1に記載されており、そのマラリアワクチンマイクロ粒子への製作については実施例2に記載されている。設計されたペプチドである、Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys→Ser、配列番号13)およびPam3Cys-T1BT*-K20(Cys→Ala、配列番号14)は、それぞれ、Cys334の代わりにセリンおよびアラニンの置換を含有する。これらの設計されたペプチドを含有するマイクロ粒子ワクチン、および天然遊離システイン設計ペプチドPam3Cys-T1BT*-K20(配列番号11)を含有するマイクロ粒子を使用して、実施例3および実施例4に記載されているように、マウスを免疫化した。免疫化に続いて、ヒトマラリア生物体Plasmodium falciparum(Pf)由来のスポロゾイト周囲(CS)コートタンパク質のT1B反復エレメントを発現するよう遺伝子工学的に操作されたマウスマラリア生物体Plasmodium bergheii(Pb)のハイブリッド形態に感染した蚊を用いて、動物にチャレンジした。PfPb形質転換体は、マウスのチャレンジ実験において、PfのCSタンパク質に対して標的化したワクチンを試験することを可能にする。実施例3に記載されている実験では、すべてのマウスコホートが、強い抗T1Bポリクローナル抗体応答をもって免疫化に応答した(図5)。種々のワクチンバッチは、ベース層の架橋およびT*エピトープの334位の残基を除いて、すべての点で同様であるので、これは予測された結果であった。データのさらなる精査によって、セリンの代替物(配列番号13)は、システイン含有配列(配列番号11)と等しい抗T1B力価を有するマウス血清を誘発したが、一方、アラニンの代替物(配列番号14)は、より低い力価の抗T1B血清を誘発したことが明らかとなる。置換はT*領域で起こっているにも関わらずT1Bエピトープに対する抗体の応答に影響を有するように見られ、この結果は予測されなかったものである。すなわち、T*エピトープは、T1B特異的抗体応答の大きさに影響を及ぼすようであり、天然のシステインに対する最適でない代替物は応答の大きさを低減する。
実施例4では、改変したT*エピトープを有するワクチンマイクロ粒子構築物で免疫化したマウスから、T細胞を採取した。T1Bペプチドに特異的なT細胞アッセイで試験した場合、天然のシステイン残基または代替物であるセリン残基を有する構築物だけが強力な応答を誘発した。アラニン置換構築物で処置したマウス由来の細胞は乏しいT細胞応答しか生じなかった(図6)。さらに、PbPfハイブリット生物体を用いて動物をチャレンジに供した場合、セリン突然変異体を含有するマイクロ粒子で免疫化した動物は、アラニン構築物で免疫化したマウスと比較して保護レベルの増大を示した(図7)。理論に拘泥するものではないが、T*エピトープのセリン突然変異体は、MHC提示分子もしくはT細胞受容体のいずれかまたは両方との重要な分子相互作用を保存しているが、アラニン突然変異体は1つまたは複数の相互作用を欠いていると考えられる。相互作用を失うことの機能的な結果は、T細胞特異的応答が弱まることであり、生きたPfPb生物体に対する保護レベルが低下することである。
タンパク質結晶学の実践を通して、MHC-抗原ペプチド-TCR相互作用系について多くのことが学ばれた。しかし、タンパク質の一次配列からMHC結合ペプチドを正確に予想することは、まだ正確な科学になるに至っていない。したがって、T細胞エピトープは、依然として、経験的な方法によって特定され、評価される必要がある。同様に、特定されたT細胞エピトープへの許容される改変は、経験的に試験される必要がある。単一の点置換を有するエピトープは、十分な免疫学的活性を保持するか、または野生型の天然配列と比較して、免疫学的活性の低減、免疫学的活性の消失、もしくは免疫学的活性の増大を示す場合もある。単一の点置換を有するエピトープは、誘導されるT細胞応答をTh1表現型とTh2表現型の間で変更するなど、野生型配列と質的に異なる活性を示す場合がある。適切な置換を予想することはできるが、それらは経験的な方法によって試験され、評価されなければならない。
本明細書において、2つ以上の多価電解質の層を含む多層フィルムを含む免疫組成物であって、隣接する層が逆荷電した多価電解質を含み、1つの層がPlasmodium属の原生動物のエピトープを含む免疫組成物がさらに開示される。免疫原性組成物は、設計されたポリペプチドを含む1つまたは複数の層を、任意選択でさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、同じまたは異なる設計されたポリペプチドのいずれかに、改変T*エピトープまたは改変T1BT*エピトープに加えて第2のPlasmodium属の原生動物のエピトープをさらに含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、複数の独特の抗原性多価電解質を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、各多価電解質内に複数のPlasmodium属原生動物エピトープを含む、複数の免疫原性多価電解質を含む。これらの免疫原性組成物の利点は、複数の抗原決定基または単一の直鎖状抗原決定基の複数の立体構造が、単一の合成ワクチン粒子中に存在しうることである。複数の抗原決定基を有するこのような組成物は、複数のエピトープに対する抗体を潜在的にもたらすことができ、生物の免疫系によって生じた抗体の少なくとも一部が、例えば、病原体またはがん細胞上の標的特異的抗原を中和する見込みを増大させる。
免疫原性組成物の免疫原性は、いくつかの方法で増強され得る。一実施形態では、多層フィルムは、1種または複数のさらなる免疫調節性生理活性分子を任意選択で含む。必ずしも必要ではないが、1種または複数のさらなる免疫調節性生理活性分子は、典型的には、1つまたは複数のさらなる抗原決定基を含む。適切なさらなる免疫調節性生理活性分子として、例えば、薬物、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、脂質、リン脂質、炭水化物、多糖、リポ多糖、低分子量免疫刺激分子、または前述の生理活性分子のうちの1つもしくは複数を含む組合せが挙げられる。他の種類のさらなる免疫増強剤として、機能性膜断片、膜構造、ウイルス、病原体、細胞、細胞の凝集体、細胞小器官、または前述の生理活性構造のうちの1つもしくは複数を含む組合せが挙げられる。
一実施形態では、多層フィルム/免疫原性組成物は、病原体に対する、免疫系からの応答を惹起する。一実施形態では、ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた免疫原性組成物を含む。したがって、病原性疾患に対するワクチン接種の方法は、有効量の免疫原性組成物を、ワクチン接種を必要とする対象に投与することを含む。
薬学的に許容される担体として、これらに限定されないが、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子が挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、または硫酸塩などの無機塩および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩を組成物中で使用することもできる。組成物は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤などの物質を含有することもできる。リポソームを担体として使用することもできる。
脊椎動物の疾患または病原体に対して免疫応答を誘発する方法(例えば、ワクチン接種)は、Plasmodium属の原生動物のエピトープを含む多層フィルムを含む免疫原性組成物を投与することを含む。一実施形態では、Plasmodium属の原生動物のエピトープを含有する多価電解質は、多層フィルムの最も外側かまたは溶媒に曝露される層に存在する。免疫原性組成物は、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、舌下、皮内、肺、または経皮経路を含む多種多様な経路を介して投与することができる。免疫原性組成物は、単回用量で、または最適な応答および保護を達成するために経時的に分散した多数回用量で投与することができる。一般的に、組成物は、投与製剤に適合する方式で、かつ、予防的におよび/または治療上有効であると思われるような量で投与される。投与される免疫原性組成物の正確な量は、医療従事者の判断に応じて変わり、各対象に特有であり得る。免疫原性組成物の治療有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、組成物が他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、およびレシピエントの免疫状態および健康に応じて変わることは、当業者によって明らかである。治療有効投薬量は、当技術分野でよく知られているように、患者の特徴(年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患など)に基づいて通常の技術を有する医療従事者によって決定されうる。さらに、さらなる日常的な研究が行われると、種々の患者における種々の状態の治療のために適当な投薬量レベルに関して、より具体的な情報が明らかになり、通常の技術を有する従事者は、レシピエントの治療内容、年齢および健康全般を考慮に入れ、適正な投与を確認することができる。
免疫原性組成物は、任意選択で、アジュバントを含む。アジュバントは、一般に、宿主の免疫応答を、非特異的な方式でブーストする物質を含む。アジュバントの選択は、ワクチン接種される対象に応じて変わる。好ましくは、薬学的に許容されるアジュバントが使用される。例えば、ヒトに対するワクチンは、完全および不完全フロインドアジュバントを含む油状または炭化水素エマルジョンアジュバントを避けるべきである。ヒトに使用するのに適するアジュバントの一例は、ミョウバン(アルミナゲル)である。しかし、動物に対するワクチンは、ヒトに使用するのに適当でないアジュバントを含有してもよい。
免疫応答は、このような応答を誘発することのできる任意のタンパク質またはペプチドの提示によって誘発されうることが企図される。一実施形態では、抗原は、感染性疾患の特定の作用物に対する強い免疫応答を生じる鍵となるエピトープ、すなわち、免疫優勢エピトープである。所望の場合、2種以上の抗原またはエピトープが、免疫応答の可能性を増大させるために、免疫原性組成物中に含まれてもよい。
設計されたペプチドは、設計されたペプチドの荷電した表面吸着領域とフィルムの逆荷電した表面の間の静電引力によって、LBLフィルムの表面に吸着する。吸着効率は、表面吸着領域の組成に大きく依存する。したがって、異なるエピトープを有するが同様の表面吸着領域を有する設計されたペプチドは、同様の効率で吸着することが期待される。それぞれを1:1のモル比で2つの異なる設計されたポリペプチドを含有するフィルムを製作するために、そのモル比でペプチドを混合し、それらを特定の層に同時に堆積させることができる。あるいは、各ペプチドを別々の層に個別に堆積させることもできるであろう。吸着されたペプチドのモル比は、ペプチドが積層される相対的濃度またはペプチドが組み込まれる積層工程の数を大きく反映するものとなる。
LBLフィルムに組み込まれる設計されたポリペプチドの量は、様々な方法で測定することができる。アミノ酸定量分析(AAA)は、この目的に対して特によく研究されている。DPを含有するフィルムは、濃塩酸(6M)と加熱、典型的には115℃で15時間で処理することによって、それらの構成アミノ酸に分解される。次いで、各アミノ酸の量が、当業者に周知のクロマトグラフィー技術を使用して測定される。フィルム中の設計されたペプチドのうちの1つだけに生じるアミノ酸をそのペプチドのトレーサーとして使用することができる。設計されたペプチドが特有のアミノ酸を欠く場合、非天然のアミノ酸(例えば、アミノ酪酸またはホモバリン)を合成中に設計されたペプチドに組み込むことができる。これらのトレーサーアミノ酸は、AAA実験中に容易に特定され、フィルム中のペプチドの量を定量するために使用することができる。
本明細書で使用する場合、特異的T細胞応答は、目的のエピトープ、具体的には、Plasmodium属原生動物のエピトープに特異的な応答である。特異的T細胞応答は、免疫化した宿主に由来するT細胞によるIFNγおよび/またはIL-5の分泌によって現れる。
本明細書で使用する場合、特異的抗体応答は、目的のエピトープ、具体的には、本明細書に開示されているPlasmodium属原生動物のエピトープに特異的な応答である。
本明細書で使用する場合、「層」は、例えば、フィルム形成のための鋳型上の、吸着工程後の厚みの増分を意味する。「多層」は、複数の(すなわち、2つ以上の)厚みの増分を意味する。「多価電解質多層フィルム」は、1つまたは複数の多価電解質の厚みの増分を含むフィルムである。堆積後、多層フィルムの層は、個別の層としては残らない場合もある。実際に、特に、厚みの増分の界面では、かなりの種が混在する可能性がある。混在、または混在の不在は、表面電位測定およびX線光電子分光法などの分析技術によってモニタリングすることができる。
「アミノ酸」は、ポリペプチドの構築ブロックを意味する。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」は、20種の通常天然に存在するL-アミノ酸、他のすべての天然アミノ酸、すべての非天然アミノ酸、および、ペプトイドと称されることも多いすべてのアミノ酸模倣体、例えば、N-アルキルグリシンアミノ酸を含む。
「天然に存在するアミノ酸」は、グリシンと20種の通常天然に存在するL-アミノ酸、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、オルニチン、チロシン、トリプトファン、およびプロリンを意味する。
「非天然アミノ酸」は、任意の20種の通常天然に存在するL-アミノ酸以外のアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸は、L-またはD-立体化学のいずれかを有することができる。
「ペプトイド」またはN-置換グリシンは、対応するアミノ酸と同じ側鎖を有するが、その側鎖が残基のα-炭素ではなくアミノ基の窒素原子に付け加えられる、対応するアミノ酸モノマーの類似体を意味する。結果として、ポリペプトイド中のモノマー間の化学的連結はペプチド結合ではなく、このことはタンパク質消化を制限するのに有用となりうる。
「アミノ酸配列」および「配列」は、少なくとも2つのアミノ酸残基長であるポリペプチド鎖の連続した長さを意味する。
「残基」は、重合体またはオリゴマー中のアミノ酸を意味し、ポリマーが形成されるアミノ酸モノマーの残基である。ポリペプチド合成には脱水が関わり、すなわち、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の付加の際に、単一の水分子が「失われる」。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」および「ポリペプチド」はすべて、隣接するアミノ酸のアルファ-アミノ基とアルファ-カルボキシル基の間のペプチド結合によって互いに接続した一連のアミノ酸を指し、グリコシル化、側鎖の酸化、もしくはリン酸化などの修飾、またはその欠如が免疫原性を破壊しないことを条件として、このような修飾を含有してもしなくてもよい。本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」は、ペプチドとポリペプチドあるいはタンパク質との両方を指すことを意味する。
「設計されたポリペプチド」は、逆荷電した表面への安定した結合のために十分な電荷を有するポリペプチド、すなわち、フィルム形成の駆動力が静電気である多層フィルムの層に堆積されうるポリペプチドを意味する。具体的な実施形態では、設計されたポリペプチドは少なくとも15アミノ酸長であり、ポリペプチドの残基あたりの正味の電荷の大きさは、pH7.0で0.1、0.2、0.3、0.4または0.5以上である。一実施形態では、同じ極性の荷電した残基の数から逆の極性の残基の数を引いた数の、ポリペプチド中の残基の総数に対する比は、pH7.0で0.2以上である。ポリペプチドの長さに絶対的な上限は存在しないが、一般に、LBL堆積に適する設計されたポリペプチドは、1,000残基の実用上の長さの上限を有する。設計されたポリペプチドは、Plasmodium属の原生動物のエピトープなどの天然に見出される配列、および、設計されたポリペプチドがポリペプチド多層フィルムへと堆積されることを可能にする、本明細書において表面吸着領域とも称される荷電領域などの、ペプチドに機能性を与える領域を含むことができる。
「一次構造」は、ポリペプチド鎖における連続した直鎖状のアミノ酸配列を意味し、「二次構造」は、非共有結合による相互作用、通常は水素結合によって安定化された、ポリペプチド鎖中の多かれ少なかれ規則的な種類の構造を意味する。二次構造の例として、α-ヘリックス、β-シート、およびβ-ターンが挙げられる。
「ポリペプチド多層フィルム」は、上記で定義された1つまたは複数の設計されたポリペプチドを含むフィルムを意味する。例えば、ポリペプチド多層フィルムは、設計されたポリペプチドを含む第1の層と設計されたポリペプチドと逆の極性の正味の電荷を有する多価電解質を含む第2の層とを含む。例えば、第1の層が正味の正電荷を有する場合は第2の層は正味の負電荷を有し、第1の層が正味の負電荷を有する場合は第2の層は正味の正電荷を有する。第2の層は、別の設計されたポリペプチドまたは別の多価電解質を含む。
「基質」は、水溶液からの多価電解質の吸着に適する表面を有する固体材料を意味する。基質の表面は、本質的に任意の形状、例えば、平面、球形、立方体、桿状、またはその他の形状を有することができる。基質表面は、滑らかであっても荒くてもよく、均整がとれていても凹凸があってもよい。基質は結晶であってもよい。基質は、生理活性分子であってもよい。基質のサイズは、ナノ規模からマクロ規模の範囲である。さらに、基質は、任意選択で、いくつかの小さなサブ粒子を含む。基質は、有機材料、無機材料、生理活性材料、またはその組合せから作製することができる。基質の非限定例として、シリコンウエハー；荷電したコロイド粒子、例えば、CaCO3またはメラミンホルムアルデヒドのマイクロ粒子；赤血球、肝細胞、細菌細胞、または酵母細胞などの生物細胞；有機重合体格子、例えば、ポリスチレンまたはスチレン共重合体格子；リポソーム；オルガネラ；およびウイルスが挙げられる。一実施形態では、基質は、人工ペースメーカー、人工内耳、またはステントなどの医学デバイスである。
基質が崩壊するか、またはそうでなければ、フィルム形成中または後に除去される場合、基質は（フィルム形成のための）「鋳型」と呼ばれる。鋳型粒子は、適当な溶媒に溶解されるか、または熱処理によって除去され得る。例えば、部分的に架橋したメラミン-ホルムアルデヒド鋳型粒子が使用される場合、鋳型は、穏やかな化学的方法、例えば、DMSO中で、またはpH値の変化によって崩壊しうる。鋳型粒子の溶解後、多価電解質の交互層で構成される中空の多層シェルが残る。
「カプセル」は、中空シェルまたはコアを囲むコーティングの形態の多価電解質フィルムである。コアは、様々な異なる封入物、例えば、タンパク質、薬物、またはその組合せを含む。直径が約1μm未満のカプセルをナノカプセルと称する。直径が約1μmより大きいカプセルはマイクロカプセルと称する。
「架橋」は、2つ以上の分子の間の共有結合、またはいくつかの結合、または多くの結合の形成を意味する。
「生理活性分子」は、生物学的作用を有する分子、巨大分子、またはその複合体を意味する。具体的な生物学的作用は、適切なアッセイにおいて、生理活性分子の単位重量あたり、または分子あたりで標準化して測定することができる。生理活性分子は、カプセル化されるか、多価電解質フィルムの裏面に保持されるか、または多価電解質フィルム内にカプセル化されることができる。生理活性分子の非限定例として、薬物、薬物の結晶、タンパク質、タンパク質の機能性断片、タンパク質の複合体、リポタンパク質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、リボソーム、活性治療剤、リン脂質、多糖、リポ多糖がある。本明細書で使用する場合、「生理活性分子」は、例えば、機能性膜断片、膜構造、ウイルス、病原体、細胞、細胞の凝集体、およびオルガネラなどの生物学的に活性な構造もさらに包含する。ポリペプチドフィルムの裏面にカプセル化または保持されうるタンパク質の例は、ヘモグロビン；例えば、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、リゾチームなどの酵素；細胞外マトリックスタンパク質、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンおよびコラーゲン；ならびに抗体である。多価電解質フィルムの裏面にカプセル化または保持されうる細胞の例は、移植された膵島細胞、真核生物細胞、細菌細胞、植物細胞および酵母細胞である。
「生体適合性」は、経口摂取、局所適用、経皮適用、皮下注射、筋肉内注射、吸入、移植、または静脈内注射の際に、実質的に有害な健康への影響を引き起こさないことを意味する。例えば、生体適合性フィルムは、例えば、ヒトの免疫系と接触した場合に、実質的な免疫応答を引き起こさないものを含む。
「免疫応答」は、身体のいずれかの場所における物質の存在に対する細胞または体液の免疫系の応答を意味する。免疫応答は、いくつかの方法で、例えば、ある特定の抗原を認識する抗体の数の血流中における増加によって、特徴付けることができる。抗体は、B細胞によって分泌されるタンパク質であり、免疫原は、免疫応答を誘発する実体である。
「抗原」は、感受性の脊椎動物の組織に導入された場合に免疫応答(例えば、特異的抗体分子の生成)を誘発する外来の物質を意味する。抗原は、1つまたは複数のエピトープを含有する。抗原は、純粋な物質であってもよく、物質の混合物(細胞または細胞断片を含む)であってもよい。抗原という用語は、適切な抗原決定基、自己抗原(auto-antigen)、自己抗原(self-antigen)、交差反応抗原、アロ抗原、寛容原、アレルゲン、ハプテン、および免疫原、またはその一部、およびその組合せを含み、これらの用語は互換的に使用される。抗原は、一般的に、高分子量のものであり、通常はポリペプチドである。強い免疫応答を誘発する抗原は、強く免疫原性であるといえる。相補的な抗体が特異的に結合することができる、抗原上の部位は、エピトープまたは抗原決定基と呼ばれる。
「抗原性の」は、当該組成物に特異的な抗体を生じさせる、または細胞媒介性免疫応答を生じさせる、組成物の能力を指す。
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」および「抗原決定基」は互換的に使用され、抗体またはT細胞によって認識される抗原の構造または配列を意味する。エピトープの例として、タンパク質および設計されたポリペプチド内の配列が挙げられる。通常は、抗体エピトープは、タンパク質の表面上に存在することになる。「連続したエピトープ」は、直鎖状ペプチド配列のスパンに由来する数個以上のアミノ酸残基を含むものである。「立体構造的エピトープ」は、三次元折り畳みによって空間的に接触することになるペプチドタンパク質の直鎖状配列の不連続なスパンに由来するアミノ酸残基を含む。立体構造的エピトープは、サブユニットの四次元アセンブリーによって空間的に接触することになる個別のペプチドまたはタンパク質のサブユニットに由来する不連続なペプチドセグメントから構成されることもできる。抗原と抗体の間で効率的な相互作用が生じるために、エピトープは、結合のために容易に利用可能でなければならない。したがって、抗体エピトープまたは抗原決定基は、通常、タンパク質の表面に位置するか、埋め込まれていて、構造的再構成によって表面に曝露される。
本明細書で使用する場合、「ワクチン組成物」は、哺乳動物に投与された場合に免疫応答を誘発する組成物であり、その応答が、免疫作用物または免疫学的に交差反応性の作用物による次のチャレンジに対してその哺乳動物を保護する。保護は、ワクチン接種されていない生物と比較して、症状または感染の低減に関して完全であっても部分的であってもよい。免疫学的に交差反応性の作用物は、例えば、免疫原として使用するためにサブユニットペプチドがそこから導出されたところの、全体タンパク質であってもよい。あるいは、免疫学的に交差反応性の作用物は、免疫作用物によって誘発された抗体によって全体としてまたは部分的に認識される、異なるタンパク質であってもよい。
本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、投与される生物において免疫応答を誘発する組成物であって、免疫作用物による次のチャレンジに対して当該免疫化哺乳動物を保護するかもしれないししないかもしれないものを包含することを意図する。一実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチン組成物である。
本発明は、以下の非限定例によってさらに例証される。
試験プロトコール
マウスおよび免疫化：6〜8週齢の雌のC57BL/6JをJackson Laboratoriesから入手し、New HavenのNorthEast Life Sciencesに収容した。マウスを、使用前に少なくとも1週間、環境に順応させた。マイクロ粒子をPBS中に再懸濁させて所望のDP濃度にし(例えば、注射1回あたり10μg/100μl)、シリンジにローディングし免疫化する直前に10分間超音波処理した。マウスは、0、21および42日目に、後足の足蹠に、懸濁液を用いて免疫化した。陽性対照のマウスは、0日目に完全フロインドアジュバント(CFA)中のDPを、21日目、42日目に不完全フロインドアジュバント(IFA)中のDPを皮下(s.c.)注射することによって免疫化し、陰性対照のマウスは、PBSを用いて疑似免疫化した。
ELISA：49日目（2回目のブースト後）にマウスから採血し、T1BペプチドでコーティングしたELISAプレートを使用して抗体応答を分析するために血清を回収した。抗体の結合を、HRP標識したヤギ抗マウスIgGで検出した。
ELISPOT：49日目にマウスを屠殺し、脾臓を回収し、単細胞懸濁液へと裂いて、塩化アンモニウムによる浸透圧ショック法によって赤血球を除去した。赤血球が除去された脾臓細胞を、市販の試薬(BD Biosciences)とプレート(Millipore Corporation)および以下の製造業者の使用説明書を使用して、IFNγまたはIL-5 ELISPOTプレート中でT1Bペプチドを用いて再刺激した。各プレート上のスポットの数をAID Viruspot Readerで計数した。
PfPbチャレンジ：49日目にマウスから採血し、上述のELISAによって抗体力価を測定した。抗体測定後、マウスをPfPb（P. falciparumのCS遺伝子のT1BT*サブユニットについて形質転換体されたPlasmodium bergheii）でチャレンジした。チャレンジは、マウスに麻酔をかけ、PfPb感染した蚊を10分間マウスに供給することによって行われた。チャレンジの2日後、チャレンジされたマウスから採血し、屠殺し、qPCRによる寄生虫負荷分析のために肝臓RNAを抽出した。
実施例1：例示的なペプチドの設計と合成
設計されたポリペプチドは、P. falciparum CSのT1BT*多価ペプチドに基づいた。表面吸着領域K20(配列番号9)またはK20Y(配列番号16)をC末端に付加し、LbL粒子に組み込むための設計されたポリペプチド(DP)を得た(図1)。Pam3CysをDPにコンジュゲートする場合、リンカー配列SKKKKも付加した。標準の固相ペプチド化学手順を使用してペプチドを合成し、C末端アミドとして調製した。簡単にいうと、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸を、CEM Libertyマイクロ波ペプチド合成機で、製造業者の合成プロトコールを使用し、カップリング温度に軽微な修正を加えて、Rink MBHAアミド樹脂に二重カップリングさせた。ペプチド合成後、Pam3Cys-OHの手動によるカップリングか、またはFmoc-Pam2Cys-OHの自動カップリングのいずれかによって、Pam3Cys基を樹脂に付加し、続いて、Fmocを除去し、最後にパルミチン酸を用いてキャッピング工程を行った。トリフルオロ酢酸(TFA)/トリイソプロピルシラン/フェノール/水のカクテルで処理して、ペプチドを樹脂から切断し、エーテルで沈殿させた。水(0.1%のTFA)/アセトニトリル勾配を使用するC18 HPLCによって、または水(0.1%のTFA)/イソプロパノール勾配を使用するPam3CysペプチドのためのC4 HPLCによって、粗製のペプチドを精製した。精製したペプチドを、280nmのUV吸光度によって、またはアミノ酸分析によって定量し、アリコートし、凍結乾燥し、-20℃で保存した。配列番号13に対する典型的なC4分析HPLCクロマトグラムを図12に示し、エレクトロスプレー質量スペクトルを図13に示す。配列番号13の平均MWの計算値は9486.27であり、MWの実測値は9485.6である。

T1BT*-K20:(配列番号10)
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

Pam3Cys-T1BT*-K20:(配列番号11)
Pam3CysSKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

T1BT*-K20(Cys→Ser):(配列番号12)
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys→Ser):(配列番号13)
Pam3CysSKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

T1BT*-K20(Cys→Ala):(配列番号:14)
DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPASVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

Pam3Cys-T1BT*-K20(Cys→Ala):(配列番号:15)
Pam3CysSKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPASVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

T1BT*-K20(Cys→Ser):(配列番号:17)
SKKKKDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
実施例2：ワクチンマイクロ粒子のLBL製作
20cm2、500kD(MWCO)のMicroKros(登録商標)mPESフィルターモジュールを備えた、Spectrum Labs(Rancho Dominiguez、CA)からのKrosFlo(登録商標) Research IIi Tangential Flow Filtration Systemで、LBLを実施した。ポリ-L-グルタミン酸ナトリウム塩(PGA)およびポリ-L-リシン臭化水素塩(PLL)をSigma-Aldrich、USAから入手した(それぞれ、カタログ番号P4636およびP6516)。Volodkinら(D.V. Volodkinら Adv. Funct. Mater. 2012 1)によって報告されたプロセスの修正バージョンを使用して、1.0mg/mLのPGA含む0.33MのCaCl2および0.33MのNa2CO3から、球形のメソポーラスなCaCO3コア(2〜5um)を共沈殿させた。すべての工程を室温で行った。
TFF装置を20mLの3%のCaCO3(乾燥重量)のマイクロ粒子懸濁液で満たし、処理期間中40mL/分で一定の循環を保った。10mMのHEPES緩衝液(pH7.4)100mLを用いて浸透させることによって粒子を洗浄した。浸透バルブを閉じ、6.3mg/mLのPLLの5.0mLのアリコートを単一のボーラスに添加した。粒子を5分間循環させ、次いで、浸透バルブを開いて、懸濁液を20mLの体積まで濃縮した。緩衝液供給バルブを開き、次いで、100mLのHEPES緩衝液を用いて浸透させることによって粒子を洗浄した。浸透バルブを閉じ、5.0mg/mLのPGAの5.0mLのアリコートを単一のボーラスに添加した。粒子を5分間循環させ、濃縮し、次いで、100mLのHEPES緩衝液を用いて浸透させることによって洗浄した。最外層にPGAを含む7つの層ベースのフィルムが製作されるまで、前述の工程を繰り返した。
洗浄したマイクロ粒子懸濁液をTFF装置から除去し、ベース層フィルムを、200mMのリン酸緩衝液(pH6.5)中200mMのEDCおよび50mMのスルホ-NHSで30分間処理することによって、任意選択でアミド架橋した(bXL=ベース層架橋した)。粒子を低速でスピンさせてペレット化し、吸引して、10mMのHEPES緩衝液で2回洗浄して、残留試薬を除去した。次いで、マイクロ粒子(nXLまたはXL)を、穏やかに混合しながら、T1BT* DPの0.5mg/mLの溶液に5分間浸漬した。次いで、粒子を低速でスピンさせ、新鮮なHEPES緩衝液で洗浄して、最終の8ペプチド層マイクロ粒子ワクチン構築物を得た。DPローディングを定量アミノ酸分析によって測定し、次いで、粒子を、5%のマンニトールと0.2%のカルボキシメチルセルロースナトリウムを含有するHEPES緩衝液に懸濁した。懸濁液を都合のよい体積にアリコートし(例えば、全DPが125ug)、液体窒素中でフラッシュ凍結し、凍結乾燥した。得られた乾燥マンニトールケーキを4℃で保存したが、これは少なくとも6カ月間安定である。
Figure 2018529684
実施例3：T1BT*マイクロ粒子で免疫化することによって誘発された免疫表現型
C57BL/6Jマウスを、0、21および42日目に、示した構築物で免疫化した。49日目に採取した血清を、図2に示すように、T1Bペプチドに対するELISAで試験した。結果を1群あたり10頭のマウスの平均±SDで示す。血清を1:250で試験し、プレートを図3に示すアイソタイプ特異的検出抗体でプローブした。結果を1群あたり10頭のマウスの平均±SDで示す。49日目に脾臓細胞を回収し、図4に示すようにIFNγおよびIL-5 ELISPOTプレート中でT1Bペプチドを用いて再刺激した。データは1群あたり3頭のマウスの平均±SDを示す。nXL=架橋していない、bXL=ベース層架橋した。
これらの結果により、P. falciparumスポロゾイト周囲タンパク質のT1BT*サブユニットペプチドを含む設計されたペプチドを用いてローディングしたLBLマイクロ粒子は、含まれた抗原エピトープに対する体液性および細胞性免疫応答の両方を誘発することが実証されている。この結果は、ベース層を架橋することによってマイクロ粒子を改変することにより、ワクチンの効力が増大することをさらに示す(図2で示した高い抗体力価)。DPにTLR2アゴニストであるPam3Cysを含ませることによってマイクロ粒子を改変することによっても、その効力が増大したが、免疫応答の表現型も変化した(図3に示すIgG2c抗体アイソタイプの増加と図4に示すIL-5応答の低下)。図2に示す抗体力価は、同じマイクロ粒子に両方の改変を含ませることによって、ワクチンの効力にさらなる利益が生じることをさらに実証する。
実施例4：T1BT* LbL-MPの免疫原性および有効性
マウスを、0、28および42日目に、示した構築物で免疫化した。1236および1237は、T*においてC→Aの置換を有したが、1238および1239は、T*においてC→Sの置換を有した。59日目に血清を回収し、図5に示すように、T1Bペプチドに対するELISAで試験した。結果を1群あたり10頭のマウスの平均±SDで示す。59日目に脾臓細胞を回収し、図6に示すようにIFNγおよびIL-5 ELISPOTプレート中でT1Bペプチドを用いて再刺激した。データは1群あたり3頭のマウスの平均±SDを示す。63日目にマウスをPfPbでチャレンジし、図7に示すように40時間後に屠殺した。肝臓に寄生した寄生虫をqPCRによって測定した。結果を1群あたり10頭のマウスの平均±SDで示す。挿入記載は、保護されたマウス(PBS対照と比較して、18S遺伝子発現が90%超の低減)の数を示す。
これらの結果により、すべての構築物がT1Bペプチドに対する抗体応答を誘発したが、架橋による改変によってワクチンの効力がやはり改善されたことが示される。予期せぬことに、ACT-1236およびACT-1237(T*におけるC→Aの置換)はT1Bペプチドに対するIFNγおよびIL-5T細胞の応答を誘導することができなかった一方、ACT-1238およびACT-1239(T*におけるC→Sの置換)は両方のT細胞応答を誘導した。これらの構築物の置換は、ELISPOTアッセイでは存在しなかったT*エピトープにおけるものであるため、この活性の差は驚くべきものであった。C→Sの置換が活性を保持し、一方、C→Aの置換が活性を失うことを予測する理由は存在しない。
実施例5：種々の保存条件下でのシステイン含有T1BT*ペプチドの分解
設計されたシステイン含有T1BT*ペプチド配列番号10を実施例1に記載したように合成し、C18 HPLCによって判断して95%を超える純度まで精製した(図8A)。サンプルを水または緩衝液に溶解し、以下の条件下で保存した：およそpH5の溶液中、室温で16日間(図8B)、pH7.4の溶液中、室温で2.7日間(8C)、pH7.4の溶液中、室温で16日間(8D)、凍結溶液として-20℃から-10℃で4年間保存(8E)。Waters X-bridge C18カラムおよび100%の水/(0.075%のトリフルオロ酢酸(TFA))から50%の水/アセトニトリル(0.075%のTFA)の勾配を使用して20分かけて、これらのサンプルについて分析HPLCを実施した。クロマトグラムによって、元のモノマーペプチドの保持時間が12.6分であり、新たなピークは13.3分に出現することが示されたが、これはジスルフィド二量体と推定される。
実施例6：設計されたT1BT*ペプチドのpH5での酸化とDTTを用いた還元
水中の設計されたT1BT*ペプチド配列番号10の1.0mg/mLの溶液を調製し、pHが約pH5であることをpH紙により推定した。溶液を室温で16日間置いておき、その後、やや長い保持時間を有する第2のピークがC18クロマトグラムに表われ、ジスルフィド二量体であると推定された(図9A)。1MのTris緩衝液を添加することによってpHを7.4に調整し、サンプルを、1mg/mLのジチオトレイトール(DTT)の新たに調製した溶液と1:1で混合した。5分後、HPLCへの2回目の注入により、より遅い溶出ピークはほとんど消失したことが示され、これはモノマーペプチドへと還元し直したことと合致した。
実施例7：設計されたT1BT*ペプチドのpH7.4での酸化とDTTを用いた還元
水中の設計されたT1BT*ペプチド配列番号10の1.0mg/mLの溶液を調製し、1MのTris緩衝液を添加することによってpHを7.4に調整した。溶液を、室温で、C18 HPLCクロマトグラムによって判断してほとんどのペプチドが二量体に変換された時間である5日間置いておいた(図10B)。次いで、サンプルを、1mg/mLのDTTの新たに調製した溶液と1:1で混合、5分後に、サンプルをHPLCに注入した。クロマトグラムにより、モノマーペプチドへのほとんど完全な変換が示された(図10C)。
実施例8：設計されたセリン含有ペプチド配列番号17の安定性
水中の設計されたT1BT*ペプチド配列番号17の1.0mg/mLの溶液を調製し、1MのTris緩衝液を添加することによってpHを7.4に調整した。溶液を室温で5日間置いておき、HPLCによってモニタリングした。クロマトグラムにより、小さなサテライトピークが出現したが(図11B)、実施例7のシステイン含有ペプチドと対照的に、設計されたペプチドのほとんどはインタクトなままであることが示されている。
用語「1つの(a)」および「1つの(an)」および「その(the)」および同様の指示対象の使用は(特に以下の特許請求の範囲の文脈では)、本明細書で他に示されていないか、または文脈によって明らかに否定されていなければ、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるべきである。用語第1の、第2のなどは、本明細書で使用する場合、任意の特定の順番を示すことを意味するものではなく、単に、便宜上、複数の、例えば、層を示すことを意味するものである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、および「含有する(containing)」は、他に記載されていなければ、オープンエンドの用途として解釈されるべきである(すなわち、「含むが、限定されない」ことを意味する)。値の範囲についての記載は、本明細書で他に示されていなければ、単に、その範囲内にあるそれぞれ別の値を個々に言及する簡略表記法としての役目を果たすことを意図するものであり、それぞれ別の値は、本明細書に個々に記載されていたかのように、本明細書に組み込まれる。すべての範囲の末端値は、その範囲内に含まれており、独立して組み合わせることができる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書で他に示されていないか、または他に文脈によって明らかに否定されていなければ、適切な順番で実施することができる。任意かつすべての例、または例示の語(例えば、「など」)の使用は、単に本発明をより例証することを意図するものであり、他に請求されていなければ、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本明細書中のいかなる語も、本明細書で使用される本発明の実施に必須であるとして任意の特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本発明は、例示の実施形態に言及して記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ、その要素の代わりに均等物で置き換えることができることを当業者は理解するであろう。さらに、本発明の本質的な範囲を逸脱することなく、本発明の教示に対して特定の状況または材料を適合させるために多くの修正がなされてもよい。したがって、本発明は、この発明を実行するために企図されたベストモードとして開示された特定の実施形態に制限されず、添付された特許請求の範囲の範囲内にあるすべての実施形態を含むことが意図される。本明細書で他に示されていないか、または他に文脈によって明らかに否定されていなければ、その可能な変形のすべてにおいて上述の要素の任意の組合せが本発明によって包含されている。

Claims (19)

  1. 配列番号5の配列を含む単離されたペプチド。
  2. 配列番号1、配列番号2、またはその両方の配列をさらに含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  3. 1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料に共有結合により連結している、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  4. ポリペプチドのC末端および／またはN末端において1つまたは2つの表面吸着領域に共有結合により連結しており、前記表面吸着領域のうちの少なくとも1つは、5つ以上の負または正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  5. 配列番号12または配列番号13を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  6. 複数の逆荷電した多価電解質層を含む第1の多層フィルムであって、多層フィルム中の前記多価電解質層のうちの1つが第1の抗原性多価電解質を含む、第1の多層フィルム
    を含む組成物であって、
    前記第1の抗原性多価電解質が、配列番号5の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T*エピトープを含み、
    多層フィルム中の前記多価電解質は、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む、
    組成物。
  7. 前記第1の多層フィルムが、コアナノ粒子またはコアマイクロ粒子上に堆積されているか、または前記コアナノ粒子またはコアマイクロ粒子を溶解することによって調製されるナノカプセルまたはマイクロカプセルの形態である、請求項6に記載の組成物。
  8. 前記配列番号5の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T*エピトープが、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料に共有結合により連結している、請求項6に記載の組成物。
  9. 前記配列番号5の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T*エピトープが、ポリペプチドのC末端および／またはN末端において1つまたは2つの表面吸着領域に共有結合により連結しており、前記表面吸着領域のうちの少なくとも1つは、5つ以上の負または正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項6に記載の組成物。
  10. 前記多層フィルムが、トール様受容体リガンドをさらに含む、請求項6に記載の組成物。
  11. 前記トール様受容体リガンドが、前記第1の抗原性多価電解質に共有結合により連結している、請求項10に記載の組成物。
  12. 前記第1の抗原性多価電解質が、配列番号7の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1BT*エピトープを含む、請求項6に記載の組成物。
  13. 前記配列番号7の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1BT*エピトープが、1分子あたり1,000より大きい分子量および少なくとも5つの電荷を有するポリカチオン材料またはポリアニオン材料に共有結合により連結している、請求項12に記載の組成物。
  14. 前記配列番号7の改変されたPlasmodium falciparumスポロゾイト周囲T1BT*エピトープが、ポリペプチドのC末端および／またはN末端において1つまたは2つの表面吸着領域に共有結合により連結しており、前記表面吸着領域のうちの少なくとも1つは、5つ以上の負または正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項12に記載の組成物。
  15. 前記第1の抗原性多価電解質が、配列番号12または配列番号13である、請求項12に記載の組成物。
  16. 宿主生物への前記組成物の投与が、エピトープ特異的T細胞応答を生じ、前記T細胞応答は、INFγ T細胞応答、IL-5 T細胞応答、またはその両方である、請求項6に記載の組成物。
  17. 前記第1の抗原性多価電解質を含有する層以外の、多層フィルムの少なくとも2つの多価電解質層が共有結合により架橋されている、請求項6に記載の組成物。
  18. 前記共有結合による架橋が、アミノ酸側鎖官能基が関わるアミド結合である、請求項17に記載の組成物。
  19. 脊椎動物における免疫応答を誘発する方法であって、脊椎動物に、請求項6に記載の組成物を投与することを含む方法。
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