RU2609661C2 - Антигенные композиции респираторного синцитиального вируса и способы - Google Patents
Антигенные композиции респираторного синцитиального вируса и способы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2609661C2 RU2609661C2 RU2013101972A RU2013101972A RU2609661C2 RU 2609661 C2 RU2609661 C2 RU 2609661C2 RU 2013101972 A RU2013101972 A RU 2013101972A RU 2013101972 A RU2013101972 A RU 2013101972A RU 2609661 C2 RU2609661 C2 RU 2609661C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rsv
- polypeptide
- epitope
- polyelectrolytes
- peptide
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title abstract description 104
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title description 34
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims abstract description 110
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 39
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 340
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 243
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 191
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 53
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 37
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 32
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 29
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims description 17
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 11
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 3
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 claims 20
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 13
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000010408 film Substances 0.000 description 120
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 95
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 90
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 66
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 49
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 20
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 17
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 16
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 13
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- -1 furcellaran Polymers 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 6
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 5
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000835 CX3C Chemokine Receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 description 3
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 3
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039196 CX3C chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002518 Polyallylamine hydrochloride Polymers 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- VRDGQQTWSGDXCU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-iodoacetate Chemical compound ICC(=O)ON1C(=O)CCC1=O VRDGQQTWSGDXCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGMMKWFUXPMTRW-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[(2-bromoacetyl)amino]propanoate Chemical compound BrCC(=O)NCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O WGMMKWFUXPMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUKOTTQGWQVMQB-UHFFFAOYSA-N (2-bromoacetyl) 2-bromoacetate Chemical compound BrCC(=O)OC(=O)CBr FUKOTTQGWQVMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTLYLLTVENPWFT-UPHRSURJSA-N (Z)-3-aminoacrylic acid Chemical compound N\C=C/C(O)=O YTLYLLTVENPWFT-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZYJWMQAABJXBHW-UHFFFAOYSA-N 1,8-bis(sulfanyl)octane-3,6-dione Chemical compound SCCC(=O)CCC(=O)CCS ZYJWMQAABJXBHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVRLFABOQXZUJX-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C)N1C(=O)C=CC1=O RVRLFABOQXZUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGVWDRVQIYUSRA-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethyldisulfanyl]ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CCSSCCN1C(=O)C=CC1=O SGVWDRVQIYUSRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNJBTKQBKFMEHH-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-2,3-dihydroxybutyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CC(O)C(O)CN1C(=O)C=CC1=O VNJBTKQBKFMEHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXXSHAKLDCERGU-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CCCCN1C(=O)C=CC1=O WXXSHAKLDCERGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDNJGYSBTLOSGU-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)prop-2-enoic acid Chemical compound CCN(CC)C(=C)C(O)=O VDNJGYSBTLOSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDWYGWMSVGVBCG-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)prop-2-enoic acid Chemical compound CN(C)C(=C)C(O)=O UDWYGWMSVGVBCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSMXGKUBAXWYNH-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)prop-2-enoic acid Chemical compound CCNC(=C)C(O)=O PSMXGKUBAXWYNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOGHFLHNVLOXEE-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-3-(methylamino)prop-2-enoic acid Chemical compound CNC=C(C)C(O)=O FOGHFLHNVLOXEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWRZIZXBOLBCON-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethenamine Chemical compound NC=CC1=CC=CC=C1 UWRZIZXBOLBCON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 1
- ZVDJGOAHCVLUCZ-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylamino)-2-methylprop-2-enoic acid Chemical compound CCN(CC)C=C(C)C(O)=O ZVDJGOAHCVLUCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYCHBDHDMFEQMC-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)-2-methylprop-2-enoic acid Chemical compound CN(C)C=C(C)C(O)=O TYCHBDHDMFEQMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUDKPHCQRWNEHI-UHFFFAOYSA-N 3-(ethylamino)-2-methylprop-2-enoic acid Chemical compound CCNC=C(C)C(O)=O LUDKPHCQRWNEHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 4,4'-dipyridyl disulfide Chemical compound C=1C=NC=CC=1SSC1=CC=NC=C1 UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004298 CX3C Chemokine Receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical group O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010065838 Middle ear inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010049175 N-substituted Glycines Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 229920002201 Oxidized cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011126 aluminium potassium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- AJXBTRZGLDTSST-UHFFFAOYSA-N amino 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)ON AJXBTRZGLDTSST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 108010088716 attachment protein G Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001558 benzoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) pentanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;1,3,5-triazine-2,4,6-triamine Chemical compound O=C.NC1=NC(N)=NC(N)=N1 IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 150000002690 malonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960001913 mecysteine Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FLEYLGCAQDCGHN-UHFFFAOYSA-N n-methyl-α-β-dehydroalanine Chemical compound CNC(=C)C(O)=O FLEYLGCAQDCGHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229940039328 nanoparticle-based vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940107304 oxidized cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 229940050271 potassium alum Drugs 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 102200026928 rs80356671 Human genes 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000001004 secondary ion mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- XUXNAKZDHHEHPC-UHFFFAOYSA-M sodium bromate Chemical compound [Na+].[O-]Br(=O)=O XUXNAKZDHHEHPC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010671 solid-state reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZNHKBFIBYXPDV-UHFFFAOYSA-N trimethyl-[3-(2-methylprop-2-enoylamino)propyl]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC(=C)C(=O)NCCC[N+](C)(C)C UZNHKBFIBYXPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложены иммуногенные композиции в виде многослойной пленки, содержащей В-клеточный (антительный) эпитоп RSV-G169-191 и дополнительно Т-клеточный эпитоп RSV-M281-95 белков респираторного синцитиального вируса (RSV), причем эпитоп RSV-G находится во внешнем слое пленки. Указанная пленка содержит два или более слоя полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты, содержащие поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу. В дополнение описан способ иммунизации против RSV. Композиции по настоящему изобретению обеспечивают увеличенный В-клеточный ответ против RSV и могут найти применение в профилактике инфекции RSV. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 21 ил., 5 табл., 19 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/485669, поданной 13 мая 2011, и №61/362029, поданной 7 июля 2010, при этом обе эти заявки включены в настоящее описание в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам профилактики инфекции респираторным синцитиальным вирусом, в частности к композициям в виде многослойной пленки, содержащей антигенные эпитопы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Респираторный синцитиальный вирус (RSV) является наиболее важной причиной серьезного заболевания нижних отделов дыхательных путей у детей первого года жизни и детей младшего возраста во всем мире, а также является потенциально опасным для пожилых пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом. В Соединенных Штатах RSV инфекции в результате приводят к госпитализации до 126000 детей первого года жизни и госпитализации до 60000 пожилых людей в год. Поскольку природная инфекция RSV не индуцирует устойчивый длительный иммунитет, пациенты подвержены повторному инфицированию тем же или другим штаммом вируса на протяжении всей жизни. RSV ассоциируется со вторичными инфекциями, такими как воспаление среднего уха, и может вызывать предрасположенность у детей младшего возраста к заболеваниям, родственным астме, в дальнейшей жизни.
После более 40 лет попыток безопасной и эффективной вакцины против RSV не существует. Самые ранние попытки разработать инактивированную формалином осажденную алюминиевыми квасцами RSV (FI-RSV) вакцину в 1960-х годах фактически вызвали предрасположенность вакцинированных детей к более серьезному заболеванию и даже смерти при последующем природном инфицировании. Точный механизм этой реакции не был полностью охарактеризован, но, по-видимому, он зависит от отклонения иммунного ответа в направлении воспалительного Th2-доминантного фенотипа, характеризующегося несоответствующей активацией цитокиновых и хемокиновых путей.
Принимая во внимание экономический эффект RSV заболевания, по оценкам приблизительно $700 миллионов в год в США в 2004, опасные для жизни осложнения, которые могут быть результатом RSV инфекции у детей первого года жизни, у пожилых людей и у пациентов с ослабленным иммунитетом, разработка безопасных и эффективных вакцин против RSV имеет первостепенное значение.
Существует необходимость в улучшении антигенных композиций, подходящих для стимуляции иммунного ответа на RSV.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления композиция содержит первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV, где первый и второй полипептидные эпитопы ковалентно связаны с одним или более полиэлектролитами, где один или более полиэлектролитов находятся в одной или нескольких многослойных пленках, где одна или несколько многослойных пленок каждая содержит два или более слоев полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты и где полиэлектролит содержит поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу, и где первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV находятся в одной и той же или в разных многослойных пленках.
В другом варианте осуществления композиция содержит первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV, где первый и второй полипептидные эпитопы находятся в виде одной или нескольких многослойных пленок, где одна или несколько многослойных пленок каждая содержит два или более слоя полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты и где по меньшей мере один полиэлектролит многослойной пленки содержит сконструированный полипептид, где сконструированный полипептид имеет достаточный заряд для стабильного связывания с противоположно заряженной поверхностью и где сконструированный полипептид содержит первый полипептидный эпитоп из RSV, второй полипептидный эпитоп из RSV или оба, где полиэлектролит, который не представляет собой сконструированный полипептид, содержит поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу, и где первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV находятся в одной и той же или в разных многослойных пленках.
Композиция содержит RSV-G полипептидный эпитоп, ковалентно связанный с одним или несколькими полиэлектролитами, где один или несколько полиэлектролитов находятся в одной или нескольких многослойных пленках, где одна или несколько многослойных пленок каждая содержит два или более слоев полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты и где полиэлектролит содержит поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1: Расширенный FT-ICR масс-спектр для MH6 +6 зарядового состояния интактного ACT-2044 (SEQ ID NO:8). Ожидаемое моноизотопное m/z для полностью окисленного пептида = 1015,43, найдено = 1015,6008. Этот результат полностью согласуется с двумя внутримолекулярными дисульфидами в АСТ-2044.
Фигура 2: FT-ICR масс-спектр для ACT-2086 (SEQ ID NO:13). MH9 +9 моноизотопный пик имеет m/z 867,1571, соответствующее моноизотопной массе 7795,344 атомных единиц массы (а.е.м.), которая очень близка к вычисленной моноизотопной массе 7795,33 а.е.м. Этот результат полностью согласуется с наличием двух дисульфидных связей в АСТ-2086.
Фигура 3: Поверхностный (зета) потенциал наночастиц, измененный после каждой стадии наслоения ELBL. Непокрытые частицы (ЕР) имеют положительную величину зета. Нанесение одного слоя PGA придает отрицательную величину зета. Последующие стадии наслаивания сконструированным пептидом АСТ-2031, полипептидами PGA и PLL или сконструированным пептидом ACT-2044 вызывают изменение положительного или отрицательного сдвигов в зета потенциале, указывая на успешные стадии ELBL.
Фигура 4: Иммунизация мышей BALB/c три раза наночастицами ACT-1042 (SEQ ID NO:8; RSV-G164-191) посредством инъекции в подушечки лап; образцы сыворотки собирали и тестировали посредством ELISA. Образцы сыворотки распознавали конформационный RSV-G CX3C эпитопный пептид ACT-2044 (SEQ ID NO:8).
Фигура 5: Иммунизация мышей BALB/c три раза наночастицами ACT-1042 (SEQ ID NO:8; RSV-G164-191) посредством инъекции в подушечки лап; образцы сыворотки собирали и тестировали посредством ELISA. Образцы сыворотки не распознавали вариант того же пептида (ACT-2054; SEQ ID NO:9), который был линеаризован путем кэппирования остатков цистеина.
Фигура 6: Иммунизация мышей BALB/c три раза наночастицами ACT-1042 (SEQ ID NO:8; RSV-G164-191) посредством инъекции в подушечки лап; образцы сыворотки собирали и тестировали посредством ELISA. Образцы сыворотки также распознавали нативный белок RSV-G.
Фигура 7: Иммунизация мышей BALB/c три раза наночастицами ACT-1042 (SEQ ID NO:8; RSV-G164-191) посредством инъекции в подушечки лап; образцы сыворотки собирали и тестировали в анализе биохимического связывания, измеряя ингибирование связывания RSV-G с хемокиновым рецептором CX3CR1. Биологическую активность антительного ответа, индуцируемого под действием АСТ-1042, подтверждали путем ингибирования связывания RSV-G с хемокиновым рецептором.
Фигура 8: Иммунизация мышей BALB/c три раза наночастицами ACT-1042 (SEQ ID NO:8; RSV-G164-191) посредством инъекции в подушечки лап; образцы сыворотки собирали и тестировали в анализе миграции клеток. Биологическую активность антительного ответа, индуцируемого под действием ACT-1042, подтверждали путем ингибирования миграции РВМС человека к очищенному RSV-G.
Фигура 9: RSV М2-специфичные Т-клеточные ответы после иммунизации с использованием ACT-1023 (SEQ ID NO:12; RSV-M281-98) посредством подкожного, внутрибрюшинного, интраназального введения и введения в подушечки лап. Спленоциты собирали у мышей на 14 день после иммунизации и рестимулировали в IL-4 или IFNγ ELISPOT планшетах с ACT-2019 (SEQ ID NO:7), пептидом RSV-M2. Результаты отражают число антиген-специфичных Т-клеток/106 клеток у отдельных интактных или иммунизированных животных.
Фигура 10: Иммуногенность мультивалентной RSV вакцины в виде смеси наночастиц. Мышей BALB/c (5 на группу, возраст 5-6 недель) иммунизировали на 0 и 21 день. Антительные ответы на RSV-G: образцы сыворотки собирали на 28 день и титры RSV-G-специфичных IgG антител измеряли с помощью ELISA. Данные показывают среднее значение ±SD 5 мышей на группу.
Фигура 11: Иммуногенность мультиваленной RSV вакцины в виде смеси наночастиц. Мышей BALB/c (5 на группу, возраст 5-6 недель) иммунизировали на 0 и 21 день. Т-клеточные ответы на RSV-M2: клетки селезенки собирали на 28 день и рестимулировали с использованием RSV-M2 (ACT-2031; SEQ ID NO:12) пептида в IFNγ или IL-4 ELISPOT планшетах. Данные показывают среднее значение ±SD 5 мышей на группу.
Фигура 12: Индукция in vivo CTL активности под действием иммунизации наночастицами RSV. Мышей BALB/c иммунизировали, как показано, и сенсибилизировали 7 дней спустя путем внутривенной инъекции сингенных клеток селезенки, активированных под действием АСТ-2031 (RSV-M2; SEQ ID NO:12) и меченных высокой дозой флуоресцентного индикатора CFSE (синие пики), смешанного с сингенными клетками селезенки, меченными низкой дозой CFSE и без целевого пептида (красные пики). На следующий день селезенки иммунизированных мышей анализировали проточной цитометрией для установления выживаемости дифференциально-меченых донорских клеток-мишеней. Каждая гистограмма показывает результаты, полученные от одной иммунизированной мыши в этой испытуемой группе.
Фигура 13: индукция in vivo CTL активности под действием иммунизации наночастицами RSV. Результаты показывают процент специфического уничтожения клеток-мишеней, меченных RSV-M2, на Фигуре 12, вычисленный путем сравнения относительного числа клеток в каждом пике в пределах гистограммы. На Фигурах 14 и 15 показан антительный ответ после первичной (14) и повторной (15) иммунизации частицами RSV с использованием одноэпитопных и многоэпитопных конструкций.
Фигура 16 представляет собой столбчатую диаграмму результатов, показанных на Фигурах 14 и 15.
На Фигуре 17 показаны результаты сенсибилизации живым RSV мышей, иммунизированных наночастицами RSV, содержащими либо RSV-G, RSV-M2, либо комбинацию. Данные показаны в виде анализа бляшкообразования и количественной ПЦР.
Фигура 18: индукция in vivo CTL активности путем иммунизации наночастицами RSV. Мышей BALB/c иммунизировали, как показано, и сенсибилизировали 7 дней спустя внутривенной инъекцией сингенных клеток селезенки, активированных с использованием ACT-2031 (RSV-M2; SEQ ID NO:12) и меченных высокой дозой флуоресцентного индикатора CFSE (синие пики), в смеси с сингенными клетками селезенки, меченными низкой дозой CFSE и без целевого пептида (красные пики). На следующий день селезенки иммунизированных мышей анализировали проточной цитометрией для установления выживаемости дифференциально-меченых донорских клеток-мишеней. Каждая гистограмма показывает результаты, полученные от одной иммунизированной мыши в этой испытуемой группе.
Фигура 19: Индукция in vivo CTL активности путем иммунизации наночастицами RSV. Результаты показывают процент специфичного уничтожения клеток-мишеней, меченных RSV-M2 на Фигуре 18, вычисленный путем сравнения относительного числа клеток в каждом пике в пределах гистограммы.
Фигуры 20 и 21: RSV-G-специфичные антительные ответы. Мышей BALB/c иммунизировали на 0 и 21 день. Титры RSV-G-специфичных IgG антител в образцах сыворотки после повторной иммунизации измеряли с помощью ELISA. (20) Величины OD отдельных образцов сыворотки в разведении 1:50. Смесь=ACT-1023+1042. Горизонтальные столбцы представляют среднее отдельных величин в пределах группы. (21) Среднее 5 образцов сыворотки на группу в серийных титрованиях.
Описанные выше и другие отличительные особенности будут ясны и понятны специалистам в данной области из следующего подробного описания, чертежей и прилагаемой формулы изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящей заявке описаны многослойные пленки, содержащие полипептидные эпитопы из RSV, где многослойные пленки способны индуцировать иммунный ответ у хозяина при введении этому хозяину. В одном варианте осуществления, многослойные пленки содержат два полипептидных эпитопа из RSV, в частности эпитоп, который индуцирует специфический Т-клеточный ответ, например цитотоксический Т-клеточный ответ, и эпитоп, который индуцирует специфический антительный ответ. В этом варианте осуществления авторами изобретения неожиданно было показано, что путем комбинирования эпитопа, который индуцирует специфический Т-клеточный ответ, и эпитопа, который индуцирует специфический антительный ответ, способность к специфическому иммунному ответу, измеренная как Т-клеточный ответ, неожиданно улучшается по сравнению с ведением только одного компонента. В частности, комбинация эпитопов RSV-G (специфический антительный ответ) и RSV-M2 (специфический Т-клеточный ответ) в форме одной или нескольких многослойных пленок индуцирует значительно улучшенный Т-клеточный ответ по сравнению с многослойной пленкой, содержащей только один эпитоп RSV-M2.
В частности, многослойные пленки содержат чередующиеся слои противоположно заряженных полиэлектролитов, в которых один полиэлектролитный слой содержит полиэлектролит, имеющий ковалентно присоединенный к нему по меньшей мере один полипептидный эпитоп из RSV. Первый и второй полипептидные эпитопы RSV могут быть присоединены к одному и тому же или к разным полиэлектролитам и/или могут находиться в одной и той же или в разных многослойных пленках. В одном варианте осуществления первый и второй полипептидные эпитопы RSV ковалентно присоединены к одному и тому же полиэлектролиту и, следовательно, находятся в одной и той же многослойной пленке. В другом варианте осуществления первый и второй полипептидные эпитопы RSV ковалентно присоединены к различным полиэлектролитам, но наслоены в пределах одной и той же многослойной пленки. Еще в одном варианте осуществления первый и второй полипептид RSV ковалентно присоединен к различным полиэлектролитам, но наслоены в разных многослойных пленках, которые впоследствии перемешивают перед применением.
В одном варианте осуществления, многослойные пленки содержат чередующиеся слои противоположно заряженных полиэлектролитов, в которых один полиэлектролитный слой представляет собой сконструированный полипептид, содержащий по меньшей мере однин эпитоп из RSV. Первый и второй полипептидные эпитопы RSV могут находиться в одном и том же или в различных сконструированных полипептидах и/или могут находиться в одной и той же или в разных многослойных пленках. В одном варианте осуществления первый и второй полипептидные эпитопы RSV находятся в одном и том же сконструированном полипептиде и, следовательно, находятся в одной и той же многослойной пленке. В другом варианте осуществления первый и второй полипептид RSV находятся в разных сконструированных полипептидах, но наслоены в пределах одной и той же многослойной пленки. Еще в одном варианте осуществления первый и второй полипептид RSV находятся в разных сконструированных полипептидах, но наслоены в разных многослойных пленках, которые впоследствии перемешивают перед применением.
В одном варианте осуществления, полипептидные эпитопы RSV представляют собой эпитопы из белка RSV-G. Белок RSV-G (присоединение) был ассоциирован со многими нарушениями, включая измененную экспрессию мРНк СС и СХС хемокинов и Th2 цитокиновых ответов, которые, по-видимому, подтверждают неадекватные иммунологические результаты и усугубление заболевания. Центральная богатая цистеином консервативная область белка RSV-G содержит СХЗС хемокиновый мотив в аминокислотных положениях 182-186, который связывается с CX3CR1, фракталкиновым рецептором (CX3CL1). Мимикрия CX3CL1 RSV-G была показана для обеспечения RSV инфекции и препятствия нормальным адаптивным иммунным реакциям на этот вирус. Активная иммунизация пептидами, перекрывающими мотив СХ3С RSV-G, защищает мышей от RSV инфекции и воспаления легких. До сих пор эти RSV-G пептиды не были разработаны в безопасную и эффективную вакцину.
В другом варианте осуществления, полипептидные эпитопы RSV представляют собой эпитопы из белка RSV-F или RSV-M2. Помимо белка RSV-G белки RSV-F (слитый) и RSV-M2 (матриксный) являются возможными кандидатами для вакцин. Попытки разработать моновалентные вакцины RSV, содержащие только одну из главных антигенных детерминант, были затруднены неполной защитой от инфекционных и воспалительных заболеваний, указывая на то, что мультивалентный подход мог бы быть более успешным. Действительно, иммунизация мышей мультивалентными вакцинами, которые индуцируют как антительный, так и CD8+ Т-клеточный ответ, в результате приводит к уменьшению Th2 и повышению Th1/CD8 ответов, которые коррелируют с большей защитой от вирусной инфекции и меньшей воспалительной патологией легких. Эти результаты указывают на то, что идеальная созданная RSV вакцина включала бы эпитопы из двух или более вирусных белков и индуцировала бы как антитела, так и CD8+ Т-клетки, секретирующие IFNγ.
В другом варианте осуществления многослойная пленка содержит полипептидный эпитоп из RSV, где полипептидный эпитоп представляет собой эпитоп из RSV-G белка (специфический антительный ответ). Неожиданно было обнаружено, что мыши, иммунизированные наночастицами, содержащими эпитоп СХ3С RSV-G, были защищены от заражения живым RSV. Интересно то, что эпитоп RSV-M2 не обеспечивал защиту от заражения живым RSV, а комбинация RSV-G и RSV-M2 вакцины не обеспечивала улучшенную защиту по сравнению с одним только RSV-G. Не придерживаясь теории, считается, что высокая концентрация наночастиц, используемых в этих экспериментах, могла иметь скрытые потенциальные благоприятные эффекты комбинации наночастиц.
В одном варианте осуществления многослойная пленка расположена на ядре частицы, например наночастице СаСО3, латексной частице или частице железа. В основном используют частицы размером порядка 5 нанометров (нм) до 50 микрометров (мкм) в диаметре. Частицы, сделанные из других материалов, также могут быть использованы в качестве ядер, при условии, что они являются биосовместимыми, имеют контролируемое распределение по размеру и имеют достаточный поверхностный заряд (либо положительный, либо отрицательный) для связывания полиэлектролитных пептидов. Примеры включают наночастицы и микрочастицы, изготовленные из таких материалов, как полимолочная кислота (PLA), сополимер полимолочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA), полиэтиленгликоль (PEG), хитозан, гиалуроновая кислота, желатин или их комбинации. Ядра частиц также могли быть изготовлены из материалов, которые считаются неподходящими для использования людьми, при условии, что они могут быть растворены и отделены от многослойной пленки после производства пленки. Примеры веществ для матрицы ядра включают органические полимеры, такие как латекс, или неорганические вещества, такие как кремний.
Полиэлектролитные многослойные пленки представляют собой тонкие пленки (например, толщиной от нескольких нанометров до микрометров), состоящие из чередующихся слоев противоположно заряженных полиэлектролитов. Такие пленки могут быть сформированы послойной сборкой на подходящем субстрате. В электростатической послойной самосборке («ELBL») физическая основа ассоциации полиэлектролитов представляет собой электростатическое притяжение. Наращивание пленки является возможным, поскольку знак плотности поверхностного заряда пленки меняется на противоположный при нанесении последовательных слоев. Универсальность и относительная простота процесса ELBL для пленки позволяет разместить многие различные типы полиэлектролитов на многие различные типы поверхности. Полипептидные многослойные пленки представляют собой разновидность полиэлектролитных многослойных пленок, содержащих по меньшей мере один слой, содержащий заряженный полипептид, в настоящей заявке называемый сконструированным полипептидом. Ключевым преимуществом полипептидных многослойных пленок перед другими пленками, изготовленными из других полимеров, является их биосовместимость. Пленки ELBL также могут быть использованы для инкапсуляции. Применения полипептидных пленок и микрокапсул включают, например, нанореакторы, биосенсоры, искусственные клетки и носители для доставки лекарственных средств.
Термин «полиэлектролит» включает поликатионные и полианионные вещества, имеющие молекулярную массу более 1000 и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу. Подходящие поликатионные вещества включают, например, полипептиды и полиамины. Полиамины включают, например, полипептид, такой как поли-L-лизин (PLL) или поли-L-орнитин, поливиниламин, поли(аминостирол), поли(аминоакрилат), поли(N-метиламиноакрилат), поли(N-этиламиноакрилат), поли(N,N-диметиламиноакрилат), поли(N,N-диэтиламиноакрилат), поли(аминометакрилат), поли(N-метиламино-метакрилат), поли(N-этиламинометакрилат), поли(N,N-диметиламинометакрилат), поли(N,N-диэтиламинометакрилат), поли(этиленимин), поли(диаллилдиметиламмония хлорид), поли(N,N,N-триметиламиноакрилат хлорид), поли(метакриламидопропилтриметиламмония хлорид), хитозан и комбинации, содержащие одно или более из указанных выше поликатионных веществ. Подходящие полианионные вещества включают, например, полипептид, такой как поли-L-глутаминовая кислота (PGA) и поли-L-аспарагиновая кислота, нуклеиновую кислоту, такую как ДНК и РНК, альгинат, каррагенан, фурцелларан, пектин, ксантан, гиалуроновая кислота, гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат, дермантансульфат, декстрансульфат, поли(мет)акриловую кислоту, окисленную целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, кислые полисахариды и кроскармелозу, синтетические полимеры и сополимеры, содержащие дополнительные боковые карбоксильные группы, и комбинации одного или нескольких указанных выше полианионных веществ. В одном варианте осуществления, эпитоп RSV и полиэлектролит имеют одинаковый знак заряда.
В одном варианте осуществления один или несколько полиэлектролитных слоев пленки, необязательно включающей полиэлектролит, содержащий эпитоп RSV, представляют собой сконструированный полипептид. В одном варианте осуществления принципы создания полипептидов, подходящие для электростатического послойного осаждения материала, освещены в патентной публикации US № 2005/0069950, включенной в настоящую заявку посредством ссылки для предоставления сведений о полипептидных многослойных пленках. Вкратце, основными особенностями конструкции являются длина и заряд полипептида. Электростатические параметры являются наиболее важной особенностью конструкции, поскольку это является основой ELBL. Без подходящих свойств заряда полипептид может не быть в значительной степени растворимым в водном растворе при рН 4-10 и не может легко использоваться для производства многослойной пленки путем ELBL. Другие особенности конструкции включают физическую структуру полипептидов, физическую растворимость пленок, образованных из этих полипептидов, и биосовместимость и биоактивность пленок и составляющих их полипептидов.
Сконструированный полипептид означает полипептид, который имеет достаточный заряд для стабильного связывания с противоположно заряженной поверхностью, то есть полипептид, который может быть осажден в слой многослойной пленки, где движущей силой образования пленки является электростатическая сила. Короткая стабильная пленка представляет собой пленку, которая, сформировавшись, сохраняет более половины своих компонентов после инкубирования в PBS при 37°С в течение 24 часов. В конкретных вариантах осуществления сконструированный полипептид составляет по меньшей мере 15 аминокислот в длину, и величина суммарного заряда на остаток полипептида является большей или равной 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5 при рН 7,0. Положительно заряженными (основными) природными аминокислотами при рН 7,0 являются аргинин (Arg), гистидин (His), орнитин (Orn) и лизин (Lys). Отрицательно заряженными (кислыми) природными аминокислотами при рН 7,0 являются глутаминовая кислота (Glu) и аспарагиновая кислота (Asp). Смесь аминокислотных остатков противоположного заряда может быть использована при условии, что суммарный чистый коэффициент заряда соответствует заданным критериям. В одном варианте осуществления сконструированный полипептид не является гомополимером. В другом варианте осуществления сконструированный полипептид является неразветвленным.
Одной особенностью конструкции является контроль стабильности полипептидных пленок ELBL. Ионные связи, водородные связи, Ван дер Ваальсовые взаимодействия и гидрофобные взаимодействия вносят свой вклад в стабильность многослойных пленок. Кроме того, ковалентные дисульфидные связи, образованные между сульфгидрилсодержащими аминокислотами в полипептидах в пределах одного и того же слоя или в смежных слоях, могут повысить структурную прочность. Сульфгидрилсодержащие аминокислоты включают цистеин и гомоцистеин, и эти остатки легко могут быть включены в синтетические сконструированные пептиды. Помимо сульфгидрильных групп в полиэлектролит могут быть включены гомополимеры, такие как поли-L-лизин или поли-L-глутаминовая кислота, способами, широко описанными в литературе. Сульфгидрилсодержащие аминокислоты могут быть использованы для «запирания» (связать вместе) и «отпирания» слоев многослойной полипептидной пленки путем изменения окислительного потенциала. Также включение сульфгидрилсодержащей аминокислоты в сконструированный полипептид дает возможность использовать относительно короткие пептиды в производстве тонкой пленки, посредством образования межмолекулярной дисульфидной связи.
В одном варианте осуществления сконструированные сульфгидрилсодержащие полипептиды, либо синтезированные химически, либо продуцированные в организме-хозяине, собирают посредством ELBL в присутствии восстанавливающего агента для предотвращения преждевременного образования дисульфидной связи. После сборки пленки восстанавливающий агент удаляют и добавляют окисляющий агент. В присутствии окисляющего агента образуются дисульфидные связи между сульфгидрильными группами, тем самым «запирая» вместе полипептиды внутри слоев и между слоями, где присутствуют тиольные группы. Подходящие восстанавливающие агенты включают дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол (ВМЕ), восстановленный глутатион, трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорид (ТСЕР) и комбинации более одного из этих реактивов. Подходящие окисляющие агенты включают окисленый глутатион, трет-бутилгидропероксид (t-BHP), тимеросал, диамид, 5,5’-дитио-бис-(2-нитро-бензойную кислоту) (DTNB), 4,4’-дитиодипиридин, бромат натрия, перекись водорода, тетратионат натрия, порфириндин, ортойодособензоат и комбинации более одного из этих реактивов.
В качестве альтернативы дисульфидным связям, могут быть использованы химические составы, которые образуют другие ковалентные связи для стабилизации пленок ELBL. Для пленок, состоящих из полипептидов, химические составы, которые образуют амидные связи, являются особенно подходящими. В присутствии соответствующих связующих реагентов кислые аминокислоты (с боковыми цепями, содержащими группы карбоновой кислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) будут вступать в реакцию с аминокислотами, боковые цепи которых содержат аминогруппы (такими как лизин и орнитин) с образованием амидных связей. Амидные связи являются более стабильными, чем дисульфидные связи, в биологических условиях, и амидные связи не будут подвергаться реакциям обмена. Многие реактивы могут быть использованы для активации боковых цепей полипептида для амидного связывания. Карбодиимидные реактивы, такие как водорастворимый 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), будут взаимодействовать с аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой при слабокислом рН, образуя промежуточный продукт, который будет необратимо взаимодействовать с амином с образованием амидной связи. Добавки, такие как N-гидроксисукцинимид, зачастую добавляют к реакционной смеси для ускорения скорости и эффективности образования амида. После реакции растворимые реагенты удаляют из наночастиц или микрочастиц центрифугированием и аспирацией. Примеры других связующих реагентов включают диизопропилкарбодиимид, HBTU, HATU, HCTU, TBTU и РуВОР. Примеры других добавок включают сульфо-N-гидроксисукцинимид, 1-гидроксибензотриазол и 1-гидрокси-7-аза-бензотриазол. Степень амидного поперечного связывания может контролироваться путем изменения стехиометрии связующих реагентов, времени реакции или температуры реакции и может контролироваться такими способами, как инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT-IR).
Ковалентно поперечно связанные ELBL пленки обладают желаемыми свойствами, такими как повышенная стабильность. Большая стабильность дает возможность использования более жестких условий во время производства наночастиц, микрочастиц, нанокапсул или микрокапсул. Примеры жестких условий включают высокие температуры, низкие температуры, криогенные температуры, высокие скорости центрифугирования, буферы с высокой концентрацией солей, буферы с высоким рН, буферы с низким рН, фильтрование и длительное хранение.
Способ получения полиэлектролитной многослойной пленки включает напыление множества слоев противоположно заряженных химических соединений на субстрат. В одном варианте осуществления по меньшей мере один слой содержит сконструированный полипептид. Последовательно напыленные полиэлектролиты будут иметь противоположные суммарные заряды. В одном варианте осуществления напыление полиэлектролита включает воздействие на субстрат водным раствором, содержащим полиэлектролит при рН, при котором он имеет подходящий суммарный заряд для ELBL. В других вариантах осуществления напыление полиэлектролита на субстрат достигается последовательным распылением растворов противоположно заряженных полипептидов. Еще в одном варианте осуществления напыление на субстрат осуществляют путем одновременного распыления растворов противоположно заряженных полиэлектролитов.
В ELBL способе образования многослойной пленки противоположные заряды смежных слоев обеспечивают движущую силу для сборки. Не является крайне важным, чтобы полиэлектролиты в противоположных слоях имели одинаковую суммарную линейную плотность заряда, только чтобы противоположные слои имели противоположные заряды. Одна стандартная методика сборки пленки путем напыления включает образование жидких растворов полиионов при рН, при котором они являются ионизированными (т.е. рН 4-10), обеспечение субстрата, несущего поверхностный заряд, и попеременное погружение в заряженные полиэлектролитные растворы. Этот субстрат необязательно промывают между напылениями чередующихся слоев.
Концентрацию полиэлектролита, подходящую для напыления полиэлектролита, легко может определить специалист в данной области. Концентрация, приводимая в качестве примера, составляет от 0,1 до 10 мг/мл. Для типичных неполипептидных полиэлектролитов, таких как поли(акриловая кислота) и поли(аллиламингидрохлорид), характерная толщина слоя составляет примерно от 3 примерно до 5 Å, в зависимости от ионной силы раствора. Короткие полиэлектролиты обычно образуют более тонкие слои, чем длинные полиэлектролиты. Что касается толщины пленки, толщина полиэлектролитной пленки зависит от влажности, а также от числа слоев и состава пленки. Например, PLL/PGA пленки 50 нм толщиной сжимаются до 1,6 нм при высушивании азотом. В целом, пленки толщиной от 1 нм до 100 нм или более могут быть образованы в зависимости от состояния гидратации пленки и молекулярной массы полиэлектролитов, используемых в сборке.
Кроме того, количество слоев, необходимое для формирования стабильной полиэлектролитной многослойной пленки, будет зависеть от полиэлектролитов в пленке. Для пленок, содержащих только слои полипептидов с низкой молекулярной массой, пленка обычно будет иметь 4 или более бислоев противоположно заряженных полипептидов. Для пленок, содержащих полиэлектролиты с высокой молекулярной массой, такие как поли(акриловая кислота) и поли(аллиламингидрохлорид), пленки, содержащие один бислой противоположно заряженного полиэлектролита, могут быть стабильными. Исследования показали, что полиэлектролитные пленки являются динамичными. Полиэлектролиты, содержащиеся в пленке, могут мигрировать между слоями и могут обмениваться с растворимыми полиэлектролитами одноименного заряда при суспендировании в растворе полиэлектролитов. Более того, полиэлектролитные пленки могут разделяться или растворяться в ответ на изменение окружения, например температуры, рН, ионной силы или окислительного потенциала суспензионного буфера. Таким образом, некоторые полиэлектролиты и, в частности, пептидные полиэлектролиты, проявляют динамическую стабильность. Стабильность пептидных полиэлектролитых пленок можно контролировать путем суспендирования пленок в подходящем буфере в контролируемых условиях в течение фиксированного периода времени, а затем измерения количеств пептидов в пленке с помощью подходящего анализа, например анализа аминокислот, ВЭЖХ или флуоресцентного анализа. Пептидные полиэлектролитные пленки являются наиболее стабильными в условиях, которые соответствуют условиям их хранения и применения в качестве вакцин, например, в нейтральных буферах и при температуре окружающей среды 4-37°С. В этих условиях стабильные пептидные полиэлектролитные пленки будут сохранять большинство составляющих их пептидов по меньшей мере в течение 24 часов и зачастую вплоть до 14 дней и больше.
В одном варианте осуществления сконструированный полипептид содержит одну или более областей поверхностной абсорбции, ковалентно связанных с одним или более эпитопами RSV, где сконструированный полипептид и одна или более областей поверхностной абсорбции имеют одинаковый знак заряда, то есть оба положительно или оба отрицательно заряжены суммарно. В контексте настоящего изобретения область поверхностной абсорбции представляет собой заряженную область сконструированного полипептида, которая преимущественно обеспечивает достаточный заряд, так чтобы пептид, содержащий эпитоп из RSV, например, мог быть осажден в многослойной пленке. В одном варианте осуществления, одна или более областей поверхностной абсорбции и один или более эпитопов RSV имеют одинаковую суммарную полярность. В другом варианте осуществления растворимость сконструированного полипептида при рН 4-10 больше или равна примерно 0,1 мг/мл. В другом варианте осуществления растворимость сконструированного полипептида при рН 4-10 больше или равна примерно 1 мг/мл. Растворимость является ограничением практического характера для облегчения напыления полипептидов из водного раствора. Применяемый на практике верхний предел в отношении степени полимеризации антигенного полипептида составляет примерно 1000 остатков. Вероятно, однако, что более длинные составные полипептиды могли быть получены соответствующим способом синтеза.
В одном варианте осуществления сконструированный полипептид содержит один антигенный эпитоп RSV, фланкированный двумя областями поверхностной адсорбции и C-концевой областью поверхностной адсорбции. В другом варианте осуществления сконструированный полипептид содержит один антигенный эпитоп RSV, фланкированный одной областью поверхностной адсорбции, связанной с N-концом эпитопа RSV. В другом варианте осуществления сконструированный полипептид содержит один антигенный эпитоп RSV, фланкированный одной областью поверхностной адсорбции, связанной с С-концом эпитопа RSV.
Каждая из независимых областей (например, RSV эпитопы и области поверхностной адсорбции) сконструированного полипептида может быть синтезирована отдельно с помощью пептидного синтеза в жидкой фазе, твердофазного пептидного синтеза или генной инженерией подходящего организма-хозяина. Пептидный синтез в жидкой фазе представляет собой способ, используемый для получения большинства одобренных пептидных фармацевтических средств на рынке на сегодняшний день. Сочетание способов жидкой фазы и твердой фазы может быть использовано для синтеза относительно длинных пептидов и даже белков с низкой молекулярной массой. Компании, занимающиеся пептидным синтезом, обладают специальными знаниями и опытом для синтеза сложных пептидов на платной основе. Синтез проводят по правилам организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP) и в масштабе, подходящем для клинических испытаний и коммерческого выпуска лекарственного средства.
Альтернативно, различные независимые области могут быть синтезированы вместе в виде одной полипептидной цепи с помощью пептидного синтеза в жидкой фазе, твердофазного пептидного синтеза или методами генной инженерии подходящего организма-хозяина. Выбор подхода в каждом конкретном случае будет вопросом удобства и экономических факторов.
В тех случаях, когда различные эпитопы RSV и области поверхностной адсорбции синтезируют отдельно, после очистки, например, ионообменной хроматографией или высокоэффективной жидкостной хроматографией, их соединяют посредством синтеза пептидных связей. То есть N-конец области поверхностной адсорбции и С-конец эпитопа RSV ковалентно соединяют для получения сконструированного полипептида. Альтернативно, С-конец области поверхностной адсорбции и N-конец эпитопа RSV ковалентно соединяют для получения сконструированного полипептида. Отдельные фрагменты могут быть синтезированы твердофазными методами и получены в виде полностью защищенных, полностью незащищенных или частично защищенных сегментов. Эти сегменты могут быть ковалентно соединены в реакции, проходящей в жидкой фазе или твердофазной реакции. Если один полипептидный фрагмент содержит цистеин в виде его N-концевого остатка, а другой полипептидный фрагмент содержит сложный тиоэфир или предшественник сложного тиоэфира на его C-концевом остатке, эти два фрагмента будут соединяться спонтанно в растворе специфичной реакцией, общеизвестной (специалистам в данной области) как нативное лигирование. Нативное лигирование является особенно перспективным вариантом выбора для синтеза сконструированного пептида, поскольку оно может быть выполнено с пептидными фрагментами, с которых полностью снята защита, или частично защищенными пептидными фрагментами в водном растворе и в разбавленных концентрациях.
В одном варианте осуществления эпитопы RSV и/или области поверхностной адсорбции соединяют пептидными или непептидными связями, как описано в патенте США №7723294, включенном в настоящее описание посредством ссылки на содержащиеся в нем сведения по использованию непептидных связей для соединения сегментов полипептидов для использования в многослойных пленках. Подходящие непептидные линкеры включают, например, алкильные линкеры, такие как -NH-(CH2)s-С(O)-, где s=2-20. Алкильные линкеры необязательно замещены пространственно не затрудненными группами, такими как низший алкил (например, C1-С6), низший ацил, галоген (например, Cl, Br), CN, NH2, фенил и подобные. Другой приводимый в качестве примера непептидный линкер представляет собой полиэтиленгликольный линкер, такой как -NH-(CH2-CH2-O)n,-C(O)-, где n является таковым, что этот линкер имеет молекулярную массу от 100 до 5000 Да, в частности от 100 до 500 Да. Многие линкеры, описанные в настоящей заявке, доступны от коммерческих фирм-поставщиков в форме, подходящей для использования в твердофазном пептидном синтезе.
В одном варианте осуществления один или более полипептидных эпитопов из RSV ковалентно присоединен к одному или нескольким полиэлектролитам, таким как полипептид или другой полиэлектролит, посредством ковалентных связей. Примеры подходящих ковалентных связей включают амиды, сложные эфиры, простые эфиры, тиоэфиры и дисульфиды. Специалист в данной области может использовать преимущества ряда функциональных групп, обнаруженных в пределах эпитопного пептида для конструирования связи с подходящим электролитом. Например, карбоновая кислота в эпитопном полипептиде может находиться либо на С-конце, либо на боковой цепи аминокислот аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты. Карбоновые кислоты могут быть активированы подходящими пептидными связующими реагентами, такими как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), для взаимодействия с первичными или вторичными аминами, которые находятся в пептидных полиэлектролитах, таких как поли-L-лизин. Полученная в результате амидная связь является стабильной в условиях внешней среды. С другой стороны, кислотные группы в пептидном полиэлектролите могут быть активированы с помощью EDC для взаимодействия с аминными группами в эпитопном пептиде. Подходящие аминные группы могут находиться на N-конце эпитопного пептида или на боковой цепи остатков лизина.
Эпитопные пептиды также могут быть присоединены к полиэлектролитам через дисульфидные связи. Полиэлектролиты, такие как PGA или PLL, могут быть химически модифицированы таким образом, чтобы фракция их боковых частей содержала сульфгидрильные группы. В присутствии подходящего окислителя эти сульфгидрилы будут вступать в реакцию с сульфгидрильной группой остатка цистеина, содержащегося в эпитопном пептиде. Цистеин может представлять собой либо нативный цистеин из белковой последовательности патогена, такого как RSV, либо он может представлять собой ненативный цистеин, который был намеренно встроен в эпитоп во время пептидного синтеза. Подходящие окислители включают DTNB, 2,2’-дитиопиридин, перекись водорода, цистеин и окисленный глутатион. Присоединение эпитопных пептидов к полиэлектролитам через дисульфидные связи является особенно удобным. Дисульфиды являются стабильными в обычных условиях производства пленок и хранения, но легко расщепляются восстанавливающими агентами, в естественных условиях находящимися в клетках, которые освобождают эпитопный пептид для иммунологического процессинга.
Эпитопные пептиды также могут быть присоединены к полиэлектролитам посредством тиоэфирных связей. Синтетические эпитопные пептиды могут быть синтезированы с соответствующими электрофилами, такими как галоацетильные группы, которые специфически взаимодействуют с сульфгидрилами. Например, эпитопный пептид, содержащий хлорацетил на своем N-конце, будет образовывать стабильную связь с полиэлектролитами, несущими сульфгидрил, такими как PGA-SH, описанная выше.
Эпитопные пептиды также могут быть присоединены ковалентно к полиэлектролитам через бифункциональные линкерные молекулы. Бифункциональные линкеры обычно содержат две электрофильные группы, которые могут вступать в реакцию с нуклеофилами, находящимися либо на эпитопном пептиде, либо на молекуле полиэлектролита. В продаже имеется два класса линкерных молекул, гомобифункциональные линкеры и гетеробифункциональные линкеры. Гомобифункциональные линкеры содержат две копии электрофильных групп, соединенных нереакционноспособным спейсером. Зачастую электрофилы представляют собой активные сложные эфиры, такие как N-гидроксисукцинимидные (NHS) сложные эфиры или сульфо-N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры (сульфо NHS), которые вступают в реакцию с нуклеофильными аминами. Примеры гомобифункциональных NHS сложных эфиров включают бис(сульфосукцинимидил)суберат, дисукцинимидилглутарат, дитиобис(сукцинимидил)пропионат, дисукцинимидилсуберат, дисукцинимидилтартрат. Иногда электрофилами являются альдегидные группы, которые образуют имиды с нуклеофильными аминами на эпитопе и молекулах полиэлектролита. Имидные связи являются транзиторно стабильными, но могут быть преобразованы в стабильные структуры восстанавливающими агентами, такими как боргидрид натрия, или каталитическим гидрогенированием. Наиболее часто используемым гомобифункциональным альдегидным линкером является глутаральдегид.
Другие широко используемые гомобифункциональные линкеры, содержащие электрофилы, которые специфически взаимодействуют с нуклеофильными тиолами, которые могут быть использованы для связывания цистеин-содержащих эпитопных пептидов с полиэлектролитами, содержащими сульфгидрил, описаны выше. Примеры специфичных к сульфгидрилам гомобифункциональных линкеров включают 1,4-бисмалеимидобутан, 1,4-бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан, бисмалеимидогексан, бис-малеимидогексан, бис-малеимидоэтан, 1,4-ди-[3’-(2’-пиридилдитио)-пропионамидо]бутан, дитио-бисмалеимидоэтан, 1,6-гексан-бис-винилсульфон.
Представители гетеробифункционального класса поперечно-сшивающих реагентов содержат две группы с различной реакционной способностью, зачастую, но не всегда, электрофилы, которые специфично взаимодействуют с различными функциональными группами в молекулах субстрата. Особенно используемыми являются линкеры, которые содержат одну электрофильную группу, которая специфична в отношении сульфгидрила, и другой электрофил, который специфичен в отношении амина. Примеры этих реагентов включают N-сульфосукцинимидил[4-йодацетил]аминобензоат, N-сукцинимидил [4-йодацетил]аминобензоат, сукцинимидил 3-[бромацетамидо]пропионат, N-сукцинимидилйодацетат, сульфосукцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат, сукцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат, ([N-е-малеимидокапроилокси]сульфосукцинимидный сложный эфир, м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный сложный эфир, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)-пропионат, сукцинимидил 6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат, 4-сукцинимидилоксикарбонил-метил-а-[2-пиридилдитио]толуол.
Разнообразные функциональные группы, которые обычно находятся как в эпитопных полипептидах, так и в полиэлектролитах, или которые легко могут быть помещены в любую из этих молекул, позволяют специалисту выбрать стратегию соединения, которая лучше всего соответствует субстрату, представляющему интерес. Подходящим примером является связывание цистеина, содержащего эпитопный пептид, с PLL.
Полипептидные сегменты могут быть присоединены различными путями, в зависимости от химических свойств непептидного линкера. Например, N-конец первого полипептидного сегмента присоединен к С-концу второго полипептидного сегмента; N-конец первого полипептидного сегмента присоединен к N-концу второго полипептидного сегмента; С-конец первого полипептидного сегмента присоединен к С-концу второго полипептидного сегмента; С-конец первого полипептидного сегмента присоединен к N-концу второго полипептидного сегмента; С-конец или N-конец первого полипептидного сегмента присоединен к концевой боковой цепи второго полипептидного сегмента или С-конец или N-конец второго полипептидного сегмента присоединен к концевой боковой цепи первого полипептидного сегмента. Независимо от точки присоединения, однако, первый и второй сегмента ковалентно присоединены посредством непептидного линкера.
В одном варианте осуществления сконструированный полипептид представляет собой уникальное сочетание ковалентно присоединенных одной или нескольких областей поверхностной адсорбции и одного или нескольких эпитопов RSV. Не существует конкретного ограничения в отношении длины эпитопов RSV, которые могут быть линейными эпитопами или конформационными эпитопами. Эпитопы могут содержать в любом месте примерно от трех аминокислотных остатков до нескольких сотен аминокислотных остатков для сложных конформационных эпитопов.
В одном варианте осуществления сконструированный полипептид содержит один эпитоп RSV и одну область поверхностной адсорбции. В другом варианте осуществления, сконструированный полипептид содержит один эпитоп RSV и две области поверхностной адсорбции, одна присоединена к N-концу эпитопа RSV и одна присоединена к С-концу эпитопа RSV. Назначением области (областей) поверхностной адсорбции является обеспечение адсорбции полипептида на противоположно заряженную поверхность для построения многослойной пленки.
Количество областей поверхностной адсорбции в сконструированном полипептиде относительно количества и/или длины эпитопов RSV связано с требованиями растворимости. Например, если эпитоп RSV представляет собой короткую аминокислотную последовательность, например из трех аминокислотных остатков, только одна область поверхностной адсорбции по меньшей мере из восьми аминокислотных остатков потребуется для адсорбции сконструированного полипептида на походящим образом заряженную поверхность. Если, напротив, эпитоп RSV представляет собой растворимый складчатый структурный домен белка, содержащий, например, 120 аминокислотных остатков, две области поверхностной адсорбции может потребоваться для придания достаточного заряда для сконструированного полипептида, чтобы он был водорастворимым и подходящим для адсорбции. Области поверхностной адсорбции могли быть смежными и располагаться на N-конце домена, смежными и располагаться на С-конце домена или несмежными с одной на N-конце и одной на С-конце. Кроме того, эпитоп RSV может содержать заряженный сегмент (либо отрицательно заряженный, либо положительно заряженный) в пределах нативной последовательности, которая может служить в качестве области поверхностной адсорбции.
Полипептид или антиген могут содержать одну или более различных антигенных детерминант. Антигенная детерминанта может относиться к иммуногенной части разветвленного белка.
Способы и методики для определения расположения и состава антигенной детерминанты или эпитопа для специфического антитела хорошо известны из уровня техники. Эти методики могут быть использованы для идентификации и/или характеристики эпитопов для использования в качестве эпитопов RSV. В одном варианте осуществления способы картирования/характеристики эпитопа для антиген-специфичного антитела могут быть определены посредством «отпечатка подошвы» эпитопа, с использованием химической модификации подвергаемых воздействию аминов/карбоксилов в антигенном белке. Одним примером такой методики «отпечатка подошвы» является использование HXMS (водород-дейтериевый обмен, регистрируемый масс-спектрометрией) где происходит водород-дейтериевый обмен рецептора и протонов амида лигандного белка, связывание и обратный обмен, где амидные группы остова, принимающие участие в связывании белка, защищены от обратного обмена и, следовательно, останутся дейтерированными. Релевантные области могут быть идентифицированы в этой точке пепсиновым протеолизом, разделением на высокочувствительной микроколонке высокоэффективной жидкостной хроматографией и/или масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением.
В другом варианте осуществления методикой идентификации подходящего эпитопа является картирование эпитопа ядерным магнитным резонансом (ЯМР), где обычно сравнивают положение сигналов в двумерных спектрах ЯМР свободного антигена и антигена, образовавшего комплекс с антиген-связывающим пептидом, таким как антитело. Антиген обычно является селективно меченным изотопом 15N так, чтобы только сигналы, соответствующие антигену, а не сигналы от антиген-связывающего белка были видны на ЯМР спектре. Антигенные сигналы, происходящие от аминокислот, вовлеченных во взаимодействие с антиген-связывающим пептидом, обычно будут сдвигать положение в спектре комплекса по сравнению со спектрами свободного антигена, и аминокислоты, вовлеченные в связывание, могут быть идентифицированы этим путем.
В другом варианте осуществления картирование эпитопа/характеристику можно осуществить с помощью пептидного сканирования. В этом подходе готовят серии перекрывающихся пептидов, охватывающих всю длину полипептидной цепи антигена, и тестируют по отдельности на иммуногенность. Титр антител соответствующего пептидного антигена определяют стандартным способом, например твердофазным иммуноферментным анализом. Различные пептиды затем могут быть классифицированы по иммуногенности, обеспечивая эмпирическую основу для выбора конструкции пептида для разработки вакцины.
В другом варианте осуществления, методики расщепления протеазой также могут быть использованы применительно к картированию эпитопа и идентификации. Области/последовательности, релевантные антигенным детерминантам, могут быть определены расщеплением протеазой, например, путем использования трипсина в соотношении примерно 1:50 к антигенному белку в расщеплении в течение ночи (O/N) при 37°С и рН 7-8, с последующим масс-спектрометрическим анализом (MS) для идентификации пептида. Пептиды, защищенные от расщепления трипсином антигенным белком, впоследствии могут быть идентифицированы путем сравнения образцов, подвергавшихся расщеплению трипсином, и образцов, инкубированных с CD38BP, а затем подвергавшихся расщеплению, например, трипсином (тем самым выявляя отпечаток подошвы для связующего). Другие ферменты, такие как химотрипсин, пепсин и т.д., также или альтернативно могут быть использованы в аналогичном способе характеристики эпитопа. Более того, расщепление протеазой может обеспечить быстрый способ определения локализации последовательности потенциальной антигенной детерминанты в пределах известного антигенного белка с использованием известного антитела. В другом варианте осуществления, методики протеазного расщепления также могут быть использованы применительно к картированию эпитопа и идентификации.
В настоящей заявке далее описана иммуногенная композиция, указанная иммуногенная композиция содержит многослойную пленку, содержащую два или более слоев полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты, где один слой содержит эпитоп RSV. Эта иммуногенная композиция необязательно дополнительно содержит один или более слоев, содержащих сконструированный полипептид.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит множество эпитопов RSV либо на одном и том же, либо на разных полиэлектролитах, например сконструированных полипептидах. Множество антигенных детерминант могут быть из одного и того же либо из разных инфекционных агентов. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция содержит множество уникальных антигенных полиэлектролитов. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит множество иммуногенных полиэлектролитов, содержащих многочисленные эпитопы RSV в пределах каждого полиэлектролита. Преимуществом этих иммуногенных композиций является то, что многочисленные антигенные детерминанты или многочисленные конформации одной линейной антигенной детерминанты могут присутствовать в одной синтетической вакцинной частице. Такие композиции с многочисленными антигенными детерминантами потенциально могут продуцировать антитела против многочисленных эпитопов, повышая вероятность того, что по меньшей мере некоторые антитела, продуцированные иммунной системой организма, будут нейтрализовать патоген или специфические антигены-мишени, например, на злокачественных клетках.
Иммуногенность иммуногенной композиции может быть увеличена целым рядом способов. В одном варианте осуществления, многослойная пленка необязательно содержит один или более дополнительных иммуногенных биоактивных молекул. Хотя это не является обязательным, одна или более дополнительных биоактивных молекул обычно будет содержать одну или более дополнительных антигенных детерминант. Подходящие дополнительные иммуногенные биоактивные молекулы включают, например, лекарственное средство, белок, олигонуклеотид, нуклеиновую кислоту, липид, фосфолипид, углевод, полисахарид, липополисахарид, иммуностимулирующую молекулу с низкой молекулярной массой или комбинацию, содержащую одну или более из указанных выше биоактивных молекул. Другие типы дополнительных усилителей иммунитета включают функциональный мембранный фрагмент, мембранную структуру, вирус, патоген, клетку, агрегат клеток, органеллу или комбинацию одной или более из указанных выше биоактивных структур.
В одном варианте осуществления многослойная пленка необязательно содержит одну или более дополнительных биоактивных молекул. Одна или более дополнительных биоактивных молекул может представлять собой лекарственное средство. Альтернативно, иммуногенная композиция находится в форме полой раковины или покрытия, окружающего ядро. Ядро содержит целый ряд различных инкапсулирующих веществ, например одну или более дополнительных биоактивных молекул, включая, например, лекарственное средство. Таким образом, иммуногенные композиции, сконструированные, как описано в настоящем изобретении, также могут быть использованы для комбинированной терапии, например, индуцируя иммунный ответ, и для направленной доставки лекарственного средства. «Ядра» микронного размера подходящего терапевтического вещества в «кристаллической» форме могут быть инкапсулированы иммуногенной композицией, содержащей антигенные полипептиды, и полученные в результате микрокапсулы могли быть использованы для доставки лекарственных средств. Ядро может быть нерастворимым в некоторых условиях, например при высоком рН или низкой температуре, и растворимым в условиях, при которых происходит контролируемое высвобождение. Поверхностный заряд на кристаллах можно определить путем измерения ζ-потенциала (используемого для определения заряда в электростатических единицах на коллоидных частицах в жидкой среде). Скорость, при которой содержимое микрокапсул высвобождается из внутреннего пространства микрокапсулы в окружающую среду, будет зависеть от ряда факторов, в том числе толщины инкапсулирующей оболочки, антигенных полипептидов, используемых в этой оболочке, наличия дисульфидных связей, степени перекрестного сшивания пептидов, температуры, ионной силы и способа, используемого для сборки пептидов. В основном, чем толще капсула, тем дольше время высвобождения.
В другом варианте осуществления дополнительная иммуногенная биомолекула представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, способную направлять синтез желаемого иммуногена в организме-хозяине или препятствовать экспрессии генетической информации из патогена. В первом случае такая последовательность нуклеиновой кислоты встроена, например, в подходящий вектор экспрессии способами, известными специалистам в данной области. Векторы экспрессии, подходящие для получения высокоэффективного переноса генов in vivo включают ретровирусные, аденовирусные и осповирусные векторы. Функциональные элементы таких векторов экспрессии включают по меньшей мере один промотор, по меньшей мере один оператор, по меньшей мере одну лидерную последовательность, по меньшей мере один стоп-кодон и любые другие последовательности ДНК, необходимые или предпочтительные для соответствующей транскрипции и последующей трансляции векторной нуклеиновой кислоты. В частности, предполагается, что такие векторы будут содержать по меньшей мере одну точку начала репликации, распознаваемую организмом-хозяином по меньшей мере наряду с одним селектируемым маркером и по меньшей мере одной промоторной последовательностью, способной инициировать транскрипцию последовательности нуклеиновой кислоты. В последнем случае, многочисленные копии такой последовательности нуклеиновой кислоты будут получены для доставки, например, путем инкапсулирования нуклеиновых кислот в полипептидной многослойной пленке в форме капсулы для внутривенной доставки.
В конструкции рекомбинантного вектора экспрессии дополнительно следует отметить, что многочисленные копии последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, и сопровождающие ее функциональные элементы могут быть встроены в каждый вектор. В таком варианте осуществления организм-хозяин продуцировал бы большие количества желаемого белка на вектор. Число многочисленных копий последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут быть встроены в векторы, ограничено только способностью полученного в результате вектора, вследствие его размера, к переносу и репликации и транскрипции в подходящем микроорганизме-хозяине.
Еще в одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит смесь антигенных полиэлектролитов/иммуногенных биоактивных молекул. Они могут быть получены из того же антигена, могут быть разными антигенами из одного и того же инфекционного агента или заболевания или они могут быть из разных инфекционных агентов или заболеваний. Этот комплекс или смесь, следовательно, будут вызывать иммунный ответ на ряд антигенов и, возможно, ряд инфекционных агентов или заболеваний, определенных компонентами антигенного пептида/белка системы доставки.
В одном варианте осуществления многослойная пленка/иммуногенная композиция вызывает ответ иммунной системы на патоген. В одном варианте осуществления вакцинная композиция содержит иммуногенную композицию в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Таким образом, способ вакцинации от патогенного заболевания включает введение пациенту, нуждающемуся в вакцинации, эффективного количества иммуногенной композиции.
Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются, крупные, медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, инактивированные вирусные частицы и подобное. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть использованы в этой композиции, например минеральные соли, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты или сульфаты, а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты или бензоаты. Композиция также может содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол, а также такие вещества, как увлажняющие агенты, эмульгаторы или рН буферные агенты. Липосомы также могут быть использованы в качестве носителей.
Способ индукции иммунного ответа на заболевание или патоген у позвоночного (например, вакцинация) включает введение иммуногенной композиции, содержащей многослойную пленку, содержащую эпитоп RSV. В одном варианте осуществления полиэлектролит, содержащий эпитоп RSV, является самым внешним или подвергающимся воздействию растворителя слоем многослойной пленки. Иммуногенную композицию можно вводить перорально, интраназально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, подъязычно, внутрикожно, пульмонально или чрескожно, либо с повторной дозой, либо без нее. В основном композиции вводят способом, совместимым с дозированным составом, и в таких количествах, которые будут профилактически и/или терапевтически эффективными. Точные количества вводимой иммуногенной композиции зависят от мнения лечащего врача и могут быть индивидуальными для каждого пациента. Специалисту в данной области будет очевидно, что терапевтически эффективное количество иммуногенной композиции будут зависеть, среди прочего, от схемы введения, единичной дозы вводимого антигена, вводят ли эти композиции в сочетании с другими терапевтическими средствами и иммунного статуса и состояния здоровья реципиента. Терапевтически эффективная доза может быть определена медицинским работником исходя из характеристик больного (возраст, масса тела, пол, состояние, осложнения, другие заболевания и т.д.), как хорошо известно в данной области. Более того, поскольку проводятся дополнительные рутинные исследования, более конкретная информация будет появляться в отношении соответствующих уровней доз для лечения различных заболеваний у различных пациентов, и специалист в данной области, принимая во внимание терапевтическую ситуацию, пол и общее состояние здоровья реципиента, сможет установить правильную дозу.
Иммуногенная композиция необязательно содержит адъювант. Адъюванты в основном содержат вещества, которые усиливают иммунный ответ организма-хозяина неспецифическим образом. Выбор адъюванта зависит от вакцинируемого пациента. Предпочтительно, используют фармацевтически приемлемый адъювант. Например, вакцина для человека должна избегать содержания масляных адъювантов или эмульсий углеводородов, в том числе полного и неполного адъюванта Фрейнда. Одним примером адъюванта, подходящего для использования у людей, являются алюмокалиевые квасцы (гель оксида алюминия). Вакцина для животного, однако, может содержать адъюванты, не подходящие для использования у людей.
Предполагается, что иммунный ответ может быть индуцирован через презентацию любого белка или пептида, способного индуцировать такой ответ. В одном варианте осуществления антиген представляет собой основной эпитоп, который вызывает сильный иммунный ответ на конкретный агент инфекционного заболевания, т.е. иммунодоминантный эпитоп. При необходимости, более одного антигена или эпитопа может быть включено в иммуногенную композицию для повышения вероятности иммунного ответа.
В одном варианте осуществления многочисленные пептиды RSV или пептидные эпитопы включены в пленку ELBL. Различные эпитопы могут быть синтезированы или экспрессированы в одной сконструированной пептидной молекуле. Ожидается, что расположение многочисленных эпитопов в одном сконструированном пептиде имеет определенные преимущества. Например, это должно упрощать процесс изготовления путем ELBL и повышать воспроизводимость. Кроме того, расположение многочисленных эпитопов в одном сконструированном пептиде будет фиксировать молярные соотношения различных эпитопов в желаемом соотношении, например 1:1. Альтернативно эпитопы могут быть встроены в отдельные сконструированные пептиды. Сконструированные пептиды встраивают в пленку ELBL во время одной или нескольких стадий наслоения. Изготовление пленок с использованием множества различных сконструированных пептидов также может представлять определенные преимущества. Это должно упростить синтез сконструированного пептида, снижая расходы. Также это должно обеспечить изменение и оптимизацию относительных доз каждого сконструированного пептида в пленке. Если, например, доклинические или клинические биологические данные показывали, что оптимальная вакцина должна содержать пять копий одного эпитопа на каждую копию второго эпитопа (соотношение 5:1), подход к конструированию пептида с отдельным эпитопом облегчил бы производство такой вакцины.
Сконструированные пептиды адсорбируют на поверхности пленок ELBL посредством электростатического притяжения между заряженными областями поверхностной адсорбции сконструированного пептида и противоположно заряженной поверхностью пленки. Эффективность адсорбции будет зависеть в значительной степени от состава области (областей) поверхностной адсорбции. Таким образом, сконструированные пептиды с различными эпитопами, но сходными областями поверхностной адсорбции будут адсорбироваться со сходной эффективностью. Для изготовления пленки с двумя разными сконструированными пептидами, каждый в молярном соотношении 1:1, можно смешать пептиды в этом молярном соотношении и нанести их одновременно на конкретный слой. Альтернативно, можно нанести каждый пептид отдельно на отдельные слои. Молярное соотношение адсорбированных пептидов будет в значительной степени отражать относительные концентрации, при которых они были нанесены, или количество стадий нанесения, во время которых они были встроены.
Количество сконструированных пептидов, включенных в ELBL пленку, можно измерить различными путями. Количественный анализ аминокислот (ААА) особенно хорошо подходит для этой цели. Пленки, содержащие сконструированные пептиды, распадаются до составляющих их аминокислот путем обработки концентрированной соляной кислотой (6 М) и нагревания, обычно при 115°С в течение 15 часов. Количества каждой аминокислоты затем измеряют с помощью хроматографических методик, хорошо известных специалистам в данной области. Аминокислоты, которые встречаются только в одном из сконструированных пептидов в пленке, могут быть использованы в качестве маркерных элементов для этого пептида. В тех случаях, когда сконструированные пептиды лишены уникальных аминокислот, неприродные аминокислоты (например, аминомасляная кислота или гомовалин) могут быть включены в сконструированные пептиды во время синтеза. Эти маркерные аминокислоты легко идентифицируются во время ААА эксперимента и могут быть использованы для определения количества пептида в пленке.
В контексте настоящего изобретения специфический Т-клеточный ответ представляет собой ответ, который является специфическим в отношении эпитопа, представляющего интерес, в частности эпитопа RSV, такого как эпитоп RSV-M2, описанный в настоящей заявке. Специфический Т-клеточный ответ может представлять собой либо цитотоксический Т-клеточный ответ, либо ответ Т-клеток хелперов, но который предпочтительно является цитотоксическим Т-клеточным ответом.
В контексте настоящего изобретения специфический антительный ответ представляет собой ответ, который является специфичным в отношении эпитопа, представляющего интерес, в частности эпитопа RSV, такого как эпитоп RSV-G, описанный в настоящей заявке.
В контексте настоящего изобретения «слой» означает наращивание толщины, например, на матрице для образования пленки, после стадии адсорбции. «Мультислой» означает множественные (т.е. два или более) наращивания толщины. «Полиэлектролитная многослойная пленка» представляет собой пленку, содержащую одно или более наращиваний толщины полиэлектролитов. После нанесения слои многослойной пленки могут не оставаться в виде дискретных слоев. В действительности, возможно, что существует значительное смешивание групп, в частности на границах раздела наращиваний толщины. Смешивание или его отсутствие можно отслеживать с помощью аналитических методик, например измерений ζ потенциала, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и вторичной ионной масс-спектрометрии времени пролета.
«Аминокислота» означает структурный элемент полипептида. В контексте настоящего изобретения «аминокислота» включает 20 основных природных L-аминокислот, все другие природные аминокислоты, все неприродные аминокислоты и все миметики аминокислот, например пептоиды.
«Природные аминокислоты» означают глицин плюс 20 основных природных L-аминокислот, то есть аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин, метионин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту, глутамин, аргинин, лизин, гистидин, фенилаланин, орнитин, тирозин, триптофан и пролин. «Неприродная аминокислота» означает аминокислоту, отличную от любой из 20 основных природных L-аминокислот. Неприродная аминокислота может иметь либо L-, либо D-стереохимию.
«Пептоид», или N-замещенный глицин, означает аналог соответствующего аминокислотного мономера с такой же боковой цепью, как в соответствующей аминокислоте, но с боковой цепью, присоединенной к атому азота аминогруппы, а не к α-углеродам этого остатка. Следовательно, химические связи между мономерами в полипептоиде не являются пептидными связями, которые могут быть использованы для ограничения протеолитического расщепления.
«Аминокислотная последовательность» и «последовательность» означает непрерывную длину полипептидной цепи, которая по меньшей мере составляет в длину два аминокислотных остатка.
«Остаток» означает аминокислоту в полимере или олигомере; это остаток аминокислотного мономера, из которого образуется полимер. Полипептидный синтез включает дегидрирование, то есть одна молекула воды «теряется» при добавлении аминокислоты к полипептидной цепи.
В контексте настоящего изобретения «пептид» и «полипептид» относятся к ряду аминокислот, соединенных одна с другой пептидными связями между альфа-амино и альфа-карбокси группами смежных аминокислот, и может содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, или быть свободным от них, при условии, что такие модификации или их отсутствие не разрушают иммуногенность. В контексте настоящего изобретения подразумевается, что термин «пептид» относится как к пептиду, так и к полипептиду или белку.
«Сконструированный полипептид» означает полипептид, который имеет достаточный заряд для стабильного связывания с противоположно заряженной поверхностью, то есть, полипептид, который может быть нанесен на слой многослойной пленки, где движущая сила для образования пленки является электростатической. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид составляет в длину по меньшей мере 15 аминокислот и величина суммарного заряда на остаток в полипептиде больше или равна 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5 при рН 7,0. В одном варианте осуществления соотношение количества заряженных остатков одинаковой полярности минус количество остатков противоположной полярности к общему количеству остатков в полипептиде больше или равно 0,5 при рН 7,0. Другими словами, величина суммарного заряда на остаток в полипептиде больше или равна 0,5. Хотя не существует абсолютного верхнего предела длины полипептида, в основном, сконструированные полипептиды, подходящие для нанесения путем ELBL, имеют практический верхний предел длины 1000 остатков. Сконструированные полипептиды могут включать последовательности, имеющиеся в природе, такие как эпитопы RSV, а также области, которые обеспечивают функциональную активность пептидов, например, заряженные области также называются в настоящей заявке областями поверхностной адсорбции, которые дают возможность наносить сконструированные полипептиды на полипептидную многослойную пленку.
«Первичная структура» означает непрерывную линейную последовательность аминокислот в полипептидной цепи, а «вторичная структура» означает более или менее правильные типы структуры в полипептидной цепи, стабилизированные нековалентными взаимодействиями, обычно водородными связями. Примеры вторичной структуры включают α-спираль, β-слой и β-виток.
«Полипептидная многослойная пленка» означает пленку, содержащую один или более сконструированных полипептидов, как определено выше. Например, полипептидная многослойная пленка содержит первый слой, содержащий сконструированный полипептид, и второй слой, содержащий полиэлектролит, имеющий суммарный заряд противоположной полярности по отношению к сконструированному полипептиду. Например, если первый слой имеет суммарный положительный заряд, второй слой имеет суммарный отрицательный заряд; и если первый слой имеет суммарный отрицательный заряд, второй слой имеет суммарный положительный заряд. Второй слой содержит другой сконструированный полипептид или другой полиэлектролит.
«Субстрат» означает твердое вещество с подходящей поверхностью для адсорбции полиэлектролитов из водного раствора. Поверхность субстрата может иметь, по существу, любую поверхность, например плоскую, сферическую, форму стержня и т.д. Поверхность субстрата может быть правильной или неправильной. Субстрат может представлять собой кристалл. Субстрат может представлять собой биологически активную молекулу. Субстраты классифицируются по размеру от наномерных до макромерных. Более того, субстрат необязательно содержит несколько небольших субчастиц. Субстрат может быть изготовлен из органического материала, неорганического материала, биоактивного материала или их сочетания. Неограничивающие примеры субстратов включают кремнийсодержащие подложки; заряженные коллоидные частицы, например микрочастицы СаСО3 или меламиноформальдегидной смолы; биологические клетки, такие как эритроциты, гепатоциты, бактериальные клетки или клетки дрожжей; органические полимерные каркасы, например каркасные структуры сополимеров полистирола или стирола; липосомы; органеллы и вирусы. В одном варианте осуществления субстрат представляет собой медицинское устройство, такое как искусственный водитель ритма, кохлеарный имплантат или стент.
В тех случаях, когда субстрат распадается или иным образом удаляется во время или после формирования пленки, его называют «матрицей» (для образования пленки). Частицы матрицы могут быть растворены в соответствующих растворителях или удалены термической обработкой. Например, в тех случаях, когда используют частично перекрестно сшитые меламинформальдегидные матричные частицы, матрица может распадаться под действием мягких химических способов, например в DMSO, или путем изменения значения рН. После растворения частиц матрицы остаются полые многослойные раковины, которые состоят из чередующихся полиэлектролитных слоев.
«Капсула» представляет собой полиэлектролитную пленку в форме полой раковины или покрытия, окружающего ядро. Ядро содержит целый ряд различных инкапсулятов, например белок, лекарственное средство или их сочетание. Капсулы с диаметрами примерно менее 1 мкм называются нанокапсулами. Капсулы с диаметром примерно более 1 мкм называются микрокапсулами.
«Перекрестное сшивание» означает образование ковалентной связи или нескольких связей или многих связей между двумя или более молекулами.
«Биологически активная молекула» означает молекулу, макромолекулу или совокупность макромолекул, обладающих биологическим действием. Специфическое биологическое действие может быть измерено в подходящем анализе и нормировано на единицу массы или на молекулу биологически активной молекулы. Биологически активная молекула может быть инкапсулирована, удерживаться в основе или быть инкапсулирована в пределах полиэлектролитной пленки. Неограничивающими примерами биологически активной молекулы являются: лекарственное средство, кристаллическая форма лекарственного средства, белок, функциональный фрагмент белка, комплекс белков, липопротеин, олигопептид, олигонуклеотид, нуклеиновая кислота, рибосома, активный терапевтический агент, фосфолипид, полисахарид, липополисахарид. В контексте настоящего изобретения «биологически активная молекула» дополнительно охватывает биологически активные структуры, например, такие как функциональный мембранный фрагмент, мембранная структура, вирус, патоген, клетка, агрегат клеток и органелла. Примерами белка, который может быть инкапсулирован или удерживается в основе полипептидной пленки, являются: гемоглобин; ферменты, например, такие как глюкозоксидаза, уреаза, лизоцим и подобные; белки внеклеточного матрикса, например фибронектин, ламинин, витронектин и коллаген; и антитело. Примерами клетки, которая может быть инкапсулирована или удерживаться в основе полиэлектролитной пленки, являются трансплантированные островковые клетки, эукариотические клетки, бактериальные клетки, клетки растений и клетки дрожжей.
«Биосовместимый» означает не вызывающий значительного неблагоприятного воздействия на здоровье при применении внутрь, наружном нанесении, чрескожном введении, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, ингаляции, имплантации или внутривенной инъекции. Например, биосовместимые пленки включают те, которые не вызывают значительной иммунной реакции при контакте с иммунной системой, например иммунной системой человека.
«Иммунный ответ» означает ответ клеточной или гуморальной иммунной системы на присутствие вещества в любом месте организма. Иммунный ответ может быть охарактеризован различными путями, например повышением в кровотоке числа антител, которые распознают определенный антиген. Антитела представляют собой белки, секретируемые В-клетками, а иммуноген представляет собой структуру, которая вызывает иммунный ответ. Организм человека борется с инфекцией и ингибирует повторное инфицирование путем повышения количества антител в кровотоке и в других местах.
«Антиген» означает чужеродное вещество, которое вызывает иммунный ответ (например, продукцию специфичных молекул антител) при введении в ткани восприимчивого организма позвоночного. Антиген содержит один или несколько эпитопов. Антиген может представлять собой чистое вещество, смесь веществ (в том числе клетки или фрагменты клеток). Термин «антиген» включает подходящую антигенную детерминанту, аутоантиген, собственный антиген, перекрестно реагирующий антиген, аллоантиген, толероген, аллерген, гаптен и иммуноген или их части и их сочетания и эти термины используют взаимозаменяемо. Антигены в основном имеют высокую молекулярную массу и в большинстве случаев являются полипептидами. Антигены, которые вызывают иммунные реакции, называют сильно иммуногенными. Участок на антигене, с которым может специфически связываться комплементарное антитело, называют эпитопом или антигенной детерминантой.
«Антигенный» относится к способности композиции вызывать образование антител, специфичных к этой композиции или вызывать опосредованный клетками иммунный ответ.
В контексте настоящего изобретения термины «эпитоп» и «антигенная детерминанта» используют взаимозаменяемо, и они означают структуру или последовательность антигена, например белка или сконструированного пептида, распознаваемую антителом. Обычно эпитоп будет находиться на поверхности белка. «Эпитоп непрерывного типа» представляет собой эпитоп, который включает в себя несколько смежных аминокислотных остатков, не тот, который включает в себя аминокислотные остатки, которые случайно оказываются в контакте или в ограниченной области пространства в уложенном белке. «Конформационный эпитоп» включает в себя аминокислотные остатки из различных частей линейной последовательности белка, которые приходят в контакт в трехмерной структуре белка. Для того чтобы между антигеном и антителом имело место эффективное взаимодействие, эпитоп должен быть легко доступен для связывания. Таким образом, эпитоп или антигенные детерминанты находятся в собственном антигенном клеточном окружении или только подвергаются воздействию при денатурации. В своей природной форме они могут быть цитоплазматическими (растворимыми), мембраносвязанными или секретируемыми. Количество, расположение и размер эпитопов будет зависеть от того, сколько антигенов презентировано во время процесса образования антител.
В контексте настоящего изобретения «вакцинная композиция» представляет собой композицию, которая индуцирует иммунный ответ у млекопитающего, которому введена эта композиция, и которая защищает иммунизированный организм от последующего заражения иммунизирующим агентом или иммунологически перекрестно реагирующим агентом. Защита может быть полной или частичной в отношении снижения симптомов или инфицирования по сравнению с невакцинированным организмом. Иммунологически перекрестно реагирующим агентом может быть, например, целый белок (например, глюкозилтрансфераза), из которого был получен субъединичный пептид для использования в качестве иммуногена. Альтернативно, иммунологически перекрестно реагирующий агент может быть другим белком, который распознается целиком или частично антителами, индуцированными иммунизирующим агентом.
В контексте настоящего изобретения «иммуногенная композиция» охватывает композицию, которая индуцирует иммунный ответ в организме, которому она введена, и которая может защищать или не защищать иммунизированное млекопитающее от последующего заражения иммунизирующим агентом. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция представляет собой вакцинную композицию. Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Синтез сконструированных полипептидов (DP)
Сконструированные полипептиды были получены из эпитопов, находящихся в последовательностях белков RSV-G, RSV-F или RSV-M2. Аминокислотные последовательности полноразмерных белков представляют собой следующее (выбранные пептидные эпитопы, встроенные в сконструированные полипептиды, подчеркнуты).
Сконструированные пептиды были синтезированы путем ступенчатого твердофазного синтеза пептидов использованием Liberty ТМ (СЕМ, Matthews, NC) автоматизированного синтезатора с микроволновым регулятором температуры. Пептиды были синтезированы либо на Rink Amide, либо на кислую полистироловую смолу Ванга с использованием стандартных Fmoc аминокислот, HBTU/DIEA активации и обычного двойного связывания. После синтеза смолы сушили и пептиды расщепляли путем обработки с использованием TFA/триизопропилсилана/фенола/3,6-диоксо-1,8-октандитиола/воды (86:4:4:3:3) в течение двух часов. Неочищенные пептиды осаждали эфиром, центрифугировали и сушили под вакуумом. Пептиды очищали с помощью C18 ВЭЖХ с обращенной фазой, используя градиент воды (0,1% трифторуксусной кислоты)/ацетонитрила. Подлинность каждого очищенного пептида подтверждали масс-спектрометрией с электрораспылением (ESMS). Окончательный выход рассчитывали по УФ-поглощению при 280 нм и/или аминокислотным анализом. Пептиды были поделены на аликвоты, лиофилизированы и хранились в виде трифторацетатных солей при температуре -20°С до использования.
В Таблице 1 показаны выбранные эпитопы из белков RSV-G, RSV-F и RSV-M2. Каждый эпитоп был включен в сконструированный пептид (DP) путем добавления C-концевого полиионного хвоста, такого как Lys20 (K20) или Lys-Val-Lys-Ala повтора (KVKA)4. C-концевой тирозин, как правило, был включен в целях облегчения количественного анализа с помощью УФ. Нативная последовательность RSV-M2 содержит цистеин в положении 96. В синтетических эпитопных пептидах этот остаток был заменен на серин (C96S) для того, чтобы избежать нежелательных дисульфидных связей в этом положении.
Таблица 1 | |||
Последовательности и характеристики выбранных эпитопов RSV | |||
Обозначение | Последовательность эпитопа | SEQ ID NO: | Объяснение или описание |
G164-198 | HFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNK | 4 | Консервативная последовательность, содержащая химокиновый мотив, ассоциированный с воспалением |
F51-65 | GWYTSVITIELSNIK | 5 | Консервативные эпитопы CD4+ (Th1), которые индуцируют реакции IFNγ |
F338-354 | DRGWYSDNAGSVSFFRG | 6 | Консервативные эпитопы CD4+ (Th1), которые индуцируют реакции IFNγ |
ACT-2019 | ESYIGSINNITKQSA | 7 | М281-95; CD8+ Т-клеточная мишень, которая, как показано, модулирует Th2 ответы на RSV-G |
ACT-2044 | HFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 8 | RSV-G164-191K21Y амид |
ACT-2054 | HFEVFNFVPXSIXSNNPTXWAIXKRIPNKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 9 | RSV-G164-191K21Y амид с кэппированными остатками цистеина C* = карбоксамидо-метилцистеин |
G175-184 | cyclo-ICSNNPTCWA | 10 | RSV-G175-184 |
Обозначение | Последовательность эпитопа | SEQ ID NO: | Объяснение или описание |
ACT-2042 | NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 11 | RSV-G169-191K21Y |
ACT-2031 | ESYIGSINNITKQSASVAKVKAKVKAKVKAKVKA | 12 | RSV-M281-98 (KVKA)4 амид |
ACT-2086 | ESYIGSINNITKQSASGSHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 13 | RSV-M281-98G164-191K20Y амид |
ACT-2087 | NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 14 | RSV-G169-198K20Y амид |
ACT-2088 | HFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 15 | RSV-G164-198K20Y амид |
ACT-2033 | ESYIGSINNITKQSASVAKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY | 16 | RSV M281-98K20Y амид |
Пример 2: Укладка и структурная конформация сконструированных полипептидов, которые содержат конформационный эпитоп из белка RSV-G
Белок прикрепления RSV (RSV-G белок) содержит четыре консервативных остатка цистеина, которые образуют две внутренние дисульфидные связи, расположенные в пределах аминокислот 169-191. Антитела, которые распознают эту область, могут нейтрализовать RSV так, чтобы конформационно-ограниченные синтетические пептиды, полученные из этого сегмента, могли бы быть эффективными компонентами вакцины. Предыдущие исследователи использовали сочетание протеолитического расщепления, ВЭЖХ и масс-спектрометрии, чтобы показать, что Cys173 связывается с Cys186 и что Cys176 связывается с Cys182. Пептиды, содержащие остатки 169-191 белка RSV-G, были синтезированы твердофазным пептидным синтезом. При нейтральном рН эти белки легко окисляются и полученные в результате продукты, по-видимому, содержат два внутренних дисульфида, как определено потерей четырех протонов в спектре ESMS, а также отрицательным сигналом в исследовании Эллмана (DTNB). Легкость, с которой проходят реакции окисления, и точность превращений убедительно иллюстрируют, что образуются нативные дисульфиды. В характерном эксперименте восстановленные пептиды RSV-G (например, SEQ ID NO:8, 11, 13, 14, 15) растворяют при концентрации 1-5 мг/мл в Трис-буфере с рН 7,4, содержащем 2,5 мМ глутатиона и 2,5 мМ глутатиола. Реакцию сворачивания контролируют с помощью C18 ВЭЖХ с обращенной фазой, поскольку окисленный продукт показывает сдвиг к несколько более короткому времени удерживания по сравнению с восстановленным белком. По этому критерию реакцию сворачивания считают завершенной после 2 часов при комнатной температуре или после 18 часов при 4°С.
Образец свернутого ACT-2044 (RSV-G164-191K21Y амид) (SEQ ID NO:8) был проанализирован с помощью масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием с электрораспылением (FT-ICR MS). Заряженное состояние МН6 +6 дало сильный сигнал, и расширенный спектр МН6 +6 пиков показан на Фигуре 1. Моноизотопный пик при массе к заряду (m/z) 1015,6008 соответствует моноизотопной массе 6087,56 а.е.м., которая очень близка к расчетной моноизотопной массе 6088,51 а.е.м., и этот результат полностью согласуется с наличием двух дисульфидных связей в АСТ-2044. Точно так же образец свернутого ACT-2086 (RSV-M281-98G164-191K20Y амида (SEQ ID NO:13) был проанализирован с помощью FT-ICR MS и спектр показан на Фигуре 2. Сильные пики наблюдались для заряженных состояний МН6 +6 - МН10 +10. МН9 +9 моноизотопный пик имел m/z 867,1571, соответствующий моноизотопной массе 7795,344 а.е.м., которая очень близка к расчетной моноизотопной массе 7795,33 а.е.м. Этот результат снова полностью согласуется с наличием двух дисульфидных связей.
Образец ACT-2044 (RSV-G164-191K21Y) (SEQ ID NO:8) подвергали расщеплению термолизином. ВЭЖХ анализ продукта расщепления показал полный расход исходного белка. FT-ICR спектр этого продукта содержал сложную смесь продуктов, но доминирующий ион был обнаружен при m/z 1106,4. Эти продукты реакции соответствуют заряженному состоянию MH+1 для внутримолекулярных связанных дисульфидами RSV-G175-184 (цикло-ICSNNPTCWA (SEQ ID NO:10), ожидаемая MH+ масса=1106,440, найденная=1106,438). Этот пептид является отличительным для нативной дисульфидной связи между Cys176 и Cys182. Таким образом, данные FT-ICR MS всецело поддерживают утверждение, что АСТ-2044 (и близкородственные белки ACT-2042 (SEQ ID NO:11), ACT-2086 (SEQ ID NO:13), ACT-2087 (SEQ ID NO:14), ACT-2088 (SEQ ID NO:15)) содержат две внутренние дисульфидные связи в соответствующем (нативном) образце.
Пример 3: Общая методика изготовления ELBL наночастиц
Наночастицы СаСО3 (NPCC-111) получали от NanoMaterials Technology (Singapore). Эксперименты, проведенные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), показали, что частицы имеют кубическую морфологию и в диаметре составляют приблизительно 50 нм. Полипептиды поли-l-лизин 15 кДа (PLL, № по каталогу Р6516), поли-l-глутаминовую кислоту 14,5 кДа (PGA, № по каталогу Р4636) и 1 М буферный раствор HEPES (№ по каталогу Н-3662) получали от Sigma-Aldrich (USA). Противоположно заряженные полипептиды оставляли для самосборки в многослойную пленку на ядрах наночастиц СаСО3 в следующих одна за другой стадиях адсорбции. Вкратце, PLL, PGA или сконструированный полипептид (DP, где указано) растворяли до концентрации 1 мг/мл (масса/объем) в 10 мМ HEPES, рН 7,4, и фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Ядра наночастиц СаСО3 промывали три раза свободной от эндотоксина водой и центрифугировали при 16000 g в течение 1 минуты в микроцентрифуге. Наночастицы ресуспендировали до 6% (масса/объем) в 1 мг/мл PGA в качестве первого слоя. При нейтральном рН PGA демонстрирует суммарный отрицательный заряд, тогда как суммарный заряд частиц СаСО3 является положительным, таким образом, обеспечивая электростатическое взаимодействие и успешное нанесение первого слоя. Смесь подвергали воздействию ультразвука в течение 10 минут при комнатной температуре, затем промывали дважды 10 мМ буфером HEPES и центрифугировали при 48700×g в течение 1 минуты (TL-100 Ultracentrifuge, Beckman). Для нанесения второго слоя наночастицы ресуспендировали до 6% (мас./об.) в 1 мг/мл PLL (положительный заряд) и подвергали воздействию ультразвука в течение 10 минут при комнатной температуре также как и в случае первого слоя. Каждый последующий слой наносили таким же способом, используя PGA, PLL или DP, как указано в Таблице 2 или в Таблице 3. Обычно сконструированные пептиды наносили в концентрации 0,5-1,0 мг/мл. После нанесения конечного слоя наночастицы промывали дважды с использованием 10 мМ HEPES, рН 7 4 и аликвоты осаждали центрифугированием, аспирировали и хранили в виде сырых гранул при 4°С до использования. Несколько конструкций было получено с использованием в основном одной и той же методики и изменением последовательности и расположения сконструированного пептида; все наночастицы содержат всего восемь слоев в полипептидной биопленке. Конструкции наночастиц суммированы в Таблице 2. Концентрацию полипептида или DP на наночастицах определяли анализом аминокислот. Размер наночастиц определяли с помощью динамического рассеяния света (Malvern Nano S-90) 0,06% (мас./об.) суспензий в HEPES, рН 7,4, подвергали воздействию ультразвука в течение 20 минут в ультразвуковой водяной бане (Branson 1510, USA) до измерения. Уровни эндотоксина в наночастицах определяли анализом лизата амебоцитов мечехвоста, хромогенного анализа конечной точки (#50-647U, Lonza, Walkersville, MD). Полученные наночастицы хранили в виде сырых гранул ри 4°С до готовности к использованию.
Таблица 2 | |||
Конструкции моновалентных наночастиц. ACT # относится к обозначению различных конструкций наночастиц. DP # относится к различным сконструированным пептидам. Последовательность DP перечисляет специфичные эпитопы RSV и полиионный хвост, включенный в каждый DP | |||
ACT# | Слои | DP ACT# | Последовательность DP |
1023 | PGA/PLL/PGA/RSV-M2/PGA/PLL/PGA/PLL | 2031 | RSV-M281-98(KVKA)4 (SEQ ID NO:12) |
1041 | PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/RSV-G | 2042 | RSV-G169-191K21Y (SEQ ID NO:11) |
1042 | PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/RSV-G | 2044 | RSV-G164-191K21Y (SEQ ID NO:8) |
Пример 4: Изготовление и характеристика ELBL наночастицы ACT-1077
Стандартная методика, описанная в Примере 3, представляла собой следующее. 1,0 мг/мл раствора сконструированного пептида ACT-2031 (RSV-M281-98(KVKA)4 (SEQ ID NO:12)) использовали во время второй стадии нанесения покрытия путем ELBL, и 1,0 мг/мл раствора сконструированного пептида АСТ-2044 (RSV-G164-191K21Y (SEQ ID NO:8)) использовали во время восьмой стадии ELBL. После каждой стадии наслоения наночастицы промывали и ресуспендировали до 6%. Аликвоту 10 мкл удаляли и разбавляли в 1,0 мл 10 мМ буфера HEPES для анализа поверхностного (зета) потенциала. На Фигуре 3 показаны поверхностные зета потенциалы, измеренные для наночастиц в каждой стадии ELBL процесса. Перед нанесением покрытия частицы СаСО3 демонстрировали положительный поверхностный потенциал примерно +28 мВ. После нанесения одного слоя PGA был измерен отрицательный поверхностный потенциал -18 мВ. Нанесение ACT-2031 (SEQ ID NO:12) на втором слое увеличивало зета потенциал примерно до 0 мВ, указывая на адсорбцию пептида. В дальнейшем каждая стадия наслоения вызывала отрицательный или положительный сдвиг в зета потенциале, указывая на успешную ELBL адсорбцию. После изготовления количество каждого адсорбированного сконструированного пептида вычисляли по сигналу от уникальных аминокислот в аминокислотной хроматограмме. Глицин является уникальным для АСТ-2031 и может быть использован для определения концентрации АСТ-2031, тогда как аргинин, гистидин и фенилаланин являются уникальными для ACT-2044 и могут быть использованы для определения концентрации ACT-2044. Из четырех отдельных партий средние количества ACT-2031 и ACT-2044, адсорбированные на 1% суспензии частиц СаСО3, составляли 21 мкг/мл и 53 мкг/мл соответственно.
Пример 5: Изготовление ELBL наночастицы ACT-1086
Методику нанесения покрытия ELBL, описанную в Примере 3, использовали для нанесения 50 нм наночастиц СаСО3 с семью слоями PGA и PLL. 0,5 мг/мл раствора сконструированного пептида ACT-2086 (SEQ ID NO:13; RSV-M281-98G164-191K20Y амид) в 10 мМ буфере HEPES использовали для нанесения конечного слоя. Количество адсорбированного сконструированного пептида измеряли аминокислотным анализом. Из трех отдельных партий среднее количество АСТ-2086, адсорбированного на 1% суспензии частиц СаСО3, составило 37 мкг/мл.
Пример 6: Изготовление ELBL наночастиц ACT-1139
ELBL методику нанесения покрытий, описанную в Примере 3, использовали для покрытия 50 нм наночастиц СаСО3 семью слоями PGA и PLL. 10 мМ раствор HEPES сконструированных пептидов ACT-2033 (SEQ ID NO:16; RSV M281-98 K20Y амид) и ACT-2044 (SEQ ID NO:8; RSV-G161-191 K21Y амид) каждый в конечной концентрации 0,25 мг/мл использовали для нанесения конечного слоя. Наночастицы промывали, осаждали и хранили в виде сырых гранул при 4°С. Количества каждого адсорбированного сконструированного пептида вычисляли по сигналу от уникальных аминокислот в аминокислотной хроматограмме. Глицин является уникальным для АСТ-2033 и может быть использован для определения концентрации АСТ-2033, тогда как аргинин, гистидин и фенилаланин являются уникальными для АСТ-2044 и могут быть использованы для определения концентрации ACT-2044. По результатам этого анализа определили, что 1% суспензия частиц содержала 25 мкг/мл АСТ-2033 и 24 мкг/мл ACT-2044.
Пример 7: Изготовление путем ELBL микрочастиц АСТ-1145
Микрочастицы Mesoporous 3 μm СаСО3 получали от PlasmaChem GmbH (Berlin, № по каталогу PL-CA3). Частицы суспендировали до 6% (масса/объем) в 10 мМ HEPES. Методику нанесения покрытия ELBL, описанную для наночастиц СаСО3 в Примере 3, использовали со следующими модификациями. Наночастицы СаСО3 3 мкм без труда оседали в условиях нормальной гравитации в водной суспензии, поэтому вместо обработки ультразвуком во время стадий нанесения слоев суспензии осторожно перемешивали на роторной установке в течение 10 минут. Также более медленные скорости центрифугирования могут быть использованы для гранулирования микрочастиц на последующих стадиях нанесения слоев и стадиях промывания. Таким образом, суспензии микрочастиц подвергали центрифугированию при 1500 g в течение 1 минуты. Для изготовления ACT-1145 использовали 1,0 мг/мл раствор PGA для нанесения первого слоя и 1,0 мг/мл слой PLL, меченный флуоресцеином (PLL-FITC, Sigma № по каталогу Р3543), использовали для второго слоя. PGA и PLL использовали для следующих пяти стадий нанесения слоев для покрытия микрочастиц суммарно семью полипептидными слоями (эти частицы могут быть использованы в эксперименте амидного поперечного связывания, описанного в Примере 8). Раствор 0,5 мг/мл ACT-2086 (SEQ ID NO:13; RSV-M281-98G164-191K20Y амид) использовали для нанесения конечного слоя. Микрочастицы промывали, центрифугировали и хранили в виде сырых гранул при 4°С. Количество АСТ-2086, адсорбированного на частицах, вычисляли с помощью анализа аминокислот, и было установлено, что оно составляет 43 мкг/мл для 1% суспензии частиц. Частицы изучали с помощью флуоресцентной микроскопии, было обнаружено, что они являются сферическими с диаметрами 3,0 (+/-1,5) мкм. Частицы представляли собой хорошо диспергированные одиночные частицы с несколькими агрегатами из двух или трех частиц.
Пример 8: Изготовление ELBL микрочастиц АСТ-1146
Методику Примера 7 использовали для изготовления 3 мкм микрочастиц СаСО3 с семью полипептидными слоями (PGA/PLL-FITC/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA). Готовили свежие растворы 0,2 М фосфатно-натриевого буфера рН 6,5, содержащего 38 мг/мл (0,20 М) 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC, Sigma № по каталогу Е6383) и 11 мг/мл (0,05 М) N-гидроксисульфосукцинимид натриевой соли (сульфо-NHS, Sigma № по каталогу 56485). Семислойные микрочастицы суспендировали в растворе EDC/сульфо-NHS до 3% суспензии. Суспензию осторожно перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре, затем частицы центрифугировали и промывали три раза 10 мМ буфером HEPES. 0,5 мг/мл раствор ACT-2086 (SEQ ID NO:13; RSV-M281-98G164-191 K20Y амид) использовали для нанесения конечного слоя. Микрочастицы промывали, центрифугировали и хранили в виде сырых гранул при 4°С. Количество ACT-2086, адсорбированного на частицах, вычисляли с помощью анализа аминокислот, и было обнаружено, что оно составляет 49 мкг/мл для 1% суспензии частиц.
Пример 9: Изготовление ELBL микрокапсулы АСТ-1147
Микрочастицы СаСО3 АСТ-1146 из Примера 8 суспендировали до 6% (масса/объем) в растворе 0,5 М EDTA натрия, рН 8,0. Частицы осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, центрифугировали в течение 3 минут при 1500 g и раствор EDTA аспирировали. Полученные в результате микрокапсулы дважды ресуспендировали в 10 мМ буфере HEPES и центрифугировали в течение 3 минут при 1500 g для удаления избытка солей. Микрокапсулы центрифугировавли, аспирировали и хранили в виде сырых гранул при 4°С. Количество ACT-2086, адсорбированного на капсулах, вычисляли с помощью анализа аминокислот, и было обнаружено, что оно составляет 41 мкг/мл для 1% суспензии частиц. Капсулы изучали посредством флуоресцентной микроскопии, и было обнаружено, что они являются сферическими с диаметрами 3,0 (+/-1,5) мкм. Капсулы представляли собой хорошо диспергированные одиночные капсулы с небольшим числом агрегатов из двух или трех капсул.
Пример 10: Иммуногенность RSV-G моновалентных наночастиц
Мышей BALB/c иммунизировали три раза наночастицами ACT-1042 (DP SEQ ID NO:8; RSV-G164-191) посредством инъекции в подушечки лап и образцы сыворотки собирали и тестировали посредством ELISA. Образцы сыворотки распознавали конформационный RSV-G СХ3С эпитопный пептид АСТ-1042 (Фигура 4), но не вариант того же пептида (АСТ-2054), который был линеаризован путем кэппирования остатков цистеина (Фигура 5). Образцы сыворотки также распознавали нативный белок RSV-G (Фигура 6), давая возможность предположить, что иммунизация наночастицами RSV-G ELBL вызывала конформационно-зависимые антительные ответы. Биологическая активность антительного ответа, индуцированного под действием ACT-1042, была подтверждена в исследованиях, измеряющих ингибирование RSV-G СХ3С хемокинового связывания (Фигура 7) и ингибирование миграции РВМС человека к очищенному RSV-G (Фигура 8). Таким образом, конструкция новой вакцины на основе наночастиц, которая включает сконструированный пептид на основе конформационно ограниченного RSV-G СХ3С эпитопа, может вызывать биологически релевантные антительные ответы.
Пример 11: Иммуногенность моновалентных наночастиц RSV-M2
Мышей BALB/c иммунизировали наночастицами ACT-1023 (RSV-M281-98) (DP SEQ ID NO:12) путем s.c. (подкожного), i.p. (внутрибрюшинного), i.n. (интраназального) введения или в подушечки лап. Мышей положительного контроля иммунизировали подкожно пептидом ACT-2019 (RSV-M281-95; SEQ ID NO:7) в полном адъюванте Фрейнда (CFA) и повторно иммунизировали АСТ-2019 в неполном адъюванте Фрейнда (IFA); неиммунизированные мыши служили в качестве отрицательного контроля. Т-клеточные ответы в селезенках измеряли в анализах IL-4 и IFNγ ELISPOT через 14 дней после иммунизации. Данные, приведенные на Фигуре 9, показывают, что иммунизация с использованием ACT-1023 индуцировала слабые IL-4 ELISPOT, как ожидалось для эпитопа CD8, содержащегося в DP. Напротив, мыши, иммунизированные посредством инъекции в подушечки лап, давали в результате сильные IFNγ реакции после однократной иммунизации. Группы s.c. и i.p. введения в результате давали менее мощные реакции, которые все же были сравнимы с группой положительного контроля CFA. Интраназальная доставка, по-видимому, не является иммуногенной в этом эксперименте. Иммунизация одним только пептидом давала в результате низкие уровни IFNγ реакций. Таким образом, авторы изобретения подтвердили, что эффективность пептида RSV-M2 значительно увеличивается путем заключения его в наночастицу ELBL.
Пример 12: Улучшенная иммуногенность RSV-G и RSV-M2 наночастиц при объединении в мультивалентную смешанную вакцину
Иммунизация мышей любой моновалентной вакциной на основе наночастиц индуцировала прогнозируемые иммунные реакции (см. Фигуры 4-8 и 9). Интересно отметить, что для антительных ответов, представленных на Фигурах 4-8, требовались три иммунизации (первичная + две повторные), тогда как для Т-клеточных реакций, представленных на Фигуре 9, требовалась только одна иммунизация (первичная). Для определения, могла ли мультивалентная вакцина на основе наночастиц, содержащая как RSV-G, так и RSV-M2, улучшать иммунную силу RSV-G компонента, мышей иммунизировали смесью RSV-G (ACT-1042,1 мкг DP на дозу) и RSV-M2 (ACT-1023, 5 мкг DP на дозу) наночастиц, доставляемых либо посредством инъекции в подушечки лап, либо интраназально. Титры антител после первичной иммунизации и после повторной иммунизации измеряли с помощью ELISA и Т-клеточные реакции после повторной иммунизации контролировали с помощью ELISPOT. Ни одна из мышей, получавших любую из этих конструкций, не имела измеряемого первичного антительного ответа (данные не показаны). На Фигуре 10 показаны результаты измерения посредством ELISA RSV-G-специфичных IgG после повторной иммунизации. У мышей, которые получали только АСТ-1042, только введение в подушечки лап в результате приводило к определяемым титрам. Добавление RSV-M2 наночастицы в группу введения в подушечки лап давало в результате титры антител, равные таковым, индуцированным под действием 5 мкг RSV-G пептида в CFA. Интраназальное введение смеси индуцировало титры почти такие же, что и f.p. инъекция только RSV-G наночастиц, тогда как i.n. введение только RSV-G наночастиц не индуцировало определяемых титров антител при повтрной иммунизации. Эти результаты демонстрируют, что включение RSV-M2 наночастиц, по-видимому, повышает эффективность антительного эпитопа в RSV-G и что i.n. введение наночастиц может индуцировать иммунный ответ.
Т-клеточные реакции у тех же мышей измеряли с помощью ELISPOT. На Фигуре 11 показано, что у мышей, иммунизированных посредством f.p. с использованием RSV-М2-содержащей наночастицы или смеси, повышался Т-клеточный ответ против эпитопа М2, который почти полностью представлял собой IFNγ, как ожидалось. При интраназальном введении только наночастиц RSV-M2 (ACT-1023) Т-клеточные реакции не индуцировались. Напротив, совместное введение RSV-M2 и RSV-G наночастиц (смесь) индуцировало мощный IFNγ ответ, который был сравним с таковым, индуцированным под действием иммунизации в подушечки лап только RSV-M2.
Т-клеточные реакции также изучали в in vivo анализе CTL, в котором измеряют активность цитотоксических Т-клеток у животного-хозяина. В моновалентной группе мышей BALB/c иммунизировали посредством введения в подушечки лап однократной инъекции PBS (отрицательный контроль), пептида АСТ-2031 (RSV-M2) в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) или наночастицы ACT-1023 (RSV-M2). В мультивалентной группе мышей иммунизировали PBS, пептидом ACT-2031 (RSV-M2) плюс пептид АСТ-2044 (RSV-G) в IFA или ACT-1023 (RSV-M2) плюс ACT-1042 (RSV-G). Спустя семь дней клетки-мишени RSV-M2 получали путем примирования сингенных нативных клеток селезенки пептидом ACT-2031 и мечения высокой дозой флуоресцентной метки CFSE, тогда как контрольные клетки-мишени получали путем мечения сингенных нативных клеток селезенки низкой дозой CFSE и без целевого пептида. Две популяции клеток, меченных CFSE, перемешивали в соотношении 1:1 и 5×106 клеток вводили внутривенно иммунизированным мышам, в которых они направлялись обратно в селезенку организма-хозяина. Через 24 часа иммунизированных мышей скарифицировали и клетки селезенок анализировали на CFSE флуоресценцию для мониторинга выживания двух клеточных популяций. На Фигуре 12 крайние левые пики на гистограммах представляют выживание контрольных клеток-мишеней, а крайние правые пики представляют выживание клеток-мишеней, меченных RSV-M2. Как ожидалось, обе клеточные популяции выживали одинаково у неиммунизированных мышей (PBS). Напротив, у мышей, иммунизированных пептидом ACT-2031/IFA, приблизительно 18% клеток-мишеней RSV-M2 были уничтожены (сравнить размер правого пика с размером левого пика на гистограмме ACT-2031/IFA). Аналогичные результаты были получены у мышей, иммунизированных высокой дозой (75 мкг) наночастиц ACT-1023, по сравнению с неуничтожением меченых клеток-мишеней у мышей, иммунизированных более низкой дозой (10 мкг) ACT-1023. У мышей, иммунизированных комбинацией двух пептидов или двух наночастиц, наблюдалась более высокая степень уничтожения меченых клеток-мишеней. В частности, у мышей, иммунизированных смесью наночастиц (ACT-1023 + ACT-1042 по 10 мкг каждого), было уничтожено 35% меченных клеток-мишеней RSV-M2, что выше реакции, индуцированной даже высокой дозой моновалентной иммунизации (ACT-1023/75 мкг). Процент специфичного уничтожения клеток-мишеней, меченных RSV-M2, суммирован на Фигуре 13. Эти результаты согласуются с повышенными количествами IFNγ ELISPOT, определяемыми у мышей, иммунизированных смесью наночастиц RSV-G и RSV-M2 (смотри Фигуры 10, 11). Эти данные дают возможность предположить, что сочетание наночастиц RSV-G и RSV-M2 в смешанной вакцине обеспечивает взаимное улучшение иммунологической эффективности обоих компонентов. Тогда как улучшение антительного ответа на RSV-G (Фигура 10) могло быть приписано помощи Т-клеток, индуцированных RSV-M2, реципрокное улучшение Т-клеточного ответа на RSV-M2 после интраназального введения смеси (Фигура 11) было неожиданным.
Пример 13: Конструирование мультивалентной наночастицы
Дополнительные наночастицы были сконструированы для включения многочисленных эпитопов в одну и ту же частицу либо в виде отдельного DP с совместными слоями в одной и той же частице, либо в виде слитого DP, содержащего как RSV-G, так и RSV-M2 эпитопы. В Таблице 3 описана схема построения наночастиц с многочисленными эпитопами RSV, а в Таблице 4 описаны последовательности DP, использованные в каждой наночастице. Наночастицы ACT-1077-1079 содержат Т-клеточный эпитоп RSV-M2 в одном или многочисленных слоях, а B-клеточный эпитоп RSV-G - в восьмом слое. Наночастицы ACT-1086-1088 содержат спаренные эпитопные пептиды АСТ-2086-2088 соответственно, расположенные только в восьмом слое. Дополнительные конструкции могут быть представлены с использованием тех или иных эпитопов RSV либо с совместно нанесенными слоями, либо в одном слитом пептиде.
Таблица 3: Схема построения конструкций мультивалентных RSV наночастиц, RSV микрочастиц и RSV микрокапсул. ACT-1077-1079 содержат два отдельных DP, расположенных в различных слоях в одной и той же наночастице ELBL. ACT-1139 содержит два отдельных DP, расположенных в восьмом слое в той же наночастице ELBL. ACT-1086-1088 содержат один слитый пептид, включающий как антительные, так и Т-клеточные целевые эпитопы, расположенные в восьмом слое наночастицы ELBL. ACT-1145 и -1146 содержат один слитый пептид, включающий как антительные, так и Т-клеточные целевые эпитопы, расположенные в восьмом слое микрочастиц ELBL. ACT-1147 содержит один слитый пептид, включающий как антительные, так и Т-клеточные эпитопы, расположенные в восьмом слое микрокапсул ELBL
ACT # | Слои | DP ACT # | Последовательность DP |
1077 | PGA/RSV-M2/(PGA/PLL)2/PGA/RSV-G | 2031 | RSV-M281-98(KVKA)4 (SEQ ID NO:12) |
2044 | RSV-G164-191K21Y (SEQ ID NO:8) | ||
1078 | (PGA/RSV-M2)2/PGA/PLL/PGA/RSV-G | 2031 | RSV-M281-98(KVKA)4 (SEQ ID NO:12) |
2044 | RSV-G164-191K21Y (SEQ ID NO:8) | ||
1079 | (PGA/RSV-M2)3/PGA/RSV-G | 2031 | RSV-M281-98(KVKA)4 (SEQ ID NO:12) |
2044 | RSV-G164-191K21Y (SEQ ID NO:8) | ||
1086 | (PGA/PLL)3/PGA/RSV-G+M2 | 2086 | RSV-M281-98G164-191K20Y (SEQ ID NO:13) |
1087 | (PGA/PLL)3/PGA/RSV-G | 2087 | RSV-G169-198K20Y (SEQ ID NO:14) |
1088 | (PGA/PLL)3/PGA/RSV-G | 2088 | RSV-G164-198K20Y (SEQ ID NO:15) |
1139 | PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/RSV-M2 + RSV-G mixed | 2033 | RSV M281-98K20Y (SEQ ID NO:16) |
2044 | RSV-G164-191K21Y (SEQ ID NO:8) |
ACT # | Слои | DP ACT # | Последовательность DP |
1145 | PGA/PLL-FITC/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/RSV-G | 2086 | RSV-M281-98G164-191K20Y (SEQ ID NO:13) |
1146 | PGA/PLL-FITC/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/RSV-G | 2086 | RSV-M281-98G164-191K20Y (SEQ ID NO:13) |
1147 | PGA/PLL-FITC/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA/RSV-G | 2086 | RSV-M281-98G164-191K20Y (SEQ ID NO:13) |
Таблица 4 | ||||
Последовательности DP RSV использованных в мультивалентных конструкциях наночастиц ELBL в Таблице 3. В-клеточные эпитопы показаны подчеркнутыми, Т-клеточные эпитопы показаны жирным шрифтом, консервативные цистеины заштрихованы, ненативная последовательность показана курсивом | ||||
Последовательность белка М2 | Связь | Последовательность G белка | Хвост | |
АСТ-2031 | ESYIGSINNITKQSA SVA SEQ ID NO:12 | (KVKA)4 SEQ ID NO:16 | ||
АСТ-2033 | ESYIGSINNITKQSA SVA SEQ ID NO:12 | K20Y SEQ ID NO:17 | ||
АСТ-2042 | NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPN SEQ ID NO:18 | K21Y SEQ ID NO:19 | ||
АСТ-2044 | HFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPN SEQ ID NO:20 | K21Y | ||
АСТ-2086 | ESYIGSINNITKQSA SEQ ID NO:7 | SGS | HFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPN SEQ ID NO:21 | K20Y |
Последовательность белка М2 | Связь | Последовательность G белка | Хвост | |
ACT-2087 | NFVPCSICSNNPTCWA ICKRI PNKKPGKKT SEQ ID NO:22 | K20Y | ||
ACT-2088 | HFEVFNFVPCSICSNN PTCWAICKRI PNKKP GKKT SEQ ID NO:23 | K20Y |
Пример 14: Дозозависимость конструкций DP-наночастиц
Одну и ту же дозу сконструированного пептида (1 мкг) использовали как в группе положительного контроля (CFA), так и наночастиц (1042). В предыдущих экспериментах 5-10 мкг использовали для CFA и 1 мкг - для наночастицы. Эти результаты показывают, что в эквивалентных дозах наночастицы являются более иммуногенными, чем CFA контроль.
Таблица 5 | |
Группы для RSV смешанного исследования | |
Группа | Описание |
1 | Нативная |
2 | (ACT-2044 + ACT-2031)/CFA(IFA) подкожно |
3 | ACT-1042 1 мкг в подушечки лап |
4 | ACT-1042 1 мкг + ACT-1023 1 мкг в подушечки лап |
5 | ACT-1077 1 мкг в подушечки лап |
6 | ACT-1078 1 мкг в подушечки лап |
7 | ACT-1079 1 мкг в подушечки лап |
Данные показаны на Фигурах 14-16.
Пример 15: Тиолирование поли-L-глутаминовой кислоты (PGA-SH) и присоединение цистеинсодержащего пептида
32 мг натриевой соли PGA средней молекулярной массы (продаваемой фирмой Sigma) растворяли в 1,0 мл 0,1 М фосфатно-натриевого буфера рН 7,2. Добавляли 22 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и 15 мг сульфо-NHS и раствор держали при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляли 4,6 мг HCl соли цистамина и раствор оставляли для взаимодействия в течение 90 мин. Продукт очищали пропусканием через Desalt® колонку (продаваемую фирмой Pierce), предварительно уравновешенную разбавленным ацетатным буфером при рН 4,5. Элюент замораживали и хранили при -80°С. Степень тиолилирования оценивали с помощью анализа Элмана (DTNB), и было обнаружено, что она составляет приблизительно 24% от общего числа остатков глутамата.
Синтетический пептид, содержащий известный Т-клеточный эпитоп из белка RSV-G (RSV-G остатки 186-198, SED ID NO:24 CKRIPNKKPGKKT), может быть легко синтезирован стандартными способами твердофазного пептидного синтеза. 15 мг PGA-SH в 0,5 мл фосфатного буфера рН 7 можно обработать 0,4 мг DTNB (~1,0 мкмоль) в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор станет желтым. Реакцию активации можно контролировать путем УФ-спектроскопии, и судили о завершении, когда больше не было увеличения поглощения при 412 нм. Затем можно добавить 1,5 мг цистеинсодержащего эпитопного пептида (~1 мкмоль), и раствор оставляли взаимодействовать в течение 10 минут. Продукт может быть частично очищен диализом с использованием диализной трубки с отсечкой 5000 MW, и пептидная нагрузка может быть подтверждена аминокислотным анализом.
Пример 16: Тиоэфирное присоединение эпитопного пептида к PGA-SH
Синтетический пептид, содержащий известный Т-клеточный эпитоп из белка RSV-G (RSV-G остатки 187-198, SEQ ID NO:25 KRIPNKKPGKKT), может быть синтезирован на смоле для твердофазного пептидного синтеза. Перед отщеплением смолы бромацетильная группа может быть введена на N-конце путем обработки смолы бромуксусным ангидридом. После отщепления смолы и очистки 1,5 мг (~1 мкмоль) пептида (бромацетил-KRIPNKKPGKKT) может быть добавлен к раствору 15 мг PGA-SH в фосфатном буфере рН 7. Продукт может быть частично очищен диализом с использованием диализной трубки с отсечкой 5000 MW, и пептидная нагрузка может быть подтверждена аминокислотным анализом.
Пример 17: Перекрестное связывание цистеинсодержащего эпитопного пептида с PLL
Матричный раствор PLL средней молекулярной массы (продаваемый фирмой Sigma) в подходящей концентрации, обычно 0,5-50 мг/мл, и с почти нейтральным рН, обычно рН 6-8, перемешивают с перекрестно-сшивающим агентом, таким как сульфосукцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилатом (сульфо-SMCC). Количество сульфо-SMCC может варьироваться, но достаточное количество используют для модификации 1-25% остатков лизина в PLL. Характерное время реакции составляет 0,5-5 часов. Избыток сульфо-SMCC реагента затем удаляют, либо пропуская реакционный раствор через гель-фильтрационную колонку, либо путем диализа. Модифицированный PLL затем оставляют для взаимодействия с небольшим избытком цистеинсодержащего эпитопного пептида почти при нейтральном рН, обычно рН 6-8. Конечный конъюгат PLL-эпитоп очищают, либо пропуская раствор через гель-фильтрационную колонку, либо диализом. Этот реагент будет подходящим для включения в полиэлектролитную ELBL пленку способами, аналогично используемыми для PLL.
Пример 18: Защита от заражения RSV после иммунизации мышей наночастицами
Мышей заражали интраназально RSV на 28 день и скарифицировали 5 дней спустя. Легкие собирали и гомогенизировали и титры вируса измеряли анализом клеток Vero и с помощью qPCR амплификации гена RSV-M. Результаты (Фигура 17) демонстрируют по существу полную защиту любой композицией, которая содержит RSV-G (группы 3-6). В этом исследовании только RSV-M2 ни защищал, ни улучшал работу мультивалентной вакцины по сравнению с одним RSV-G, возможно в связи с относительно высокой используемой дозой (10 мкг).
Пример 19: Иммуногенность мультивалентных наночастиц, содержащих эпитопы RSV-G и RSV-M2 в одном и том же или в разных слоях
Мышей иммунизировали в 0 день инъекцией конструкций наночастиц RSV в подушечку задней лапы; иммуногены включали ACT-1023 (RSV-M2), ACT-1042 (RSV-G)+ACT-1023 (RSV-M2), ACT-1086 (RSV-M2+G слитый пептид в одном слое) и ACT-1077 (RSV-G + RSV-M2 пептиды в различных слоях). Мышей заражали клетками-мишенями, нагруженными RSV-M2, меченными CFSE, на 7 день. На следующий день клетки селезенки анализировали проточной цитометрией для определения выживания клеток-мишеней, меченных CFSE. Результаты (Фигуры 18 и 19) показывают, что хотя иммунизация любой наночастицей, содержащей эпитоп RSV-M2, индуцировала RSV-M2-специфичные эффекторные клетки, ответ был более мощным у мышей, иммунизированных мультивалентными конструкциями (RSV-M2+G), чем у мышей, иммунизированными моновалентными конструкциями (RSV-M2).
В отдельном исследовании мышей иммунизировали на 0 и 21 день инъекцией конструкциями наночастиц RSV в подушечку задней лапы; иммуногены включали ACT-1023 (RSV-M2), ACT-1042 (RSV-G), ACT-1042+ACT-1023, ACT-1086 (RSV-M2+G слитый пептид в одном слое) и ACT-1139 (RSV-G+RSV-M2 пептиды, совместно загруженные в одном и том же слое). У мышей брали кровь на 28 день и сыворотки анализировали на RSV-G-специфичные антитела с помощью ELISA. Результаты (Фигура 20, 21) показывают, что все композиции, которые содержали RSV-G эпитоп, индуцировали титры антител, хотя мультивалентная наночастица АСТ-1139, по-видимому, является наиболее эффективной.
Использование терминов в единственном числе и аналогичных ссылок (в частности, в контексте последующей формулы изобретения) охватывает как единственное, так и множественное число, если в настоящей заявке не указано иное или иное не противоречит контексту. Термины «первый», «второй» и т.д., используемые в контексте настоящего изобретения, не предназначены для обозначения какого-либо конкретного порядка, а просто для удобства обозначения, например, множества слоев. Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» должны толковаться как открытые термины (т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь»), если не указано иное. Перечисление диапазонов значений служит только как способ сокращения ссылки индивидуально для каждого отдельного значения, входящего в диапазон, если не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально перечислено в настоящем описании. Конечные точки всех диапазонов включены в диапазон и независимо комбинируются. Все описанные здесь способы могут быть выполнены в подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту. Использование любого и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, «такой как») предназначено только для лучшей иллюстрации изобретения и не ограничивает объем изобретения, если иное не заявлено. В настоящем описании отсутствуют формулировки, которые должны быть истолкованы как указывающие на любой незаявленный элемент как необходимый для осуществления настоящего изобретения, в данном контексте.
Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на вариант осуществления, приводимый в качестве примера, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть сделаны различные изменения и эквиваленты могут быть заменены их элементами без отклонения от объема изобретения. Кроме того, многие модификации могут быть выполнены для того, чтобы адаптировать конкретную ситуацию или вещество к сведениям, представленным в настоящем изобретении, без отклонения от его существенного объема. Таким образом, предполагается, что изобретение не ограничивается конкретным вариантом осуществления, раскрытым как лучший вариант из предполагаемых для осуществления этого изобретения, но что изобретение будет включать все варианты осуществления, подпадающие под объем прилагаемой формулы изобретения. Любое сочетание описанных выше элементов во всех возможных их вариантах охватывается настоящим изобретением, если в настоящей заявке не указано иное или иное явным образом не противоречит контексту.
Claims (24)
1. Иммуногенная композиция, содержащая:
первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV, где первый полипептидный эпитоп из RSV представляет собой эпитоп белка RSV-M2, включающий M281-95, а второй полипептидный эпитоп из RSV представляет собой эпитоп белка RSV-G, включающий RSV-G169-191, и где первый и второй полипептидные эпитопы
(i) ковалентно связаны с одним или более полиэлектролитами, отличными от полипептидных полиэлектролитов, содержащими поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу, или
(ii) являются частью одного или более полиэлектролитов, которые представляют собой сконструированные полипептиды, состоящие из одной или более областей поверхностной адсорбции, ковалентно связанных с указанными одним или более эпитопами RSV, где сконструированный полипептид и одна или более областей поверхностной адсорбции имеют одинаковый знак заряда, а сконструированный полипептид имеет достаточный заряд для стабильного связывания с противоположно заряженной поверхностью,
где один или более полиэлектролитов находятся в одной и той же многослойной пленке, причем указанная пленка содержит два или более слоя полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты, содержащие поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу, и где эпитоп RSV-G находится во внешнем слое многослойной пленки.
2. Композиция по п.1, где многослойная пленка содержит указанный сконструированный полипептид.
3. Композиция по п.2, где длина сконструированного полипептида составляет по меньшей мере 15 аминокислот и этот полипептид имеет суммарный заряд на остаток при нейтральном рН, превышающий или равный 0,1, и где первый полипептидный эпитоп из RSV, второй полипептидный эпитоп из RSV или оба этих эпитопа являются частями указанного сконструированного полипептида.
4. Композиция по п.1, где первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV ковалентно связаны с одним и тем же полиэлектролитом или являются его частями.
5. Композиция по п.1, где первый полипептидный эпитоп из RSV и второй полипептидный эпитоп из RSV ковалентно связаны с различными полиэлектролитами или являются их частями.
6. Композиция по п.5, где первый электролит, ковалентно связанный с первым полипептидным эпитопом из RSV или частью которого является первый полипептидный эпитоп из RSV, и второй электролит, ковалентно связанный со вторым полипептидным эпитопом из RSV или частью которого является второй полипептидный эпитоп из RSV, находятся в одной и той же многослойной пленке.
7. Композиция по п.1, где первый полипептидный эпитоп из RSV индуцирует специфический цитотоксический ответ или ответ Т-хелперов, а второй полипептидный эпитоп из RSV индуцирует специфический антительный ответ.
8. Композиция по п.1, где первый полипептидный эпитоп из RSV содержит SEQ ID NO: 7, а второй полипептидный эпитоп из RSV содержит SEQ ID NO: 4.
9. Композиция по п.1, причем указанная композиция дополнительно содержит белок RSV-F.
10. Композиция по п.1, где пленка нанесена на ядро частицы.
11. Композиция по п.1, где многослойная пленка находится в форме полой капсулы.
12. Композиция по п.11, где два или более слоя многослойной пленки ковалентно сшиты.
13. Композиция по п.12, где два или более слоя многослойной пленки ковалентно сшиты амидными связями.
14. Композиция по п.12, где два или более слоя многослойной пленки ковалентно сшиты дисульфидными связями.
15. Иммуногенная композиция, содержащая:
полипептидный эпитоп RSV-G, включающий RSV-G169-191 и ковалентно сшитый с одним или более полиэлектролитами, где один или более полиэлектролитов находятся в одной или более многослойных пленках, где одна или более многослойных пленок каждая содержит два или более слоя полиэлектролитов, где смежные слои содержат противоположно заряженные полиэлектролиты, и
где полиэлектролит содержит поликатионное вещество или полианионное вещество, имеющее молекулярную массу, превышающую 1000, и по меньшей мере 5 зарядов на молекулу, и
где эпитоп RSV-G находится во внешнем слое многослойной пленки.
16. Композиция по п.15, где полипептидный эпитоп RSV-G содержит SEQ ID NO: 4.
17. Способ иммунизации против RSV, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции по любому из пп.1-16.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36202910P | 2010-07-07 | 2010-07-07 | |
US61/362,029 | 2010-07-07 | ||
US201161485669P | 2011-05-13 | 2011-05-13 | |
US61/485,669 | 2011-05-13 | ||
PCT/US2011/043136 WO2012006395A1 (en) | 2010-07-07 | 2011-07-07 | Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013101972A RU2013101972A (ru) | 2014-08-20 |
RU2609661C2 true RU2609661C2 (ru) | 2017-02-02 |
Family
ID=45438747
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013101972A RU2609661C2 (ru) | 2010-07-07 | 2011-07-07 | Антигенные композиции респираторного синцитиального вируса и способы |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9487593B2 (ru) |
EP (1) | EP2590675B1 (ru) |
JP (1) | JP5890407B2 (ru) |
CN (2) | CN106008716B (ru) |
AU (1) | AU2011276251B2 (ru) |
BR (1) | BR112013000345B1 (ru) |
CA (1) | CA2799934C (ru) |
DK (1) | DK2590675T3 (ru) |
ES (1) | ES2688993T3 (ru) |
IL (1) | IL222723B (ru) |
MX (1) | MX340796B (ru) |
RU (1) | RU2609661C2 (ru) |
WO (1) | WO2012006395A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8883717B2 (en) * | 2012-03-30 | 2014-11-11 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Antigenic compositions and methods |
US9433671B2 (en) | 2012-03-30 | 2016-09-06 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Anti-malaria compositions and methods |
JP6523955B2 (ja) | 2012-08-01 | 2019-06-05 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ(mva)rsウイルス(rsv)ワクチン |
MX2016001931A (es) * | 2013-08-13 | 2016-09-07 | Univ Northwestern | Particulas conjugadas con peptidos. |
MX2016014863A (es) | 2014-05-27 | 2017-06-21 | Artificial Cell Tech Inc | Construccion capa a capa automatizada de nucleos recubiertos con multiples capas mediante fft. |
US9630994B2 (en) | 2014-11-03 | 2017-04-25 | University Of Washington | Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures |
US9968665B2 (en) | 2015-09-16 | 2018-05-15 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Anti-malaria compositions and methods |
US20170230649A1 (en) * | 2016-02-05 | 2017-08-10 | Qualcomm Incorporated | Calibration of hybrid auto focus (af) imaging systems |
RU2019130167A (ru) | 2017-04-04 | 2021-05-05 | Юниверсити Оф Вашингтон | Самосборные белковые наноструктуры, экспонирующие f-белки парамиксовируса и/или пневмовируса, и их применение |
CA3079604A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Trellis Bioscience, Llc | Conformational epitopes in respiratory syncytial virus g protein central conserved region |
EP3758747A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-06 | University of Washington | Self-asssembling nanostructure vaccines |
US20230414526A1 (en) * | 2022-03-29 | 2023-12-28 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU96105905A (ru) * | 1993-08-06 | 1998-06-10 | Коннот Лабораториз Лимитед | Инактивированные вакцины респираторно-синцитиального вируса |
WO2006023029A2 (en) * | 2004-06-16 | 2006-03-02 | The Johns Hopkins University | The cysteine-rich region of respiratory syncytial virus and methods of use therefor |
EP2058002A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-13 | Bestewil Holding B.V. | Reconstituted respiratory syncytial virus membranes and use as respiratory syncytial virus vaccine |
WO2009079066A2 (en) * | 2007-09-26 | 2009-06-25 | Aparna Biosciences | Therapeutic and vaccine polyelectrolyte nanoparticle compositions |
US20100028448A1 (en) * | 2005-10-25 | 2010-02-04 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Immunogenic compositions and methods of use |
US7723294B2 (en) * | 2007-04-02 | 2010-05-25 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Polypeptide films and methods |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0714306T3 (da) * | 1993-08-06 | 1998-10-19 | Connaught Lab | Inaktiveret respiratorisk syncytialvirus-vacciner |
FR2718452B1 (fr) | 1994-04-06 | 1996-06-28 | Pf Medicament | Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation. |
WO1996006112A1 (en) | 1994-08-25 | 1996-02-29 | Instituut Voor Veehouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Antigenic peptides derived from the g protein of rsv for type- and subtype-specific diagnosis of respiratory syncytial virus (rsv) infection |
FR2726471B1 (fr) | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins |
AUPO026596A0 (en) | 1996-06-05 | 1996-06-27 | Biomolecular Research Institute Limited | Viral peptide |
CA2426312C (en) | 2000-10-18 | 2014-01-14 | Ralph A. Tripp | Compositions and methods for modulating rsv infection and immunity |
FR2819810B1 (fr) | 2001-01-23 | 2004-05-28 | Pf Medicament | Peptides non glycosyles derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin |
AUPR520201A0 (en) | 2001-05-23 | 2001-06-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Antiviral compounds |
JP3997930B2 (ja) | 2003-02-27 | 2007-10-24 | 富士ゼロックス株式会社 | カーボンナノチューブの製造装置および製造方法 |
US7368537B2 (en) | 2003-07-15 | 2008-05-06 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection |
US7615530B2 (en) | 2003-08-29 | 2009-11-10 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Immunogenic compositions and methods of use |
US7348399B2 (en) | 2003-08-29 | 2008-03-25 | Louisiana Tech University Foundation, Inc. | Nanofabricated polypeptide multilayer films, coatings, and microcapsules |
US20080131450A1 (en) | 2004-07-23 | 2008-06-05 | Pierre Fabre Medicament | Immunogenic complexes, preparation method thereof and use of same in pharmaceutical compositions |
WO2006079928A2 (en) * | 2005-01-31 | 2006-08-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Polyelectrolyte multilayer film, preparation and uses thereof |
US20090220537A1 (en) * | 2005-04-12 | 2009-09-03 | The University Of Queensland | Vaccine delivery system |
EP1972348A1 (en) | 2007-03-14 | 2008-09-24 | Pierre Fabre Medicament | Novel vaccine composition for the treatment of respiratory infectious diseases |
WO2008114149A2 (en) | 2007-03-21 | 2008-09-25 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Chimeric antigens |
CN102131830A (zh) | 2008-07-18 | 2011-07-20 | 魁北克益得生物医学公司 | 嵌合呼吸道合胞病毒多肽抗原 |
WO2010075491A2 (en) | 2008-12-24 | 2010-07-01 | University Of Rochester | Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins |
EP2461825B1 (en) | 2009-08-04 | 2017-05-31 | The Government of The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, | Anti-rsv immunogens and methods of immunization |
US8883717B2 (en) * | 2012-03-30 | 2014-11-11 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Antigenic compositions and methods |
-
2011
- 2011-07-07 AU AU2011276251A patent/AU2011276251B2/en active Active
- 2011-07-07 WO PCT/US2011/043136 patent/WO2012006395A1/en active Application Filing
- 2011-07-07 US US13/177,671 patent/US9487593B2/en active Active
- 2011-07-07 ES ES11731610.9T patent/ES2688993T3/es active Active
- 2011-07-07 CN CN201610369657.4A patent/CN106008716B/zh active Active
- 2011-07-07 JP JP2013518819A patent/JP5890407B2/ja active Active
- 2011-07-07 RU RU2013101972A patent/RU2609661C2/ru active
- 2011-07-07 BR BR112013000345-6A patent/BR112013000345B1/pt active IP Right Grant
- 2011-07-07 DK DK11731610.9T patent/DK2590675T3/en active
- 2011-07-07 CN CN201180033742.9A patent/CN103037898B/zh active Active
- 2011-07-07 EP EP11731610.9A patent/EP2590675B1/en active Active
- 2011-07-07 MX MX2012015030A patent/MX340796B/es active IP Right Grant
- 2011-07-07 CA CA2799934A patent/CA2799934C/en active Active
-
2012
- 2012-10-28 IL IL222723A patent/IL222723B/en active IP Right Grant
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU96105905A (ru) * | 1993-08-06 | 1998-06-10 | Коннот Лабораториз Лимитед | Инактивированные вакцины респираторно-синцитиального вируса |
WO2006023029A2 (en) * | 2004-06-16 | 2006-03-02 | The Johns Hopkins University | The cysteine-rich region of respiratory syncytial virus and methods of use therefor |
US20100028448A1 (en) * | 2005-10-25 | 2010-02-04 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Immunogenic compositions and methods of use |
US7723294B2 (en) * | 2007-04-02 | 2010-05-25 | Artificial Cell Technologies, Inc. | Polypeptide films and methods |
WO2009079066A2 (en) * | 2007-09-26 | 2009-06-25 | Aparna Biosciences | Therapeutic and vaccine polyelectrolyte nanoparticle compositions |
EP2058002A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-13 | Bestewil Holding B.V. | Reconstituted respiratory syncytial virus membranes and use as respiratory syncytial virus vaccine |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CHANG-FA FAN, XING-GUO MEI, "Co-immunization of BALB/c mice with recombinant immunogens containing G protein fragment and chimeric CTL epitope of respiratory syncytial virus induces enhanced cellular immunity and high level of antibody response." Vaccine, 2005, 23(35): 4453-4461. * |
CHOUNG S.-F. et al., "A paradigm for peptide vaccine delivery using viral epitopes encapsulated in degradable polymer hydrogel capsules", Biomaterials, 2009; 30(28): 5178-5186. * |
ZENG RUI-HONG et al. "Induction of balanced immunity in BALB/c mice by vaccination with a recombinant fusion protein containing a respiratory syncytial virus G protein fragment and a CTL epitope", Vaccine, 2006; 24(7): 941-947. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5890407B2 (ja) | 2016-03-22 |
CN103037898B (zh) | 2016-06-29 |
MX2012015030A (es) | 2013-06-13 |
WO2012006395A1 (en) | 2012-01-12 |
IL222723A0 (en) | 2012-12-31 |
EP2590675B1 (en) | 2018-08-29 |
US20120009254A1 (en) | 2012-01-12 |
CN106008716A (zh) | 2016-10-12 |
BR112013000345B1 (pt) | 2021-11-23 |
BR112013000345A2 (pt) | 2016-05-31 |
AU2011276251B2 (en) | 2015-02-05 |
IL222723B (en) | 2020-03-31 |
JP2013535428A (ja) | 2013-09-12 |
AU2011276251A1 (en) | 2012-11-08 |
CA2799934A1 (en) | 2012-01-12 |
CN103037898A (zh) | 2013-04-10 |
AU2011276251A2 (en) | 2013-01-24 |
CA2799934C (en) | 2020-01-28 |
CN106008716B (zh) | 2019-08-13 |
EP2590675A1 (en) | 2013-05-15 |
ES2688993T3 (es) | 2018-11-07 |
RU2013101972A (ru) | 2014-08-20 |
US9487593B2 (en) | 2016-11-08 |
MX340796B (es) | 2016-07-27 |
DK2590675T3 (en) | 2018-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2609661C2 (ru) | Антигенные композиции респираторного синцитиального вируса и способы | |
AU2013240105B2 (en) | Microparticle vaccine against malaria | |
US10588954B2 (en) | Anti-malaria compositions and methods | |
US20230414526A1 (en) | Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods | |
CA3112575A1 (en) | Anti-malaria compositions and methods |