ES2688993T3 - Composiciones antigénicas y métodos para el virus respiratorio sincicial - Google Patents

Composiciones antigénicas y métodos para el virus respiratorio sincicial Download PDF

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Abstract

Una película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca, en donde dicha película multicapa comprende un epítopo de la proteína M2 de RSV y un epítopo de la proteína G de RSV, consistiendo dichos epítopos en 3 a 120 aminoácidos, como parte de uno o más polipéptidos diseñados, en donde un polipéptido diseñado es un polipéptido que consiste en una o más regiones de absorción a superficie cargadas de al menos 8 aminoácidos unidos covalentemente al epítopo de la proteína M2 de RSV, el epítopo de la proteína G de RSV, o ambos, que tienen carga suficiente para la unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, y en donde el polipéptido diseñado y las una o más regiones de absorción a superficie cargadas en el mismo están cargadas de forma positiva o cargadas de forma negativa, en donde dicha película multicapa comprende dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta, en donde al menos un polielectrolito de la película multicapa es dicho uno o más polipéptidos diseñados y en donde un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones antigénicas y métodos para el virus respiratorio sincicial Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere a composiciones y métodos para la prevención de la infección por el virus respiratorio sincicial, específicamente composiciones de película multicapa que contienen epítopos antigénicos de la proteína M2 de RSV y la proteína G de RSV.
Antecedentes
El virus respiratorio sincicial (RSV, forma siglada del inglés respiratory syncytial virus) es la causa más importante de las enfermedades graves de las vías respiratorias bajas en bebés y niños pequeños en todo el mundo, y también es una amenaza para los ancianos y los pacientes inmunocomprometidos. En Estados Unidos, las infecciones por RSV dan como resultado hasta 126.000 hospitalizaciones de bebes y hasta 60.000 hospitalizaciones de adultos ancianos por año. Dado que la infección natural por RSV no induce una inmunidad duradera a largo plazo, los pacientes son susceptibles a la reinfección con las mismas y distintas cepas de virus durante toda la vida. El RSV se asocia con infecciones secundarias tales como la otitis media y puede predisponer a los niños pequeños a enfermedades relacionadas con el asma más adelante en la vida.
Murata, Y., 2009, Clinical Laboratory Medicine, Vol. 29(4), 725-739, proporcionan una revisión del desarrollo de la vacuna frente al virus respiratorio sincicial.
Después de más de 40 años de esfuerzo, no existe una vacuna segura y eficaz frente al RSV. De hecho, los primeros intentos de desarrollar una vacuna para el RSV precipitada con alumbre e inactivada con formol (RSV-IF) en la década de 1960 parecían predisponer a los niños vacunados a una enfermedad más grave e incluso a la muerte durante una infección natural posterior. El mecanismo exacto de esta respuesta no se ha caracterizado completamente, pero parece depender de un sesgo de la respuesta inmunitaria hacia un fenotipo inflamatorio Th2 dominante caracterizado por la activación inadecuada de las rutas de citocinas y quimiocinas.
Dado el impacto económico de la enfermedad provocada por el RSV, estimado en casi 594,8 millones de € (700 millones de USD) por año en los EE. UU. en 2004, y las complicaciones potencialmente mortales que pueden ser el resultado de la infección por RSV en bebés, ancianos y pacientes inmunodeprimidos, el desarrollo de vacunas seguras y eficaces para el RSV es una prioridad alta.
Existe una necesidad de composiciones antigénicas mejoradas adecuadas para la estimulación de una respuesta inmunitaria frente al RSV.
Sumario
En un aspecto, la invención proporciona una película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca, en donde dicha película multicapa comprende un epítopo de la proteína M2 de RSV y un epítopo de la proteína G de RSV, consistiendo dichos epítopos en 3 a 120 aminoácidos, como parte de uno o más polipéptidos diseñados, en donde un polipéptido diseñado es un polipéptido que consiste en una o más regiones de absorción a superficie cargadas de al menos 8 aminoácidos unidos covalentemente al epítopo de la proteína M2 de RSV, el epítopo de la proteína G de RSV, o ambos, que tienen carga suficiente para la unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, y en donde el polipéptido diseñado y las una o más regiones de absorción a superficie cargadas en el mismo están cargadas de forma positiva o cargadas de forma negativa,
en donde dicha película multicapa comprende dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta,
en donde al menos un polielectrolito de la película multicapa es dicho uno o más polipéptidos diseñados y en donde un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula.
Además se describe en el presente documento una composición que comprende un primer epítopo polipeptídico del RSV y un segundo epítopo polipeptídico del RSV, en donde los primero y segundo epítopos polipeptídicos están unidos covalentemente a uno o más polielectrolitos, en donde los uno o más polielectrolitos están en una o más películas multicapa, en donde las una o más películas multicapa comprenden dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta, y en donde el polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula, y en donde el primer epítopo polipeptídico del RSV y el segundo epítopo polipeptídico del RSV están presentes en la misma película multicapa o en una distinta.
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Además se describe en el presente documento una composición que comprende un primer epítopo polipeptídico del RSV y un segundo epítopo polipeptídico del RSV, en donde los primero y segundo epítopos polipeptídicos están en forma de una o más películas multicapa, en donde las una o más películas multicapa comprenden dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta, y donde al menos un polielectrolito de la película multicapa comprende un polipéptido diseñado, en donde el polipéptido diseñado tiene carga suficiente para una unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, y en donde el polipéptido diseñado comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV, el segundo epítopo polipeptídico de RSV, o ambos, en donde un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula, y en donde el primer epítopo polipeptídico del RSV y el segundo epítopo polipeptídico del RSV están presentes en la misma película multicapa o en una distinta.
Además se describe en el presente documento una composición que comprende un epítopo polipeptídico de G de RSV unido covalentemente a uno o más polielectrolitos, en donde los uno o más polielectrolitos están en una o más películas multicapa, en donde las una o más películas multicapa comprenden dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta, y en donde el polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Espectro de masas de FT-ICR expandido para el estado de carga de MH6+6 de ACT-2044 intacto (SEQ ID NO: 8). M/z monoisotópica esperada para el péptido completamente oxidado = 1015,43, encontrada = 1015,6008. Este resultado es totalmente congruente con dos disulfuros intramoleculares en ACT-2044.
Figura 2: Espectro de masas FT-ICR para ACT-2086 (SEQ ID NO: 13). El pico monoisotópico MHg+9 tiene una m/z de 867,1571, que corresponde a una masa monoisotópica de 7795,344 amu, lo que está muy cerca de la masa monoisotópica calculada de 7795,33 amu. Este resultado es totalmente congruente con la presencia de dos enlaces disulfuro en ACT-2086.
Figura 3: Potencial de superficie (zeta) de las nanopartículas medido después de cada etapa de la formación de capas por ELBL. Las partículas no recubiertas (EP) tienen un valor zeta positivo. El recubrimiento con una única capa de PGA imparte un valor zeta negativo. Las etapas posteriores de formación de capas con el péptido diseñado ACT-2031, los polipéptidos PGA y PLL, o el péptido diseñado ACT-2044 provocan cambios positivos o negativos alternos en el potencial zeta, lo que indica etapas del ECPC satisfactorias.
Figura 4: Inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartículas de ACT-1042 (SEQ ID NO: 8; G de RSV164-1g1) a través de inyección en la almohadilla plantar; se recogieron los sueros y analizaron por ELISA. Los sueros reconocieron el péptido epitópico conformacional CX3C de G de RSV ACT-2044 (SEQ ID NO: 8).
Figura 5: Inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartículas de ACT-1042 (SEQ ID NO: 8; G de RSV164-191) a través de inyección en la almohadilla plantar; se recogieron los sueros y analizaron por ELISA. Los sueros no reconocieron una versión del mismo péptido (ACT-2054; SEQ ID NO: 9) que se linealizó protegiendo los restos de cisteína.
Figura 6: Inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartículas de ACT-1042 (SEQ ID NO: 8; G de RSV164-191) a través de inyección en la almohadilla plantar; se recogieron los sueros y analizaron por ELISA. Los sueros reconocieron también la proteína G de RSV nativa.
Figura 7: Inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartículas de ACT-1042 (SEQ ID NO: 8; G de RSV164-191) a través de inyección en la almohadilla plantar; se recogieron los sueros y analizaron en un ensayo de unión bioquímico que mide la inhibición de la unión de G de RSV al receptor de quimiocina CX3CR1. La actividad biológica de la respuesta de anticuerpos suscitada por ACT-1042 se confirmó mediante la inhibición de la unión de G de RSV al receptor de quimiocinas.
Figura 8: Inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartículas de ACT-1042 (SEQ ID NO: 8; G de RSV164-191) a través de inyección en la almohadilla plantar; se recogieron los sueros y se analizaron en un ensayo de migración celular. La actividad biológica de la respuesta de anticuerpos suscitada por ACT-1042 se confirmó mediante la inhibición de la migración de CMSP humanas hacia G de RSV purificada.
Figura 9: Respuestas de linfocitos T específicos para M2 de RSV después de la inmunización con ACT-1023 (SEQ ID NO: 12; M2 de RSVs1 -98) a través de administración s.c., i.p., i.n. y en la almohadilla plantar. Se recogieron esplenocitos de los ratones el día 14 posinmunización y se reestimularon en placas de ELISPOT de IL-4 o IFNy con ACT-2019 (SEQ ID NO: 7), el péptido de M2 de RSV. Los resultados reflejan el número de linfocitos T específicos de antígeno/106 células en animales individuales sin tratamiento previo o inmunizados. Figura 10: Inmunogenicidad de una vacuna multivalente de un cóctel de nanopartículas de RSV. Se inmunizaron ratones BALB/c (5/grupo, 5-6 semanas de edad) en los días 0 y 21. Respuestas de anticuerpos frente a G de RSV: Se recogieron sueros el día 28 y se midieron los títulos de anticuerpos IgG específicos para G de RSV mediante ELISA. Los datos se representan como la media±DT de 5 ratones por grupo.
Figura 11: Inmunogenicidad de una vacuna multivalente de un cóctel de nanopartículas de RSV. Se inmunizaron ratones BALB/c (5/grupo, 5-6 semanas de edad) en los días 0 y 21. Respuestas de linfocitos T frente a M2 de RSV: Se recogieron células de bazo el día 28 y se reestimularon con el péptido de M2 de RSV (ACT-2031; SEQ
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Figura 12: Inducción de actividad CTL in vivo mediante inmunización con nanopartículas de RSV. Se inmunizaron ratones BALB/c como se muestra y se expusieron 7 días después por inyección i.v. de células de bazo singénicas pulsadas con ACT-2031 (M2 de RSV; SEQ ID NO: 12) y marcadas con una dosis alta de indicador fluorescente CFSE (picos azules) mezcladas con células de bazo singénicas marcadas con una dosis baja de CFSE y sin péptido diana (picos rojos). Al día siguiente, se analizaron los bazos de los ratones inmunizados por citometría de flujo para detectar la supervivencia de las células diana donantes marcadas de forma diferencial. Cada histograma muestra los resultados de un único ratón inmunizado del grupo de tratamiento.
Figura 13: Inducción de actividad CTL in vivo mediante inmunización con nanopartículas de RSV. Los resultados muestran el porcentaje de destrucción específica de células diana marcadas con M2 de RSV de la Figura 12, calculado comparando el número relativo de células en cada pico dentro de un histograma.
Las Figuras 14 y 15 muestran la respuesta de anticuerpos después de la sensibilización (14) y el refuerzo (15), tras la inmunización con partículas de RSV usando construcciones de un único epítopo y de múltiples epítopos.
La Figura 16 es un gráfico de barras de los resultados mostrados en las Figuras 14 y 15.
La Figura 17 muestra los resultados de una exposición a RSV vivo de ratones inmunizados con nanopartículas de RSV que contienen G de RSV, M2 de RSV o una combinación. Los datos se muestran como un ensayo de placas y un ensayo de qPCR.
Figura 18: Inducción de actividad CTL in vivo mediante inmunización con nanopartículas de RSV. Se inmunizaron ratones BALB/c como se muestra y se expusieron 7 días después por inyección i.v. de células de bazo singénicas pulsadas con ACT-2031 (M2 de RSV; SEQ ID NO: 12) y marcadas con una dosis alta de indicador fluorescente CFSE (picos azules) mezcladas con células de bazo singénicas marcadas con una dosis baja de CFSE y sin péptido diana (picos rojos). Al día siguiente, se analizaron los bazos de los ratones inmunizados por citometría de flujo para detectar la supervivencia de las células diana donantes marcadas de forma diferencial. Cada histograma muestra los resultados de un único ratón inmunizado del grupo de tratamiento.
Figura 19: Inducción de actividad CTL in vivo mediante inmunización con nanopartículas de RSV. Los resultados muestran el porcentaje de destrucción específica de células diana marcadas con M2 de RSV en la Figura 18, calculado comparando el número relativo de células en cada pico dentro de un histograma.
Figuras 20 y 21: Respuestas de anticuerpos específicos para G de RSV. Se inmunizaron ratones BALB/c en los días 0 y 21. Se midieron por ELISA los títulos de anticuerpos IgG específicos para G de RSV en los sueros posrefuerzo. (20) valores de DO de sueros individuales a dilución 1:50. cóctel = ACT-1023 + 1042. Las barras horizontales representan el promedio de los valores individuales dentro de un grupo. (21) Promedio de 5 sueros por grupo en titulaciones en serie.
Los expertos en la materia apreciarán y comprenderán las características descritas anteriormente y otras a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones adjuntas.
Descripción detallada
En el presente documento se divulgan películas multicapa que comprenden epítopos polipeptídicos de RSV, en donde las películas multicapa tienen la capacidad de suscitar en un hospedador una respuesta inmunitaria tras la administración al hospedador. Las películas multicapa comprenden dos epítopos polipeptídicos de RSV, específicamente un epítopo que suscita una respuesta de linfocitos T específica, tal como una respuesta de linfocitos T citotóxicos, y un epítopo que suscita una respuesta de anticuerpos específica. Los inventores han demostrado inesperadamente en el presente documento que combinando un epítopo que suscita una respuesta de linfocitos T específica y un epítopo que suscita una respuesta de anticuerpos específica, la potencia inmunitaria, medida como la respuesta de linfocitos T, se mejora inesperadamente en comparación con la administración de solo un componente. Específicamente, una combinación de epítopos de G de RSV (respuesta de anticuerpos específica) y de M2 de RSV (respuesta de linfocitos T específica) en forma de una o más películas multicapa, suscita una respuesta de linfocitos T sustancialmente mejorada en comparación con una película multicapa que contiene un epítopo de M2 de RSV solo.
En un primer aspecto la invención proporciona una película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca, en donde dicha película multicapa comprende un epítopo de la proteína M2 de RSV y un epítopo de la proteína G de RSV, consistiendo dichos epítopos en 3 a 120 aminoácidos, como parte de uno o más polipéptidos diseñados, en donde un polipéptido diseñado es un polipéptido que consiste en una o más regiones de absorción a superficie cargadas de al menos 8 aminoácidos unidos covalentemente al epítopo de la proteína M2 de RSV, el epítopo de la proteína G de RSV, o ambos, que tienen carga suficiente para la unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, y en donde el polipéptido diseñado y las una o más regiones de absorción a superficie cargadas en el mismo están cargadas de forma positiva o cargadas de forma negativa,
en donde dicha película multicapa comprende dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta,
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en donde al menos un polielectrolito de la película multicapa es dicho uno o más polipéptidos diseñados y en donde un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula.
Los primero y segundo epítopos polipeptídicos de RSV pueden estar presentes en el mismo polipéptido diseñado o en un distinto. En una realización, los primero y segundo epítopos polipeptídicos de RSV están presentes en el mismo polipéptido diseñado. En otra realización, los primero y segundo polipéptidos de RSV están presentes en distintos polipéptidos diseñados, pero están depositados en capas dentro de la misma película multicapa.
La proteína G de RSV (unión) se ha asociado con muchas aberraciones que incluyen la expresión alterada de ARNm de las citoquinas CC y CXC y respuestas de citocinas Th2 que parecen sustentar resultados inmunitarios inadecuados y una enfermedad potenciada. La región central rica en cisteínas conservada de la proteína G de RSV contiene un motivo de quimiocina CX3C en las posiciones de aminoácidos 182-186 que se une a CX3CR1, el receptor de fractalquina (CX3CL1). Se ha demostrado que el mimetismo con CX3CL1 de G de RSV facilita la infección por RSV e interfiere con las respuestas inmunitarias adaptativas normales frente al virus. La inmunización activa con péptidos que abarcan el motivo CX3C de G de RSV protege a los ratones de la infección por RSV y de la inflamación pulmonar. Hasta ahora, estos péptidos de G de RSV no se han utilizado en una vacuna segura y efectiva.
Además de la proteína G del RSV, son posibles candidatas para vacunas las proteínas F de RSV (fusión) y M2 de RSV (matriz). Los intentos de desarrollar vacunas monovalentes frente al RSV que contengan solo uno de los principales determinantes antigénicos se han visto obstaculizados por la protección incompleta frente a la infección y la enfermedad inflamatoria, sugiriendo que un enfoque multivalente podría ser más exitoso. De hecho, la inmunización de ratones con vacunas multivalentes que suscitaron respuestas tanto de anticuerpo como de linfocitos T CD8+ dio como resultado una disminución de la respuesta Th2 y un aumento en la Th1/CD8, que se correlacionaba con una mayor protección frente a la infección por virus y menos patología pulmonar inflamatoria. Estos resultados sugieren que el diseño ideal de vacuna frente a RSV incluiría epítopos de dos o más proteínas víricas y suscitaría tanto anticuerpos como linfocitos T CD8+ que secretan IFNy.
Inesperadamente, se descubrió que los ratones inmunizados con nanopartículas que contienen un epítopo CX3C de G de RSV estaban protegidos frente a la exposición a RSV vivo. Curiosamente, un epítopo de M2 de RSV no proporcionó protección frente a la exposición a RSV en vivo y una vacuna de combinación con G de RSV y M2 de RSV no proporcionó una protección mejorada en comparación con G de RSV solo. Sin quedar vinculado a teoría alguna, se cree que la alta concentración de nanopartículas utilizada en estos experimentos puede haber enmascarado los posibles beneficios de las nanopartículas de combinación.
En una realización, la película multicapa se deposita sobre una partícula núcleo, tal como una nanopartícula de CaCO3, una partícula de látex o una partícula de hierro. Son particularmente útiles los tamaños de partícula del orden de 5 nanómetros (nm) a 50 micrómetros (um) de diámetro. También pueden usarse como núcleos las partículas fabricadas de otros materiales, siempre y cuando sean biocompatibles, tengan una distribución de tamaños que se pueda controlar y tengan una carga superficial suficiente (ya sea positiva o negativa) para unirse a los péptidos polielectrolito. Los ejemplos incluyen nanopartículas y micropartículas fabricadas de materiales tales como ácido poliláctico (PLA), copolímero de ácido poliláctico ácido glicólico (PLGA), polietilenglicol (PEG), quitosano, ácido hialurónico, gelatina o combinaciones de los mismos. Las partículas núcleo también podrían fabricarse de materiales que se cree que son inadecuados para el uso humano, siempre y cuando puedan disolverse y separarse de la película multicapa después de la fabricación de la película. Los ejemplos de las sustancias del núcleo molde incluyen polímeros orgánicos tales como látex o materiales inorgánicos tales como sílice.
Las películas multicapa de polielectrolitos son películas finas (por ejemplo, de unos pocos nanómetros a micrómetros de espesor) compuestas de capas alternas de polielectrolitos cargados de forma opuesta. Dichas películas pueden formarse por ensamblaje capa por capa sobre un sustrato adecuado. En el autoensamblaje electrostático capa por capa ("ECPC"), la base física de la asociación de los polielectrolitos es la atracción electrostática. La acumulación de película es posible debido a que el signo de la densidad de carga superficial de la película se invierte al depositar las capas sucesivas. La generalidad y la relativa simplicidad del procedimiento de película por ECPC permiten la deposición de muchos tipos distintos de polielectrolitos en muchos tipos distintos de superficie. Las películas polipeptídicas multicapa son un subconjunto de películas multicapa de polielectrolitos, que comprenden al menos una capa que comprende un polipéptido cargado, denominado en el presente documento polipéptido diseñado. Una ventaja clave de las películas polipeptídicas multicapa sobre las películas fabricadas a partir de otros polímeros es su biocompatibilidad. Las películas ECPC también se pueden usar para encapsulación. Las aplicaciones de películas polipeptídicas y microcápsulas incluyen, por ejemplo, nanorreactores, biosensores, células artificiales y vehículos para suministro de fármacos.
El término "polielectrolito" incluye materiales policatiónicos y polianiónicos que tienen un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula. Los materiales policatiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, polipéptidos y poliaminas. Las poliaminas incluyen, por ejemplo, un polipéptido tal como poli-L-lisina (PLL) o poli-L-ornitina,
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polivinilamina, poli(aminoestireno), poli(aminoacrilato), poli (N-metil aminoacrilato), poli (N-etilaminoacrilato), poli(N,N-dimetil aminoacrilato), poli(N,N-dietilaminoacrilato), poli(aminometacrilato), poli(N-metil aminometacrilato), poli(N-etil aminometacrilato), poli(N,N-dimetil aminometacrilato), poli(N,N-dietil aminometacrilato), poli(etilenimina), poli (cloruro de dialil dimetil amonio), poli(cloruro de N,N,N-trimetilaminoacrilato), poli(cloruro de metiacrilamidopropiltrimetil amonio), quitosano y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales policatiónicos anteriores. Los materiales polianiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, un polipéptido tal como ácido poli-L-glutámico (PGA) y ácido poli-L-aspártico, un ácido nucleico tal como ADN y ARN, alginato, carragenano, fulcelarán, pectina, xantana, ácido hialurónico, heparina, heparán sulfato, sulfato de condroitina, dermatán sulfato, sulfato de dextrano, poli(ácido metacrílico), celulosa oxidada, carboximetilcelulosa, polisacáridos ácidos y croscarmelosa, polímeros y copolímeros sintéticos que contienen grupos carboxilo colgantes, y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales polianiónicos anteriores. En una realización, el epítopo de RSV y el polielectrolito tienen el mismo signo de carga.
En una realización, una o más capas de polielectrolito de la película, incluyendo el polielectrolito que comprende el epítopo de RSV, son un polipéptido diseñado. En una realización, los principios de diseño para polipéptidos adecuados para deposición electrostática capa por capa se elucidan en la Publicación de patente de Estados Unidos N.° 2005/0069950,
que enseña películas polipeptídicas multicapa. Brevemente, los problemas principales del diseño son la longitud y la carga del polipéptido. La electrostática es el problema de diseño más importante debido a que es la base del ECPC. Sin propiedades de carga adecuadas, un polipéptido puede no ser sustancialmente soluble en solución acuosa a pH 4 a 10 y no puede usarse fácilmente para la fabricación de una película multicapa mediante ECPC. Otros problemas de diseño incluyen la estructura física de los polipéptidos, la estabilidad física de las películas formadas a partir de los polipéptidos y la biocompatibilidad y bioactividad de las películas y los polipéptidos constituyentes.
Un polipéptido diseñado significa un polipéptido que tiene carga suficiente para una unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, es decir, un polipéptido que puede depositarse en una capa de una película multicapa en donde la fuerza impulsora para la formación de la película es la electrostática. Una película corta estable es una película que, una vez formada, retiene más de la mitad de sus componentes tras la incubación en PBS a 37 °C durante 24 horas. En realizaciones específicas, un polipéptido diseñado es al menos de 15 aminoácidos de longitud y la magnitud de la carga neta por resto del polipéptido es mayor o igual a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 a pH 7,0. Los aminoácidos de origen natural cargados de forma positiva (básicos) a pH 7,0 son arginina (Arg), histidina (His), ornitina (Orn) y lisina (Lys). Los restos de aminoácido de origen natural cargados de forma negativa (ácidos) a pH 7,0 son ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp). Se puede emplear una mezcla de restos de aminoácido de carga opuesta siempre que la relación neta global de carga cumpla los criterios especificados. En una realización, un polipéptido diseñado no es un homopolímero. En otra realización, un polipéptido diseñado es no ramificado.
Un problema del diseño es el control de la estabilidad de las películas polipeptídicas ECPC. Los enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals e interacciones hidrófobas, contribuyen a la estabilidad de las películas multicapa. Además, los enlaces disulfuro covalentes formados entre los aminoácidos que contienen sulfhidrilos de los polipéptidos, dentro de la misma capa o en capas adyacentes, pueden aumentar la resistencia estructural. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilos incluyen cisteína y homocisteína, y estos restos pueden incorporarse fácilmente en péptidos sintéticos diseñados. Además, los grupos sulfhidrilo se pueden incorporar en homopolímeros de polielectrolito tales como poli-L-lisina o ácido poli-L-glutámico por métodos bien descritos en la bibliografía. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilos pueden usarse para "bloquear" (unir entre sí) y "desbloquear" capas de una película polipeptídica multicapa mediante un cambio en el potencial de oxidación. Además, la incorporación de un aminoácido que contiene sulfhidrilo en un polipéptido diseñado permite el uso de péptidos relativamente cortos en la fabricación de una película fina, en virtud de la formación de enlaces disulfuro intermoleculares.
En una realización, los polipéptidos diseñados que contienen sulfhidrilos, ya sea sintetizados químicamente o producidos en un organismo hospedador, se ensamblan mediante ECPC en presencia de un agente reductor para impedir la formación prematura de enlaces disulfuro. Después del ensamblaje de la película, se elimina el agente reductor y se añade un agente oxidante. En presencia del agente oxidante se forman enlaces disulfuro entre los grupos sulfhidrilos, "bloqueando" de esta forma entre si los polipéptidos dentro de las capas y entre las capas donde están presentes los grupos tiol. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (BME), glutatión reducido, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y combinaciones de más de uno de estos productos químicos. Los agentes de oxidación adecuados incluyen glutatión oxidado, ferc-butilhidroperóxido (t-BHP), timerosal, diamida, 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitro-benzoico) (DTNB), 4,4'-ditiodipiridina, bromato de sodio, peróxido de hidrógeno, tetrationato de sodio, porfirindina, ortoyodosobenzoato de sodio y combinaciones de más de uno de estos productos químicos.
Como alternativa a los enlaces disulfuro, se pueden usar para estabilizar películas ECPC las químicas que producen otros enlaces covalentes. Para películas compuestas de polipéptidos, son particularmente útiles las químicas que producen enlaces amida. En presencia de reactivos de acoplamiento apropiados, los aminoácidos ácidos (aquellos con cadenas laterales que contienen grupos ácido carboxílico tales como el ácido aspártico y el ácido glutámico)
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reaccionarán con aminoácidos cuyas cadenas laterales contienen grupos amina (tales como la lisina y la ornitina) para formar enlaces amida. En condiciones biológicas los enlaces amida son más estables que los enlaces disulfuro y no sufrirán reacciones de intercambio. Se pueden usar muchos reactivos para activar cadenas laterales de los polipéptidos para el enlazamiento de amida. Los reactivos de carbodiimida, tales como la 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) soluble en agua, reaccionarán con ácido aspártico o ácido glutámico a un pH ligeramente ácido, formando un producto intermedio que reaccionará de forma irreversible con una amina para producir un enlace amida. A menudo se añaden a la reacción aditivos tales como N-hidroxisuccinimida, para acelerar la velocidad y la eficacia de la formación de amidas. Después de la reacción, los reactivos solubles se eliminan de las nanopartículas o micropartículas mediante centrifugación y aspiración. Los ejemplos de otros reactivos de acoplamiento incluyen diisopropilcarbodiimida, HBTU, HATU, HCTU, TBTU y PyBOP. Los ejemplos de otros aditivos incluyen sulfo-N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol. El grado de reticulación de amidas puede controlarse modulando la estequiometría de los reactivos de acoplamiento, el tiempo de reacción o la temperatura de la reacción, y puede controlarse mediante técnicas tales como la espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-lR).
Las películas por ECPC reticuladas covalentemente tienen propiedades convenientes tales como una estabilidad aumentada. Una mayor estabilidad permite utilizar condiciones más rigurosas durante la fabricación de nanopartículas, micropartículas, nanocápsulas o microcápsulas. Los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen altas temperaturas, bajas temperaturas, temperaturas criogénicas, altas velocidades de centrifugación, tampones de alta sal, tampones de alto pH, tampones de bajo pH, filtración y almacenamiento a largo plazo.
Un método de fabricación de una película de polielectrolitos multicapa comprende depositar una pluralidad de capas de especies químicas cargadas de forma opuesta sobre un sustrato. Al menos una capa comprende un polipéptido diseñado. Los polielectrolitos depositados sucesivamente tendrán cargas netas opuestas. En una realización, la deposición de un polielectrolito comprende exponer el sustrato a una solución acuosa que comprende un polielectrolito a un pH en el que tiene una carga neta adecuada para el ECPC. En otras realizaciones, la deposición de un polielectrolito sobre el sustrato se consigue mediante pulverización secuencial de soluciones de polipéptidos cargados de forma opuesta. En otras realizaciones más, la deposición sobre el sustrato es mediante pulverización simultánea de soluciones de polielectrolitos cargados de forma opuesta.
En el método de ECPC para la formación de una película multicapa, las cargas opuestas de las capas adyacentes proporcionan la fuerza impulsora para el ensamblaje. No es crítico que los polielectrolitos en capas opuestas tengan la misma densidad de carga lineal neta, solo que las capas opuestas tengan cargas opuestas. Un procedimiento convencional de ensamblaje de películas por deposición incluye la formación de soluciones acuosas de los poliiones a un pH en el que están ionizados (es decir, pH 4-10), la provisión de un sustrato que porte una carga superficial y la inmersión alterna del sustrato en las soluciones de polielectrolitos cargados. Opcionalmente, el sustrato se lava entre la deposición de la capa alterna.
La concentración de polielectrolito adecuada para la deposición del polielectrolito puede determinarla fácilmente un experto en la materia. Una concentración ejemplar es de 0,1 a 10 mg/ml. Para polielectrolitos no polipeptídicos típicos, tal como poli(ácido acrílico) y poli(clorhidrato de alilamina), los grosores de capa típicos son de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 A, dependiendo de la fuerza iónica de la solución. Normalmente, los polielectrolitos cortos forman capas más finas que los polielectrolitos largos. Con respecto al grosor de la película, el grosor de la película de polielectrolitos depende de la humedad, así como del número de capas y de la composición de la película. Por ejemplo, las películas de PLL/PGA con un grosor de 50 nm se contraen a 1,6 nm al secarse con nitrógeno. En general, se pueden formar películas de 1 nm a 100 nm o más de grosor, dependiendo del estado de hidratación de la película y del peso molecular de los polielectrolitos empleados en el ensamblaje.
Además, el número de capas necesarias para formar una película de polielectrolitos multicapa estable dependerá de los polielectrolitos en la película. Para las películas que comprenden solo capas de polipéptidos de bajo peso molecular, una película tendrá normalmente 4 o más bicapas de polipéptidos cargados de forma opuesta. Para películas que comprenden polielectrolitos de alto peso molecular, tales como poli(ácido acrílico) y poli(clorhidrato de alilamina), pueden ser estables las películas que comprenden una única bicapa de polielectrolito cargado de forma opuesta. Los estudios han demostrado que las películas de polielectrolitos son dinámicas. Los polielectrolitos contenidos en una película pueden migrar entre las capas y pueden intercambiarse con polielectrolitos solubles de carga similar cuando se suspenden en una solución de polielectrolitos. Además, las películas de polielectrolitos pueden desmontarse o disolverse en respuesta a un cambio en el entorno, tal como la temperatura, el pH, la fuerza iónica o el potencial de oxidación del tampón de suspensión. Por lo tanto, algunos polielectrolitos, y en particular los polielectrolitos peptídicos, presentan estabilidad transitoria. La estabilidad de las películas de polielectrolitos peptídicos se puede controlar suspendiendo las películas en un tampón adecuado en condiciones controladas, durante un período de tiempo fijo, y midiendo después las cantidades de los péptidos dentro de la película con un ensayo adecuado, tal como el análisis de aminoácidos, ensayo de HPLC, o ensayo de fluorescencia. Las películas de polielectrolitos peptídicos son más estables en condiciones que son importantes para su almacenamiento y el uso como vacunas, por ejemplo en tampones neutros y a temperaturas ambiente, tales como de 4 °C a 37 °C. En estas
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condiciones, las películas de polielectrolitos peptídicos estables conservarán la mayoría de sus péptidos componentes durante al menos 24 horas y a menudo hasta 14 días y más.
En conformidad con la invención, un polipéptido diseñado es un polipéptido que consiste en una o más regiones de absorción a superficie cargadas de al menos 8 aminoácidos unidas covalentemente al epítopo de la proteína M2 de RSV, el epítopo de la proteína G de RSV, o ambos, que tiene carga suficiente para la unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, y en donde el polipéptido diseñado y las una o más regiones de absorción a superficie cargadas en el mismo están cargadas de forma positiva o cargadas de forma negativa. En una realización, las una o más regiones de adsorción a superficie y el uno o más epítopos de RSV tienen la misma polaridad neta. En otra realización, la solubilidad del polipéptido diseñado a pH 4 a 10 es mayor que o igual a aproximadamente 0,1 mg/ml.
En otra realización, la solubilidad del polipéptido diseñado a pH 4 a 10 es mayor que o igual a aproximadamente 1 mg/ml. La solubilidad es una limitación práctica para facilitar la deposición de los polipéptidos a partir de una solución acuosa. Un límite superior práctico del grado de polimerización de un polipéptido antigénico es de aproximadamente 1.000 restos. Es concebible, sin embargo, que los polipéptidos compuestos más largos podrían realizarse mediante un método apropiado de síntesis.
En una realización, un polipéptido diseñado comprende un único epítopo antigénico de RSV flanqueado por dos regiones de adsorción a superficie, una región de adsorción de superficie N-terminal y una región de adsorción a superficie C-terminal. En otra realización, un polipéptido diseñado comprende un único epítopo antigénico de RSV flanqueado por una región de adsorción a superficie unida al extremo N del epítopo de RSV. En otra realización, un polipéptido diseñado comprende un único epítopo antigénico de RSV flanqueado por una de las regiones de adsorción a superficie unida al extremo C del epítopo de RSV.
Cada una de las regiones independientes (por ejemplo, epítopos de RSV y regiones de adsorción a superficie) del polipéptido diseñado puede sintetizarse por separado mediante síntesis peptídica en fase en solución, síntesis peptídica en fase sólida o ingeniería genética de un organismo hospedador adecuado. La síntesis de péptidos en fase en solución es el método utilizado para producción de la mayoría de los productos farmacéuticos peptídicos aprobados actualmente en el mercado. Para sintetizar péptidos relativamente largos e incluso proteínas pequeñas se puede usar una combinación de métodos en fase en solución y en fase sólida. Las empresas de síntesis de péptidos tienen la competencia técnica y la experiencia para sintetizar péptidos difíciles sobre una base de tarifa por servicio. Las síntesis se realizan en condiciones de prácticas correctas de fabricación (GMP, forma siglada de good manufacturing pactice) y en una escala adecuada para ensayos clínicos y lanzamiento comercial de fármacos.
Como alternativa, las diversas regiones independientes se pueden sintetizar juntas como una única cadena polipeptídica mediante síntesis peptídica en fase de solución, síntesis peptídica en fase sólida o ingeniería genética de un organismo hospedador adecuado. En cualquier caso particular la elección del enfoque será una cuestión de conveniencia o economía.
Si los diversos epítopos de RSV y las regiones de adsorción a superficie se sintetizan por separado, una vez purificados, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante cromatografía líquida de alto rendimiento, se unen mediante síntesis de enlaces peptídicos. Es decir, el extremo N de la región de adsorción a superficie y el extremo C del epítopo de RSV están unidos covalentemente para producir el polipéptido diseñado. Como alternativa, el extremo C de la región de adsorción a superficie y el extremo N del epítopo de RSV están unidos covalentemente para producir el polipéptido diseñado. Los fragmentos individuales pueden sintetizarse por métodos en fase sólida y obtenerse como segmentos completamente protegidos, completamente desprotegidos o parcialmente protegidos. Los segmentos se pueden unir covalentemente en una reacción en fase en solución o reacción en fase sólida. Si un fragmento polipeptídico contiene una cisteína como resto N-terminal y el otro fragmento polipeptídico contiene un tioéster o un precursor tioéster en su resto C-terminal, los dos fragmentos se acoplarán espontáneamente en solución mediante una reacción específica comúnmente conocida (para los expertos en el arte) como Ligación Nativa. La Ligación Nativa es una opción particularmente atractiva para la síntesis de péptidos diseñados debido a que puede realizarse con fragmentos peptídicos completamente desprotegidos o parcialmente protegidos en solución acuosa y en concentraciones diluidas.
En una realización, los epítopos de RSV y/o las regiones de adsorción a superficie se unen por enlaces peptídicos o no peptídicos como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 7.723.294, que enseña el uso de enlaces no peptídicos para unir segmentos de polipéptidos para su uso en películas multicapa. Los enlazadores no peptídicos adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores alquílicos tales como -NH-(CH2)s-C(O)-, en donde s=2-20. Opcionalmente, los enlazadores alquílicos están sustituidos por un grupo no obstaculizador desde el punto de vista estérico, tal como un alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo y similares. Otro enlazador no peptídico ejemplar es un enlazador de polietilenglicol tal como -NH-(CH2-CH2- O)n,-C(O)- en donde n es tal que el enlazador tiene un peso molecular de 100 a 5000 Da, específicamente de 100 a 500 Da. Muchos de los enlazadores descritos en el presente documento están disponibles en proveedores comerciales en una forma adecuada para su uso en la síntesis de péptidos en fase sólida.
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En una realización, uno o más epítopos polipeptídicos de RSV están unidos covalentemente a uno o más de los polielectrolitos, tales como un polipéptido u otro polielectrolito, a través de enlaces covalentes. Los ejemplos de enlaces covalentes adecuados incluyen amidas, ésteres, éteres, tioéteres y disulfuros. Un experto en la materia puede aprovechar una serie de grupos funcionales encontrados dentro del péptido epitópico para diseñar técnicamente un enlace a un electrolito adecuado. Por ejemplo, un ácido carboxílico en el péptido epitópico puede encontrarse en la cadena C-terminal o en la cadena lateral de los aminoácidos ácido aspártico o ácido glutámico. Los ácidos carboxílicos se pueden activar con reactivos de acoplamiento de péptidos adecuados tales como 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para la reacción con aminas primarias o secundarias que se encuentran en los polielectrolitos peptídicos tales como poli-L-lisina. El enlace amida resultante es estable bajo condiciones ambientales. Por el contrario, los grupos ácidos en un polielectrolito peptídico se pueden activar con EDC, para la reacción con grupos amina en el péptido epitópico. Los grupos amina útiles se pueden encontrar en el extremo N- terminal del péptido epitópicos o en la cadena lateral de restos lisina.
Los péptidos epitópicos también se pueden unir a polielectrolitos a través de enlaces disulfuro. Los polielectrolitos tales como PGA o PLL pueden modificarse químicamente de modo que una fracción de sus cadenas laterales contenga grupos sulfhidrilo. En presencia de un oxidante adecuado, los sulfhidrilos reaccionarán con el grupo sulfhidrilo de un resto cisteína contenido dentro del péptido epitópico. La cisteína puede ser una cisteína nativa de la secuencia de la proteína de un patógeno tal como RSV o puede ser una cisteína no nativa que se incorporó manera intencionada en el epítopo durante la síntesis peptídica. Los oxidantes adecuados incluyen DTNB, 2,2'-ditiopiridina, peróxido de hidrógeno, cistina y glutatión oxidado. La unión de péptidos epitópicos a polielectrolitos a través de enlaces disulfuro es particularmente útil. Los disulfuros son estables en condiciones normales de fabricación y almacenamiento de películas, pero se escinden fácilmente mediante agentes reductores que se encuentran naturalmente en las células, lo que libera el péptido epitópico para el procesamiento inmunitario.
Los péptidos epitópicos también se pueden unir a polielectrolitos a través de enlaces tioéter. Los péptidos epitópicos sintéticos pueden sintetizarse con electrófilos apropiados tales como grupos haloacetilo que reaccionan específicamente con los sulfhidrilos. Por ejemplo, un péptido epitópico que contiene un cloroacetilo en su N-terminal formará un enlace estable con polielectrolitos que portan sulfhidrilos, tales como PGA-SH descrito anteriormente.
Los péptidos epitópicos también se pueden unir covalentemente a polielectrolitos a través de moléculas enlazadoras bifuncionales. Los enlazadores bifuncionales contienen habitualmente dos grupos electrófilos que pueden reaccionar con nucleófilos presentes en el péptido epitópico o con la molécula de polielectrolito. Se venden comercialmente dos clases de moléculas enlazadoras, los enlazadores homobifuncionales y los enlazadores heterobifuncionales. Los enlazadores homobifuncionales contienen dos copias de un grupo electrófilo unido por un espaciador no reactivo. A menudo los electrófilos son ésteres activos, tal como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) o ésteres de sulfo-N- hidroxisuccinimida (sulfo NHS) que reaccionan con aminas nucleófilas. Los ejemplos de ésteres de NHS homobifuncionales incluyen bis(sulfosuccinimidil) suberato, disuccinimidil glutarato, ditiobis(succinimidil) propionato, disuccinimidil suberato, disuccinimidil tartrato. En ocasiones los electrófilos son grupos aldehído que forman imidas con aminas nucleófilas en el epítopo y las moléculas de polielectrolito. Los enlaces imida son transitoriamente estables pero pueden convertirse en estructuras estables con agentes reductores tales como borohidruro de sodio o hidrogenación catalítica. El enlazador de aldehído homobifuncional más comúnmente utilizado es el glutaraldehído.
Otros enlazadores homobifuncionales usados comúnmente contienen electrófilos que reaccionan específicamente con tioles nucleófilos, los cuales pueden usarse para unir péptidos epitópicos que contienen cisteínas a polielectrolitos que contienen sulfhidrilos como se describe anteriormente. Los ejemplos de enlazadores homobifuncionales específicos de sulfhidrilo incluyen 1,4-bismaleimidobutano, 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano, vbismaleimidohexano, bis-maleimidoetano, 1,4-Di-[3'-(2'piridilditio)-propionamido) butano, ditiobismaleimidoetano, 1,6-hexano-bis-vinilsulfona.
Los miembros de la clase heterobifuncional de reactivos de reticulación contienen dos grupos de reactividad distintos, a menudo, pero no siempre, electrófilos, que reaccionan específicamente con distintos grupos funcionales de las moléculas sustrato. Son particularmente útiles los enlazadores que contienen un grupo electrófilo que es específico para un sulfhidrilo y otro electrófilo que es específico para una amina. Los ejemplos de estos reactivos incluyen W-sulfosuccinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato, W-succinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato, succinimidil 3- [bromoacetamido]propionato, /V-succinimidil iodoacetato, sulfosuccinimidil 4-[V-maleimidometil]ciclohexano-1- carboxilato, succinimidil 4-[V-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, (éster de[N-e-
maleimidocaproiloxi]sulfosuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, V-succinimidil 3-(2- piridilditio)-propionato, succinimidil 6-(3'-[2-piridilditio]propionamido)hexanoato, 4-succinimidiloxicarbonil-metil-a-[2- piridilditio)tolueno.
La amplia variedad de funcionalidad que está normalmente presente tanto en los péptidos epitópicos como en los polielectrolitos o que puede instalarse fácilmente en cualquiera de las moléculas permite escoger la estrategia de unión que mejor se adapte a los sustratos de interés. Un ejemplo plausible es la unión de un péptido epitópico que contiene cisteínas a PLL.
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Los segmentos polipeptídicos se pueden unir de una diversidad de modos, dependiendo de la química del enlazador no peptídico. Por ejemplo, el extremo N del primer segmento polipeptídico se une al extremo C del segundo segmento polipeptídico; el extremo N del primer segmento polipeptídico se une al extremo N del segundo segmento polipeptídico; el extremo C del primer segmento polipeptídico se une al extremo C del segundo segmento
polipeptídico; el extremo C del primer segmento polipeptídico se une al extremo N del segundo segmento
polipeptídico; el extremo C o el extremo N del primer segmento polipeptídico se une a una cadena lateral colgante del segundo segmento polipeptídico; o el extremo C o el extremo N del segundo segmento polipeptídico se une a una cadena lateral colgante del primer segmento polipeptídico. Independientemente del punto de unión, sin embargo, los segmentos primero y segundo están unidos covalentemente mediante un enlazador no peptídico.
En una realización, un polipéptido diseñado es una combinación exclusiva de una o más regiones de adsorción a superficie unidas covalentemente y uno o más epítopos de RSV. Los epítopos de RSV pueden ser epítopos lineales o conformacionales. En conformidad con la invención, los epítopos de RSV consisten en de 3 a 120 aminoácidos.
En una realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV y una región de adsorción de superficie.
En otra realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV y dos regiones de adsorción de
superficie, una unida al extremo N del epítopo de RSV y una unida al extremo C del epítopo de RSV. El fin de la región (o regiones) de adsorción a superficie es permitir la adsorción del polipéptido sobre una superficie cargada de forma opuesta para construir una película multicapa.
El número de regiones de adsorción a superficie en un polipéptido diseñado con respecto al número y/o longitud de los epítopos de RSV está relacionado con los requisitos de solubilidad. Por ejemplo, si el epítopo de RSV es una secuencia de aminoácidos corta de, por ejemplo, tres restos de aminoácido, se precisará solo una región de adsorción a superficie de al menos ocho restos de aminoácido para adsorber el polipéptido diseñado sobre una superficie cargada de forma adecuada. Si, por el contrario, el epítopo de RSV es un dominio estructural plegado soluble de una proteína que comprende, por ejemplo, 120 restos de aminoácido, pueden precisarse dos regiones de adsorción a superficie para impartir suficiente carga para que el polipéptido diseñado sea soluble en agua y adecuado para la adsorción. Las regiones de adsorción a superficie podrían ser contiguas y emplazarse en el extremo N del dominio, ser contiguas y emplazarse en el extremo C del dominio, o no ser contiguas estando una en el extremo N y una en el extremo C. De manera adicional, un epítopo de RSV puede contener un segmento cargado (cargado negativamente o cargado positivamente) dentro de su secuencia nativa, que puede servir como una región de adsorción a superficie.
Un polipéptido o antígeno puede contener uno o más determinantes antigénicos distintos. Un determinante antigénico puede referirse a una porción inmunogénica de una proteína de múltiples cadenas.
Los métodos y técnicas para determinar el emplazamiento y la composición de un determinante antigénico o epítopo para un anticuerpo específico son bien conocidos en la técnica. Estas técnicas pueden usarse para identificar y/o caracterizar epítopos para su uso como epítopos de RSV. En una realización, los métodos de mapeo/caracterización de un epítopo para un anticuerpo específico de antígeno pueden determinarse por "foot-printing" epitópico usando la modificación química de las aminas/carboxilos expuestos en la proteína antigénica. Un ejemplo de tal técnica de foot-printing es el uso de HXMS (intercambio de hidrógeno-deuterio detectado por espectrometría de masas) en donde se produce un intercambio de hidrógeno/deuterio de los protones de las amidas de una proteína ligando y un receptor, la unión y un intercambio hacia atrás, en donde los grupos amida del esqueleto que participan en la unión de la proteína están protegido del intercambio hacia atrás y, por lo tanto, permanecerán
deuterados. En este punto, las regiones relevantes pueden identificarse por proteólisis con pepsina, separación por cromatografía líquida de alto rendimiento de microcalibre rápida y/o electronebulización-espectrometría de masas.
En otra realización, una técnica de identificación de epítopos adecuada es el mapeo epitópico por resonancia magnética nuclear (RMN), donde normalmente se compara la posición de las señales en los espectros de RMN bidimensional del antígeno libre y el antígeno formando complejo con el péptido de unión al antígeno, tal como un anticuerpo. Normalmente, el antígeno se marca isotópicamente de forma selectiva con 15N de forma que solo se vean en el espectro de RMN las señales correspondientes al antígeno y no las señales del péptido de unión al antígeno. Las señales del antígeno que se originan a partir de aminoácidos implicados en la interacción con el péptido de unión al antígeno normalmente cambiarán de posición en los espectros del complejo en comparación con los espectros del antígeno libre, y de esa manera se pueden identificar los aminoácidos implicados en la unión.
En otra realización, la caracterización/mapeo de epítopos se puede realizar mediante exploración de péptidos. En este enfoque, una serie de péptidos solapantes que abarcan la longitud completa de la cadena polipeptídica de un antígeno se preparan y analizan individualmente con respecto a la inmunogenicidad. El título de anticuerpos del antígeno peptídico correspondiente se determina mediante un método convencional, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Después, los diversos péptidos se pueden clasificar con respecto a la inmunogenicidad, proporcionando una base empírica para la selección del diseño de péptidos para el desarrollo de vacunas.
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En otra realización, también pueden ser útiles en el contexto del mapeo e identificación de epítopos las técnicas de digestión con proteasas. Las regiones/secuencias relevantes del determinante antigénico se pueden determinar mediante digestión con proteasas, por ejemplo mediante el uso de una digestión con tripsina durante una noche (O/N) a 37 °C y pH 7-8, en una relación de aproximadamente 1:50 con respecto a la proteína antigénica, seguido por análisis de espectrometría de masas (MS) para la identificación del péptido. Los péptidos protegidos por la proteína antigénica frente a la escisión con tripsina pueden identificarse posteriormente mediante comparación de muestras sometidas a digestión con tripsina y muestras incubadas con CD38BP, y luego sometidas a digestión con, por ejemplo, tripsina (revelando de este modo la huella para el ligante). También, o alternativamente, se pueden usar en un método de caracterización de epítopos similar otras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc. Además, la digestión con proteasas puede proporcionar un método rápido para determinar el emplazamiento de la secuencia de un posible determinante antigénico dentro de una proteína antigénica conocida usando un anticuerpo conocido. En otra realización, también pueden ser útiles en el contexto del mapeo e identificación de epítopos las técnicas de digestión con proteasas.
Se divulga adicionalmente en el presente documento una composición inmunogénica, comprendiendo dicha composición inmunogénica una película multicapa que comprende dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta, en donde una capa comprende un epítopo de RSV. Opcionalmente, la composición inmunogénica comprende adicionalmente una o más capas que comprenden un polipéptido diseñado.
La película de polielectrolito multicapa de la invención comprende una pluralidad de epítopos de RSV, en los mismos o en distintos polipéptidos diseñados. La pluralidad de determinantes antigénicos puede ser de los mismos o de distintos agentes infecciosos. En una realización, la película comprende una pluralidad de polielectrolitos antigénicos exclusivos. En otra realización, la película comprende una pluralidad de polielectrolitos inmunogénicos que comprenden múltiples epítopos de RSV dentro de cada polielectrolito. Una ventaja de estas películas es que pueden estar presentes múltiples determinantes antigénicos o múltiples conformaciones de un único determinante antigénico lineal en una única partícula de vacuna sintética. Dichas películas con múltiples determinantes antigénicos pueden potencialmente producir anticuerpos frente múltiples epítopos, aumentando las probabilidades de que al menos algunos de los anticuerpos generados por el sistema inmunitario del organismo neutralicen al patógeno o a antígenos específicos diana en células cancerosas, por ejemplo.
En una realización, la película multicapa comprende opcionalmente una o más moléculas bioactivas inmunogénicas adicionales. Aunque no es necesario, las una o más moléculas bioactivas inmunogénicas adicionales comprenderán normalmente uno o más determinantes antigénicos adicionales. Las moléculas bioactivas inmunogénicas adecuadas adicionales incluyen, por ejemplo, un fármaco, una proteína, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un lípido, un fosfolípido, un hidrato de carbono, un polisacárido, un lipopolisacárido, una molécula inmunoestimuladora de bajo peso molecular, o una combinación que comprende una o más de las moléculas bioactivas anteriores. Otros tipos de potenciadores inmunitarios adicionales incluyen un fragmento funcional de membrana, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células, un orgánulo o una combinación que comprende una o más de las estructuras bioactivas anteriores.
En una realización, la película multicapa comprende opcionalmente una o más moléculas bioactivas adicionales. Las una o más moléculas bioactivas adicionales pueden ser un fármaco. Como alternativa, un núcleo sobre el que se puede depositar la película comprende una diversidad de encapsulantes distintos, por ejemplo, una o más moléculas bioactivas adicionales, incluido, por ejemplo, un fármaco. Por lo tanto, las composiciones inmunogénicas diseñadas como se describe en el presente documento también podrían usarse para terapia combinada, por ejemplo, suscitando una respuesta inmunitaria, y para el suministro dirigido de fármacos. Los "núcleos" micrométricos de un material terapéutico adecuado en forma "cristalina" se pueden encapsular por una composición inmunogénica que comprende los polipéptidos antigénicos, y las microcápsulas resultantes podrían usarse para el suministro de fármacos. En algunas condiciones el núcleo puede ser insoluble, por ejemplo, pH alto o baja temperatura, y soluble en las condiciones en las que se producirá una liberación controlada. La carga superficial sobre los cristales se puede determinar mediante mediciones de potencial Z (utilizado para determinar la carga en unidades electrostáticas sobre partículas coloidales en un medio líquido). La velocidad a la que se liberan los contenidos de microcápsulas desde el interior de la microcápsula al entorno circundante dependerá de una serie de factores, que incluyen el grosor de la cubierta de encapsulación, los polipéptidos antigénicos utilizados en la cubierta, la presencia de enlaces disulfuro, el grado de reticulación de los péptidos, la temperatura, la fuerza iónica y el método usado para ensamblar los péptidos. En general, cuanta más gruesa sea la cápsula, mayor es el tiempo de liberación.
En otra realización, la biomolécula inmunogénica adicional es una secuencia de ácido nucleico que tiene la capacidad de dirigir la síntesis del organismo hospedador de un inmunógeno deseado o de interferir con la expresión de información genética de un patógeno. En el caso anterior, tal secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, se inserta en un vector de expresión adecuado por métodos conocidos por los expertos en la materia. Los vectores de expresión adecuados para producir in vivo transferencia génica de alta eficacia incluyen vectores víricos retrovíricos, adenovíricos y del virus de la variolovacuna. Los elementos operativos de tales vectores de expresión incluyen al menos un promotor, al menos un operador, al menos una secuencia líder, al menos un codón de terminación y
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cualquier otra secuencia de ADN necesaria o preferente para una transcripción apropiada y la posterior traducción del ácido nucleico del vector. En particular, se contempla que tales vectores contendrán al menos un origen de replicación reconocido por el organismo hospedador junto con al menos un marcador de selección y al menos una secuencia promotora que tenga la capacidad de iniciar la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. En este último caso, se prepararán para el suministro múltiples copias de tal secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la encapsulación de los ácidos nucleicos dentro de una película polipeptídica multicapa en forma de una cápsula para el suministro intravenoso.
En la construcción de un vector de expresión recombinante, debe señalarse adicionalmente que pueden insertarse en cada vector copias múltiples de la secuencia de ácido nucleico de interés y sus elementos operativos asociados. En tal realización, el organismo hospedador produciría mayores cantidades de la proteína deseada por vector. El número de copias múltiples de la secuencia de ácido nucleico que puede insertarse en el vector está limitado solo por la capacidad del vector resultante, debido a su tamaño, de ser transferido y replicarse, y transcribirse en un microorganismo hospedador apropiado.
En una realización adicional, la película de la invención comprende una mezcla de polielectrolitos antigénicos/moléculas bioactivas inmunogénicas. Estos pueden obtenerse del mismo antígeno, pueden ser antígenos distintos del mismo agente infeccioso o enfermedad, o pueden ser de distintos agentes infecciosos o enfermedades. Por lo tanto, el complejo o mezcla producirá una respuesta inmunitaria frente a varios antígenos y posiblemente una serie de agentes infecciosos o enfermedades según lo especificado por los componentes peptídicos/proteicos antigénicos del sistema de suministro.
En una realización, la película multicapa desencadena una respuesta del sistema inmunitario frente a un patógeno. En una realización, una composición de vacuna comprende una película de la invención en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, un método de vacunación frente a una enfermedad patógena comprende la administración a un sujeto que necesita vacunación de una cantidad eficaz de la película de la invención.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, grandes macromoléculas que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, partículas víricas inactivas y similares. Además se pueden usar en la composición sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos o sulfatos, así como las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos. Las composiciones también pueden contener líquidos, tal como agua, solución salina, glicerol y etanol, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emusionantes o agentes tamponadores de pH. Se pueden usar liposomas como vehículos.
Un método para suscitar una respuesta inmunitaria frente a una enfermedad o patógeno en un vertebrado (por ejemplo, vacunación) comprende administrar una composición inmunogénica que comprende una película multicapa de la invención. En una realización, el polielectrolito que contiene el epítopo de RSV está en la capa más exterior o expuesta al disolvente de la película multicapa. La composición inmunogénica se puede administrar por vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, sublingual, intradérmica, pulmonar o transdérmica, ya sea con o sin una dosis de refuerzo. En general, las composiciones se administran de manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad tal que sean profilácticamente y/o terapéuticamente eficaces. Las cantidades precisas de composición inmunogénica a administrar dependen del criterio del médico y pueden ser peculiares para cada sujeto. Será evidente para los expertos en la materia que la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica dependerá, entre otros,
de la pauta de administración, de la dosis unitaria de antígeno administrado, de si las composiciones se administran en combinación con otros agentes terapéuticos y del estado inmunitario y la salud del receptor. Un especialista sanitario experto en la materia puede determinar una dosificación terapéuticamente eficaz basándose en las características del paciente (edad, peso, sexo, estado, complicaciones, otras enfermedades, etc.), como es bien sabido en la materia. Adicionalmente, a medida que se realizan estudios rutinarios adicionales, irá emergiendo información más específica con respecto a los niveles de dosificación adecuados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el experto en la materia, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, es capaz de determinar la dosificación apropiada.
La composición inmunogénica comprende adicionalmente un adyuvante. En general, los adyuvantes comprenden sustancias que refuerzan la respuesta inmunitaria del hospedador de una manera no específica. La selección de un adyuvante depende del sujeto a vacunar. Preferentemente, se usa un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una vacuna para un ser humano debe evitar los adyuvantes para emulsiones oleosas o hidrocarburo, incluyendo el adyuvante de Freund completo e incompleto. Un ejemplo de un adyuvante adecuado para su uso en seres humanos es el alumbre (gel de alúmina). Una vacuna para un animal, sin embargo, puede contener adyuvantes no apropiados para el uso con seres humanos.
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Se contempla que se puede suscitar una respuesta inmunitaria a través de la presentación de cualquier proteína o péptido que tenga la capacidad de suscitar tal respuesta. En una realización, el antígeno es un epítopo clave, que da lugar a una fuerte respuesta inmunitaria frente a un agente de enfermedades infecciosas particular, es decir, un epítopo inmunodominante. Si se desea, para aumentar la probabilidad de una respuesta inmunitaria se puede incluir en la composición inmunogénica más de un antígeno o epítopo.
En conformidad con la invención, se incorporan múltiples epítopos peptídicos o proteicos del RSV en una película de ECPC. Los distintos epítopos pueden sintetizarse o expresarse en una única molécula peptídica diseñada. Se espera que colocar múltiples epítopos dentro de un único péptido diseñado tenga determinadas ventajas. Por ejemplo, debería simplificar el proceso de fabricación por ECPC y aumentar la reproducibilidad. De manera adicional, la colocación de múltiples epítopos dentro de un único péptido diseñado bloqueará las relaciones molares de los distintos epítopos en una relación deseada, por ejemplo 1:1.
Como alternativa, los epítopos se pueden incorporar en péptidos diseñados distintos. Los péptidos diseñados se incorporan en una película de ECPC durante uno o más etapas de formación de capas. La fabricación de películas usando múltiples péptidos diseñados distintos también puede presentar determinadas ventajas. Debería simplificar la síntesis de péptidos diseñados reduciendo los costos. Además permitirá variar y optimizar las dosis relativas de cada péptido diseñado dentro de la película. Si, por
ejemplo, los datos biológicos preclínicos o clínicos indicaron que una vacuna óptima debería contener cinco copias de un epítopo por cada copia de un segundo epítopo (relación 5:1), el enfoque de péptidos diseñados con epítopos separados facilitaría la fabricación de tal vacuna.
Los péptidos diseñados se adsorben a la superficie de una película de ECPC en virtud de la atracción electrostática entre la región (o regiones) de adsorción a superficie cargada del péptido diseñado y la superficie cargada de forma opuesta de la película. La eficacia de la adsorción dependerá en gran medida de la composición de la región (o regiones) de adsorción a superficie. De este modo, los péptidos diseñados con distintos epítopos pero una región (o regiones) de adsorción a superficie similar se adsorberán con una eficacia similar. Para fabricar una película con dos péptidos diseñados distintos, cada uno a una relación molar de 1:1, se podrían mezclar los péptidos a esa relación molar y depositarlos simultáneamente en una capa particular. Como alternativa, se podría depositar cada péptido individualmente en capas separadas. La relación molar de los péptidos adsorbidos reflejará en gran medida las concentraciones relativas a las que fueron depositados en capas o el número de etapas de formación de capas durante el cual se incorporaron.
La cantidad de péptidos diseñados incorporados en una película de ECPC puede medirse en una diversidad de formas. El análisis cuantitativo de aminoácidos (AAA) es particularmente adecuado para este propósito. Las películas que contienen péptidos diseñados se descomponen en sus aminoácidos constituyentes mediante tratamiento con ácido clorhídrico concentrado (6 M) y calentamiento, normalmente a 115 °C durante 15 horas. Después, se miden las cantidades de cada aminoácido usando técnicas cromatográficas bien conocidas por los expertos en la materia. Los aminoácidos que están presentes en solo uno de los péptidos diseñados en una película se pueden usar como indicadores de ese péptido. Cuando los péptidos diseñados carecen de aminoácidos exclusivos, durante la síntesis pueden incorporarse aminoácidos no naturales (por ejemplo, aminobutírico u homovalina) en los péptidos diseñados. Estos aminoácidos indicadores se identifican fácilmente durante el experimento de AAA y se pueden usar para cuantificar la cantidad de péptido en la película.
Como se usa en el presente documento, una respuesta de linfocitos T específica es una respuesta que es específica para un epítopo de interés, específicamente un epítopo de RSV tal como un epítopo de M2 de RSV, como se divulga en el presente documento. Una respuesta de linfocitos T específica puede ser una respuesta de linfocitos T citotóxicos o una respuesta de linfocitos T auxiliares, pero que preferentemente será una repuesta de linfocitos T.
Como se usa en el presente documento, una respuesta de anticuerpos específica es una respuesta que es específica para un epítopo de interés, específicamente un epítopo de RSV tal como un epítopo de G de RSV, como se divulga en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "capa" significa un aumento de grosor, por ejemplo, sobre un molde para la formación de película, después de una etapa de adsorción. "Multicapa" significa múltiples aumentos de grosor (es decir, dos o más). Una "película de polielectrolito multicapa" es una película que comprende uno o más aumentos de grosor de polielectrolitos. Después de la deposición, las capas de una película multicapa pueden no permanecer como capas discretas. De hecho, es posible que haya una entremezcla significativa de especies, en particular en las interfaces de los aumentos de grosor. La entremezcla, o la ausencia de la misma, puede controlarse por técnicas analíticas tales como mediciones de los potenciales Z, la espectroscopía de fotoelectrones de rayos X y espectrometría de masas de iones secundarios por tiempo de vuelo.
"Aminoácido" significa un componente básico de un polipéptido. Como se usa en el presente documento, "aminoácido" incluye los 20 L-aminoácidos de origen natural comunes, todos los otros aminoácidos naturales, todos los aminoácidos no naturales y todos los miméticos de aminoácido, por ejemplo, los peptoides.
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"Aminoácidos de origen natural" significa glicina más los 20 L-aminoácidos de origen natural comunes, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, fenilalanina, ornitina, tirosina, triptófano y prolina.
"Aminoácidos no naturales" significa un aminoácido distinto de cualquiera de los 20 L-aminoácidos de origen natural comunes. Un aminoácido no natural puede tener una estequiometría L o D.
"Peptoides", o glicina N-sustituida, significa un análogo del correspondiente monómero de aminoácido, con la misma cadena lateral que el aminoácido correspondiente, pero con la cadena lateral anexa al átomo de nitrógeno del grupo amino en lugar de a los a-carbonos del resto. Por consiguiente, los enlaces químicos entre los monómeros de un polipéptido no son enlaces peptídicos, lo que puede ser útil para limitar la digestión proteolítica.
"Secuencia de aminoácidos" y "secuencia" significan un tramo contiguo de una cadena de polipéptido que tiene al menos dos restos de aminoácidos de longitud.
"Resto" significa un aminoácido en un polímero o un oligómero; es el resto del monómero de aminoácido a partir del cual se formó el polímero. La síntesis de polipéptidos implica deshidratación, es decir, al agregar el aminoácido a una cadena polipeptídica se "pierde" una única molécula de agua.
Como se usa en el presente documento, "péptido" y "polipéptido" se refieren a una serie de aminoácidos conectados entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo de aminoácidos adyacentes, y pueden contener o no tener modificaciones tales como glucosilación, oxidación de la cadena lateral o fosforilación, siempre que tales modificaciones, o la falta de las mismas, no destruya la inmunogenicidad. Como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere tanto a un péptido como a un polipéptido o proteína.
"Polipéptido diseñado" significa un polipéptido que tiene carga suficiente para una unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, es decir, un polipéptido que puede depositarse en una capa de una película multicapa en donde la fuerza impulsora para la formación de la película es la electrostática. En realizaciones específicas, un polipéptido diseñado es al menos de 15 aminoácidos de longitud y la magnitud de la carga neta por resto del polipéptido es mayor o igual a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 a pH 7,0. En una realización, la relación del número de restos cargados de la misma polaridad menos el número de restos de la polaridad opuesta al número total de restos del polipéptido es mayor o igual a 0,5 a pH 7,0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por resto del polipéptido es mayor o igual a 0,5. Aunque no existe un límite superior absoluto para la longitud del polipéptido, en general, los polipéptidos diseñados adecuados para la deposición de ECPC tienen un límite superior práctico de longitud de 1.000 restos. Los polipéptidos diseñados pueden incluir secuencias que se encuentran en la naturaleza, tales como epítopos de RSV, así como regiones que proporcionan funcionalidad a los péptidos, tales como regiones cargadas también denominadas en el presente documento regiones de adsorción a superficie, la cuales permiten que los polipéptidos diseñados se depositen en una película polipeptídica multicapa.
"Estructura primaria" significa la secuencia lineal contigua de aminoácidos en una cadena de polipéptido y "estructura secundaria" significa los tipos más o menos regulares de estructura en una cadena polipeptídica estabilizada por interacciones no covalentes, habitualmente enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de estructura secundaria incluyen a hélice, lámina p y giro p.
"Película polipeptídica multicapa" significa una película que comprende uno o más polipéptidos diseñados como se definió anteriormente. Por ejemplo, una película polipeptídica multicapa comprende una primera capa que comprende un polipéptido diseñado y una segunda capa que comprende un polielectrolito que tiene una carga neta de polaridad opuesta al polipéptido diseñado. Por ejemplo, si la primera capa tiene una carga neta positiva, la segunda capa tiene una carga neta negativa; y si la primera capa tiene una carga neta negativa, la segunda capa tiene una carga neta positiva. La segunda capa comprende otro polipéptido diseñado u otro polielectrolito.
"Sustrato" significa un material sólido con una superficie adecuada para la adsorción de polielectrolitos de una solución acuosa. La superficie de un sustrato puede tener esencialmente cualquier forma, por ejemplo, plana, esférica, en forma de varilla, etc. La superficie del sustrato puede ser regular o irregular. Un sustrato puede ser un cristal. Un sustrato puede ser una molécula bioactiva. Un sustrato varía de tamaño desde la nanoescala a la macroescala. Además, un sustrato comprende opcionalmente varias subpartículas pequeñas. Un sustrato puede estar fabricado de un material orgánico, un material inorgánico, un material bioactivo o una combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes de sustratos incluyen obleas de silicio; partículas coloidales cargadas, por ejemplo, micropartículas de CaCO3 o melamina formaldehído; células biológicas tales como eritrocitos, hepatocitos, células bacterianas y células de levadura; redes poliméricas orgánicas, por ejemplo, poliestireno o redes de copolímeros de estireno; liposomas; orgánulos; y virus. En una realización, un sustrato es un dispositivo médico tal como un marcapasos artificial, un implante coclear o una endoprótesis vascular.
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Cuando un sustrato se desintegra o se elimina de otra forma durante o después de la formación de la película, se denomina "un molde" (para la formación de película). Las partículas de molde pueden disolverse en disolventes apropiados o eliminarse mediante tratamiento térmico. Si, por ejemplo, se utilizan partículas de molde de melamina- formaldehído parcialmente reticuladas, el molde se puede desintegrar mediante métodos químicos suaves, por ejemplo, en DMSO, o mediante un cambio del valor del pH. Después de la disolución de las partículas de molde, quedan las cubiertas multicapa huecas que están compuestas de capas de polielectrolito alternas.
Una "cápsula" es una película de polielectrolito en forma de una cubierta hueca o un recubrimiento que rodea un núcleo. El núcleo comprende una diversidad de encapsulantes distintos, por ejemplo, una proteína, un fármaco o una combinación de los mismos. Las cápsulas con diámetros inferiores a aproximadamente 1 pm se denominan nanocápsulas. Las cápsulas con diámetros mayores a aproximadamente 1 pm se denominan microcápsulas.
"Reticulación" significa la formación de un enlace covalente, o de varios enlaces, o de muchos enlaces entre dos o más moléculas.
"Molécula bioactiva" significa una molécula, macromolécula o ensamblaje macromolecular que tiene un efecto biológico. El efecto biológico específico se puede medir en un ensayo adecuado y normalizar por unidad de peso o por molécula de la molécula bioactiva. Una molécula bioactiva puede estar encapsulada, retenida detrás, o encapsulada dentro de una película de polielectrolito. Los ejemplos no limitantes de una molécula bioactiva son un fármaco, un cristal de un fármaco, una proteína, un fragmento funcional de una proteína, un complejo de proteínas, una lipoproteína, un oligopéptido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ribosoma, un agente terapéutico activo, un fosfolípido, un polisacárido, un lipopolisacárido. Como se usa en el presente documento, "molécula bioactiva" abarca adicionalmente estructuras biológicamente activas, tales como, por ejemplo, un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células y un orgánulo.
Los ejemplos de una proteína que puede encapsularse o retenerse detrás de una película polipeptídica son la hemoglobina; enzimas, tales como, por ejemplo, la glucosa oxidasa, la ureasa, la lisozima y similares; proteínas de matriz extracelular, por ejemplo, fibronectina, laminina, vitronectina y colágeno, y un anticuerpo. Los ejemplos de una célula que puede encapsularse o retenerse detrás de una película polipeptídica son células de los islotes trasplantadas, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula vegetal y una célula de levadura.
"Biocompatible" significa que no causa ningún efecto adverso sustancial sobre la salud tras la ingestión oral, aplicación tópica, aplicación transdérmica, una inyección subcutánea, inyección intramuscular, inhalación, implantación o inyección intravenosa. Por ejemplo, las películas biocompatibles incluyen las que no provocan una respuesta inmunitaria sustancial cuando están en contacto con el sistema inmunitario de, por ejemplo, un ser humano.
"Respuesta inmunitaria" significa la respuesta del sistema inmunitario celular o humoral frente a la presencia de una sustancia en cualquier parte del cuerpo. Una respuesta inmunitaria se puede caracterizar de varias maneras, por ejemplo, por un aumento en el flujo sanguíneo del número de anticuerpos que reconocen un determinado antígeno. Los anticuerpos son proteínas secretadas por los linfocitos B y un inmunógeno es una entidad que suscita una respuesta inmunitaria. El cuerpo humano combate la infección e inhibe la reinfección al aumentar el número de anticuerpos en el torrente sanguíneo y en otros lugares.
"Antígeno" significa una sustancia extraña que suscita una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la producción de moléculas de anticuerpo específicas) cuando se introduce en los tejidos de un organismo vertebrado susceptible. Un antígeno contiene uno o más epítopos. El antígeno puede ser una sustancia pura, una mezcla de sustancias (incluyendo células o fragmentos celulares). El término antígeno incluye un determinante antigénico, autoantígeno, antígeno propio, antígeno que reacciona de forma cruzada, aloantígeno, tolerógeno, alergeno, hapteno e imnunógeno adecuados, o partes de los mismos, y combinaciones de los mismos, y estos términos se usan indistintamente. Generalmente, los antígenos son de alto peso molecular y comúnmente son polipéptidos. Se dice que los antígenos que suscitan respuestas inmunitarias fuertes son fuertemente inmunogénicos. El sitio en un antígeno al que se puede unir específicamente un anticuerpo complementario se denomina epítopo o determinante antigénico.
"Antigénico" se refiere a la capacidad de una composición para dar lugar a anticuerpos específicos frente a la composición o para dar lugar a una respuesta inmunitaria mediada por células.
Como se usa en el presente documento, los términos "epítopo" y la expresión "determinante antigénico" se usan indistintamente y significan la estructura o secuencia de un antígeno, por ejemplo, una proteína o un péptido diseñado, que reconoce un anticuerpo. Normalmente, un epítopo estará en la superficie de una proteína. Un "epítopo continuo" es uno que implica varios restos de aminoácido contiguos, no uno que implica restos de aminoácido que puedan estar en contacto o en la región limitada de espacio en una proteína plegada. Un "epítopo conformacional" implica restos de aminoácido de distintas porciones de la secuencia lineal de una proteína que entran en contacto en la estructura tridimensional de la proteína. Para que se produzca una interacción eficaz entre
5
10
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20
25
30
35
el antígeno y el anticuerpo, el epítopo debe estar fácilmente disponible para la unión. Por lo tanto, el epítopo o los determinantes antigénicos están presentes en el entorno celular nativo del antígeno o solo están expuestos cuando están desnaturalizados. En su forma natural, pueden ser citoplásmicos (solubles), estar asociados a membrana o secretarse. El número, el emplazamiento y el tamaño de los epítopos dependerán de cuanto antígeno se presenta durante el proceso de fabricación del anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, una "composición de vacuna" es una composición que suscita una respuesta inmunitaria en un mamífero al que se administra y que protege el organismo inmunizado frente a la exposición posterior con el agente inmunizante o un agente de reactividad cruzada inmunológicamente. La protección puede ser completa o parcial con respecto a la reducción de los síntomas o la infección, en comparación con un organismo no vacunado. Un agente de reactividad cruzada inmunológicamente puede ser, por ejemplo, la proteína completa (por ejemplo, glucosiltransferasa) a partir de la cual se ha obtenido un péptido de subunidad para su uso como inmunógeno. Como alternativa, un agente de reactividad cruzada inmunológicamente puede ser una proteína distinta, que reconocen en su totalidad o en parte los anticuerpos suscitados por el agente inmunizante.
Como se usa en el presente documento, una "composición inmunogénica" pretende abarcar una composición que suscita una respuesta inmunitaria en un organismo al que se administra y que puede o no proteger al mamífero inmunizado frente a una exposición posterior con el agente inmunizante. En una realización, la composición inmunogénica es una composición de vacuna.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Síntesis de polipéptidos diseñados (PD)
Los polipéptidos diseñados se obtuvieron de epítopos que se encuentran en secuencias de las proteínas G de RSV, F de RSV o M2 de RSV. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de longitud completa son las siguientes (los epítopos peptídicos seleccionados incorporados en los polipéptidos diseñados están subrayados).
G de RSV- SEQ ID NO:1
1 MSKNKDQRTA KTLERTWDTL NHLLFISSCL YKLNLKSVAQ ITLSILAMII STSLIIAAII 60
61 FIASANHKVT PTTAIIQDAT SQIKNTTPTY FTQNPQFGIS PSNPSEITSQ ITTIFASTTP 120
121 GVKSTFQSTT VKTKNTTTTQ TQPSKPTTKQ RQNKPPSKPN
NDFHFEVFNF VPCSICSNNP 180
181 TCWAICKRIP NKKPGKKTTT KPTKKPTFKT TKKDPKPQTT
KSKEVPTTKP TEEPTINTTK 240
241 TNIITTFFTS NTTGNPEFTS QMETFHSTSS EGNPSPSQVS TTSEYPSQPS SPPNTPRQ 298
F de RSV- SEQ ID NO:2

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
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    30
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    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca,
    en donde dicha película multicapa comprende un epítopo de la proteína M2 de RSV y un epítopo de la proteína G de RSV, consistiendo dichos epítopos en 3 a 120 aminoácidos, como parte de uno o más polipéptidos diseñados, en donde un polipéptido diseñado es un polipéptido que consiste en una o más regiones de absorción a superficie cargadas de al menos 8 aminoácidos unidos covalentemente al epítopo de la proteína M2 de RSV, el epítopo de la proteína G de RSV, o ambos, que tienen carga suficiente para la unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, y en donde el polipéptido diseñado y las una o más regiones de absorción a superficie cargadas en el mismo están cargadas de forma positiva o cargadas de forma negativa,
    en donde dicha película multicapa comprende dos o más capas de polielectrolitos, en donde las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta,
    en donde al menos un polielectrolito de la película multicapa es dicho uno o más polipéptidos diseñados y en donde un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula.
  2. 2. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 1, en donde el polipéptido diseñado tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y tiene una carga neta por resto a pH neutro de más de o igual a 0,1.
  3. 3. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 1, en donde el epítopo de la proteína M2 de RSV y el epítopo de la proteína G de RSV están presentes en un único polipéptido diseñado.
  4. 4. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 1, en donde el epítopo de la proteína M2 de RSV y el epítopo de la proteína G de RSV están presentes en distintos polipéptidos diseñados.
  5. 5. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 1, en donde el epítopo de la proteína M2 de RSV suscita una respuesta citotóxica o de linfocitos T auxiliares específica y el epítopo de la proteína G de RSV suscita una respuesta de anticuerpos específica.
  6. 6. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 1, en donde el epítopo de la proteína M2 de RSV comprende la SEQ ID NO: 7 y el epítopo de la proteína G de RSV comprende la SEQ iD NO: 4.
  7. 7. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 1, en donde dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente.
  8. 8. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 7, en donde dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente mediante enlaces amida.
  9. 9. La película de polielectrolitos multicapa depositada sobre una micropartícula núcleo o una nanopartícula núcleo, o en forma de una microcápsula hueca o una nanocápsula hueca de la reivindicación 7, en donde dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente mediante enlaces disulfuro.
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    Potencial zeta por etapas
    20
    PGA 2031 PUA PIJ, PC.A 1 2 3 4 5
    Pl.l. PC.A 6 7
    2( 44
    Adición (capa)
    Potencial zeta por etapas
    =- -20
    PGA 2031 PGA PLL PGA 1 2 3 4 5
    Pl.l. PGA (. 7
    21144
    Adición (capa)
    imagen5
    Potencial zeta por etapas
    PGA
    2031 PC, A
    PI.I,
    PC, A 5
    PI.I
    6
    PC. A
    7
    2044
    Adición (capa)
    Potencial zeta por etapas
    PGA
    I
    PGA
    PI.I
    6
    PGA
    7
    2044
    Adición (capa)
    imagen6
    imagen7
    Inhibición de CX3C de G de RSV-CX3CR1 I>
    100 -r
    90 -
    . 80'
    :2 70 -
    u
    £ 60 - ■3
    .£ 50 -
    o „
    •o 40 -
    N®
    ^ 30 - 20 - 10 - 0 -•
    PBS G de RSV 1042 10 ng Inmunógeno
    Figura 8
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    mezcla
    mezcla
    previo
    Estudio de M2 de RSV n. 2: Primaria
    2000
    IFNy
    O 1L-4
    1000
    C/5 ■
    M ('í (N
    ^ >
    o -3
    s:>
    ligura 11
    Figura 10,
    ELISPOT de M2 de RSV
    ELISPOT de G de RSV
    2000
    II.-'-
    [1,4
    SS [1 Ny
    □ U-Ny
    1500
    es 1000
    500
    2044
    (G)
    2031
    <M2l
    1042
    042
    1023 1023 mezcla
    í.n. a.p. í.n.
    mezcla
    a.p.
    2031
    (M2)
    1042
    1012
    1023
    1023
    a.p.
    mezcla mezcla i-n. a.p.
    previo
    í.n
    í.n
    a.p.
    Inniimogciio
    Inmunogeno
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    ELISA para G de RSY: Estudio de mezcla n.° 3
    sin trat. previo
    — (2Q44 + 203ÍYACF
    1042
    1042 y 1023
    1077 (2 )
    107814a)
    1079 (6a)
    100
    10000
    100000
    dilución de sueros
    Figura 15
    ELISA para G de RSV: Estudio de mezcla n. 3 ...
    sin trat. previo
    (2.044 + 203 lyACF
    1042 y 1023
    1077 (2 )
    ***** 1078 (4d)
    1079 (6a)
    1000
    100000
    100
    10000
    dilución de sueros
    UFP/g x 10
    rs
    s
    s
    —
    o
    «
    O
    O
    <]
    £
    o
    c.
    Estudio de mezcla de RSV n.° 3: sensibilización frente a refuerzo
    2,0
    1,8
    1-6 1 1
    1,2
    ir.
    1,0
    0,8
    0,4
    0-2
    ü-ü
    I Sensibilización ^
    S refuerzo
    sm
    trac.
    previo
    (204-4 +
    2031)MCF
    1042- 1042 y 1023 1077(2»)
    imagen14
    Figura 17
    imagen15
    imagen16
    Figura 19
    Actividad CTL in vivo
    imagen17
    Inmunó^cno
    imagen18
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9433671B2 (en) 2012-03-30 2016-09-06 Artificial Cell Technologies, Inc. Anti-malaria compositions and methods
US8883717B2 (en) * 2012-03-30 2014-11-11 Artificial Cell Technologies, Inc. Antigenic compositions and methods
KR102435054B1 (ko) * 2012-08-01 2022-08-22 버베리안 노딕 에이/에스 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(ankara) (mva) 호흡기 신시티알 바이러스(rsv) 백신
KR20230008909A (ko) * 2013-08-13 2023-01-16 노쓰웨스턴유니버시티 펩티드-접합된 입자
CA2946425C (en) 2014-05-27 2022-08-30 Artificial Cell Technologies, Inc. Automated layer by layer construction of multilayer coated cores by tff
US9630994B2 (en) 2014-11-03 2017-04-25 University Of Washington Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures
IL257895B2 (en) 2015-09-16 2024-03-01 Artificial Cell Tech Inc Preparations and methods against malaria
US20170230649A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 Qualcomm Incorporated Calibration of hybrid auto focus (af) imaging systems
MX2019011869A (es) 2017-04-04 2020-01-09 Univ Washington Nanoestructuras proteicas auto-ensamblables que muestran proteinas f de paramixovirus y/o neumovirus y su uso.
JP7445895B2 (ja) 2017-10-13 2024-03-08 トレリス・バイオサイエンス・インコーポレーテッド 呼吸器合胞体ウイルスｇタンパク質中央保存領域の立体構造エピトープ
WO2019169120A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 University Of Washington Self-asssembling nanostructure vaccines
US20230414526A1 (en) * 2022-03-29 2023-12-28 Artificial Cell Technologies, Inc. Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995004545A1 (en) * 1993-08-06 1995-02-16 Connaught Laboratories Limited Inactivated respiratory syncytial viral vaccines
FR2718452B1 (fr) 1994-04-06 1996-06-28 Pf Medicament Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation.
US6077511A (en) 1994-08-25 2000-06-20 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Antigenic peptide derived from the G protein of RSV for type- and subtype-specific diagnosis of respiratory syncytial virus (RSV) infection
FR2726471B1 (fr) 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins
AUPO026596A0 (en) 1996-06-05 1996-06-27 Biomolecular Research Institute Limited Viral peptide
AU2002224416A1 (en) 2000-10-18 2002-04-29 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Compositions and methods for modulating RSV infection and immunity
FR2819810B1 (fr) 2001-01-23 2004-05-28 Pf Medicament Peptides non glycosyles derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin
AUPR520201A0 (en) 2001-05-23 2001-06-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Antiviral compounds
JP3997930B2 (ja) 2003-02-27 2007-10-24 富士ゼロックス株式会社 カーボンナノチューブの製造装置および製造方法
US7368537B2 (en) 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
US7348399B2 (en) 2003-08-29 2008-03-25 Louisiana Tech University Foundation, Inc. Nanofabricated polypeptide multilayer films, coatings, and microcapsules
US7615530B2 (en) 2003-08-29 2009-11-10 Artificial Cell Technologies, Inc. Immunogenic compositions and methods of use
EP1768993A4 (en) * 2004-06-16 2008-07-23 Univ Johns Hopkins CYSTEINE-RICH REGION OF SYNCYTIAL RESPIRATORY VIRUS AND METHODS OF USE THEREOF
US20080131450A1 (en) 2004-07-23 2008-06-05 Pierre Fabre Medicament Immunogenic complexes, preparation method thereof and use of same in pharmaceutical compositions
EP1843802A2 (en) * 2005-01-31 2007-10-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Polyelectrolyte multilayer film, preparation and uses thereof
US20090220537A1 (en) * 2005-04-12 2009-09-03 The University Of Queensland Vaccine delivery system
WO2008030253A2 (en) * 2005-10-25 2008-03-13 Louisiana Tech University Research Foundation Multilayer films, coatings and microcapsules comprising polypeptides
EP1972348A1 (en) 2007-03-14 2008-09-24 Pierre Fabre Medicament Novel vaccine composition for the treatment of respiratory infectious diseases
EP2181121A4 (en) 2007-03-21 2012-07-11 Id Biomedical Corp Quebec CHIMÄRE ANTIGENE
US7723294B2 (en) 2007-04-02 2010-05-25 Artificial Cell Technologies, Inc. Polypeptide films and methods
WO2009079066A2 (en) * 2007-09-26 2009-06-25 Aparna Biosciences Therapeutic and vaccine polyelectrolyte nanoparticle compositions
EP2058002A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-13 Bestewil Holding B.V. Reconstituted respiratory syncytial virus membranes and use as respiratory syncytial virus vaccine
AU2009270399A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Id Biomedical Corporation Of Quebec Chimeric respiratory syncytial virus polypeptide antigens
US20110318376A1 (en) 2008-12-24 2011-12-29 University Of Rochester Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins
US8846056B2 (en) 2009-08-04 2014-09-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control Anti-RSV immunogens and methods of immunization
US8883717B2 (en) * 2012-03-30 2014-11-11 Artificial Cell Technologies, Inc. Antigenic compositions and methods

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Publication number Publication date
US9487593B2 (en) 2016-11-08
US20120009254A1 (en) 2012-01-12
EP2590675A1 (en) 2013-05-15
AU2011276251A2 (en) 2013-01-24
CA2799934A1 (en) 2012-01-12
CN106008716B (zh) 2019-08-13
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