MX2012015030A - Composiciones y procedimientos antigenicos del virus respiratorio sincitial. - Google Patents

Abstract

Películas multicapa comprenden epítopos polipeptídicos de RSV. Las películas multicapa son capaces de provocar una respuesta inmune en un huésped tras la administración al huésped. Las películas multicapa incluyen al menos un péptido diseñado que incluye uno o más epítopos polipeptídicos de RSV. Específicamente, las películas multicapa incluyen dos epítopos polipeptídicos de RSV, tales como un epítopo que provoca una respuesta de linfocitos T específica tal como una respuesta de linfocitos T citotóxica y un epítopo que provoca una respuesta de anticuerpos específica.

Description

COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS ANTIGÉNICOS DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para la prevención de la infección por el virus respiratorio sincitial, específicamente composiciones peliculares multicapa que contienen epítopos antigénicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus respiratorio sincitial (RSV) es la causa más importante de enfermedad del tracto respiratorio sincitial en lactantes y niños pequeños en todo el mundo y es también una amenaza para los pacientes de edad avanzada e inmunocomprometidos. En los Estados Unidos, las infecciones con RSV dan como resultado hasta 126.000 hospitalizaciones de lactantes y hasta 60.000 hospitalizaciones de adultos de edad avanzada por año. Dado que la infección con RSV natural no induce inmunidad a largo plazo duradera, los pacientes son susceptibles de reinfección con las mismas y diferentes cepas de virus a lo largo de la vida. El RSV está asociado con infecciones secundarias tales como otitis media y puede predisponer a niños pequeños a enfermedad relacionada con asma más adelante en la vida.

Después de más de 40 años de esfuerzo, no hay vacuna de RSV segura y efectiva. Los intentos más tempranos para desarrollar una vacuna de RSV precipitado en alumbre inactivado por formalina (FI-RSV) en los años 60 parece que realmente predispusieron a los niños vacunados a enfermedad más grave e incluso a muerte tras infección natural subsiguiente. Los mecanismos exactos de esta respuesta no se han caracterizado totalmente, pero parecen ser dependientes de una inclinación de la respuesta inmune hacia un fenotipo Th2-dominante caracterizado por activación inapropiada de rutas de citocinas y quimiocinas.

Dado el impacto económico de la enfermedad de RSV, estimado en cerca de 700 millones de dólares por año en los EE.UU. en 2.004 y las complicaciones potencialmente mortales que pueden resultar de la infección con RSV en pacientes lactantes, de edad avanzada e inmunocomprometidos, el desarrollo de vacunas de RSV seguras y efectivas es una prioridad alta.

Hay una necesidad de composiciones antigénicas mejoradas adecuadas para estimular una respuesta inmune a RSV.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una realización, una composición comprende un primer epítopo polipeptídico de RSV y un segundo epítopo polipeptídico de RSV, estando el primero y el segundo epítopos polipeptídicos unidos covalentemente a uno o más polielectrolitos, estando los uno o más polielectrolitos en una o más formas multicapa, en la que las una o más películas multicapa comprenden cada una dos o más capas de polielectrolitos, comprendiendo las capas adyacentes polielectrolitos cargados de forma opuesta y en la que el polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molécular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula y en la que el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en la misma película multicapa o en diferentes películas multicapa.

En otra realización, una composición comprende un primer epítopo polipeptídico de RSV y un segundo epítopo polipeptídico de RSV, estando el primero y el segundo epítopos polipeptídicos en forma de una o más películas multicapa que comprenden cada una dos o más capas de polielectrolitos, en la que las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta y en la que al menos un polielectrolito de la película multicapa comprende un polipéptido diseñado, en la que el polipéptido diseñado tiene suficiente carga para unión estable a una superficie de carga opuesta y en la que el polipéptido diseñado comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV, el segundo epítopo polipeptídico de RSV, o ambos, en la que un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula y en la que el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en la misma película multicapa o en diferentes películas multicapa.

Una composición comprende un epítopo polipeptídico de RSV-G unido covalentemente a uno o más polielectrolitos, en la que los uno o más polielectrolitos están en una o más películas multicapa, en la que las una o más películas multicapa comprenden cada una dos o más capas de polielectrolitos, en la que las capas adyacentes comprenden polielectrolitos cargados de forma opuesta y en la que el polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : muestra el espectro de masas de FT-ICR expandido para el estado de carga de MH6+6 de ACT-2044 intacto (SEC ID N.°: 8). m/z monoisotópica esperada para péptido oxidado totalmente = 1015,43, hallado = 1015,6008. Este resultado es totalmente consistente con dos disulfuros intramoleculares en ACT-2044.

Figura 2: muestra el espectro de masas de FT-ICR para ACT-2086 (SEC ID N.°: 13). El pico monoisotópico MH9+9 tiene una m/z de 867,1571 que corresponde a una masa monoisotópica de 7795,344 U u.m.a., que está muy cerca de la masa monoisotópica calculada de 7795,33 u.m.a. Este resultado es totalmente consistente con la presencia de dos enlaces disulfuro en ACT-2086.

Figura 3: muestra el potencial de superficie (zeta) de nanopartículas medidos después de cada etapa de formación de capas de ELBL. Las partículas no revestidas (EP) tienen un valor zeta positivo. El revestimiento con una capa única de PGA imparte un valor zeta negativo. Las etapas de formación de capas subsiguientes con péptidos diseñados ACT-2031 , polipéptidos PGA y PLL, o péptído diseñado ACT-2044 causan cambios positivos o negativos alternantes en potencial zeta, indicando etapas de ELBL exitosas.

Figura 4: muestra la inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartícula ACT-1042 (SEC ID N.°: 8; RSV-G164-i9i) por medio de inyección en la almohadilla plantar; los sueros se recogieron y se sometieron a prueba por ELISA. Los sueros reconocieron el péptido de epítopo RSV-G CX3C conformacional ACT-2044 SEC ID N.°: 8).

Figura 5: muestra la inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartícula ACT-1042 (SEC ID N.°: 8; RSV-Gi64-i9i) por medio de inyección en la almohadilla plantar; los sueros se recogieron y se sometieron a prueba por ELISA. Los sueros no reconocerán una versión del mismo péptido (ACT-2054; SEC ID N.°: 9) que se linealizó rematando los residuos de cisteína.

Figura 6: muestra la inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartícula ACT-1042 (SEC ID N.°: 8; RSV-G i6 -i9i) por medio de inyección en la almohadilla plantar; los sueros se recogieron y se sometieron a prueba por ELISA. Los sueros reconocieron también proteína RSV-G nativa.

Figura 7: muestra la inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartícula ACT-1042 (SEC ID N.°: 8; RSV-Gi64.i9i) por medio de inyección en la almohadilla plantar; los sueros se recogieron y se sometieron a prueba en un ensayo de unión bioquímica que mide inhibición de unión de RSV-G al receptor de quimiocinas CX3CR1. La actividad biológica de la respuesta de anticuerpos provocada por ACT-1042 se confirmó por inhibición de unión de RSV-G al receptor de quimiocinas.

Figura 8: muestra la inmunización de ratones BALB/c tres veces con nanopartícula ACT-1042 (SEC ID N.°: 8; RSV-G 64-i9i) por medio de inyección en la almohadilla plantar; los sueros se recogieron y se sometieron a prueba en un ensayo de migración celular. La actividad biológica de la respuesta de anticuerpos provocada por ACT-1042 se confirmó por inhibición de migración de PBMC humana a RSV-G purificada.

Figura 9: muestra las respuestas de linfocitos T específicos de RSV M2 tras inmunización con ACT-1023 (SEC ID N.°: 12; RSV-M281.98) subcutáneamente, intraperitonealmente, intranasalmente y por administración en la almohadilla plantar. Los esplenocitos se recogieron de los ratones en el día 14 tras la inmunización y se reestimularon en placas ELISPOT en IL-4 o IFNy con ACT-2019 (SEC ID N.°: 7), el péptido RSV-M2. Los resultados reflejan el número de linfocitos T específicos de antígenos/106 células en animales no inmunizados o inmunizados individuales.

Figura 10: muestra la inmunogenicidad de vacuna de cóctel de nanopartículas de RSV multivalente. Los ratones BALB/c (5/grupo, 5-6 semanas de edad) se inmunizaron los días 0 y 21. Respuestas de anticuerpos a RSV-G: Los sueros se recogieron en el día 28 y los títulos de anticuerpos IgG específicos de RSV-G se midieron por ELISA. Los datos representan la media de ± DE de 5 ratones por grupo.

Figura 11 : muestra la inmunogenicidad de vacuna de cóctel de nanopartículas de RSV multivalente. Los ratones BALB/c (5/grupo, 5-6 semanas de edad) se inmunizaron los días 0 y 21. Respuestas de linfocitos T a RSV-M2: Las células del bazo se recogieron el día 28 y se reestimularon con péptido RSV-M2 (ACT-2031 ; SEC ID N.°: 12) en placas ELISPOT de IFNy o de IL-4. Los datos representan la media de ± DE de 5 ratones por grupo.

Figura 12: muestra la inducción de actividad de CTL in vivo por inmunización con nanopartículas de RSV. Los ratones BALB/c se inmunizaron como se muestra y se sometieron a prueba 7 días después por inyección i.v. de de células del hígado singénicas sometidas a pulsos con ACT-2031 (RSV-M2; SEC ID N.°: 12) y se marcaron con una dosis alta de marcador fluorescente CFSE (picos azules) mezclado con células del bazo singénicas con una dosis baja de CFSE y ningún péptido objetivo (picos rojos). Al día siguiente, los bazos de los ratones inmunizados se analizaron por citometría de flujo para detectar supervivencia de las células objetivo donantes marcadas de forma diferencial. Cada histograma muestra los resultados de un ratón inmunizado individual en el grupo de tratamiento.

Figura 13: muestra la inducción de actividad de CTL in vivo por inmunización con nanopartículas de RSV. Los resultados muestran mortalidad específica en porcentaje de células objetivo marcadas con RSV-M2 en la Figura 12 calculado comparando el número relativo de células en cada pico dentro de un histograma.

Las Figuras 14 y 15 muestran la respuesta de anticuerpos después de sensibilizar (14) y reforzar (15) después de inmunización con partículas de RSV usando construcciones de epítopo individual y de epítopos múltiples.

La Figura 16 muestra un gráfico de barras de los resultados mostrados en las Figuras 14 y 15.

La Figura 17 muestra los resultados de una prueba con RSV vivo de ratones inmunizados con nanopartículas de RSV conteniendo bien un RSV-G, bien un RSV-M2 o bien una combinación. Los datos se muestran como un ensayo de placa y un ensayo de qPCR.

Figura 18: muestra la inducción de actividad de CTL in vivo por inmunización con nanopartículas de RSV. Los ratones BALB/c se inmunizaron como se muestra y se sometieron a prueba 7 días después por inyección i.v. de de células del hígado singénicas sometidas a pulsos con ACT-2031 (RSV-M2; SEC ID N.°: 12) y se marcaron con una dosis alta de marcador fluorescente CFSE (picos azules) mezclado con células del bazo singénicas con una dosis baja de CFSE y ningún péptido objetivo (picos rojos). Al día siguiente, los bazos de los ratones inmunizados se analizaron por citometría de flujo para detectar supervivencia de las células objetivo donantes marcadas de forma diferencial. Cada histograma muestra los resultados de un ratón inmunizado individual en el grupo de tratamiento.

Figura 19: muestra la inducción de actividad de CTL in vivo por inmunización con nanopartículas de RSV. Los resultados muestran mortalidad específica en porcentaje de células objetivo marcadas con RSV-M2 en la Figura 18 calculado comparando el número relativo de células en cada pico dentro de un histograma.

Figuras 20 y 21 : muestran las respuestas específicas de anticuerpos o de RSV-G. Los ratones BALB/c se inmunizaron en los días 0 y 21. Los títulos de anticuerpos IgG específicos de RSV-G en sueros post-refuerzo se midieron por ELISA. (20) Valores de densidad óptica de sueros individuales a dilución de 1 :50. Cóctel = ACT-1023 + 1042. Las barras horizontales representan el promedio de los valores individuales dentro de un grupo. (21 ) Promedio de 5 sueros por grupo en títulos seriados.

Las características anteriormente descritas y otras se apreciarán y entenderán por aquellos expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada, dibujos y reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el presente documento se divulgan películas multicapa que comprenden epítopos polipeptídicos de RSV, siendo las películas multicapa capaces de provocar una respuesta inmune en un huésped tras administración al huésped. En una realización, las películas multicapa comprenden dos epítopos polipeptídicos de RSV, específicamente un epítopo que provoca una respuesta de linfocitos T específica tal como una respuesta de linfocitos T citotóxica y un epítopo que provoca una respuesta de anticuerpos específica. En esta realización, se ha mostrado inesperadamente por los autores de la presente invención en el presente documento que combinando un epítopo que provoca una respuesta de linfocitos T específica y un epítopo que provoca una respuesta de anticuerpos específica, la potencia inmune medida como la respuesta de linfocitos T específica se ha incrementado inesperadamente comparada con la administración de un solo componente. Específicamente, una combinación de epítopos de RSV-G (respuesta de anticuerpos específica) y de RSV-M2 (respuesta de células específica) en forma de una o más películas multicapa provoca una respuesta de linfocitos T sustancialmente mejorada comparada con una película multicapa que contiene el epítopo de RSV-M2 solo.

Específicamente, las películas multicapa comprenden capas alternantes de polielectrolitos cargados de forma opuesta en los que una capa de polielectrolitos comprende un polielectrolito que tiene covalentemente unido a él al menos un epítopo polipeptídico de RSV. El primero y el segundo epítopos polipeptídicos de RSV pueden estar unidos al mismo o a diferentes polielectrolitos y/o pueden estar presentes en la misma película multicapa o en diferentes películas multicapa. En una realización, el primero y el segundo epítopos polipeptídicos de RSV están unidos covalentemente al mismo polielectrolito y así están en la misma película multicapa. En otra realización, el primero y el segundo epítopos polipeptídicos de RSV están unidos covalentemente a polielectrolitos diferentes, pero están formando capas en la misma película multicapa. En aún otra realización, el primero y el segundo polipéptido RSV están unidos covalentemente a diferentes polielectrolitos, pero están formando capas en diferentes películas multicapa que se mezclan subsiguientemente antes de la administración.

En una realización, las películas multicapa comprenden capas alternantes de polielectrolitos cargados de forma opuesta en los que una capa polielectrolítica es un polipéptido diseñado que comprende al menos un epítopo polipeptídico de RSV. El primero y el segundo epítopos polipeptídicos pueden estar presentes en el mismo polipéptido diseñado o en diferentes polipéptidos diseñados, y/o pueden estar presentes en la misma o en diferentes películas multicapa. En una realización, el primero y el segundo epítopos polipeptídicos de RSV están presentes en el mismo polipéptido diseñado y así están en la misma película multicapa. En otra realización, el primero y el segundo polipéptidos de RSV están presentes en polipéptidos diseñados diferentes, pero están formando capas dentro de la misma película multicapa. En aún otra realización, el primero y el segundo polipéptido RSV están presentes en polipéptidos diseñados de forma diferente, pero están formando capas en diferentes películas multicapa que se mezclan subsiguientemente antes de administración.

En una realización, los epítopos polipeptídicos de RSV son de la proteína RSV-G. La proteína RSV-G (de unión) se ha asociado con muchas aberraciones incluyendo expresión de ARNm de quimiocinas CC y CXC alteradas y respuestas de citocinas de Th2 que parecen respaldar salidas inmunes inapropiadas y enfermedad potenciada. La región conservada rica en cisternas central de la proteína RSV-G contiene un resto de quimiocina de CX3C en las posiciones de aminoácidos 182-186 que se unen a CX3CR1 , el receptor fractalcina (CX3CL1). La imitación de CX3CL1 por RSV-G se ha mostrado que provoca infección por RSV y que interfiere con respuestas inmunes adaptativas normales frente al virus. La inmunización activa con péptidos que abarcan el resto RSV-G CX3C protege a los ratones de infección con RSV y de infección pulmonar. Hasta ahora, estos péptidos RSV-G no se han desarrollado en una vacuna segura y efectiva.

En otra realización, los epítopos polipeptídicos de RSV son de la proteína RSV-F o de la proteína RSV-M2. Además de la proteína RSV-G, la proteína RSV-F (de fusión) y la proteíi a RSV-M2 (de matriz) son candidatos a vacunas posibles. Intentos de desarrollar vacunas de RSV monovalentes que contengan uno solo de los determinantes antigénicos principales han estado entorpecidos por protección incompleta a partir de infección y enfermedad inflamatoria, sugiriendo que una aproximación multivalente podría ser más exitosa. De hecho, la inmunización de ratones con vacunas multivalentes que facilitó tanto las respuestas de anticuerpos como las respuestas de linfocitos T CD8+ dieron como resultado un decrecimiento en respuestas Th2 y un incremento en respuestas Th1/CD8 que correlacionó con protección mayor de infección con virus y menos patología pulmonar inflamatoria. Estos resultados sugieren que el diseño de vacuna de RSV ideal incluiría epítopos a partir de dos o más proteínas víricas y provocaría tanto anticuerpos como linfocitos T CD8+ que secretan IFNy.

En otra realización, una película multicapa comprende un epítopo polipeptídico de RSV, siendo el epítopo polipeptídico de la proteína RSV-G (respuesta de anticuerpos específica). Se encontró inesperadamente que ratones inmunizados con nanopartículas que contienen un epítopo RSV-G CX3C estaban protegidos de provocación con RSV vivos. Interesantemente, un epítopo RSV-M2 no proporciona protección de provocación con RSV vivos y una combinación de vacuna RSV-G y RSV-M2 no proporciona protección mejorada comparada con RSV-G sola. Sin vinculación a ninguna teoría en particular, se cree que la concentración alta de nanopartículas usada en estos experimentos puede haber enmascarado los beneficios potenciales de las nanopartículas de combinación.

En una realización, la película de multicapas se deposita en una partícula núcleo, tal como una nanopartícula de CaC03, una partícula de látex, o una partícula de hierro. Los tamaños de partículas del orden de 5 nanómetros (nm) a 50 micrómetros (um) de diámetro son particularmente útiles. Las partículas hechas de otros materiales se pueden usar también como núcleos dado que son biocompatibles, tienen distribución de tamaños controlables y tienen suficiente carga de superficie (bien positiva o bien negativa) para unir péptidos polielectrolíticos. Ejemplos incluyen nanopartículas y micropartículas hechas de materiales tales como ácido poliláctico (PLA), copolímero de ácido glicólico ácido poliláctico (PLGA), polietilenglicol (PEG), quitosano, ácido halurónico, gelatina, o combinaciones de los mismos. Las partículas de núcleo también se hacen de materiales que se cree que son inapropiados para uso humano dado que se pueden disolver y separar de la película multicapa tras la fabricación de la película. Ejemplos de las sustancias de núcleo de molde incluyen polímeros orgánicos tales como látex o materiales inorgánicos tales como sílice.

Las películas multicapa polielectrolíticas son películas finas (por ejemplo, de unos pocos nanómetros a micrómetros de espesor) compuestas de capas alternantes de polielectrolitos cargados de forma opuesta. Tales películas pueden estar formadas por ensamblaje capa a capa en un sustrato adecuado. En el autoensamblaje capa a capa electrostático ("ELBL"), la base física de asociación de polielectrolitos es la atracción electrostática. La acumulación de películas es posible debido a que el signo de la densidad de carga de superficie de la película revierte en deposición de capas sucesivas. La generalidad y la relativa simplicidad del procesamiento de películas de ELBL permite la deposición de muchos tipos diferentes de polielectrolito sobre muchos tipos diferentes de superficie. Las películas multicapa polipeptídicas son un subgrupo de películas multicapa polielectrolíticas, que comprenden al menos un polipéptido cargado, referido en el presente documento como un polipéptido diseñado. Una ventaja clave de las películas multicapa polipeptídicas sobre las películas hechas de otros polímeros es su biocompatibilidad. Las películas de ELBL se pueden usar también para encapsulación. Las aplicaciones de películas : polipeptídicas y microcápsulas incluyen, por ejemplo, nano-reactores, biosensores, células artificiales y vehículos de desarrollo de fármacos.

El término "polielectrolito" incluye materiales policatiónicos y polianiónicos que tienen un peso molecular de más de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula. Los materiales policatiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, polipéptidos y poliaminas. Las poliaminas incluyen, por ejemplo, un polipéptido tal como poli-L-lisina (PLL) o poli-L-ornitina, polivinilamina, poli(aminoestireno), poli(aminoacrilato), poli(N-metilaminoacrilato), poli(N-etilaminoacrilato), poli(N,N-d¡metilaminoacrilato), poli(N,N-dietilaminoacrilato), poli(aminometacrilato), poli(N-metilamino-métácrilato), poli(N-etilaminometacrilato), poli(N,N-dimetilaminometacrilato), polo(N,N-dietilaminometacrilato), poli(etilenimina), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(cloruro de ?,?,?-trimetilaminoacrilato), poli(cloruro de metilacrilamidopropiltrimetilamonio), quitosano y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales policatiónicos precedentes. Los materiales polianiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, un polipéptido tal como ácido poli-L-glutámico (PGA) y ácido poli-L-aspártico, un ácido nucleico tal como ADN y ARN, alginato, carragenina, furcelarano, pectina, xantana, ácido hialurónico, heparina, heparán sulfato, sulfato de condroitina, dermatán sulfato, sulfato de dextrano, ácido poli(met)acrílico, celulosa oxidada, carboximetilcelulosa, polisacáridos ácidos y croscarmelosa, polímeros y copolímeros sintéticos que contienen grupos carboxilo laterales y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales polianiónicos anteriores. En una realización, el epítopo de RSV y el polielectrolito tienen el mismo signo de carga.

En una realización, una o más capas polielectrolíticas de la película, que incluyen opcionalmente el polielectolito que comprende el epítopo RSV, son un polipéptido seleccionado. En una realización, los principios de diseño para polipéptidos adecuados para la deposición capa a capa electrostática se dilucidan en la Publicación de Patente de los EE.UU. N.°: 2005/0069950, incorporada en el presente documento por referencia por su enseñanza sobre películas multicapa polipeptídicas. Brevemente, los asuntos de diseño primarios son la longitud y la carga del polipéptido. El asunto de diseño más importante son las propiedades electrostáticas porque ellas son la base de ELBL. Sin propiedades de carga adecuadas, un polipéptido no puede ser sustancialmente soluble en solución acuosa a pH 4 a 10 y no puede usarse fácilmente para la fabricación de una película multicapa por ELBL. Otros asuntos de diseño incluyen la estructura física de los polipéptidos, la estabilidad física de las películas formadas a partir de los polipéptidos y la biocompatibilidad y la bioactividad de las películas¦ y los polipéptidos constituyentes.

Un polipéptido diseñado quiere decir un polipéptido que tiene carga suficiente para unión estable a una superficie cargada de forma opuesta, es decir, un polipéptido que puede depositarse dentro de una capa de película multicapa en el que la fuerza directriz para la formación de la película son las propiedades electrostáticas. Una película estable corta es una película que una vez formada retiene más de la mitad de sus componentes después de incubación en PBS a 37 °C durante 24 horas. En realizaciones específicas, un polipéptido diseñado es de al menos 15 aminoácidos en longitud y la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor que o igual a 0,1 , 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 a pH 7,0. Los aminoácidos que se dan en la naturaleza cargados positivamente (básicos) a pH 7,0 son arginina (Arg), histidina (His), ornitina (Orn) y lisina (Lys). Los residuos de aminoácidos que se dan en la naturaleza cargados negativamente (ácidos) a pH 7,0 son ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp). Una mezcla de aminoácidos de carga opuesta se pueden emplear siempre que la proporción neta general de carga cumpla los criterios especificados. En una realización, un polipéptido diseñado no es un homopolímero. En otra realización, un polipéptido deseado no está ramificado.

Un asunto de diseño es el control de la estabilidad de películas de ELBL polipeptídicas. Los enlaces iónicos, los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrófobas pueden contribuir a la estabilidad de películas multicapa. Además, los enlaces disulfuro covalentes formados entre aminoácidos que contienen sulfhidrilos en la misma capa o en capas adyacentes pueden incrementar la fuerza estructural. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilo incluyen cisteína y homocisteína y estos residuos pueden incorporarse fácilmente en péptidos diseñados sintéticos. Además los grupos sulfhidrilo pueden incorporarse en homopolímeros polielectrolíticos tales como poli-L-lisina o ácido poli-L-glutámico por procedimientos bien descritos en la bibliografía. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilo pueden usarse para "bloquear" (unir entre sí) y "desbloquear" capas de una película polipeptídica multicapa por un cambio en el potencial de oxidación. Además, la incorporación de un aminoácido que contiene suflhidrilo en un polipéptido diseñado permite el uso de péptidos relativamente cortos en fabricación de película fina, en virtud de la formación de enlaces disulfuro intermoleculares.

En una realización, los polipéptidos que contienen sulfhidrilo diseñados, si se sintetizan químicamente o si se producen en un organismo huésped, se ensamblan por ELBL en presencia de un agente reductor para evitar formación de puentes de hidrógeno prematura. Tras el ensamblaje de la película, el agente reductor se retira y se añade un agente oxidante. En presencia de un agente oxidante se forman enlaces disulfuro entre grupos sulfhidrilo , "bloqueando" por lo tanto entre sí los polipéptidos dentro de las capas y entre capas donde están presentes los grupos tiol. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (BME), glutatión reducido, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y combinaciones de más de uno de estos productos químicos. Los agentes oxidantes adecuados incluyen glutatión oxidado, terc-butilhidroperóxido (t-BHP), timerosal, diamida, 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitro-benzoico) (DTNB), 4,4'-ditiodipiridina, bromato de sodio, peróxido de hidrógeno, tetrationato de sodio, porfirindina, ortoyodosobenzoato de sodio y combinaciones de más de uno de estos productos químicos Como una alternativa a los enlaces disulfuro, se pueden usar procedimientos de química que producen otros enlaces covalentes para estabilizar películas ELBL. Para películas compuestas de polipéptidos, son particularmente útiles los procedimientos de química que producen enlaces amida. En presencia de reactivos de acoplamiento apropiados (aquellos con cadenas laterales que contienen grupos ácido carboxílico tales como ácido aspártico y ácido glutámico) reaccionarán con aminoácidos cuyas cadenas laterales contienen grupos amina (tales como lisina u ornitina) para formar enlaces amida. Los enlaces amida son más estables que los enlaces disulfuro según condiciones biológicas y los enlaces amida no sufren reacciones de intercambio. Se pueden usar muchos reactivos para activar cadenas laterales polipeptídicas para formación de enlaces amida. Los reactivos de carbodiimida, tales como la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) reaccionarán con ácido aspártico o ácido glutámico a pH ligeramente ácido, formando un producto intermedio que reaccionará irreversiblemente con una amina para producir un enlace amida. Se añaden a menudo aditivos tales como N-hidrosuccinimida a la reacción para acelerar la velocidad y la eficiencia de formación de amidas. Después de la reacción los reactivos solubles se retiran a partir de nanopartículas o micropartículas por centrifugación y aspiración. Ejemplos de otros reactivos de acoplamiento incluyen diisopropilcarbodiimida, HBTU, HATU, HCTU, TBTU y PyBOP. Ejemplos de otros aditivos incluyen sulfo-N-hidrosuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol. La extensión de la reticulación por amida se puede controlar modulando la estequiometría de los reactivos de acoplamiento, el tiempo de reacción, o la temperatura de la reacción y puede controlarse por técnicas tales como espectroscopia de infrarrojos transformada de Fourier (IR-FT).

Las películas ELBL reticuladas convenientemente tienen propiedades deseables tales como estabilidad incrementada. La mayor estabilidad permite usar condiciones más restrictivas durante la fabricación de nanopartículas, micropartículas, nanocápsulas o microcápsulas. Los ejemplos de condiciones restrictivas incluyen temperaturas altas, temperaturas bajas, temperaturas criogénicas, velocidades de centrifugación altas, tampones de alta salinidad, tampones de pH alto, tampones de pH bajo, filtración y almacenamiento a largo plazo.

Un procedimiento de fabricación de un electrolito multicapa comprende depositar una pluralidad de capas de especies químicas cargadas de forma opuesta en un sustrato. En una realización, al menos una capa comprende un polipéptido designado. Los polielectrolitos depositados de forma exitosa tendrán cargas netas opuestas. En una realización, la deposición de un polielectrolito comprende exportar el sustrato a una solución acuosa que comprende un polielectrolito a un pH al que tiene carga neta adecuada para ELBL. En otras realizaciones, la deposición de un polielectrolito sobre el sustrato se logra por pulverización secuencial de soluciones de polipéptidos cargados de forma opuesta. En aún otras realizaciones, la deposición en el sustrato es por pulverización simultánea de soluciones de polielectrolitos cargados de forma opuesta.

En el procedimiento de ELBL de formar una película multicapa, las cargas opuestas de las capas adyacentes proporcionan la fuerza directriz para ensamblar. No es crítico que los polielectrolitos en capas opuestas tengan la misma densidad de carga lineal, solo que las capas opuestas tengan cargas opuestas. Un procedimiento de ensamblaje de película estándar por deposición incluye soluciones acuosas de los poli-iones a un pH al que están ionizados (es decir, pH 4-10), proporcionando un sustrato que lleva una carga de superficie y alternando inmersión del sustrato en las soluciones polielectrolíticas cargadas. El sustrato se lava opcionalmente entre la deposiciones de capas alternantes.

La concentración de polielectrolitos adecuada para la deposición del polielectrolito puede determinarse fácilmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica. Una concentración ejemplar es 0,1 a 10 mg/ml. Para electrolitos no polipeptídicos típicos tales como ácido poli(acrílico) y poli(clorhidrato de alilamina), el grosor de capa típico es aproximadamente 3 a aproximadamente 5 A, dependiendo de la fuerza iónica de la disolución. Los polielectrolitos cortos forman típicamente capas más delgadas que los polielectrolitos largos. Con respecto al grosor de las películas, el grosor de las películas de polielectrolitos depende de la humedad así como el número de capas y la composición del film. Por ejemplo, las películas PLL/PGA de 50 nm de grosor se contraen a 1 ,6 nm tras secar con nitrógeno. En general, las películas de 1 nm a 100 nm o más en grosor se pueden formar dependiendo del estado de hidratación de la película y del peso molecular de los polielectrolitos empleados en el ensamblaje.

Además, el número de capas requeridas para formar una película multicapa de polielectrolitos estable dependerá de los polielectrolitos en la película. Para películas que comprenden solo capas polipeptídicas de peso molecular bajo, una película tendrá típicamente 4 o más bicapas de polipéptidos cargados de forma opuesta. Para películas que comprenden polielectrolitos de peso molecular alto tales como poli(ácido acrílico) y poli(clorhidrato de alilamina), las películas que comprenden una bicapa individual de polielectrolito cargado de forma opuesta pueden ser estables. Los estudios han mostrado que las películas de polielectrolitos son dinámicas. Los polielectrolitos contenidos dentro de un película pueden migrar entre capas y pueden intercambiarse con polielectrolitos solubles de carga similar cuando están suspendidos en una solución de polielectrolitos. Además las películas de polielectrolitos pueden desensamblarse o disolverse en respuesta a un cambio en el ambiente tal como temperatura, pH, fuerza iónica, o potencial de oxidación del tampón de oxidación. Así algunos polipéptidos y particularmente polielectrolitos peptídicos presentan estabilidad transitoria. La estabilidad de películas polielectrolíticas peptídicas puede controlarse suspendiendo las películas en un tampón apropiado en condiciones controladas durante un periodo de tiempo fijo y después midiendo las cantidades de los péptidos dentro de la película con un ensayo adecuado tal como análisis de aminoácidos, ensayo de HPLC, o ensayo de fluorescencia. Las películas polielectrolíticas peptídicas son más estables en condiciones que sean adecuadas para su almacenamiento y uso como vacunas, por ejemplo en tampones neutros y a temperaturas tales como 4o C a 37° C. En estas condiciones las películas polielectrolíticas peptídicas retendrán la mayoría de sus péptidos componentes durante al menos 24 horas y después hasta 14 días y más allá.

En una realización, un polipéptido diseñado comprende una o más regiones de adsorción de superficie unidas covalentemente a uno o más epítopos de RSV, en la que el polipéptido diseñado y las una o más regiones de adsorción de superficie tienen el mismo signo de carga, es decir, están ambos cargados positivamente o ambos cargados negativamente en general. Como se usa en el presente documento, una región de adsorción es una región cargada de un polipéptido diseñado que proporciona adecuadamente suficiente carga de tal forma que un péptido que contiene un epítopo de RSV, por ejemplo, se puede depositar en una película multicapa. En una realización, las una o más regiones de adsorción de superficie y los uno o más epítopos de RSV tienen la misma polaridad neta. En otra realización, la solubilidad del polipéptido diseñado a pH 4 a 10 es mayor que o igual a aproximadamente 0,1 mg/ml. En otra realización, la solubilidad del polipéptido diseñado a pH 4 a 10 es mayor que o igual a aproximadamente 1 mg/ml. La solubilidad es una limitación práctica para provocar deposición de los polipéptidos de la solución acuosa. Un límite superior en el grado de polimerización de un polipéptido antigénico es aproximadamente 1.000 residuos. Es concebible, sin embargo, que polipéptidos compuestos más largos pudieran realizarse por un procedimiento apropiado de síntesis.

En una realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV antigénico individual flanqueado por dos regiones de adsorción de superficie, una región de superficie N-terminal y una región de adsorción de superficie C-terminal. En otra realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV antigénico individual flanqueado por una región de adsorción de superficie unida al extremo N-terminal del epítopo de RSV. En otra realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV antigénico individual flanqueado por regiones de adsorción de superficie unidas al extremo C-terminal del epítopo de RSV.

Cada una de las regiones independientes (por ejemplo, epítopos de RSV y regiones de adsorción de superficie) del polipéptido diseñado puede sintetizarse separadamente por síntesis de péptidos en fase de solución, síntesis de péptidos en fase sólida, o ingeniería genética de un organismo huésped. La síntesis peptídica en fase de solución es el procedimiento usado para la producción de la mayoría de los productos farmacéuticos peptídicos aprobados en el mercado actualmente. Una combinación de los procedimientos en fase sólida y en fase de solución se pueden usar para sintetizar péptidos relativamente largos e incluso proteínas pequeñas. Las compañías de síntesis peptídica tienen la pericia y la experiencia para sintetizar péptidos difíciles en base a una tarifa por el servicio. La síntesis se lleva a cabo en condiciones de buenas prácticas de preparación (GMP) y a una escala adecuada para ensayos clínicos y lanzamiento de fármacos comerciales.

Alternativamente, las diversas regiones independientes pueden sintetizarse conjuntamente con una cadena polipeptídica individual por síntesis peptídica en fase de solución, síntesis peptídica en fase sólida o ingeniería genética en un organismo huésped adecuado. La elección de aproximación en cualquier caso particular será una materia de conveniencia o económica.

Si los diversos epítopos de RSV y regiones de adsorción de superficie se sintetizan separadamente, una vez purificados, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico o por cromatografía líquida de alta resolución, se unen por síntesis de enlaces peptídicos. Es decir, el extremo N-terminal de la región de superficie y el extremo C-terminal del epítopo de RSV se unen covalentemente para producir el polipéptido diseñado. Alternativamente, el extremo C-terminal de la región de superficie y el extremo N-terminal del epítopo de RSV se unen covalentemente para producir el polipéptido diseñado. Los fragmentos individuales se pueden sintetizar por procedimientos en fase sólida y se pueden obtener como segmentos totalmente protegidos, totalmente desprotegidos, o parcialmente protegidos. Los segmentos pueden estar unidos covalentemente en una fase de reacción en solución o en una fase de reacción sólida. Si un fragmento polipeptídico contiene una cisteína como su residuo N-terminal y el otro fragmento polipeptídico contiene un tioéster o un precursor de tioéster en su residuo C-terminal los dos fragmentos se acoplarán espontáneamente en solución por una reacción específica comúnmente conocida (para aquellos expertos en la técnica) como Ligación Nativa. La Ligación Nativa es una opción particularmente atractiva para síntesis de péptido diseñado debido a que puede llevarse a cabo con fragmentos peptídicos totalmente desprotegidos o parcialmente protegidos en solución acuosa y a concentraciones diluidas.

En una realización, los epítopos de RSV y/o las regiones de adsorción de superficie están unidas por enlaces peptídicos o no peptídicos según se describe en la patente de los EE.UU. N.°: 7.723.294, incorporada en el presente documento por referencia por su enseñanza del uso de engarces no peptídicos para unir segmentos de polipéptidos para usar en películas multicapa. Los engarces no peptídicos adecuados incluyen, por ejemplo, enlaces de alquilo tales como -NH-(CH2)S-C(0)-, en los que s = 2-20. Los engarces de alquilo están opcionalmente sustituidos con un grupo que no causa dificultades estéricamente tal como alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo y similares. Otro engarce no peptídico ejemplar es un engarce de polietilenglicol tal como -NH-(CH2-CH2-0)„,-C(0)- en el que n es tal que el engarce tienen un peso molecular de 100 a 5000 Da, específicamente 100 a 500 Da. Muchos de los engarces descritos en el presente documento están disponibles a partir de vendedores comerciales en una forma adecuada para usar en síntesis peptídica en fase sólida.

En una realización, uno o más de los epítopos polipeptídicos de RSV están covalentemente unidos a uno o más de los polielectrolitos, tales como un polipéptido u otro polielectrolito, por enlaces covalentes. Ejemplos de enlaces covalentes adecuados incluyen amidas, ésteres, tioéteres y disulfuros. Alguien experto en la técnica puede tomar ventaja de un intervalo de grupos funcionales encontrados dentro del péptido de epítopo para manipular un enlace a un electrolito adecuado. Por ejemplo, un ácido carboxílico en el péptido de epítopo se puede encontrar bien en el extremo C-terminal o bien en la cadena lateral de aminoácidos ácido aspártico o ácido glutámico. Los ácidos carboxílicos se pueden activar con reactivos de acoplamiento peptídicos adecuados tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para reacción con aminas primarias o secundarias que se encuentran en polielectrolitos tales como poli-L-lisina. El enlace amida resultante es estable en condiciones ambientales. Por el contrario, los grupos ácidos en un polielectrolito peptídico se pueden activar con EDC para reacción con grupos amina en un péptido de epítopo. Los grupos amina útiles pueden encontrarse en el extremo N-terminal peptídico o en la cadena lateral de los residuos de lisina.

Los péptidos de epítopos pueden estar también unidos a polielectrolitos por medio de enlaces disulfuro. Los polielectrolitos tales como PGA o PLL pueden modificarse químicamente de tal forma que una fracción de sus cadena laterales contienen grupos sulfhidrilo. En presencia de un oxidante adecuado, esos sulfhidrilos reaccionarán con el grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína contenido dentro del péptido de epítopo. La cisteína bien puede ser una cisteína nativa de la secuencia de proteínas de un patógeno tal como RSV o bien puede ser una cisteína no nativa que se incorporó ¡ntencionalmente dentro del epítopo durante la síntesis peptídíca. Los oxidantes adecuados incluyen DTNB, 2,2'-ditiopiridina, peróxido de hidrógeno, cistina y glutatión oxidado. La unión de péptidos de epítopos a polielectrolitos por medio de enlaces disulfuro es particularmente útil. Los disulfuros son estables en condiciones normales de fabricación de películas y almacenamiento pero se escinden fácilmente por agentes reductores encontrados de forma natural en células, que liberan el péptido de epítopo para el procesamiento inmune.

Los péptidos de epítopos pueden estar también unidos a polielectrolitos por medio de enlaces tioéter. Los péptidos de epítopos sintéticos se pueden sintetizar con electrófilos apropiados tales como grupos haloacetilo que reaccionan específicamente con sulfhidrilos. Por ejemplo, un péptido de epítopo que contiene un cloroacetilo en su extremo C-terminal formará un enlace estable a polielectrolitos que llevan sulfhidrilo tal como PGA-SH descrito anteriormente.

Los péptidos de epítopos pueden estar unidos covalentemente a polielectrolitos a través de moléculas de engarce bifuncionales. Los engarces bifuncionales contienen usualmente dos grupos electrolíticos que pueden reaccionar con nucleófilos presentes bien en el péptido de epítopo o bien en la molécula de polielectrolito. Se venden comercialmente dos clases de moléculas de engarce, engarces homobifuncionales y engarces heterobifuncionales. Los engarces homobifuncionales contienen dos copias de un grupo electrófilo unidas por un espaciador no reactivo. A menudo los electrófilos son ésteres activos, tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) o ésteres de sulfo-N-hidroxisuccinimida (sulfo NHS) que reaccionan con aminas nucleófilas. Los ejemplos de ésteres de NHS homobifuncionales incluyen suberato de bis(sulfosuccinimidilo), glutarato de disuccinimidilo, propionato de ditiobis(succinimidilo), suberato de disuccinimidilo, tartrato de disuccinimidilo. Algunas veces los electrófilos son grupos aldehido que forman imidas con aminas nucleófilas en las moléculas de epítopo y de polielectrolito. Los enlaces de ¡mida son transitoriamente estables pero pueden convertirse a estructuras estables con agentes reductores tales como borohidruro de sodio o hidrogenación catalítica. El engarce de aldehido homobifuncional más comúnmente usado es glutaraldehído.

Otros engarces homobifuncionales comúnmente usados contienen electrófilos que reaccionan específicamente con tioles nucleofilos que pueden usarse para unir péptidos de epítopos a polielectrolitos que contienen sulfhidrilo como se describe más adelante. Ejemplos de engarces homobifuncionales específicos de sulfhidrilo incluyen 1 ,4-bismaleimidobutano, 1 ,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano, bismaleimidohexano, bis-maleimidoetano, 1 ,4-di-[3'-(2'-piridilditio)-propionam¡do]butano, ditio-bismaleimidoetano, 1 ,6-hexano-bis-vinilsulfona.

Miembros de la clase heterobifuncional de reactivos de reticulación contienen dos grupos de reactividad diferente, a menudo pero no siempre electrófilos, que reaccionan específicamente con diferentes grupos funcionales en moléculas de sustrato. Son particularmente útiles engarces que contienen un grupo electrófilo que es específico para un sulfhidrilo y otro electrófilo que es específico para una amina. Ejemplos de estos reactivos incluyen [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-sulfosuccinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de /V-succinimidilo, 3-[bromoacetamido]propionato de succinimidilo, yodoacetato de /V-succinimidilo, 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, éster de ([N-e-maleimidocaproiloxi]sulfosuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, 3-(2-piridild¡tio)-prop¡onato de N -succinimidilo, 6-(3-[2-piridild¡t¡o]-prop¡onamido)hexanoato de succinimidilo, 4-succinimidiloxicarbonil-metil-a-[2-piridilditio]tolueno.

El amplio intervalo de funcionalidad que está presente normalmente tanto en péptidos de epítopo como en polielectrolitos o que puede instalarse fácilmente en ambas moléculas permite a alguien escoger la estrategia de unión que mejor se ajuste a los sustratos de interés. Un ejemplo probable es la unión de un péptido de epítopo que contiene cisteína a PLL.

Los segmentos polipeptídicos pueden estar unidos de una diversidad de maneras, dependiendo de la química del enlace no peptídico. Por ejemplo, el extremo N-terminal del primer segmento polipeptídico está unido al extremo C-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo N-terminal del primer segmento polipeptídico está unido al extremo N-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo C-terminal del primer segmento polipeptídico está unido al extremo C-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo C-terminal del primer segmento polipeptídico está unido al extremo N-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del primer segmento polipeptídico está unido a una cadena pendiente lateral del segundo segmento polipeptídico; o el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del segundo segmento polipeptídico está unido a una cadena pendiente lateral del primer segmento polipeptídico. Independientemente del punto de unión, sin embargo, el primero y el segundo segmentos están covalentemente unidos por un engarce no peptídico.

En una realización, un polipéptido diseñado es una combinación única de una o más región/regiones de adsorción covalentemente unida(s) y de uno o más epítopo(s) de RSV. No hay limitación particular de la longitud de los epítopos de RSV, que pueden ser epítopos lineales o epítopos conformacionales. Los epítopos pueden comprender en cualquier punto desde tres residuos aminoácidos hasta varios cientos de residuos de aminoácidos para epítopos conformacionales complejos.

En una realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV y una región de adsorción de superficie. En otra realización, un polipéptido diseñado comprende un epítopo de RSV y dos regiones de absorción de superficie, una unida al extremo N-terminal del epítopo de RSV y una unida al extremo C-terminal del epítopo de RSV. El propósito de la(s) región/regiones de superficie de adsorción es permitir la adsorción del polipéptido sobre una superficie cargada de forma opuesta con el fin de construir una película multicapa.

El número de regiones de adsorción de superficie en un polipéptido diseñado en relación al número y/o longitud de los epítopos de RSV se refiere al requerimiento de solubilidad. Por ejemplo, si el epítopo de RSV es una secuencia de aminoácidos corta o, por ejemplo, tres residuos de aminoácidos, solo se requerirá para adsorber el polipéptido diseñado sobre una superficie adecuadamente cargada una región de adsorción de superficie de al menos ocho residuos de aminoácidos. Si, en contraste, el epítopo RSV es un dominio estructural soluble de una proteína que comprende, por ejemplo, 120 residuos de aminoácidos, se pueden requerir dos regiones de adsorción de superficie para conferir carga suficiente para que el polipéptido diseñado sea soluble en agua y adecuado para adsorción. Las regiones de adsorción de superficie podrían ser contiguas y localizarse en el extremo N-terminal del dominio, contiguas y localizarse en el extremo C-terminal del dominio, o no contiguas con una en el extremo N-terminal y una en el extremo C-terminal. Adicionalmente, un epítopo de RSV puede contener un segmento cargado (bien cargado negativamente o bien cargado positivamente) dentro de su secuencia nativa que puede servir como una región de adsorción de superficie.

Un polipéptido o antígeno puede contener uno o más determinantes antigénicos distintos. Un determinante antigénico puede referirse a una parte inmunógena de una proteína multicadena.

Se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar la localización y composición de un determinante antigénico o epítopo para un anticuerpo específico. Estas técnicas pueden usarse para identificar y/o caracterizar epítopos para usar como epítopos de RSV. En una realización, los procedimientos de mapeo/caracterización de un epítopo para un anticuerpo específico de antígeno pueden determinarse por "huella" de epítopo usando modificación química de las/los aminas/carboxilos expuestos/as en la proteína antigénica. Un ejemplo de una técnica tal de huella es el uso de HXMS (intercambio hidrógeno-deuterio detectado por espectrometría de masas) en el que tiene lugar un intercambio hidrógeno/deuterio de protones receptor y ligando proteína amida, unión e intercambio de retorno, en el que los grupos amida de armazón que participan en la unión de proteínas están protegidos del intercambio de retorno y por lo tanto permanecen deuterados. Se pueden identificar las regiones relevantes en este punto por proteolisis péptica, separación por cromatografía líquida de alta resolución capilar rápida, y/o espectrometría de masas de ionización por electropulverización.

En otra realización, una técnica de identificación de epítopo adecuada es mapeo de epítopos por resonancia magnética nuclear (RMN), donde típicamente se comparan las posiciones de las señales en espectros de RMN bidimensionales del antígeno libre y el antígeno que forma un complejo con el péptido de unión al antígeno, tal como un anticuerpo. El antígeno está marcado isotópicamente selectivamente con 15N de tal forma que solo se ven señales correspondientes al antígeno y no se ve ninguna señal del péptido de unión al antígeno en el espectro de RMN. Las señales de antígeno que se originan a partir de aminoácidos implicados en la interacción con el péptido de unión a antígeno cambiarán típicamente de posición en los espectros del complejo en comparación con los espectros del antígeno libre y de esta manera pueden identificarse los aminoácidos implicados en la unión.

En otra realización, el mapeo/caracterización de epítopos puede hacerse por escaneo peptídico. En este planteamiento, se preparan una serie de péptidos solapantes que abarcan la longitud total de la cadena polipeptídica de un antígeno y se ponen a prueba individualmente con respecto a la inmunogenicidad. El título de anticuerpos del antígeno peptídico correspondiente se determinó por un procedimiento estándar, por ejemplo, ensayo ¡nmunoadsorbente ligado a enzima. Los péptidos pueden ordenarse después con respecto a inmunogenicidad, proporcionando una base empírica para la selección de diseño de péptidos para el desarrollo de vacunas.

En otra realización, las técnicas de digestión de proteasas pueden también ser útiles en el contexto de mapeo e identificación de epítopos. Las regiones/secuencias determinantes-relevantes antigénicas se pueden determinar por digestión con proteasas, por ejemplo usando tripsina en una proporción de aproximadamente 1 :50 frente a proteína antigénica durante toda una noche (O/N) a 37 °C y a pH 7-8, seguido por análisis de espectrometría de masas (EM) para identificación peptídica. Los péptidos protegidos de escisión por tripsina por la proteína antigénica pueden identificarse convenientemente por comparación de muestras sometidas a digestión con tripsina y muestras incubadas con CD38BP y después sometidas a digestión por ejemplo con tripsina (revelando de este modo una huella para el aglutinante). Otras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc., pueden también o alternativamente usarse en un procedimiento de caracterización de epítopos similares. Además, la digestión por proteasas puede proporcionar un procedimiento rápido para determinar la localización de una secuencia de determinante antigénico potencial dentro de una proteína antigénica conocida usando un anticuerpo conocido. En otra realización, las técnicas de digestión de proteasas pueden también ser útiles en el contexto de mapeo e identificación de epítopos.

Se divulga adicionalmente en el presente documento una composición inmunógena, comprendiendo dicha composición inmunógena una película multicapa que comprende dos o más capas de polielectrolitos, comprendiendo las capas adyacentes polielectrolitos cargados de manera opuesta, en las que una capa comprende un epítopo de RSV. La composición inmunógena comprende opcionalmente adicionalmente una o más capas que comprenden un polipéptido diseñado.

En una realización, una composición inmunógena comprende una pluralidad de epítopos de RSV, bien en el mismo o en diferentes polielectrolitos, por ejemplo, polipéptidos diseñados. La pluralidad de determinantes antigénicos puede ser de los mismos o de diferentes agentes infecciosos. En una realización, la composición inmunógena comprende una pluralidad de polielectrolitos antigénicos únicos. En otra realización, la composición inmunógena comprende una pluralidad de polielectrolitos inmunogénicos que comprenden epítopos de RSV múltiples con cada polielectrolito. Una ventaja de estas composiciones inmunógenas es que determinantes antigénicos múltiples o conformaciones múltiples de un determinante antigénico lineal individual pueden estar presentes en una partícula de vacuna sintética individual. Tales composiciones con múltiples determinantes antigénicos pueden proporcionar potencialmente anticuerpos contra múltiples epítopos, incrementando las posibilidades de que al menos algunos de los anticuerpos generados por el sistema inmune del organismo neutralicen el patógeno o los antígenos específicos objetivo o las células cancerosas, por ejemplo.

La inmunogenicidad de una composición inmunógena puede estar potenciada de una serie de formas. En una realización, la película multicapa comprende opcionalmente una o más moléculas bioactivas inmunógenas adicionales. Aunque no es necesario, las una o más moléculas bioactivas inmunógenas comprenderán típicamente uno o más determinantes antigénicos adicionales. Las moléculas bioactivas adicionales adecuadas incluyen, por ejemplo, un fármaco, una proteína, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un lípido, un fosfolípido, un carbohidrato, un lipopolisacárido, una molécula inmunoestimuladora de bajo peso molecular, o una combinación que comprende una o más de las moléculas bioactivas precedentes. Otros tipos de potenciadores inmunitarios adicionales incluyen un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células, un orgánulo, o una combinación que comprende una o más de las estructuras bioactivas precedentes.

En una realización, la película multicapa comprende opcionalmente una o más moléculas bioactivas adicionales. Las una o más moléculas bioactivas adicionales pueden ser un fármaco. Alternativamente, la composición inmunógena está en forma de una cáscara hueca o un revestimiento rodeando un núcleo. El núcleo comprende una diversidad de diferentes encapsulantes, por ejemplo, una o más moléculas : bioactivas adicionales, incluyendo, por ejemplo un fármaco. Así, las composiciones inmunógenas diseñadas según se describen en el presente documento podrían usarse también para terapia combinada, por ejemplo, provocando una respuesta inmune y para administrar el fármaco objetivo. Los "núcleos" de tamaño menor que un micrométrico de un material terapéutico adecuado en forma "cristalina" pueden encapsularse mediante una composición inmunógena que comprenda los polipéptidos antigénicos y las microcápsulas resultantes podrían usarse para administración de fármacos. El núcleo puede ser insoluble en algunas condiciones, ' por ejemplo a pH alto o a temperatura baja y soluble en las condiciones donde tendrá ' lugar la liberación controlada. La carga de superficie de los cristales se puede determinar por medidas de potencial ? (usadas para determinar la carga en unidades electrostáticas en partículas coloidales en un medio líquido). La velocidad a la que los contenidos de las microcápsulas se liberan del interior al ambiente circundante dependerá de una serie de factores, incluyendo el grosor de la cáscara encapsulante, los polipéptidos antigénicos usados en la cáscara, la presencia de enlaces disulfuro, el grado de reticulación de los péptidos, la temperatura, fuerza iónica y el procedimiento usado para ensamblar los péptidos. Generalmente, cuanto más espesa es la cápsula, más largo es el tiempo de liberación.

En otra realización, la biomolécula inmunógena adicional es una secuencia de ácidos nucleicos capaz de dirigir la síntesis de organismos huésped de un inmunógeno deseado o de interferir con la expresión de información genética a partir de un patógeno. En el primer caso, un ácido nucleico tal se inserta, por ejemplo, dentro de un vector de expresión adecuado por procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los vectores de expresión adecuados para producir transferencia génica de alta eficiencia in vivo incluyen vectores retrovíricos, adenovíricos y de virus vacunal. Los elementos operacionales de tales vectores de expresión incluyen al menos un promotor, al menos un operador, al menos una secuencia líder, al menos un codón terminador y cualesquiera otras secuencias de ADN necesarias o preferidas para transcripción apropiada y traducción subsiguiente del ácido nucleico del vector. En particular, se contempla que tales vectores contendrán al menos un origen de replicación reconocido por el organismo huésped junto con al menos un marcador seleccionable y al menos una secuencia promotora capaz de iniciar transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos. En el último caso, se prepararán múltiples copias de una secuencia de ácidos nucleicos tal para administrar, por ejemplo, por encapsulación de los ácidos nucleicos dentro de una película múlticapa polipeptídica en forma de una cápsula por administración intravenosa.: En la construcción de un vector de expresión recombinante, debería destacarse adicionalmente que se pueden insertar múltiples copias de la secuencia de ácidos nucleicos de interés y sus elementos operacionales concomitantes dentro de cada vector. En una realización tal, el organismo huésped produciría grandes cantidades por vector de la proteína deseada. El número de copias múltiples de la secuencia de ácidos nucleicos que se pueden insertar en el vector está limitado solo por la posibilidad del vector resultante debido a su tamaño, para transferirse dentro de y replicarse y transcribirse en un organismo huésped apropiado.

En una realización adicional, la composición inmunógena comprende una mezcla de polielectrolitos antigénicos/moléculas bioactivas inmunógenas. Estas pueden derivar del mismo antígeno, pueden ser diferentes antígenos del mismo agente infeccioso o enfermedad, o pueden ser de diferentes agentes infecciosos o enfermedades. El complejo o mezcla provocará por lo tanto una respuesta inmune contra un número de antígenos y posiblemente un número de agentes infecciosos o enfermedades según se especifica por los componentes de péptidos antigénicos/proteínas antigénicas del sistema de administración.

En una realización, la composición de películas multicapa/inmunógena provoca una respuesta del sistema inmune frente a un patógeno. En una realización, una composición de vacuna comprende una composición inmunógena en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Así un procedimiento de vacunación contra una enfermedad patógena comprende la administración a un sujeto en necesidad de vacunación de una cantidad efectiva de la composición inmunógena.

Los vehículos farmacéuticamente adecuados incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, partículas de virus inactivadas y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden usar también en la composición, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos. La composición puede contener también líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol, así como sustancias humectantes, agentes emulsionantes, o agentes tamponantes de pH. Se pueden usar también liposomas como vehículos.

Un procedimiento de provocación de una respuesta inmune contra una enfermedad o patógeno en un vertebrado (por ejemplo, vacunación) comprende administrar una composición inmunógena que comprende una película multicapa que comprende un epítopo de RSV. En una realización, el polielectrolito que contiene el epítopo de RSV está en la capa más exterior o capa más expuesta al disolvente de la película multicapa. La composición inmunógena se puede administrar oralmente, intranasalmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intraperitonealmente, sublingualmente, intradérmicamente, pulmonarmente, o transdérmicamente, bien con o bien sin una dosis reforzante. Generalmente, las composiciones se administran de una: manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal como para que sean profilácticamente y/o terapéuticamente efectivas. Las cantidades precisas de composición inmunógena a administrarse dependen del juicio del experto y pueden ser peculiares para cada sujeto. Será patente para aquellos de habilidad en la técnica que la cantidad terapéuticamente efectiva de una composición inmunógena dependerá, entre otras cosas, del programa de administración, de la dosis unitaria de antígenos administrada, de si las composiciones se administran en combinación con otros agentes terapéuticos y del estado inmunitario y de salud del paciente. Una dosificación efectiva terapéuticamente se puede determinar por el trabajador médico de habilidad normal en base a las características del paciente (edad, peso, sexo, afección, complicaciones, otras enfermedades, etc.), como se conoce bien en la técnica. Además, según se llevan a cabo estudios de rutina, surgirá información más específica con respecto a niveles de dosificación apropiados para tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes y el trabajador de habilidad ordinaria, considerando el contexto terapéutico, edad y salud general del paciente, es capaz de determinar la dosis apropiada.

La composición inmunógena comprende opcionalmente un coadyuvante. Los coadyuvantes comprenden en general sustancias que refuerzan la respuesta inmune del huésped en una manera no específica. La selección de un coadyuvante depende del sujeto a vacunarse. Preferentemente, se usa un coadyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una vacuna para un ser humano debería evitar coadyuvantes de emulsión de aceites o de hidrocarburos, incluyendo coadyuvante de Freund completo e incompleto. Un ejemplo de un coadyuvante adecuado para usar con seres humanos es alumbre (gel de alúmina). Una vacuna para un animal, sin embargo, puede contener coadyuvantes no apropiados para usar con seres humanos.

Se contempla que una respuesta inmune puede provocarse por medio de presentación de cualquier proteína o polipéptido capaz de provocar una respuesta tal. En una realización, el antígeno es un epítopo clave, que da lugar a una respuesta inmune fuerte frente a un agente particular de enfermedad infecciosa, es decir, un epítopo inmunodominante. Si se desea, se puede incluir en la composición inmunógena más de un antígeno o epítopo con el fin de incrementar la probabilidad de una respuesta inmune.

En una realización, se incorporan epítopos de péptidos o proteínas de RSV múltiples dentro de una película de ELBL. Los distintos epítopos se pueden caracterizar o expresar dentro de una molécula peptídica diseñada individual. Se espera que situar epítopos múltiples dentro de un péptido diseñado individual tenga ciertas ventajas. Por ejemplo esto debería simplificar el procedimiento de fabricación de ELBL e incrementar la reproducibilidad. Adicionalmente, situar epítopos múltiples dentro de un péptido diseñado bloqueará las proporciones moleculares de los distintos epítopos en una proporción deseada, por ejemplo 1:1.

Alternativamente los epítopos se pueden incorporar en péptidos diseñados distintos. Los péptidos diseñados se incorporan dentro de una película de ELBL durante una o más etapas de formación de capas. La fabricación de películas usando péptidos diseñados distintos múltiples puede presentar también ciertas ventajas. Esto debería simplificar la síntesis de péptidos diseñados reduciendo costes. Esto permitirá también que se varíen y optimicen las dosis relativas de cada péptido diseñado dentro de la película. Si, por ejemplo, los datos biológicos preclínicos o clínicos indicaron que una vacuna óptima debería contener cinco copias de un epítopo por cada copia de un segundo epítopo (proporción 5:1) el enfoque de péptidos diseñados de epítopos distintos facilitaría la elaboración de una vacuna tal.

Los péptidos diseñados se adsorben a la superficie de películas de ELBL en virtud de la atracción electrostática entre la(s) región/regiones del péptido diseñado y de la superficie cargada de forma opuesta de la película. La eficiencia de la adsorción dependerá grandemente de la composición de la(s) región/regiones de adsorción a superficie. Así los péptidos diseñados con epítopos diferentes pero con región/regiones de adsorción a superficie similares(s) se adsorberán con eficiencia similar. Para fabricar un película con dos péptidos diseñados distintos cada uno en una proporción molar 1 :1 se podrían mezclar los péptidos en una proporción molar y depositarlos en una capa particular. Alternativamente, se podría depositar cada péptido individualmente en capas separadas. La proporción molar de péptidos adsorbidos reflejará grandemente aquellas concentraciones relativas a las que se formaron capas o el número de etapas de formación de capas durante las que se incorporaron.

La cantidad de péptidos diseñados incorporados en una película de ELBL puede medirse en una diversidad de formas. El análisis de aminoácidos cuantitativo (AAA) se adecúa particularmente bien a este propósito. Las películas que contienen los péptidos diseñados se descomponen en sus aminoácidos constituyentes por tratamiento con ácido clorhídrico concentrado (6 M) y se calientan, típicamente a 115 °C durante 15 horas. Las cantidades de cada aminoácido se midieron después usando técnicas cromatográficas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. Los aminoácidos que aparecen en uno solo de los péptidos diseñados en una película se pueden usar como sondas para ese péptido. Cuando los péptidos diseñados carecen de aminoácidos únicos, se pueden incorporar aminoácidos no naturales (por ejemplo ácido aminobutírico u homovalina) dentro de péptidos diseñados durante la síntesis. Estos aminoácidos marcadores se identifican fácilmente durante el experimento de AAA y se pueden usar para cuantificar la cantidad de péptido en la película.

Como se usa en el presente documento, una respuesta de linfocitos T específica es una respuesta que es específica para un epítopo de interés, específicamente un epítopo de RSV tal como un epítopo de RSV-M2 como se describe en el presente documento. Una respuesta específica de linfocitos T puede ser también una respuesta de linfocitos T citotóxica o una respuesta de linfocitos T coadyuvante, pero es preferentemente una respuesta de linfocitos T citotóxica.

Como se usa en el presente documento, una respuesta de anticuerpos es una respuesta que es específica para un epítopo de interés, específicamente un epítopo de RSV tal como un epítopo de RSV-G como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "capa" quiere decir un incremento en grosor, por ejemplo, en un molde para formación de películas, tras una etapa de adsorción. "Multicapa" quiere decir múltiples incrementos en grosor (es decir, dos o más). Una "película multicapa polielectrolítica" es una película que comprende uno o más incrementos de grosor de polielectrolitos. Después de deposición, las capas de una película multicapa pueden no permanecer como capas discretas. De hecho, es posible que haya entremezclado significativo de especies, particularmente en las interfases de los incrementos de grosor. El entremezclado, o la ausencia del mismo, se puede someter a seguimiento por técnicas analíticas tales como medidas de potencial ?, espectroscopia de fotoelectrón de rayos X y espectrometría de masas iónica secundaria de tiempo de vuelo.

"Aminoácido" quiere decir un bloque de construcción de un polipéptido. Como se usa en el presente documento, "aminoácido" incluye los 20 L-aminoácidos que se dan en la naturaleza comunes, todos los otros aminoácidos naturales, todos los aminoácidos no naturales y todos los imitadores de aminoácidos, por ejemplo peptoides.

"Aminoácidos que se dan en la naturaleza" quiere decir glicina más los 20 aminoácidos que se dan en la naturaleza comunes, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, ácido aspártico, asparragina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, fenilalanina, ornitina, tirosina, triptófano y prolina.

"Aminoácido no natural" quiere decir un aminoácido distinto de cualquiera de los 20 L-aminoácidos que se dan en la naturaleza comunes. Un aminoácido no natural puede tener también bien estereoquímica L o bien estereoquímica D.

"Peptoide", o glicina N-sustituida, quiere decir un análogo del monómero de aminoácido correspondiente, con la misma cadena lateral que el aminoácido correspondiente pero con la cadena lateral adjunta al átomo de nitrógeno del grupo amino más que a los carbonos a del residuo. Consecuentemente, los enlaces químicos entre monómeros en un polipeptoide no son enlaces peptídicos lo que puede ser útil para limitar digestión proteolítica.

"Secuencia de aminoácidos" y "secuencia" quieren decir una longitud contigua de cadena polipeptídica que es de al menos dos residuos de aminoácidos de largo.

"Residuo" quiere decir un aminoácido en un polímero u oligómero; es el residuo a partir del que se forma el polímero. La síntesis polipeptídica implica deshidratación, es decir, una molécula de agua individual se "pierde" en la adición del aminoácido a una cadena polipeptídica.

Como se usan en el presente documento "péptido" y "polipéptido" se refieren todos a una serie de aminoácidos conectados unos a otros por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y los grupos alfa-carboxi de los aminoácidos adyacentes y pueden contener o estar libres de modificaciones tales como glicosilación, oxidación de cadena lateral, o fosforilación, dado que tales modificaciones, o la carencia .de las mismas, no destruyen la inmunogenicidad. Como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere tanto a un péptido como a un polipéptido o a una proteína.

"Polipéptido diseñado" quiere decir un polipéptido que tiene carga suficiente para unión estable a una superficie cargada opuestamente, es decir, un polipéptido que puede depositarse dentro de una capa de película multicapa en el que la fuerza directriz para la formación de la película son las propiedades electrostáticas. En realizaciones específicas, un polipéptido diseñado es de al menos 15 aminoácidos en longitud y la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor que o igual a 0,1 , 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 a pH 7,0. En una realización, la proporción del número de residuos cargados de la misma polaridad menos el número de residuos de la polaridad opuesta frente al número total de residuos en el polipéptido es mayor que o igual a 0,5 a pH 7,0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor que o igual a 0,5. Aunque no hay ningún límite superior absoluto de la longitud del polipéptido, en general, los polipéptidos diseñados adecuados para deposición de ELBL tienen un límite de longitud superior en la práctica de 1.000 residuos. Los polipéptidos diseñados pueden incluir secuencias encontradas en la naturaleza tales como epítopos de RSV así como regiones que proporcionan funcionalidad a los péptidos tales como regiones cargadas también referidas en el presente documento como regiones de absorción de superficie, que permiten a los polipéptidos diseñados depositarse dentro de una película multicapa polipeptídica.

"Estructura primaria" quiere decir la secuencia lineal contigua de aminoácidos en una cadena polipeptídica y "estructura secundaria" quiere decir tipos de estructura más o menos regulares en una cadena polipeptídica estabilizados por interacciones no covalentes, usualménte enlaces de hidrógeno. Ejemplos de estructura secundaria incluyen hélice a, lámina ß y giro ß.

"Película multicapa polipeptídica" quiere decir una película que comprende uno o más polipéptidos diseñados según se definen anteriormente. Por ejemplo, una película multicapa polipeptídica comprende una primera capa que comprende un polipéptido diseñado y una segunda capa que comprende un polielectrolito que tiene una carga neta de polaridad opuesta a un polipéptido diseñado. Por ejemplo, si la primera capa tiene una carga neta positiva, la segunda capa tiene una carga neta negativa; y si la primera capa tiene una carga neta negativa, la segunda capa tiene una carga neta positiva. La segunda capa comprende otro polipéptido diseñado u otro polielectrolito. ¦ "Sustrato" quiere decir un material sólido con una superficie adecuada para adsorción de polielectrolitos a partir de solución acuosa. La superficie de un sustrato puede tener esencialmente cualquier forma, por ejemplo, plana, esférica, con forma de varilla, etc. Una superficie de sustrato puede ser regular o irregular. Un sustrato puede ser un cristal. Un sustrato puede ser una molécula bioactiva. Los sustratos varían en tamaño desde la nanoescala a la macro-escala. Además, un sustrato opcionalmente comprende varias subpartículas pequeñas. Un sustrato puede testar constituido por material orgánico, material inorgánico, material radioactivo, o una combinación de los mismos. Ejemplos no limitantes de sustrato incluyen obleas de silicio; partículas coloidales cargadas, por ejemplo, micropartículas de CaCÜ3 o de formaldehído melamina; células biológicas tales como eritrocitos, hepatocitos, células bacterianas, o células de levaduras; retículos poliméricos orgánicos, por ejemplo, retículos de copolímeros de poliestireno o estireno; liposomas; orgánulos; y virus. En una realización, un sustrato es un dispositivo médico tal como un marcapasos artificial, un implante coclear, o una prótesis vascular.

Cuando un sustrato se disgrega o se elimina de otra forma durante o después de la formación de película, ello se llama "un molde" (para formación de películas). Las partículas de molde se pueden disolver en disolventes apropiados o se pueden eliminar por tratamiento térmico. Si, por ejemplo, se usan las partículas de molde de melamina-formaldehído parcialmente reticuladas, o moldes se pueden disgregar por procedimientos químicos suaves, por ejemplo, en DMSO, o por un cambio en valor de pH. Después de la disolución de las partículas de moldes, quedan cásea ras multicapa huecas que están compuestas de capas polielectrolíticas alternantes.

Una "cápsula" es una película polielectrolítica en forma de un cáscara hueca o de un revestimiento que rodea un núcleo. El núcleo comprende una diversidad de encapsulantes diversos, por ejemplo, una proteína, un fármaco, o una combinación de los mismos. Cápsulas con diámetros menores de aproximadamente 1 pm se refieren como nanocápsulas. Cápsulas con diámetros mayores de aproximadamente 1 µ?t? se refieren como microcápsulas.

"Reticulación" quiere decir la formación de un enlace covalente, o de varios enlaces, o de muchos enlaces entre dos o más moléculas.

"Molécula bioactiva" quiere decir una molécula, macromolécula o ensamblaje de macromolécula que tiene un efecto biológico. El efecto biológico específico puede medirse en un ensayo adecuado y normalizarse por unidad de peso o por molécula de la molécula bioactiva. Una molécula bioactiva puede encapsularse, retenerse detrás, o encapsularse dentro de una película polielectrolítica. Los ejemplos no limitantes de una molécula bioactiva son un fármaco, un cristal de un fármaco, una proteína, un fragmento funcional de una proteína, un complejo de proteínas, una lipoproteína, un oligopéptido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ribosoma, un agente terapéuticamente activo, un fosfolípido, un polisacárido, un lipopolisacárido. Como se usa en el presente documento, "molécula bioactiva" comprende adicionalmente estructuras biológicamente activas, tales como, por ejemplo, un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células y un orgánulo. Ejemplos de una proteína que puede encapsularse o retenerse detrás de una película polipetídica son hemoglobina, enzimas, tales como por ejemplo glucosa oxidasa, ureasa, lisozima y similares; proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, fibronectina, laminina, vitronectina y colágeno; y un anticuerpo. Ejemplos de una célula que puede encapsularse o retenerse detrás de una película polielectrolítica son una célula insular trasplantada, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula vegetal y una célula de levadura.

"Biocompatible" quiere decir que no causa ningún efecto adverso para la salud tras ingestión oral, aplicación tópica, aplicación transdérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inhalación, implantación, o inyección intravenosa. Por ejemplo, las películas biocompatibles incluyen aquellas que no causan una respuesta sustancial del sistema inmune cuando están en contacto con el sistema inmune de, por ejemplo, un ser humano.

"Respuesta inmune" quiere decir la respuesta del sistema inmune celular o humoral a la presencia de una sustancia en cualquier parte del cuerpo. Una respuesta inmune se puede caracterizar en un número de formas. Por ejemplo, por un incremento en el torrente sanguíneo del número de anticuerpos que reconocen un cierto antígeno. Los anticuerpos son proteínas segregadas por células B y un inmunógeno es una entidad que provoca una respuesta inmune. El cuerpo humano lucha contra la infección e inhibe la reinfección incrementando el número de anticuerpos en el torrente sanguíneo y en otros lugares.

"Antígeno" significa una sustancia exógena que provoca una respuesta inmune (por ejemplo, la producción de moléculas de anticuerpos específicas) cuando se introduce en los tejidos de un organismo vertebrado susceptible. Un antígeno contiene uno o más epítopos. El antígeno puede ser una sustancia pura, una mezcla de sustancias (incluyendo células o fragmentos de células). El término antígeno incluye un determinante antigénico adecuado, auto-antígeno, antígeno propio, antígeno reactivo de forma cruzada, aloantígeno, tolerógeno, alérgeno, hapteno e inmunógeno, o partes de los mismos y combinaciones de. los mismos y esos términos se usan intercambiablemente. Los antígenos son generalmente de peso molecular alto y son comúnmente polipéptidos. Los antígenos que provocan respuestas inmunes fuertes se dice que son fuertemente inmunogénicos. El sitio de antígeno al que se puede unir específicamente un anticuerpo complementario se llama un epítopo o determinante antigénico.

"Antigénica" se refiere a la capacidad de una composición para dar lugar a anticuerpos específicos para la composición o para dar lugar a una respuesta inmune mediada por células.

Como se usa en el presente documento, los términos "epitopo" y "determinante antigénico" se usan intercambiablemente y quieren decir la estructura o secuencia de un antígeno, por ejemplo, una proteína o un péptido diseñado, que se reconoce por un anticuerpo. De ordinario un epitopo estará en la superficie de una proteína. Un "epitopo continuo" es uno que implica varios residuos de aminoácidos contiguos, no uno que implica residuos de aminoácidos que se encuentran en contacto o en la región limitada de espacio en una proteína plegada. Un "epitopo conformacional" implica residuos de aminoácidos de diferentes partes de la secuencia lineal de una proteína que entra en contacto en la estructura tridimensional de la proteína. Para que tenga lugar interacción eficiente entre el antígeno y el anticuerpo, el epitopo debe estar fácilmente disponible para unión. Así, los epítopos o determinantes antigénicos están presentes en el ambiente nativo del antígeno, celular, o solo se exponen cuando se desnaturalizan. En su forma natural pueden ser citoplásmicos (solubles), pueden estar asociados a membranas o pueden segregarse. El número, localización y tamaño de los epítopos dependerá de cuanto del antígeno esté presente durante el proceso de elaboración de anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, una "composición de vacuna';' es una composición que provoca una respuesta inmune en un mamífero al que se le administra y que protege al organismo inmunizado contra la provocación subsiguiente por el agente inmunizante o por un agente reactivo de forma cruzada inmunológicamente. La protección puede ser completa o parcial con respecto a reducción en síntomas o infección según se compara con un organismo no vacunado. Un agente reactivo de forma cruzada inmunológicamente puede ser, por ejemplo, la proteína completa (por ejemplo, glucosiltransferasa) a partir de la que un péptido de subunidad diferente se ha derivado para usar como un inmunógeno. Alternativamente, un agente inmunológicamente reactivo de forma cruzada puede ser una proteína diferente, que se reconozca en todo o en parte por anticuerpos provocados por el agente inmunizador.

Como se usa en el presente documento, una "composición inmunógena se desea para comprender una composición que provoca una respuesta inmune en un organismo al que se está administrando y que puede proteger o puede no proteger al mamífero inmunizado contra una provocación subsiguiente con el agente inmunizante. En una realización, una composición inmunógena es una composición de vacuna.

La invención se ilustra adicionalmente con los ejemplos no limitantes siguientes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Síntesis de polipéptidos diseñados (DP) Los polipéptidos diseñados se derivan de epítopos que residen en las secuencias de las proteínas RSV-G, RSV-F o RSV-M2. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de longitud total son como sigue (los epítopos de péptidos seleccionados incorporados en polipéptidos diseñados están subrayados). SEC ID N.°: 1 de RSV-G 1 MSKNKDQRTA KTLERTWDTL NHLLFISSCL YKLNLKSVAQ ITLSILAMII STSLIIAAII 60 61 FIASANHKVT PTTAIIQDAT SQIKNTTPTY LTQNPQLGIS PSNPSEITSQ ITTILASTTP 120 121 GVKSTLQSTT VKTKNTTTTQ TQPSKPTTKQ RQNKPPSKPN NDF HFEVFNF VPCSICSNNP 180 181 TCWAICKRIP NKKPGKKTTT KPTKKPTLKT TKKDPKPQTT KSKEVPTTKP TEEPTINTTK 240 241 TNIITTLLTS NTTGNPELTS QMETFHSTSS EGNPSPSQVS TTSEYPSQPS SPPNTPRQ 298 SEC ID N.°: 2 de RSV-F 1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 60 61 LSA//KENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PPTNNRARRE LPRFMNYTLN 120 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 180 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN 240 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 300 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTPftG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 360 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEIN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 420 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGMDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 480 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS 540 541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSN 574 SEC ID N.°: 3 de RSV-M 1 MSRRNPCKFE IRGHCLNGKR CHFSHNYFEW PPHALLVRQN FMLNRILKSM DKSIDTLSEI 60 61 SGAAELDRTE EYALGWGVL ESYIGSINNI TKQSACVAMS KLLTELNSDD IKKLRDNEEL 120! 121 NSPKIRVYNT VISYIESNRK NNKQTIHLLK RLPADVLKKT IKNTLDIHKS ITINNPKEST 180 181 DTNDHAKN NDTT 194 Los péptidos diseñados se sintetizaron por síntesis peptídica en fase sólida usando un sintetizador automatizado Liberty™ (CEM, Matthews, NC) con control de temperatura de microondas. Los péptidos se sintetizaron bien en soporte de resina Rink Amide o bien en soporte de resina poliestirénica ácida de Wang usando aminoácidos de Fmoc estándar, activación de HTBU/DIEA y acoplamiento doble de rutina. Tras la síntesis las resinas se secaron y los péptidos se escindieron por tratamiento con TFA/triisopropilsilano/fenol/3,6-dioxo-1 ,8-octanoditiol/agua (86:4:4:3:3) durante dos horas. Los péptidos en bruto se precipitaron con éter, se centrifugaron y se secaron al vacío. Los péptidos se purificaron por HPLC en fase inversa de Ci8 usando un gradiente de agua (ácido trifluoroacético al 0,1 %)/acetonitrilo. La identidad de cada péptido purificado se confirmó por espectrometría de masas de electropulverización (EMEP). Los rendimientos finales se calcularon por absorción de UV a 280 nm y/o por análisis de aminoácidos. Los péptidos se alicuotaron, se liofilizaron y se almacenaron como sales de trifluoroacetato a -20 °C hasta su uso.

La tabla 1 muestra los epítopos seleccionados de proteínas de RSV-G, RSV-F y RSV-M2. Cada! epítopo se incorporó dentro de un péptido diseñado (DP) por la adición de una cola poli-iónica C-terminal tal como Lys2o (K20) o repetición de Lys-Val-Lys-Ala (KVKA)4. Una tirosina C-terminal se incorporó usualmente con el fin de provocar cuantificación por UV. La secuencia nativa de RSV-M2 contiene una cisteína en posición 96. En los péptidos de epítopo sintéticos este residuo se ha reemplazado por una serina (C96S) con el fin de evitar enlaces disulfuro indeseados en esa posición.

Tabla 1 : Secuencias y características de epítopos de RSV seleccionados.

Ejemplo 2: Confirmación de plegamiento y estructura de pólipéptidos diseñados que contienen un epítopo conformacional de la proteína RSV-G: La proteína de unión de RSV (proteína RSV-G) contiene cuatro residuos conservados de cisteína que forman dos enlaces disulfuro internos localizados dentro de los aminoácidos 169-191. Los anticuerpos que reconocen esta región pueden neutralizar RSV, de tal forma que péptidos sintéticos restringidos conformacionalmente derivados de este segmento pueden ser componentes de vacuna efectivos. Los investigadores anteriores han usado una combinación de digestión proteolítica, HPLC y espectrometría de masas que muestra que Cys173 está unida a Cys186 y que Cys176 está unida a Cys182. Los péptidos que contienen residuos de proteínas RSV-G 169-191 se sinterizaron por síntesis peptídica en fase sólida. A pH neutro estos péptidos se oxidan fácilmente y los productos resultantes parecen contener dos disulfuros internos según se mide por la pérdida de cuatro protones en el espectro de EMEP así como por señal negativa en el ensayo de Ellman (DTNB). La facilidad con la que tienen lugar reacciones de oxidación y la limpieza de las conversiones está sugiriendo fuertemente que se están formando disulfuros nativos. En un experimento típico se disuelven péptidos de RSV-G (por ejemplo SEC ID N.°: 8, 11 , 13, 14, 15) a una concentración de 1-5 mg/ml en tampón de Tris pH 7,4 conteniendo glutatión 2,5 mM y glutatiol 2,5 mM. La reacción de plegamiento se controla por HPLC en fase inversa Cíe ya que el producto oxidado muestra un cambio a tiempo de retención ligeramente más corto en: relación al péptido reducido. Por estos criterios la reacción de plegamiento se juzga completada después de 2 horas a temperatura ambiente o después de 18 horas a 4 °C.

Se analizó una muestra de ACT-2044 (amida de RSV-G164-i9i K2iY) (SEC ID N.°: 8) plegada usando espectrometría de masas de resonancia de ciclotrón iónica transformada de Fourier de electropulverización (EM de FT-ICR). El estado de carga de MH6+6 dio una señal fuerte y el espectro expandido de los picos Mh 6 se muestra en la Figura 1. El pico monoisotópico a masa-carga (m/z) 1015,6008 corresponde a una masa monoisotópica de 6087,56 u.m.a., que está muy cerca de la masa monoisotópica calculada de 6088,51 u.m.a. y este resultado es totalmente consistente con la presencia de dos enlaces disulfuro en ACT-2044. Asimismo se analizó una muestra de ACT-2086 (amida de RSV-M28i.98Gi64-i9i 20Y) (SEC ID N.°: 13) plegada por EM de FT-ICR y el espectro se mostró en la Figura 2. Se observaron picos fuertes para los estados de carga de ?6+6-????+10. El pico monoisotópico MHg+9 tiene una m/z de 867,1571 que corresponde a una masa monoisotópica de 7795,344 u.m.a., que está muy cerca de la masa monoisotópica calculada de 7795,33 u.m.a. Este resultado es totalmente consistente con la presencia de dos enlaces disulfuro.

Se sometió a digestión con termolisina una muestra de ACT-2044 (RSV.G164-i9iK2iY) (SEC ID N.°: 8). El análisis de HPLC de la digestión demostró consumo completo del péptido de inicio. El espectro de FT-ICR de este producto contenía una mezcla compleja de productos, pero se encontró un ion dominante a . m/z 1106,4.

Esta especie corresponde al estado de carga de MH+1 para disulfuro intramolecular unido a RSV-G175-184 (c/c/o-ICSNNPTCWA (SEC ID N.°: 10), masa de MH+ esperada = 1106,440, hallada = 06,438). Este péptido es diagnostico para el enlace disulfuro nativo entre Cys176 y Cys182. En resumen, los datos de EM de FT-ICR respaldan fuertemente la reivindicación de que ACT-2044 (y los péptidos estrechamente relacionados ACT-2042 (SEC ID N.°: 11), ACT-2086 (SEC ID N.°: 13), ACT-2087 (SEC ID N.°: 14), ACT-2088 (SEC ID N.°: 15)) contiene dos enlaces disulfuro internos en el patrón correcto (nativo).

Ejemplo 3: Procedimiento general para fabricación de nanopartículas de ELBL: Se obtuvieron nanopartículas de CaC03 (NPCC-111) de NanoMaterials Technology (Singapur). Los experimentos de microscopía electrónica de barrido mostraron partículas que tienen una morfología cúbica y son de aproximadamente 50 nm en diámetro. Los polipéptidos poli-l-lisína 15 kDa (PLL, número de catálogo P6516), ácido poli-l-glutámico 14,5 kDa (PGA, número de catálogo P4636) y solución tampón HEPES 1 M (número de catálogo H-3662) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE.UU.). Los polipéptidos cargados de forma opuesta se dejaron autoensamblarse dentro de una película multicapa en núcleos de nanopartículas de CaC03 en etapas de adsorción sucesivas. Brevemente, PLL, PGA o polipéptido diseñado (DP, donde se indique) se disolvieron a 1 mg/ml (peso/volumen) en HEPES 10 mM, pH 7,4 y se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm. Los núcleos de nanopartículas de CaC03 se lavaron tres veces con agua libre de endotoxinas y se centrifugaron a 16.000 g durante 1 minuto en una microcentrífuga. Se resuspendieron núcleos de nanopartículas al 6 % (peso/volumen) en PGA 1 mg/ml como la primera capa. A pH neutro, PGA muestra una carga negativa neta mientras que las partículas de CaC03 son positivas netas, permitiendo así la interacción electrostática y la deposición exitosa de la primera capa. La mezcla se sónico durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se lavó dos veces con tampón de HEPES 10 mM y con centrifugación a 48.700 x g durante 1 minuto (Ultracentrífuga TL-100, Beckman). Para la deposición de la segunda capa, las nanopartículas se resuspendieron al 6 % (p/v) en PLL 1 mg/ml (carga positiva) y se sonicaron durante 10 minutos a temperatura ambiente como para la primera capa. Cada capa subsiguiente se depositó por el mismo procedimiento, usando PGA, PLL, o DP como se indica en la tabla 2 o en la tabla 3. Los péptidos típicamente diseñados se revistieron a una concentración de 0,5-1 ,0 mg/ml. Tras la deposición de capa final, las nanopartículas se lavaron dos veces con HEPES 10 mM, pH 4 y se sedimentaron por centrifugación, se aspiraron y se almacenaron como sedimento húmedo a 4 0 C hasta su uso. Se produjeron varios diseños usando esencialmente el mismo procedimiento u alterando lá secuencia y localización del péptido deseado; todas las nanopartículas contienen un total de ocho capas en la biopelícula polipeptídica. Los diseños de nanopartículas se resumen en la tabla 2. La concentración del polipéptido o DP sobre las nanopartículas se determinó por análisis de aminoácidos. El tamaño de las nanopartículas se determinó por dispersión de luz dinámica (Malvern Nano S-90) de suspensiones al 0,06 % (p/v) en HEPES, pH 7,4, se sónico durante 20 minutos en un baño de agua ultrasónico (Branson 1510, EE.UU.) antes de medida. Los niveles de endotoxina en las nanopartículas se determinaron por ensayo de Lisado de Amebocito Limulus, un ensayo cromogénico de criterio de valoración (n.°: 50-647U, Lonza, Walkersville, MD). Las nanopartículas preparadas se almacenaron en forma de un sedimento húmedo a 4 °C hasta estar listas para su uso.

Tabla 2: Diseños de nanopartículas monovalentes. El n.° de ACT hace referencia a la designación de distintos diseños de nanopartículas. El n.° de DP hace referencia a péptidos diseñados distintos. La secuencia del DP lista los epítopos de SV específicos y la cola poli-iónica incluida en cada DP.

Ejemplo 4: Fabricación y caracterización de nanopartículas de ELBL ACT-1077: Se siguió el procedimiento estándar descrito en el Ejemplo 3. Una solución de 1 ,0 mg/ml de péptido diseñado ACT-2031 (RSV-M28i-98(KVKA)4 (SEC ID N.°: 12)) se usó durante la segunda etapa de revestimiento de ELBL y una solución del péptido diseñado ACT-2044 1 ,0 mg/ml (RSV-Gi64-i9iK2iY (SEC ID N.°: 8)) se usó durante la octava etapa de ELBL. Después de cada etapa de formación de capas las nanopartículas se lavaron y se resuspendieron al 6 %. Una alícuota de 10 µ? se retiró y diluyó en 1 ,0 mi de tampón de HEPES 10 mM para análisis de potencial de superficie (zeta). La Figura 3 muestra los potenciales zeta de superficie para las nanopartículas en cada etapa del procedimiento de ELBL. Antes del revestimiento las partículas de : CaCC«3 presentaron un potencial de superficie positivo de aproximadamente +28 mV. Después de revestir con una capa única de PGA, se midió un potencial de superficie negativo de -18 mV. El revestimiento con ACT-2031 (SEC ID N.°: 12) en lá segunda capa Incrementó el potencial zeta a aproximadamente 0 mV, indicando adsorción del péptido. A partir de entonces, cada etapa de formación de capa llevó a cabo un cambio negativo o positivo en potencial zeta, indicando adsorción de ELBL exitosa. Después de la fabricación la cantidad de cada péptido diseñado adsorbida se calculó a partir de la señal de aminoácidos únicos en el cromatograma de aminoácidos. La glicina es única para ACT-2031 y se puede usar determinando concentración de ACT-2031 mientras que arginina, histidina y fenilalanina son únicos para ACT-2044 y se pueden usar determinando la concentración de ACT-2044. Las cantidades promedio de ACT-2031 y ACT-2044 adsorbidas a partir de cuatro lotes distintos a una suspensión de partículas de CaC03 al 1 % fueron 21 g/ml y 53 pg/ml, respectivamente.

Ejemplo 5: Fabricación de nanopartículas de ELBL ACT-1086: El procedimiento de revestimiento de ELBL descrito en el Ejemplo 3 se usó revistiendo nanopartículas de CaC03 50 nm con siete capas de PGA y PLL. Se usó una solución de 0,5 mg/ml de péptido diseñado ACT-2086 (SEC ID N.°: 13; amida de RSV-M28i-98Gi64-i9i K20Y), en tampón HEPES 10 mM revistiendo la capa final. La cantidad de péptido diseñado adsorbido se midió por análisis de aminoácidos. A partir de los tres lotes separados la cantidad promedio de ACT-2086 adsorbida a una suspensión de partículas de CaC03 al 1 % fue de 37 pg/ml.

Ejemplo 6: Fabricación de nanopartículas de ELBL ACT-1139: El procedimiento de revestimiento de ELBL descrito en el Ejemplo 3 se usó revistiendo nanopartículas de CaC03 50 nm con siete capas de PGA y PLL. Se usó una solución de HEPES 10· mM de péptidos diseñados ACT-2033 (SEC ID N.°: 16; amida de RSV M2 8?-9ß K20Y) y ACT-2044 (SEC ID N.°: 8; amida de RSV-G161.19i K2iY) cada uno a una concentración final de 0,25 mg/ml revistiendo la capa final. Las nanopartículas se lavaron, se sedimentaron por centrifugación y se almacenaron como sedimento húmedo a 4 °C. Las cantidades de cada péptido diseñado adsorbidas se calcularon a partir de la señal de aminoácidos únicos en el cromatograma de aminoácidos. La glicina es única para ACT-2033 y se puede usar determinando concentración de ACT-2033 mientras que arginina, histidina y fenilalanina son únicas para ACT-2044 y se pueden usar determinando la concentración de ACT-2044. A partir de este análisis se determinó que una suspensión de partículas al 1 % contenía ACT-2033 a 25 pg/ml y ACT-2044 a 24 Mg/ml .

Ejemplo 7: Fabricación de micropartículas de ELBL ACT-1 145: Se obtuvieron micropartículas de CaCÜ3 de 3 pm mesoporosas de PlasmaChem GmbH (Berlín, n.° de catálogo PL-CA3). Las partículas se suspendieron al 6 % (peso/volumen) en HEPES 10 mM. El procedimiento de revestimiento de ELBL descrito para partículas de CaCCb en el Ejemplo 3 se usó con las siguientes modificaciones. Micropartículas de CaCÜ3 de 3 pm se asientan fácilmente en gravedad normal en suspensión acuosa de tal forma que en lugar de sonicación durante las etapas de formación de capas se mezclaron suavemente en un rotador durante 10 minutos. Además, velocidades de centrifugación menores se pueden usar para sedimentar micropartículas tras las etapas de formación de capas y lavado. Así las suspensiones de micropartículas se sedimentaron a 1500 g durante 1 minuto. Para la fabricación de ACT-1145 se usó una solución de 1 ,0 mg/ml de PGA revistiendo la primera capa y se usó una capa de 1 ,0 mg/ml de PLL marcada con fluoresceína (PLL-FITC, catálogo de Sigma n.°: P3543) para la segunda capa. PGA y PLL se usaron para las cinco etapas de formación de capas siguientes revistiendo las micro-partículas con un total de siete capas polipeptídicas. (Estas partículas se pueden usar en un experimento de revestimiento según se describe en el Ejemplo 8). Se usó una solución de 0,5 mg/ml de ACT-2086 (SEC ID N.°: 13; amida de RSV-M28i-98Gi64-i9i 2oY), en tampón HEPES 10 mM revistiendo la capa final. Las micropartículas se lavaron, se sedimentaron y se almacenaron como sedimento húmedo a 4 °C. La cantidad de ACT-2086 adsorbida en las partículas se calculó por análisis de aminoácidos y se encontró que era 43 pg/ml para una suspensión de partículas del 1 %. Las partículas se examinaron por microscopía de fluorescencia y se encontró que eran esféricas con diámetros de 3,0 (+/- 1 ,5) pm. Las partículas eran partículas individuales bien dispersas con unos pocos agregados de dos o tres partículas.

Ejemplo 8: Fabricación de micropartículas de ELBL ACT-1 146: El procedimiento en el Ejemplo 7 se usó fabricando micropartículas de CaC03 de 3 pm con siete capas polipeptídicas (PGA/PLL-FITC/PGA/PLL/PGA/PLL/PGA). Se preparó de forma reciente una solución de tampón de pH 6,5 de fosfato de sodio 0,2 M conteniendo 1-etil-3-(3-dimet¡lam¡nopropil)carbodiimida a 38 mg/ml (0,20 M) (EDC, número de catálogo de Sigma: E6383) y de sal sódica de /V-hidroxisulfosuccinimida a 1 1 mg/ml (0,05 M) (sulfo-NHS, número de catálogo de Sigma: 56485). Las micropartículas de las siete capas se suspendieron en la solución de EDC/sulfo-NHS a una suspensión del 3 %. La suspensión se mezcló suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente, después las partículas se centrifugaron y se lavaron tres veces con tampón de HEPES 10 mM. Se usó una solución de 0,5 mg/ml de ACT-2086 (SEC ID N.°: 13; amida de RSV-M281-98Gi64-i9i K20Y), en tampón HEPES 10 mM revistiendo la capa final. Las micropartículas se lavaron, se sedimentaron y se almacenaron como sedimento húmedo a 4 °C. La cantidad de ACT-2086 adsorbida en las partículas se calculó por análisis de aminoácidos y se encontró que era 49 pg para una suspensión de partículas del 1 %.

Ejemplo 9: Fabricación de microcápsulas de ELBL ACT- 147: Se suspendieron micropartículas de CaC03 ACT-1146 del Ejemplo 8 al 6 % (peso/volumen) en EDTA de sodio 0,5 M, solución a pH 8,0. Las partículas se mezclaron suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos, se centrifugaron durante 3 minutos a 1500 g y la solución de EDTA se aspiró. Las microcápsulas resultantes se resuspendieron dos veces en HEPES 10 mM y se centrifugaron durante 3 minutos a 1500 g eliminando las sales en exceso. Las micropartículas se lavaron, se sedimentaron y se almacenaron como sedimento húmedo a 4 °C. La cantidad de ACT-2086 adsorbida en las cápsulas se calculó por análisis de aminoácidos y se encontró que era 41 pg/ml para una suspensión de partículas del 1 %. Las cápsulas se examinaron por microscopía de fluorescencia y se encontró que eran esféricas con diámetros de 3,0 (+/- 1,5) pm. Las cápsulas eran cápsulas individuales bien dispersas con unos pocos agregados de dos o tres partículas.

Ejemplo 10: Inmunogenicidad de nanopartículas monovalentes de RSV-G: Se inmunizaron ratones BALB/c tres veces con nanopartículas ACT-1042 (DP de SEC ID N.°: 8; RSV-G164-191 ) por medio de inyección en la almohadilla plantar y los sueros se recogieron y se sometieron a prueba por ELISA. Los sueros reconocieron el péptido de epítopo RSV-G CX3C conformacional ACT-1042 (Figura 4) pero no una versión del mismo péptido (ACT-2054) que se linealizó cubriendo los residuos de cisteína (Figura 5). Los sueros también reconocieron la proteína RSV-G nativa (Figura 6), sugiriendo que la inmunización con la nanopartícula RSV-G ELBL facilitó respuestas de anticuerpos dependientes de conformación. La actividad biológica de la respuesta de anticuerpos provocada por ACT-1042 se confirmó en ensayos midiendo inhibición de unión de quimiocinas RSV-G CX3C (Figura 7) e inhibición de migración de PBMC humana a RSV-G purificada (Figura 8). Así, una vacuna de diseño de nanopartículas que incorpora un péptido diseñado en base al epítopo RSV-G CX3C restringido conformacionalmente puede provocar las respuestas de anticuerpos biológicamente relevantes.

Ejemplo 11 : Inmunogenicidad de nanopartículas monovalentes de RSV-M2: Se inmunizaron ratones BALB/c con nanopartículas ACT-1023 (RSV-M2ei-98) (DP de SEC ID NO:12) de manera s.c. (subcutánea), i.p. (intraperitoneal), i.n. (intranasal), o por almohadilla plantar. Los ratones controles positivos se inmunizaron s.c. con péptido ACT-2019 (RSV-M281 -95; SEC ID N.°: 7) en coadyuvante completo de Freund (CFA) y se reforzaron con ACT-2019 en coadyuvante de Freund incompleto (IFA); los ratones no inmunizados sirvieron como controles negativos. Las respuestas de linfocitos T en los bazos se midieron en ensayos de ELISPOT de IL-4 e IFNy 14 días después de la inmunización. Los datos en la Figura 9 muestran que la inmunización con ACT-1023 indujo ELISPOT de IL-4 débil, como se esperaba para el epítopo de CD8 contenido en el DP. En contraste, los ratones inmunizados a través de la almohadilla plantar proporcionaron respuestas de IFNy vigorosas siguiendo una inmunización individual. Los grupos de s.c. y de i.p. proporcionaron respuestas menos potentes que aún fueron comparables al control positivo del grupo CFA. La administración intranasal no parece ser inmunógena en este experimento. La inmunización con péptido solo permitió niveles bajos de respuestas de IFNy. Así, los autores de la presente invención han confirmado que la potencia del péptido de RSV-M2 se incrementa significativamente incrustándolo en una nanopartícula de ELBL.

Ejemplo 12: Inmunogenicidad mejorada de nanopartículas de RSV-G y RSV-M2 cuando se combinan en una vacuna de cóctel multivalente: La inmunización de ratones con cualquier vacuna de nanopartículas monovalente provocó las respuestas inmunes predichas (véanse Figuras 4-8 y 9). Es interesante notar que las respuestas de anticuerpos descritas en las Figuras 4-8 requirieron tres inmunizaciones (principal + dos refuerzos) mientras que las respuestas de linfocitos T representadas en la Figura 9 requirieron una inmunización individual (principal). Determinando si un vacuna de nanopartículas multivalente que contiene tanto RSV-G como RSV-M2 podría mejorar la potencia inmune del componente RSV-G, los ratones se inmunizaron con una mezcla de nanopartículas de RSV-G (ACT-1042, 1 pg de DP por dosis) y de RSV-M2 (ACT-1023, 5 pg de DP por dosis) administradas por medio de la almohadilla plantar o intranasalmente. Se midieron títulos de anticuerpos tras la inmunización principal y tras los refuerzos por ELISA y las respuestas de linfocitos T tras los refuerzos se sometieron a seguimiento por ELISPOT. Ninguno de los ratones que recibieron cualquiera de las construcciones tuvo una respuesta de anticuerpos primaria medible (datos no mostrados). La Figura 10 muestra los resultados del ELISA post-refuerzo midiendo IgG específica de RSV-G. En ratones que recibieron solo ACT-1042, solo la administración a través de la almohadilla plantar dio como resultado un título detectable. La adición de la nanopartícula de RSV-M2 en el grupo de almohadilla plantar produjo títulos de anticuerpos iguales a aquellos inducidos por 5 pg del péptido de RSV-G en CFA. La administración intranasal de la mezcla facilitó títulos cerca de la misma como inyección i.p. de las nanopartículas de RSV-G solas; mientras que la administración i.n. de la nanopartículas de RSV-G solas falló en provocar títulos de anticuerpos detectables en refuerzo. Estos resultados demostraron que la inclusión de las nanopartículas de RSV-M2 parece incrementar la potencia del epítopo de anticuerpos en RSV-G y que la administración i.n. de nanopartículas puede provocar una respuesta inmune.

Las respuestas de los linfocitos T de los mismos ratones se midieron por ELISPOT. La Figura 1 1 muestra que los ratones inmunizados a través de la i.p. con las nanopartículas que contienen RSV-M2 del cóctel organizaron una respuesta de linfocitos T contra el epítopo de M2 que era casi enteramente IFNY, como se esperaba. Cuando se administró intranasalmente, la nanopartícula sola (ACT- 023) falló en provocar una respuesta de linfocitos T. Por contraste, la co-administración de las nanopartículas de RSV-M2 y de RSV-G (mezcla) provocó una potente respuesta de IFNy que fue comparable a aquella inducida por inmunización de almohadilla plantar con RSV-M2 sola.

Las respuestas de linfocitos T se examinaron en un ensayo de CTL in vivo que mide la actividad de linfocitos T citotóxicos en el animal huésped. En la cohorte monovalente, los ratones BALB/c se inmunizaron a través de la almohadilla plantar con una inyección individual de PBS (control negativo), péptido ACT-2031 (RSV-M2) en coadyuvante de Freund incompleto (IFA), o nanopartícula ACT-1023 (RSV-M2). En la cohorte multivalente, los ratones se inmunizaron con PBS, péptido ACT-2031 (RSV-M2) más péptido ACT-2044 (RSV-G) en IFA, o ACT-1023 (RSV-M2) más ACT-1042 (RSV-G). Siete días más tarde, las células objetivo RSV-M2 se prepararon sometiendo a pulsos a células del bazo no inmunizadas singénicas con péptido ACT-2031 y marcándolas con una dosis alta de marcador fluorescente CFSE, mientras que las células objetivo control se prepararon marcando células del bazo no inmunizadas singénicas con una dosis baja de CFSE y sin ningún péptido objetivo. Las dos poblaciones celulares marcadas se mezclaron a una proporción 1 : 1 y las 5 x 106 células se inyectaron i.v. dentro de los ratones inmunizados donde ellos se alojan al bazo del huésped. Después de 24 horas, los ratones inmunizados se sacrificaron y sus células del bazo se analizaron en fluorescencia de CFSE controlando la supervivencia de las dos poblaciones celulares. En la Figura 12, los picos más a la izquierda en los histogramas representan las células objetivo de control de supervivencia y los picos más a la derecha representan las células objetivo RSV-M2 marcadas. Como se espera, ambas poblaciones celulares sobrevivieron igualmente en los ratones no inmunizados (de PBS). En contraste, en ratones inmunizados con péptido ACT-2031/IFA, se mataron aproximadamente el 18 % de las células objetivo RSV-M2 (comparar el tamaño del pico derecho con el tamaño del pico izquierdo en el histograma ACT-2031/IFA). Se obtuvieron resultados similares en ratones inmunizados con una dosis alta (75 pg) de nanopartícula ACT-1023, comparados con la no mortalidad de células objetivo marcadas en ratones inmunizados con un dosis inferior (10 pg) de ACT-1023. En los ratones inmunizados con una combinación de los dos péptidos o de las dos nanopartículas, se observó un grado más alto de mortalidad de células objetivo marcadas. Específicamente, los ratones inmunizados con el cóctel de nanopartículas (ACT-1023 + ACT-1042 a 10 pg cada una) mataron el 35 % de las células objetivo marcadas con RSV-M2, lo que es más alto que la respuesta inducida incluso con una dosis alta de inmunización monovalente (ACT-1023/75 pg). La mortalidad específica en porcentaje de células objetivo marcadas con RSV-M2 se resume en la Figura 13. Estos resultados están de acuerdo con los números de ELISPOT de IFNy incrementados detectados en ratones inmunizados con el cóctel de nanopartículas RSV-G y RSV-M2 (véanse Figura 10, 11). Estos datos sugieren que combinar nanopartículas RSV-G y RSV-M2 en una vacuna de cóctel proporciona una mejora mutua en potencia inmune de ambos componentes. Mientras que el incremento en la respuesta de anticuerpos a RSV-G (Figura 10) puede atribuirse a ayuda de linfocitos T provocada por RSV-M2, la mejora recíproca en la respuesta de linfocitos T a RSV-M2 tras la administración intranasal del cóctel (Figura 11) fue inesperada.

Ejemplo 13: Diseño de nanopartículas multivalentes Las partículas adicionales se diseñaron incluyendo epítopos múltiples en la misma partícula bien como DP separados formando capas conjuntamente en la misma partícula, bien como DP separados formando capas conjuntamente en la misma partícula o como DP de fusión conteniendo tanto epítopo RSV-G como RSV-M2. La Tabla 3 describe la arquitectura de nanopartículas de RSV de epítopos múltiples y la Tabla 4 describe las secuencias de DP usadas en cada una. Las nanopartículas ACT-1077 a 1079 contienen el epítopo de linfocitos T de RSV-M2 en una o múltiples capas y el epítopo de células B de RSV-G en la 8a capa. Las nanopartículas ACT-1086 a 1088 contienen péptidos de epítopos duales ACT-2086 a través de -2088, respectivamente, depositados solo en la 8a capa. Los diseños adicionales pueden preverse usando estos u otros epítopos de RSV bien formando capas conjuntamente o bien en un péptido de fusión individual.

Tabla 3: Arquitectura de diseños de nanopartículas de RSV multivalentes, micropartículas de RSV y microcápsulas de RSV. ACT-1077 a 1079 contienen dos DP separados depositados en distintas capas en la misma nanopartícula de ELBL. ACT-1139 contiene dos DP separados depositados en la 8a capa en la misma nanopartícula de ELBL. ACT-1086 a 1088 contienen un péptido de fusión individual que incorpora tanto epítopos objetivo de anticuerpos como epítopos objetivo de linfocitos T en la 8a capa de nanopartículas de ELBL. ACT-1145 a 1146 contienen un péptido de fusión individual que incorpora tanto epítopos objetivo de anticuerpos como epítopos objetivo de linfocitos T en la 8a capa de micropartículas de ELBL. ACT-11457 contiene un péptido de fusión individual que incorpora tanto epítopos objetivo de anticuerpos como epítopos objetivo de linfocitos T en la 8a capa de microcápsulas de ELBL.

Tabla 4: Secuencias de RSV de DP usadas en diseños de nanopartículas de ELBL multivalentes en la Tabla 3. Los epítopos de células B se muestran subrayados, los epítopos de linfocitos T se muestran en negrita, las cisteínas conservadas se muestran sombreadas, la secuencia no nativa se muestra en cursiva.

Ejemplo 14: Dosodependencia de construcciones de nanopartículas de DP La misma dosis de péptido diseñado (1 pg) se usó tanto en los grupos de control positivo (CFA) como en los grupos de nanopartículas (1042). En los experimentos anteriores, se usaron 5-10 pg para los CFA y se usó 1 pg para la nanopartícula. Estos resultados mostraron que a dosis equivalentes las nanopartículas son más inmunógenas que el control CFA.

Tabla 5: Grupos para estudio de mezclado de RSV Los datos se muestran en las Figuras 14-16.

Ejemplo 15: Tiolación de ácido poli-L-glutámico (PGA-SH) y unión de péptido que contiene cisteína.

Se disolvieron 32 mg de sal sódica de PGA de peso molecular medio (vendida por Sigma) en 1 ,0 mi de tampón de pH 7,2 de fosfato de sodio. Sé añadieron 22 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y 15 mg de sulfo-NHS y la solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 4,6 mg de sal HCI de cistamina y se permitió a la solución reaccionar durante 90 minutos. El producto se purificó por paso sobre una columna Desait® (vendida por Pierce) pre-equilibrada con tampón de acetato diluido a pH 4,5. El eluyente se congeló y almacenó a -80 °C. La extensión de la tiolación se estimó por ensayo de Ellman: (DTNB) y se encontró que era aproximadamente el 24 % de residuos de glutamato totales.

Un péptido sintético que contiene un epítopo de linfocitos T conocido de la proteína RSV G (residuos de RSV G 186-198, SEC ID N.°: 24 CKRIPNKKPGKKT) puede sintetizarse fácilmente por procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida estándar. Se pueden tratar 15 mg de PGA-SH en 0,5 mi de tampón fosfato de pH 7 con 0,4 mg de DTNB (~1 ,0 pmol) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución se volverá amarilla. La reacción de activación puede someterse a seguimiento por espectroscopia de UV y juzgarse completa cuando no hay más incremento en absorbancia según 412 nm. Se pueden añadir después 1 ,5 mg de cisteína que contienen péptido de epítopo (~1 pmol) y se permitió a la solución reaccionar durante 10 min. El producto se purificó parcialmente por diálisis usando tubos de diálisis de corte de 5000 p.m. y la carga de péptidos se puede confirmar por análisis de aminoácidos.

Ejemplo 16: Unión de tioéter de un péptido de epítopo a PGA-SH.

Un péptido sintético que contiene un epítopo de linfocitos T conocido de la proteína RSV G (residuos de RSV G 187-198, SEC ID N.°: 25 KRIPNKKPGKKT) se puede sintetizar sobre una resina de síntesis peptídica en fase sólida. Antes de escisión de la resina, se puede instalar una grupo bromoacetilo en el extremo N-terminal tratando la resina con anhídrido bromoacético. Tras la escisión de la resina y la purificación se pueden añadir 1 ,5 mg (~ 1 pmol) del péptido (bromoacetil- KRIPNKKPGKKT) a una solución de 15 mg de PGA-SH en tampón fosfato de pH 7. El producto puede purificarse parcialmente por diálisis usando tubos de diálisis de corte de PM de 5000 y la carga del péptido se puede confirmar por un análisis de aminoácidos.

Ejemplo 17: Reticulación de un péptido de epítopo que contiene cisteína a PLL.

Una solución madre de medio MW PLL (vendido por Sigma) a una concentración conveniente, típicamente 0,5-50 mg/ml y a un pH cerca del neutro, típicamente pH 6-8, se mezcla con un agente de reticulación tal como 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC). La cantidad de sulfo-SMCC puede variar pero se usa suficiente cantidad modificando entre el 1-25 % de los residuos de lisina en el PLL. El tiempo de reacción típico es 0,5-5 horas. El exceso de reactivo sulfo-SMCC se retira después bien haciendo pasar la solución de reacción sobre una columna de filtración de gel o bien por diálisis. El PLL modificado se deja reaccionar después con un ligero exceso de péptido de epítopo que contiene cisteína a pH cercano al neutro, típicamente pH 6-8. El conjugado de PLL-epítopo final se purifica bien haciendo pasar la solución sobre una columna de filtración de gel o bien por diálisis. Este reactivo será adecuado para incorporación dentro de una película de ELBL polielectrolítica por procedimientos usados de manera similar para PLL.

Ejemplo 18: Protección de provocación de RSV tras inmunización de ratones con nanopartículas Se provocaron ratones intranasalmente con RSV en el día 28 y se sacrificaron 5 días más tarde. Los pulmones se recogieron y homogeneizaron y los títulos víricos se midieron por ensayos de células Vero y por amplificación con qPCR del gen RSV- M. Los resultados (Figura 17) demuestran protección esencialmente completa con cualquier formulación que contenga RSV-G (grupos 3-6). En este estudio, RSV- 2 solo no protegió, ni funcionó mejor la vacuna multivalente que RSV-G solo, posiblemente debido a la dosis relativamente alta usada (10 g).

Ejemplo 19: Inmunogenicidad de las nanopartículas multivalentes que contienen epítopos de RSV-G y de RSV-M2 de las mismas o diferentes capas Se inmunizaron ratones en el día 0 por inyección de construcciones de nanopartículas de RSV en la almohadilla plantar trasera; los inmunógenos incluyeron ACT-1023 (RSV-M2), ACT-1042 (RSV-G) + ACT-1023 (RSV-M2), ACT-1086 (péptido de fusión RSV-M2 + G en una capa individual) y ACT-1077 (péptidos RSV-G + RSV-M2 en diferentes capas). Los ratones se provocaron con células objetivo cargadas con RSV-M2, marcadas con CFSE en el día 7. Al día siguiente, las células del bazo se analizaron por citometría de flujo detectando la supervivencia de las células objetivo marcadas con CFSE. Los resultados (Figuras 18 y 19) muestran que mientras que la inmunización con cualquier nanopartícula que contenga epítopo RSV-M2 facilitó las células efectoras específicas de RSV-M2, la respuesta fue más potente en ratones inmunizados con construcciones multivalentes (RSV-M2 + G) que en ratones inmunizados con construcciones monovalentes (RSV-M2).

En un estudio separado, los ratones se inmunizaron en los días 0 y 21 por inyección de construcciones de nanopartículas de RSV en la almohadilla plantar trasera; los inmunógenos incluyeron ACT-1023 (RSV-M2), ACT-1042 (RSV-G), ACT- 1042 + ACT-1023, ACT-1086 (péptido de fusión RSV-M2 + G en una capa individual) y ACT-1139 (péptidos RSV-G + RSV-M2 co-cargados en la misma capa). Se sacó sangre a los ratones en el día 28 y los sueros se analizaron en cuanto a anticuerpos específicos de RSV-G por ELISA. Los resultados (Figura 20, 21) mostraron que todas las formulaciones que contenían el epítopo RSV-G provocaron títulos de anticuerpos, mientras que la nanopartícula multivalente de ACT-1139 pareció ser la más potente.

El uso de los términos "un", "una" y "el" y referentes similares (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) son para interpretarse como que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que ello sea de otra forma claramente contradictorio con el contexto. Los términos primero, segundo, etc., como se usan en el presente documento no están significando denotar orden alguno en particular, sino simplemente denotar por conveniencia una pluralidad de, por ejemplo, capas. Los términos "comprendiendo", "teniendo", "incluyendo" y "conteniendo" son para interpretarse como términos abiertos (es decir, significando "incluyendo, pero no limitados a") a menos que se señale de otro modo. La enumeración de intervalos y valores se desea meramente para servir como un procedimiento abreviado de referirse individualmente a cada valor por separado que caiga dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento y cada valor separado se incorpora dentro de la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Los puntos finales de todos los intervalos están incluidos dentro del intervalo y son combinables individualmente. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo en un orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que ello sea de otra forma claramente contradictorio con el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje ejemplar (por ejemplo "tal como") se desea meramente para ilustrar mejor la invención y no posee una limitación del alcance de la invención a menos que se reivindique de otro modo. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debería interpretarse como indicando cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención según se usa en el presente documento.

Aunque la invención se ha descrito en referencia a una realización ejemplar, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer diversos cambios y se pueden sustituir equivalentes por elementos de los mismos sin apartarse del alcance de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación o material particular a las enseñanzas de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma. Por lo tanto, se pretende que la invención no se limite a la realización particular dada a conocer como el mejor modo contemplado para llevar a cabo esta invención, sino que la invención incluirá a todas las realizaciones que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos está abarcada por la invención, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que ello sea de otra forma claramente contradictorio con el contexto.

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, caracterizada porque comprende: un primer epítopo polipeptídico de RSV y un segundo epítopo polipeptídico de RSV, estando el primer y el segundo epítopos unidos covalentemente a uno o más polielectrolitos, estando los uno o más polielectrolitos en una o más películas multicapa, en la que las una o más películas multicapa comprenden cada una dos o más capas de polielectrolitos, comprendiendo las capas adyacentes polielectrolitos cargados de forma opuesta y en la que el polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1000 y al menos 5 cargas por molécula y en la que el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en la misma o en diferentes películas multicapa.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un polielectrolito de la película multicapa comprende un polipéptido diseñado, teniendo el polipéptido diseñado carga suficiente para unión estable a una superficie cargada de forma opuesta.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido diseñado es de al menos 15 aminoácidos de largo y tiene una carga neta por residuo a pH neutro de más de o igual a 0,1 y en la que el polipéptido diseñado comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV, el segundo epítopo polipeptídico de RSV, o ambos.

4 La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en un polielectrolito individual y en la misma película multicapa.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en polielectrolitos distintos.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque un primer polielectrolito que comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV y un segundo polielectrolito que comprende el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en la misma película multicapa.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque un primer polielectrolito que comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV está presente en una primera película multicapa y un polielectrolito que comprende el segundo epítopo polipeptídico de RSV está presente en una segunda película multicapa.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV provoca una respuesta específica citotóxica o de linfocito T cooperador y el segundo epítopo polipeptídico de RSV provoca una respuesta de anticuerpo específica.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV es un epítopo de proteína RSV-M2 y el segundo epítopo polipeptídico de RSV es un epítopo de proteína RSV-G.

. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el epítopo polipeptídico de RSV comprende la SEC ID N.°: 7 y el segundo epítopo polipeptídico de RSV comprende la SEC ID N.°: 4.

11. La composición de la reivindicación 8, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV es un epítopo de la proteína RSV-F y el segundo epítopo polipeptídico es un epítopo de la proteína RSV-G.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la película está depositada sobre una partícula de núcleo.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la película multicapa está en forma de una cápsula hueca.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente por enlaces amida.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente por enlaces disulfuro.

17. Una composición, caracterizada porque comprende: un primer epítopo polipeptídico de RSV y un segundo epítopo polipeptídico de RSV, estando el primer y el segundo epítopos polipeptídicos están en la forma de una o más películas multicapa, en la que las una o más películas multicapa comprenden cada una dos o más capas de polielectrolitos, comprendiendo las capas adyacentes polielectrolitos cargados de forma opuesta y en la que al menos un polielectrolito de la película multicapa comprende un polipéptido diseñado, en la que el polipéptido diseñado tiene suficiente carga para unión estable a una superficie cargada de forma opuesta y en la que el polipéptido diseñado comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV, el segundo epítopo polipeptídico de RSV, o ambos, en la que un polielectrolito que no es un polipéptido diseñado comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de mas de 1.000 y al menos 5 cargas por molécula y en la que el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en la misma o en diferentes películas multicapa.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el polipéptido diseñado es de al menos 15 aminoácidos de largo y tiene una carga neta por residuo a pH neutro de más de o igual a 0,1.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en un polipéptido diseñado individual y en la misma película multicapa.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV y el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en polipéptidos diseñados distintos.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque un primer polipéptido diseñado que comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV y un segundo polipéptido diseñado que comprende el segundo epítopo polipeptídico de RSV están presentes en la misma película multicapa.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque un primer polipéptido diseñado que comprende el primer epítopo polipeptídico de RSV está presente en una primera película multicapa y un segundo polipéptido diseñado que comprende el segundo epítopo polipeptídico de RSV está presente en una segunda película multicapa.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV provoca una respuesta específica citotoxica o de linfocito T cooperador y el segundo epítopo polipeptídico de RSV provoca una respuesta de anticuerpo específica.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el primer epítopo polipeptídico de RSV es un epítopo de proteína RSV-M2 y el segundo epítopo polipeptídico de RSV es un epítopo de proteína RSV-G.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el epítopo polipeptídico de RSV comprende la SEC ID N.°: 7 y el segundo epítopo polipeptídico de RSV comprende la SEC ID N.°: 4.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizasa porque el primer epítopo polipeptídico de RSV es un epítopo de proteína RSV-F y el segundo epítopo polipeptídico es un epítopo de proteína RSV-G.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la película está depositada sobre una partícula de núcleo.

28. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la película multicapa está en forma de una cápsula hueca.

29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente.

30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente por enlaces amida.

31. La composición de la reivindicación 29, en la que dos o más de las capas de la película multicapa están reticuladas covalentemente por enlaces disulfuro.

32. Una composición, caracterizada porque comprende: un epítopo polipeptídico de RSV-G unido covalentemente a uno o más polielectrolitos, estando los uno o más polielectrolitos en una o más películas multicapa, comprendiendo las una o más películas multicapa comprenden cada una dos o más capas de polielectrolitos y comprendiendo las capas adyacentes polielectrolitos cargados de forma opuesta y en la que el polielectrolito comprende un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular de más de 1000 y al menos 5 cargas por molécula.

33. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el epítopo polipeptídico RSV-G comprende la SEC ID N.°: 4.

34. Un procedimiento de administración a un individuo en necesidad de inmunización de RSV de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33.