ES2885806T3 - Vacuna con micropartículas/nanopartículas contra la malaria - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una primera película multicapa que comprende una pluralidad de capas de polielectrolito con carga opuesta y un lipopéptido TLR2, TLR1/2 y/o ligando TLR6/2, en donde una de las capas de polielectrolito en la película multicapa comprende un primer polielectrolito antigénico, donde el primer polielectrolito antigénico comprende un epítopo T1BT* del circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un primer polielectrolito, donde el primer polielectrolito antigénico es un polipéptido diseñado que tiene al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 1,000 residuos de aminoácidos de longitud y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor o igual a 0.2 a pH 7.0, donde los polielectrolitos en la película multicapa comprenden un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular superior a 1,000 y al menos 5 cargas por molécula, y donde la primera película multicapa se deposita sobre una micropartícula central o nanopartícula central o tiene la forma de una microcápsula hueca o nanocápsula hueca.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna con micropartículas/nanopartículas contra la malaria

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a composiciones y usos de las mismas para la prevención de infecciones por malaria, específicamente composiciones de película multicapa que contienen epítopos antigénicos.

Antecedentes

La malaria es una de las infecciones más prevalentes en áreas tropicales y subtropicales de todo el mundo. Las infecciones de malaria provocan enfermedades graves en cientos de millones de personas en todo el mundo, lo que provoca la muerte de millones de personas, principalmente en países en desarrollo y emergentes cada año. La aparición generalizada y la elevada incidencia de la malaria son consecuencia del número cada vez mayor de parásitos resistentes a los medicamentos y vectores parásitos resistentes a los insecticidas. Otros factores incluyen cambios ambientales y climáticos, disturbios civiles y una mayor movilidad de las poblaciones.

La malaria es causada por parásitos hematoprotozoarios transmitidos por mosquitos que pertenecen al género Plasmodium. Cuatro especies de protozoos de Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae) son responsables de la enfermedad en el ser humano; muchos otros causan enfermedades en animales, como P. yoelii y P. berghei en ratones. P. falciparum representa la mayoría de las infecciones y es el tipo más letal, a veces llamado "malaria tropical". Los parásitos de la malaria tienen un ciclo de vida que consta de varias etapas. Cada etapa es capaz de inducir respuestas inmunes específicas dirigidas contra los antígenos correspondientes producidos en una etapa específica.

Existe la necesidad de composiciones antigénicas mejoradas adecuadas para estimular una respuesta inmune a la malaria.

El documento WO 2009/082440 A2 describe composiciones que incluyen al menos una proteína de fusión que incluye al menos una porción de al menos un agonista del receptor tipo Toll y al menos una porción de al menos un antígeno de la malaria que se puede emplear en procedimientos que estimulan una respuesta inmune en un sujeto, en particular, una inmunidad estéril y una respuesta inmune protectora en un sujeto.

Thomas J Powell et al., 2012, Vaccine, Vol 29(3), 558-569 describe vacunas de nanopartículas sintéticas producidas por ensamblaje capa por capa de biopelículas artificiales que inducen respuestas protectoras potentes de células T y anticuerpos in vivo.

James Moon et al., 2012, PLoS ONE, Vol 7(2), e31472 describen nanopartículas de PLGA envueltas en lípidos que muestran antígenos como agentes de administración para una vacuna contra la malaria Plasmodium vivax.

Resumen

En un aspecto, una composición comprende

una primera película multicapa que comprende una pluralidad de capas de polielectrolito con carga opuesta y un lipopéptido TLR2, TLR1/2 y/o ligando TLR6/2, en la que una de las capas de polielectrolito en la película multicapa comprende un primer polielectrolito antigénico,

donde el primer polielectrolito antigénico comprende un epítopo T1BT* del circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un primer polielectrolito, donde el primer polielectrolito antigénico es un polipéptido diseñado que tiene al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 1000 residuos de aminoácidos de longitud y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor o igual a 0.2 a pH 7.0 y

donde los polielectrolitos en la película multicapa comprenden un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular superior a 1,000 y al menos 5 cargas por molécula, y donde la primera película multicapa se deposita sobre una micropartícula central o nanopartícula central o está en forma de microcápsula hueca o nanocápsula hueca.

En otro aspecto, la invención proporciona la composición anterior para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un organismo vertebrado que comprende administrar dicha composición al organismo vertebrado.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los epítopos y péptidos diseñados para nanopartículas que contienen péptidos de circumsporozoito. (Panel superior) Diagrama de la proteína CS de P. falciparum que muestra las ubicaciones y secuencias de los epítopos T1, B y T*. (Panel inferior) Diseño de péptidos de la subunidad CS fusionados a una cola de poli-lisina.

Las Figuras 2 y 3 muestran las respuestas de anticuerpos después de la inmunización con nanopartículas que contienen epítopos de CS de malaria. Se inmunizaron ratones BALB/c (Figura 2) y C57BL/6 (Figura 3) (3/grupo, 5-6 semanas de edad) los días 0, 21 y 42. El día 28, se extrajo sangre de los ratones y se analizaron los títulos de IgG específicos de T1BT* en los sueros combinados por medio de ELISA.

La Figura 4 muestra la antigenicidad de las nanopartículas de malaria. Se revistió una placa ELISA con las nanopartículas indicadas en la leyenda y se sondaron con diluciones en serie del mAb 2A10 específico de NANP. Después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, la placa se desarrolló con sustrato Ultra TMB. Los resultados reflejan la media ± SD de OD450 de muestras por triplicado.

Las Figuras 5 y 6 muestran respuestas de células T inducidas por nanopartículas CS LbL en ratones BALB/c (Figura 5) y C57BL/6 (Figura 6). Los ratones se inmunizaron como se indica. Las células del bazo se recolectaron el día 49, se enriquecieron en células CD4+ o CD8+ y se reestimularon con T* o T1 en placas ELISPOT. Los resultados muestran la media ± SD para 3 ratones por grupo.

La Figura 7 muestra las respuestas de células T provocadas por nanopartículas que contienen epítopos de CS de malaria. Los bazos de ratones inmunizados con nanopartícula o péptido T1BT* y luego desafiados con PfPb se probaron en IL-5 e IPNy ELISPOT contra péptidos T1BT* (Panel A) o T i (Panel B). Los datos representan la media ± SD de 7 ratones por grupo.

La Figura 8 muestra los niveles de ARN del parásito en hígados de ratones desafiados. Se extrajo ARN de los hígados de los ratones desafiados con PfPb, descritos en la Figura 7 y se analizó la carga de parásitos mediante qPCR. Los resultados muestran el número de copias de ARNr del parásito por muestra de ARN hepático en ratones individuales. Las barras grises representan una reducción > 90% (1 log) en el número de copias de ARNr del parásito en comparación con el promedio de los siete ratones tratados con PBS; las barras de color gris claro punteadas representan una reducción > 80% en comparación con el promedio de PBS.

La Figura 9 muestra la inmunogenicidad y eficacia de micropartículas de LbL que contienen epítopos de T1BT* de malaria. Se inmunizaron ratones C57BL/6 los días 0 y 21 como se indica. Se recogieron los sueros el día 28 y se analizaron los títulos de IgG específicos de T1B mediante ELISA y los anticuerpos funcionales mediante TSNA. Los resultados muestran la media ± SD de 5 ratones por grupo para el título de anticuerpos (barra gris) y el % de inhibición (barra roja); se utilizaron sueros combinados de 5 ratones inmunizados de forma simulada (PBS) para ambos ensayos. * P <0.05 para ELISA en comparación con 1140; ** P <0.05 para ELISA y TSNA en comparación con 1140.

La Figura 10 muestra las respuestas de las células T de los ratones representados en la Figura 9. El día 28 se recogieron células de bazo y se reestimularon con péptido T1BT* en placas ELISPOT de IPNy e IL-5 y se contó el número de células formadoras de manchas en cada placa en un lector AID ViruSpot. Los resultados muestran la media ± SD de 3 ratones por grupo.

La Figura 11 muestra la eficacia protectora en ratones inmunizados con micropartículas de LbL que contienen epítopos T1BT*. Se inmunizaron ratones C57BL/6 los días 0, 21 y 42, y se desafiaron el día 56. La carga de parásitos en los hígados se midió mediante qPCR 2 días después del desafío. Los resultados muestran el número de copias de ARNr del parásito de ratones individuales (círculos grises) y el valor medio para cada grupo (barras rojas); los recuadros muestran el número de ratones por grupo que estaban protegidos (reducción > 90% del ARNr del parásito), reducción del porcentaje de grupo del ARNr del parásito y * P <0.05, todo en comparación con el grupo de control de PBS; NS = no significativo.

La Figura 12 muestra una comparación de la protección in vivo frente al desafío de parásitos y la actividad neutralizante in vitro para ocho sueros individuales seleccionados al azar de la Figura 11 para el grupo MP-1141.

La Figura 13 muestra una comparación de la protección in vivo frente al desafío de parásitos y la actividad neutralizante in vitro para ocho sueros individuales seleccionados al azar de la Figura 11 para el grupo MP-1142.

La Figura 14 muestra las respuestas de las células T de los ratones representados en la Figura 11. Los ratones se inmunizaron con los tratamientos indicados los días 0, 21 y 42 (péptido 2062 en CFA e IF A, respectivamente). Se recolectaron células de bazo el día 49 y se reestimularon con péptido T1BT* en placas de IPNy y IL-5 ELISPOT. Los datos representan la media ± SD de 3 ratones por grupo.

La Figura 15 muestra la inmunidad celular inducida por micropartículas de LbL que contienen epítopos de malaria T1BT*. Los ratones BALB/c se inmunizaron de forma simulada con PBS o se inmunizaron con MP-1141, y 7 días después se agotaron las células CD4+ o CD8+ o ambas. La actividad de CTL in vivo se midió el día siguiente al agotamiento. Los resultados muestran una media ± SD porcentual de muerte específica del péptido en 3 ratones por grupo. El eje X muestra el fenotipo de las células T que quedan en los ratones el día de la exposición.

La Figura 16 muestra la inmunidad celular inducida por micropartículas de LbL que contienen epítopos de CS de P. berghei de la malaria. Se inmunizaron ratones BALB/c los días 0 y 28 con DP 2147 (Pb CD4+: péptido de fusión CD8+) en adyuvante de Freund o MP cargado con péptido Pb CD4+ (MP-1182), péptido CD8+ (MP-1183) o CD4+: CD8+ péptido de fusión (MP-1184) como se indica (10 |jg de DP en cada dosis). El día 35, se midió la actividad CTL in vivo en tres ratones por grupo. Los resultados muestran la muerte específica media ± SD porcentual de las células pulsadas con el péptido diana.

La Figura 17 muestra la eficacia en los 10 ratones restantes por grupo de la Figura 16 que fueron desafiados por exposición a mosquitos infectados con PfPb, y la carga de parásitos en el hígado 40 horas después se midió mediante qPCR. Los resultados se muestran como se describe en la leyenda de la Figura 11.

La Figura 18 muestra las respuestas de anticuerpos provocadas por micropartículas de Pam3Cys.T1B de malaria en ratones C57BL/6. Los ratones se inmunizaron los días 0 y 21 y se les extrajo sangre el día 28; Los sueros se probaron en ELISA contra el péptido T1B. Los resultados muestran la media ± SD del título de anticuerpos IgG anti-TIB de 10 ratones por grupo. § P <0.05 en comparación con el grupo MP-1167.

La Figura 19 muestra la distribución de isotipos de la respuesta de anticuerpos en los sueros de la Figura 18. El ELISA T1B se repitió con una dilución 1:250 de sueros individuales, y cada suero se investigó con anticuerpos de detección específicos de isotipo. Los resultados muestran la media ± SD de 10 ratones por grupo.

La Figura 20 muestra la eficacia en los ratones representados en la Figura 18. Se inmunizaron ratones C57BL/6 los días 0, 21 y 42 con micropartículas de Pam3Cys.T1B y se desafiaron el día 56 mediante exposición a mosquitos infectados con PfPb. La carga de parásitos en el hígado 40 horas después del desafío se midió mediante qPCR. Los expertos en la técnica apreciarán y comprenderán las características descritas anteriormente y otras a partir de la siguiente descripción detallada, dibujos y reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada

En el presente documento se divulgan películas multicapa que comprenden epítopos polipeptídicos de un protozoo de Plasmodium, en donde las películas multicapa son capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un huésped tras la administración al huésped. También se incluyen composiciones que comprenden dos o más películas multicapa diferentes.

En un primer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende

una primera película multicapa que comprende una pluralidad de capas de polielectrolito con carga opuesta y un lipopéptido TLR2, TLR1/2 y/o ligando TLR6/2, en donde una de las capas de polielectrolito en la película multicapa comprende un primer polielectrolito antigénico,

donde el primer polielectrolito antigénico comprende un epítopo T1BT* del circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un primer polielectrolito,

donde el primer polielectrolito antigénico es un polipéptido diseñado que tiene al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 1,000 residuos de aminoácidos de longitud y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor o igual a 0.2 a pH 7.0,

donde los polielectrolitos en la película multicapa comprenden un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular superior a 1,000 y al menos 5 cargas por molécula, y

en donde la primera película multicapa se deposita sobre una micropartícula central o nanopartícula central o tiene la forma de una microcápsula hueca o nanocápsula hueca.

Como se usa en este documento, los antígenos de la proteína del circumsporozoito de Plasmodium falciparum son: T1: DPNANPNVDPNANPNV (SEQ ID NO: 1)

B: NANP (SEQ ID NO: 2)

T*: EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO: 3)

En ciertas formas de realización, el epítopo T1, B o T*, particularmente el epítopo B, se repite 2 o más veces.

El primer polielectrolio antigénico es un polipéptido que contiene carga suficiente para su deposición en una película polipeptídica multicapa. En una forma de realización, la carga neta por residuo del polipéptido es mayor o igual a 0.3, 0.4 o 0.5 a pH 7.0, como se explica en el presente documento.

En una forma de realización, la primera película multicapa comprende además un segundo polielectrolito antigénico que comprende un epítopo T1, B o T* de circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un segundo polielectrolito, en donde el primer y segundo polielectrolitos antigénicos comprenden diferentes epítopos de circumsporozoito plasmodium falciparum. En una forma de realización adicional, la primera película multicapa comprende además un tercer polielectrolito antigénico que comprende un epítopo T1, B o T* de circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un tercer polielectrolito, en donde el primer, segundo y tercer polielectrolitos antigénicos comprenden diferentes epítopos de circunsporozoito de Plasmodium falciparum. En una forma de realización, el primer, segundo y/o tercer polielectrolito es un polipéptido.

En una forma de realización, el primer, segundo y opcionalmente tercer polielectrolito se presenta en una película multicapa separada, tal como dos o tres poblaciones individuales de núcleos revestidos, y cada población comprende una película multicapa diferente. Por tanto, en una forma de realización, una composición comprende una primera película multicapa como se describe anteriormente y una segunda película multicapa que comprende una pluralidad de capas de polielectrolito con carga opuesta, en donde una de las capas en la segunda película multicapa comprende un segundo polielectrolito antigénico, en donde el segundo polielectrolito antigénico comprende un epítopo T1, B o T* de circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un segundo polielectrolito, en donde el primer y segundo polielectrolitos antigénicos comprenden diferentes epítopos de circumsporozoito de Plasmodium falciparum. En una forma de realización adicional, la composición comprende además una tercera película multicapa que comprende una pluralidad de capas de polielectrolito con carga opuesta, en donde una de las capas en la tercera película multicapa comprende un tercer polielectrolito antigénico, en donde el tercer polielectrolito antigénico comprende un epítopo T1, B o T* de circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un tercer polielectrolito, en donde el primer, segundo y tercer polielectrolitos antigénicos comprenden diferentes epítopos de circumsporozoitos de Plasmodium falciparum. En determinadas formas de realización, el primer, segundo y/o tercer polielectrolito es un polipéptido. En algunas formas de realización, la primera, segunda y tercera películas multicapa se colocan en capas sobre partículas centrales, de modo que una composición comprende dos o tres poblaciones distintas de partículas.

Las películas multicapa de acuerdo con la invención comprenden además un ligando de receptor tipo toll de lipopéptido (TLR) 2, TLR1/2 y/o TLR6/2. Como se usa en este documento, los ligandos de receptores de tipo toll, o ligandos de TLR, son moléculas que se unen a los TLR y activan o reprimen los receptores de TLR. La activación de la señalización de TLR a través del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y de imitadores conduce a la activación transcripcional de genes que codifican citocinas proinflamatorias, quimiocinas y moléculas coestimuladoras, que pueden controlar la activación de la respuesta inmune adaptativa específica de antígeno. Los TLR se han buscado como dianas terapéuticas potenciales para diversas enfermedades inflamatorias y cáncer. Después de la activación, los TLR inducen la expresión de varias familias de proteínas, incluidas las citocinas inflamatorias, los interferones de tipo I y las quimiocinas. Los ligandos del receptor de TLR pueden funcionar como adyuvantes de la respuesta inmune.

Los ligandos TLR ejemplares incluyen un ligando TLR1, un ligando TLR2, un ligando TLR3, un ligando TLR4, un ligando TLR5, un ligando TLR6, un ligando TLR 7, un ligando TLR8, un ligando TLR9 y combinaciones de los mismos.

Los ligandos de TLR1 ejemplares incluyen lipopéptidos bacterianos. Ejemplos de ligandos TLR2 incluyen lipopéptidos tales como Pam3Cys ([N-palmitoil-S- [2,3-bis (palmitoiloxi) propil] cisteína]) y Pam2Cys (Pam2Cys [S- [2,3-bis (palmitoiloxi) propil] cisteína]). Los ligandos de TLR6 ejemplares son lipopéptidos de diacilo. TLR1 y TLR6 requieren heterodimerización con TLR2 para reconocer ligandos. TLR1/2 son activados por lipoproteínas de triacilo (o un lipopéptido, como Pam3Cys), mientras que TLR6/2 son activados por lipoproteínas de diacilo (por ejemplo, Pam2Cys), aunque puede haber algún reconocimiento cruzado.

Un ligando de TLR3 ejemplar es Poly (I:C). Los ligandos de TLR4 ejemplares son lipopolisacárido (LPS) y monofosfolípido A (MPL). Un ligando de TLR5 ejemplar es la flagelina. Un ligando de TLR7 ejemplar es imiquimod. Un ligando de TLR8 ejemplar es el ARN monocatenario. Un ligando de TLR9 ejemplar es a Dn de oligodesoxinucleótido CpG no metilado.

En una forma de realización, el primer, segundo o tercer polielectrolito antigénico, por ejemplo, un polipéptido antigénico, tiene un ligando TLR unido covalentemente al mismo. Por ejemplo, Pam3Cys se puede acoplar covalentemente a una cadena polipeptídica mediante la química de síntesis de polipéptidos estándar.

En otra forma de realización, un sustrato tal como un núcleo molde ha depositado sobre el mismo un ligando TLR antes de la deposición de las capas de polielectrolito. En otra forma de realización, un ligando de TLR se deposita conjuntamente con una o más capas de polielectrolito durante el ensamblaje de la película multicapa.

La película multicapa de la invención se deposita sobre una micropartícula central o nanopartícula central o tiene la forma de una microcápsula hueca o nanocápsula hueca. Tales partículas centrales incluyen una nanopartícula de CaCO³, una partícula de látex o una partícula de hierro. Los tamaños de partículas del orden de 5 nanómetros (nm) a 500 micrómetros (nm) de diámetro son particularmente útiles, al igual que las partículas más grandes que tienen diámetros de 1 pm o más, tales como partículas de 3 pm de diámetro. Las partículas hechas de otros materiales también se pueden usar como núcleos siempre que sean biocompatibles, tengan una distribución de tamaño controlable y tengan suficiente carga superficial (positiva o negativa) para unir péptidos polielectrolitos. Los ejemplos incluyen nanopartículas y micropartículas hechas de materiales tales como ácido poliláctico (PLA), copolímero de ácido glicólico y ácido poliláctico (PLGA), polietilenglicol (PEG), quitosano, ácido hialurónico, gelatina o combinaciones de los mismos. Las partículas centrales también podrían estar hechas de materiales que se cree que son inapropiados para uso humano siempre que puedan disolverse y separarse de la película multicapa después de la fabricación de la película. Los ejemplos de las sustancias del núcleo molde incluyen polímeros orgánicos tales como látex o materiales inorgánicos tales como sílice.

Las películas multicapa de polielectrolito son películas delgadas (por ejemplo, de unos pocos nanómetros a micrómetros de espesor) compuestas por capas alternas de polielectrolitos con carga opuesta. Tales películas pueden formarse mediante ensamblaje capa por capa sobre un sustrato adecuado. En el autoensamblaje electrostático capa por capa ("LBL"), la base física de la asociación de polielectrolitos es la atracción electrostática. La acumulación de película es posible porque la señal de la densidad de carga superficial de la película se invierte en la deposición de capas sucesivas. La generalidad y relativa simplicidad del procedimiento de película LBL permite la deposición de muchos tipos diferentes de polielectrolitos sobre muchos tipos diferentes de superficie. Las películas multicapa de polipéptidos son un subconjunto de películas multicapas de polielectrolitos, las cuales comprenden al menos una capa que comprende un polipéptido cargado, denominado en el presente documento polipéptido diseñado. Una ventaja clave de las películas multicapa de polipéptidos sobre las películas hechas de otros polímeros es su biocompatibilidad. Las películas LBL también se pueden utilizar para encapsular. Las aplicaciones de películas y microcápsulas de polipéptidos incluyen, por ejemplo, nano-reactores, biosensores, células artificiales y vehículos de administración de fármacos.

El término "polielectrolito" incluye materiales policatiónicos y polianiónicos que tienen un peso molecular superior a 1.000 y al menos 5 cargas por molécula. Los materiales policatiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, polipéptidos y poliaminas. Las poliaminas incluyen, por ejemplo, un polipéptido como poli-L-lisina (PLL) o poli-L-ornitina, polivinil amina, poli(aminoestireno), poli(aminoacrilato), poli(N-metil aminoacrilato), poli(N- etilaminoacrilato), poli(N,N-dimetil aminoacrilato), poli(N,N-dietilaminoacrilato), poli(etilenimina), poli(cloruro de dialil-dimetilamonio), poli(cloruro de N,N,N-trimetilaminoacrilato), poli(cloruro de metilacrilamidopropiltrimetilamonio), quitosano y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales policatiónicos anteriores. Los materiales polianiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, un polipéptido tal como ácido poli-L-glutámico (PGA) y ácido poli-L-aspártico, un ácido nucleico tal como ADN y ARN, alginato, carragenano, furcelarano, pectina, xantano, ácido hialurónico, heparina, heparán sulfato, condroitín sulfato, dermatán sulfato, dextrano sulfato, poli(ácido (met)acrílico), celulosa oxidada, carboximetilcelulosa, polisacáridos ácidos y croscarmelosa, polímeros sintéticos y copolímeros que contienen grupos carboxilo colgantes, y combinaciones que comprenden uno o más de los materiales polianiónicos anteriores. En un ejemplo, el epítopo de Plasmodium protozoario y el polielectrolito tienen el mismo signo de carga.

De acuerdo con la invención, al menos el primer polielectrolito que comprende un epítopo T1BT* de Plasmodium protozoario unido covalentemente al mismo es un polipéptido diseñado que tiene al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 1,000 residuos de aminoácidos de longitud y tiene una magnitud de carga neta por residuo superior o igual a 0.2 a pH 7.0. Otras capas de polielectrolitos de las películas de la invención también pueden diseñarse como polipéptidos.

Los principios de diseño para polipéptidos adecuados para la deposición electrostática capa por capa se aclaran en la publicación de patente de EE.UU. No. 2005/0069950. Brevemente, las preocupaciones principales del diseño son la longitud y la carga del polipéptido. La electrostática es la preocupación de diseño más importante porque es la base de LBL. Sin propiedades de carga adecuadas, un polipéptido puede no ser sustancialmente soluble en solución acuosa a un pH de 4 a 10 y no puede usarse fácilmente para la fabricación de una película multicapa por LBL. Otras preocupaciones de diseño incluyen la estructura física de los polipéptidos, la estabilidad física de las películas formadas a partir de los polipéptidos y la biocompatibilidad y bioactividad de las películas y los polipéptidos constituyentes.

Un polipéptido diseñado significa un polipéptido que tiene carga suficiente para una unión estable a una superficie con carga opuesta, es decir, un polipéptido que puede depositarse en una capa de una película multicapa en la que la fuerza impulsora para la formación de la película es electrostática. Una película corta estable es una película que, una vez formada, retiene más de la mitad de sus componentes después de la incubación en PBS a 37°C durante 24 horas. Un polipéptido diseñado tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor o igual a 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 o 0.5 a pH 7.0. Los aminoácidos de origen natural con carga positiva (básicos) a pH 7.0 son arginina (Arg), histidina (His), ornitina (Orn) y lisina (Lys). Los residuos de aminoácidos de origen natural (ácidos) cargados negativamente a pH 7.0 son ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp). Puede emplearse una mezcla de residuos de aminoácidos de carga opuesta siempre que la relación neta global de carga cumpla con los criterios especificados. En un ejemplo, un polipéptido diseñado no es un homopolímero. En otro ejemplo, un polipéptido diseñado no está ramificado.

Una preocupación de diseño es el control de la estabilidad de las películas de polipéptido LBL. Los enlaces iónicos, los enlaces de hidrógeno, las interacciones de van der Waals y las interacciones hidrófobas contribuyen a la estabilidad de las películas multicapa. Además, los enlaces disulfuro covalentes formados entre aminoácidos que contienen sulfhidrilo en los polipéptidos dentro de la misma capa o en capas adyacentes pueden aumentar la resistencia estructural. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilo incluyen cisteína y homocisteína y estos residuos pueden incorporarse fácilmente en péptidos diseñados sintéticos. Además, se pueden incorporar grupos sulfhidrilo en homopolímeros de polielectrolitos tales como poli-L-lisina o ácido poli-L-glutámico mediante procedimientos bien descritos en la bibliografía. Los aminoácidos que contienen sulfhidrilo se pueden usar para "bloquear" (unir) y "desbloquear" capas de una película polipeptídica multicapa mediante un cambio en el potencial de oxidación. Además, la incorporación de un aminoácido que contiene sulfhidrilo en un polipéptido diseñado permite el uso de péptidos relativamente cortos en la fabricación de películas delgadas, en virtud de la formación de enlaces disulfuro intermoleculares.

En un ejemplo, los polipéptidos diseñados que contienen sulfhidrilo, ya sean sintetizados químicamente o producidos en un organismo huésped, son ensamblados por LBL en presencia de un agente reductor para prevenir la formación prematura de enlaces disulfuro. Después del montaje de la película, se elimina el agente reductor y se añade un agente oxidante. En presencia del agente oxidante se forman enlaces disulfuro entre los grupos sulfhidrilo, "bloqueando" juntos los polipéptidos dentro de las capas y entre las capas donde están presentes los grupos tiol. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (BME), glutatión reducido, clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) y combinaciones de más de uno de estos productos químicos. Los agentes oxidantes adecuados incluyen glutatión oxidado, hidroperóxido de terc-butilo (t-BHP), timerosal, diamida, ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitro-benzoico) (DTNB), 4,4'-ditiodipiridina, bromato de sodio, peróxido de hidrógeno, tetrationato de sodio, porfirindina, ortoyodosobenzoato de sodio y combinaciones de más de uno de estos productos químicos.

Como alternativa a los enlaces disulfuro, se pueden usar químicas que producen otros enlaces covalentes para estabilizar películas LBL. Para películas compuestas de polipéptidos, las químicas que producen enlaces amida son particularmente útiles. En presencia de reactivos de acoplamiento apropiados, los aminoácidos ácidos (aquellos con cadenas laterales que contienen grupos de ácido carboxílico como ácido aspártico y ácido glutámico) reaccionarán con aminoácidos cuyas cadenas laterales contienen grupos amina (como lisina y ornitina) para formar enlaces amida. Los enlaces amida son más estables que los enlaces disulfuro en condiciones biológicas y los enlaces amida no sufrirán reacciones de intercambio. Se pueden usar muchos reactivos para activar cadenas laterales de polipéptidos para la unión amida. Los reactivos de carbodiimida, como la 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) soluble en agua, reaccionarán con ácido aspártico o ácido glutámico a un pH ligeramente ácido, formando un producto intermedio que reaccionará irreversiblemente con una amina para producir un enlace de amida. A menudo se agregan a la reacción aditivos como N-hidroxisuccinimida para acelerar la velocidad y la eficiencia de la formación de amidas. Después de la reacción, los reactivos solubles se eliminan de las nanopartículas o micropartículas mediante centrifugación y aspiración. Los ejemplos de otros reactivos de acoplamiento incluyen diisopropilcarbodiimida, HBTU, HATU, HCTU, TBTU y PyBOP. Los ejemplos de otros aditivos incluyen sulfo-N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazol y 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol. El grado de reticulación de amidas se puede controlar modulando la estequiometría de los reactivos de acoplamiento, el tiempo de reacción o la temperatura de la reacción, y se puede controlar mediante técnicas como la espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR).

Las películas LBL reticuladas covalentemente tienen propiedades deseables tales como una mayor estabilidad. Una mayor estabilidad permite el uso de condiciones más estrictas durante la fabricación de nanopartículas, micropartículas, nanocápsulas o microcápsulas. Ejemplos de condiciones estrictas incluyen altas temperaturas, bajas temperaturas, temperaturas criogénicas, altas velocidades de centrifugación, reguladores de pH con alto contenido de sal, reguladores de pH alto, reguladores de pH bajo, filtración y almacenamiento a largo plazo.

Un procedimiento para fabricar una película multicapa de polielectrolito comprende depositar una pluralidad de capas de especies químicas con carga opuesta sobre un sustrato. En un ejemplo, al menos una capa comprende un polipéptido diseñado. Los polielectrolitos depositados sucesivamente tendrán cargas netas opuestas. En un ejemplo, la deposición de un polielectrolito comprende exponer el sustrato a una solución acuosa que comprende un polielectrolito a un pH al cual tiene una carga neta adecuada para LBL. En otros ejemplos, la deposición de un polielectrolito sobre el sustrato se logra mediante la pulverización secuencial de soluciones de polipéptidos con carga opuesta. En otros ejemplos más, la deposición sobre el sustrato se realiza mediante la pulverización simultánea de soluciones de polielectrolitos con carga opuesta.

En el procedimiento LBL de formar una película multicapa, las cargas opuestas de las capas adyacentes proporcionan la fuerza impulsora para el ensamblaje. No es crítico que los polielectrolitos en capas opuestas tengan la misma densidad de carga lineal neta, solo que las capas opuestas tengan cargas opuestas. Un procedimiento estándar de ensamblaje de película por deposición incluye la formación de soluciones acuosas de los poliiones a un pH al cual se ionizan (es decir, pH 4-10), proporcionando un sustrato con una carga superficial y la inmersión alterna del sustrato en las soluciones de polielectrolito cargadas. El sustrato se lava opcionalmente entre la deposición de capas alternas.

La concentración de polielectrolito adecuada para la deposición del polielectrolito puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Una concentración ejemplar es de 0.1 a 10 mg/ml. Para los polielectrolitos no polipeptídicos típicos tales como poli(ácido acrílico) y poli(clorhidrato de alilamina), los espesores de capa típicos son de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 A, dependiendo de la fuerza iónica de la solución. Los polielectrolitos cortos suelen formar capas más delgadas que los polielectrolitos largos. En cuanto al grosor de la película, el grosor de la película de polielectrolito depende de la humedad, así como del número de capas y la composición de la película. Por ejemplo, las películas de p Ll/PGA de 50 nm de espesor se contraen a 1.6 nm al secarse con nitrógeno. En general, se pueden formar películas de 1 nm a 100 nm o más de espesor dependiendo del estado de hidratación de la película y del peso molecular de los polielectrolitos empleados en el ensamblaje.

Además, el número de capas necesarias para formar una película multicapa de polielectrolito estable dependerá de los polielectrolitos de la película. Para películas que comprenden solo capas de polipéptidos de bajo peso molecular, una película tendrá típicamente 4 o más bicapas de polipéptidos cargados de manera opuesta. Para películas que comprenden polielectrolitos de alto peso molecular tales como poli(ácido acrílico) y poli(clorhidrato de alilamina), las películas que comprenden una única bicapa de polielectrolito con carga opuesta pueden ser estables. Los estudios han demostrado que las películas de polielectrolitos son dinámicas. Los polielectrolitos contenidos dentro de una película pueden migrar entre capas y pueden intercambiarse con polielectrolitos solubles de carga similar cuando se suspenden en una solución de polielectrolitos. Además, las películas de polielectrolito se pueden desmontar o disolver en respuesta a un cambio en el entorno, como la temperatura, el pH, la fuerza iónica o el potencial de oxidación del regulador de pH de suspensión. Por tanto, algunos polielectrolitos y, en particular, los polielectrolitos de péptidos exhiben una estabilidad transitoria. La estabilidad de las películas de polielectrolitos de péptidos se puede controlar suspendiendo las películas en un regulador de pH adecuado en condiciones controladas durante un período de tiempo fijo, y luego midiendo las cantidades de péptidos dentro de la película con un ensayo adecuado, como análisis de aminoácidos, ensayo de HPLC, o ensayo de fluorescencia. Las películas de péptidos polielectrolitos son más estables en condiciones que son relevantes para su almacenamiento y uso como vacunas, por ejemplo, en reguladores de pH neutros y a temperaturas ambiente tales como 4°C a 37°C. En estas condiciones, las películas de polielectrolitos de péptidos estables retendrán la mayoría de los péptidos que los componen durante al menos 24 horas y, a menudo, hasta 14 días y más.

Un polipéptido diseñado de uso en la invención puede comprender una o más regiones de adsorción superficial unidas covalentemente a uno o más epítopos de protozoos de Plasmodium, donde el polipéptido diseñado y una o más regiones de adsorción superficial tienen el mismo signo de carga; es decir que ambos están cargados de manera positiva o negativa en general. Como se usa en este documento, una región de adsorción superficial es una región cargada de un polipéptido diseñado que proporciona ventajosamente carga suficiente para que un péptido que contiene un epítopo de un Plasmodium protozoario, por ejemplo, pueda depositarse en una película multicapa. En un ejemplo, la una o más regiones de adsorción superficial y el uno o más epítopos de Plasmodium protozoario tienen la misma polaridad neta.

La solubilidad de un polipéptido diseñado para uso en la invención a un pH de 4 a 10 puede ser mayor o igual a aproximadamente 0.1 mg/ml. En otro ejemplo, la solubilidad de un polipéptido diseñado para uso en la invención a un pH de 4 a 10 es mayor o igual a aproximadamente 1 mg/ml. La solubilidad es una limitación práctica para facilitar la deposición de los polipéptidos de la solución acuosa. Un límite superior práctico sobre el grado de polimerización de un polipéptido antigénico es de aproximadamente 1,000 residuos. Sin embargo, es concebible que se puedan realizar polipéptidos compuestos más largos mediante un procedimiento de síntesis apropiado.

Un polipéptido diseñado de uso en la invención puede comprender un epítopo de Plasmodium protozoario antigénico único flanqueado por dos regiones de adsorción superficial, una región de adsorción superficial N-terminal y una región de adsorción superficial C-terminal. En otro ejemplo, un polipéptido diseñado de uso en la invención comprende un único epítopo de Plasmodium protozoario antigénico flanqueado por una región de adsorción superficial unida al N-terminal del epítopo del Plasmodium protozoario. En otro ejemplo, un polipéptido diseñado de uso en la invención comprende un único epítopo de Plasmodium protozoario antigénico flanqueado por regiones de adsorción superficial unidas al C-terminal del epítopo del Plasmodium protozoario.

Cada una de las regiones independientes (por ejemplo, epítopos de Plasmodium protozoario y regiones de adsorción superficial) del polipéptido diseñado se puede sintetizar por separado mediante síntesis de péptidos en fase de solución, síntesis de péptidos en fase sólida o ingeniería genética de un organismo huésped adecuado. La síntesis de péptidos en fase de solución es el procedimiento utilizado para la producción de la mayoría de los péptidos farmacéuticos aprobados en el mercado actual. Puede usarse una combinación de procedimientos en fase de solución y en fase sólida para sintetizar péptidos relativamente largos e incluso proteínas pequeñas. Las empresas de síntesis de péptidos tienen la experiencia y los conocimientos necesarios para sintetizar péptidos difíciles mediante el pago de una tarifa por servicio. Las síntesis se realizan en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) y a una escala adecuada para ensayos clínicos y lanzamiento comercial de fármacos.

Alternativamente, las diversas regiones independientes pueden sintetizarse juntas como una única cadena polipeptídica mediante síntesis de péptidos en fase de solución, síntesis de péptidos en fase sólida o ingeniería genética de un organismo huésped adecuado. La elección del enfoque en cualquier caso particular será una cuestión de conveniencia o de economía.

Si los diversos epítopos de Plasmodium protozoario y regiones de adsorción superficial se sintetizan por separado, una vez purificados, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante cromatografía líquida de alta resolución, se unen mediante síntesis de enlaces peptídicos. Es decir, el extremo N de la región de adsorción superficial y el extremo C del epítopo de Plasmodium protozoario se unen covalentemente para producir el polipéptido diseñado. Alternativamente, el extremo C de la región de adsorción superficial y el extremo N del epítopo de Plasmodium protozoario se unen covalentemente para producir el polipéptido diseñado. Los fragmentos individuales pueden sintetizarse mediante procedimientos en fase sólida y obtenerse como segmentos completamente protegidos, completamente desprotegidos o parcialmente protegidos. Los segmentos se pueden unir covalentemente en una reacción en fase de solución o en una reacción en fase sólida. Si un fragmento de polipéptido contiene una cisteína como su residuo N-terminal y el otro fragmento de polipéptido contiene un tioéster o un precursor de tioéster en su residuo C-terminal, los dos fragmentos se acoplarán espontáneamente en solución mediante una reacción específica comúnmente conocida (para los expertos en el arte) como la ligadura nativa. La ligadura nativa es una opción particularmente atractiva para la síntesis de péptidos diseñada porque se puede realizar con fragmentos de péptidos totalmente desprotegidos o parcialmente protegidos en solución acuosa y en concentraciones diluidas.

Los epítopos de Plasmodium protozoario y/o las regiones de adsorción superficial pueden unirse mediante enlaces peptídicos o no peptídicos como se describe en la patente de EE.UU. No. 7,723,294. Los enlazadores no peptídicos adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores alquilo tales como -NH-(CH²)^s-C(O)-, en donde s=2-20. Los enlazadores de alquilo están opcionalmente sustituidos con un grupo que no obstaculiza estéricamente, tal como alquilo inferior (por ejemplo, Ci-Ca), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH², fenilo y similares. Otro enlazador no peptídico ejemplar es un enlazador de polietilenglicol tal como -NH-(CH²-CH²-O)n,-C(O)- donde n es tal que el enlazador tiene un peso molecular de 100 a 5000 Da, específicamente 100 hasta 500 Da. Muchos de los enlazadores descritos en el presente documento están disponibles por parte de proveedores comerciales en una forma adecuada para su uso en la síntesis de péptidos en fase sólida.

Uno o más de los epítopos polipeptídicos de un Plasmodium protozoario pueden unirse covalentemente a uno o más de los polielectrolitos, tales como un polipéptido u otro polielectrolito, a través de enlaces covalentes. Los ejemplos de enlaces covalentes adecuados incluyen amidas, ésteres, éteres, tioéteres y disulfuros. Un experto en la técnica puede aprovechar una variedad de grupos funcionales que se encuentran dentro del péptido epítopo para diseñar un enlace a un electrolito adecuado. Por ejemplo, un ácido carboxílico en el péptido del epítopo se puede encontrar en el extremo C o en la cadena lateral de los aminoácidos ácido aspártico o ácido glutámico. Los ácidos carboxílicos se pueden activar con reactivos de acoplamiento de péptidos adecuados tales como 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) para la reacción con aminas primarias o secundarias que se encuentran en polielectrolitos de péptidos tales como poli-L-lisina. El enlace de amida resultante es estable en condiciones ambientales. Por el contrario, los grupos ácidos en un polielectrolito peptídico pueden activarse con EDC para reaccionar con grupos amina en el péptido de epítopo. Se pueden encontrar grupos amina útiles en el extremo N del péptido epítopo o en la cadena lateral de los residuos de lisina.

Los péptidos de epítopo también se pueden unir a polielectrolitos mediante enlaces disulfuro. Los polielectrolitos como PGA o PLL pueden modificarse químicamente de modo que una fracción de sus cadenas laterales contenga grupos sulfhidrilo. En presencia de un oxidante adecuado, esos sulfidrilos reaccionarán con el grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína contenido dentro del péptido epítopo. La cisteína puede ser una cisteína nativa de la secuencia de proteínas de un patógeno como un Plasmodium protozoario o puede ser una cisteína no nativa que se incorporó intencionalmente al epítopo durante la síntesis de péptidos. Los oxidantes adecuados incluyen DTNB, 2,2'-ditiopiridina, peróxido de hidrógeno, cistina y glutatión oxidado. La unión de péptidos epítopos a polielectrolitos mediante enlaces disulfuro es particularmente útil. Los disulfuros son estables en condiciones normales de fabricación y almacenamiento de la película, pero se escinden fácilmente mediante agentes reductores que se encuentran naturalmente en las células, lo que deja libre al péptido epítopo para el procesamiento inmunológico.

Los péptidos epítopos también se pueden unir a polielectrolitos mediante enlaces tioéter. Los péptidos epítopos sintéticos se pueden sintetizar con electrófilos apropiados tales como grupos haloacetilo que reaccionan específicamente con sulfhidrilos. Por ejemplo, un péptido epítopo que contiene un cloroacetilo en su extremo N formará un enlace estable a los polielectrolitos que llevan sulfhidrilo tales como PGA-SH descrito anteriormente.

Los péptidos epítopos también pueden unirse covalentemente a polielectrolitos a través de moléculas enlazadoras bifuncionales. Los enlazadores bifuncionales generalmente contienen dos grupos electrofílicos que pueden reaccionar con nucleófilos presentes en el péptido epítopo o en la molécula de polielectrolito. Se venden comercialmente dos clases de moléculas enlazadoras, enlazadores homobifuncionales y enlazadores heterobifuncionales. Los enlazadores homobifuncionales contienen dos copias de un grupo electrófilo unidas por un espaciador no reactivo. A menudo, los electrófilos son ésteres activos, tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) o ésteres de sulfo-N-hidroxisuccinimida (sulfo NHS) que reaccionan con aminas nucleófilas. Los ejemplos de ésteres de NHS homobifuncionales incluyen suberato de bis(sulfosuccinimidilo), glutarato de disuccinimidilo, propionato de ditiobis(succinimidilo), suberato de disuccinimidilo, tartrato de disuccinimidilo. A veces, los electrófilos son grupos aldehido que forman imidas con aminas nucleófilas en el epítopo y las moléculas de polielectrolito. Los enlaces imida son transitoriamente estables, pero se pueden convertir en estructuras estables con agentes reductores tales como borohidruro de sodio o hidrogenación catalítica. El enlazador de aldehído homobifuncional más comúnmente utilizado es el glutaraldehído.

Otros enlazadores homobifuncionales comúnmente usados contienen electrófilos que reaccionan específicamente con tioles nucleofílicos, que pueden usarse para unir péptidos epítopos que contienen cisteína a polielectrolitos que contienen sulfhidrilo como se describió anteriormente. Ejemplos de enlazadores homobifuncionales específicos de sulfhidrilo incluyen 1,4-bismaleimidobutano, 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano, vbis-maleimidohexano, bismaleimidoetano, 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio) -propionamido] butano, ditio-bismaleimidoetano, 1,6-hexano-bis-vinilsulfona.

Los miembros de la clase heterobifuncional de reactivos de reticulación contienen dos grupos de reactividad diferentes, a menudo, pero no siempre, electrófilos que reaccionan específicamente con diferentes grupos funcionales en moléculas de sustrato. Particularmente útiles son los enlazadores que contienen un grupo electrófilo que es específico para un sulfhidrilo y otro electrófilo que es específico para una amina. Ejemplos de estos reactivos incluyen N-sulfosuccinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato, N-succinimidil[4-yodoacetil]aminobenzoato, succinimidil-3-[bromoacetamido]propionato, N-succinimidilyodoacetato, sulfosuccinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, éster de ([N-e-maleimidocaproiloxi] sulfosuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, N-succinimidil 3-(2-piridilditio)-propionato, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato, succinimidil-6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato, 4-succinimidiloxicarbonil-metil-a-[2-piridilditio]tolueno.

La amplia gama de funcionalidad que normalmente está presente tanto en los péptidos epítopos como en los polielectrolitos o que se puede instalar fácilmente en cualquier molécula permite elegir la estrategia de enlace que mejor se adapte a los sustratos de interés. Un ejemplo probable es la unión de un péptido epítopo que contiene cisteína a PLL.

Los segmentos polipeptídicos se pueden unir de diversas formas, dependiendo de la química del enlazador no peptídico. Por ejemplo, el extremo N-terminal del primer segmento polipeptídico se une al extremo C-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo N-terminal del primer segmento polipeptídico se une al extremo N-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo C-terminal del primer segmento polipeptídico se une al extremo C-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo C-terminal del primer segmento polipeptídico se une al extremo N-terminal del segundo segmento polipeptídico; el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del primer segmento polipeptídico está unido a una cadena lateral colgante del segundo segmento polipeptídico; o el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del segundo segmento polipeptídico está unido a una cadena lateral colgante del primer segmento polipeptídico. Independientemente del punto de unión, sin embargo, el primer y segundo segmentos están unidos covalentemente por un enlazador no peptídico.

Un polipéptido diseñado de uso en la invención puede ser una combinación única de una o más regiones de adsorción superficial unidas covalentemente y uno o más epítopos de Plasmodium protozoario. No existe una limitación particular sobre la longitud de los epítopos de Plasmodium protozoari, que pueden ser epítopos lineales o epítopos conformacionales. Los epítopos pueden comprender desde aproximadamente tres residuos de aminoácidos hasta varios cientos de residuos de aminoácidos para epítopos conformacionales complejos.

Un polipéptido diseñado de uso en la invención puede comprender un epítopo de Plasmodium protozoario y una región de adsorción superficial. En otro ejemplo, un polipéptido diseñado de uso en la invención comprende un epítopo de Plasmodium protozoario y dos regiones de adsorción superficial, una unida al extremo N-termina del epítopo de Plasmodium protozoario y otra unida al extremo C-terminal del epítopo de Plasmodium protozoario. El propósito de la (s) región (es) de adsorción superficial es permitir la adsorción del polipéptido sobre una superficie cargada de manera opuesta para construir una película multicapa.

El número de regiones de adsorción superficial en un polipéptido diseñado en relación con el número y/o la longitud de los epítopos de Plasmodium protozoario está relacionado con el requisito de solubilidad. Por ejemplo, si el epítopo del Plasmodium protozoario es una secuencia de aminoácidos corta de, por ejemplo, tres residuos de aminoácidos, solo se requerirá una región de adsorción superficial de al menos ocho residuos de aminoácidos para adsorber el polipéptido diseñado en una superficie cargada adecuadamente. Si, por el contrario, el epítopo del Plasmodium protozoario es un dominio estructural plegado soluble de una proteína que comprende, por ejemplo, 120 residuos de aminoácidos, se pueden requerir dos regiones de adsorción superficial para impartir suficiente carga para que el polipéptido diseñado sea soluble en agua y adecuado para adsorción. Las regiones de adsorción superficial podrían ser contiguas y ubicadas en el extremo N-terminal del dominio, contiguas y ubicadas en el extremo C-terminal del dominio, o no contiguas con una en el extremo N-terminal y otra en el extremo C-terminal. Además, un epítopo de Plasmodium protozoario puede contener un segmento cargado (cargado negativamente o cargado positivamente) dentro de su secuencia nativa que puede servir como región de adsorción superficial.

Un polipéptido o antígeno puede contener uno o más determinantes antigénicos distintos. Un determinante antigénico puede referirse a una porción inmunogénica de una proteína de múltiples cadenas.

Los procedimientos y técnicas para determinar la ubicación y composición de un determinante antigénico o epítopo para un anticuerpo específico son bien conocidos en la técnica. Estas técnicas pueden usarse para identificar y/o caracterizar epítopos para usar como epítopos de Plasmodium protozoario. Los procedimientos de mapeo/caracterización de un epítopo para un anticuerpo específico de antígeno se pueden determinar mediante la "huella de pie" del epítopo usando modificación química de las aminas/carboxilos expuestos en la proteína antigénica. Un ejemplo de dicha técnica de huella de pie es el uso de HXMS (intercambio de hidrógeno-deuterio detectado por espectrometría de masas) en donde se produce un intercambio de hidrógeno/deuterio de protones de amida de proteína de ligando y receptor y ocurre un intercambio inverso, en donde los grupos amida del segmento principal que participan en la unión a proteínas están protegidos del intercambio inverso y, por lo tanto, permanecerán deuterizados. Las regiones relevantes pueden identificarse en este punto mediante proteólisis péptica, separación por rápida cromatografía líquida de alta resolución de microbore y/o espectrometría de masas de ionización por electropulverización.

Una técnica de identificación de epítopos adecuada es el mapeo de epítopos por resonancia magnética nuclear (RMN), donde típicamente se comparan la posición de las señales en espectros de RMN bidimensionales del antígeno libre y el antígeno complejado con el péptido de unión al antígeno, tal como un anticuerpo. Típicamente, el antígeno se marca isotópicamente de manera selectiva con 15N de modo que solo se observan señales correspondientes al antígeno y no se observan señales del péptido de unión al antígeno en el espectro de RMN. Las señales de antígeno que se originan a partir de aminoácidos implicados en la interacción con el péptido de unión al antígeno normalmente cambiarán de posición en los espectros del complejo en comparación con los espectros del antígeno libre, y los aminoácidos implicados en la unión pueden identificarse de esa manera.

El mapeo/caracterización de epítopos se puede realizar mediante escaneo de péptidos. En este enfoque, se preparan y prueban individualmente una serie de péptidos superpuestos que abarcan toda la longitud de la cadena polipeptídica de un antígeno con respecto a la inmunogenicidad. El título de anticuerpo del antígeno peptídico correspondiente se determina mediante un procedimiento estándar, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. A continuación, los diversos péptidos pueden clasificarse con respecto a la inmunogenicidad, lo que proporciona una base empírica para la selección del diseño de péptidos para el desarrollo de vacunas.

Las técnicas de digestión con proteasas también pueden ser útiles en el contexto del mapeo e identificación de epítopos. Las regiones/secuencias relevantes para determinantes antigénicos pueden determinarse mediante digestión con proteasa, por ejemplo, mediante el uso de tripsina en una proporción de aproximadamente 1:50 a la digestión de la proteína antigénica durante la noche (O/N) a 37°C y pH 7-8, seguida de análisis por espectrometría de masas (MS) para la identificación de péptidos. Los péptidos protegidos de la escisión de tripsina por la proteína antigénica pueden identificarse posteriormente mediante la comparación de muestras sometidas a digestión con tripsina y muestras incubadas con CD38BP y luego sometidas a digestión por, por ejemplo, tripsina (revelando así una huella de pie para el aglutinante). Otras enzimas como quimotripsina, pepsina, etc., también o alternativamente pueden usarse en un procedimiento similar de caracterización de epítopos. Además, la digestión con proteasa puede proporcionar un procedimiento rápido para determinar la ubicación de una secuencia determinante antigénica potencial dentro de una proteína antigénica conocida usando un anticuerpo conocido. Por ejemplo, las técnicas de digestión con proteasas también pueden ser útiles en el contexto del mapeo e identificación de epítopos.

En una forma de realización, la composición inmunogénica de la invención comprende una pluralidad de epítopos de Plasmodium protozoario, ya sea en el mismo o en diferentes polielectrolitos, por ejemplo, polipéptidos diseñados, incluyendo un epítopo T1Bt * de circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un polipéptido diseñado que tiene al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 1,000 residuos de aminoácidos de longitud y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor o igual a 0.2 a pH 7.0. La pluralidad de determinantes antigénicos puede ser del mismo o de diferentes agentes infecciosos. En una forma de realización, la composición inmunogénica comprende una pluralidad de polielectrolitos antigénicos únicos. En otra forma de realización, la composición inmunogénica comprende una pluralidad de polielectrolitos inmunogénicos que comprenden múltiples epítopos de Plasmodium protozoario dentro de cada polielectrolito. Una ventaja de estas composiciones inmunogénicas es que pueden estar presentes múltiples determinantes antigénicos o múltiples conformaciones de un único determinante antigénico lineal en una única partícula de vacuna sintética. Tales composiciones con múltiples determinantes antigénicos pueden producir potencialmente anticuerpos contra múltiples epítopos, aumentando las probabilidades de que al menos algunos de los anticuerpos generados por el sistema inmunológico del organismo neutralicen el patógeno o se dirijan a antígenos específicos en células cancerosas, por ejemplo.

La inmunogenicidad de una composición inmunogénica se puede potenciar de varias formas. En una forma de realización, la película multicapa comprende opcionalmente una o más moléculas bioactivas inmunogénicas adicionales. Aunque no es necesario, la una o más moléculas bioactivas inmunogénicas adicionales comprenderán típicamente uno o más determinantes antigénicos adicionales. Las moléculas bioactivas inmunogénicas adicionales adecuadas incluyen, por ejemplo, un fármaco, una proteína, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un lípido, un fosfolípido, un carbohidrato, un polisacárido, un lipopolisacárido, una molécula inmunoestimuladora de bajo peso molecular o una combinación que comprende una o más de las moléculas bioactivas anteriores. Otros tipos de potenciadores inmunes adicionales incluyen un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células, un orgánulo o una combinación que comprende una o más de las estructuras bioactivas anteriores.

En una forma de realización, la película multicapa según la invención comprende opcionalmente una o más moléculas bioactivas adicionales. La una o más moléculas bioactivas adicionales pueden ser un fármaco. Alternativamente, la película multicapa de acuerdo con la invención tiene la forma de una cubierta hueca o un revestimiento que rodea un núcleo. El núcleo puede comprender una variedad de encapsulantes diferentes, por ejemplo, una o más moléculas bioactivas adicionales que incluyen, por ejemplo, un fármaco. Por tanto, las composiciones inmunogénicas diseñadas como se describe en el presente documento también podrían usarse para terapia combinada, por ejemplo, provocando una respuesta inmune y para la administración de fármacos dirigida. Los "núcleos" del tamaño de una micra de un material terapéutico adecuado en forma "cristalina" pueden encapsularse mediante películas multicapa que comprenden polipéptidos antigénicos, y las microcápsulas resultantes podrían usarse para la administración de fármacos. El núcleo puede ser insoluble en algunas condiciones, por ejemplo, un pH alto o una temperatura baja, y soluble en las condiciones en las que se producirá una liberación controlada. La carga superficial de los cristales se puede determinar mediante mediciones de potencial Z (utilizadas para determinar la carga en unidades electrostáticas en partículas coloidales en un medio líquido). La velocidad a la que se libera el contenido de la microcápsula desde el interior de la microcápsula al entorno circundante dependerá de varios factores, incluido el grosor de la capa encapsulante, los polipéptidos antigénicos utilizados en la capa, la presencia de enlaces disulfuro, la extensión de entrecruzamiento de péptidos, temperatura, fuerza iónica y el procedimiento utilizado para ensamblar los péptidos. Generalmente, cuanto más gruesa es la cápsula, mayor es el tiempo de liberación.

En otra forma de realización, la biomolécula inmunogénica adicional es una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la síntesis del organismo huésped de un inmunógeno deseado o de interferir con la expresión de información genética de un patógeno. En el primer caso, dicha secuencia de ácido nucleico se inserta, por ejemplo, en un vector de expresión adecuado mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores de expresión adecuados para producir una transferencia de genes de alta eficacia in vivo incluyen vectores virales retrovirales, adenovirales y de vaccinia. Los elementos operativos de dichos vectores de expresión incluyen al menos un promotor, al menos un operador, al menos una secuencia líder, al menos un codón terminador y cualquier otra secuencia de ADN necesaria o preferida para la transcripción apropiada y la posterior traducción del ácido nucleico del vector. En particular, se contempla que dichos vectores contendrán al menos un origen de replicación reconocido por el organismo huésped junto con al menos un marcador seleccionable y al menos una secuencia promotora capaz de iniciar la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. En el último caso, se prepararán múltiples copias de dicha secuencia de ácido nucleico para el suministro, por ejemplo, mediante la encapsulación de los ácidos nucleicos dentro de una película polipeptídica multicapa en forma de cápsula para el suministro intravenoso.

En la construcción de un vector de expresión recombinante, debe observarse adicionalmente que en cada vector pueden insertarse múltiples copias de la secuencia de ácido nucleico de interés y sus elementos operativos relacionados. En tal ejemplo, el organismo huésped produciría mayores cantidades por vector de la proteína deseada. El número de copias múltiples de la secuencia de ácido nucleico que pueden insertarse en el vector está limitado únicamente por la capacidad del vector resultante, debido a su tamaño, para ser transferido, replicado y transcrito en un microorganismo huésped apropiado.

En una forma de realización adicional, la composición inmunogénica comprende una mezcla de polielectrolitos antigénicos/moléculas bioactivas inmunogénicas. Estos pueden derivarse del mismo antígeno, pueden ser diferentes antígenos del mismo agente infeccioso o enfermedad, o pueden ser de diferentes agentes infecciosos o enfermedades. Por lo tanto, el complejo o la mezcla generará una respuesta inmune contra varios antígenos y posiblemente varios agentes infecciosos o enfermedades según lo especificado por los componentes péptido/proteína antigénicos del sistema de administración.

En una forma de realización, la película multicapa/composición inmunogénica evoca una respuesta del sistema inmunológico a un patógeno. En una forma de realización, una composición de vacuna comprende la composición inmunogénica en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por tanto, un procedimiento de vacunación contra una enfermedad patógena comprende administrar a un sujeto que necesite vacunación una cantidad eficaz de la composición inmunogénica. La invención proporciona además la composición de la invención para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un organismo vertebrado que comprende administrar dicha composición en el organismo vertebrado.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas grandes de metabolización lenta tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, partículas virales inactivas y similares. En la composición también se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos. La composición también puede contener líquidos, como agua, solución salina, glicerol y etanol, así como sustancias como agentes humectantes, agentes emulsionantes o agentes reguladores del pH. Los liposomas también se pueden usar como vehículos.

En una forma de realización, el polielectrolito que contiene el epítopo de Plasmodium protozoario está en la capa más exterior o expuesta al disolvente de la película multicapa. La composición inmunogénica se puede administrar por vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, sublingual, intradérmica, pulmonar o transdérmica, con o sin una dosis de refuerzo. Generalmente, las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. Las cantidades precisas de composición inmunogénica a administrarse dependen del criterio del médico y pueden ser peculiares para cada sujeto. Será evidente para los expertos en la técnica que la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica dependerá, entre otras cosas, del programa de administración, la dosis unitaria de antígeno administrada, de si las composiciones se administran en combinación con otros agentes terapéuticos, y del estado inmunológico y la salud del receptor. Una dosificación terapéuticamente eficaz puede ser determinada por el trabajador médico con experiencia ordinaria basándose en las características del paciente (edad, peso, sexo, estado, complicaciones, otras enfermedades, etc.), como es bien conocido en la técnica. Además, a medida que se realicen más estudios de rutina, surgirá información más específica con respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en varios pacientes, y el trabajador capacitado con habilidades ordinarias, teniendo en cuenta el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, podrá determinar dosis adecuada.

La composición inmunogénica comprende opcionalmente un adyuvante. Los adyuvantes en general comprenden sustancias que refuerzan la respuesta inmune del huésped de una manera no específica. La selección de un adyuvante depende del sujeto a vacunar. Preferiblemente, se usa un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una vacuna para un ser humano debe evitar los adyuvantes de emulsión de aceite o hidrocarburos, incluido el adyuvante de Freund completo e incompleto. Un ejemplo de adyuvante adecuado para su uso con seres humanos es alumbre (gel de alumbre). Sin embargo, una vacuna para un animal puede contener adyuvantes no apropiados para su uso con humanos.

Se contempla que se puede provocar una respuesta inmunitaria mediante la presentación de cualquier proteína o péptido capaz de provocar dicha respuesta. En un ejemplo, el antígeno es un epítopo clave, que da lugar a una fuerte respuesta inmune a un agente particular de enfermedad infecciosa, es decir, un epítopo inmunodominante. Si se desea, se puede incluir más de un antígeno o epítopo en la composición inmunogénica para aumentar la probabilidad de una respuesta inmune.

En una forma de realización, se incorporan múltiples epítopos de péptido o proteína de Plasmodium protozoario, incluido el epítopo T1BT* de circumsporozoito de Plasmodium falciparum, en una película LBL. Los distintos epítopos pueden sintetizarse o expresarse dentro de una única molécula de péptido diseñada. Se espera que la colocación de múltiples epítopos dentro de un único péptido diseñado tenga ciertas ventajas. Por ejemplo, debería simplificar el procedimiento de fabricación de LBL y aumentar la reproducibilidad. Además, la colocación de múltiples epítopos dentro de un único péptido diseñado bloqueará las proporciones molares de los distintos epítopos en una proporción deseada, por ejemplo 1:1.

Alternativamente, los epítopos se pueden incorporar en péptidos diseñados por separado. Los péptidos diseñados se incorporan en una película LBL durante una o más etapas de formación de capas. La fabricación de películas utilizando múltiples péptidos diseñados distintos también puede presentar ciertas ventajas. Debería simplificar la síntesis de péptidos diseñados reduciendo los costos. También permitirá variar y optimizar las dosis relativas de cada péptido diseñado dentro de la película. Si, por ejemplo, los datos biológicos preclínicos o clínicos indicaran que una vacuna óptima debería contener cinco copias de un epítopo por cada copia de un segundo epítopo (proporción 5:1), el enfoque de péptido diseñado de epítopo separado facilitaría la fabricación de dicha vacuna.

Los péptidos diseñados se adsorben en la superficie de una película LBL en virtud de la atracción electrostática entre las regiones de adsorción superficial cargadas del péptido diseñado y la superficie de la película con carga opuesta. La eficacia de la adsorción dependerá en gran medida de la composición de la (s) región (es) de adsorción superficial. Los péptidos así diseñados con diferentes epítopos, pero con regiones de adsorción superficial similares se adsorberán con una eficacia similar. Para fabricar una película con dos péptidos de diseño distinto, cada uno en una proporción molar de 1 : 1, se podrían mezclar los péptidos en esa proporción molar y depositarlos simultáneamente en una capa particular. Alternativamente, se podría depositar cada péptido individualmente en capas separadas. La relación molar de péptidos adsorbidos reflejará en gran medida las concentraciones relativas a las que se hicieron capas o el número de etapas de formación de capas durante las cuales se incorporaron.

La cantidad de péptidos diseñados incorporados en una película LBL se puede medir de diversas formas. El análisis cuantitativo de aminoácidos (AAA) es particularmente adecuado para este propósito. Las películas que contienen péptidos diseñados se descomponen en sus aminoácidos constituyentes mediante tratamiento con ácido clorhídrico concentrado (6 M) y calentamiento, típicamente a 115°C durante 15 horas. Las cantidades de cada aminoácido se miden luego usando técnicas cromatográficas bien conocidas por los expertos en la técnica. Los aminoácidos que se encuentran en solo uno de los péptidos diseñados en una película pueden usarse como trazadores para ese péptido. Cuando los péptidos diseñados carecen de aminoácidos únicos, se pueden incorporar aminoácidos no naturales (por ejemplo, ácido aminobutírico u homovalina) en los péptidos diseñados durante la síntesis. Estos aminoácidos trazadores se identifican fácilmente durante el experimento AAA y pueden usarse para cuantificar la cantidad de péptido en la película.

Como se usa en el presente documento, una respuesta de células T específica es una respuesta que es específica a un epítopo de interés, específicamente un epítopo de Plasmodium protozoario. Una respuesta de células T específica es una respuesta de células T de IFNy y/o IL-5.

Como se usa en el presente documento, una respuesta de anticuerpo específica es una respuesta que es específica para un epítopo de interés, específicamente un epítopo de Plasmodium protozoario como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "capa" significa un incremento de espesor, por ejemplo, en una plantilla para la formación de la película, después de una etapa de adsorción. "Multicapa" significa múltiples (es decir, dos o más) incrementos de espesor. Una "película multicapa de polielectrolito" es una película que comprende uno o más incrementos de espesor de polielectrolitos. Después de la deposición, las capas de una película multicapa pueden no permanecer como capas discretas. De hecho, es posible que exista un entremezclado significativo de especies, particularmente en las interfaces de los incrementos de espesor. El entremezclado, o la ausencia del mismo, se puede controlar mediante técnicas analíticas tales como mediciones de potencial Z, espectroscopía de fotoelectrones de rayos X y espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo.

"Aminoácido" significa un bloque de construcción de un polipéptido. Como se usa en el presente documento, "aminoácido" incluye los 20 L-aminoácidos comunes de origen natural, todos los demás aminoácidos naturales, todos los aminoácidos no naturales y todos los imitadores de aminoácidos, por ejemplo, peptoides.

"Aminoácidos de origen natural" significa glicina más los 20 L-aminoácidos comunes de origen natural, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina, lisina, histidina, fenilalanina, ornitina, tirosina, triptófano y prolina.

"Aminoácido no natural" significa un aminoácido distinto de cualquiera de los 20 L-aminoácidos comunes de origen natural. Un aminoácido no natural puede tener estereoquímica L o D.

"Peptoide", o glicina N-sustituida, significa un análogo del monómero de aminoácido correspondiente, con la misma cadena lateral que el aminoácido correspondiente, pero con la cadena lateral adjunta al átomo de nitrógeno del grupo amino en lugar de a los a-carbonos del residuo. En consecuencia, los enlaces químicos entre los monómeros de un polipéptoide no son enlaces peptídicos que pueden ser útiles para limitar la digestión proteolítica.

"Secuencia de aminoácidos" y "secuencia" significan una longitud contigua de cadena polipeptídica que tiene al menos dos residuos de aminoácidos de longitud.

"Residuo" significa un aminoácido en un polímero u oligómero; es el residuo del monómero de aminoácido a partir del cual se formó el polímero. La síntesis de polipéptidos implica deshidratación, es decir, una sola molécula de agua se "pierde" al añadir el aminoácido a una cadena polipeptídica.

Como se usa en este documento, "péptido" y "polipéptido" se refieren todos a una serie de aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y alfa-carboxi de aminoácidos adyacentes, y pueden contener o estar libres de modificaciones tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral o fosforilación, siempre que tales modificaciones, o la falta de las mismas, no destruyan la inmunogenicidad. Como se usa en el presente documento, el término "péptido" pretende referirse tanto a un péptido como a un polipéptido o proteína.

"Polipéptido diseñado" significa un polipéptido que tiene carga suficiente para una unión estable a una superficie con carga opuesta, es decir, un polipéptido que puede depositarse en una capa de una película multicapa en la que la fuerza impulsora para la formación de la película es electrostática. En formas de realización específicas, un polipéptido diseñado tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor o igual a 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 o 0.5 a pH 7.0. En una forma de realización, la relación entre el número de residuos cargados de la misma polaridad menos el número de residuos de polaridad opuesta y el número total de residuos en el polipéptido es mayor o igual a 0.5 a pH 7.0. En otras palabras, la magnitud de la carga neta por residuo del polipéptido es mayor o igual a 0.5. Si bien no existe un límite superior absoluto en la longitud del polipéptido, en general, los polipéptidos diseñados adecuados para la deposición de LBL tienen un límite de longitud superior práctico de 1,000 residuos. Los polipéptidos diseñados pueden incluir secuencias que se encuentran en la naturaleza, tales como epítopos de Plasmodium protozoario, así como regiones que proporcionan funcionalidad a los péptidos, tales como regiones cargadas, también denominadas aquí regiones de adsorción superficial, que permiten que los polipéptidos diseñados se depositen en una película polipeptídica multicapa.

"Estructura primaria" significa la secuencia lineal contigua de aminoácidos en una cadena polipeptídica, y "estructura secundaria" significa los tipos de estructura más o menos regulares en una cadena polipeptídica estabilizada por interacciones no covalentes, normalmente enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de estructura secundaria incluyen hélice a, lámina p y giro p.

"Película polipeptídica multicapa" significa una película que comprende uno o más polipéptidos diseñados como se definieron anteriormente. Por ejemplo, una película polipeptídica multicapa comprende una primera capa que comprende un polipéptido diseñado y una segunda capa que comprende un polielectrolito que tiene una carga neta de polaridad opuesta a la del polipéptido diseñado. Por ejemplo, si la primera capa tiene una carga neta positiva, la segunda capa tiene una carga neta negativa; y si la primera capa tiene una carga neta negativa, la segunda capa tiene una carga neta positiva. La segunda capa comprende otro polipéptido diseñado u otro polielectrolito.

"Sustrato" significa un material sólido con una superficie adecuada para la adsorción de polielectrolitos de una solución acuosa. La superficie de un sustrato puede tener esencialmente cualquier forma, por ejemplo, plana, esférica, en forma de varilla, etc. La superficie de un sustrato puede ser regular o irregular. Un sustrato puede ser un cristal. Un sustrato puede ser una molécula bioactiva. Los sustratos varían en tamaño desde la nanoescala hasta la macroescala. Además, un sustrato comprende opcionalmente varias subpartículas pequeñas. Un sustrato puede estar hecho de material orgánico, material inorgánico, material bioactivo o una combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes de sustratos incluyen obleas de silicio; partículas coloidales cargadas, por ejemplo, micropartículas de CaCO³ o de melamina formaldehído; células biológicas tales como eritrocitos, hepatocitos, células bacterianas o células de levadura; entramados de polímero orgánico, por ejemplo, entramados de poliestireno o copolímero de estireno; liposomas; orgánulos; y virus. En una forma de realización, un sustrato es un dispositivo médico, como un marcapasos artificial, un implante coclear o un stent.

Cuando un sustrato se desintegra o se elimina de otro modo durante o después de la formación de la película, se denomina "plantilla" (para la formación de la película). Las partículas de la plantilla se pueden disolver en disolventes apropiados o eliminarse mediante tratamiento térmico. Si, por ejemplo, se utilizan partículas de plantilla de melaminaformaldehído parcialmente reticuladas, la plantilla se puede desintegrar mediante procedimientos químicos suaves, por ejemplo, en DMSO, o mediante un cambio en el valor de pH. Después de la disolución de las partículas de la plantilla, quedan cascarones huecos de múltiples capas que están compuestos por capas alternas de polielectrolito.

Una "cápsula" es una película de polielectrolito en forma de un cascarón hueco o un revestimiento que rodea un núcleo. El núcleo comprende una variedad de encapsulantes diferentes, por ejemplo, una proteína, un fármaco o una combinación de los mismos. Las cápsulas con diámetros inferiores a aproximadamente 1 pm se denominan nanocápsulas. Las cápsulas con diámetros superiores a aproximadamente 1 pm se denominan microcápsulas.

"Reticulación" significa la formación de un enlace covalente, o varios enlaces, o muchos enlaces entre dos o más moléculas.

"Molécula bioactiva" significa una molécula, macromolécula o ensamblaje macromolecular que tiene un efecto biológico. El efecto biológico específico se puede medir en un ensayo adecuado y normalizando por unidad de peso o por molécula de la molécula bioactiva. Una molécula bioactiva puede encapsularse, retenerse detrás o encapsularse dentro de una película de polielectrolito. Ejemplos no limitativos de una molécula bioactiva son un fármaco, un cristal de un fármaco, una proteína, un fragmento funcional de una proteína, un complejo de proteínas, una lipoproteína, un oligopéptido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un ribosoma, un agente terapéutico activo, un fosfolípido, un polisacárido, un lipopolisacárido. Como se usa en este documento, "molécula bioactiva" abarca además estructuras biológicamente activas, tales como, por ejemplo, un fragmento de membrana funcional, una estructura de membrana, un virus, un patógeno, una célula, un agregado de células y un orgánulo. Ejemplos de una proteína que puede encapsularse o retenerse detrás de una película polipeptídica son la hemoglobina; enzimas, como por ejemplo glucosa oxidasa, ureasa, lisozima y similares; proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, fibronectina, laminina, vitronectina y colágeno; y un anticuerpo. Ejemplos de una célula que puede encapsularse o retenerse detrás de una película de polielectrolito son una célula islote trasplantada, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula vegetal y una célula de levadura.

“Biocompatible” significa que no causa ningún efecto adverso sustancial para la salud tras la ingestión oral, aplicación tópica, aplicación transdérmica, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inhalación, implantación o inyección intravenosa. Por ejemplo, las películas biocompatibles incluyen aquellas que no provocan una respuesta inmunitaria sustancial cuando entran en contacto con el sistema inmunológico de, por ejemplo, un ser humano.

"Respuesta inmune" significa la respuesta del sistema inmune celular o humoral a la presencia de una sustancia en cualquier parte del cuerpo. Una respuesta inmune se puede caracterizar de varias formas, por ejemplo, por un aumento en el torrente sanguíneo del número de anticuerpos que reconocen un determinado antígeno. Los anticuerpos son proteínas secretadas por las células B y un inmunógeno es una entidad que provoca una respuesta inmunitaria. El cuerpo humano combate las infecciones e inhibe la reinfección aumentando la cantidad de anticuerpos en el torrente sanguíneo y en otros lugares.

"Antígeno" significa una sustancia extraña que provoca una respuesta inmune (por ejemplo, la producción de moléculas de anticuerpos específicas) cuando se introduce en los tejidos de un organismo vertebrado susceptible. Un antígeno contiene uno o más epítopos. El antígeno puede ser una sustancia pura, una mezcla de sustancias (incluidas células o fragmentos de células). El término antígeno incluye un determinante antigénico adecuado, auto-antígeno, autoantígeno, antígeno de reacción cruzada, aloantígeno, tolerógeno, alérgeno, hapteno e inmunógeno, o partes de los mismos, y combinaciones de los mismos, y estos términos se usan indistintamente. Los antígenos son generalmente de alto peso molecular y comúnmente son polipéptidos. Se dice que los antígenos que provocan fuertes respuestas inmunitarias son fuertemente inmunogénicos. El sitio en un antígeno al que un anticuerpo complementario puede unirse específicamente se denomina epítopo o determinante antigénico.

"Antigénico" se refiere a la capacidad de una composición de dar lugar a anticuerpos específicos de la composición o de dar lugar a una respuesta inmune mediada por células.

Como se usa en este documento, los términos "epítopo" y "determinante antigénico" se usan indistintamente y significan la estructura o secuencia de un antígeno, por ejemplo, una proteína o un péptido diseñado, que es reconocido por un anticuerpo. Normalmente, un epítopo estará en la superficie de una proteína. Un "epítopo continuo" es uno que involucra varios residuos de aminoácidos contiguos, no uno que involucra residuos de aminoácidos que están en contacto o en la región limitada del espacio en una proteína plegada. Un "epítopo conformacional" implica residuos de aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal de una proteína que entran en contacto en la estructura tridimensional de la proteína. Para que se produzca una interacción eficaz entre el antígeno y el anticuerpo, el epítopo debe estar fácilmente disponible para la unión. Por tanto, el epítopo o los determinantes antigénicos están presentes en el entorno celular nativo del antígeno, o solo se exponen cuando se desnaturalizan. En su forma natural, pueden ser citoplasmáticos (solubles), asociados a la membrana o secretados. El número, la ubicación y el tamaño de los epítopos dependerán de la cantidad de antígeno que se presente durante el procedimiento de fabricación de anticuerpos.

Como se usa en el presente documento, una "composición de vacuna" es una composición que provoca una respuesta inmune en un mamífero al que se administra y que protege al organismo inmunizado contra el desafío posterior por parte del agente inmunizante o un agente inmunológicamente reactivo cruzado. La protección puede ser completa o parcial con respecto a la reducción de los síntomas o la infección en comparación con un organismo no vacunado. Un agente de reactividad cruzada inmunológica puede ser, por ejemplo, la proteína completa (por ejemplo, glucosiltransferasa) de la que se ha derivado una subunidad de péptido para su uso como inmunógeno. Alternativamente, un agente de reactividad cruzada inmunológica puede ser una proteína diferente, que es reconocida en su totalidad o en parte por los anticuerpos provocados por el agente inmunizante.

Como se usa en el presente documento, una "composición inmunogénica" pretende abarcar una composición que provoca una respuesta inmune en un organismo al que se administra y que puede o no proteger al mamífero inmunizado frente al desafío posterior con el agente inmunizante. En una forma de realización, una composición inmunogénica es una composición de vacuna.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Protocolos de prueba

Ratones e inmunizaciones: Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6J y BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, de Jackson Laboratories y se alojaron en NorthEast Life Sciences, New Haven. Los ratones se aclimataron al medio ambiente durante al menos una semana antes de su uso. Se resuspendieron nanopartículas, micropartículas o microcápsulas en PBS a la concentración de DP deseada (por ejemplo, 10 pg/100 pl/inyección) y se sometieron a sonicación durante 10 minutos inmediatamente antes de la carga de la jeringa y la inmunización. Los ratones se inmunizaron con la suspensión en la almohadilla de la pata trasera los días 0, 21 y 42. Los ratones de control positivo se inmunizaron por vía s.c. con DP en CFA (d0) o IFA (d21, d42); Los ratones de control negativo se inmunizaron de forma simulada con PBS.

ELISA: Se extrajo sangre de los ratones los días 28 (post-primer refuerzo), 49 (post-segundo refuerzo) y 58 (post­ desafío) y se recolectaron sueros para el análisis de respuestas de anticuerpos usando placas ELISA recubiertas con péptidos TIB, T1BT* o de repetición B. Para la determinación de la presentación de epítopos en nanopartículas, las placas se recubrieron con las nanopartículas indicadas, se bloquearon y se investigaron con MAb 2A10 (repetición anti-B). La unión del anticuerpo se detectó con IgG de cabra anti-ratón marcada con HRP.

ELISPOT: los ratones se sacrificaron los días 28, 49 y 58 y se recogieron los bazos y se trituraron en suspensiones unicelulares. Se reestimularon células de bazo no fraccionadas con el péptido epítopo mínimo indicado en placas ELISPOT de IFNy o IL-5 usando reactivos comerciales (BD Biosciences) y placas (Millipore Corporation) y siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se contó el número de manchas en cada placa en un AID Viruspot Reader.

Desafío con PfPb: se inmunizaron ratones C57BL/6J o BALB/c los días 0, 21 y 42 como se indica en las descripciones de las figuras. Se extrajo sangre de los ratones el día 49 y se midieron los títulos de anticuerpos mediante ELISA como se describió anteriormente. Después de la medición de anticuerpos, los ratones se desafiaron con PfPb (Plasmodium bergheii transfectado con el gen CS de P. falciparum). El desafío se logró anestesiando a los ratones y permitiendo que los mosquitos infectados con PfPb se alimentaran de ellos durante 10 minutos. Dos días después del desafío, se extrajo sangre de los ratones expuestos y se sacrificaron, y se extrajo el ARN del hígado para el análisis de la carga de parásitos mediante qPCR.

Ensayo de neutralización de esporozoitos transgénicos (TSNA): la actividad neutralizante de parásitos de los sueros en el TSNA se realizó mediante procedimientos conocidos en la técnica. En resumen, se incubó una dilución 1:5 de cada muestra de suero con parásitos PfPb (Plasmodium bergheii transfectado con el gen CS de P. falciparum) durante 40 minutos en hielo. Las mezclas se agregaron a pocillos que contenían células HepG2 y se incubaron a 37°C durante 72 horas. Los niveles de ARNr del parásito 18S en cada cultivo se midieron mediante qPCR y se compararon con una curva estándar generada con cantidades conocidas de ADNc del plásmido 18S. El porcentaje de inhibición del crecimiento de parásitos se calculó por comparación con los pocillos de control que contenían células PfPb y HepG2 sin suero.

Aislamiento de ARN y qPCR: Aproximadamente 40 horas después del desafío, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los hígados y se lavaron dos veces con 10 ml de PBS estéril. Los hígados se homogeneizaron en 10 ml de TriReagent (Molecular Research Center, cat# TR118) usando un homogeneizador Polytron (Fisher Scientific PowerGen 500) durante 1 minuto en el ajuste más alto. Los homogeneizados se agitaron con vórtex durante 2 minutos y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El homogeneizado transparente se recogió en tubos Eppendorf estériles a los que se añadieron 200 pl de cloroformo (Sigma C-0549). Las muestras se agitaron en vórtex durante 2 minutos, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se centrifugaron a 14,000 rpm a 4°C durante 15 minutos. La fase acuosa (450 pl) se recogió en tubos Eppendorf estériles de 1.5 ml a los que se añadió un volumen igual de isopropanol (Sigma 405-7). Las muestras se agitaron con vórtex durante 10 segundos, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se centrifugaron a 14,000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y la pella se lavó con 1 ml de EtOH al 70% (Sigma E7023), se agitó con vórtex durante 10 segundos y se centrifugó a 14,000 rpm a TA durante 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y se secó la pella a TA. Las pellas secas se resuspendieron en 200 pl de DEPC H²O (Invitrogen cat# 750023) para qPCR.

También se aisló ARN del homogeneizado de TriReagent usando el protocolo Qiagen RNeasy MiniPrep (Qiagen), y se convirtió en ADNc usando iScript RT Supermix (Bio-Rad), cada uno de acuerdo con el protocolo del fabricante. La PCR se realizó en un CFX96 (Bio-Rad) para determinar el número de copias del ARNr ^{1 8} S de P. bergei en el tejido hepático. Las secuencias de cebadores utilizadas fueron:

hacia delante 5'-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAC-3' (SEQ ID NO: 4)

hacia atrás 5'-GGAGATTGGTTTTGACGTTTATGTG-3' (SEQ ID NO: 5)

Las condiciones de formación de ciclo usando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) fueron: 95°C durante 3 min, luego [95°C durante 20 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos] repetido 40 veces. Para determinar el número de copias, se usó un plásmido de concentración conocida que contenía la secuencia de ARNr 18S de P. bergei (NYU) para construir una curva estándar.

Ejemplo 1: Diseño y síntesis de péptidos ejemplares

Los polipéptidos diseñados se basaron en el péptido multivalente T1BT* de P. falciparum CS. Cada combinación de uno, dos o los tres epítopos se modificó en el extremo C-terminal con K²⁰ Y (SEQ ID NO: ⁶ ) para producir péptidos diseñados (DP) para su incorporación en partículas LbL (Figura 1). Los científicos de ACT sintetizaron péptidos epítopos mínimos y DP utilizando química de péptidos en fase sólida estándar. Los péptidos se purificaron mediante RP-HPLC y se cuantificaron mediante análisis de aminoácidos (datos no mostrados).

T1BT*K20Y: (DP-2062) (SEQ ID NO: 7)

DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEYLNKIQNSLSTEW SPCSVTSGNGKKKK KKKKKKKKKKKKKKKKY

T ¹ K²⁰Y : (SEQ ID NO: ⁸ )

DPNANPNVDPNANPNVDPNAKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

BK²⁰Y: (SEQ ID NO: 9)

NANPNANPNANPNANPKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

T*K20Y: (SEQ ID NO: 10)

EILNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

TIBK ²⁰Y: (SEQ ID NO: 11)

DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPNANPKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

T1T*K2oY: (SEQ ID NO: 12)

DPNANPNVDPNANPNVEYLNKIQNSLSTEW SPCSVTSGNGKKKKKKKKKKKKKKK

KKKKKY

BT*K2oY: (SEQ ID NO: 13)

N ANPN ANPN ANPEYLNKIQNSLST EW SPC S VTS GN GKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

KY

Ejemplo 2: Procedimiento para la fabricación de nanopartículas LBL:

Se obtuvieron núcleos de CaCO³ de NanoMaterials Technology Pte Ltd, Singapur (50 nm, sólidos, cúbicos). PLL y PGA se obtuvieron de Sigma-Aldrich, EE. UU. Se disolvieron PLL, PGA y DP en HEp Es de 10 mM, pH 7.4. Se permitió que los polipéptidos cargados de manera opuesta se autoensamblaran en una película multicapa sobre núcleos de nanopartículas de CaCO³ en sucesivas etapas de adsorción. Brevemente, se disolvieron PLL, PGA y DP (cuando se indique) a 1 mg/ml en HEPES de 10 mM, pH 7.4, y se filtraron a través de un filtro de 0.22 pm. Los núcleos de nanopartículas de CaCO³ se lavaron tres veces con agua sin endotoxinas y se centrifugaron a 16,000 x g durante 1 minuto en una microcentrífuga. Los núcleos de nanopartículas se resuspendieron al 6% (p/v) en 1 mg/ml de PGA como primera capa. A pH neutro, el PGA exhibe una carga neta negativa mientras que las partículas de CaCO³ son netamente positivas, lo que permite la interacción electrostática y la deposición exitosa de la primera capa. La mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego se lavó dos veces con regulador de pH HEPES de 10 mM y se centrifugó a 48,700 x g durante 1 minuto (ultracentrífuga TL-100, Beckman). Para la deposición de la segunda capa, las nanopartículas se resuspendieron al 6% (p/v) en 1 mg/ml de PLL (carga positiva) y se procesaron como para la primera capa. Cada capa subsiguiente se depositó por el mismo procedimiento, usando PGA y PLL en capas alternas; donde se indica, se utilizó DP (carga positiva) para la capa indicada. Después de la deposición de la capa final, las partículas maduras se lavaron y almacenaron como gránulos húmedos a 4°C o TA hasta su uso. La integridad de las partículas y el control de calidad se monitorearon utilizando los procedimientos descritos en la Tabla 1, y las construcciones específicas se identifican en la Tabla 2.

Tabla 1: Metodolo ías criterios de CC em leados

Tabla 2: Lista de nano artículas

Ejemplo 3: Respuesta de anticuerpos provocada por nanopartículas

Se inmunizaron ratones BALB/c por vía f.p. los días 0, 21 y 42 con PBS (control negativo), 10 pg de DP en CFA (control positivo) o 10 pg de nanopartículas que contenían epítopo T* (ACT-1051 (SEQ ID NO: 7), ACT-1056 (SEQ ID NO: 12), ACT-1129 (AEQ ID NO: 10) y ACT-1132 (SEQ ID NO: 13)). Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía f.p. los días 0, 21 y 42 con PBS (control negativo), 10 |jg de DP en CFA (control positivo) o 10 |jg de nanopartículas que contenían epítopo B (ACT-1052 (SEQ ID NO: 9)) o epítopo T1 (ACT -1051 (SEQ ID NO: 7), ACT-1056 (SEQ ID NO: 12), ACT-1130 (SEQ ID NO: 8) y ACT-1131 (s Eq ID NO: 11)). Se extrajo sangre de todos los ratones el día 49 (7 días después del segundo refuerzo) y se sacrificaron tres ratones por grupo para el análisis ELISPOT. Los resultados de ELISA demuestran que ACT-1051 (T1BT*K20Y; SEQ ID NO: 7) y ACT-1132 (BT*K²0Y; SEQ ID NO: 13) indujeron respuestas de anticuerpos específicos de T1BT* en ambas cepas de ratones; ACT-1131 (TIBK²⁰Y; SEQ ID NO: 11) indujo una modesta respuesta de anticuerpos específicos de T1BT* en ratones C57BL/6, mientras que ACT-1052 (BK²⁰Y; SEQ ID NO: 9) no provocó respuestas de anticuerpos detectables (Figuras 2 y 3). Ninguno de los antisueros reconoció el epítopo de repetición B en ELISA (datos no mostrados)

Es posible que la falta de respuesta del anticuerpo a la repetición B se deba a una presentación inadecuada del epítopo en las partículas. Esta posibilidad se abordó recubriendo las placas ELISA con las nanopartículas indicadas y probando con diluciones en serie de mAb 2A10, específico para la repetición B (secuencia NANP). Los resultados de la Figura 4 muestran que el mAb específico de repetición reaccionó con todas las nanopartículas que contienen los epítopos de repetición T1 o B, pero no con nanopartículas que contienen solo T* o un epítopo irrelevante derivado de LCMV. Estos resultados sugieren que la falta de respuestas de anticuerpos de repetición B no se debe a una exhibición insuficiente del epítopo en las nanopartículas.

Ejemplo 4: respuestas de células T con nanopartículas

Para determinar la especificidad de las respuestas CD4+ y CD8+ de los ratones representadas en las Figuras 2 y 3, se probaron las respuestas ELISPOT de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas contra T1 o T*. El día 49, se sacrificaron tres ratones por grupo, se recolectaron células de bazo y se fraccionaron en poblaciones CD4+ o CD8+ usando enriquecimiento con perlas magnéticas y el clasificador de células autoMACS; la pureza de cada población fue superior al 90% (datos no mostrados). Las células se reestimularon en placas ELISPOT de IL-5 o iPNy con los péptidos indicados. Los resultados de las Figuras 5 y 6 muestran que tres inmunizaciones con nanopartículas ACT-1056 (T1T*K20Y (SEQ ID NO: 12)) o ACT-1129 (T*K²0Y (SEQ ID NO: 10)) provocaron fuertes respuestas de células T CD4+ específicas de T* en ratones BALB/c, mientras que tres inmunizaciones con nanopartículas ACT-1056 (T1T*K20Y (SEQ ID NO: 12)) o ACT-1130 (T¹ K²⁰Y (SEQ ID NO: 8)) provocaron fuertes respuestas de células T CD4+ específicas de T1 en ratones C57BL/6. En la mayoría de los casos, la respuesta de las células T se inclinó hacia IL-5 (Th2) sobre IPNy (Th1). Todas las construcciones indujeron respuestas débiles de células T CD8+ en ambas cepas de ratones.

Ejemplo 5: desafío de PfPb con nanopartículas

En un experimento separado, siete ratones por grupo se inmunizaron con nanopartículas ACT-1051 o su péptido diseñado ACT-2062 (T1BT*K20Y (SEQ ID NO: 7)), luego se desafiaron con PfPb. Los ratones se sacrificaron dos días después del desafío y se extrajo el ARN del hígado para el análisis de la carga de parásitos mediante qPCR (NYU). Además, se recogieron los bazos y se analizaron las respuestas de las células T a los péptidos T1BT* y T1 en ELISPOT de IL-5 e IFNy. La Figura 7 muestra que los ratones inmunizados presentaron una respuesta INFy débil tanto al epítopo T1BT* de longitud completa como al epítopo T1. Sorprendentemente, se detectó una fuerte respuesta de IL-5 en los ratones inmunizados con nanopartículas. Como ni los grupos PBS ni 2062/CFA muestran esta respuesta, la producción de IL-5 no es el resultado de la infección sola, sino que parece estar asociada con la inmunización de nanopartículas antes de la infección.

El ARN de hígado extraído de los ratones desafiados se sometió a análisis de qPCR de la carga de parásitos. Los resultados de la Figura 8 muestran que todos los ratones inmunizados con 2062/CFA estaban protegidos del desafío a PfPb como lo demuestra la reducción > 90% en los niveles de ARN del parásito en comparación con el promedio de los ratones tratados con PBS. Es alentador que al menos tres de los ratones inmunizados (uno en el grupo f.p. y dos en el grupo s.c.) mostraron niveles similares de protección, y dos más en el grupo s.c. exhibieron protección marginal (> 80% de reducción). Sin embargo, cuando se compararon las cargas parasitarias individuales con las respuestas inmunitarias (títulos de anticuerpos y respuestas ELISPOT), no se pudo encontrar una correlación inmunitaria clara de protección (datos no mostrados).

Ejemplo 6: Fabricación de micropartículas

El péptido ACT-2062 (T1BT*K20Y (SEQ ID NO: 7)) se sintetizó usando química de péptidos en fase sólida estándar, se purificó mediante RP-HPLC y se cuantificó mediante análisis de aminoácidos.

Se obtuvieron núcleos de CaCO³ de PlasmaChem GmbH, Alemania (3 jm , mesoporoso, esférico). PLL y PGA se obtuvieron de Sigma-Aldrich, EE. UU. Se disolvieron PLL, PGA y a Ct -2062 en HEPES de 10 mM, pH 7.4. Las partículas de LbL se fabricaron esencialmente como para las nanopartículas. Después de ensamblar las 7 capas base con PGA y PLL, la película se reticuló usando EDC de 200 mM y sulfo-NHS de 50 mM en regulador de pH fosfato de 200 mM, pH 6.5. Las partículas se lavaron dos veces con regulador de pH HEPES de 10 mM para eliminar cualquier reactivo residual. Se añadió el DP (ACT-2062, T1BT*K20Y (SEQ ID NO: 7)) como la octava capa para generar la micropartícula ACT-1140. En la micropartícula ACT-1141, las 7 capas base se reticularon antes de depositar el DP. La microcápsula ACT-1142 se preparó tratando ACT-1141 con EDTA de 0.5 M para disolver el núcleo de CaCO³ antes de depositar el DP. Las partículas maduras y las cápsulas se lavaron y almacenaron como pellas húmedas a 4°C o TA hasta su uso.

Ejemplo 7: inmunogenicidad de micropartículas y microcápsulas

Se inmunizaron ratones C57BL/6J con MP-1140, MP-1141 o MC-1142, cada uno cargado con DP 2062 (T1BT*K20Y; SEQ ID NO: 7). Las respuestas de los anticuerpos se probaron mediante ELISA y TSNA, mientras que las respuestas de las células T se probaron mediante ELISPOt . MP-1141 y MC-1142 fueron las construcciones LbL más potentes, provocando títulos de anticuerpos (Figura 9) y respuestas de IFNy+ (Figura 10) comparables a las de los ratones de control positivo. La Figura 9 también muestra que los resultados del ELISA de T1B se correlacionan con el nivel de actividad funcional del anticuerpo medido en el TSNA (r2 = 0.79, P = 0.0004 mediante el análisis del coeficiente de correlación de Pearson de los títulos de suero individuales en ambos ensayos), lo que demuestra la utilidad de ELISA como procedimiento de cribado rápido para medir las respuestas funcionales de anticuerpos anti-TIB.

Ejemplo 8: eficacia de micropartículas y microcápsulas

Se inmunizaron ratones con MP-1141 o MC-1142 y se desafiaron mediante exposición a picaduras de mosquitos infectados con PfPb. Cuarenta horas después del desafío, se controló la carga de parásitos en el hígado cuantificando los niveles de ARNr 18S de P. berghei mediante qPCR. La protección se define como una reducción >90% en la carga de parásitos en comparación con los ratones naive, desafiados. La inmunización con MP-1141 protegió a 8 de 10 ratones y resultó en una reducción del 94% en la carga parasitaria promedio en el grupo de tratamiento (P <0.05, prueba de suma de rangos de Wilcoxon), comparable a los ratones de control inmunizados con DP 2062 en adyuvante de Freund (Figura 11). La inmunización con MC-1142 protegió a la mitad de los ratones, pero no dio como resultado una reducción significativa de la carga parasitaria media del grupo en comparación con el control con PBS.

Los sueros recogidos de los ratones antes del desafío se probaron en el TSNA para medir la actividad neutralizadora de parásitos que bloqueaba eficazmente la invasión de esporozoitos de células de hepatoma humano in vitro, definida como una reducción > 90% de los niveles de ARNr del parásito en células HepG2 medidos por qPCR. Una comparación de la actividad de TSNA con la eficacia in vivo mostró que la eficacia estaba asociada con una potente actividad de anticuerpos neutralizantes en la mitad de los ratones inmunizados con MP-1141 (Figura 12, círculos abiertos). Sin embargo, había varios ratones en ambos grupos inmunizados que estaban protegidos del desafío con el parásito in vivo mientras montaban solo respuestas modestas de anticuerpos neutralizantes (Figura 12 y 13, círculos negros), lo que sugiere que los mecanismos celulares también pueden estar involucrados en la protección.

Ejemplo 9: respuestas de células T provocadas por micropartículas

Los mismos días en que se recogieron los sueros para ELISA (Figuras 12 y 13), se recogieron células de bazo y se estimularon con péptido T1B en placas ELISPOT de IPNy e IL-5. Los ratones inmunizados con ACT-1141 o ACT-1142 produjeron respuestas tanto de Th1 (IFNy) como de Th2 (IL-5), mientras que los ratones inmunizados con DP 2062 en adyuvante produjeron una respuesta sesgada hacia Th1 (IFNy) (Figura 14).

Ejemplo 10: Papel de la inmunidad celular en la eficacia de las partículas LbL

La detección de células secretoras de IFNy en ELISPOT (Figura 10) sugiere la activación potencial de células T efectoras citotóxicas después de la inmunización con partículas LbL, como se encontró anteriormente. La generación de respuestas de células efectoras citotóxicas específicas de la malaria se examinó en un ensayo CTL in vivo utilizando ratones BALB/c ya que los ratones C57BL/6J no desarrollan respuestas CTL fuertes a la proteína CS y existe un epítopo de células T CD8+ restringido a H-2d conocido que está contenido dentro del epítopo T*. Los ratones se inmunizaron con PBS o MP-1141, y 7 días después se redujeron los fenotipos de células T CD4+, CD8+ o ambos mediante la administración de los anticuerpos monoclonales relevantes. Al día siguiente se midió la actividad CTL in vivo. La Figura 15 muestra que se detectó un nivel modesto de destrucción de células diana cargadas con T* en los ratones inmunizados con poblaciones de células T intactas. El agotamiento de las células CD8+ no disminuyó la actividad CTL in vivo mientras que el agotamiento de las células CD4+ impidió por completo la actividad efectora, lo que indica que la inmunización con LbL MP que lleva el antígeno T1BT* provoca células efectoras citotóxicas CD4+, de acuerdo con los resultados publicados que demuestran la actividad efectora CD4+ en voluntarios humanos.

A la luz de las respuestas de células T detectadas en ELISPOT (Figura 10) y el ensayo CTL in vivo (Figura 15), y la aparente discordancia entre la eficacia y los títulos de TSNA en varios de los ratones inmunizados (Figura 12 y 13), hemos examinado la contribución de la inmunidad celular a la eficacia de las micropartículas de LbL. Para probar la eficacia de las respuestas celulares solas, en ausencia de respuestas de anticuerpos específicos de T1B, hemos construido MP cargado con epítopos de células T de la proteína CS de P. berghei, el patógeno de ratón (Tabla 3). En este estudio se utilizaron BALB/c ya que tanto los epítopos de células T CD4+ como CD8+ se reconocen en ratones H-2d. Los ratones se inmunizaron los días 0 y 28 con MP que contenía epítopos de células T CD4+ de P. berghei(MP-1182), epítopos de células T CD8+ (MP-1183), un péptido de fusión que contenía ambos epítopos de células T (MP-1184), o péptido de fusión DP en adyuvante de Freund. El día 35, se realizó un experimento CTL in vivo utilizando células diana cargadas con el epítopo o epítopos inmunizantes. La inmunización con MP cargado con el epítopo de células T de P. berghei provocó actividad efectora contra las células diana cargadas con el péptido inmunizante (Figura 16). Sin embargo, la actividad de CTL no fue suficiente para proteger a los ratones contra el desafío con esporozoitos de PfPb que expresan los epítopos de células T de P. berghei (Figura 17), lo que sugiere que la eficacia informada en la Figura 11 estaba mediada por anticuerpos.

T ei

SEQ ID NO: 14

LEFVKQIRDSITEEWSQCNVKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

SEQ ID NO: 15

KNNNNDDSYIPSAEKILEFVKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKY

SEQ ID NO: 16

KNNNNDD S YIP S AE KILEF VKQIRD SITEE W SQCN VKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK

Y

Ejemplo 11: Inmunogenicidad de micropartículas de malaria Pam3Cys.T1B

Los ensayos clínicos de vacunas de péptidos de la malaria han demostrado que los adyuvantes pueden aumentar significativamente las respuestas celulares y de anticuerpos, pero frecuentemente a costa de una mayor reactogenicidad. El uso de agonistas de TLR que se dirigen con mayor precisión a la inmunidad innata puede ayudar a evitar respuestas inflamatorias excesivas asociadas con adyuvantes potentes. Pair^Cys, un agonista de TLR2 lipopéptido sintético, es un estimulador inmune innato especialmente atractivo para el enfoque LbL ya que puede incorporarse directamente en DP. Se sintetizó una serie de DP que contienen diversas configuraciones de T1B (ver Tabla 4). Las secuencias de los antígenos de la proteína del circumsporozoito de Plasmodium falciparum T1 y B se indican a continuación:

T1:DPNANPNVDPNANPNV (SEQ ID NO: 1)

B: NANP (SEQ ID NO: 2)

Se obtuvieron núcleos de CaCO³ de PlasmaChem GmbH, Alemania (3 |jm, mesoporosos, esféricos). PLL y PGA se obtuvieron de Sigma-Aldrich, EE. UU. PLL, PGA y ACT-2062 (T1BT*K2oY:

DPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANPEILNKIQNSLSTEWSPCSVTSGNGKKKK KKKKKKKKKKKKKKKY (SEQ ID NO: 7)) se disolvieron en HEPES de 10 mM, pH 7.4. Las partículas de LbL se fabricaron esencialmente como para las nanopartículas. Después de ensamblar las 7 capas base con PGA y PLL, la película se reticuló usando EDC de 200 mM y sulfo-NHS 50 de mM en regulador de pH fosfato de 200 mM, pH 6.5. Las partículas se lavaron dos veces con regulador de pH HEPES de 10 mM para eliminar cualquier reactivo residual. El DP se añadió como la octava capa para generar las micropartículas enumeradas en la Tabla 4. Las partículas maduras se lavaron y almacenaron como pellas húmedas a 4°C o TA hasta su uso.

El extremo N-terminal de DP-2163 (TNBsPf) se extendió durante la síntesis en fase de solución añadiendo un espaciador de serina-lisina-lisina-lisina-lisina seguido de acoplamiento con N-terminal de un residuo de cisteína modificado con Pam³, incorporando así el ligando TLR2 Pam3Cys para producir DP-2167 (Pairtá.TNBsPf).

Tabla 4: Lista de micro artículas

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende

una primera película multicapa que comprende una pluralidad de capas de polielectrolito con carga opuesta y un lipopéptido TLR2, TLR1/2 y/o ligando TLR6/2, en donde una de las capas de polielectrolito en la película multicapa comprende un primer polielectrolito antigénico,

donde el primer polielectrolito antigénico comprende un epítopo T1BT* del circumsporozoito de Plasmodium falciparum unido covalentemente a un primer polielectrolito,

donde el primer polielectrolito antigénico es un polipéptido diseñado que tiene al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 1,000 residuos de aminoácidos de longitud y tiene una magnitud de carga neta por residuo mayor o igual a 0.2 a pH 7.0,

donde los polielectrolitos en la película multicapa comprenden un material policatiónico o un material polianiónico que tiene un peso molecular superior a 1,000 y al menos 5 cargas por molécula, y

donde la primera película multicapa se deposita sobre una micropartícula central o nanopartícula central o tiene la forma de una microcápsula hueca o nanocápsula hueca.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la película multicapa está reticulada covalentemente, preferiblemente en la que las reticulaciones covalentes son enlaces amida que implican grupos funcionales de la cadena lateral de aminoácidos.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el ligando TLR de lipopéptido está unido covalentemente al primer polielectrolito antigénico.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el ligando TLR de lipopéptido es un lipopéptido PamaCys.

5. La composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta inmune en un organismo vertebrado que comprende administrar dicha composición en el organismo vertebrado.