KR100632835B1 - 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Th1 타입 면역 반응의 우선적인 자극제인 애쥬번트와 결합된 (a) 단백질 또는 펩티드에 컨쥬게이션되거나, 컨쥬게이션되지 않은 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류 및 (b) RSV 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 조합 백신은 어린이 및 노인층을 위해 특히 유용하다.

Description

조성물{NOVEL COMPOSITIONS}
본 발명은 신규한 백신 제형, 이들을 제조하는 방법 및 예방 및 치료에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 어린이 및 노인층에게 투여하기 위한 조합 백신에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 감염 또는 질환에 대한 방어를 위한 조합 백신에 관한 것이다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 특히, 어린이 및 노인층에서 상당한 발병율 및 사망률을 초래하는 그람 양성 세균이다. 특히 어린 아이에서 호흡기, 및 중이(middle ear)의 광범위한 군락화가 미국에서 문병객들의 유일한 가장 보편적인 원인이다. 상기 세균은 하폐에 침입 및 감염하여 폐렴을 유발시킬 수 있다. 60세 이상에 대한 미국에서의 폐렴구균성 폐렴의 비율은 100,000명 당 3 내지 8명인 것으로 추정된다. 20%의 경우에 이것은 항생제 처리에도 불구하고 30%의 사망률을 가진 균혈증, 및 수막염과 같은 증상을 초래한다. 세균을 둘러싸고 있는 캡슐 다당류의 구조에 의해 결정되는 90개의 공지된 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 혈청형이 존재하며, 이는 주요 독성 인자이다.
17가의 폐렴구균성 백신[모니아릭스(Moniarix)]이 공지되어 있으며, 이는 침입성 질환에 가장 보편적으로 관여하는 폐렴구균성 혈청형의 정제된 다당류에 기초한 것이다. 이러한 다당류의 정제 방법은 유럽 특허 제 72513 B1호에 기술되어 있다. 저가(lower valent) 백신을 사용한 백신 효능 시도는 조합물내에 존재하는 혈청형에 대해 70 내지 90% 효능을 보여주었다. 14가의 백신을 사용하여 55세를 초과하는 사람에 대한 미국에서의 통제된 연구의 경우는 70% 효능을 보여주었다[참조: Mills, O.F., and Rhodas, G.G; J. Clin. Epidemiol. (1996); Vol.49(6) 631-636]. 비록 임상 효능 데이터 부족이 존재하더라도, 적절한 혈청형 반응에 기초하여 (23가의 폐렴구균성 백신을 만들기 위해) 추가적인 다당류의 포함이 용인되었다(참조: K. R. Brown In 'Combined. Vaccines and Simultaneous Administration', Ed. Williams et al. New York Academy of Sciences 1995 pp 241-249).
23가의 폐렴구균성 백신(Pnu-Immune 23 - Lederle USA) 및 인플루엔자 백신(Fluarix)을 사용한 동시 면역화가 연구되었고(참조: TJ Fletcher, TW Tunnicliffe, K Hammond, K Roberts, JG Ayres; (1997) Br. Med. J. 314: 1663) 동시 면역화, 또는 1개월 간격의 면역화 사이에 어떠한 현저한 면역학적 차이도 알려지지 않았다.
폐렴구균성 다당류는 이들을 단백질 담체와 화학적으로 커플링시킴으로써 유아에게서 보다 큰 면역원성을 줄 수 있다. 임상적 효능 시도를 수행하여 유아 중이염을 예방하는 데 있어서의 효능에 대한 상기 개념을 증명하였다.
7가 내지 11가의 컨쥬게이트 폐렴구균성 백신을 사용하여 프라이밍된 유아는 혈청형 적용범위 및 IgG 농도를 증가시키기 위해 23가의 단순 다당류 폐렴구균성 백신을 사용하여 추가접종될 수 있다[참조: Block, SL, JA. Hedrick, R.A. Smith, R.D. Tyler, M. Giordani, M.D. Blum, J. Sadoff, E. Keegan; Abstract G-88, 37th ICAAC, Toronto(1997); Anderson, E.L., Kennedy, D.J., Geldmacher, K.M., Donnelly, J., Mendelman, P; The Journal of Paediatrics, May 1996. Vo. 128, n°5, Part 1, 649-653].
사람 호흡기 합포체 바이러스(RSV)는 바이러스의 파라믹소비리대 패밀리의 구성원이고 특히 어린 아이 및 아기에게서 하기도 질병을 일으킨다. 최근 보고는 RSV가 성인, 특히 노인층에게 중요한 병원체임을 제안하였다.
RSV는 각각 단일 폴리펩티드를 코딩하고 있는 10개의 메신저 RNA를 코딩하는 15,222 뉴클레오티드의 분절되지 않은 네가티브 가닥 리보핵산(RNA) 게놈을 가진 외피(envelope)로 싸여진 바이러스이다. 상기 10개 단백질 중 3개는 트랜스멤브레인 표면 단백질이다: G(부착), F(융합) 및 SH 단백질. 2개의 단백질은 바이리온 매트릭스 단백질(M 및 M2)이고, 3개의 단백질은 뉴크레오캡시드의 구성요소(N, P 및 L)이고, 2개의 단백질은 비구조성(NS1 및 NS2)이다. RSV의 항원적으로 구별되는 2개의 균주가 존재하며, 이는 균주 A 및 균주 B로 표기된다. 이러한 그룹으로부터의 균주의 특징화는 F 단백질이 보존되는 반면, G 단백질상에 존재하는 주요한 차이에 의해 결정된다.
호흡기 합포체 바이러스(RSV)는 온대 기후에서 겨울 동안 및 더욱 따뜻한 기후에서 우기 동안 절정에 이르는 계절적 발생을 일으킨다(참조: DeSilva LM & Hanlon MG. 호흡기 합포체 바이러스: 소아과 병원에서의 5년 연구에 대한 보고서. J Med Virol 1986; 19: 299-305). 어느 지역에서나, RSV는 규칙적이고 예측가능한 패턴을 가지는 경향이 있고 그 밖의 돌발적으로 발생하는 호흡기 바이러스성 병원체는 병발적으로 거의 존재하지 않는다(참조: Glezen WP & Denny FW. Epidemiology of acute lower respiratory disease in children. N. Engl. J. Med. 1973; 288: 498-505).
RSV는 어린이에게서 심각한 하기도 질환의 주요 원인이다. 세기관지염으로 입원한 어린이 중 40 내지 50% 및 폐렴으로 입원한 어린이 중 25%는 RSV 감염의 직접적인 결과로써 입원한 것으로 추정된다. 일차적인 RSV 감염은 1년이 되지 않은 어린이에게 주로 발생하며 어린이 중 95%는 2세 까지 과거 감염의 혈청학적 증거를 가지며 성인 까지는 군집의 100%가 그렇다.
유아 및 어린 아이에 있어서, 약 40%의 경우에서 상기도로부터 하기도까지 감염이 진행되고 임상학적으로 대표적인 것은 세기관지염 또는 폐렴의 진행이다. 태어난 지 2 내지 6개월 된 아이는 RSV에 의한 감염의 심각한 증상(주로 호흡 곤란)을 나타낼 우려가 가장 높다; 하지만, 심장 또는 폐렴 질환에 걸린 임의 연령의 어린이, 조산아, 및 면역손상된 영아는 이 뿐만 아니라 심각한 합병증의 우려가 있다.
증후성 재감염은 일생 동안 일어나며 이는 RSV가 특히 노인층에 대해서 중요한 성인 병원체임을 더욱 더 명백하게 한다.
RSV 감염은 부분적으로는 어린이의 감염일 것이라고 생각되기 때문에, 성인에서는 거의 확실하게 진단불현성이다. 결과적으로, 성인에 있어서 호흡기 질병을 설명하기 위해 바이러스의 증거를 찾지는 않는다. 또한, RSV는 대다수의 성인이 그런 것 처럼, 바이러스에 대해 어느 정도 부분적인 면역성을 가진 개인으로부터의 비내 분비물에서 확인하기가 어렵다. 젊은이 내지 중년의 성인은 전형적으로 RSV에 감염되는 경우 지속적인 감기 유사 증상을 나타낸다. 노인층은 폐렴을 포함하여, 하기도 연관에 의해 수반될 수 있는 상기도 증상과 함께, 사실상 인플루엔자와 구별할 수 없는 연장된 호흡기 증상을 나타낼 수 있다. 기관에 수용된 노인층 군집은 이들이 함께 군집을 이룬 수많은 민감한 개인들을 포함하기 때문에 특히 관심의 대상이다. 이들 중 다수가 이들의 질환을 더욱 심각하게 진행시킬 수 있는 여러 의학적 문제를 가진 이러한 군집을 통한 감염의 확산은 제어하기가 어렵다.
또한, 성인 및 공동체에 거주하는 건강한 노인층에 있어서 입원의 원인으로서 RSV 감염의 영향을 평가하는 최근 연구 보고는 이러한 군집에서 심각한 하기도 질환에 있어서 RSV 감염의 중요한 역할에 대해 추가로 지적하고 있다(참조: Dowell SF, Anderson LJ, & Gray Jr HE, et al. J. Infect Dis 1996; 174: 456-462; Falsey AR, Cunningham CK, & Barker WH, et al. J. Infect Dis 1995; 172: 389-394). 도웰(Dowell)은 성인의 입원을 초래하는 심각한 하기도 질환을 일으키는 4가지의 가장 보편적인 병원체 중 하나로서 RSV를 확인하였다(참조: Dowell SF, Anderson LJ, & Gary Jr HE, et al. J. Infect Dis 1996; 174: 456-462). 팔세이(Falsey)는 노인층에서의 심각한 RSV 감염이 요양소 또는 발생 상황에 제한되지 않음을 증명하였다. 오히려, RSV 감염은 공동체에 거주하는 노인 환자 사이 에서 심각한 질병의 예측가능한 원인이다. 인플루엔자 A에 대한 입원과 유사하게, RSV 감염과 관련된 입원은 연장된 병원 체류에 의해 증명되는 바와 같이, 실질적인 발병률, 높은 집중 치료 승인 비용 및 높은 환기장치 유지 비용을 수반한다(참조: Falsey AR, Cunningham CK, & Barker WH, et al. J. Infect Dis 1995; 172: 389-394).
이러한 연구들은 영아, 성인 및 공동체에 거주하는 건강한 노인층 및 기관에 수용된 노인층 둘 모두에서 RSV 감염의 심각한 합병증을 예방할 수 있는 효과적인 백신을 위한 의학적 및 경제적 필요성을 지적한다.
재조합 서브유닛 백신 또는 킬드(killed) 백신을 위해, 애쥬번트의 사용이 일차적으로 중요하다. 백반(Alum)은 현재 사람용으로 인가된 유일한 애쥬번트이다. 그러나, 백반은 체액성 반응에 대한 제한적인 애쥬번트 효과를 가지며, 주로 Th2 타입 면역 반응을 유도시키는 것으로 공지되어 있다(참조: Byars NE, Nakano G, & Welch M, et al. Vaccine 1991; 9: 309-318). 그러나, 백반과 조합된 3 De-O-아실화된 모노프스포릴 지질 A(3D-MPL)이 체액성 반응을 향상시키고 우선적으로 Th1-타입 면역을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 3D-MPL 애쥬번트를 지닌 알루미늄 염을 백반/3D-MPL이라 한다.
본 발명은 Th1 타입 반응의 우선적인 자극제인 애쥬번트와 함께
(a) 단백질 또는 펩티드에 컨쥬케이션되거나, 컨쥬게이션되지 않은 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류; 및
(b) RSV 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
조합 백신에 대한 동향은 수용자에게 불쾌함을 감소시키고, 계획을 수월하게 하고, 레지먼트(regiment)의 완료를 보장한다는 장점을 가지지만; 백신의 효능의 감소가 동시에 발생할 위험성도 존재한다. 그러므로, 군집의 요구를 충족시키고, 추가적으로, 서로 간섭하지 않는 백신 조합물을 제조하는 것이 장점적일 것이다. 백신의 조합이 하나 또는 둘 모두의 백신 효능을 향상시키는 상승 작용을 초래하는 경우가 추가로 장점적일 것이며, 또한 하나 또는 두 백신 모두를 위한 방어의 상관관계를 향상시킨다. 이것은 특히 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 및/또는 RSV 감염의 위험성이 있을 수 있는 어린이 또는 노인층에게 투여하기 위해 매우 유익한 본 발명의 백신 조성물에 의해 달성된다.
임의적으로 본 발명의 백신 조성물은 인플루엔자(influenza) 바이러스 항원과 같은 수많은 다른 항원 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 현재 이용가능한 인플루엔자 백신에는 완전히 불활성화된 바이러스 백신, 스플릿 입자 백신, 및 서브유닛 백신이 포함된다. 모든 종류의 인플루엔자 백신은 대개 3가 백신이다. 이들은 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 균주로부터 유도된 항체를 포함하고 있다. 이들 대부분 중 표준 0.5ml 양에는 각 균주로부터 혈구응집소 성분 15㎍이 포함되어 있다.
인플루엔자 백신으로 통합될 균주를 결정하기 위한 과정은 세계 보건 기구, 국립 보건 당국 및 백신 제조업체 사이의 공동연구와 관련된 복잡한 방법이다.
폐렴구균성 다당류는 화학적으로 이들을 단백질 담체와 커플링시킴으로써 더욱 면역원성으로 제조될 수 있으며, 영아 중이염을 예방하는 데 있어서의 효능에 대한 이러한 개념을 증명하기 위해 임상학적인 효능 시도가 수행중이다.
면역원성 다당류 구성물을 생성시키기 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 컨쥬게이션 방법이 있다: (1) 탄수화물과 단백질의 직접적인 컨쥬게이션; 및 (2) 두가지작용성 링커 또는 스페이서 시약을 통한 탄수화물과 단백질의 간접적인 컨쥬게이션. 일반적으로, 직접적 및 간접적 컨쥬게이션 둘 모두는 유도체화 이전에 탄수화물 부분의 화학적 활성화를 필요로 한다. [참조: US 5,651,971 and Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds), Vol. 10, 48 - 114 (1989)].
본 발명에 따른 조성물중의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류는 필수적인 것은 아니지만 바람직하게는 컨쥬게이션된 형태로 존재한다. 컨쥬게이션되지 않은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류는 배제되지 않는다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류는, 컨쥬게이션된 경우, 단백질 또는 펩티드에 컨쥬게이션된다. 다당류 항원은 수많은 T 헬퍼 단백질과 컨쥬게이션된다. 이것은 T-헬퍼 에피토프를 제공한다. 대표적인 단백질에는 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae) B 로부터의 단백질 D 또는 이의 지질화된 유도체 지단백질 D가 포함된다. 그 밖의 적합한 단백질 담체에는 디프테리아 Crm 197 및 인플루엔자로부터의 주요한 비구조성 단백질인 NS1(특히 아미노산 1-81)이 포함된다.
단백질 D는 본 발명에 따른 백신의 바람직한 성분이며, 이에는 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류가 컨쥬게이션되어 있다. 단백질 D의 단편 또한 적합하다. 단백질 D는 EP 0 594 610호에 기술되어 있다. 사용하기에 적합한 단편들에는 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 단편이 포함된다. 특히 단백질 D 단편은 단백질의 N-말단 1/3을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 조성물내의 단백질 D-컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 다당류(Streptococcus pneumoniae)와 RSV 항원과의 조합이 컨쥬게이트의 단백질 D 성분에 대한 면역 반응에 영향을 미치지 않음이 추가적으로 밝혀졌다. 단백질 D는 타입을 결정할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae) B(NTHi) 감염에 대한 방어성 항원이다.
따라서 본 발명은 임의적으로는 Th1 애쥬번트와 같은 애쥬번트와 함께, RSV 항원 및 단백질 D 또는 이의 단편에 컨쥬게이션된 하나 이상의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류를 포함하는 백신을 추가로 제공한다.
전형적으로 본 발명의 백신내의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 성분은 (바람직하게는 컨쥬게이션된) 다당류 항원을 포함할 것이며, 여기서 다당류는 폐렴구균의 4종 이상의 혈청형으로부터 유도된다. 바람직하게는 4종의 혈청형에는 6B, 14, 19F 및 23F가 포함된다. 더욱 바람직하게는, 7종 이상의 혈청형이 조성물내에 포함되며, 예컨대 이들은 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 유도된다. 더욱 바람직하게는, 11종 이상의 혈청형이 조성물내에 포함되며, 예컨대 하나의 구체예에서 조성물은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터 유도된 캡슐 다당류를 포함한다(바람직하게는 컨쥬게이션된). 본 발명의 바람직한 구체예에서, 추가의 다당류 항원, 예컨대 23가(혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F와 같은)가 본 발명에 의해 고찰되었지만, 13종 이상 또는 15종 이상 또는 17종 이상의 다당류 항원(바람직하게는 컨쥬게이션된)이 포함된다.
노인층 백신접종(이를 테면, 폐렴의 예방을 위한)을 위해서는 상기 기술한 11가 항원 조성물에 혈청형 8 및 12F(및 가장 바람직하게는 이 뿐만 아니라 15 및 22)를 포함시켜 15가 백신을 형성시키는 것이 장점적인 반면, 영아 또는 갓난아이(중이염이 더욱 중요한)의 경우에는 혈청형 6A 및 19A를 포함시켜 13가 백신을 형성시키는 것이 장점적이다.
본 발명에 따른 백신내에 함유시키기 위한 적합한 RSV 항원에는 예컨대, 포르말린을 사용하여 화학적으로 불활성화된 RSV 바이러스와 같은, 불활성화된 RSV 바이러스가 포함된다. 이 불활성화된 바이러스는 계대 또는 유전자 조작에 의해 약독화된 RSV로부터 생성될 수 있거나, 이것은 야생형 RSV로부터 생성될 수 있다. RSV의 상이한 균주로부터의 외피 항원, 예컨대 임의적으로 약독화된 RSV B 외피 단백질을 가진 RSV 균주 A 골격을 포함하도록 조작된 재조합 RSV를 사용할 수 있다.
적절한 RSV 항원은 특히, RSV 바이러스로부터 유도된 항원, 바람직하게는 예컨대, 미국 특허 제 5,149,650호에 기술되어 있는 바와 같이 RSV F 또는 G 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 같은 사람 RSV 외피 당단백질, 또는 RSV F 및 G 단백질 둘 모두로부터의 하나 이상의 면역원성 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 장점적으로는 바람직하게는 CHO 세포로부터 발현되는 예컨대 미국 특허 제 5,194,595호에 기술되어 있는 바와 같이 RSV FG 키메라 단백질을 포함한다.
바람직하게는 RSV 항원은 RSV 외피 당단백질 또는 이의 유도체이다. 바람직하게는 항원은 RSV 균주 A로부터 유도된다. 또한 항원은 균주 B로부터 유도될 수 있거나, 조성물내에 균주 A 및 B 각각으로부터의 항원이 존재할 수 있다. 바람직한 항원은 F 당단백질, G 당단백질 또는 FG 융합 단백질 또는 이의 면역원성 유도체로부터 선택된다.
전형적으로 면역원성 유도체에는 트랜스멤브레인 도메인이 없는 단백질(즉, F Δtm, G Δtm 및 F Δtm G Δtm)이 포함된다. 바람직하게는 신호 서열은 G 단백질로부터 결실된다. F 또는 G 단백질의 세포외 도메인의 약 50% 이상 또는 약 80% 이상(연속적인 서열)이 존재하는 것이 바람직하다. 특정 예는 F 단백질의 1 내지 526 또는 1 내지 489 아미노산, G 단백질의 아미노산 69 내지 298 또는 대안적인 위치 97 내지 279, 및 F1-526G69-298 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 융합체는 F 단백질로부터의 1 내지 489 아미노산에 이은 G 단백질의 97 내지 279를 포함한다.
본 발명에 따른 RSV/스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 백신 조성물은 면역계의 세포 매개되는 부문을 조력하기 위한 반응의 Th1 타입의 우선적인 유도체인 애쥬번트를 포함한다.
면역 반응은 면역계의 세포와 항원과의 상호작용을 통해 항원에 대해 일어난다. 일어난 면역 반응은 두 가지 극단적인 범주, 즉 체액성 또는 세포 매개되는 면역 반응(전통적으로 항체 및 방어 세포성 이펙터 메카니즘에 의해 각각 특징화됨)으로 대체로 구별될 수 있다. 반응의 이러한 범주를 Th1-타입 반응(세포-매개된 반응), 및 Th2-타입 면역 반응(체액성 반응)이라 한다.
극단적인 Th1-타입 면역 반응은 항원 특이적이고, 일배체형 제한 세포독성 T 림프구, 및 내츄럴 킬러 세포 반응의 생성에 의해 특징화될 수 있다. 마우스에서 Th1-타입 반응은 종종 IgG2a 서브타입의 항체의 생성에 의해 특징화되는 반면, 사람의 경우에 IgG2a 서브타입의 항체는 IgG1 타입 항체에 상응한다. Th2-타입 면역 반응은 마우스에서 IgG1, IgA, 및 IgM을 포함하는 광범위한 면역글로불린 이소타입의 생성에 의해 특징화된다.
이러한 두 가지 타입의 면역 반응의 발생의 이면에 유도력은 면역계의 세포를 돕고 Th1 또는 Th2 반응에 대한 궁극적인 면역 반응을 조정하는 역할을 하는 사이토카인, 확인된 수많은 단백질 전달체라고 생각할 수 있다. 따라서 높은 수준의 Th1-타입 사이토카인은 소정의 항원에 대해 세포 매개된 면역 반응을 유도시키는 경향이 있는 반면, 높은 수준의 Th2-타입 사이토카인은 항원에 대해 체액성 면역 반응을 유도시키는 경향이 있다.
Th1 및 Th2-타입 면역 반응의 구별이 절대적이지 않음을 명심해야 한다. 실제로 한 개인은 우세하게 Th1 또는 우세하게 Th2라고 기술되어 있는 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만(Mosmann) 과 코프만(Coffman)에 의해 뮤린 CD4 + ve T 세포 클론에서 기술된 점에서 사이토카인의 패밀리를 생각하는 것이 종종 편리하다[참조: Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretioin lead to different function properties. Annul Review of Immunology, 7, p145-173]. 전통적으로, Th1-타입 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 사이토카인의 생성과 연관되어 있다. Th1-타입 면역 반응의 유도와 종종 직접적으로 연련되어 있는 그 밖의 사이토카인은 IL-12와 같은 T-세포에 의해 생성되지 않는다. 대조적으로, Th2-타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 종양 괴사 인자-β(TNF-β)의 분비와 연관되어 있다.
특정 백신 애쥬번트가 Th1 또는 Th2-타입 사이토카인 반응의 자극을 위해 특히 적합하다는 것은 공지되어 있다. 전통적으로 백신접종 또는 감염 후 면역 반응의 Th1:Th2 균형에 대한 가장 우수한 지시자에는 항원을 사용한 재자극 후 시험관내에서 T 림프구에 의한 Th1 또는 Th2 사이토카인의 생성의 직접적인 측정, 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a 비의 측정이 포함된다.
따라서, Th1-타입 애쥬번트는 단리된 T-세포 군집을 자극하여 시험관내에서 항원으로 재자극되는 경우 높은 수준의 Th1-타입 사이토카인을 생성시키고, Th1-타입 이소타입과 연관되어 있는 항원 특이적 면역글로불린 반응을 유도시킨다. 우세하게 Th1 반응을 촉진시키는 적합한 애쥬번트 시스템에는 모노포스포릴 지질 A 또는 이의 유도체, 특히 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A, 및 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 알루미늄 염과의 조합이 포함된다. 추가의 적합한 애쥬번트 시스템은 하기에 기술한다.
이러한 애쥬번트는 예컨대, 국제 특허 출원 번호 WO 94/00153호 및 WO 95/17209호에 기술되어 있다.
3D-MPL은 GB 2220211호(리비(Ribi))에 기술되어 있다. 화학적으로 이것은 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이고 리비 이뮤노켐 몬타나(Ribi Immunochem Montana)에 의해 제조된다. 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽 특허 EP 0 689 454 B호에 기술되어 있다.
바람직하게는, 3D-MPL의 입자의 크기는 0.22 미크론 멤브레인을 통해 멸균 여과될 정도로 작다(유럽 특허 EP 0 689 454호에 기술된 바와 같이).
3D-MPL은 정상적으로는 투여량 당 10㎍ 내지 100㎍, 바람직하게는 25㎍ 내지 50㎍의 범위로 존재할 것이고 항원은 전형적으로는 투여량 당 2㎍ 내지 50㎍의 범위로 존재할 것이다.
또 다른 바람직한 애쥬번트는 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유도된 사포닌의 Hplc 정제된 비독성 분획인 Q21을 포함한다. 임의적으로 이것은 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL), 임의적으로는 담체와 함께 혼합될 수 있다.
QS21의 생성 방법은 미국 특허 제 5,057,540호에 기술되어 있다.
Q21을 함유하는 비 반응원성 애쥬번트 제형은 WO 96/33739에 기술되어 있다. QS21 및 콜레스테롤을 함유하는 이러한 제형은 항원과 함께 제형되는 경우 성공적인 Th1 자극성 애쥬번트임이 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 일부분을 이루는 백신 조성물은 QS21과 콜레스테롤의 조합물을 포함할 수 있다.
Th1 반응의 우선적인 자극제인 추가적 애쥬번트는 면역조절 올리고뉴클레오티드, 예컨대 WO 96/02555에 기술되어 있는 바와 같이 메틸화되지 않은 CpG 서열을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 상이한 Th1 자극성 애쥬번트의 조합물을 Th1 타입 반응의 우선적인 자극제인 애쥬번트를 공급함에 따라 고찰하였다. 예를 들어, QS21(바람직하게는 콜레스테롤과 함께)은 3D-MPL과 함께 제형화될 수 있다. QS21 : 3D-MPL의 비는 전형적으로는 약 1:10 내지 10:1; 바람직하게는 1:5 내지 5:1 및 종종 실질적으로는 1:1이 될 것이다. 최적의 상승작용을 위해 바람직한 3D-MPL:QS21 범위는 2.5:1 내지 1:1이다.
바람직하게는 담체가 또한 본 발명에 따른 백신 조성물내에 존재한다. 이 담체는 수중유 에멀젼 또는 알루미늄 염일 수 있다.
바람직한 수중유 에멀젼은 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및 트윈 80과 같은 대사가능한 오일을 포함한다. 추가적으로 수중유 에멀젼은 스판 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 포함할 수 있다.
바람직한 일면에서 수산화 알루미늄(백반) 또는 알루미늄 포스페이트는 면역원성을 향상시키기 위해 본 발명의 조성물에 첨가될 것이다.
특히 바람직한 일면에서 본 발명에 따른 백신 조성물중의 항원은 3D-MPL 및 백반과 조합된다.
전형적으로 사람 투여를 위해 QS21 및 3D-MPL은 투여량 당 10 내지 100㎍, 바람직하게는 10㎍ 내지 50㎍과 같은, 1㎍ 내지 200㎍의 범위로 백신내에 존재할 것이다. 전형적으로 수중유는 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 트윈 80을 함유할 것이다. 바람직하게는 스쿠알렌: 알파 토코페롤의 비는 동일하거나 이것이 더욱 안정적인 에멀젼을 제공하도록 1 미만이다. 또한 스판 85가 1%의 수준으로 존재할 수 있다. 일부 경우에서는 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 포함하는 것이 장점적일 수 있다.
무독성 수중유 에멀젼은 바람직하게는 수성 담체내에 무독성 오일, 예컨대, 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 에멀젼화제, 예컨대, 트윈 80을 함유한다. 수성 담체는 예컨대, 인산염 완충 염수일 수 있다.
수중유 에멀젼중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 함유하는 특히 강력한 애쥬번트 제형은 WO 95/17210에 기술되어 있다.
본 발명의 백신은 면역방어적 양의 항원을 포함할 것이며 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
백신 제조는 일반적으로 문헌(참조: Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978)에 기술되어 있다. 리포솜내로의 캡슐화는 예컨대, 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877호에 기술되어 있다. 고분자에 단백질의 컨쥬게이션은 예컨대, 리크하이트(Likhite)의 미국 특허 제 4,372,945호 및 아르모르(Armor) 등의 미국 특허 4,474,757호에 기술되어 있다.
각각의 백신 투여량에서 단백질의 양은 전형적인 백신접종자에게 현저하게 불리한 부작용을 일으키지 않으면서 면역방어적 반응을 유도시키는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 사용되는 특이적인 면역원에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 각각의 투여량은 1 내지 1000 mg의 단백질, 바람직하게는 2 내지 100 mg, 가장 바람직하게는 4 내지 40 mg을 함유할 것으로 생각된다. 특정 백신을 위한 최적의 양은 피검자에서의 항원 역가 및 그 밖의 반응의 관찰과 관련된 표준 연구에 의해 평가될 수 있다. 초기 백신접종 이후, 피검자는 약 4주내에 추가접종 받을 수 있다. 특히 영아의 경우, 3회 투여가 바람직할 수 있다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 또는 RSV 감염에 걸리기 쉬운 사람의 백신접종에 추가적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 감염에 걸린 환자를 면역치료적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 일면에서 본원에 기술한 바와 같이 백신 제형의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 항원 및 RSV 항원을 Th-1 유도성 애쥬번트, 예컨대 3D-MPL 및 바람직하게는 담체, 예컨대 백반과 혼합하는 것을 포함한다.
원하는 경우, 다른 항원들을 (임의의 편리한 순서로) 첨가하여 본원에 기술하는 바와 같이 다가의 백신을 제공할 수 있다.
본 발명은 단백질 D에 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류를 RSV 항원 및 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하는 것을 포함하여 백신 조성물을 생성시키는 방법을 추가로 제공한다.
하기 실시예에서, RSV 백신 후보물질인 FG와 화학적으로 이용가능한 마우스 모델내의 23가의 폐렴구균성 백신(Wyeth-Lederle로부터의 Pneumune)과의 조합의 효 과에 대한 평가를 수행하였다. 본 모델에서 백신을 물리적으로 혼합하고 동일 부위에 주입시키는 조합된 면역화를 시험하였다. 이러한 연구의 결과는 상호 상승작용을 보여주었고, 두 백신 모두에 대한 특정 면역학적 마커에 대한 향상된 반응을 초래하였다.
실시예들은 마우스 모델에서 RSV 백신 후보물질과 11가의 컨쥬게이션된 폐렴구균 백신과의 조합된 백신을 설명한다. 본 연구는 대부분의 면역학적 마커들에 대해, 항원들간에 어떠한 간섭도 없거나 단지 소수의 간섭이 존재하지만, 실제로 일부 면역학적 마커의 경우에는 향상된 반응이 존재하고 따라서 상승 효과가 존재함을 증명한다. 주목할 만 하게도, 컨쥬게이션된 폐렴구균성 다당류의 단백질 D 성분에 대한 면역 반응에서 어떠한 감소도 없었다.
실시예 1 - 조합된 RSV + 23가 폐렴구균 백신의 평가
1. 제형화 방법:
H2O-희석된 FG 항원(2㎍:1/10 HD)을 Al(OH)3 50㎍상에 15분 동안 흡착시켰다. 사용시에, 3D-MPL 5㎍을 100 nm 입자의 현탁물로서 상기 제조물(preparation)에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음에 제형물을 10 배 농축된 PBS pH 7.4를 사용하여 완충시켰다. 사용시에, 상기 완충 용액을 첨가한 지 15분 후에 23가의 폐렴구균성 백신(11.5㎍:1/50 HD)을 첨가하였다. FG가 없는 그룹의 경우에 있어서 동일한 제형 순서를 따라서 우선 3D-MPL을 Al(OH)3상에 흡착시킨후 23가의 폐렴구균 백신을 첨가하였다. 농축된 완충액을 첨가한 지 15분 후에 23가의 폐렴구균성 백신 페녹시에탄올(5mg/ml)을 보존제로서 제형물에 첨가하였다.
모든 인큐베이션을 교반하에 실온에서 수행하였다. 제 1 주입 전에 완결된 제형물을 2회 주입을 위해 7일 성숙화시키는 동시에 제형물을 제조하였다.
제형 성분의 조성:
성분 회분 번호 농도(㎍/ml) 완충액
FG 54/023 265 10PO4, 150NaCl pH6.8
Al(OH)3 96A0089 10380 H2O
23가 뉴뮨(Pneumune) 1150 염수
3D-MPL 109 964 H2O
2. 면역화 프로토콜:
10마리 마우스로 구성된 11개 그룹을 다양한 제형물을 사용하여 제 0일 및 제 28일에 상이한 경로(50㎕)에 의해 면역화시켰다( 표 1 참조). 그룹 7 및 그룹 8을 비내 경로(60㎕)에 의해 살아있는 RSV를 사용하여 면역화시켰다. 혈청을 제 28일(28 d 포스트 I) 및 제 42일(14 d 포스트 II)에 수득하였다. 제 42일에, 그룹 4, 5, 6, 7, 8, 9의 5마리 마우스 뿐만 아니라 나이브(naive) Balb/c 마우스(그룹 1, 면역화되지 않음) 5마리로부터 비장 및 결절 세포를 수득하였다.
3. 체액성 반응.
3.1. 항-FG 항체:
모든 체액성 반응 결과를 10마리 마우스/그룹에 대해 수행하였고(항-FG 역가에 대한 개별적인 반응 및 이소타입 프로파일을 위해 푸울링된 혈청) 세포성 반응 결과를 5마리 마우스/그룹에 대해 제시하였다.
개별적인 혈청을 제 1 면역화 후 28일 및 제 2 면역화 후 14일에 수득하였고 FG 특이적인 Ig 항체의 존재 및 이들의 이소타입(IgG2a, IgG1) 분포에 대해 시험하였다.
검정 프로토콜은 다음과 같다: 웰 당 FG 54/023(1㎍/ml) 50㎕를 사용하여 4℃에서 밤새 코팅하고, 37℃에서 1시간 포화시키고, 37℃에서 1시간 30분 동안 혈청과 함께 인큐베이션시키고, 37℃에서 1시간 30분 동안 항-마우스 Ig 바이오틴 1/1500(또는 IgG1, IgG2a 바이오틴 1/1000)과 함께 인큐베이션시키고, 37℃에서 30분 동안 스트렙타-퍼옥시다제 1/2500과 함께 인큐베이션시키고, 실온에서 15분 동안 OPDA Sigma와 함께 인큐베이션시키고, H2SO42N을 사용하여 정지시켰다.
OD를 490nm에서 모니터링하고 표준 곡선을 참고로 하여 역가를 소프트맥스프로(Softmaxpro)(4 변수 방정식)에 의해 결정하고 EU/ml로 표현하였다.
14d 포스트 II에서 수득된 개별 혈청을 다음의 프로토콜을 사용하여 중화 항체의 존재에 대해 시험하였다: 혈청(최초 희석 1/25)의 연속 2배 희석물 50㎕를 이중으로 96 웰 플레이트내에 300 pfu의 RSV-A/Long(Lot 14) 및 기니아 돼지 보충물(1/25 희석)을 함유하는 혼합물 50㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 105 세포/ml의 HEp-2 세포 현탁물 100㎕를 각각의 웰에 첨가하고 5% CO2의 존재하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다.
그런 다음 상층액을 흡인시키고, WST-1 제조물(희석 1/12.5) 100㎕를 첨가한 후에 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 24시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. OD를 595nm에서 모니터링하고 역가를 선형 회귀(y=a.logx + b)에 의해 결정하였다: 역가 = 감염되지 않은 세포에 대해 관찰된 최대 OD의 50% 감소를 제공하는 혈청 희석.
시험에서의 대조군은 임의로 선택된 사람 혈청의 푸울 및 산도글로불린(lot 069, 산도즈(Sandoz)에 의해 생성된 일반적인 사람 IgG)이 포함된다.
3.2 항-폐렴구균성 다당류 IgG:
폐렴구균성 다당류 타입 6B, 14, 19F 및 23F에 대한 뮤린 IgG를 CDC 프로토콜로부터 적합된 방법으로 ELISA에 의해 측정하였다. 이 프로토콜에는 CPS 항체의 측정을 억제시키기 위하여 혈청에 가용성 세포벽 다당류(CPS)를 첨가하는 것을 포함한다. CPS는 모든 폐렴구균에 공통적인 테이코산을 가지는 포스포릴 콜린이다. 이것은 캡슐하에 존재하고, 이에 대한 항체는 약한 방어성 일 뿐이다. CPS는 캡슐 다당류에 연결되어 있기 때문에, ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 사용된 정제된 캡슐 다당류를 오염시키는 0.5 내지 1% CPS가 보통 존재한다. 따라서, CPS 항체의 측정은 캡슐 다당류에 관한 ELISA 해석 결과를 혼란시킬 수 있다.
ELISA는 타입 6B, 14, 19F 및 23F 각각을 위한 탄산염 완충액중에 20, 5, 10 및 20㎍/ml로 코팅된 다당류를 사용하여 수행하였다. 혈청을 희석시키지 않은 혈청중의 500 ㎍/ml CPS의 등가물과 예비-혼합시키고, ELISA 플레이트에 첨가하기 전에 30분 동안 인큐베이션하였다. 뮤린 IgG를 1:2000 희석으로 잭슨 이뮤노랩(Jackson ImmunoLab) 염소 항-뮤린 IgG(H+L) 퍼옥시다제를 사용하여 검출하였다. 역가 곡선을 소프트맥스 프로에 의한 기호논리학적 로그 비교를 사용하여 각각의 혈청형에 대한 공지된 농도의 다당류 특이적인 뮤린 모노클로날 항체에 대해 참조하였다. 사용된 모노클로날은 타입 6B, 14, 19F 및 23F에 대해 각각 HASP4, PS14/4, PS19/5 및 PS23/22였다. 이용가능한 혈청의 제한된 양으로 인해, 푸울링된 혈청(pooled sera)을 시험하였고, 따라서 통계학적 분석은 이용할 수 없었다.
4. 세포성 반응
비장 및 림프절 세포를 FG-특이적 세포성 반응 분석을 위한 음성 대조군으로서 사용하기 위해 그룹 4 내지 9 및 나이브 마우스(그룹 1)로부터 14d 포스트 II에 단리하였다. 샘플을 FG-특이적 림프증식 및 사이토카인(IFN-γ + IL-5) 분비 둘 모두에 대해 분석하였다.
증식을 FG(3배 희석) 10 내지 0.03 ㎍/ml을 포함하는 배지 200㎕가 담긴 96 웰 플레이트에서 웰당 4x105 세포를 96시간 동안 인큐베이션시킨 후에 평가하였다. 3H-티미딘을 혼입(incorporation)시키는 경우에, FG 특이적 증식을 본 발명자들의 표준 프로토콜에 따라 측정하였다. 사이토카인 유도를 FG(10배 희석) 10㎍ 내지 0.01㎍을 포함하는 배지 1 ml이 담긴 24 웰에서 웰당 2.5x106 세포를 96시간 동안 인큐베이션시킨 후에 평가하였다. 그런 다음 상층액을 수집하여 본 발명자들의 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 유도된 IFN-γ 및 IL-5의 양을 결정하였다.
1. 그룹들.
10개의 그룹은 23가의 백신 또는 FG 또는 수산화 알루미늄 및 3D-MPL 또는 수산화 알루미늄과 함께 제형화된 둘의 조합물을 함유하는 다양한 제형물로 2회 면역화되었다. 그룹 1은 CMI 연구를 위한 대조군으로 구성되었다. 그룹 2 및 그룹 9는 23가의 폐렴구균성 백신의 평가를 위해 문헌에서 사용된 복강내 면역화, 및 IM 면역화시에 23가의 폐렴구균성 백신에 대한 면역원성 평가를 하게 할 것이고, 그룹 3 및 그룹 10은 그룹 2 및 그룹 9와 유사하되, 23가의 폐렴구균성 백신이 백반/3D-MPL을 사용하여 제형화되는 것이 예외적이다. 또한 그룹 2 및 그룹 3는 FG 백반/3D-MPL과 조합되지 않는 경우 23가의 폐렴구균성 백신에 대한 백반/3D-MPL의 영향에 대한 대조군으로 구성되었다. 그룹 4는 FG 백반/3D-MPL과 23가의 폐렴구균성 백신의 조합의 IM 면역화시에 유도된 면역 반응의 평가가 가능하도록 할 것이다. 그룹 5 및 그룹 6는 23가의 폐렴구균성 백신과 조합되지 않는 경우 FG에 대한 백반/3D-MPL의 영향에 대한 평가를 위한 대조군으로 구성되었다. 살아있는 RSV 면역화는 천연 RSV IN 감염시에 유도된 면역 반응을 위한 대조군이었다(그룹 7). 마지막으로, 그룹 9는 백반/3D-MPL 단독의 영향에 대한 대조군이다.
표 1
그룹 항원 애쥬번트 경로
1 없음 없음
2 23가의 뉴뮨(11.5㎍) 없음 IM
3 23가의 뉴뮨(11.5㎍) 백반/3D-MPL IM
4 23가의 뉴뮨(11.5㎍)/FG(2㎍) 백반/3D-MPL IM
5 FG(2㎍) 백반/3D-MPL IM
6 FG(2㎍) 백반 IM
7 살아있는 RSV(Lot 14: 105PFU) 없음 IN
8 없음 백반/3D-MPL IM
9 23가의 뉴뮨(11.5㎍) 없음 IP
10 23가의 뉴뮨(11.5㎍) 백반/3D-MPL IP
2. 체액성 반응.
2.1. 항-FG 항체
28 d 포스트 I 및 14 d 포스트 II에서 특이적인 항-FG 항체의 분석은 FG 백반/3D-MPL/23가에 대해 관찰된 다소 높은 역가와 함께 FG 백반/3D-MPL/23가(그룹 4) 또는 FG 백반/3D-MPL 단독(그룹 5)를 사용한 면역화시에 유사한 항체 반응의 유도를 보여주었다( 도 1 ). FG 백반(그룹 6)을 사용한 면역화는 두 시점 모두에서 예상되는 낮은 항체 역가를 유도시켰다. 통계적인 분석은 실제로 28 d 포스트 I 및 14 d 포스트 II에서 그룹 4 내지 그룹 6에 의해 유도된 항-FG Ig 역가사이에 현저한 차이가 있음을 보여주었다.
결과
항-RSVA 중화 항체의 분석( 도 2 )은 항-FG Ig 반응에 대해 관찰된 바와 유사한 프로파일을 나타내었다.
상기 결과에 기초하여, 항-FG/항 RSV 중화 항체 비(28d 포스트II)를 계산하였고 FG 백반/3D-MPL/23가, FG 백반/3D-MPL 및 FG 백반의 비가 RSV IN 그룹에 의해 유도된 비와 동등함이 밝혀졌다( 표 2 ).
표 2
Figure 112005017215612-pct00045
개별적인 항-FG Ig, IgG1 및 IgG2a 이소타입 역가에 대한 철저한 통계학적 분석을 통해 FG 백반/3D-MPL에 23가의 백신을 첨가하는 것이 Ig 및 IgG1 반응을 유지시키고 IgG2a 반응을 현저하게 증가시킴을 밝혔다( 도 3A ). 또한, 상기 분석을 통해 IgG1/IgG2a 비 및 FG 백반/3D-MPL/23가 및 FG 백반/3D-MPL의 IgG1 역가가 FG 백반과 현저하게 다름에도 불구하고 유사하였음을 밝혔다( 도 3B ). 세 가지 제형물은 이들의 IgG2a 역가에서 상당한 차이를 가지고 있었다.
2.2. 항-폐렴구균성 다당류 IgG
마우스 및 그 밖의 설치류들은 다당류 면역원에 대한 IgM을 생성할 수 있지만, 이들은 다당류에 대한 IgG를 정상적으로 생성하지 못한다. 그 이유는 이들의 면역계에 다당류와 같은 T-독립성 항원에 대한 이소타입 스위칭을 유도하기 위한 신호가 결여되어 있기 때문이다. 따라서, 마우스에서의 항-다당류 IgG의 측정은 향상된 T-의존성 면역 반응의 유도에 대한 민감한 시험이다.
23개의 다당류 중 4개에 대해 유도된 IgG의 농도를 표 3 에 제시하였다. 본 발명자들이 다른 실험에서 알게 된 바와 같이, 어떠한 IgG도 다당류 타입 6B 및 23F에 대해 생성되지 않았다. 그러나, 타입 14 및 19F에 대해 생성된 IgG를 측정할 수 있었다.
23가의 백신을 포함하고 있지 않은 그룹들은 다당류 14 및 19F에 대한 검출가능한 IgG를 보여주었고, 측정의 특이성을 확인하였다.
면역화의 경로에 대한 비교를 통해 23가의 백신이 애쥬번트로서 백반/3D-MPL과 함께 처리되는 경우, 타입 19F에 대해 근육내 경로가 복강내 경로보다 더 우수한 반면, 그 역은 타입 14에 대해 사실임이 밝혀졌다. 단순한 23가에 대해서는, 현저한 차이가 있는 것 같지 않았다.
23가 + 백반/3D-MPL은 23가 단독과 비교할 때 IM 및 IP 면역화 경로 둘 모두에서 타입 14 및 19F에 대한 IgG를 더 많이 유도시켰다. 그러나 FG와 조합되는 경우, IgG 반응은 감소하였다. 그럼에도 불구하고, 23가 + FG/백반/3D-MPL에서 19F에 대한 IgG 반응은 23가 단독에 의해 유도된 경우보다 여전히 컸으며(그룹 3 및 그룹 4 비교), 타입 14에 대한 반응은 향상되었다.
표 3
Figure 112001026882393-pct00002
3. 세포성 반응.
유도된 FG-특이적 림프증식은 비장 세포 및 림프절 세포 둘 모두에서 FG 백반/3D-MPL +/- 23가 및 FG 백반 사이에 어떠한 차이도 나타내지 않았다.
IL-5 및 IFN-γ의 생성에 대한 분석은 FG 백반/3D-MPL과 23가 백신의 혼합물이 IFN-γ의 생성을 방해하지 못하지만 IL-5의 생성을 다소 증가시킬 수 있었음을 시사한다( 도 4 ). 이러한 관찰을 시험관내 재자극을 위해 사용된 FG의 2회 투여량(10 및 1㎍ FG/ml)에서 관찰된 IFN-γ/IL-5 비에서 2 내지 8배 차이에 의해 확정하였다. 그러나, FG 백반/3D-MPL/23가 백신은 FG 백반보다 훨씬 높은 IFN-γ/IL-5 비를 여전히 유도시켰다.
결론
유도된 항-FG Ig 특이적 및 항 RSVA 중화 항체 역가에 대한 분석을 통해 23가의 폐렴구균성 백신과 FG 백반/3D-MPL의 조합이 FG 백반/3D-MPL 단독을 사용하여 관찰된 반응의 유도를 방해하지 못함이 밝혀졌다. 또한 항-FG/항-RSVA 중화 항체 비에 의해 측정된 반응의 질은 변하지 않았고 RSV 실제 IN 경로를 사용하는 천연 감염시에 관찰된 비에 가까웠다.
유도된 FG 특이적 세포 매개된 반응에 대한 분석은 FG 백반/3D-MPL에 23가 백신의 첨가가 비장 세포 및 림프절 세포 둘 모두에서 림프증식의 유도에 영향을 미치지 않음을 시사하였다. 또한, 전형적으로 FG 백반/3D-MPL을 사용하여 관찰된 Th1 타입 반응의 유도는 FG 특이적 비장 및 림프절 세포의 시험관내 사이토카인 생성에 의해 측정된 바와 같이 23가의 첨가에 의해 방해되지 않으며 FG 특이적 이소타입 항체 분포를 분석하는 경우 향상되는 것 같다. 실제로, Th1 반응의 마커인 IFN-γ의 생성은 FG 백반/3D-MPL에 23가 백신의 첨가시에 변화하지 않은 채로 남아있는 반면 Th2 반응의 마커인 IL-5의 생성은 단지 약간만 증가하였다. 흥미롭게도, FG 백반/3D-MPL에 23가 백신의 첨가는 Th1 반응의 마커인 IgG2a 항체의 생성을 현저하게 증가시키지만, IgG1(Th2 반응의 마커) 또는 IgG1/IgG2a 반응 둘 모두에 영향을 미치지 않았다.
따라서 FG 백반/3D-MPL 및 23가 백신의 조합은 FG 백반/3D-MPL을 사용하여 관찰된 반응에 영향을 미치지 않으며 따라서 FG 백반/3D-MPL 제형 대 FG 백반과 관련된 장점, 즉 높은 일차 및 이차 중화 항체 반응 및 IgG2a 항체의 존재에 의해 측정되는 바와 같이 Th1 반응 및 고농도의 IFN-γ에 의한 유도가 유지된다.
FG 백반/3D-MPL과 23가 뉴뮨의 조합은 시험된 4개의 다당류 중 2개에서 증가된 IgG 생성을 초래하였지만, 타입 19F의 경우에 가장 극적이었다. 백반/3D-MPL과 함께 23가 단독은 가장 높은 IgG 농도를 산출하였다.
결론적으로, RSV FG 백반/3D-MPL과 23가 폐렴구균 백신의 유리한 조합이 존재하며 두 백신 모두가 특정 면역학적 시험에서 향상을 보여주고, 임의의 시험에서 억제되지 않는다는 점에서 두 백신 모두에 대한 상승 효과가 존재한다.
실시예 2 - 조합된 RSV + 11가 컨쥬게이션된 폐렴구균 백신의 평가
조합 백신을 콜레스테롤 함유 리포솜, 또는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드(백반을 포함하거나 포함하지 않음)에서 3D-MPL + 백반, 3D-MPL + QS21을 사용하여 평가하였다.
또한 단백질 D(PD) 담체에 대한 IgG 면역 반응상의 조합 백신의 영향을 평가하였다.
PD는 타입을 결정할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae) B(NTHi) 감염에 대한 방어성 항체이다. 그러므로, PD-컨쥬게이션된 폐렴구균 PS와 FG를 조합시키는 것은 3가지 병원체에 대한 효과적인 방어를 제공할 수 있다: 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), RSV 및 타입을 결정할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae) B. Th1 타입 면역성은 NTHi에 대한 방어와 관련있을 것이다. 그러므로, Th1 반응의 우수한 지시자인 항-PD IgG2a 항체를 또한 시험하였다.
본 실시예에서 사용된 11가 후보 백신에는 EP 72513호에 기술된 바와 같이 필수적으로 포함되는 캡슐 다당류 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F가 포함된다. 각각의 다당류를 CDAP 화학(WO 95/08348)을 사용하여 활성화 및 유도체화시키고 단백질 담체와 컨쥬게이션시켰다. 혈청형 3(이의 점도를 감소시키기 위해 크기가 감소됨)을 제외한 모든 다당류를 이들의 본래 형태로 컨쥬게이션시켰다.
단백질 담체는 타입을 결정할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae)로부터의 재조합 단백질 D(PD)였으며, 대장균내에서 발현되었다.
1. 제형화 방법:
제형물을 제 1 주입 12일 전에 제조하였다.
1.1. QS21, 3D-MPL 기재 제형물
필요한 경우, 항원(FG(2㎍) 및/또는 비흡착된 PS 컨쥬게이트(0.5㎍/원자가))를 10배 농축된 PBS pH 7.4 및 H2O의 혼합액으로 희석하였다. QS21(5㎍)을 1/5의 QS21/콜레스테롤 중량비로 MPL을 함유하는 리포솜과의 혼합물로서 첨가하였다(DQ/3D-MPLin로서 언급됨). 30분 후에 티오메르살 1㎍/ml을 보존제로서 첨가하였다.
1.2. CpG 또는 3D-MPL 기재 제형물
필요한 경우, Al(OH)3를 항원(FG(2㎍) 및/또는 비흡착된 PS 컨쥬케이트(0.5㎍/원자가))를 첨가하기 전에 물로 희석하였다. 30분 동안 흡착시킨 후에, MPL 또는 CpG를 첨가하였다. 30분 후에 제형물을 10 배 농축된 PO4-NaCl pH 6.8로 완충시켰다. 그런 다음 티오메르살 1mg/ml 또는 페녹시 5mg/ml을 보존제로서 첨가하였다.
모든 인큐베이션을 교반하에 실온에서 수행하였다. 제 1 주입 전에 완결된 제형물을 2회 주입을 위해 7일 성숙시키는 동시에 제형물을 제조하였다.
1.3. 제형 성분의 조성:
성분 AG 또는 IMST 농도(㎍/ml) AL+++ 농도(㎍/ml) 완충액
FG 484 PO4/NaCl 10/150mM pH 6.8
임상적 11가 비흡착
PS1 144 NaCl 150mM pH6.1
PS3 149 NaCl 150mM pH6.1
PS4 125 NaCl 150mM pH6.1
PS5 135 NaCl 150mM pH6.1
PS6b 206 NaCl 150mM pH6.1
PS7 168 NaCl 150mM pH6.1
PS9 175 NaCl 150mM pH6.1
PS14 180 NaCl 150mM pH6.1
PS18 127 NaCl 150mM pH6.1
PS19 140 NaCl 150mM pH6.1
PS23 158 NaCl 150mM pH6.1
QS21 2000 H2O
MPL 1019 H2O
CpG 5000 H2O
SUV DOPC 40000 Chol 10000 MPL 2000 PBS pH7.4
AlPO4 1000 NaCl 150mM pH6.1
Al(OH)3 10380 H2O
2. 면역화 프로토콜:
10 마리의 마우스로 구성된 14개 그룹을 다양한 제형물을 사용하여 제 0일 및 제 28일에 IM 경로(50㎕)에 의해 면역화시켰다( 결과 절 참조). 혈청을 42일(14d 포스트 II)에 수득하였다. 42일에 비장 세포를 FG 항원으로 면역화된 그룹 중 5마리 마우스 뿐만 아니라 5마리 나이브 Balb/c 마우스로부터 취하였다.
3. 체액성 반응.
3.1. 항-FG 항체:
모든 체액성 반응 결과를 10마리 마우스/그룹에 대해 수행하였고(항-FG Ig, IgG1 및 IgG2a에 대한 개별 반응 및 중화 역가) 세포성 반응 결과들을 푸울상의 5마리 마우스/그룹에 대해 제시하였다.
개별적인 혈청을 제 2 면역화시킨지 14/15일 후에 수득하였고 FG 특이적 Ig 항체의 존재 및 이들의 이소타입(IgG2a, IgG1) 분포에 대해 시험하였다. 검정 프로토콜은 다음과 같았다: 웰당 정제된 FG DFGP107(1㎍/ml) 50㎕와 함께 4℃에서 밤새 코팅시키고, 37℃에서 1시간 포화시키고, 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션시키고, 37℃에서 1시간 30분 동안 항-마우스 Ig 바이오틴 1/1500(또는 IgG1, IgG2a 바이오틴/1000)과 함께 인큐베이션시키고, 37℃에서 30분 동안 스트렙타-퍼옥시다제 1/1500과 함께 인큐베이션시키고, 실온에서 20분 동안 OPDA Sigma와 함께 인큐베이션키고, H2SO42N을 사용하여 중지시켰다.
OD를 490nm에서 모니터링하였고 역가를 표준 곡선을 참고로 하여 소프트맥스프로(4 변수 방정식)에 의해 결정하고 EU/ml로 표현하였다.
14d 포스트 II에 수득된 개별 혈청을 다음 프로토콜을 사용하여 중화 항체의 존재에 대해 시험하였다: 혈청(최초 희석 1/25)의 연속 2배 희석물 50㎕를 이중으로 96웰 플레이트중의 RSV-A/Long(Lot 14) 3000 pfu 및 기니아 돼지 보충물(1/25 희석)을 함유하는 혼합물 50㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음 105 세포/ml의 HEp-2 세포 현탁물 100㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다.
그런 다음 상층액을 흡인시키고, WST-1 제조물(희석 1/15) 100㎕를 첨가한 후에 플레이트를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 24시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. OD를 490nm에서 모니터링하였고 역가를 선형 회귀(y=a.logx + b)에 의해 결정하였다: 역가 = 감염되지 않은 세포에 대해 관찰된 최대 OD의 50% 감소를 제공하는 혈청 희석.
3.2. 항-폐렴구균 다당류 IgG:
폐렴구균 다당류 타입 3, 6B, 7F, 14, 19F 및 23F에 대한 뮤린 IgG를 CDC 프로토콜로부터 적용된 방법으로 ELISA에 의해 측정하였다. 이 프로토콜에는 혈청에 가용성 세포벽 다당류(CPS)를 첨가하여 CPS 항체의 측정을 억제시키는 것이 포함된다. CPS는 모든 폐렴구균에 공통적인 테이코산을 함유하는 포스포릴-콜린이다. 이것은 캡슐하에 존재하며, 이에 대한 항체는 약한 방어성일 뿐이다. CPS는 캡슐 다당류에 결합되어 있기 때문에 통상적으로 ELISA 플레이트를 코팅하기 위해 사용되는 정제된 캡슐 다당류를 오염시키는 0.5% 내지 1% CPS가 존재한다. 따라서, CPS 항체의 측정은 캡슐 다당류와 관련하여 ELISA 결과 해석을 혼란시킬 수 있다.
ELISA를 타입 6B, 7F, 14, 19F 및 23F 각각에 대해 PBS 완충액 중 20, 5, 5, 20 및 20 ㎍/ml로 코팅된 다당류를 사용하여 수행하였다. 혈청을 희석하지 않은 혈청중의 500㎍/ml CPS의 등가물과 미리 혼합하였고 ELISA 플레이트에 첨가하기 전에 30분 동안 인큐베이션시켰다. 뮤린 IgG를 1:5000 희석에서 잭슨 이뮤노랩 염소 항-뮤린 IgG(H+L) 퍼옥시다제를 사용하여 검출하였다. 역가 곡선을 소프트맥스 프로에 의한 기호논리학적 로그를 사용하여 각각의 혈청형에 대해 공지된 농도의 다당류 특이적인 뮤린 모노클로날 항체에 대해 참조하였다. 사용된 모노클로날 항체는 타입 6B, 7F, 14, 19F 및 23F에 대해 각각 HASP4, PS7/19, PS14/4, PS19/5 및 PS23/22이었다.
혈청형 3의 경우, 유사한 ELISA를 수행하되 면역플레이트를 우선 메틸화된 사람 혈청 알부민으로 코팅시켜(PBS중 1㎍/ml, 2시간, 37℃) PS3 코팅을 향상시켰다(PBS중 2.5 ㎍/ml, 밤새, 4℃). 모노클로날 항체 PS3/6을 표준 참조로서 사용하였다.
3.3. 항-PD 혈청 IgG의 ELISA 용량
Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS중에 희석시킨 2㎍/ml PD 항원 100㎕/웰(플레이트의 B열 내지 H열), 또는 PBS중의 1㎍/ml 정제된 염소 항-마우스 Ig(잭슨) 100㎕(A열)를 사용하여 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 그런 다음, 순수한 마우스 IgG(잭슨)의 연속 2배 희석물(PBS 트윈20 0.05% 완충액, 웰당 100㎕)을 표준 곡선(1㎍/ml로 시작하고 A열에 놓음)과 같이 첨가하고 혈청 샘플(1/20 희석으로 시작하고 B열 내지 H열에 놓음)을 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그런 다음, PBS 트윈20 0.05% 완충액중에 1/5000 희서된 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG(잭슨)를 교반하에 20℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 수 회 세척한 후에, 플레이트를 리벨레이션(revelation) 완충액(시트레이트 완충액 100mM pH 4.5중의 OPDA 0.4 mg/ml(Sigma) 및 H2O2 0.05%) 100㎕/웰을 사용하여 암 조건하에 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 리벨레이션을 HCl 1N 50㎕/웰을 첨가함으로써 중지시켰다. 광학 밀도를 이맥스 이뮤노리더(Emax immunoreader)(Molecular Devices)를 사용하여 490 및 620nm에서 판독하였다. 항체 역가를 소프트맥스프로 소프트웨어를 사용하는 4 변수 수학적 방법에 의해 계산하였다.
3.4. 항-PD 혈청 IgG1, 2a 및 2b의 ELISA 용량
Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS중에 희석된 2㎍/ml PD 항원 50㎕/웰(플레이트의 B열 내지 H열), 또는 PBS중의 5㎍/ml 정제된 염소 항-마우스 Ig(Boerhinger) 50㎕(A열)를 사용하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 트윈20 0.05% BSA 1% 완충액을 사용하여 포화시킨 후에, 순수한 마우스 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 모노클로날 항체(Sigma)의 연속 2배 희석물(포화 완충액중에, 웰당 50㎕)을 표준 곡선(200ng/ml로 시작하고 A열에 놓음)과 같이 첨가하고 혈청 샘플(포화 완충액중에 1/20 희석으로 시작하고 B열 내지 H열에 놓음)을 교반하에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. NaCl 0.9% 트윈-20 0.05% 완충액을 사용하여 수 회 세척한 후에, 포화 완충액중에 1/1000으로 희석된 비오티닐화된 항-마우스 IgG1 또는 항-마우스 IgG2a 또는 항-마우스 IgG2b 염소 IgG(Amersham)를 교반하에 20℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다(50㎕/웰). 추가로 세척한 후에, 플레이트를 포화 완충액중에 1/1000으로 희석된 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘(Amersham)과 함께 교반하에 20℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다(50㎕/웰). 세척한 후에, 리벨레이션을 암 조건하에 실온에서 20분 동안 리벨레이션 완충액(시트레이트 완충액 100mM pH 4.5중의 OPDA 0.4 mg/ml(Sigma) 및 H2O2 0.05%) 50㎕/웰을 첨가함으로써 완료하였다. 리벨레이션을 HCl 1N 50㎕/웰을 첨가함으로써 중지시켰다. 광학 밀도를 이맥스 이뮤노리더(Molecular Devices)를 사용하여 490 및 620nm에서 판독하였다. 항체 역가를 소프트맥스프로 소프트웨어를 사용하는 4변수 수학적 방법에 의해 계산하였다.
4. 세포성 반응
비장 세포를 FG로 면역화된 모든 그룹 뿐만 아니라 FG-특이적인 세포성 반응 분석을 위한 음성 대조군으로서 사용하기 위한 나이브 마우스로부터 14d 포스트 II에 단리하였다.
샘플을 FG-특이적인 림프증식 및 사이토카인(IFN-g + IL-5) 분비 둘 모두에 대해 분석하였다.
증식을 FG(3배 희석) 10 내지 0.03 ㎍/ml을 함유하는 배지 200㎕가 담긴 96웰 플레이트의 웰당 4x105 세포를 인큐베이션시킨지 96시간 후에 평가하였다. 3H-티미딘을 혼입시킨 경우에, FG 특이적 증식을 본 발명자들의 표준 프로토콜에 따라 측정하였다. 사이토카인 유도를 FG(10배 희석) 10㎍ 내지 0.01㎍을 함유하는 배지 1ml이 담긴 24웰의 웰당 2.5x106 세포를 인큐베이션시킨지 96시간 후에 평가하였다. 그런 다음 상층액을 본 발명자들의 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 유도된 IFN-γ 및 IL-5의 양을 결정하기 위해 수집하였다.
결과
1. 그룹들.
14개 그룹을 11가 컨쥬게이션된 백신 또는 FG 또는 백반 3D-MPL, CpG, Cpg 백반 또는 백반과 함께 제형화된 둘 모두의 조합을 포함하는 다양한 제형물로 28일 간격으로 2회 IM 면역화시켰다.
제 1절 내지 제 4절에 제시된 결과들을 논의하였다. 각각의 절에서, FG 백반의 결과를 우세하게 Th2-타입 애쥬번트와의 특이적인 RSV 면역 반응의 유도에 대한 대조군으로서 포함시켰다. 또한 나이브 마우스 그룹을 FG-특이적인 CMI 분석의 내부 대조군으로서 사용하기 위해 첨가하였다.
제 1절:
그룹 항원 애쥬번트 경로
A PS-PD(0.5㎍) 백반 3D-MPL IM
B FG(2㎍) 백반 3D-MPL IM
C PS-PD(0.5㎍)+FG(2㎍) 백반 3D-MPL IM
D FG(2㎍) 백반 IM
E 없음 없음 IP
제 2절:
그룹 항원 애쥬번트 경로
A PS-PD(0.5㎍) 3D-MPL+QS21 IM
B FG(2㎍) 3D-MPL+QS21 IM
C PS-PD(0.5㎍)+FG(2㎍) 3D-MPL+QS21 IM
D FG(2㎍) 백반 IM
E 없음 없음 IP
제 3절:
그룹 항원 애쥬번트 경로
A PS-PD(0.5㎍) CpG(50㎍) IM
B FG(2㎍) CpG(50㎍) IM
C PS-PD(0.5㎍)+FG(2㎍) CpG(50㎍) IM
D PS-PD(0.5㎍) CpG(50㎍)백반 IM
E FG(2㎍) CpG(50㎍)백반 IM
F PS-PD(0.5㎍)+FG(2㎍) CpG(50㎍)백반 IM
G FG(2㎍) 백반 IM
H 없음 없음
제 4절:
제 3절과 동일한 그룹
2. 제 1절:
2.1. 항-FG 항체:
유사한 항-RSVA 중화 항체 수준을 FG/백반/3D-MPL 또는 11가 PS 컨쥬게이트와 조합된 FG/백반/3D-MPL에 의해 유도시켰다( 도 5 ). RSVA 중화 항체의 유도를 위한 약간의 상승 효과가 실제로 두 백신의 조합시에 관찰될 수 있었다.
개별적인 항-FG IgG1 및 IgG2a 이소타입 역가에 대한 분석은 FG/백반/3D-MPL/11가 PS 컨쥬게이트 대 FG/백반/3D-MPL에 의한 유사하거나 다소 낮은 역가의 유도를 보여주었다( 도 6 ).
IgG2a 대 IgG1의 이소타입 비의 분석을 통해 두 백신의 존재가 FG 백반, 인식된 Th2 유도성 애쥬번트에 의해 유도된 비 보다 훨씬 낮게 유지되는 이소타입 비를 변경시키지 않음이 밝혀졌다.
2.2. 항-폐렴구균성 다당류 IgG
다당류 3, 6B, 14, 19F 및 23F에 대한 혈청 IgG 역가를 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정하였다. 유사한 항체 반응을 11가의 PS 컨쥬게이트/백반/3D-MPL 제형 또는 FG 항원으로 보충된 동일한 백신을 사용한 면역화 시에 유도시켰다( 도 7 ). 이러한 결과는 백반 3D-MPL 제형내에서 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트 및 RSV FG 항원이 조합되는 것이 항-폐렴구균성 면역 반응을 감소시키거나 변경시키지 않는다는 것을 증명한 것이다.
2.3. FG-특이적인 세포성 반응.
IL-5 및 IFN-γ의 생성에 대한 분석은 FG/백반/3D-MPL과 11가의 PS 컨쥬게이트와의 혼합물이 이들 사이토카인의 생성의 수준에 어느 정도 영향을 미쳤음을 시사한다( 도 8 ). 그러나 반응의 Th 프로파일의 지시자인 측정된 사이토카인의 비는 상기 혼합물에 의해 영향을 받지 않았으며 FG 백반 제형물, Th2 유도성 애쥬번트에 대해 관찰된 비와 매우 상이하게 남아있었다.
3. 제 2절: DQ/3D-MPLin
3.1. 항-FG 항체:
유사한 항-FG Ig 항체 수준을 FG DQ/3D-MPLin 또는 11가의 PS 컨쥬케이트와 조합된 FG DQ/3D-MPLin에 의해 유도시켰다( 도 9 ).
항-FG Ig 분석에 대해 제시된 바와 같이, FG DQ-MPLin과 11가의 PS 컨쥬게이트와의 혼합시에 항-RSVA 중화 항체 수준상에 어떠한 간섭도 관찰되지 않았다( 도 10 ).
개별적인 항-FG IgG1 및 IgG2a 이소타입 역가에 대한 분석은 FG DQ-MP/11가 PS 컨쥬게이트 대 단순 FG DQ-MP에 의한 유사한 역가의 유도를 보여주었다( 도 11 ). 이소타입 비의 분석을 통해 상기 백신을 조합시키는 것이 FG 백반, 인식된 Th2 유도성 애쥬번트에 의해 유도된 비보다 훨씬 낮게 유지되는 이소타입 비를 변경시키지 않음이 밝혀졌다.
3.2. 항-폐렴구균성 다당류 IgG
다당류 3, 6B, 14, 19F 및 23F에 대한 혈청 IgG 역가를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 측정하였다. 유사한 항체 반응을 11가의 PS 컨쥬게이트/DQ/3D-MPLin 제형물 또는 FG 항원이 보충된 동일한 백신을 사용한 면역화 시에 유도시켰다( 도 12 ). 이러한 결과는 DQ/3D-MPLin 제형물내에서 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트와 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 항-폐렴구균성 면역 반응을 감소시키거나 변경시키지 않음을 증명하였다.
3.3. FG-특이적인 세포성 반응.
처음에 IL-5 및 IFN-γ의 생성에 대한 분석은 FG DQ/3D-MPLin과 11가의 PS 컨쥬케이트와의 혼합물이 INF-γ의 생성의 수준에 어느 정도 영향을 미침을 시사하였다( 도 13 ). 반응의 Th 프로파일의 지시자인 측정된 사이토카인의 비에 대한 추가적인 분석은 FG DQ/3D-MPLin과 11가의 PS 컨쥬게이트와의 혼합물이 Th 프로파일에 어느 정도 영향을 미침을 보여주었다. 그러나, IL-5이상으로 IFN-γ의 우세함은 두 항원과 DQ/3D-MPLin과의 조합에 대해 유지되었고 FG 백반, 인식된 Th2 유도성 애쥬번트에 대해 관찰된 것 보다 훨씬 높게 유지되었다.
4. 제 3절: CpG 및 CpG 백반.
4.1. 항-FG 항체:
유사한 항-FG Ig 항체 수준을 FG CpG 또는 11가의 PS 컨쥬게이트와 조합된 FG CpG에 의해 유도시켰다( 도 14 ). 또한 FG CpG와 11가 PS 컨쥬게이트의 혼합으로 인한 간섭의 부재를 CpG 백반 기재 제형물에 대해 관찰할 수 있었다.
항-FG Ig 분석에 대해 제시된 바와 같이, FG CpG 또는 11가의 PS 컨쥬게이트와 FG CpG의 혼합시에 항-RSVA 중화 항체 수준상에서 어떠한 간섭도 관찰되지 않았다( 도 15 ).
개별적인 항-FG IgG1 및 IgG2a 이소타입 역가에 대한 분석은 FG CpG 또는 FG CpG 백반 제형물에 11가의 PS 컨쥬케이트 첨가시 어떠한 간섭도 나타내지 않았다( 도 16 ).
IgG1/IgG2a 이소타입 비에 대한 추가 분석을 통해 두 백신의 혼합이 FG 백반, Th2 애쥬번트에 의해 유도된 비보다 훨씬 낮게 유지되는 이소타입 비를 변경시키지 않았음을 밝혔다.
4.2. 항-폐렴구균성 다당류 IgG
다당류 3, 6B, 7F, 14, 19F 및 23F에 대한 혈청 IgG 역가를 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정하였다. 본 실시예에서는, 두 가지 애쥬번트 제형물을 시험하였다: CpG 및 백반/CpG. 두 애쥬번트 제형물 모두에 있어서, 항-PS IgG 역가는 적어도 11가의 PS 컨쥬게이트 단독을 사용하여 면역화된 동물과 비교하여 FG가 보충된 11가 PS 컨쥬게이트를 제공한 동물에서 유사하였다( 도 17 ). 이러한 결과는 CpG 또는 백반 CpG 제형물내에서 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트와 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 항-폐렴구균성 면역 반응을 감소시키거나 변경시키지 않음을 증명하였다. 혈청형 7F 및 14에 대한 항원 역가는 CpG 애쥬번트 제형물을 사용하는 FG의 존재하에서 현저하게 향상되었다.
4.3. FG-특이적인 세포성 반응.
IL-5 및 IFN-γ의 생성에 대한 분석은 FG CpG 또는 CpG 백반과 11가 PS 컨쥬게이트의 혼합물이 이들 사이토카인의 생성 수준 또는 IFN-γ/IL-5 비 둘 모두에 영향을 미치지 않음을 시사한다( 도 18 ). 그러므로, Th1 반응의 마커인 IFN-γ의 우세성은 CpG 및 CpG 백반 제형물내에서 두 조합물 모두에 대해 유지된다. IFN-γ 유도는 CpG 애쥬번트 제형물을 사용하는 FG의 존재하에서 향상되었다.
5. 제 4절:
단백질 D(PD) 담체에 대한 IgG 면역 반응상에 PS 컨쥬게이션 제형물내로 FG를 첨가하는 것에 대한 영향을 평가하였다. PD는 타입을 결정할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자(Heamophilus influenzae) B(NTHi) 감염에 대한 방어성 항원이다. Th1 타입 세포-매개된 면역은 아마도 NTHi에 대한 방어와 관련되어 있다. 그러므로, Th1 반응의 우수한 지시자인 항-PD IgG2a 항체를 또한 시험하였다.
5.1. 항-FG 항체:
제 3절 참조
5.2. 항-폐렴구균성 다당류 IgG
제 3절 참조
5.3. FG-특이적인 세포성 반응.
제 3절 참조
5.4. 항-PD 혈청 IgG, IgG1, 2a 및 2b의 ELISA 용량.
도 19 에 제시한 바와 같이, PD 담체에 대한 전체 혈청 IgG 반응은 사용된 애쥬번트(CpG 또는 백반 CpG)가 무엇이든지 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트 제형물내로의 FG의 존재에 의해 현저하게 영향을 받지는 않았다. CpG 또는 백반 CpG PS 컨쥬게이트 제형물을 사용한 백신접종시에 유도된 혈청 항-PD IgG2a 항체의 높은 비율(전체 IgG의 약 30%)은 상기 제형물내로의 FG의 첨가에 의해 변경되지 않았다( 도 20 ). 이러한 IgG2a 반응은 강한 Th1 면역성을 나타내는 것이다. 종합하면, 이러한 결과는 CpG 또는 백반 CpG 제형물내에서 PD-컨쥬게이션된 폐렴구균성 PS과 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 항-PD 면역 반응을 변경시키지 않았음을 증명하였다.
토론 및 결론
제 1절: 백반/3D-MPL
결과는 백반 3D-MPL 제형물내에서 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트와 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 체액성 항-폐렴구균성 면역 반응을 변경시키지 않았음을 증명하였다. 체액성 및 세포성 FG-특이적인 면역 반응의 두 수준 모두는 혼합물에 의해 다소 영향을 받은 것 같지만, 단순 FG 제형물의 Th 프로파일에 영향을 미치지 않았다.
제 2절: DQ/3D-MPLin
결과는 DQ/3D-MPLin을 가진 제형물에서 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트와 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 체액성 항-폐렴구균성 면역 반응 또는 체액성 FG-특이적 반응을 변경시키지 않았음을 증명하였다. 세포성 반응에 대한 추가 분석은 DQ/3D-MPLin을 가진 제형물에서 두 항원 모두의 조합이 IFN-γ의 유도에 어느 정도 영향을 미침을 시사한다. 그러나, 이것은 FG(단독) 제형물에 비해 Th 프로파일에 영향을 미치지 않았다.
제 3절: CpG/CpG 백반
결과는 CpG 또는 백반 CpG를 가진 제형물에서 폐렴구균성 PS 컨쥬게이트와 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 체액성 항-폐렴구균성 면역 반응 또는 체액성 및 세포성 FG-특이적 반응을 감소시키거나 변경시키지 않았음을 증명하였다.
제 4절: CpG/CpG 백반
결과는 CpG 또는 백반 CpG를 가진 제형물에서 PD-컨쥬게이션된 폐렴구균성 PS와 RSV FG 항원을 조합시키는 것이 항-PD 면역 반응을 감소시키거나 변경시키지 않았음을 증명하였다.
결론적으로, 23가의 폐렴구균성 백신과 RSV FG 3D-MPL과의 유리한 조합이 존재하며, 두 백신 모두가 특정 면역학적 시험에서 향상을 보여주고 임의 시험에서는 억제를 보여주지 않는다는 점에서 두 백신 모두에 대한 상승 효과가 존재한다. 상기 제시된 결과로부터 유리한 조합은 Th1 애쥬번트의 세트내에서 RSV FG 항원과 11가 PD-컨쥬게이션된 폐렴구균성 PS를 조합시키는 경우 관찰되었다. 실제로, 시험된 여러 Th1 애쥬번트에 대한 대부분의 면역적인 판독에 있어서, 백신 항원의 조합은 어느 쪽 백신의 기존 특징을 방해하지 않거나, 단지 조금 방해한다(전체 반응에 관한 한 현저하지는 않음). 실시예 1에서 FG를 23가의 백신과 조합시에 관찰되는 바와 같이, 일부 예에서 하나 또는 다른 백신은 특정한 면역학적 시험에서 향상을 보이지 않았다.

Claims (15)

  1. (a) 단백질 또는 펩티드에 컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류; 및 (b) Th1 타입 반응의 우선적인 자극제인 애쥬번트와 결합된 RSV 항원을 포함하는 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류가 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B로부터의 단백질 D 또는 이의 단편, 단백질 D의 지질화된 형체(지단백질 D); 파상풍 독소 및 디프테리아 독소를 포함하는 군으로부터의 단백질에 우선적으로 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 담체를 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, Th1 타입 반응의 우선적인 자극제가 3D-MPL, 3D-MPL(여기서, 3D-MPL의 입자의 크기는 100nm 미만임), QS21, QS21과 콜레스테롤의 혼합물, CpG 올리고뉴클레오티드 및 이들의 조합물을 포함하는 애쥬번트의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, Th1 타입 반응의 우선적인 자극제가 3D-MPL을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, QS21을 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류가 23가 폐렴구균성 다당류 백신임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류가 11가의 컨쥬게이션된 폐렴구균성 다당류 백신임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 항원이 사람 RSV 외피 당단백질임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, RSV 항원이 키메라 FG 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 삭제
  12. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 수산화 알루미늄, 알루미늄 포스페이트 및 토코페롤 및 수중유 에멀젼을 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 항원과 RSV 항원을 Th1 유도성 애쥬번트와 혼합시키는 것을 포함하여, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 백신을 제조하는 방법.
  14. 단백질 D 또는 이의 단편에 컨쥬게이션된 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류를 RSV 항원 및 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합시키는 것을 포함하여, 백신 조성물을 제조하는 방법.
  15. RSV 감염, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 감염, 또는 두 감염 모두를 예방하거나 완화시키는데 유용한 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물.
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