MXPA01010653A - Vacuna de combinacion contra streptococcus pneumoniae y virus sincital respiratorio - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a una composición de vacuna que comprende:(a) uno o más polisacáridos de Streptococcus pneumoniae ya sea conjugados con una proteína o péptido o no conjugados;y (b) un antígeno de RSV en conjunto con un adyuvante, el cual es un estimulador preferencial de una respuesta inmune de tipo Th1. Las vacunas de combinación proporcionadas por la invención son particularmenteútiles para niños y personas de edad avanzada.

Description

VACUNA DE COMBINACIÓN CONTRA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Y VIRUS SINCITAL RESPIRATORIO Esta invención se refiere a formulaciones de vacuna novedosas, los métodos para prepararlas y su uso en profilaxis y terapia. En particular, la presente invención se refiere a vacunas de combinación para su administración a niños y personas de edad avanzada. Más particularmente, la invención se refiere a vacunas de combinación para protección contra Streptococcus pneumoniae e infección o enfermedad por Virus Sincital Respiratorio (RSV). La Streptococcus pneumoniae es una bacteria gram-positiva responsable de una considerable morbidez y mortandad, particularmente en jóvenes y personas de edad avanzada. La colonización expansiva del tracto respiratorio y el oído medio, especialmente en niños pequeños, es la única causa más común de visitas a hospitales en los EU. La bacteria puede volverse invasiva, infectando los pulmones inferiores y originando neumonía. La tasa de neumonía pneumococal en los EU para personas de más de 60 años de edad se estima es de 3 a 8 personas por 100,000. En 20% de los casos, esto conduce a bacteremia y otras manifestaciones tales como meningitis, con una tasa de mortandad cercana a 30% aún con tratamiento antibiótico. Existen 90 serotipos conocidos de Streptococcus pneumoniae que se determinan por las estructuras del polisacárido capsular que rodea la bacteria y éste es su principal factor de virulencia. Se conoce una vacuna pneumococal de valencia 17 (Moniarix) en base a los polisacáridos purificados de los serotipos pneumococales más comúnmente involucrados en la enfermedad invasiva. El método de purificación de estos polisacáridos se expuso en la Patente Europea 72513 B1. Los ensayos de eficacia de la vacuna con vacunas de valencia inferior demostraron un 70 a 90% de eficacia con respecto a los serotipos presentes en la combinación. Los estudios de casos controlados en los EU en personas de >55 años mediante el uso de una vacuna de valencia 14 demostraron 70% de eficacia (Mills, O. F. y Rhoads, G.G; J. Clin. Epidemiol. (1996); Vol. 49(6) 631-636). La inclusión de polisacáridos adicionales (para elaborar una vacuna pneumococal de valencia 23) se aceptaron sobre la base de una respuesta serológica adecuada, aunque existió falta de datos de eficacia clínica (K.R. Brown en 'Combined Vaccines and Simultaneous Administration'. Ed. Williams ef al. , New York Academy of Sciences 1995 pp 241-249). Se ha estudiado la inmunización simultánea con una vacuna pneumococal de valencia 23 (Pnu-Inmune 23-Lederle USA) y vacuna de influenza (Fluarix) (TJ Fletcher, TW Tunnicliffe, K Hammond, K Roberts, JG Ayres; (1997) Br. Med. J._ 314: 1663) y no se observaron diferencias inmunológicas significativas entre la inmunización simultánea ni en inmunizaciones con un mes de separación. Los polisacáridos pneumococales pueden volverse más inmunogénicos en infantes al acoplarlos químicamente a vehículos de proteína. Los ensayos de eficacia clínica se llevan a cabo para verificar este concepto respecto a eficacia en la prevención de Otitis media en infantes. Los infantes cargados con una vacuna pneumococal conjugada de valencia 7 a 11 pueden reforzarse con la vacuna pneumococal polisacárida simple de valencia 23 con objeto de incrementar la cobertura de serotipos y las concentraciones de IgG (Block, SL, JA. Hedrick, R.A. Smith, R.D. Smith, R.D. Tyler, M. Giordani, M.D. Blum, J. Sadoff, E. Keegan; Resumen G-88, 37a ICAAC, Toronto (1997); Anderson, E.L., Kennedy, D.J. , Geldmacher, K.M., Donnelly, J., Mendelman, P: The Journal of Paediatrics, Mayo 1996. Vol. 128, No. 5, Parte I, 649-653). El Virus Sincital Respiratorio Humano (RSV) es un miembro de la familia Paramyxoviridiae de virus y origina enfermedad del tracto respiratorio inferior, particularmente en niños pequeños y bebés. Los reportes recientes sugieren que el RSV es un patógeno importante en adultos, particularmente las personas de edad avanzada. El RSV es un virus desarrollado con un genoma de ácido ribonucleico (ARN) de filamento negativo, no segmentado de 15,222 nucleótidos, que codifica 10 ARNs mensajeros, codificando cada uno un solo polipéptido. Tres de las diez proteínas son proteínas superficiales de transmembrana: las proteínas G (de anexo), F (de fusión) y SH. Dos proteínas son proteínas de matriz de virión (M y M2), tres proteínas son componentes de la nucleocápsida (n, P y L) y dos proteínas son no estructurales (NS1 y NS2). Existen dos cepas antigénicamente distintas de RSV, designadas cepa A y B. La caracterización de cepas de estos grupos ha determinado que las diferencias principales residen en las proteínas G, mientras que se conservan las proteínas F. El Virus Sincital Respiratorio (RSV) ocurre en cambios de estación, elevándose durante el invierno en climas templados y durante la estación lluviosa en climas más calientes (DeSilva LM & Hanlon MG. Virus Sincital Respiratorio: un reporte de un estudio de 5 años en hospital infantil. J Med Virol 1986; 19: 299-305). Cualquiera que sea el área, el RSV tiende a tener un patrón regular y predecible y otros patógenos virales respiratorios que ocurren en los cambios de estación se presentan raramente de manera concurrente (Glezen WP & Denny FW. Epidemiología de enfermedad respiratoria inferior aguda en niños. N. Engl. J. Med. 1973; 288: 498-505). El RSV es una causa importante en enfermedades serias del tracto respiratorio inferior en niños. Se estima que 40-50% de los niños hospitalizados con bronquitis y 25% de los niños hospitalizados con neumonía se hospitalizan como resultado directo de infecciones por RSV. La infección primaria de RSV normalmente ocurre en niños menores de un año de edad; 95% de los niños tienen evidencia serológica de infección pasada a los dos años de edad y 100% de la población la tiene en la edad adulta. En infantes y niños pequeños, la infección progresa desde el tracto respiratorio inferior en aproximadamente 40% de los casos y la presentación clínica es la bronquiolitis o neumonía. Los niños de dos a seis meses de edad se encuentran en mayor riesgo de desarrollar manifestaciones serias de infección con RSV (básicamente falla respiratoria); sin embargo, los niños de cualquier edad con enfermedad cardiaca o pulmonar precedente, infantes prematuros e infantes inmunocomprometidos, se encuentran en riesgo de serias complicaciones también.

La reinfección sintomática ocurre a través de toda la vida y se ha vuelto crecientemente aparente que el RSV es un patógeno importante en adultos también, especialmente para los de edad avanzada. La infección por RSV ciertamente casi se subdiagnostica en adultos, en parte debido a que se considera una infección de niños. En consecuencia, la evidencia del virus en adultos no se considera con objeto de explicar la enfermedad respiratoria. Además, el RSV es difícil de identificar en secreciones nasales de individuos que tienen cierto grado de inmunidad parcial al virus, como lo hacen la gran mayoría de los adultos. Los adultos jóvenes hasta los adultos de edad media típicamente desarrollan un síndrome persistente similar al resfriado cuando se infectan con RSV. Los individuos de mayor edad pueden desarrollar un síndrome respiratorio prolongado que es virtualmente indistinguible de la influenza, son síntomas respiratorios superiores que pueden acompañarse por el involucramiento del tracto respiratorio inferior, incluyendo neumonía. Las poblaciones de edad avanzada en instituciones son de interés particular, debido a que comprenden grandes números de individuos susceptibles agrupados. La difusión de la infección a través de tal población, muchos de los cuales tienen múltiples problemas médicos que pueden predisponerlos a un curso más severo de la enfermedad, es difícil de controlar. Además, los reportes de estudios recientes que evalúan el impacto de la infección de RSV como una causa de hospitalización en adultos y en personas de edad avanzada saludables de comunidades en edificios se enfocan aún más en un importante papel de la infección de RSV en enfermedad severa del tracto respiratorio inferior en estas poblaciones (Dowell SF, Anderson LJ, & Gary Jr HE, eí al. J. Infecí. Dis 1996; 174: 456-462; Falsey AR, Cunningham CK & Barker WH, eí al. J. Infecí Dis 1995; 172: 389-394). Dowell identificó al RSV como uno de los cuatro patógenos más comunes que originan enfermedad severa del tracto respiratorio inferior dando como resultado la hospitalización de adultos (Dowell SF, Anderson LJ & Gary Jr HE, et al. J. Infecí Dis 1996; 174: 456-462). Falsey demostró que las infecciones serias por RSV en personas de edad avanzada no se limitan a asilos o situaciones de cambios de estación. Más bien, la infección por RSV es una causa predecible de enfermedad seria entre pacientes de edad avanzada que residen en la comunidad. Similares a las hospitalizaciones por influenza A, aquellas relacionadas con infecciones por RSV se asociaron con morbidez substancial, según se hace evidente por prolongadas estancias en el hospital, elevadas tasas de admisión en cuidados intensivos y elevadas tasas de soporte respiratorio (Falsey AR, Cunningham CK & Barker WH, et al. J. Infecí Dis 1995; 172: 389-394). Estos estudios señalan la necesidad médica y económica de una vacuna eficaz que pueda prevenir complicaciones severas de infección por RSV en infantes, adultos y personas de edad avanzada tanto de instituciones como de comunidades en edificios de salud. Para una vacuna de sub-unidad recombinante o una vacuna eliminada, el uso de un adyuvante es de importancia básica. El alumbre es el único adyuvante actualmente autorizado para uso humano. Sin embargo, el Alumbre tiene un efecto adyuvante limitado en la respuesta humoral y se sabe que induce principalmente una respuesta inmune de tipo Th2 (Byars EN, Nakano G & Welch M, ef al. Vaccine 1991 ; 9: 309-318). Sin embargo, se ha encontrado que el lípido A de monofosforilo 3-Des-O-acilado (3D-MPL) es combinación con Alumbre mejora la respuesta humoral y estimula preferentemente una inmunidad de tipo Th1. La sal de aluminio con adyuvante de 3D-MPL se denota Alumbre/3D-MPL. La presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende: (a) uno o más polisacáridos de Sirepiococcus pneumoniae ya sea conjugados con una proteína o péptido o no conjugados; y (b) un antígeno de RSV en combinación con un adyuvante que es un estimulador preferencial de una respuesta de tipo Th1. La tendencia a las vacunas de combinación tiene la ventaja de reducir la incomodidad del recipiente, facilitando la programación y asegurando el término del régimen; pero también existe el riesgo concomitante de reducir la eficacia de la vacuna. Por consiguiente, sería ventajoso elaborar combinaciones de vacuna que satisfagan las necesidades de una población en la cual, además, no interfieran entre sí. Sería una ventaja adicional si la combinación de la vacuna da como resultado la sinergia con una mejora resultante de una o ambas eficacias de la vacuna o correlaciones mejoradas de protecciones para una o ambas vacunas. Estos se logra por la composición de vacuna de la invención que es de gran beneficio para la administración en niños o las personas de edad avanzada que pueden encontrarse particularmente en riesgo de Sfrepiococcus pneumoniae y/o infección por RSV. Opcionalmente, la composición de vacuna de la invención comprende de manera adicional uno o más de otros diversos antígenos tales como el antígeno del virus de influenza. Las vacunas de influenza actualmente disponibles incluyen vacunas de virus inactivados completos, vacunas de partículas de disociación y vacunas de subunidad. Las vacunas de influenza de todo tipo son normalmente vacunas trivalentes. Contienen antígenos derivados de dos cepas de virus de influenza A y una cepa de influenza B. Una dosis estándar de 0.5 ml de la mayoría de ellos contienen 15 µg de componente de hemaglutinina de cada cepa. El procedimiento para determinar las cepas a incorporarse en una vacuna de influenza es un proceso complejo que involucra la colaboración entre la Organización Mundial de la Salud, las autoridades nacionales de salud y los fabricantes de la vacuna. Los polisacáridos pneumococales pueden volverse más inmunogénicos al acoplarlos químicamente a vehículos de proteína y se llevan a cabo ensayos de eficacia clínica para verificar este concepto respecto a la eficacia en la prevención de Otitis media en infantes. Existen dos métodos de conjugación generalmente utilizados para producir construcciones polisacáridas inmunogénicas: (1 ) conjugación directa de carbohidrato y proteína; y (2) conjugación indirecta de carbohidratos y proteína a través de un enlazador bifuncional o reactivo separador. Generalmente, tanto la conjugación directa como la indirecta requieren la activación química del elemento de carbohidrato antes de la derivación. Ver, por ejemplo, EU 5,651 ,971 y Dick & Beurret, "Glicoconjugados de Antígenos de Carbohidrato Bacterianos", Vacunas Conjugadas, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds), VOL. 10, 48-114 (1989). El polisacárido de Sfrepiococcus pneumoniae en la composición de acuerdo con la invención se encuentra, preferentemente pero no necesariamente, en una forma conjugada. El polisacárido de S.pneunoniae no conjugado no se excluye. Los polisacáridos de Streptococcus pneumoniae, si se conjugan, se conjugan ya sea con una proteína o un péptido. Los antígenos polisacáridos se han conjugado con varias proteínas auxiliares T. Estas proporcionan epítopes auxiliares T. Las proteínas representativas incluyen Toxoide de Difteria, Toxoide de Tétanos y proteína D o su lipoproteína D derivada de lípido de Haemophilus influenzae B. Otros vehículos de proteína adecuados incluyen, Crm de Difteria 197 y la principal proteína no estructural de influenzae, NS1 (particularmente amino ácido 1 -81). La proteína D es un componente preferido de una vacuna de acuerdo con la invención, en la cual se conjugan polisacáridos de Strepíococcus pneumoniae. Los fragmentos de proteína D también son adecuados. La proteína D se describe en la EP 0 594 610. Los fragmentos adecuados- para utilizarse incluyen fragmentos que abarcan epítopes auxiliares T. En particular, un fragmento de proteína D preferentemente contendrá 1/3 de la terminal N de la proteína. Sorprendentemente, se ha encontrado adicionalmente que la combinación de proteína D-polisacárido de Sirepiococcus pneumoniae conjugado con un antígeno de RSV en la composición de acuerdo a la invención no afecta la respuesta inmune al componente de proteína D del conjugado. La Proteína D es un antígeno protector contra infección no tipificable de Haemophilus influenzae B (NTHi). Por lo tanto, la invención proporciona además una vacuna que comprende un antígeno de RSV y al menos un polisacárido de Sirepíococcus pneumoniae conjugado con proteína D o un fragmento de la misma, opcionalmente junto con un adyuvante tal como un adyuvante de Th1 . Típicamente, el componente de Sirepfococcus pneumoniae en una vacuna de la presente invención comprenderá antígenos polisacáridos (preferentemente conjugados), en donde los polisacáridos se derivan de al menos cuatro serotipos de pneumococos. Preferentemente, los cuatro serotipos incluyen 6B, 14, 19F y 23F. Más preferentemente, al menos 7 serotipos se incluyen en la composición, por ejemplo, aquellos derivados de serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Más preferentemente aún, al menos 1 1 serotipos se incluyen en la composición, por ejemplo, la composición en una modalidad incluye polisacáridos capsulares derivados de serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F (preferentemente conjugados). En una modalidad preferida de la invención, también se contemplan por la invención al menos 13 o al menos 15 o al .menos 17 antígenos polisacáridos, por ejemplo de valencia 23 (tales como los serotipos 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 1 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F). Para la vacunación de personas de edad avanzada (por ejemplo, para la prevención de neumonía) es ventajoso incluir serotipos 8 y 12F (y más preferentemente 15 y 22 también) a la composición antigénica de valencia 11 arriba descrita para formar una vacuna de valencia 15, mientras que para los infantes o niños que comienzan a caminar (donde la Otitis media es de mayor preocupación) los serotipos 6A y 19A se incluyen ventajosamente para formar una vacuna de valencia 13. Los antígenos de RSV adecuados para su inclusión en vacunas de acuerdo con la invención incluyen virus de RSV inactivado, tal como un virus de RSV químicamente inactivado, inactivado con, por ejemplo, formalina. El virus inactivado puede producirse, por ejemplo, a partir de un RSV atenuado, el cual se ha atenuado, por ejemplo, mediante paso o manipulación genética, o puede producirse a partir de un RSV de tipo silvestre. Puede utilizarse un RSV recombinante que se ha diseñado para contener un antígeno de cubierta de una cepa de RSV diferente, por ejemplo, una estructura de cepa A de RSV con una proteína de cubierta B de RSV, opcionalmente atenuada. Los antígenos de RSV adecuados incluyen, en antígenos particulares derivados del virus de RSV, glicoproteínas de cubierta de RSV preferentemente humanas, tales como la proteína F o G de RSV o fragmentos inmunogénicos de las mismas, según se expone, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 5, 149,650 o un polipéptido quimérico que comprende al menos un fragmento inmunogénico de ambas proteínas F y G de RSV, ventajosamente una proteína quimérica de FG de RSV según se expone, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 5, 194,595, preferentemente expresada a partir de células de CHO. Preferentemente, el antígeno de RSV es una glicoproteína de cubierta de RSV o derivado de la misma. Preferentemente, el antígeno se deriva de una cepa A de RSV. De manera alternativa, el antígeno puede derivarse de cepa B o puede existir un antígeno de cada una de las cepas A y B en la composición. Los antígenos preferidos se seleccionan a partir de glicoproteína F, glicoproteína G o una proteína de fusión de FG o derivados inmunogénicos de las mismas. Típicamente, los derivados inmunogénicos incluyen en donde la proteína se desprende del dominio de transmembrana, es decir F ?tm, G ?tm y F ?tm, G ?tm. Preferentemente, la secuencia de señal se omite de la proteína G. Se prefiere que se presente al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 80% (secuencia contigua) del dominio extracelular de la proteína F o G. Los ejemplos particulares incluyen 1-526 o 1-489 amino ácidos de la proteína F, 69-298 amino ácido o posiciones alternativas 97-279 de la proteína G y proteína de fusión F?.s2s G69-298- Una fusión alternativa comprende 1-489 amino ácidos de F seguidos por 97-279 de proteína G. La composición de vacuna de RSV/ Streptococcus pneumoniae de acuerdo con la invención comprende un adyuvante que es un inductor preferencial de un tipo de respuesta Th1 para auxiliar la ramificación mediada-por célula del sistema inmune. Una respuesta inmune se genera para un antígeno a través de la interacción del antígeno con las células del sistema inmune. La respuesta inmune resultante puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, siendo respuestas inmunes humorales o mediadas por células (tradicionalmente caracterizadas por anticuerpos y mecanismos efectores celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se han llamado respuestas de tipo Th1 (respuesta mediada por célula) y respuestas inmunes de tipo Th2 (respuesta humoral). Las respuestas inmunes de tipo Th1 extremas pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos restringidos de haplotipo, específicos de antígeno y respuestas de células eliminadoras naturales. En los ratones, las respuestas de tipo Th1 con frecuencia se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo lgG2a, mientras que en los humanos estos corresponde a anticuerpos de tipo lgG1. Las respuestas inmunes de tipo Th2 se caracterizan por la generación de un amplio rango de isotipos de inmunoglobulina que incluyen en ratones lgG1 , IgA e IgM. Puede considerarse que la fuerza motriz detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citocinas, varios mensajeros de proteína identificados que sirven para ayudar a las células del sistema inmune e influenciar la respuesta inmune eventual ya sea a la respuesta Th1 o a la respuesta Th2. Por lo tanto, los niveles elevados de citocinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para ei antígeno dado, mientras que los niveles elevados de citocinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales para el antígeno. Es importante recordar que la distinción de respuestas inmunes de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de los descrito en las clonas celulares T CD4+ve murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patferns of lymphokine secrefion lead fo different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173).

Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th 1 se asocian con la producción de las citocinas de INF-? e IL-2 por los linfocitos T. Otras citocinas con frecuencia asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo Th 1 no se producen por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo Th2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y factor-ß(TNF-ß) de necrosis de tumor. Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocina ya sea de tipo Th1 o de Th2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio de Th1 :Th2 de la respuesta inmune después de una vacunación o una infección incluyen ia medición directa de la producción de citocinas de Th1 o Th2 mediante linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la proporción de lgG 1 : lgG2a de respuestas de anticuerpo específicas de antígeno. Por lo tanto, un adyuvante de tipo Th1 es una que estimula poblaciones de células T aisladas para producir niveles elevados de citocinas de tipo Th1 cuando se re-estimulan con antígeno in vitro e induce respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con isotipo de tipo Th1. Los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente Th 1 incluyen lípido A de Monofosforilo o un derivado del mismo, particularmente lípido A de monofosforilo 3-Des-O-acilado y una combinación de lípido A de monofosforilo, preferentemente lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. A continuación se describen sistemas adyuvantes adecuados, adicionales. Tales adyuvantes se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/00153 y WO 95/17209. (3D-MPL se describe en la GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas y se elabora por Ribi Immunochem Montana. Una forma preferida de lípido A de monofosforilo 3-Des-O-acilado se expone en la Patente Europea EP 0 689 454 B. Preferentemente, el tamaño de las partículas de 3D-MPL es lo suficientemente pequeño para filtrarse de manera estéril a través de una membrana de 0.22 micrones (como se describe en la Patente Europea EP 0 689 454). 3D-MPL normalmente estará presente en el rango de 10 µg-100 µg, preferentemente 25-50 µg por dosis, en donde el antígeno típicamente estará presente en un rango de 2-50 µg por dosis. Otro adyuvante preferido comprende QS21 , una fracción no tóxica purificada con Hplc de una saponina derivada de la mordida de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, esto puede mezclarse con lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo. Un método para producir QS21 se expone (como QS21) en la Patente de E.U. No. 5,057,540. Las formulaciones adyuvantes no reactogénicas que contienen QS21 se describen en WO 96/33739. Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser exitosos adyuvantes estimuladores de Th1 cuando se formulan junto con un antígeno. Por lo tanto, las composiciones de vacuna que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de QS21 y colesterol. Los adyuvantes adicionales que son estimuladores preferenciales de respuesta de Th1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias de CpG no metiladas como se expone en WO 96/02555. Las combinaciones de diferentes adyuvantes estimuladores de Th1 , tales como aquellos mencionados con anterioridad, también se contemplan en la proporción de un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta de tipo Th1. Por ejemplo, QS21 (preferentemente también con colesterol) puede formularse junto con 3D-MPL. La proporción de QS21 :3D-MPL se encontrará típicamente en el orden de 1 :10 hasta 10:1 , preferentemente 1 :5 hasta 5:1 y con frecuencia substancialmente 1 : 1. El rango preferido para la sinergia óptima es 2.5: 1 hasta 1 : 1 3D-MPL: QS21. Preferentemente, también se presenta un vehículo en la composición de vacuna de acuerdo a la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio. Una emulsión preferida de aceite en agua comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. De manera adicional, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina. En un aspecto preferido, el hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio se agregará a la composición de la invención para mejorar la inmunogenicidad. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con 3D-MPL y alumbre. Típicamente, para la administración en humanos, QS21 y 3D-MPL se presentarán en una vacuna en el rango de 1 µg - 200 µg, tal como 10-100 µg, preferentemente 10 µg - 50 µg por dosis. Típicamente, el agua en aceite comprenderá desde 2 hasta 10% de escualeno, desde 2 hasta 10% de alfa tocoferol y desde 0.3 hasta 3% de Tween 80. Preferentemente, la proporción de escualeno.alfa tocoferol es igual o menor a 1 ya que proporciona una emulsión más estable. El Span 85 también puede presentarse en un nivel de 1 %. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador. Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua preferentemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualeno o escualano, un emulsificador, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina regulada con fosfato. Una formulación adyuvante particularmente potente que involucra QS21 , 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210.

La vacuna de la presente invención contendrá una cantidad inmunoprotectora de los antígenos y puede prepararse mediante técnicas convencionales. La preparación de la vacuna se describe de manera general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Diseño de Vacuna - el enfoque de subunidad y adyuvante, editado por Powell y Newman, Plenum Press, 1995; Nuevas Tendencias y Desarrollos en las Vacunas, editado por Voller et al. , University Park Press, Baltimore, Maryland, E. U.A. 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, Patente de E. U. No. 4,235,877. La conjugación de proteínas con macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite, Patente de E. U . No. 4,372,945 y por Armor et al. , Patente de E. U. No. 4,474,757. La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos colaterales adversos significativos en vacunados típicos. Tal cantidad variará dependiendo del inmunogen específico empleado. En general, se espera que cada dosis comprenda 1 -1000 mg de proteína, preferentemente 2-100 mg, más preferentemente 4-40 mg. Una cantidad óptima para una vacuna en particular puede determinarse mediante estudios estándares que involucran la observación de títulos de anticuerpo y otras respuestas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo en aproximadamente 4 semanas. Para los infantes en particular, pueden preferirse tres dosis. Además de la vacunación de personas susceptibles a infecciones por Streptococcus pneumoniae o RSV, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse para tratar, de manera inmunoterapéutica, los pacientes que sufren de dichas infecciones. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para la elaboración de una formulación de vacuna según se describe en la presente, en donde el método comprenden una mezcla de antígeno de Streptococcus pneumoniae y un antígeno de RSV con un adyuvante inductor de Th-1 , por ejemplo, 3D-MPL y, preferentemente, un vehículo, por ejemplo, alumbre. Si se desea, pueden agregarse otros antígenos, en cualquier orden conveniente, para proporcionar composiciones de vacuna multivalente, según se describe en la presente. La invención proporciona además un método para la producción de una composición de vacuna que comprende una mezcla de un polisacárido de Streptococcus pneumoniae conjugado con proteína D con un antígeno de RSV y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En el ejemplo que sigue, se llevó a cabo la evaluación del efecto en la combinación de un candidato a vacuna de RSV, FG con la vacuna pneumococal de valencia 23 comercialmente disponible (Pneumune de Wyeth-Lederle) en un modelo de ratón. Este modelo experimentó una inmunización combinada donde las vacunas se mezclan físicamente y se inyectan en el mismo sitio. Los resultados de este estudio demuestran una sinergia mutua, dando como resultado respuestas mejoradas para ciertos marcadores inmunológicos para ambas vacunas. El ejemplo demuestra además una vacuna combinada con un candidato a vacuna de RSV y una vacuna pneumococal conjugada de valencia 1 1 , en un modelo de ratón. Este demuestra que, para la mayoría de los marcadores inmunológicos, no existe interferencia o solo una mínima interferencia entre los antígenos, pero de hecho, existe una respuesta mejorada para algunos marcadores inmunológicos y, por consiguiente, un efecto sinergístico. Notablemente, no existe reducción en la respuesta inmune al componente de proteína D del polisacárido pneumococal conjugado.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Evaluación de RSV combinado + vacuna pneumococal de valencia 23 1. Proceso de la formulación: El antígeno de FG diluido en H2O (2µg: 1 /10 HD) se adsorbió durante 15 minutos en 50 µg de AI(OH)3. Cuando se utilizó, se agregaron µg de 3D-MPL a la preparación como una suspensión de 100 nm partículas y se incubó durante 30 minutos. Las formulaciones se regularon entonces con PBS concentrado 10 veces pH 7.4. Cuando se utilizó, la vacuna pneumococal de valencia 23 (1 1.5 µg: 1 /50 HD) se agregó 15 minutos después de la adición de la solución reguladora. Para los grupos sin FG se siguió la misma secuencia de formulación a fin de que el 3D- MPL se adsorbiera primero en AI(OH)3 antes de la adición de la vacuna pneumococal de valencia 23. Quince minutos después de la adición del regulador concentrado o la vacuna pneumococal de valencia 23, se agregó fenoxietanol (5 mg/ml) a las formulaciones como preservativo.

Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación. Las formulaciones se prepararon de manera simultánea para las dos inyecciones con una maduración de 7 días de las formulaciones terminadas antes de la primer inyección.

Composición de los constituyentes de la formulación: 2. Protocolo de inmunización: Se inmunizaron 11 grupos de 10 ratones mediante diferentes rutas (50 µl) los días 0 y 28 con diversas formulaciones (ver Tabla 1 ). Los grupos 7 y 8 se inmunizaron con RSV vivo mediante la ruta intra-nasal (60 µl). El suero se obtuvo los días 28 (28 d Post I) y 42 (14 d Post II). El día 42, se tomaron células de bazo y de nodo de 5 ratones de los grupos 4, 5, 6, 7, 8, 9, así como también de 5 ratones Balb/C Na?ve (grupo 1 , no inmunizado). 3. Respuesta Humoral. 3.1. Anticuerpos de anti-FG: Todos los resultados humorales se llevaron a cabo para 10 ratones/grupo (respuesta individual para los títulos de anti-FG y suero depositado para el perfil de isotipo) y los resultados celulares se presentaron para 5 ratones/grupo. El suero individual se obtuvo 28 días después de la primer Inmunización y 14 días después de la segunda inmunización y se examinaron respecto a la presencia de anticuerpos de Ig específicos de FG y su distribución de isotipo (lgG2a, lgG 1 ). El protocolo del ensayo fue como sigue: recubrimiento durante la noche a 4°C con 50 µl de FG purificado 54/023 (1 µg/ml) por cavidad, saturación 1 h a 37°C, incubación con suero 1 h30 a 37°C, incubación con biotina de Ig de anti-ratón 1/1500 (o lgG1 , biotina de lgG2a 1/1000) 1 h30 a 37°C, incubación con estrepta-peroxidasa 1 /2500 30 minutos a 37°C, incubación con OPDA Sigma 15 minutos a RT, detención con 2N de H2SO . El OD se monitoreó a 490 nm y los títulos se determinaron por Softmaxpro (ecuación de 4 parámetros) refiriéndose a una curva estándar y se expresaron en EU/ml. El suero individual obtenido 14d Post I I se examinó respecto a la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante el uso del siguiente protocolo: 50 µl de diluciones dos veces seriales de suero (primera dilución 1/25) se incubaron durante 1 hora a 37°C con 50 µl de una mezcla que contiene 300 pfu de RSV-A/Largo (Lote 14) y complemento de conejillo de indias (1 /25 dilución) en una placa de 96 cavidades por duplicado. 100 µl de una suspensión celular de HEp-2 a 105 células /ml se agregaron entonces a cada cavidad y las placas se incubaron durante 4 días a 37°C en presencia de 5% de CO2. Los sobrenadantes se aspiraron entonces y después de la adición de una preparación de 100 µl de WST-1 (dilución 1/12.5)las placas se incubaron de manera adicional durante 24 H a 37°C en presencia de 5% de CO . El OD se monitoreó a 595 nm y los títulos se determinaron mediante regresión lineal (y=a.logx + b): título = dilución de suero que da 50% de reducción del máximo OD observado para las células no infectadas. Los controles en la prueba incluyeron un depósito de suero humano aleatoriamente elegido (depósito Humano) y Sandoglobulina (lote 069, IgG humano genérico producido por Sandoz). 3.2 IgG Polisacárido Anti-pneumococal: El IgG murino para los tipos polisacáridos pneumococales 6B, 14, 19F y 23F se midió por ELISA en un método adaptado del protocolo de CDC. Este protocolo incluye la adición de polisacárido de pared celular soluble (CPS) al suero para inhibir la medición de anticuerpos de CPS. CPS es una colina de fosforilo que contiene ácido ticóico común a todos los neumococos. Se presenta bajo la cápsula y los anticuerpos para ésta son solo débilmente protectores. Ya que el CPS se enlaza al polisacárido capsular, existe normalmente 0.5 hasta 1 % de CPS contaminando el - polisacárido capsular purificado utilizado para cubrir las placas de ELISA. Por lo tanto, la medición de los anticuerpos de CPS puede confundir la interpretación de los resultados de ELISA con respecto al polisacárido capsular. El ELISA se llevó a cabo con polisacáridos cubiertos en 20, 5, 10 y 20 µg/ml en regulador de carbonato para los tipos 6B, 14, 19F y 23F, respectivamente. El suero se pre-mezcló con el equivalente de 500 µg/ml de CPS en suero sin diluir y se incubó durante 30 minutos antes de la adición a la placa de ELISA. El IgG murino se detectó con peroxidasa de IgG anti-murino de cabra de Jackson ImmunoLab (H+L) a una dilución de 1 :2000. Las curvas de titulación fueron referidas a anticuerpos monoclonales murinos específicos de polisacárido de concentración conocida para cada serotipo mediante el uso de comparación logarítmica logística mediante SoftMax Pro. Los monoclonales utilizados fueron HASP4, PS14/4, PS19/5 y PS23/22 para los tipos 6B, 14, 19F y 23F, respectivamente. Debido a la cantidad limitada de suero disponible, se examinó el suero depositado, por lo que no se encuentra disponible ningún análisis estadístico. 4. Respuesta Celular Las células de nodos linfáticos y de bazo se aislaron 14d Post II de los grupos 4-9 y de ratones Na?ve (grupo 1) para utilizarse como un control negativo para el análisis de respuesta celular específico de FG. Las muestras se analizaron tanto para la linfoproliferación específica de FG como la secreción de citocina (IFN-? + IL-5). La proliferación se evaluó después de una incubación de 96 horas de 4x105 células/cavidad de placas de 96 cavidades con 200 µl de medio que contiene de 10 hasta 0.03 µg/ml de FG (diluciones 3 veces). Después de la incorporación de 3H-timidina, la proliferación específica de FG se midió después de nuestro protocolo estándar. La inducción de citocina se evaluó después de una incubación de 96 horas de 2.5x106 células por cavidad de 24 cavidades con 1 ml de medio que contiene 10 µg hasta 0.01 µg de FG (diluciones 10 veces). Los sobrenadantes se recolectaron entonces para determinar la cantidad de IFN-? e IL-5 inducidos por ELISA después de nuestro protocolo estándar. 1. GRUPOS 10 grupos recibieron dos inmunizaciones de diversas formulaciones que contienen ya sea la vacuna de valencia 23 o FG o una combinación de ambos formulados con hidróxido de aluminio y 3D-MPL o hidróxido de aluminio. El grupo 1 constituye el control para los estudios de CMI . Los grupos 2 y 9 permitirán la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna pneumococal de Valencia 23 después de la inmunización intraperitoneal que se utilizó en la literatura para la evaluación de la vacuna pneumococal de Valencia 23 y, después de la inmunización de IM, los Grupos 3 y 10 permiten un análisis paralelo a los grupos 2 y 9, excepto que la vacuna pneumococal de Valencia 23 se formula con Alumbre/3D-MPL. Los grupos 2 y 3 también constituyen controles para el impacto del Alumbre/3D-MPL sobre la vacuna pneumococal de Valencia 23 cuando no se- combina con Alumbre de FG/3D-MPL. El grupo 4 permitirá la evaluación de la respuesta inmune inducida después de la Inmunización de IM de la combinación de la vacuna pneumococal de Valencia 23 y Alumbre de FG/3D-MPL. Los grupos 5 y 6 constituyen un control para la evaluación del impacto de Alumbre/3D-MPL sobre FG cuando no se combina con la vacuna pneumococal de Valencia 23. Las inmunizaciones con RSV vivo fueron un control para la respuesta inmune inducida después de la infección con RSV I N natural (Grupo 7). Finalmente, el grupo 9 es un control para el impacto de Alumbre/3D-MPL solo.

TABLA 1 2. RESPUESTA HUMORAL 2.1 Anticuerpos de Anti-FG El análisis de los anticuerpos de anti-FG específicos a 28 d Post O y 14 d Post II muestra la inducción de respuestas de anticuerpo similares después de la Inmunización con Alumbre de FG/3D-MPL/Valencia 23 (Grupo 4) o Alumbre de FG/3D-MPL solo (Grupo 5) con títulos ligeramente mayores observados para el Alumbre de FG/3D-MPL/Valencia 23 (Figura 1). La inmunización con Alumbre de FG (Grupo 6) induce inesperadamente títulos de anticuerpo inferiores en ambos puntos de tiempo. El análisis estadístico muestra que, no obstante, existe una diferencia significativa entre los títulos de Ig de anti-FG inducidos por los Grupos 4-6 a 28 d Post I y 14 d Post II. RESULTADOS El análisis de los anticuerpos neutralizantes de anti-RSVA (Figura 2) presenta un perfil paralelo al observado para las respuestas de Ig de anti-FG. En base a los resultados anteriores, se calculó la proporción de anti-FG/anticuerpo neutralizante de anti RSV (28d Postll) y se demostró que la proporción de Alumbre de FG/3D-MPL/Valencia 23, Alumbre de FG/3D-MPL y Alumbre de FG se compara a la proporción inducida por el grupo de RSV IN (Tabla 2).

TABLA 2 Ni 00 Un análisis estadístico profundo sobre los títulos de isotipo individuales de Ig de anti-FG, lgG1 e lgG2a mostró que la adición de la vacuna de valencia 23 al Alumbre de FG/3D-MPL mantiene las respuestas de Ig e lgG1 e incrementa significativamente las respuestas de lgG2a (Figura 3A). Además, el análisis mostró que la proporción de lgG1/lgG2a y el título de lgG1 del Alumbre de FG/3D-MPL/valencia 23 y Alumbre de FG/3D-MPL fueron similares aunque significativamente diferentes del Alumbre de FG (Figura 3B). Las tres formulaciones tuvieron diferencias significativas en sus títulos de lgG2a. 2.2 [gG Polisacárido Anti-Pneumococal Aunque los ratones y otros roedores pueden producir IgM contra inmunogenes polisacáridos, normalmente no producen IgG contra polisacáridos. Esto es debido a que sus sistema inmune carece de las señales para inducir el cambio de isotipo a un antígeno independiente de T, tal como un polisacárido. Por lo tanto, la medición de IgG de anti-polisacárido en ratones es una prueba sensible a la inducción de una respuesta inmune independiente de T, mejorada. Las concentraciones de IgG inducidas contra cuatro de los 23 polisacáridos se presentan en la Tabla 3. Como hemos observado en otros experimentos, no se produjo IgG contra tipos polisacáridos 6B y 23F. Sin embargo, existió IgG medible producido contra tipos 14 y 19F. Los grupos que no contienen la vacuna de Valencia 23 mostraron cualquier IgG detectable a los polisacáridos 14 y 19F, confirmando la especificidad de las mediciones. Una comparación de la ruta de inmunización revela que cuando la vacuna de valencia 23 se adyuva con Alumbre/3D-MPL, ia ruta intra-muscular parece ser mejor que la inter-peritoneal para el tipo 19F, mientras que lo inverso es cierto para el tipo 14. Con la Valencia 23 simple, parece no haber una diferencia significativa. La Valencia 23 + Alumbre/3D-MPL induce un IgG mayor para los tipos 14 y 19F, tanto en rutas de inmunización IM como IP, en comparación con la Valencia 23 sola. Cuando se combina con FG, sin embargo, existe una reducción en la respuesta de IgG. No obstante, la respuesta de IG a 19F en la Valencia 23+FG/Alumbre/3D-MPL es aún mayor que la inducida por la Valencia 23 sola (comparar grupos 3 y 4) y se mejora la respuesta al tipo 14. t t Wl O Ux TABLA 3 IgG Murino de Vacuna Pneumococal de RSV de Combinación (µg/ml) ? 3. RESPUESTA CELULAR. La linfoproliferación específica de FG inducida no mostró ninguna diferencia entre Alumbre de FG/3D-MPL +/- Valencia 23 y Alumbre de FG, tanto en células de bazo como en células de nodo linfático. El análisis de la producción de I L-5 e IFN-? sugiere que la mezcla de la vacuna de valencia 23 con Alumbre de FG/3D-MPL no daña la producción de IFN-? pero podría incrementar algo la producción de IL-5 (Figura 4). Esta observación se confirma por una diferencia de 2 a 8 veces en la proporción de IFN-?/IL-5 observada en dos dosis de FG (10 y 1 µg de FG/ml) utilizadas para la re-estimulación in vitro. Sin embargo, el Alumbre de FG/3D-MPL/vacuna de Valencia 23 aún induce una proporción mucho mayor de I FN-?/IL-5 que el Alumbre de FG. CONCLUSIONES El análisis del Ig de anti-FG inducido específico y los títulos de anticuerpo de neutralización de anti RSVA muestra que la combinación de Alumbre de FG/3D-MPL con la vacuna pneumococal de valencia 23 no daña la inducción de la respuesta- observada con el Alumbre de FG/3D-MPL solo. La calidad déla respuesta medida por la proporción de anti-FG/anticuerpo de neutralización de anti-RSVA también permanece sin cambios y cercana a la proporción observada después de la infección natural con RSV a través de la ruta IN . El análisis de la respuesta mediada por células específica de FG inducida sugiere que la adición de la vacuna de valencia 23 al Alumbre de FG/3D-MPL no afecta la inducción de la linfoproliferación en las células de bazo ni en las células de nodo linfático. Además, la inducción de una respuesta de tipo Th1 típicamente observada con Alumbre de FG/3D-MPL no se daña por la adición de la Valencia 23 según se mide por la producción de citocina in vitro de células de bazo y linfonodales específicas de FG y parece mejorarse cuando se analiza la distribución de anticuerpo de isotipo específico de FG. No obstante, la producción de IFN-?, un marcador de una respuesta de Th1 , permanece sin cambio después de la adición de la vacuna de valencia 23 al Alumbre de FG/3D-MPL mientras que la producción de IL-5, marcador de una respuesta Th2, solo se incrementa ligeramente. De manera interesante, la adición de la vacuna de valencia 23 a Alumbre de FG/3D-MPL incrementa significativamente la producción de anticuerpos de lgG2a, marcador de una respuesta Th 1 , mientras que no afecta la respuesta de lgG 1 (marcador de una respuesta Th2) ni la de lgG 1 /lgG2a. Por lo tanto, la combinación de Alumbre de FG/3D-MPL y la vacuna de valencia 23 no afecta la respuesta observada con Alumbre de FG/3D-MPL y, por consiguiente, las ventajas enlazadas a la formulación de Alumbre de FG/3D-MPL contra el Alumbre de FG, es decir, las inducción de elevadas respuestas de anticuerpos de neutralización primarios y secundarios y una respuesta Th 1 según se mide por la presencia de anticuerpos de lgG2a y se mantiene la inducción por niveles elevados de I FN-?. La combinación de Pneumune de Valencia 23 con Alumbre de FG/3D-MPL da como resultado una producción de IgG incrementada en 2 de 4 polisacáridos examinados, pero de manera más dramática para el tipo 19F. La Valencia 23 solo con Alumbre/3D-MPL dio las concentraciones más elevadas de IgG. En conclusión, existe una combinación favorable de vacuna pneumococal de valencia 23 con Alumbre de FG de RSV/3D-MPL en el cual existe un efecto sinergístico para ambas vacunas, ya que ambas vacunas muestran mejoras en ciertas pruebas inmunológicas e inhibición alguna en ninguna prueba.

EJEMPLO 2- Evaluación de un RSV + vacuna pneumococal conjugada de valencia 1 1 combinados La vacuna de combinación se evaluó ya sea con 3D-MPL + alumbre, 3D-MPL + QS21 en liposomas que contienen colesterol u oligonucleótidos que contienen CpG (con o sin alumbre). El impacto de la vacuna de combinación en la respuesta inmune de IgG para el vehículo de proteína D (PD) también se determinó. La PD es un antígeno protector contra infección por Haemophilus influenzae B (NTHi) no tipificable. Por consiguiente, la combinación de PS neumococal conjugada con PD y FG podría conferir una protección eficaz contra tres patógenos: S. pneumoniae, RSV y Haemophilus influenzae B no tipificable. Una inmunidad de tipo Th1 se involucra probablemente en la protección contra NTHi. Por consiguiente, los anticuerpos de lgG2a de anti-PD, que son un buen indicador de una respuesta Th 1 , también se examinaron. La vacuna candidato de valencia 1 1 utilizada en este ejemplo incluye los serotipos polisacáridos capsulares 1 , 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F, los cuales se elaboraron esencialmente como se describe en EP 72513. Cada polisacárido se activa y deriva mediante el uso de química de CDAP (WO 95/08348) y se conjuga con el vehículo de proteína. Todos los polisacáridos se conjugan en su forma nativa, excepto para el serotipo 3 (el cual se redujo en tamaño para disminuir su viscosidad). El vehículo de proteína fue proteína D recombinante (PD) proveniente de Haemophilus influenzae no tipificable, expresada en E.coli. 1. Proceso de ia formulación: Las formulaciones se prepararon 12 días antes de la primer inyección. 1.1. QS21 , formulaciones en base a 3D-MPL Cuando fue necesario, los antígenos (FG (2 µg) o/y conjugados de PS no adsorbidos (0.5 µg/valencia)) se diluyeron en una mezcla de PBS concentrado 10 veces pH 7.4 y H2O. Se agregó QS21 (5 µg) como una mezcla con liposomas que contienen MPL en una proporción en peso de QS21/Colesterol de 1 /5 (referida como DQ/3D-MPLin). Treinta minutos después se agregó como preservativo 1 µg/ml de tiomersal. 1.2 Formulaciones en base a CpG o 3D-MPL Cuando fue necesario, se diluyó AI(OH)3 en H2O antes de la adición de los antígenos (FG (2µg) ó/y conjugados de PS no adsorbidos (0.5 µg/valencia)). Después de una adsorción de 30 minutos, se agregó MPL o CpG. Treinta minutos después, las formulaciones se regularon con PO -NaCI concentrado 10 veces pH 6.8. Se agregó entonces tiomersal a 1 > mg/ml o fenoxi a 5 mg/ml como preservativo. Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación. Las formulaciones se prepararon de manera simultánea para las 2 inyecciones con una maduración de 7 días de las formulaciones finalizadas antes de la primer inyección. 1.3 Composición de los constituyentes de ia formulación: 2. Protocolo de inmunización: Se inmunizaron 14 grupos de 10 ratones mediante la ruta IM (50 µl) los días 0 y 28 con diversas formulaciones (ver Sección de Resultados). El suero se obtuvo el día 42 (14 d Post II). El día 42, las células de bazo se tomaron de 5 ratones de grupos inmunizados con antígeno de FG así como también de 5 ratones Balb/c Na?ve. 3. Respuesta Humoral. 3.1. Anticuerpos de anti-FG: Todos los resultados humorales se llevaron a cabo para 10 ratones/grupo (respuesta individual para los títulos de Ig, lgG1 e lgG2a y neutralización) y los resultados celulares se presentaron para 5 ratones/grupo en depósito. El suero individual se obtuvo 14/15 días después de la segunda Inmunización y se examinaron respecto a la presencia de anticuerpos de Ig específicos de FG y su distribución de isotipo (lgG2a, lgG 1 ). El protocolo del ensayo fue como sigue: recubrimiento durante la noche a 4°C con 50 µl de DFGP107 de FG purificado (1 µtf/ml) por cavidad, saturación 1 h a 37°C, incubación con suero 1 h30 a 37°C, incubación con biotina de Ig de anti-ratón 1/1500 (o lgG1 , biotina de lgG2a 1 /1000) 1 h30 a 37°C, incubación con estrepta-peroxidasa 1 /1500 30, minutos a 37°C, incubación con OPDA Sigma 20 minutos a RT, detención con 2N de H2SO .

El OD se monitoreó a 490 nm y los títulos se determinaron por Softmaxpro (ecuación de 4 parámetros) refiriéndose a una curva estándar y se expresaron en EU/ml. El suero individual obtenido 14d Post II se examinó respecto a la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante el uso del siguiente protocolo: 50 µl de diluciones dos veces seriales de suero (primera dilución 1 /25) se incubaron durante 1 hora a 37°C con 50 µl de una mezcla que contiene 300 pfu de RSV-A/Largo (Lote 14) y complemento de conejillo de indias (1/25 dilución) en una placa de 96 cavidades por duplicado. 100 µl de una suspensión celular de HEp-2 a 10s células/ml se agregaron entonces a cada cavidad y las placas se incubaron durante 4 días a 37°C en presencia de 5% de CO2. Los sobrenadantes se aspiraron entonces y después de la adición de una preparación de 100 µl de WST-1 (dilución 1 /15) las placas se incubaron de manera adicional durante 24 H a 37°C en presencia de 5% de CO2. El OD se monitoreó a 490 nm y los títulos se determinaron mediante regresión lineal (y=a.logx + b): título = dilución de suero que da 50% de reducción del máximo OD observado para las células no infectadas. 3.2 IgG Polisacárido Anti-pneumococal: El IgG murino para los tipos polisacáridos pneumococales 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F se midió por ELISA en un método adaptado del protocolo de CDC. Este protocolo incluye la adición de polisacárido de pared celular soluble (CPS) al suero para inhibir la medición de anticuerpos de CPS. CPS es una colina de fosforilo que contiene ácido ticóico común a todos los neumococos. Se presenta bajo la cápsula y los anticuerpos para ésta son solo débilmente protectores. Ya que el CPS se enlaza al polisacárido capsular, existe normalmente 0.5 hasta 1 % de CPS contaminando el polisacárido capsular purificado utilizado para cubrir las placas de ELISA. Por lo tanto, la medición de los anticuerpos de CPS puede confundir la interpretación de los resultados de ELISA con respecto al polisacárido capsular. El ELISA se llevó a cabo con polisacáridos cubiertos en 20, 5, 5, 20 y 20 µg/ml en regulador de PBS para los tipos 6B, 7F, 14, 19F y 23F, respectivamente. El suero se pre-mezcló con el equivalente de 500 µg/ml de CPS en suero sin diluir y se incubó durante 30 minutos antes de la adición a la placa de ELISA. El IgG murino se detectó con peroxidasa de IgG anti-murino de cabra de Jackson ImmunoLab (H+L) a una dilución de 1 :5000. Las curvas de titulación fueron referidas a anticuerpos monoclonales murinos específicos de polisacárido de concentración conocida para cada serotipo mediante el uso de comparación logarítmica logística mediante SoftMax Pro. Los anticuerpos monoclonales utilizados fueron HASP4, PS7/19, PS14/4, PS19/5 y PS23/22 para los tipos 6B, 7F, 14, 19F y 23F, respectivamente. Para - el serotipo 3, se hizo un ELISA excepto que las inmunoplacas se cubrieron primero con albúmina de suero humana metilada (1 µg/ml en PBS, 2 horas, 37°C) con objeto de mejorar el recubrimiento de PS3 (2.5 µg/ml en PBS, durante la noche, 4°C). El anticuerpo monoclonal PS3/6 se utilizó como referencia estándar. 3.3 Dosis de ELISA de IgG de suero de anti-PD Las inmunoplacas de Maxisorp Nunc se cubrieron a 37°C durante 2 horas con 100 µl de 1 µg/ml de Ig de anti-ratón de cabra purificado (Jackson), en PBS (hilera A). Después, las diluciones 2 veces seriales (en regulador de PBS Tween 20 al 0.05%, 100 µl por cavidad) de IgG de ratón puro (Jackson) se agregaron como una curva estándar (iniciando en 1 µg/ml y colocándose en la hilera A) y las muestras de suero (iniciando a una dilución de 1/20 y colocándose en las hileras B a H) se incubaron durante la noche a 4°C. Después, el IgG de anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (Jackson) diluido 1/5000 en regulador de PBS Tween 20 al 0.05% se incubaron (100 µl/cavidad) durante 30 minutos a 20°C, bajo agitación. Después de varios enjuagues, ias placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la obscuridad con 100 µl/cavidad de regulador de revelación (OPDA 0.4 mg/ml (Sigma) y H2O2 al 0.05% en 100 mM pH 4.5 de regulador de citrato). La revelación se detuvo mediante la adición de 50 µg/cavidad de 1 N de HCl. Las densidades ópticas se leyeron a 490 y 620 nm mediante el uso de inmunolector Emax (Molecular Devices). El título de anticuerpo se calculó mediante el método matemático de 4 parámetros utilizando software SoftMaxPro. 3.4 Dosis de ELISA de lgG1 de suero de anti-PD, 2a y 2b Las inmunoplacas de Maxisorp Nunc se cubrieron durante la noche a 4°C con 50 µl/cavidad de 21 µg/ml de antígeno de PD diluido en PBS (en hileras B a H de la placa), o con 50 µl de 5 µg/ml de Ig de anti-ratón de cabra purificado (Boerhinger), en PBS (hilera A). Después de la saturación de la placa con regulador de BSA al 1 % de PBS Tween 20 al 0.05%, las diluciones 2 veces seriales (en regulador de saturación, 50 µl por cavidad) de lgG1 de ratón puro, los anticuerpos monoclonales de lgG2a o lgG2b (Sigma) se agregaron como una curva estándar (iniciando en 200 ng/ml y colocándose en la hilera A) y las muestras de suero (iniciando a una dilución de 1/20 en regulador de saturación y colocándose en las hileras B a H) se incubaron durante 1 hora a 37°C bajo agitación. Después de varios enjuagues con regulador de NaCI 0.9% de Tween 20 al 0.05%, el IgG de cabra de IgG de anti-ratón bioestañado o lgG2a de anti-ratón o lgG2b de anti-ratón (Amersham) diluido 1/1000 en regulador de saturación se incubaron (50 µl/cavidad) durante 30 minutos a 20°C, bajo agitación. Después enjuagues adicionales, las placas se incubaron durante 30 minutos a 20°C bajo agitación con estreptavidina conjugada con peroxidasa (Amersham) diluida 1/1000 en regulador de saturación (50 µl/cavidad). Después de los enjuagues, la revelación se realizó mediante la adición de 50 µl/cavidad de regulador de revelación (OPDA 0.4 mg/ml (Sigma) y H2O2 0.05% en 100 mM pH 4.5 de regulador de citrato) durante 20 minutos a temperatura ambiente en la obscuridad. La revelación se detuvo mediante la adición de 50 µl/cavidad de 1 N de HCl . Las densidades ópticas se leyeron a 490 y 620 nm mediante el- uso de inmunolector Emax (Molecular Devices). El título de anticuerpo se calculó mediante el método matemático de 4 parámetros utilizando software SoftMaxPro. 4. Respuesta Celular Las células de bazo se aislaron 14d Post II de todos los grupos inmunizados con FG así como también de ratones Na?ve para utilizarse como control negativo para el análisis de respuesta celular específica de FG. Las muestras se analizaron tanto para la linfoproliferación específica de FG como para la secreción de citocina (I FN-G + IL-5). La proliferación se evaluó después de una incubación de 96 horas de 4x105 células/cavidad de placas de 96 cavidades con 200 µl de medio que contiene de 10 hasta 0.03 µg/ml de FG (diluciones 3 veces). Después de la incorporación de 3H-timidina, la proliferación específica de FG se midió después de nuestro protocolo estándar. La inducción de citocina se evaluó después de una incubación de 96 h de 2.5x106 células por cavidad de 24 cavidades con 1 ml de medio que contiene 10 µg hasta 0.01 µg de FG (diluciones 10 veces). Los sobrenadantes se recolectaron entonces para determinar la cantidad de IFN-? e IL-5 inducidos por ELISA después de nuestro protocolo estándar. RESULTADOS 1 . GRUPOS. 14 grupos recibieron dos inmunizaciones de IM con una separación de 28 días de diversas formulaciones que contienen ya sea la vacuna conjugada de valencia 1 1 o FG o una combinación de ambos formulados con 3D-MPL de alumbre, CpG, alumbre de Cpg o alumbre. Se discuten los resultados presentados en las Secciones 1 a 4. En cada Sección, los resultados del Alumbre de FG se incluyen como un control para la inducción de una respuesta inmune de RSV específica con un adyuvante predominantemente de tipo Th2. Un grupo de ratones Na?ve también se agregó para utilizarse como un control interno de análisis de CMI específico de FG. Sección 1 : Sección 2: Sección 3: Sección 4: Los mismos grupos que para la Sección 3 2. Sección 1 : 2.1. Anticuerpos de Anti-FG: Los niveles de anticuerpo de neutralización anti-RSVA similares se indujeron por FG/Alumbre/3D-MPL o FG/Alumbre/3D-MPL combinados con el conjugado de PS de valencia 1 1 (Figura 5). De hecho, puede observarse un ligero efecto sinergístico para la inducción de anticuerpos de neutralización de RSVA después de la combinación de ambas vacunas. El análisis de títulos de isotipo de lgG1 e lgG2a de anti-FG individuales mostró la inducción de títulos ligeramente inferiores o similares por FG/Alumbre/3D-MPL/conjugado de PS de valencia 1 1 versus FG/Alumbre/3D-MPL (Figura 6). El análisis de la proporción de isotipo de lgG2a respecto a lgG1 , indica que la presencia de ambas vacunas no altera la proporción de isotipo que permanece mucho más inferior al inducido por Alumbre de FG, un adyuvante inductor de Th2 reconocido. 2.2. IgG Polisacárido Anti-Pneumococal Los títulos de IgG de suero para polisacáridos 3, 6B, 14, 19F y 23F se midieron como se describe en el Ejemplo 1 . Las respuestas de anticuerpo similares se indujeron después de la inmunización con la formulación de conjugado de PS de valencia 1 1 /Alumbre/3D-MPL o con la misma vacuna complementada con antígeno de FG (Figura 7). Este resultado demostró que la combinación de conjugados de PS pneumococales y antígeno de FG de RSV dentro de una formulación de 3D-MPL de Alumbre no reduce ni altera la respuesta inmune anti-pneumococal. 2.3. Respuesta celular específica de FG. El análisis de la producción de IL-5 e IFN-? sugiere que la mezcla de FG/Alumbre/3D-MPL con el conjugado de PS de valencia 1 1 afecta algo el nivel de producción de estas citocinas (Figura 8). Sin embargo, la proporción de las citocinas medidas, un indicador del perfil de Th de la respuesta, no se afecta por la mezcla y permanece bastante diferente de la proporción observada para la formulación de Alumbre de FG, un adyuvante inductor_.de Th2. 3. SECCIÓN 2: DQ/3D-MPLin 3.1. Anticuerpos de Anti-FG: Se indujeron niveles similares de anticuerpo de Ig de anti-FG mediante DQ de FG/3D-MPLin o DQ de FG/3D-MPLin combinado con el conjugado de PS de valencia 1 1 (Figura 9). Como se observa para el análisis de Ig de anti-FG, no se observa ninguna interferencia en los niveles de anticuerpo de neutralización de anti-RSVA cuando se mezcla DQ de FG-MPLin con el conjugado de PS de valencia 1 1 (Figura 10). El análisis de títulos de isotipo de lgG1 e lgG2a de anti-FG individual mostró la inducción de títulos similares por DQ de FG-MP/conjugado de PS de valencia 11 versus DQ de FG-MP simple (Figura 11). El análisis de la proporción de isotipo indica que la combinación de las vacunas no altera la proporción de isotipo que permanece mucho más inferior a la inducida por Alumbre de FG, un reconocido adyuvante inductor de Th2. 3.2. IgG Polisacárido Anti-Pneumococal Los títulos de IgG de suero para polisacáridos 3, 6B, 14, 19F y 23F se midieron como se describe en el Ejemplo 1. Las respuestas de anticuerpo similares se indujeron después de la inmunización con la formulación de conjugado de PS de valencia 1 1/DQ/3D-MPLin o con la misma vacuna complementada con antígeno de FG (Figura 12). Este resultado demostró que la combinación de conjugados de PS pneumococales y antígeno de FG de RSV dentro de una formulación de DQ/3D-MPL no reduce ni altera la respuesta inmune anti-pneumococal. 3.3. Respuesta celular específica de FG. El análisis de ia producción de IL-5 e IFN-? sugiere inicialmente que la mezcla de DQ de FG/3D-MPLin con el conjugado de PS de valencia 11 afecta algo el nivel de producción de IFN-? (Figura 13). El análisis adicional de la proporción de las citocinas medidas, un indicador del perfil de Th de la respuesta, muestra que la mezcla de DQ de FG/3D-MPLin con el conjugado de PS de valencia 11 afecta algo el perfil de Th. Sin embargo, la predominancia de IFN-? sobre IL-5 se mantiene para la combinación de los dos antígenos con DQ/3D-MPLin y permanece mucho mayor que el que se observa para el alumbre de FG, un reconocido adyuvante inductor de Th2. 4. SECCIÓN 3: CPG Y ALUMBRE DE CPG 4.1. Anticuerpos de Anti-FG: Se indujeron niveles similares de anticuerpo de Ig de anti-FG mediante CpG de FG o CpG de FG combinado con el conjugado de PS de valencia 1 1 (Figura 14). La ausencia o interferencia debido a la mezcla de CpG de FG y el conjugado de PS de valencia 1 1 también puede observarse para las formulaciones en base a alumbre de CpG. Como se observa para el análisis de Ig de anti-FG, no se observa ninguna interferencia en los niveles de anticuerpo de neutralización de anti-RSVA cuando se mezcla CpG de FG o alumbre de CpG de FG con el conjugado de PS de valencia 1 1 (Figura 15). El análisis de los títulos de isotipo de lgG1 e lgG2a de anti-FG individual no mostraron interferencia después de la adición del conjugado de PS de valencia 1 1 a las formulaciones de alumbre de CpG de FG o de CpG de FG (Figura 16). El análisis posterior de la proporción de isotipo de lgG1 /lgG2a, indica que la mezcla de ambas vacunas no altera la proporción d.e isotipo que permanece muy inferior a la inducida por el Alumbre de FG, un adyuvante de Th2. 4.2. IgG Polisacárido Anti-Pneumococal Los títulos de IgG de suero para polisacáridos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F se midieron como se describe en el Ejemplo 1 . En el presente ejemplo, se examinaron dos formulaciones adyuvantes: CpG y Alumbre/CpG. Para ambas formulaciones adyuvantes, los títulos de IgG de anti-PS fueron al menos similares en los animales a los que se dió conjugado de PS de valencia 1 1 complementado con FG en comparación con los animales inmunizados solo con el conjugado de PS de valencia 1 1 (Figura 17). Este resultado demostró que la combinación de conjugados de PS pneumococales y antígeno de FG de RSV dentro de una formulación de CpG o de CpG de Alumbre no reduce ni altera la respuesta inmune anti-pneumococal. Los títulos de anticuerpo para los serotipos 7F y14 se mejoraron inclusosignificativamente en presencia de FG mediante el uso de la formulación adyuvante de CpG. 4.3. Respuesta celular específica de FG. El análisis de la producción de IL-5 e IFN-? sugiere inicialmente que la mezcla de CpG de FG o alumbre de CpG y el conjugado de PS de valencia 1 1 no afecta el nivel de producción de estas citocinas ni de su proporción de IFN-?/IL-5 (Figura 18). Por consiguiente, la predominancia de IFN-?, un marcador de una respuesta Th1 , se mantiene para ambas combinaciones dentro de las formulaciones de CpG y Alumbre de CpG. La inducción de IFN-? incluso se mejoró en presencia de FG mediante el uso de la formulación adyuvante de CpG . 5. SECCIÓN 4: Se determinó el impacto de agregar FG en formulaciones de conjugado de PS en la respuesta inmune de IgG al vehículo de proteína D (PD). La PD es un antígeno protector contra infección por Haemophilus influenzae B no tipificable (NTHi). Una inmunidad mediada por célula de tipo Th1 probablemente se involucra en la protección contra NTHi. Por consiguiente, los anticuerpos de lgG2a de anti-PD que son un buen indicador de una respuesta de Th 1 , también se examinaron. 5.1. Anticuerpos de Anti-FG: Ver Sección 3 5.2. IgG Polisacárido Anti-Pneumococal Ver Sección 3 5.3. Respuesta Celular Específica de FG Ver Sección 3 5.4. Dosis de ELISA de IgG de Suero de anti-PD, lgG1, 2a y 2b: Como se muestra en la Figura 19, las respuestas de IgG de suero total al vehículo de PD no se afectaron significativamente por la presencia de FG en formulaciones de conjugado de PS pneumococal, cualquier que fuera el adyuvante utilizado (CpG o CpG de Alumbre). La elevada proporción de anticuerpos de lgG2a de anti-PD de suero (alrededor de 30% del IgG total) se produjo después de la vacunación con CpG o las formulaciones de conjugado de PS de CpG de Alumbre no se modificaban por la adición de FG en esas formulaciones (Figura 20). Tal respuesta de lgG2a fue indicativa de una fuerte inmunidad de Th 1 . Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la combinación de PS pneumococal conjugado con PD y antígeno de FG de RSV dentro de una formulación de CpG o de CpG de Alumbre, no altera la respuesta inmune de anti-PD. DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN Sección 1 : Alumbre/3D-MPL Los resultados demostraron que la combinación de conjugados de PS pneumococales y antígeno de FG de RSV dentro de una formulación de 3D-MPL de Alumbre no altera las respuestas inmunes anti-pneumococales. Tanto el nivel de respuestas inmunes específicas de FG celulares como humorales parece afectarse ligeramente por la mezcla, sin embargo, no se afecta el perfil de Th de la formulación de FG simple. Sección 2: DQ/3D-MPLin Los resultados demostraron que la combinación de conjugados de PS pneumococales y antígeno de FG de RSV en una formulación con DQ/3D-MPLin no altera las respuestas inmunes anti-pneumococales humorales ni las respuestas específicas de FG humorales. El análisis adicional de la respuesta celular sugiere que la combinación de anbos antígenos en una formulación con DQ/3D-MPLin afecta algo la inducción de I FN-?. Sin embargo, esto no afecta el perfil de Th en comparación con la formulación de FG (sola). Sección 3: CpG/Alumbre de CpG -- El resultado demostró que la combinación de conjugados de PS pneumococales y antígeno de FG de RSV en una formulación con CpG o CpG de Alumbre no redujo ni alteró la respuesta inmune anti-pneumococal humoral ni las respuestas específicas de FG celulares y humorales. Sección 4: CpG/Alumbre de CpG Los resultados demistraron que la combinación de PS pneumococal conjugado con PD y el antígeno de FG de RSV en una formulación con CpG o CpG de Alumbre no redujo ni alteró la respuesta inmune de anti-PD. En conclusión, existe una combinación favorable de vacua pneumococal de valencia 23 con 3D-MPL de FG de RSV en la cual existe un efecto sínergístico para ambas vacunas, ya que ambas vacunas muestran mejoras en ciertas pruebas inmunológicas e inhibición alguna en ninguna prueba. A partir de los resultados anteriores presentados, también se observa la combinación favorable cuando se combina un PS pneumococal conjugado con PD de valencia 1 1 con antígeno de FG de RSV dentro de un conjunto de adyuvantes de Th 1 . No obstante, para la mayoría de las lecturas inmunes para los diversos adyuvantes de Th 1 examinados, la combinación de antígenos de vacuna no se daña o solo ligeramente (y no tan significativamente para que se comprometa la respuesta total), las características pre-existentes de cualquier vacuna. Como se observa cuando se combina FG con la vacuna de valencia 23 en el Ejemplo 1 , en ciertos casos una o la otra vacuna no mostraron mejoras en ciertas pruebas inmunológicas.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1 . Una composición de vacuna caracterizada porque comprende: (a) uno o más polisacáridos de Streptococcus pneumoniae ya sea conjugados con una proteína o péptido o no conjugados; y (b) un antígeno de RSV en conjunto con un adyuvante, el cual es un estimulador preferencial de una respuesta de tipo Th1 .
2. 2. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 , caracterizada porque el polisacárido de Streptococcus pneumoniae se conjuga preferentemente con una proteína del grupo que comprende; proteína D de Haemophilus influenzae B o un fragmento de la misma, una versión lipidada de proteína D (lipoproteína D); toxina de Tétanos y toxina de Difteria.
3. 3. Una composición de vacuna según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque adicionalmente comprende un vehículo.
4. 4. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el estimulador preferencial de una respusta de tipo Th1 es al menos un adyuvante seleccionado del grupo de adyuvantes que comprende: 3D-MPL, 3D-MPL en donde el tamaño de las partículas de 3D-MPL es preferentemente de aproximadamente o menos de 100nm, QS21 , una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido de CpG.
5. 5. Una composición de vacuna según la reivindicación 4, caracterizada porque el estimulador preferencial de la respuesta de tipo Th 1 comprende 3D-MPL.
6. 6. Una composición de vacuna según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además QS21 .
7. 7. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el polisacárido de Streptococcus pneumonoiae es una vacuna polisacárida pneumococal de valencia 23.
8. 8. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque es una vacuna polisacárida pneumococal conjugada de valencia 1 1 .
9. 9. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el antígeno de RSV es una glicoproteína de cubierta de RSV humana.
10. 10. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el antígeno de RSV es FG quimérico o un fragmento del mismo. 1 1 . Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque se presenta adicionalmente un antígeno de virus de influenza. 12. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizada porque el vehículo se selecciona a partir del grupo que comprende hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y tocoferol y una emulsión de aceite en agua. 13. Un método para preparar una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el método comprende la mezcla de un antígeno de Streptococcus pneumoniae y un antígeno de RSV con un adyuvante inductor de Th 1 . 14. Un método para preparar una composición de vacuna caracterizada porque comprende la mezcla de un conjugado de polisacárido de Streptococcus pneumoniae conjugado con proteína D o un fragmento del mismo, con un antígeno de RSV y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 15. Un método para la prevención o disminución de infección por RSV y/o Streptococcus pneumoniae de un paciente, caracterizado porque comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.