ES2304960T3 - Vacuna combinada contra streptococcus pneumoniae y virus sincicial respiratorio (rsv). - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna que comprende: (a) uno o más polisacáridos de Streptococcus pneumoniae bienconjugados a una proteína o péptido, o no conjugados: y (b) un antígeno de virus sincicial respiratorio (RSV) en conjunción con un coadyuvante que es un estimulador de una respuesta de tipo Th1.

Description

Vacuna combinada contra Streptococcus pneumoniae y virus sincicial respiratorio (RSV).

La presente invención se refiere a formulaciones de vacuna, procedimientos para prepararlas y su uso en profilaxis y terapia. En particular, la presente invención se refiere a vacunas de combinación para la administración a niños y ancianos. Más particularmente, la invención se refiere a vacunas de combinación para la protección contra infección o enfermedad por Streptococcus pneumoniae y virus sincicial respiratorio (RSV).

Streptococcus pneumoniae es una bacteria grampositiva responsable de considerable morbilidad y mortalidad, particularmente en jóvenes y ancianos. La colonización expansiva de las vías respiratorias y el oído medio, especialmente en niños pequeños, es la causa aislada más común de consultas hospitalarias en los Estados Unidos. La bacteria puede ser invasiva, infectar los pulmones inferiores y causar neumonía. La tasa de neumonía neumocócica en los Estados Unidos para personas mayores de 60 años se estima en 3 a 8 por 100.000. En el 20% de los casos, esto conduce a bacteriemia y otras manifestaciones tales como meningitis, con una tasa de mortalidad cercana al 30%, incluso con tratamiento con antibióticos. Se conocen 90 serotipos de Streptococcus pneumoniae, determinados por las estructuras del polisacárido capsular que rodea la bacteria, y este es su principal factor de virulencia.

Se conoce una vacuna neumocócica 17-valente (Moniarix), sobre la base del polisacárido purificado de los serotipos de neumococo más comúnmente relacionados con enfermedad invasiva. El procedimiento de purificación de estos polisacáridos se describió en la patente europea 72513 B1. Estudios de eficacia de la vacuna con vacunas de menor valencia demostraron una eficacia del 70 al 90% con respecto a los serotipos presentes en la combinación. Estudios controlados de casos en los Estados Unidos con personas >55 años que usaron una vacuna 14-valente demostraron un 70% de eficacia (Mills, O.F., y Rhoads, G.G; J. Clin. Epidemiol. (1996); Vol. 49(6) 631-636). La inclusión de polisacáridos adicionales (a fin de preparar una vacuna neumocócica 23-valente) se aceptó sobre la base de una respuesta sexológica adecuada, aún cuando se carecía de datos sobre eficacia clínica (K. R. Brown en "Combined Vaccines and Simultaneous Administration", Ed. Williams et al. New York Academy of Sciences 1995, pp. 241-249).

Se estudió la inmunización simultánea con una vacuna neumocócica 23-valente (Pnu-Immune 23 - Lederle EE. UU.) y vacuna antigripal (Fluarix) (TJ Fletcher, TW Tunnicliffe, K Hammond, K Roberts, JG Ayres; (1997) Br. Med. J. 314: 1663) y no se observaron diferencias inmunológicas significativas entre la inmunización simultánea y las inmunizaciones separadas entre sí por un mes.

Los polisacáridos neumocócicos se pueden hacer más inmunogénicos en lactantes a través de su acoplamiento químico a portadores proteicos. Se están realizando estudios de eficacia clínica para verificar este concepto respecto de la eficacia en la prevención de otitis media en lactantes.

Los lactantes expuestos a una vacuna neumocócica conjugada 7 a 11-valente pueden ser reforzados con la vacuna neumocócica de polisacárido simple 23-valente a fin de incrementar la cobertura de serotipos y las concentraciones de IgG (Block, SL, JA. Hedrick, R.A. Smith, R.D. Tyler, M. Giordani, M.D. Blum, J. Sadoff, E. Keegan; Abstract G-88, 37º ICAAC, Toronto (1997); Anderson, E.L., Kennedy, D.J., Geldmacher, K.M., Donnelly, J., Mendelman, P; The Journal of Paediatrics, Mayo 1996. Vol. 128, n.º 5, Parte 1, 649-653).

El virus sincicial respiratorio humano (RSV) es un miembro de la familia Paramixoviridiae de virus y causa enfermedad de las vías respiratorias inferiores, particularmente en niños pequeños y bebés. Informes recientes sugieren que RSV es un patógeno importante en adultos, particularmente los ancianos.

RSV es un virus con envoltura que contiene un genoma no segmentado, de cadena negativa de ácido ribonucleico (ARN) de 15.222 nucleótidos que codifican 10 ARN mensajeros, cada uno de los cuales codifica un único polipéptido. Tres de las diez proteínas son proteínas de superficie transmembrana: las proteínas G (fijación), F (fusión) y SH. Dos proteínas son proteínas de la matriz del virión (M y M2), tres proteínas son componentes del nucleocápside (N, P y L), y dos proteínas no son estructurales (NS1 y NS2). Existen dos cepas antigénicamente diferenciadas de RSV, designadas cepa A y B. La caracterización de las cepas de estos grupos determinó que las principales diferencias residen en las proteínas G, mientras que las proteínas F están conservadas.

El virus sincicial respiratorio (RSV) aparece en brotes estacionales, con picos durante el invierno en climas templados y durante la estación lluviosa en climas más cálidos (DeSilva LM & Hanlon MG. Respiratory Syncytial Virus: a report of a 5-year study at a children's hospital. J Med Virol 1986; 19:299-305). Cualquiera sea la zona, RSV tiende a presentar un patrón regular y predecible y rara vez se presenta al mismo tiempo que otros patógenos viral respiratorios que aparecen en brotes (Glezen WP & Denny FW. Epidemiology of acute lower respiratory disease in children. N. Engl. J Med 1973; 288:498-505).

RSV es una causa importante de enfermedad severa de las vías respiratorias inferiores en niños. Se estima que el 40-50% de los niños hospitalizados con bronquiolitis y el 25% de los niños hospitalizados con neumonía son internados como consecuencia directa de infecciones por RSV. La infección primaria por RSV usualmente ocurre en niños menores de un año; el 95% de los niños tienen evidencias serológicas de infección anterior a los dos años de edad y el 100% de la población tienen serología positiva en la edad adulta.

En lactantes y niños pequeños, la infección progresa desde las vías respiratorias superiores a las inferiores en aproximadamente el 40% de los casos y la presentación clínica es de bronquiolitis o neumonía. Los niños de dos a seis meses de edad están en mayor situación de riesgo de desarrollar manifestaciones severas de infección por RSV (principalmente insuficiencia respiratoria); sin embargo, los niños de cualquier edad con enfermedad cardiaca o pulmonar subyacente, los lactantes prematuros y los lactantes inmunocomprometidos también están en situación de riesgo de complicaciones severas.

Durante toda la vida ocurren reinfecciones sintomáticas y cada vez es más obvio que RSV también es un patógeno importante de los adultos, especialmente para los ancianos.

Casi con certeza hay subdiagnóstico de infección por RSV en adultos, en parte debido a que se considera una infección de los niños. En consecuencia, no se buscan evidencias del virus en adultos para explicar una enfermedad respiratoria. Además, es difícil identificar RSV en secreciones nasales de individuos que tienen cierto grado de inmunidad parcial al virus, como ocurre en la gran mayoría de los adultos. Por lo general, los adultos jóvenes o de mediana edad desarrollar un síndrome similar a un resfrío persistente cuando se infectan por RSV. Los individuos ancianos pueden desarrollar un síndrome respiratorio prolongado que casi no se puede distinguir de la gripe, con síntomas respiratorios superiores que pueden estar acompañados de compromiso de las vías respiratorias inferiores, incluso neumonía. Las poblaciones de ancianos internados en instituciones representan una particular preocupación, dado que comprenden grandes cantidades de individuos susceptibles reunidos. La diseminación de la infección a través de dicha población, muchos de los cuales tienen múltiples problemas médicos que los predisponen a un curso más severo de la enfermedad, es difícil de controlar.

Además, informes de estudios recientes que evalúan el impacto de la infección por RSV como causa de hospitalización en adultos y en ancianos sanos que viven en comunidades apuntan en particular a un papel importante de la infección por RSV en la enfermedad de las vías respiratorias inferiores en estas poblaciones (Dowell SF, Anderson LJ, & Gary Jr HE, et al. J Infect Dis 1996; 174: 456-462; Falsey AR, Cunningham CK, & Barker WH, et al. J Infect Dis 1995; 172:389-394). Dowell identificó el RSV como uno de los cuatro patógenos más comunes causales de enfermedad severa de las vías respiratorias inferiores que dan por resultado la hospitalización de adultos (Dowell SF, Anderson LJ, & Gary Jr HE, et al. J. Infect Dis 1996; 174:456-462). Falsey demostró que las infecciones severas por RSV en personas ancianas no se limitan a los hogares geriátricos o las situaciones de brotes. Más bien, la infección por RSV es una causa predecible de enfermedad severa en paciente ancianos que residen en comunidad. De manera similar a las hospitalizaciones por gripe A, las relacionadas con infecciones por RSV se asocian con sustancial morbilidad, como se evidencia por estadías hospitalarias prolongadas, elevadas tasas de admisión en unidades de cuidados intensivos y altas tasas de soporte de ventilación (Falsey AR, Cunningham CK, & Barker WH, et al. J Infect Dis 1995; 172:389-394).

Estos estudios apuntan a la necesidad médica y económica de una vacuna efectiva para prevenir las complicaciones severas de infección por RSV en lactantes, adultos y ancianos sanos que habitan en comunidades o internados en instituciones.

Para una vacuna de subunidad recombinante o una vacuna a virus muertos, el uso de un coadyuvante es de fundamental importancia. El alumbre es el único coadyuvante actualmente con licencia para uso humano. Sin embargo, el alumbre tiene limitado efecto coadyuvante sobre la respuesta humoral, y es sabido que induce principalmente una respuesta inmune de tipo Th2 (Byars NE, Nakano G, & Welch M, et al. Vaccine 1991; 9:309-318). Sin embargo, se halló que el monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL) en combinación con alumbre mejora la respuesta humoral y estimula preferentemente una inmunidad de tipo Th1. La sal de aluminio con coadyuvante 3D-MPL se denota alum/3D-MPL.

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La presente invención provee una composición de vacuna que comprende:

(a) uno o más polisacáridos de Streptococcus pneumoniae conjugado con una proteína o un péptido, o no conjugado; y

(b) un antígeno RSV

en combinación con un coadyuvante que es un estimulador preferencial de una respuesta de tipo Th1.

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La tendencia a usar vacunas de combinación tiene la ventaja de reducir las molestias para el receptor, facilitar el esquema de dosis y asegurar que se complete el régimen; pero también está el riesgo concomitante de reducir la eficacia de la vacuna. En consecuencia, sería ventajoso preparar combinaciones de vacuna que cubran las necesidades de una población, y que además no interfieran entre sí. También sería ventajoso que la combinación de las vacunas diera por resultado sinergia con el consecuente mejoramiento de la eficacia de una o ambas vacunas, o mejores correlatos de protección para una o ambas vacunas. Esto se logra mediante la composición de la vacuna de la invención, lo cual es de gran beneficio para la administración a niños o ancianos que pueden estar en particular situación de riesgo de infección por Streptococcus pneumoniae y/o RSV.

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Opcionalmente, la composición de vacuna de la invención además comprende uno o más de varios otros antígenos, por ejemplo el antígeno de virus de gripe. Las vacunas antigripales disponibles en la actualidad incluyen vacunas de virus enteros inactivados, vacunas de partículas divididas y vacunas de subunidades. Las vacunas antigripales de todos los tipos suelen ser vacunas trivalentes. Contienen antígenos derivados de dos cepas de virus de gripe A y una cepa de virus de gripe B. Una dosis estándar de 0,5 ml de la mayor parte de ellas contiene 15 \mug del componente de hemaglutinina de cada cepa.

El procedimiento para determinar las cepas que se incorporan a una vacuna antigripal es un proceso complejo que incluye la colaboración entre la Organización Mundial de la Salud, las autoridades sanitarias nacionales y los fabricantes de vacuna.

Los polisacáridos neumocócicos se pueden transformar en más inmunogénicos mediante su acoplamiento químico a portadores proteicos y se están realizando estudios de eficacia clínica para verificar este concepto para la eficacia en la prevención de otitis media en lactantes.

Generalmente se usan dos procedimientos de conjugación para producir construcciones de polisacáridos inmunogénicos: (1) conjugación directa de hidratos de carbono y proteínas; y (2) conjugación indirecta de hidratos de carbono y proteína a través de un ligador bifuncional o reactivo espaciador. Por lo general, tanto la conjugación directa como la indirecta requieren la activación química del resto de hidrato de carbono antes de la derivación. Ver por ejemplo el documento US 5.651.971 y Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds), Vol. 10, 48 - 114 (1989).

El polisacárido de Streptococcus pneumoniae en la composición de acuerdo con la invención de preferencia, pero no necesariamente, está en una forma conjugada. No se excluye el polisacárido de S. pneumoniae no conjugado.

Los polisacáridos de Streptococcus pneumoniae, si se conjugan, lo hacen con una proteína o un péptido. Los antígenos polisacáridos se han conjugado a numerosas proteínas de linfocitos T cooperadores. Estas proveen epitopos de linfocitos T cooperadores. Las proteínas representativas incluyen el toxoide de difteria, el toxoide tetánico y la proteína D o su derivado lipídico lipoproteína D proveniente de Heamophilus influenzae B. Otros portadores proteicos adecuados incluyen Crm 197 de difteria y la principal proteína no estructural de la gripe, NS1 (particularmente los aminoácidos 1-81).

La proteína D es un componente preferidos de una vacuna de acuerdo con la invención en la cual los polisacáridos de Streptococcus pneumoniae están conjugados. También son adecuados los fragmentos de proteína D. La proteína D está descrita en el documento EP 0 594 610. Los fragmentos adecuados para el uso incluyen fragmentos que abarcan epitopos de linfocitos T cooperadores. En particular, un fragmento de proteína D de preferencia contiene el tercio N terminal de la proteína.

Sorprendentemente, también se halló que la combinación de polisacárido de Streptococcus pneumoniae conjugado con proteína D con un antígeno de RSV en la composición de acuerdo con la invención no afecta la respuesta inmune al componente de proteína D del conjugado. La proteína D es un antígeno protector contra la infección no tipificada por Haemophilus influenzae B (NTHi).

En consecuencia, la invención también provee una vacuna que comprende un antígeno de RSV y al menos un polisacárido de Streptoccocus pneumoniae conjugado con proteína D o uno de sus fragmentos, opcionalmente junto con un coadyuvante, por ejemplo un coadyuvante Th1.

Generalmente, el componente de Streptococcus pneumoniae en una vacuna de la presente invención comprende antígenos polisacáridos (de preferencia conjugados), en los cuales los polisacáridos se derivan de al menos cuatro serotipos de neumococos. De preferencia, los cuatro serotipos incluyen 6B, 14, 19F y 23F. Con mayor preferencia, se incluyen al menos 7 serotipos en la composición, por ejemplo los derivados de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Con aún mayor preferencia, se incluyen al menos 11 serotipos en la composición, por ejemplo en una forma de realización la composición incluye polisacáridos capsulares derivados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F (de preferencia conjugados). En una forma preferida de realización de la invención, se incluyen al menos 13 o al menos 15, o al menos 17 antígenos polisacáridos (de preferencia conjugados), si bien también se contempla la inclusión de otros antígenos polisacáridos, por ejemplo 23-valentes (por ejemplo los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F), en la invención.

Para la vacunación de ancianos (por ejemplo para prevenir la neumonía) es conveniente incluir los serotipos 8 y 12F (y con mayor preferencia también 15 y 22) a la composición antigénica 11-valente antes descrita, para formar una vacuna 15-valente, mientras que para lactantes y niños en la primera infancia (cuando la otitis media causa mayor preocupación) se incluyen ventajosamente los serotipos 6A y 19A para formar una vacuna 13-valente.

Los antígenos RSV adecuados para su inclusión en las vacunas de acuerdo con la invención incluyen virus RSV inactivado, por ejemplo virus RSV inactivado por medios químicos, por ejemplo con formol. El virus inactivado puede ser preparado, por ejemplo, a partir de un RSV atenuado, por ejemplo por pasaje o por manipulación genética, o se puede producir a partir de RSV de tipo silvestre. Se puede usar un RSV recombinante obtenido por ingeniería, a fin de contener un antígeno de envoltura proveniente de una cepa diferente de RSV, por ejemplo un esqueleto de cepa A de RSV con una proteína de envoltura de RSV B, opcionalmente atenuada.

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Los antígenos RSV adecuados incluyen en particular los antígenos derivados del virus RSV, de preferencia glucoproteínas de envoltura de RSV humano, por ejemplo las proteínas de RSV F o G o sus fragmentos inmunogénicos, según se describe por ejemplo en la patente de los Estados Unidos N.º 5.149.650, o un polipéptido quimérico que comprende al menos un fragmento inmunogénico de ambas proteínas de RSV F y G, ventajosamente una proteína quimérica RSV FG tal como se describe por ejemplo en la patente de los Estados Unidos N.º 5.194.595 de preferencia expresada de células CHO.

De preferencia, el antígeno RSV es una glucoproteína de envoltura de RSV o uno de sus derivados. De preferencia, el antígeno se deriva de la cepa A de RSV. Como alternativa, se puede derivar el antígeno de la cepa B, o puede haber un antígeno de cada una de las cepas A y B en la composición. Los antígenos preferidos se seleccionan de la glucoproteína F, la glucoproteína G o una proteína de fusión FG o sus derivados inmunogénicos.

Generalmente, los derivados inmunogénicos proteínas carentes del dominio de transmembrana, es decir F \Deltatm, G \Deltatm y F \Deltatm G\Deltatm. De preferencia la secuencia señal se elimina de la proteína G. Se prefiere que esté presente al menos aproximadamente el 50% o al menos aproximadamente el 80% (secuencia contigua) del dominio extracelular de la proteína F o G. Los ejemplos particulares incluyen 1-526 o 1-489 aminoácidos de la proteína F, los aminoácidos 69-298 o las posiciones alternativas 97-279 de la proteína G, y la proteína de fusión F1-526G69-298. Una fusión alternativa comprende 1-489 aminoácidos de F seguidos de 97-279 de la proteína G.

La composición de vacuna RSV / Streptococcus pneumoniae de acuerdo con la invención comprende un coadyuvante que es un inductor preferencial de una respuesta de tipo Th1 para facilitar la rama celular del sistema inmune.

Una respuesta inmune es generada contra un antígeno a través de la interacción del antígeno con las células del sistema inmune. La respuesta inmune obtenida se puede distinguir en forma general en dos categorías extremas, las respuestas inmunes humoral o celular (tradicionalmente caracterizadas por tener mecanismos efectores de protección por anticuerpos y celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo Th1 (respuesta celular), y respuestas inmunes de tipo Th2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes extremas de tipo Th1 se pueden caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y restringidos a haplotipo, y las respuestas de linfocitos citolíticos naturales. En ratones, las respuestas de tipo Th1 a menudo se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en humanos corresponden a los anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo Th2 se caracterizan por la generación de un amplio rango de isotipos de inmunoglobulinas, que en ratones incluyen IgGI, IgA e IgM.

Se puede considerar que la fuerza impulsora detrás de la generación de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citoquinas, un grupo numeroso de mensajeros proteicos identificados que tienen por función ayudar a las células del sistema inmune y dirigir la eventual respuesta inmune hacia una respuesta Th1 o Th2. En consecuencia, las concentraciones elevadas de citoquinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes celulares ante determinado antígeno, mientras que los niveles elevados de citoquinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes humorales contra el antígeno.

Es importante recordar que la distinción entre las respuestas inmunes de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo sostiene una respuesta inmune que se describe con predominio de Th1 o con predominio de Th2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos descritos en clones de células T CD4 +ve murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 se asocian con la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por los linfocitos T. Otras citoquinas a menudo asociadas directamente con la inducción de las respuestas inmunes de tipo Th1 no son producidas por las células T, por ejemplo IL-12. En contraste, las respuestas de tipo Th2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y factor de necrosis tumoral \beta (TNF-\beta).

Es sabido que ciertas vacunas coadyuvantes son particularmente adecuadas para la estimulación de cualquier respuesta de citosina de tipo Th1 o Th2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del balance de Th1 :Th2 de la respuesta inmune response tras una vacunación o infección incluyen la medición directa de la producción de las citoquinas Th1 o Th2 por los linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno y/o la medición de la relación de IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpo específicas de antígeno.

En consecuencia, un coadyuvante tipo Th1 es aquel que estimula las poblaciones aisladas de células T a producir niveles elevados de citoquinas de tipo Th1 cuando son reestimuladas con antígeno in vitro, e induce respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígeno asociadas con el isotipo de tipo Th1.

Los sistemas coadyuvantes adecuados que promueven una respuesta con predominio de Th1 incluyen monofosforil lípido A o uno de sus derivados, en particular monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, y una combinación de monofosforil lípido A, de preferencia monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Otros sistemas coadyuvantes adecuados se describen más adelante.

Dichos coadyuvantes se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional N.º WO 94/00153 y WO 95/17209.

3D-MPL está descrito en el documento GB 2220211 (Ribi). Desde el punto de vista químico, es una mezcla de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem Montana. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado está descrita en la patente europea EP 0 689 454 B.

De preferencia, el tamaño de las partículas de 3D-MPL es lo suficientemente pequeño para ser filtrado en forma estéril a través de una membrana de 0,22 micrones (tal como se describe en la patente europea EP 0 689 454).

3D-MPL normalmente está presente en el rango de 10 \mug - 100 \mug, de preferencia 25-50 \mug por dosis, en la cual el antígeno por lo general está presente en un rango de 2-50 \mug por dosis.

Otro coadyuvante preferido comprende QS21, una fracción Hplc no tóxica purificada de una saponina derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente se puede mezclar esta última con monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3DMPL), opcionalmente junto con un portador.

Un procedimiento para producir QS21 está descrito (como QS21) en la patente de los Estados Unidos N.º 5.057.540.

Las formulaciones coadyuvantes no reactogénicas que contienen QS21 están descritas en el documento WO 96/33739. Se ha demostrado que dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol son exitosos coadyuvantes estimuladores de Th1 cuando se formulan junto con un antígeno. En consecuencia, las composiciones de vacuna que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de QS21 y colesterol.

Otros coadyuvantes que son estimuladores preferidos de la respuesta de Th1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias no metiladas CpG como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes coadyuvantes estimuladores de Th1, por ejemplo los antes mencionados en la presente, también se consideran para proporcionar un coadyuvante que sea un estimulador preferido de la respuesta de tipo Th1. Por ejemplo, QS21 (de preferencia también con colesterol) puede ser formulado junto con 3D-MPL. La proporción de QS21 : 3D-MPL generalmente estará en el orden de 1 : 10 a 10 : 1; de preferencia 1:5 a 5 : 1 y a menudo sustancialmente 1 : 1. El rango preferido para la sinergia óptima es 2,5 : 1 a 1 : 1 3D MPL: QS21.

De preferencia, también está presente un portador en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El portador puede ser una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, por ejemplo escualeno, alfa-tocoferol y tween 80. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

En un aspecto preferido, se puede añadir hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio a la composición de la invención, a fin de mejorar la inmunogenicidad.

En un aspecto particularmente preferido, los antígenos de la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con 3D-MPL y alumbre.

Por lo general, para la administración humana estarán presentes QS21 y 3D-MPL en una vacuna en el rango de 1 \mug - 200 \mug, por ejemplo 10-100 \mug, de preferencia 10 \mug - 50 \mug por dosis. Por lo general, el aceite en agua comprende del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10% de alfa- tocoferol y del 0,3 al 3% de tween 80. De preferencia, la proporción de escualeno: alfa tocoferol es igual o inferior a 1, dado que esto provee una emulsión más estable. También puede estar presente span 85 en una concentración del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención también contengan un estabilizante.

Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua de preferencia contienen un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno, un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un portador acuoso. El portador acuoso puede ser, por ejemplo, solución fisiológica con buffer fosfato.

Una formulación de coadyuvante particularmente poderosa que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La vacuna de la presente invención contiene una cantidad inmunoprotectora de los antígenos y se puede preparar mediante técnicas convencionales.

La preparación de vacunas se describe en general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, EE. UU., 1978. La encapsulación en liposomas está descrita, por ejemplo, por Fullerton, patente de los Estados Unidos N.º 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas está descrita, por ejemplo, por Likhite, patente de los Estados Unidos N.º 4.372.945 y por Armor et al., patente de los Estados Unidos N.º 4.474.757.

La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Dicha cantidad varía según el inmunógeno específico utilizado. Por lo general, se espera que cada dosis comprenda 1-1000 mg de proteína, de preferencia 2-100 mg, con máxima preferencia 4-40 mg. Una cantidad óptima de una vacuna particular se puede verificar mediante estudios estándar que incluyen la observación de los títulos de anticuerpo y otras respuestas en los sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo en aproximadamente 4 semanas. Para los lactantes en particular, se pueden preferir tres dosis.

Además de la vacunación de las personas susceptibles a infecciones por Streptococcus pneumoniae o RSV, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar en la fabricación de una vacuna para tratar, como terapéutica inmunológica, pacientes que padecen dichas infecciones.

En otro aspecto de la presente invención, se provee un procedimiento de fabricación de una formulación de vacuna como la que se describe en la presente, en la cual el procedimiento comprende mezclar un antígeno de Streptococcous pneumoniae y un antígeno de RSV con un coadyuvante inductor de Th-1, por ejemplo 3D-MPL y, de preferencia, un portador, por ejemplo alumbre.

Si se desea, se pueden añadir otros antígenos, en cualquier orden conveniente, a fin de proveer composiciones de vacuna multivalentes tales como las descritas en la presente.

La invención también provee un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende mezclar un polisacárido de Streptococcus pneumoniae conjugado con la proteína D con un antígeno RSV y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En los siguientes ejemplos, ser llevó a cabo la evaluación del efecto de combinar un candidato de vacuna RSV, FG con la vacuna neumocócica 23-valente disponible en el comercio (Pneumune de Wyeth-Lederle) en un modelo murino. Este modelo estudió una inmunización combinada en la cual las vacunas se mezclaron físicamente y se inyectaron en el mismo sitio. Los resultados de este estudio demuestran una sinergia mutua, lo cual da por resultado mejores respuestas para ciertos marcadores inmunológicos para ambas vacunas.

Los ejemplos también demuestran una vacuna combinada con un candidato de vacuna RSV y una vacuna neumocócica conjugada 11-valente, en un modelo murino. Este estudio demuestra que para la mayor parte de los marcadores inmunológicos no hay interferencia o solo interferencias menores entre los antígenos, pero de hecho para algunos marcadores inmunológicos hay una respuesta mejorada y en consecuencia un efecto sinérgico. Cabe destacar que no hay reducción de la respuesta inmune al componente de proteína D del polisacárido neumocócico conjugado.

Ejemplos Ejemplo 1 Evaluación de la vacuna combinada RSV + neumocócica 23-valente 1. Proceso de formulación

Antígeno FG diluido en H_{2}O (2 \mug:1/10 HD) se adsorbió durante 15 min en 50 \mug de Al(OH)_{3}. Cuando se usó, se añadieron 5 \mug de 3DMPL a la preparación como suspensión de partículas de 100 nm y se incubó durante 30 min. Luego se agregó buffer a las formulaciones con PBS concentrado 10 veces a pH 7.4. Cuando se usó, se añadió la vacuna neumocócica 23-valente (11,5 \mug:1/50 HD) 15 min después de la adición de la solución buffer. Para grupos sin FG se siguió la misma secuencia de formulación, por lo que primero se adsorbió 3D-MPL en Al(OH)_{3} antes de añadir la vacuna neumocócica 23-valente. Quince minutos después de la adición del buffer concentrado o la vacuna neumocócica 23-valente, se añadió fenoxietanol (5 mg/ml) a las formulaciones como conservante.

Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente con agitación. Las formulaciones se prepararon simultáneamente para las 2 inyecciones con una maduración de 7 días de las formulaciones terminadas antes de la primera inyección.

Composición de los constituyentes de la formulación

1

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2. Protocolo de inmunización

Se inmunizaron 11 grupos de 10 ratones por diferentes vías (50 \mul) los días 0 y 28 con diversas formulaciones (ver Tabla 1). Los grupos 7 y 8 fueron inmunizados con RSV vivo por vía intranasal (60 \mul). Se obtuvo suero los días 28 (28 d Post I) y 42 (14 d Post II). El día 42 se extrajeron el bazo y células ganglionares de 5 ratones de los grupos 4, 5, 6, 7, 8, 9, así como de 5 ratones no expuestos Balb/c (grupo 1, no inmunizado).

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3. Respuesta humoral 3.1. Anticuerpos anti-FG

Todos los resultados humorales se realizaron en 10 ratones/grupo (respuesta individual para los títulos anti-FG y conjuntos de sueros para el perfil de isotipo) y los resultados celulares se presentaron para 5 ratones/grupo.

Se obtuvieron sueros individuales 28 días después de la primera inmunización y 14 días después de la segunda inmunización, y se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos Ig específicos para FG y la distribución de su isotipo (IgG2a, IgG1).

El protocolo de ensayo era el siguiente: cubierta durante la noche a 4ºC con 50 \mul de FG 54/023 purificado (1 \mug/ml) por cavidad, saturación 1 h a 37ºC, incubación con suero 1 h 30 a 37ºC, incubación con Ig biotina antimurino 1/1500 (o IgG1, IgG2a biotina 1/1000) 1 h 30 a 37ºC, incubación con estreptoperoxidasa 1/2500 30 min a 37ºC, incubación con OPDA Sigma 15 min a RT, detención con H_{2}SO_{4} 2N.

Se monitoreó la DO a 490 nm y se determinaron los títulos por Softmaxpro (ecuación de 4 parámetros) con referencia a una curva estándar, y expresados en EU/ml.

Los sueros individuales obtenidos 14 d Post II fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante el siguiente protocolo: se incubaron 50 \mul de diluciones seriadas al medio de suero (primera dilución 1/25) durante 1 hora a 37ºC con 50 \mul de una mezcla que contiene 300 pfu de RSV-A/Long (Lotr 14) y complemento de cobayo (dilución 1/25) en una placa de 96 cavidades por duplicado. Luego se añadieron 100 \mul de una suspensión celular HEp-2 con 10^{5} células/ml a cada cavidad y las placas se incubaron durante 4 días a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}.

Luego se aspiraron los sobrenadantes y tras la adición de 100 \mul de una preparación WST-1 (dilución 1/12,5) las placas se volvieron a incubar durante 24 h a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}. La DO se monitoreó a 595 nm y se determinaron los títulos por regresión lineal (i=a.logx + b): título = dilución del suero que da 50% de reducción de la máxima DO observada para las células ni infectadas.

Los controles de las pruebas incluyeron un conjunto de sueros humanos elegidos al azar (conjunto de sueros humanos) y Sandoglobuline (lote 069, IgG genérico humano producido por Sandoz).

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3.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Se midió la IgG murina contra polisacáridos nuemocócicos de los tipos 6B, 14, 19F y 23F por ELISA en un procedimiento adaptado del protocolo de CDC. Este protocolo incluye la adición de polisacárido soluble de pared celular (CPS) al suero para inhibir la medición de los anticuerpos CPS. CPS es una fosforilcolina que contiene ácido teicoico común a todos los neumococos. Está presente bajo la cápsula y los anticuerpos contra ella son solo débilmente protectores. Dado que CPS está ligada al polisacárido capsular, usualmente hay 0,5 a 1% de CPS como contaminante del polisacárido capsular purificado que se usa para recubrir las placas de ELISA. En consecuencia, la medición de los anticuerpos contra CPS puede confundir en la interpretación de los resultados de ELISA con respecto al polisacárido capsular.

Se efectuó ELISA con polisacáridos recubiertos con 20, 5, 10 y 20 \mug/ml en buffer carbonato para los tipos 6B, 14, 19F y 23F respectivamente. Los sueros se premezclaron con el equivalente de 500 \mug/ml de CPS en suero no diluido, y se incubaron durante 30 minutos antes de la adición a la placa de ELISA. Se detectó IgG murino mediante peroxidasa de IgG (H + L) antimurino de cabra de Jackson ImmunoLab en dilución 1:2000. Las curvas de titulación se refirieron a anticuerpos monoclonales murinos específicos de polisacárido con concentración conocida para cada serotipo, mediante comparación logística log de SoftMax Pro. Los monoclonales usados eran HASP4, PS 14/4, PS-19/5 y PS23/22 para los tipos 6B, 14, 19F y 23F respectivamente. Debido a la limitada cantidad de suero disponible, se analizaron conjuntos de sueros, por lo que no se dispone de análisis estadístico.

4. Respuesta celular

Se aislaron células de bazo y de ganglios linfáticos 14 d Post II de los grupos 4-9 y de ratones no expuestos (Grupo 1) para ser usados como control negativo para el análisis de respuesta celular específica de FG. Las muestras se analizaron para linfoproliferación específica de FG y secreción de citoquinas (IFN-\gamma+ IL-5).

Se evaluó la proliferación después de 96 h de incubación de 4x10^{5} células/cavidad de placas de 96 cavidades con 200 \mul de medio que contiene 10 a 0,03 \mug/ml de FG (diluciones al tercio). Tras la incorporación de ^{3}H-timidina, se midió la proliferación específica de FG según el protocolo estándar. Se evaluó la inducción de citoquinas después de 96 h de incubación de 2,5x10^{6} células por cavidad de 24 cavidades con 1 ml de medio que contiene 10 \mug a 0,01 \mug de FG (diluciones al décimo). Luego se cosecharon los sobrenadantes para determinar la cantidad de IFN-\gamma e IL-5 inducidos por ELISA según el protocolo estándar.

1. Grupos

10 grupos recibieron dos inmunizaciones de diversas formulaciones que contenían la vacuna 23-valente o FG, o una combinación de ambos formulada con hidróxido de aluminio y 3D-MPL o hidróxido de aluminio. El grupo 1 constituye el control para los estudios CMI. Los grupos 2 y 9 permiten la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna neumocócica 23-valente tras la inmunización intraperitoneal usada en la bibliografía para la evaluación de la vacuna neumocócica 23-valente, y tras la inmunización IM, los grupos 3 y 10 permiten un análisis paralelo a los grupos 2 y 9, excepto en que la vacuna neumocócica 23-valente está formulada con alumbre/3D-MPL. Los grupos 2 y 3 también constituyen controles del impacto de alumbre/3D-MPL sobre la vacuna neumocócica 23-valente cuando no se combina con FG alumbre/3D-MPL. El grupo 4 permite la evaluación de la respuesta inmune inducida tras la inmunización IM de la combinación de la vacuna neumocócica 23-valente y FG alumbre/3D-MPL. Los grupos 5 y 6 constituyen un control para la evaluación del impacto de alumbre/3D-MPL sobre FG cuando no está combinado con la vacuna neumocócica 23-valente. Las inmunizaciones con RSV vivo eran un control de la respuesta inmune inducida tras infección por RSV IN natural (Grupo 7). Por último, el grupo 9 es un control para el impacto de alumbre/3D-MPL solo.

TABLA 1

2

2. Respuesta humoral 2.1. Anticuerpos anti-FG

El análisis de anticuerpos anti-FG específicos a los 28 d Post I y 14 d Post II muestra la inducción de respuestas de anticuerpo similares tras la inmunización con FG Alumbre/3D-MPL / 23-valente (grupo 4) o FG Alumbre/3D-MPL solo (grupo 5) con títulos ligeramente superiores observados para FG Alumbre/3D-MPL /23-valente (Figura 1). La inmunización con FG Alumbre (grupo 6) induce los esperados títulos de anticuerpo inferiores en ambos puntos temporales. El análisis estadístico demuestra que de hecho hay una diferencia significativa entre los títulos de Ig anti-FG inducidos por los grupos 4 -6 a 28 d Post I y 14 d Post II.

Resultados

El análisis de anticuerpos neutralizantes anti-RSVA (Figura 2) presenta un perfil paralelo al observado para las respuestas de Ig anti-FG.

Sobre la base de los resultados anteriores, se calculó la relación de anticuerpos neutralizantes anti-FG / anti-RSV (28 d Post II) y se demostró que la relación de FG Alumbre/3D-MPL / 23-valente, FG Alumbre/3D-MPL y FG Alumbre es comparable a la relación inducida por el grupo RSV IN (Tabla 2).

TABLA 2

3

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Un análisis estadístico en profundidad de los títulos individuales de isotipos de Ig anti-FG, IgG1 e IgG2a demostró que la adición de la vacuna 23-valente a FG Alumbre/3D-MPL mantiene las respuestas de Ig e IgG1 y aumenta significativamente las respuestas de IgG2a (Figura 3A). Además, el análisis demostró que la relación IgG1/IgG2a y el título de IgG1 de FG Alumbre/3DMPL / 23 valente y FG Alumbre/3D-MPL eran similares aunque significativamente diferentes de FG Alumbre (Figura 3B). Las tres formulaciones tenían significativas diferencias en títulos de IgG2a.

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2.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Si bien los ratones y otros roedores pueden producir IgM contra inmunógenos polisacáridos, normalmente no producen IgG contra polisacáridos. Esto se debe a que sus sistemas inmunes carecen de las señales para inducir cambio de isotipo respecto de un antígeno independiente de T, por ejemplo un polisacárido. En consecuencia, la medición de IgG antipolisacárido en ratones es una prueba sensible para la inducción de una respuesta inmune independiente de T mejorada.

Las concentraciones de IgG inducida contra cuatro de los 23 polisacáridos se presentan en la Tabla 3. Tal como se observó en otros experimentos, no se produjo IgG contra los tipos de polisacárido 6B y 23F. Sin embargo, hubo IgG medible producido contra los tipos 14 y 19F.

Los grupos que no contenían vacuna 23-valente no mostraron IgG detectable contra los polisacáridos 14 y 19F, lo cual confirma la especificidad de las mediciones.

Una comparación de la vía de inmunización revela que cuando se agrega coadyuvante a la vacuna 23-valente con alumbre/ 3D-MPL, la vía intramuscular parece ser mejor que la intraperitoneal para el tipo 19F, mientras que la inversa es cierta para el tipo 14. Con 23-valente sola no parece haber diferencia significativa.

La vacuna 23-valente + alumbre/3D-MPL induce mayor IgG para los tipos 14 y 19F, en ambas vías IM y IP de inmunización, comparado con 23-valente sola. Sin embargo, cuando se combina con FG, hay una reducción de la respuesta de IgG. No obstante, la respuesta de IgG a 19F en 23-valente + FG/alumbre/3D-MPL es aún mayor que la inducida por 23-valente sola (comparación de grupos 3 y 4), y la respuesta al tipo 14 está mejorada.

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TABLA 3 IgG murino de vacuna de combinación RSV neumococo (\mug/ml)

4

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3. Respuesta celular

La linfoproliferación inducida específica de FG no mostró ninguna diferencia entre FG Alumbre/3D-MPL +/- 23-valente y FG Alumbre, ambos en células de bazo y en células de ganglios linfáticos.

El análisis de la producción de IL-5 y IFN-\gamma sugiere que la mezcla de la vacuna 23-valente con FG Alumbre/3D-MPL no obstaculiza la producción de IFN-\gamma, pero podría incrementar en parte la producción de IL-5 (Figura 4). Esta observación se confirmó por la diferencia de 2 a 8 de la proporción de IFN-\gamma/ IL-5 observada con dos dosis de FG (10 y 1 \mug de FG/ml) usadas para la reestipulación in vitro. Sin embargo, la vacuna FG Alumbre/3D-MPL /23-valente aún induce una relación mucho mayor de IFN-\gamma/ IL-5 que FG Alumbre.

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Conclusiones

El análisis de los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos Ig específicos anti-FG y anti-RSVA demuestra que la combinación de FG Alumbre/3D-MPL con la vacuna neumocócica 23-valente no obstaculiza la inducción de la respuesta observada con FG Alumbre/3D-MPL solo. La calidad de la respuesta medida por la relación de anticuerpos neutralizantes anti-FG/anti-RSVA también permanece sin cambios y cercana a la relación observada tras la infección natural con RSV por la vía IN.

El análisis de la respuesta celular específica de FG inducida sugiere que la adición de la vacuna 23-valente a FG Alumbre/3D-MPL no afecta la inducción de la linfoproliferación en células de bazo y en células de ganglios linfáticos. Además, la inducción de una respuesta de tipo Th1 observada generalmente con FG Alumbre/3D-MPL no está obstaculizada por la adición del 23-valente medido por la producción de citoquinas in vitro de células de bazo y de ganglios linfáticos específicas para FG y aparece aumentada cuando se analiza la distribución de anticuerpos de isotipo específico de FG. De hecho, la producción de IFN-\gamma, un marcador de una respuesta Th1, permanece sin cambios tras la adición de la vacuna 23-valente a FG Alumbre/3D-MPL, mientras que la producción de IL-5, el marcador de una respuesta a Th2, está sólo ligeramente incrementada. Es interesante destacar que la adición de la vacuna 23-valente a FG Alumbre/3D-MPL aumenta significativamente la producción de anticuerpos IgG2a, los marcadores de una respuesta a Th1, mientras que no afecta IgG1 (marcador de una respuesta de Th2) ni la respuesta IgG1/IgG2a.

En consecuencia, la combinación de FG Alumbre/3D-MPL y vacuna 23-valente no afecta la respuesta observada con FG Alumbre/3D-MPL y en consecuencia se mantienen las ventajas relacionadas con la formulación FG Alumbre/3D-MPL versus FG Alumbre, es decir la inducción de elevadas respuestas de anticuerpos neutralizantes primarias y secundarias y una respuesta a Th1 medida por la presencia de anticuerpos IgG2a y la inducción por altos niveles de IFN-\gamma.

La combinación de Pneumune 23-valente con FG Alumbre/3D-MPL da por resultado un aumento de la producción de IgG en 2 de 4 polisacáridos estudiados, pero en forma más notable para el tipo 19F. 23-valente solo con Alumbre/3D-MPL dio las mayores concentraciones de IgG.

En conclusión, hay una combinación favorable de vacuna neumocócica 23-valente con RSV FG Alumbre/3DMPL en la cual hay un efecto sinérgico para ambas vacunas, dado que muestran mejoramiento en ciertas pruebas inmunológicas, y no muestran inhibición en ninguna de las pruebas.

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Ejemplo 2 Evaluación de una vacuna combinada RSV + neumocócica conjugada 11-valente

La vacuna de combinación se evaluó con 3D-MPL + alumbre, 3D-MPL + QS21 en liposomas que contenían colesterol, o oligonucleótidos que contenían CpG (con o sin alumbre).

También se evaluó el impacto de la vacuna de combinación sobre la respuesta inmune de IgG a la proteína transportadora D (PD).

PD es un antígeno protector contra la infección no tipificada de Haemophilus influenzae B (NTHi). En consecuencia, la combinación de PS neumocócico conjugado con PD y FG podría conferir una protección efectiva contra tres patógenos: S. pneumoniae, RSV y Haemophilus influenzae B no tipificado. Es probable que una inmunidad de tipo Th1 intervenga en la protección contra NTHi. En consecuencia, también se estudiaron los anticuerpos IgG2a anti-PD, los cuales son un buen indicador de una respuesta Th1.

La vacuna candidata 11-valente usada en este ejemplo incluye los polisacáridos capsulares de serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F, los cuales se prepararon esencialmente como se describe en el documento EP 72513. Cada polisacárido se activa y deriva por acción química CDAP (documento WO 95/08348) y se conjuga con la proteína portadora. Todos los polisacáridos se conjugan en su forma nativa, excepto el serotipo 3 (el cual se redujo en tamaño para disminuir su viscosidad).

La proteína portadora era proteína D recombinante D (PD) de Haemophilus influenzae no tipificado expresado en E. coli.

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1. Proceso de formulación

Se prepararon las formulaciones 12 días antes de la primera inyección.

1.1. Formulaciones basadas en QS21, 3D-MPL

Cuando era necesario, se diluyeron los antígenos (FG (2 \mug) o/y conjugados PS no adsorbidos (0,5 \mug/valencia)) en una mezcla de concentrados al décimo de PBS a pH 7,4 y H_{2}O. Se añadió QS21 (5 \mug) como mezcla con liposomas que contienen MPL en una relación en peso de QS21/colesterol de 1/5 (referido como DQ/3D-MPLin). Treinta minutos más tarde se añadió 1 \mug/ml de tiomersal como conservante.

1.2. Formulaciones basadas en CpG o 3D-MPL

Cuando era necesario, se diluyó Al(OH)_{3} en H_{2}O antes de la adición de los antígenos (FG (2 \mug) o/y los conjugados PS no adsorbidos (0,5 \mug/valencias)). Después de una adsorción de 30 min, se añadió MPL o CpG. Treinta minutos más tarde se agregó buffer a las formulaciones con PO_{4}-NaCl concentrado 10 veces a pH 6,8. Luego se añadió tiomersal a 1 mg/ml o fenoxi a 5 mg/ml como conservante.

Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente con agitación. Las formulaciones se prepararon simultáneamente para las 2 inyecciones con 7 días de maduración de las formulaciones terminadas antes de la primera inyección.

1.3. Composición de los constituyentes de la formulación

5

6

2. Protocolo de inmunización

14 grupos de 10 ratones fueron inmunizados por vía IM (50 \mul) los días 0 y 28 con diversas formulaciones (ver sección Resultados). Se obtuvieron sueros el día 42 (14 d Post II). El día 42 se extrajeron células del bazo de 5 ratones de los grupos inmunizados con antígeno FG, así como de 5 ratones no expuestos Balb/c.

3. Respuesta humoral 3.1. Anticuerpos anti-FG

Todos los resultados humorales se efectuaron para 10 ratones /grupo (respuesta individual para los títulos de anti-FG Ig, IgG1 e IgG2a y de neutralización) y los resultados celulares se presentaron para 5 ratones/grupo del conjunto.

Se obtuvieron sueros individuales 14/15 días después de la segunda inmunización y se estudió la presencia de anticuerpos Ig específicos de FG y su distribución de isotipo (IgG2a, IgG1). El protocolo de ensayo era el siguiente: cubierta durante la noche a 4ºC con 50 \mul de FG DFGP107 purificado (1 \mug/ml) por cavidad, saturación 1 h a 37ºC, incubación con suero 1 h 30 a 37ºC, incubación con Ig antimurino con biotina 1/1500 (o IgG1, IgG2a con biotina 1/1000) 1 h 30 a 37ºC, incubación con estreptoperoxidasa 1/1500 30 min a 37ºC, incubación con OPDA Sigma 20 min a RT, detención con H_{2}SO_{4} 2N.

Se monitoreó la DO a 490 nm y se determinaron los títulos por Softmaxpro (ecuación de 4 parámetros) con referencia a una curva estándar y se expresaron en EU/ml.

Los sueros individuales obtenidos el 14 d Post II se analizaron para la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante el siguiente protocolo: 50 \mul de diluciones seriadas al medio de suero (primera dilución 1/25) se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 50 \mul de una mezcla que contiene 3000 pfu de RSV-A/Long (Lote 14) y complemento de cobayo (dilución 1/25) en una placa de 96 cavidades por duplicado. Luego se añadieron 100 \mul de una suspensión de células HEp-2 a 10^{5} células/ml a cada cavidad y las placas se incubaron durante 4 días a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}.

Luego se aspiraron los sobrenadantes y tras la adición de 100 \mul de una preparación de WST-1 preparación (dilución 1/15) las placas se volvieron a incubar durante 24 h a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}. La DO se monitoreó a 490 nm y los títulos se determinaron por regresión lineal (i=a.logx + b): título = dilución del suero para dar 50% de reducción de la máxima DO observada para las células no infectadas.

3.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Se midió la IgG murina contra polisacáridos neumocócicos de los tipos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F por ELISA en un procedimiento adaptado del protocolo de CDC. Este protocolo incluye la adición de polisacárido soluble de pared celular (CPS) al suero para inhibir la medición de los anticuerpos CPS. CPS es una fosforilcolina que contiene ácido teicoico común a todos los neumococos. Está presente bajo la cápsula y los anticuerpos contra ella son solo débilmente protectores. Dado que CPS está ligada al polisacárido capsular, usualmente hay 0,5 a 1% de CPS como contaminante del polisacárido capsular purificado que se usa para recubrir las placas de ELISA. En consecuencia, la medición de los anticuerpos contra CPS puede confundir en la interpretación de los resultados de ELISA con respecto al polisacárido capsular.

Se efectuó ELISA con polisacáridos recubiertos con 20, 5, 5, 20 y 20 \mug/ml en buffer PBS para los tipos 6B, 7F, 14, 19F y 23F respectivamente. Los sueros se premezclaron con el equivalente de 500 \mug/ml de CPS en suero no diluido, y se incubaron durante 30 minutos antes de la adición a la placa de ELISA. Se detectó IgG murino mediante peroxidasa de IgG (H + L) antimurino de cabra de Jackson ImmunoLab en dilución 1:5000. Las curvas de titulación se refirieron a anticuerpos monoclonales murinos específicos de polisacárido con concentración conocida para cada serotipo, mediante comparación logística log de SoftMax Pro. Los monoclonales usados eran HASP4, PS7/19, PS14/4, PS19/5 y PS23/22 para los tipos 6B, 7F, 14, 19F y 23F respectivamente.

Para el serotipo 3, se efectuó un ELISA similar, excepto en que las inmunoplacas se recubrieron primero con albúmina sérica humana metilada (1 \mug/ml en PBS, 2 horas, 37ºC) a fin de mejorar la cubierta de PS3 (2,5 \mug/ml en PBS, durante la noche, 4ºC). Se usó anticuerpo monoclonal PS3/6 como referencia estándar.

3.3. Dosificación por ELISA de IgG sérico anti-PD

Se recubrieron inmunoplacas Maxisorp Nunc a 37ºC durante 2 horas con 100 \mul/cavidad de 2 \mug/ml de antígeno PD diluido en PBS (en las hileras B a H de la placa), o con 100 \mul de 1 \mug/ml de Ig antimurino de cabra purificado (Jackson) en PBS (hilera A). Luego se agregaron diluciones seriadas al medio (en buffer PBS Tween 20 0,05%, 100 \mul por cavidad) de IgG murino puro (Jackson) como curva estándar (a partir de 1 \mug/ml y ubicado en la hilera A) y se incubaron las muestras de suero (a partir de una dilución 1/20 y ubicadas en las hileras B a H) durante la noche a 4ºC. Luego se incubó IgG antimurino de cabra conjugado con peroxidase (Jackson) diluido 1/5000 en buffer PBS Tween20 0,05% (100 \mul/cavidad) durante 30 minutos, a 20ºC, con agitación. Después de varios lavados, se incubaron las placas durante 15 min a temperatura ambiente en oscuridad con 100 \mul/cavidad de buffer de revelación (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) y H_{2}O_{2} 0,05% en 100 mM de buffer citrato a pH 4,5). Se detuvo la revelación por agregado de 50 \mul/cavidad de HCl 1N. Las densidades ópticas se leyeron a 490 y 620 nm mediante el uso de un inmunolector Emax (Molecular Devices). Se calcularon los títulos de anticuerpo mediante el procedimiento matemático de 4 parámetros con software SoftMaxPro.

3.4. Dosificación por ELISA de IgG1, 2a y 2b sérico anti-PD

Se recubrieron inmunoplacas Maxisorp Nunc durante la noche a 4ºC con 50 \mul/cavidad de 2 \mug/ml de antígeno PD diluido en PBS (en las hileras B a H de la placa), o con 50 \mul de \mug/ml de Ig antimurino de cabra purificado (Boerhinger), en PBS (hilera A). Después de la saturación de la placa con buffer PBS Tween20 0,05% de buffer BSA 1%, se incubaron diluciones seriadas al medio (en buffer de saturación, 50 \mul por cavidad) de anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2a o IgG2b murinos puros (Sigma) agregados como curva estándar (a partir de 200 ng/ml y ubicados en la hilera A) y muestras de suero (a partir de una dilución 1/20 en buffer de saturación y ubicados en las hileras B a H) durante 1 hora a 37ºC con agitación. Después de varios lavados con buffer NaCl 0,9% Tween-20 0,05%, se incubaron IgG1 antimurino biotinilado o IgG2a antimurino o IgG2b antimurino de IgG de cabra (Amersham) diluido 1/1000 en buffer de saturación (50 \mul/cavidad) durante 30 minutos, a 20ºC, con agitación. Después de lavados adicionales, las placas se incubaron durante 30 min a 20ºC con agitación con estreptavidina conjugada con peroxidasa (Amersham) diluida 1/1000 en buffer de saturación (50 \mul/cavidad). Después de los lavados, se realizó la revelación mediante el agregado de 50 \mul/cavidad de buffer de revelación (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) y H_{2}O_{2} 0,05% en 100 mM de buffer citrato a pH 4,5) durante 20 min temperatura ambiente en oscuridad. Se detuvo la revelación por agregado de 50 \mul/cavidad de HCl 1N. Se leyeron las densidades ópticas a 490 y 620 nm mediante el uso de un inmunolector Emax (Molecular Devices). Los títulos de anticuerpo se calcularon mediante el procedimiento matemático de 4 parámetros usando software SoftMaxPro.

4. Respuesta celular

Células de bazo se aislaron 14 d Post II de todos los grupos inmunizados con FG, así como de ratones no expuestos que se usaron como control negativo para el análisis de la respuesta celular específica para FG.

Las muestras se analizaron para linfoproliferación específica de FG y secreción de citoquinas (IFN-\gamma + IL-5).

La proliferación se evaluó después de 96 h de incubación de 4x10^{5} células/cavidad de placas de 96 cavidades con 200 \mul de medio que contiene 10 a 0,3 \muml de FG (diluciones al tercio). Tras la incorporación de ^{3}H-timidina, Se evaluó la inducción de citoquinas después de 96 h de incubación de 2,5x10^{6} células por cavidad de 24 cavidades con 1 ml de medio que contiene 10 \mug a 0,01 \mug de FG ((diluciones al décimo). Luego se cosecharon los sobrenadantes para determinar la cantidad de IFN-\gamma e IL-5 inducidos por ELISA según el protocolo estándar.

Resultados 1. Grupos

14 grupos recibieron dos inmunizaciones IM separadas por 28 días de diversas formulaciones que contenían la vacuna 11-valente conjugada o FG, o una combinación de ambos formulada con alumbre 3D-MPL, CpG, alumbre Cpg o alumbre.

Se analizan los resultados presentados en las Secciones 1 a 4. En cada Sección, se incluyen los resultados de FG Alumbre como control para la inducción de una respuesta inmune específica de RSV con un coadyuvante predominantemente de tipo Th2. También se agregó un grupo de ratones no expuestos para usar como control interno del análisis CMI específico para FG.

Sección 1

7

Sección 2

8

Sección 3

9

10

Sección 4

Los mismos grupos que para la Sección 3.

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2. Sección 1 2.1. Anticuerpos anti-FG

Se indujeron concentraciones similares de anticuerpo neutralizante anti-RSVA mediante FG / Alum / 3D-MPL o FG / Alum / 3D-MPL combinado con el conjugado 11-valente de PS (Figura 5). De hecho se puede observar un ligero efecto sinérgico para la inducción de anticuerpos neutralizantes RSVA tras la combinación de ambas vacunas.

El análisis de los títulos individuales de isotipo IgG y IgG2a anti-FG demostró la inducción de títulos similares o ligeramente inferiores por FG / Alumbre / 3D-MPL / PS conjugado 11-valente versus FG / Alumbre / 3D-MPL (Figura 6).

El análisis de la proporción de isotipos de IgG2a a IgG1 indica que la presencia de ambas vacunas no altera la relación de isotipo, que se mantiene muy inferior a la inducida por FG Alumbre, un reconocido coadyuvante inductor de Th2.

2.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Los títulos séricos de IgG para los polisacáridos 3, 6B, 14, 19F y 23F se midieron tal como se describe en el Ejemplo 1. Similares respuestas de anticuerpo fueron inducidas tras la inmunización con la formulación 11-valente de PS conjugado/ Alumbre / 3D-MPL o con la misma vacuna complementada con antígeno FG (Figura 7). Este resultado demostró que la combinación de conjugados de PS neumocócico y antígeno RSV FG en una formulación de Alumbre 3D-MPL no reduce o altera la respuesta inmune antineumocócica.

2.3. Respuesta celular específica de FG

El análisis de la producción de IL-5 y IFN-\gamma sugiere que la mezcla de FG / Alumbre / 3D-MPL con el conjugado PD 11-valente no afecta en alguna medida el nivel de producción de estas citoquinas (Figura 8). Sin embargo, la relación de las citoquinas medidas, un indicador del perfil Th de la respuesta, no se ve afectada por la mezcla y se mantiene bastante diferente de la relación observada para la formulación de FG Alumbre, un coadyuvante inductor de Th2.

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3. Sección 2: DQ/3D-MPLin 3.1. Anticuerpos anti-FG

Similares niveles de anticuerpo Ig anti-FG fueron inducidos por FG DQ/3D-MPLin o FG DQ/3D-MPLin combinado con el PS conjugado 11-valente (Figura 9).

Tal como se observa en el análisis de Ig anti-FG, no se observa interferencia en los niveles de anticuerpo neutralizante anti-RSVA cuando se mezcla FG DQ-MPLin con el PS conjugado 11-valente (Figura 10).

El análisis de los títulos individuales de isotipos de IgG1 y IgG2a anti-FG demostró la inducción de títulos similares por FG DQMP/PS conjugado 11-valente versus FG DQ-MP solo (Figura 11). El análisis de la relación de isotipos indica que la combinación de las vacunas no altera la relación de isotipos, que se mantiene muy inferior a la inducida por FG Alumbre, un reconocido coadyuvante inductor de Th2.

3.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Se midieron los títulos séricos de IgG para los polisacáridos 3, 6B, 14, 19F y 23F tal como se describe en el Ejemplo 1. Similares respuestas de anticuerpo fueron inducidas tras la inmunización con la formulación de PS conjugado 11-valente / DQ/3D-MPLin o con la misma vacuna complementada con antígeno FG (Figura 12). Este resultado demostró que la combinación de conjugados PS neumocócicos y antígeno RSV FG en una formulación DQ/3D-MPLin no reduce o altera la respuesta inmune antineumocócica.

3.3 Respuesta celular específica de FG

El análisis de la producción de IL-5 y IFN-\gamma sugiere inicialmente que la mezcla de FG DQ/3D-MPLin con el conjugado PD 11-valente no afecta en alguna medida el nivel de producción de INF-\gamma (Figura 13). El análisis ulterior de la relación de las citoquinas medidas, un indicador del perfil de Th de la respuesta, demuestra que la mezcla de FG DQ/3D-MPLin con PS conjugado 11-valente afecta de alguna manera el perfil Th. Sin embargo, se mantiene el predominio de IFN-\gamma sobre IL-5 para la combinación de los dos antígenos con DQ/3D-MPLin y se mantiene muy superior al observado para FG Alumbre, un reconocido coadyuvante inductor de Th2.

4. Sección 3: CPG y CPG Alumbre 4.1. Anticuerpos-FG

Similares niveles de anticuerpos Ig anti-FG fueron inducidos por FG CpG o FG CpG combinado con el conjugado PS 11-valente (Figura 14). La ausencia de interferencia debida a la mezcla de FG CpG y el conjugado PS 11-valente también se puede observar para las formulaciones basadas en CpG alumbre.

Tal como se observa para el análisis de Ig anti-FG, no se observa interferencia en los niveles de anticuerpo neutralizante anti-RSVA cuando se mezcla FG CpG o FG CpG alumbre con el conjugado PS 11-valente (Figura 15).

El análisis de los títulos individuales de isotipo de IgG1 y IgG2a anti-FG no mostró interferencia tras la adición del conjugado PS 11-valente a las formulaciones de FG CpG o FG CpG alumbre (Figura 16).

El análisis ulterior de la relación de isotipos IgG1/IgG2a indica que la combinación de las vacunas no altera la relación de isotipos, que se mantiene muy inferior a la inducida por FG Alumbre, un coadyuvante de Th2.

4.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Se midieron los títulos séricos de IgG para los polisacáridos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F tal como se describe en el Ejemplo 1. En el presente ejemplo, se analizaron dos formulaciones de coadyuvante: CpG y Alumbre / CpG. Para ambas formulaciones coadyuvantes, los títulos de IgG anti-PS eran al menos similares en animales a los que se administró el conjugado PS 11-valente complementado con FG, en comparación con los animales inmunizados con el conjugado PS 11-valente solo (Figura 17). Este resultado demostró la combinación de conjugados PS neumocócicos y antígeno RSV FG en una formulación CpG o Alumbre CpG no reduce o altera la respuesta inmune antineumocócica. Los títulos de anticuerpo contra los 7F y 14 incluso estaban significativamente mejorados en presencia de FG al usar la formulación coadyuvante CpG.

4.3. Respuesta celular específica de FG

El análisis de la producción de IL-5 y IFN-\gamma sugiere que la mezcla de FG CpG o CpG alumbre con el conjugado PD 11-valente no afecta el nivel de producción de estas citoquinas ni su relación IFN-\gamma/ IL-5 (Figura 18). En consecuencia, el predominio de IFN-\gamma, un marcador de la respuesta Th1, se mantiene para ambas combinaciones dentro de las formulaciones CpG y CpG alumbre. La inducción de IFN-\gamma incluso estaba mejorada en presencia de FG mediante el uso de la formulación coadyuvante CpG.

5. Sección 4

Se evaluó el impacto de añadir FG en las formulaciones de PS conjugado sobre la respuesta inmune de IgG al portador de proteína D (PD). PD es un antígeno protector contra la infección por Haemophilus influenzae B no tipificable (NTHi). Es probable que intervenga una inmunidad celular de tipo Th1 en la protección contra NTHi. En consecuencia, también se analizaron los anticuerpos IgG2a anti-PD, los cuales son un buen indicador de una respuesta Th1.

5.1. Anticuerpos anti-FG

Ver Sección 3

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5.2. IgG antipolisacárido neumocócico

Ver Sección 3

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5.3. Respuesta celular específica para FG

Ver Sección 3

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5.4. Dopaje por ELISA de IgG, IgG1, 2a y 2b séricas antiPD

Tal como se muestra en la Figura 19, las respuestas de IgG sérica total al portador PD no se vieron significativamente afectadas por la presencia de FG en formulaciones de conjugado PS neumocócico, cualquiera fuera el coadyuvante usado (CpG o Alumbre CpG). La elevada proporción de anticuerpos IgG2a séricos anti-PD (alrededor del 30% de IgG total) producida tras la vacunación con formulaciones CpG o Alumbre CpG PS conjugado no se modificó por la adición de FG a esas formulaciones (Figura 20). Dicha respuesta de IgG2a indicaba una fuerte inmunidad Th1. En conjunto, estos resultados demostraron que la combinación de PD neumocócico conjugado con PD y antígeno RSV FG en una formulación CpG o Alumbre CpG no altera la respuesta inmune anti-PD.

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Análisis y conclusión Sección 1: Alumbre / 3D-MPL

Los resultados demostraron que la combinación de conjugados de PS neumocócico y antígeno RSV FG en una formulación de Alumbre 3D-MPL no altera las respuestas antineumocócicas humorales. Tanto el nivel de respuesta inmune humoral como la celular específica de FG parecen estar ligeramente afectadas por la mezcla, pero no se afecta el perfil Th de la formulación de FG sola.

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Sección 2: DQ/3D-MPLin

Los resultados demostraron que la combinación de conjugados de PS neumocócico y antígeno RSV FG en una formulación de DQ/3D-MPLin MPL no altera las respuestas inmunes antineumocócicas humorales o las respuestas humorales específicas de FG. El análisis ulterior de la respuesta celular sugiere que la combinación de ambos antígenos en una formulación con DQ/3D-MPLin de alguna manera afecta la inducción de IFN-\gamma. Sin embargo, esto no afecta el perfil de Th, comparado con la formulación FG (sola).

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Sección 3: CpG /CpG Alumbre

El resultado demostró que la combinación de conjugados de PS neumocócico y antígeno RSV FG en una formulación con CpG o Alumbre CpG no reduce o altera la respuesta inmune antineumocócica humoral o las respuestas humoral y celular específicas de FG.

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Sección 4: CpG /CpG Alumbre

Los resultados demostraron que la combinación de conjugados de PS neumocócico conjugado con PD y antígeno PS y RSV FG en una formulación con CpG o Alumbre CpG no reduce o altera la respuesta inmune anti-PD.

En conclusión, hay una combinación favorable de vacuna neumocócica 23-valente con RSV FG 3D-MPL en la cual se produce un efecto sinérgico para ambas vacunas en cuanto ambas vacunas muestran mejoramientos en ciertas pruebas inmunológicas, y sin inhibición en ninguna de las pruebas. A partir de los resultados antes presentados, también se observa una combinación favorable cuando se combina un PS neumocócico conjugado con PD 11-valente con antígeno RSV FG en un conjunto de coadyuvantes de Th1. De hecho, para la mayoría de las lecturas inmunes de los diversos coadyuvantes Th1 estudiados, la combinación de antígenos de la vacuna no obstaculiza las características preexistentes de cualquiera de las vacunas, o solo lo hace ligeramente (y no de manera significativa en lo que se refiere a la respuesta global). Tal como se observa al combinar FG con la vacuna 23-valente en el Ejemplo 1, en algunos casos una u otra vacuna mostró mejoramientos en ciertas pruebas inmunológicas.

Claims (15)

1. Una composición de vacuna que comprende:

(a) uno o más polisacáridos de Streptococcus pneumoniae bienconjugados a una proteína o péptido, o no conjugados: y

(b) un antígeno de virus sincicial respiratorio (RSV) en conjunción con un coadyuvante que es un estimulador de una respuesta de tipo Th1.

2. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 en la cual el polisacárido de Streptococcus pneumoniae está conjugado con una proteína del grupo que comprende: proteína D de Haemophilus influenzae B o uno de sus fragmentos, que abarca epitopos de linfocitos T cooperadores, una versión lipídica de la proteína D (lipoproteína D); toxina tetánica y toxina de difteria.

3. Una composición de vacuna de acuerdo con la 1 o la reivindicación 2, la cual además comprende un portador.

4. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la cual dicho coadyuvante se selecciona del grupo que consiste en: 3D-MPL de 100 nm o menos de 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol, y un oligonucleótido CpG.

5. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 4 en la cual el coadyuvante comprende 3D-MPL.

6. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, que además comprende QS21.

7. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la cual el polisacárido de Streptococcus pneumoniae es una vacuna de 23-valente de polisacárido de neumococo.

8. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la cual el polisacárido de Streptococcus pneumoniae es una vacuna 11-valente conjugada de polisacárido de neumococo.

9. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la cual el antígeno de RSV es una glucoproteína de envoltura de RSV humano.

10. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la cual el antígeno de RSV es una proteína de fusión quimérica (FG) de la proteína de fusión de RSV F y la glucoproteína de G de RSV, o uno de sus fragmentos.

11. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la cual además está presente un antígeno del virus de la gripe.

12. Una composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en la cual se selecciona un portador del grupo que comprende hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y tocoferol y una emulsión de aceite en agua.

13. Un procedimiento para preparar una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual el procedimiento comprende mezclar un antígeno de Streptococcus pneumoniae y un antígeno de RSV con un coadyuvante inductor de Th1.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual dicho antígeno de Streptococcus pneumoniae es un polisacárido conjugado con proteína D o uno de sus fragmentos que abarca epitopos de linfocito T cooperador.

15. El uso de un antígeno de Streptococcus pneumoniae y un antígeno de RSV en la preparación de una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la prevención o mejora de infección por RSV y/o Streptococcus pneumoniae en un paciente.