CN1355710A - 抗肺炎链球菌和呼吸道合胞病毒(rsv)的联合疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗组合物,该疫苗组合物包含(a)一种或多种与蛋白或肽缀合、或非缀合的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖;和(b)RSV抗原以及为Th1型免疫应答选择性刺激剂的佐剂。本发明提供的联合疫苗特别适用于儿童和老年人。

Description

抗肺炎链球菌和呼吸道合胞病毒(RSV)的联合疫苗
本发明涉及新的疫苗制剂、其制备方法以及它们在预防和治疗中的应用。具体地说，本发明涉及给予儿童和老年人的联合疫苗。更具体地讲，本发明涉及针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和呼吸道合胞病毒(RSV)感染或疾病的保护性联合疫苗。
肺炎链球菌是一种尤其在年轻人和老年人中引起相当高发病率和死亡率的革兰氏阳性菌。在美国，呼吸道和中耳的扩大建群(尤其在年幼的儿童中)是到医院就诊的一个最常见原因。肺炎链球菌细菌可以成为侵袭性细菌，感染下肺并引起肺炎。据估计，美国超过60岁的人的肺炎球菌性肺炎发病率达十万分之三至八。在20％的病例中肺炎球菌性肺炎导致菌血症和其它表现如脑膜炎，即使用抗生素治疗死亡率也接近30％。肺炎链球菌有90种已知血清型，它们是根据细菌周围的荚膜多糖结构确定的，荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子。
已知一种17价肺炎球菌疫苗(Moniarix)，它建立在侵袭性疾病最常见的肺炎球菌血清型纯化多糖的基础上。在欧洲专利72513 B1中公开了这些多糖的纯化方法。使用低价疫苗进行疫苗效力试验证实，对这些联合疫苗中的血清型有70-90％有效。在美国对55岁以上的人使用14价疫苗的病例对照研究证实，70％有效(Mills，O.F.，和Rhoads，G.G；J.Clin.Epidemiol.(1996)；第49卷(6)631-636)。在足够血清反应的基础上可包括其它多糖(以制备23价肺炎球菌疫苗)，即使缺乏临床效力数据(K.R.Brown，‘联合疫苗与同时使用’，Williams等编辑，New York Academy of Sciences，1995，第241-249页)。
已经对用一种23价肺炎球菌疫苗(Pnu-Immune 23-Lederle USA)和流感疫苗(Fluarix)同时免疫接种进行了研究(TJ Fletcher，TWTunnicliffe，K Hammond，K Roberts，JG Ayres；(1997)Br.Med.J.314：1663)，在同时免疫接种或间隔一个月免疫接种之间没有观察到显著的免疫学差异。
通过使肺炎球菌多糖与蛋白载体化学偶联，可以使肺炎球菌多糖在婴儿中的免疫原性更强。正在进行临床效力实验以证实其预防婴儿中耳炎作用机理。
初次接种7-11价缀合肺炎球菌疫苗的婴儿可用23价普通多糖肺炎球菌疫苗加强免疫，以增加血清型覆盖度和IgG浓度(Block，SL，JA.Hedrick，R.A.Smith，R.D.Tyler，M.Giordani，M.D.Blum，J.Sadoff，E.Keegan；Abstract G-88，第37届ICAAC，Toronto(1997)；Anderson，E.L.，Kennedy，D.J.，Geldmacher，K.M.，Donnelly，J.，Mendelman，P；TheJournal of Paediatrics，1996年5月，第128卷，n°5，第1部分，649-653)。
人呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科病毒之一，它引起下呼吸道疾病，尤其是在儿童和婴儿中。近来的报导表明，RSV在成年人尤其是老年人中是一种重要的病原体。
RSV是一种包膜病毒，它具有一个由15,222个核苷酸组成的非节段负链核糖核酸(RNA)基因组，该基因组编码10种各自编码单一多肽的信使RNA。所述10种蛋白中的3种是跨膜表面蛋白：G蛋白(吸附蛋白)、F蛋白(融合蛋白)和SH蛋白。两种蛋白是病毒体基质蛋白(M和M2)，三种蛋白是核壳组成部分(N、P和L)，而两种蛋白是非结构蛋白(NS1和NS2)。RSV存在两种抗原性分离株，称为A株和B株。已经确定这些病毒株特征的主要差异在于G蛋白，而F蛋白是保守的。
呼吸道合胞病毒(RSV)呈季节性爆发，在温带气候的冬季和和热带气候的雨季达到高峰(DeSilva LM & Hanlon MG.呼吸道合胞病毒：儿童医院的5年研究报告，J Med Virol 1986；19：299-305)。无论在什么地方，RSV总是呈规律性可预测模式，而其它爆发性发生的呼吸道病毒病原体极少同时存在(Glezen WP & Denny FW.儿童急性下呼吸道疾病的流行病学，N.Engl.J.Med.1973；288：498-505)。
RSV是儿童严重下呼吸道疾病的主要病因。估计40-50％毛细支气管炎住院儿童和25％肺炎住院儿童的直接住院原因是RSV感染。原发性RSV感染通常发生于1岁以下的幼儿；95％的2岁儿童具有感染后的血清学证据，而100％成年人具有这种感染的血清学证据。
在婴幼儿和少年儿童中，约40％的病例的感染从上呼吸道发展到下呼吸道，临床表现为细支气管炎或肺炎。2-6月龄的幼儿出现严重RSV感染表现(原发性呼吸道衰竭)的风险最大；然而，任何年龄的具有潜在心脏疾病或肺部疾病的儿童、早产儿和免疫功能受损的婴幼儿，也有发生严重并发症的风险。
症状性再感染在整个人生中均可能发生，而愈发明显的是RSV也是一种重要的成人病原体，尤其对于老年人而言。
几乎没有确诊的成人RSV感染，部分是因为人们认为RSV感染儿童。因此，没有为了解释呼吸道疾病而寻找RSV在成人中的证据。另外，在对RSV具有某种程度的部分免疫的个体的鼻分泌物中难以鉴定出RSV，大部分的成年人也是如此。青年至中年的成人在感染RSV时通常出现持久性感冒样综合症状。老年患者可能由于可并发下呼吸道相关病症(包括肺炎)的上呼吸道病症而发生实际上与流感无法区分的迁延性呼吸综合症。特别令人关注的是疗养院老年人群，因为他们中有大量群居在一起的易感个体。其中许多人存在多种医学问题，可能容易使他们的RSV感染更严重，在他们之间的RSV感染扩散是难以控制的。
而且，近来评价导致成人和社区居住健康老年人住院的RSV感染的影响的研究报告进一步指出，RSV感染在这些人群严重下呼吸道疾病中起重要作用(Dowell SF，Anderson LJ，& Gary Jr HE等，J.Infect Dis 1996；174：456-462；Falsey AR，Cunningham CK，& BarkerWH等，J.Infect Dis 1995；172：389-394)。Dowell认为RSV是引起导致成年人住院的严重下呼吸道疾病的四种最常见病原体之一(DowellSF，Anderson LJ，& Gary Jr HE等，J.Infect Dis 1996；174：456-462)。Falsey证实，在老年人中的严重RSV感染不限于疗养院或爆发情况。相反，RSV感染居住在社区的老年患者中预期性严重疾病的病因。与A型流感住院相似，RSV感染住院与实际发病率有关，其证据是留医时间延长、重症监护入院率高和通气辅助率高(Falsey AR，Cunningham CK，& Barker WH等，J.Infect Dis 1995；172：389-394)。
这些研究指出，在医学上和经济学上需要可以在婴儿、成年人以及社区居住健康老年人和疗养院老年人中有效预防严重RSV感染并发症的疫苗。
对于重组亚单位疫苗或灭活疫苗而言，使用佐剂是最重要的。明矾(alum)是目前批准用于人类的唯一佐剂。然而，明矾对体液免疫应答具有有限的佐剂作用，而且已知它主要诱导Th2型免疫应答(Byars NE，Nakano G，& Welch M等，Vaccine 1991；9：309-318)。然而，发现3脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)与明矾组合提高体液免疫应答，并优先刺激Th1型免疫。铝盐与3D-MPL的佐剂表示为明矾/3D-MPL。
本发明提供一种疫苗组合物，它包含：
(a)与蛋白或肽缀合、或者非缀合的一种或多种肺炎链球菌多糖；和
(b)RSV抗原
以及为Th1型应答选择性刺激剂的佐剂。
联合疫苗发展方向具有以下优势：减轻接种者的不适、易于安排免疫计划和确保完成免疫计划(regiment)；但同时也存在降低疫苗效力的风险。因此，最好是制备满足一个人群需要且此外不互相干扰的疫苗组合物。进一步的优势在于所述疫苗组合物是否能够产生协同增效作用，因此改善一种或两种疫苗的效力，或者改善一种或两种疫苗的保护相关性。这一点可以通过本发明的疫苗组合物实现，它对给予特别处于肺炎链球菌和/或RSV感染风险的儿童或老年人具有巨大的益处。
本发明的疫苗组合物还可任选含有无数其它抗原中的一种或多种抗原，诸如流感病毒抗原。目前可应用的流感疫苗包括完全灭活的病毒疫苗、片段颗粒疫苗(split particle vaccine))和亚单位疫苗。所有种类的流感疫苗通常都是三价疫苗。它们包含得自两种A型流感病毒株和一种B型流感病毒株的抗原。大部分所述疫苗的标准0.5ml剂量包含15μg得自每种病毒株的血细胞凝集素组分。
确定加入到流感疫苗中的病毒株的程序是一个涉及世界卫生组织(WHO)、国家卫生管理局(national health authority)和疫苗生产商之间协作的复杂过程。
通过将肺炎球菌多糖与蛋白载体化学偶联，可使其免疫原性更强，正在进行临床效力试验以证实其预防婴幼儿中耳炎作用的基本原理在于此。
通常用于生产免疫原性多糖构建物的缀合方法有以下两种：(1)糖类和蛋白直接缀合；和(2)糖类和蛋白通过双功能接头或间隔试剂间接缀合。一般来说，直接和间接缀合二者都需要在衍生化之前化学活化所述糖类部分。参见例如美国5,651,971和Dick & Beurret，“细菌糖抗原的糖缀合物”，Conjugate Vaccines，J.M.Cruse & R.E.Lewis(编辑)，第10卷，48-114(1989)。
在本发明组合物中的肺炎链球菌多糖优选为缀合形式，但不是必须为缀合形式。不排除非缀合肺炎链球菌多糖。
肺炎链球菌多糖(如果缀合)与一种蛋白或肽缀合。已经将多糖抗原与多种T辅助蛋白缀合。这些蛋白提供T辅助表位。代表性的蛋白包括白喉类毒素、破伤风类毒素以及得自B型流感嗜血杆菌的D蛋白或其脂化衍生物脂蛋白D。其它合适的蛋白载体包括白喉Crm197和流感病毒的主要非结构蛋白NS1(尤其是氨基酸1-81)。
D蛋白是本发明疫苗的优选组分，其中肺炎链球菌多糖是缀合肺炎链球菌多糖。D蛋白的片段也适用。EP 0 594 610介绍了D蛋白。适用片段包括含T辅助表位的片段。具体而言，D蛋白片段优选包含该蛋白的N末端1/3。
令人惊奇的是，还发现将缀合D蛋白的肺炎链球菌多糖与RSV抗原组合在本发明的组合物中不影响对缀合物中D蛋白组分的免疫应答。D蛋白是一种抗不能分型(non-typable)的B型流感嗜血杆菌(NTHi)感染的保护性抗原。
因此，本发明进一步提供包含RSV抗原和至少一种缀合D蛋白或其片段的肺炎链球菌多糖的疫苗，以及任选包括一种诸如Th1佐剂的佐剂。
通常本发明疫苗中的肺炎链球菌组分包含多糖抗原(优选缀合多糖抗原)，其中所述多糖得自至少四种血清型的肺炎球菌。所述四种血清型多糖优选包括6B、14、19F和23F血清型多糖。更优选所述组合物包括至少7种血清型多糖，例如得自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的多糖。再更优选所述组合物包括至少11种血清型多糖，例如一个实施方案的组合物包括得自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖(优选缀合荚膜多糖)。在本发明的一个优选实施方案中，包括至少13种或至少15种至少17种多糖抗原(优选缀合多糖抗原)，尽管本发明还包括其它多糖抗原，例如23价多糖抗原(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。
对于老年人免疫接种(例如预防肺炎)而言，最好上述11价抗原组合物还包括血清型8和12F(最优选还包括15和22)而形成15价疫苗，而对于婴幼儿和学步儿童(更令人关心的是中耳炎)而言，最好包括血清型6A和19A，以形成13价疫苗。
适合包含在本发明疫苗中的RSV抗原包括灭活RSV病毒，诸如用例如福尔马林灭活的化学灭活RSV病毒。例如，可由例如已通过传代或遗传操作减毒的减毒RSV生产灭活病毒疫苗，或者可由野生型RSV生产灭活病毒疫苗。可以使用已工程为含有不同RSV病毒株包膜抗原(例如RSV病毒株A主链和RSV B包膜蛋白)的重组RSV，可任选使用减毒重组RSV。
合适的RSV抗原特别包括得自RSV病毒的抗原，优选人RSV包膜糖蛋白，诸如例如美国专利5,149,650公开的的RSV F或G蛋白或其免疫原性片段，或包含至少一种来自RSV F和G蛋白二者的免疫原性片段的嵌合多肽，优选公开于例如美国专利5,194,595的RSVFG嵌合蛋白(优选表达自CHO细胞)。
所述RSV抗原优选是RSV包膜糖蛋白或其衍生物。所述抗原优选得自RSV病毒株A。或者所述抗原可得自RSV病毒株B，或者在所述组合物中可以有来自病毒株A和病毒株B每一种的抗原。优选抗原选自F糖蛋白、G糖蛋白或FG融合蛋白或其免疫原性衍生物。
通常免疫原性衍生物包括其中缺乏所述蛋白跨膜结构域的免疫原性衍生物，即FΔtm、GΔtm和FΔtm GΔtm。优选G蛋白缺失信号序列。优选F或G蛋白存在至少约50％或至少约80％(邻接序列)的胞外结构域。具体实例包括F蛋白的1-526或1-489氨基酸、G蛋白的氨基酸69-298或氨基酸位置97-279以及F1-526G69-298融合蛋白。另一种融合蛋白包含F蛋白的1-489氨基酸，后接G蛋白的97-279氨基酸。
本发明的RSV/肺炎链球菌疫苗组合物包含为Th1型应答优选诱导物的佐剂，以辅助免疫系统的细胞介导分支。
通过抗原与免疫系统细胞的相互作用产生针对抗原的免疫应答。产生的免疫应答可以广义地分为两个大类，即体液免疫应答或细胞免疫应答(传统上其特征分别为抗体和效应细胞保护机制)。这两种免疫应答称为Th1型应答(细胞介导的应答)和Th2型免疫应答(体液免疫应答)。
最典型的Th1型免疫应答的特征为产生抗原特异性单倍型限制性细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞反应。小鼠的Th1型应答特征通常为产生IgG2a亚型抗体，而在人类IgG2a亚型抗体相当于IgG1型抗体。Th2型免疫应答的特征为产生各种各样的免疫球蛋白同种型，在小鼠包括IgG1、IgA和IgM。
可以认为产生这两种免疫应答类型的驱动力是细胞因子，细胞因子是为数众多的已知蛋白信使，它们的作用是辅助免疫系统细胞和最终控制免疫应答发展为Th1或Th2应答。因此，高水平的Th1型细胞因子倾向于促进诱导针对给定抗原的细胞免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于促进诱导针对所述抗原的体液免疫应答。
重要的是要记住，Th1型或Th2型免疫应答的区别并不是绝对的。事实上，有个人支持免疫应答描述为主要是Th1免疫应答或主要是Th2免疫应答。然而，按照Mosmann和Coffman在鼠CD4阳性T细胞克隆中所述(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：不同的淋巴因子分泌模式导致不同的功能特性，AnnualReview of Immunology，7，第145-173页)来考虑细胞因子家族往往是很便利的。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2有关。与诱导Th1型免疫应答常常直接相关的其它细胞因子，如IL-12，并不是由T细胞产生。相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)的分泌有关。
已知某些疫苗佐剂特别适于刺激Th1型或Th2型细胞因子反应。传统上，在免疫接种或感染后免疫应答的Th1∶Th2平衡最佳指标包括直接检测T淋巴细胞在体外用抗原再刺激后产生的Th1或Th2细胞因子，和/或检测抗原特异性抗体反应的IgG1∶IgG2a比值。
因此，Th1型佐剂是这样一种佐剂：在体外用抗原再刺激时刺激分离的T细胞群产生高水平的Th1型细胞因子，并诱导与Th1型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白反应。促进Th1应答占优势的合适佐剂系统包括单磷酰脂质A或其衍生物，特别是3脱氧酰化单磷酰脂质A，以及单磷酰脂质A(优选3脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL))和铝盐的组合物。下面介绍其它合适的佐剂系统。
例如国际专利申请号WO 94/00153和WO 95/17209介绍了这类佐剂。
GB 2220211(Ribi)介绍了3D-MPL。在化学上它是具有4、5或6个酰化链的3脱氧酰化单磷酰脂质A的混合物，由Ribi ImmunochemMontana生产。欧洲专利EP 689 454 B公开了3脱氧酰化单磷酰脂质A的一种优选形式。
3D-MPL的粒径最好小得足以通过0.22μm膜除菌过滤(如欧洲专利EP 0 689 454所述)。
3D-MPL通常以每剂10μg-100μg、优选每剂25μg-50μg的范围存在，其中所述抗原通常以每剂2μg-50μg的范围存在。
另一种优选的佐剂包括QS21，它是一种从Quillaja SaponariaMolina树皮中得到的Hplc纯化的无毒皂苷组分。这种佐剂可以任选与3-脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)混合，以及任选与一种载体混合。
美国专利第5,057,540号公布了QS21的生产方法。
WO 96/33739描述了含有QS21的无反应原性佐剂配方。当与一种抗原一起配制时，已经证实这种包含QS21和胆固醇的配方是成功的TH1刺激佐剂。因此，构成本发明的部分的疫苗组合物可以包含QS21和胆固醇的组合。
其它属于Th1应答的优选刺激物的佐剂包括免疫调节性寡核苷酸，例如WO 96/02555公开的未甲基化CpG序列。
还考虑不同TH1刺激佐剂的组合(如上所述的组合)提供属于Th1型反应优选刺激物的佐剂。例如，QS21(还优选与胆固醇一起)可以与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比例通常约为1∶10至10∶1；最好是1∶5至5∶1，而实际上常常是1∶1。3D-MPL∶QS21最佳协同作用的最优范围是2.5∶1至1∶1。
依照本发明的疫苗组合物中最好还存在一种载体。所述载体可以是水包油乳剂或铝盐。
优选的水包油乳剂包含一种可代谢的油，如鲨烯、α-生育酚和吐温80。此外，所述水包油乳剂可以含有Span 85和/或卵磷脂和/或三辛酰甘油酯。
在一个优选方面，将氢氧化铝(明矾)或磷酸铝加入到本发明的组合物中，以增强免疫原性。
在一个特别优选的方面，依照本发明的疫苗组合物中的抗原与3D-MPL和明矾混合。
在给予人时，疫苗中使用的QS21和3D-MPL通常在每剂量1μg-200μg的范围，如10-100μg，最好是10μg-50μg。而水包油乳剂通常含有2-10％的鲨烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的吐温80。鲨烯：α-生育酚的比例最好是等于或小于1，因为这提供一种更稳定的乳浊液。也可以使用1％浓度的Span 85。在某些情况下，本发明的疫苗最好还含有一种稳定剂。
无毒的水包油乳剂最好在一种水性载体中含有一种无毒的油，如角鲨烷或鲨烯，以及一种乳化剂，如吐温80。所述水性载体可以是例如磷酸缓冲盐溶液。
WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，该制剂为包含QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳剂。
本发明的疫苗包含免疫保护量的抗原，并且可以通过常规技术制备。
疫苗制备的一般描述可见Pharmaceutical Biotechnology，第61卷疫苗设计-亚单位和佐剂方法，Powell和Newman编辑，Plenum Press，1995；New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如Fullerton，美国专利4,235,877描述了在脂质体中包囊化。例如Likhite，美国专利4,372,945以及Armor等人，美国专利4,474,757公开了蛋白与大分子的缀合。
选定的每剂疫苗蛋白量为在一般接受者诱导出免疫保护反应同时不引起显著的不利副作用的量。这样的量将根据所使用的特定免疫原而有所不同。通常，预计每剂量将包含1-1000mg的蛋白，优选2-100mg，最优选4-40mg。对特定疫苗的最佳量可以通过包括观测受试者的抗体滴度和其它反应的标准研究而确定。在初次接种疫苗之后，接受者可以在约4周后接受加强免疫。特别是对于婴幼儿，可优选3剂免疫接种。
除了免疫接种对肺炎链球菌或RSV感染易感的人之外，本发明的药用组合物可以免疫治疗性治疗所述感染的患者。
本发明的又一方面提供本文所述疫苗制剂的生产方法，其中所述方法包括将肺炎链球菌抗原和RSV抗原与一种TH-1诱导佐剂(如3D-MPL)、最好还有一种载体(如明矾)混合。
如果需要，可以以任何方便的次序加入其它抗原，以提供如本文所述的多价疫苗组合物。
本发明还提供一种生产疫苗组合物的方法，包括将缀合D蛋白的肺炎链球菌多糖与RSV抗原以及一种药学上可接受的赋形剂混合在一起。
在以下实施例中，在小鼠模型中对RSV疫苗侯选物FG与市售23价肺炎球菌疫苗(Wyeth-Lederle的Pneumune)联合应用的效果进行评价。该模型测试联合免疫，其中所述疫苗为物理性混合并在相同的部位注射。该研究的结果证实两种疫苗相互协同增效，使得对两种疫苗的某些免疫原性标记的反应增强。
所述实施例在小鼠模型中还论证了RSV疫苗侯选物和11价缀合肺炎球菌疫苗的联合疫苗。该研究证实对于大部分免疫原性标记而言，在所述抗原之间没有干扰或仅有微小的干扰，但实际上对于某些免疫原性标记来说，反应增强并因此存在协同增效作用。值得注意的是，对所述缀合肺炎球菌多糖中的D蛋白组分的免疫反应没有下降。
                 实施例实施例1-评价联合的RSV+23价肺炎球菌疫苗1.配制方法：
使水稀释的FG抗原(2μg：1/10 HD)吸附到50μg Al(OH)3上15分钟。在使用时，将5μg的3D-MPL加入到为100nm颗粒悬浮液的所述制剂中，温育30分钟。然后用浓缩10倍的PBS pH7.4缓冲制剂。使用时，在加入所述缓冲溶液后15分钟加入23价肺炎球菌疫苗(11.5μg：1/50 HD)。对于没有FG的组，遵循相同的配制程序，首先将3D-MPL吸附在Al(OH)3上，然后加入所述23价肺炎球菌疫苗。在加入浓缩缓冲液或23价肺炎球菌疫苗后15分钟，向所述制剂中加入苯氧乙醇(5mg/ml)作为防腐剂。
所有的温育都在室温下振荡进行。同时配制用于两次注射的制剂，在首次注射前将最终的制剂熟化7天。
制剂组分的构成：
  组分    批号  浓度(μg/ml)     缓冲剂
  FG   54/023     265     10 PO4、150 NaClpH 6.8
  Al(OH)3   96A0089     10380     水
  23价疫苗   Pneumune     1150     盐水
  3D-MPL   109     964     水
2.免疫方案：
用不同制剂(参见表1)在第0天和第28天通过不同途径(50μl)免疫11组(每组10只)小鼠。用活RSV经鼻内途径(60μl)免疫第7组和第8组小鼠。在第28天(初次免疫后28天)和第42天(第二次免疫接种后14天)获取血清。在第42天，从第4、5、6、7、8、9组的5只小鼠以及5只未作实验的Balb/c小鼠(第1组，未免疫)取脾细胞和淋巴结细胞。3.体液免疫应答3.1.抗FG抗体：
得到每组10只小鼠的全部体液免疫结果(抗FG滴度为个体应答和同种型分布为混合血清)，而每组有5只小鼠获得细胞免疫结果。
在初次免疫后28天和第二次免疫后14天从各小鼠获取血清，并测试其中存在的FG特异性Ig抗体以及它们的同种型(IgG2a、IgG1)分布。
测试方案如下：以每孔50μl纯化FG 54/023(1μg/ml)于4℃包被过夜，于37℃饱和1小时，于37℃和血清温育1.5小时，于37℃和抗小鼠Ig生物素1/1500(或IgG1、IgG2a生物素1/1000)温育1.5小时，于37℃和链霉过氧化物酶1/2500温育30分钟，与OPDA Sigma于室温温育15分钟，用2N H2SO4终止反应。
监测490nm的OD，通过Softmaxpro(4参数方程)参照标准曲线测定滴度，并表示为EU/ml。
使用如下方法测试在第二次免疫接种后14天获得的各个血清中存在的中和抗体：在96孔板中一式两份将50μl连续两倍稀释的血清(第一次1/25稀释)与50μl包含300pfu RSV-A/Long(批号14)和豚鼠补体(1/25稀释)的混合物于37℃温育1小时。然后将105细胞/ml的100μl HEp-2细胞悬浮液加入到每个孔中，在5％CO2存在下于37℃温育所述板4天。
然后吸出上清液，向所述板加入100μl WST-1制剂(稀释1/12.5)，此后在5％CO2存在下于37℃再温育所述板24小时。监测595nm的OD，并通过线性回归(y＝a.logx+b)测定滴度：滴度＝使观测到的未感染细胞最大OD产生50％下降的血清稀释度。
测试对照包括混合的随机选择的人血清(人混合物)和Sandoglobuline(批号069，Sandoz生产的人属(generic human)IgG)。3.2.抗肺炎球菌多糖IgG：
以CDC方法的修改方法通过ELISA检测抗6B、14、19F和23F型肺炎球菌多糖的小鼠IgG。该方法包括向血清中加入可溶性细胞壁多糖(CPS)，以抑制CPS抗体的检测。CPS是一种包含所有肺炎球菌共有的磷壁酸的磷酸胆碱。它存在于荚膜下，其抗体仅具有微弱保护性。因为CPS与荚膜多糖缀合，所以用于包被ELISA板的纯化荚膜多糖通常污染0.5-1％的CPS。因此，检测CPS抗体可能混淆对荚膜多糖的ELISA结果的整理分析。
分别以20、5、10和20μg/ml碳酸盐缓冲液包被6B、14、19F和23F型多糖进行ELISA。血清与等量的在未稀释血清中的500μg/mlCPS预混合，温育30分钟，然后加入至ELISA板。用1∶2000稀释的Jackson ImmunoLab山羊抗小鼠IgG(H+L)过氧化物酶检测小鼠IgG。使用SoftMax Pro的逻辑对数比较，参比已知浓度的抗每种血清型的多糖特异性小鼠单克隆抗体绘制滴定曲线。使用的单克隆抗体分别是抗血清型6B、14、19F和23F的HASP4、PS14/4、PS19/5和PS23/22。由于可用血清量有限，所以测试混合的血清，因此未得到统计学分析。4.细胞免疫应答
第二次免疫接种后14天由第4-9组和用作阴性对照的未做实验的小鼠(第1组)中分离脾细胞和淋巴结细胞，进行FG特异性细胞免疫应答分析。分析样品的FG特异性淋巴细胞增殖和细胞因子(IFN-γ+IL-5)分泌情况。
在将96孔板中每孔4×105细胞与200μl含10-0.03μg/ml FG(3倍稀释)的培养基温育96小时后评价淋巴细胞增殖情况。3H胸腺嘧啶核苷掺入后，根据我们的标准方法检测FG特异性淋巴细胞增殖。在将24孔板中每孔2.5×106细胞与1ml含10-0.01μg FG(10倍稀释)的培养基温育96小时后评价细胞因子诱导情况。然后收获上清液，按照我们的标准方法以ELISA测定诱导产生的IFN-γ和IL-5量。(1)实验分组
10组小鼠接受各种制剂的两次免疫，所述制剂包括23价疫苗或FG或用氢氧化铝和3D-MPL或氢氧化铝配制的二者的组合物。第1组为CMI研究的对照。第2组和第9组用于评价腹膜内免疫后23价肺炎球菌疫苗的免疫原性，在文献中曾经利用腹膜内免疫评价23价肺炎球菌疫苗，IM免疫接种后，第3组和第10组与第2组和第9组进行平行分析，只是所述23价肺炎球菌疫苗用明矾/3D-MPL配制。当23价肺炎球菌疫苗不与FG明矾/3D-MPL组合时，第2组和第3组也用作当明矾/3D-MPL对23价肺炎球菌疫苗作用的对照，此时不是组合为FG明矾/3D-MPL。第4组用于评价23价肺炎球菌疫苗和FG明矾/3D-MPL组合IM免疫接种后诱导的免疫应答。第5组和第6组用作评价明矾/3D-MPL对FG的影响的对照，此时不是与23价肺炎球菌疫苗组合。活RSV免疫接种作为天然RSV IN感染时诱导的免疫应答的对照(第7组)。最后，第9组是单独的明矾/3D-MPL的作用的对照。
                         表1
   组别     抗原     佐剂  免疫途径
    1     无     无
    2     23价Pneumune(11.5μg)     无     IM
    3     23价Pneumune(11.5μg)     明矾/3D-MPL     IM
    4     23价Pneumune(11.5μg)/FG(2μg)     明矾/3D-MPL     IM
    5     FG(2μg)     明矾/3D-MPL     IM
    6     FG(2μg)     明矾     IM
    7     活RSV(批号14：105PFU)     无     IN
    8     无     明矾/3D-MPL     IM
    9     23价Pneumune(11.5μg)     无     IP
    10     23价Pneumune(11.5μg)     明矾/3D-MPL     IP
(2)体液免疫应答2.1.抗FG抗体
对初次免疫后28天和第二次免疫接种后14天的特异性抗FG抗体的分析显示，用FG明矾/3D-MPL/23价疫苗免疫(第4组)或FG明矾/3D-MPL单独免疫(第5组)时诱导相似的抗体反应，观察到FG明矾/3D-MPL/23价疫苗的抗体滴度略高(图1)。用FG明矾免疫(第6组)在这两个时间点都诱导预期较低的抗体滴度。统计学分析显示，实际上初次免疫后28天和第二次免疫接种后14天第4-6组诱导的抗FGIg滴度之间存在显著差异。结论
抗RSVA中和抗体分析(图2)显示与观测到的抗FG Ig应答分布相似。
根据以上结果计算抗FG/抗RSV中和抗体比值(第二次免疫接种后28天后)，表明FG明矾/3D-MPL/23价疫苗、FG明矾/3D-MPL和FG明矾的比值与RSV IN组诱导的比值相当(表2)。
对各个抗FG Ig、IgG1和IgG2a同种型滴度的深入统计学分析显示，向FG明矾/3D-MPL中加入23价疫苗保持了Ig和IgG1应答，并显著增加了IgG2a应答(图3A)。另外，该分析显示，FG明矾/3D-MPL/23价疫苗和FG明矾/3D-MPL的IgG1/IgG2a比值以及IgG1滴度相似，尽管与FG明矾显著不同(图3B)。三种制剂的IgG2a滴度显著不同。
                                               表2
  候选疫苗 组别(#)                                                         抗体滴度(GMT)
                  初次免疫后28天                第二次免疫接种后14天
    抗FGELISA Ig   RSV-A中和抗体 ELISA/中和抗体比值     抗FGELISAIg    RSV-A中和抗体 ELISA/中和抗体比值
FG SB AS4/23价疫苗FG SB AS4FG明矾活RSV     4567     383627131721703     39218711735     10151520     121707780792616317119     580946642771726     2117924
2.2.抗肺炎球菌多糖IgG
尽管小鼠和其它啮齿类动物可能产生针对多糖免疫原的IgM，但它们一般不产生抗多糖的IgG。这是因为它们的免疫系统缺乏诱导同种型转向不依赖T的抗原如多糖的信号。因此，检测小鼠的抗多糖IgG对于诱导改善的不依赖T的免疫应答是一种灵敏测试。
在表3中列出了诱导产生的抗23种多糖中的4种的IgG浓度。正如我们在其它实验观察到的一样，没有产生抗6B型和23F型多糖的IgG。然而，可检测到产生抗14型和19F型多糖的IgG。
不包含23价疫苗的组别未显示出任何可检测的抗14和19F型多糖的IgG，证实了所述检测的特异性。
比较免疫接种途径揭示，当23价疫苗以明矾/3D-MPL为佐剂时，对于19F型而言肌内途径似乎好于腹膜内途径，而对于14型而言恰好相反。至于常规23价疫苗，似乎不存在明显差异。
在IM和IP两种免疫途径中，与单独的23价疫苗相比，23价疫苗+明矾/3D-MPL诱导的抗14型和19F型的IgG较高。然而，当与FG组合时，IgG反应下降。尽管如此，23价疫苗+FG/明矾/3D-MPL诱导的抗19F的IgG应答仍高于单独的23价疫苗诱导的IgG应答(比较第3组和第4组)，并且抗14型的应答提高。
                                                     表3
                                       联合RSV肺炎球菌疫苗小鼠IgG(μg/ml)
   组1      组2      组3      组4      组5      组6      组8      组9     组10
    /      IM23价疫苗      IM23价疫苗MPLAl(OH)3      IM23价疫苗/FGMPLAl(OH)3      IMFGMPLAl(OH)3      IMFGAl(OH)3      IM/MPLAl(OH)3      IP23价疫苗      IP23价疫苗MPLAl(OH)3
抗PS6B   ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2
抗PS14   ＜0.04     0.1     0.6     0.2     ＜0.04     ＜0.04     ＜0.04     0.2     1.2
抗PS19F   ＜1.2     1.7     3.8     2.3     ＜1.2     ＜1.2     ＜1.2     1.6     1.6
抗PS23F   ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1
3.细胞免疫应答
FG明矾/3D-MPL+/-23价疫苗和FG明矾对脾细胞和淋巴结细胞诱导的FG特异性淋巴细胞增殖没有任何差异。
对产生的IL-5和IFN-γ的分析提示，23价疫苗和FG明矾/3D-MPL的混合物不妨碍IFN-γ的产生，但能够稍微增加IL-5的产生(图4)。此观察结果由使用两剂体外再刺激的FG(10和1μg FG/ml)观察到的IFN-γ/IL-5比值的2-8倍差异所证实。然而，FG明矾/3D-MPL/23价疫苗仍然诱导出比FG明矾高得多的IFN-γ/IL-5比值。结论
对诱导的抗FG Ig特异性抗体滴度和抗RSVA中和抗体滴度进行分析显示，FG明矾/3D-MPL和23价肺炎球菌疫苗的组合不妨碍用单独的FG明矾/3D-MPL观察到的应答诱导。通过抗FG/抗RSVA中和抗体比值测定的应答特性也保持不变，并接近在RSV IN途径真实自然感染时观察到的比值。
对诱导的FG特异性细胞介导应答进行分析提示，向FG明矾/3D-MPL中加入23价疫苗不影响对脾细胞和淋巴结淋巴细胞增殖的诱导。而且，根据对FG特异性脾细胞和淋巴结细胞体外产生的细胞因子的检测，加入23价疫苗不妨碍对用FG明矾/3D-MPL通常观察到的Th1型应答的诱导，并且在分析FG特异性同种型抗体分布时该诱导似乎得到增强。实际上，当向FG明矾/3D-MPL中加入23价疫苗时，产生的Th1应答标志IFN-γ保持不变，而产生的Th2应答标志I1-5仅稍微增加。令人感兴趣的是，向FG明矾/3D-MPL中加入23价疫苗尽管既不影响IgG1应答(Th2应答标志)也不影响IgG1/IgG2a应答，但显著增加了Th1应答标志IgG2a抗体的产生。
因此，FG明矾/3D-MPL和23价疫苗的组合不影响用FG明矾/3D-MPL观察到的应答，所以保持了FG明矾/3D-MPL相对于FG明矾的优势，即保持了对初次和再次中和抗体应答的高度诱导，并根据存在的IgG2a抗体的检测保持了对Th1应答的诱导，以及保持了高水平IFN-γ的诱导。
23价Pneumune和FG明矾/3D-MPL的组合导致所测试的4种多糖中的两种产生的IgG增加，但19F型多糖抗体增加最多。只与明矾/3D-MPL组合的23价疫苗获得最高的IgG浓度。
总之，23价肺炎球菌疫苗与RSV FG明矾/3D-MPL的组合是有利组合，其中这两种疫苗具有相互协同作用，因为某些免疫学测试显示两种疫苗均得到提高，而且没有任何测试显示相互的抑制。实施例2-评价组合的RSV+11价缀合肺炎球菌疫苗
用3D-MPL+明矾、3D-MPL+QS21的含胆固醇脂质体或含CpG的寡核苷酸(有或没有明矾)评价所述联合疫苗。
还评价了所述联合疫苗对抗D蛋白(PD)载体的IgG免疫应答的影响。
PD是一种抗不能分型的B型流感嗜血杆菌(NTHi)感染的保护性抗原。因此，联用缀合PD的肺炎球菌PS和FG可以产生对三种病原体：肺炎链球菌、RSV和不能分型B型流感嗜血杆菌的有效保护作用。Th1型免疫可能参与抗NTHi的保护作用。因此，还测试了为Th1应答良好指标的抗PD IgG2a抗体。
在本实施例中使用的11价侯选疫苗包括基本上如EP 72513所述制备的荚膜多糖血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F。每种多糖都用CDAP化学(WO 95/08348)活化和衍生化，并缀合至蛋白载体。所有的多糖都以其天然形式缀合，只有血清型3例外(减小其大小，以降低其粘度)。
所述蛋白载体是在大肠杆菌中表达的不能分型流感嗜血杆菌的重组D蛋白(PD)。1.配制方法：
在初次注射前12天制备制剂。1.1.基于QS21、3D-MPL的制剂
需要时，用10倍浓缩的PBS pH 7.4和水的混合物稀释抗原(FG(2μg)或/和非吸附PS缀合物(0.5μg/价))。以QS21/胆固醇的重量比为1/5与包含MPL的脂质体的混合物形式加入QS21(5μg)(称之为DQ/3D-MPLin)。30分钟后加入1μg/ml的硫柳汞作为防腐剂。1.2.基于CpG或3D-MPL的制剂
需要时，用稀释Al(OH)3，然后加入抗原(FG(2μg)或/和非吸附PS缀合物(0.5μg/价))。吸附30分钟后，加入MPL或CpG。30分钟后用10倍浓缩的PO4-NaCl pH 6.8对所述制剂进行缓冲。然后加入1mg/ml的硫柳汞或5mg/ml的苯氧基作为防腐剂。
所有温育都在室温下振荡进行。同时制备用于2次注射的制剂，在初次注射前对最终的制剂进行7天的熟化。1.3.制剂成分的构成：
    组分 AG或IMST浓度(μG/ML)  AL+++浓度(μG/ML)  缓冲剂
    FG    484  PO4/NaCl10/150mM pH 6.8
    Clinicalundecaval nonads
    PS1    144  NaCl 150mM pH 6.1
    PS3    149  NaCl 150mM pH 6.1
    PS4    125  NaCl 150mM pH 6.1
    PS5    135  NaCl 150mM pH 6.1
    PS6b    206  NaCl 150mM pH 6.1
    PS7    168  NaCl 150mM pH 6.1
    PS9    175  NaCl 150mM pH 6.1
    PS14    180  NaCl 150mM pH 6.1
    PS18    127  NaCl 150mM pH 6.1
    PS19    140  NaCl 150mM pH 6.1
    PS23    158  NaCl 150mM pH 6.1
    QS21    2000  水
    MPL    1019  水
    CpG    5000  水
    SUV    DOPC 40000胆固醇10000MPL2000  PBS pH 7.4
    AlPO4     1000  NaCl 150mM pH 6.1
    Al(OH)3     10380  水
2.免疫方案：
用各种制剂(参见结果部分)在第0天和第28天经IM途径(50μl)免疫每组14组(10只/组)的小鼠。在第42天(第二次免疫接种后14天)获取血清。在第42天，从FG抗原免疫各组的5只小鼠和5只未做实验的Balb/c小鼠取出脾细胞。3.体液免疫应答3.1.抗FG抗体：
获得每组10只小鼠的全部体液免疫应答结果(各自抗FG Ig、IgG1和IgG2a的应答和中和滴度)，并显示每组5只小鼠混合的细胞免疫应答结果。
在第二次免疫接种后14/15天获取各小鼠血清，测试血清FG特异性Ig抗体及其同种型(IgG2a、IgG1)分布。测定方案如下：用每孔50μl纯化FG DFGP107(1μg/ml)于4℃包被过夜，于37℃饱和1小时，与血清于37℃温育1.5小时，与抗小鼠Ig生物素1/1500(或IgG1、IgG2a生物素1/1000)于37℃温育1.5小时，与链霉过氧化物酶1/1500于37℃温育30分钟，与OPDA Sigma于室温温育20分钟，用2N H2SO4终止反应。
监测490nm的OD，并通过Softmaxpro(4参数方程)参照标准曲线确定滴度，以EU/ml表示。
使用以下方法测试第二次免疫后14天获取的各血清中存在的中和抗体：在96孔板中一式两份将50μl连续两倍稀释的血清(第一次稀释1/25)与50μl包含3000pfu RSV-A/Long(批号14)和豚鼠补体(稀释1/25)的混合物于37℃温育1小时。然后将105细胞/ml的100μlHEp-2细胞悬浮液加入到每个孔中，在5％CO2存在下于37℃温育所述板4天。
然后吸出上清液，加入100μl WST-1制剂(稀释1/15)后，在5％CO2存在下于37℃再温育所述板24小时。监测490nm的OD，并通过线性回归(y＝a.logx+b)确定滴度：滴度＝使观测到的未感染细胞最大OD产生50％下降的血清稀释度。3.2.抗肺炎球菌多糖IgG：
以CDC方法的修改方法通过ELISA检测抗3、6B、7F、14、19F和23F型肺炎球菌多糖的小鼠IgG。该方法包括向血清中加入可溶性细胞壁多糖(CPS)，以抑制CPS抗体的检测。CPS是一种包含所有肺炎球菌共有的磷壁酸的磷酸胆碱。它存在于荚膜下，其抗体仅具有微弱保护性。因为CPS与荚膜多糖缀合，所以用于包被ELISA板的纯化荚膜多糖通常污染0.5-1％的CPS。因此，检测CPS抗体可能混淆对荚膜多糖的ELISA结果的整理分析。
分别以20、5、5、20和20μg/ml PBS缓冲液包被6B、7F、14、19F和23F型多糖进行ELISA。血清与等量的在未稀释血清中的500μg/ml CPS预混合，温育30分钟，然后加入至ELISA板。用1∶5000稀释的Jackson ImmunoLab山羊抗小鼠IgG(H+L)过氧化物酶检测小鼠IgG。使用SoftMax Pro的逻辑对数比较，参比已知浓度的抗每种血清型的多糖特异性小鼠单克隆抗体绘制滴定曲线。使用的单克隆抗体分别是抗6B、7F、14、19F和23F型多糖的HASP4、PS7/19、PS14/4、PS19/5和PS23/22。
对于血清型3，进行相似的ELISA，除了首先用甲基化人血清白蛋白包被免疫板(1μg/ml的PBS溶液，2小时，37℃)，以便改善PS3包被(2.5μg/ml的PBS溶液，过夜，37℃)。单克隆抗体PS3/6用做标准对照。3.3.抗PD血清IgG的ELISA定量
用100μl/孔的2μg/ml用PBS稀释的PD抗原(在板的B至H行)，或用100μl的1μg/ml纯化山羊抗小鼠Ig(Jackson)的PBS溶液(行A)，于37℃包被Maxisorp Nunc免疫板2小时。然后，使作为标准曲线(以1μg/ml开始，加入行A)加入的连续2倍稀释(用PBS Tween20 0.05％缓冲液，100μl/孔)的纯小鼠IgG(Jackson)和血清样品(以1/20稀释度开始，加入行B至H)于4℃温育过夜。然后，将以1/5000用PBSTween20 0.05％缓冲液稀释的缀合过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Jackson)在振荡下于20℃温育30分钟(100μl/孔)。清洗几次后，将板在室温下于黑暗中和100μl/孔的显色缓冲液(OPDA 0.4mg/ml(Sigma)和H2O2 0.05％的100mM pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液)温育15分钟。加入50μl/孔的HCl 1N终止显色。使用Emax免疫读数器(Molecular Devices)读取490和620nm的光密度。使用SoftMaxPro软件利用4参数数学算法计算抗体滴度。3.4.抗PD血清IgG1、2a和2b的ELISA定量
用50μl/孔的2μg/ml用PBS稀释的PD抗原(在板的B至H行)，或用50μl的5μg/ml纯化山羊抗小鼠Ig(Boerhinger)的PBS溶液(行A)，于4℃过夜包被Maxisorp Nunc免疫板。在用PBS Tween20 0.05％BSA 1％缓冲液饱和板之后，使作为标准曲线加入的连续2倍稀释(用饱和缓冲液，50μl/孔)的纯小鼠IgG1、IgG2a或IgG2b单克隆抗体(Sigma)(以200ng/ml开始，加入行A)和血清样品(以饱和缓冲液稀释1/20开始，加入行B至H)于37℃振荡下温育1小时。用NaCl 0.9％Tween-20 0.05％缓冲液清洗几次后，将以1/1000用饱和缓冲液稀释的生物素化抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a或抗小鼠IgG2b山羊IgG(Amersham)在振荡下于20℃温育30分钟(50μl/孔)。再清洗几次后，将板在振荡下于20℃和以1/1000用饱和缓冲液稀释的缀合过氧化物酶的链霉抗生物素(Amersham)(50μl/孔)温育30分钟。清洗后，加入50μl/孔的显色缓冲液(OPDA 0.4mg/ml(Sigma)和H2O2 0.05％的100mM pH4.5的柠檬酸盐缓冲液)于室温在黑暗中显色20分钟。加入50μl/孔的HCl 1N终止显色。使用Emax免疫读数器(Molecular Devices)读取490和620nm的光密度。使用SoftMaxPro软件利用4参数数学算法计算抗体滴度。4.细胞免疫应答
在第二次免疫接种后14天由所有FG免疫组和用作阴性对照的未做过实验的小鼠分离脾细胞，进行FG特异性细胞免疫应答分析。分析样品的FG特异性淋巴细胞增殖和细胞因子(IFN-g+IL-5)分泌情况。
在将96孔板中每孔4×105细胞与200μl含10-0.03μg/ml FG(3倍稀释)的培养基温育96小时后评价增殖情况。3H胸腺嘧啶核苷掺入后，根据我们的标准方法检测FG特异性细胞增殖。在将24孔板中每孔2.5×106细胞与1ml含10-0.01μg FG(10倍稀释)的培养基温育96小时后评价细胞因子诱导情况。然后收获上清液，按照我们的标准方法用ELISA测定所诱导产生的IFN-γ和IL-5量。结果1.各组情况
14组小鼠接受各种制剂间隔28天的两次IM免疫接种，所述制剂包含用明矾3D-MPL、CpG、Cpg明矾或明矾配制的11价缀合疫苗或FG或二者的组合。
讨论了第1至4部分的结果。在各部分中都包括FG明矾结果，它用作主要为Th2型的佐剂诱导特异性RSV免疫应答的对照。还加入一组未做实验的小鼠用做FG特异性CMI分析的内部对照。
第1部分：
 组别     抗原   佐剂 免疫途径
  ABCDE     PS-PD(0.5μg)FG(2μg)PS-PD(0.5μg)+FG(2μg)FG(2μg)无   明矶3D-MPL明矾3D-MPL明矾3D-MPL明矾无   IMIMIMIMIP
第2部分：
 组别     抗原   佐剂 免疫途径
  ABCDE     PS-PD(0.5μg)FG(2μg)PS-PD(0.5μg)+FG(2μg)FG(2μg)无   3D-MPL+QS213D-MPL+QS213D-MPL+QS21明矶无     IMIMIMIMIP
第3部分：
 组别     抗原   佐剂 免疫途径
  ABCDEFGH     PS-PD(0.5μg)FG(2μg)PS-PD(0.5μg)+FG(2μg)PS-PD(0.5μg)FG(2μg)PS-PD(0.5μg)+FG(2μg)FG(2μg)无   CpG(50μg)CpG(50μg)CpG(50μg)CpG(50μg)明矾CpG(50μg)明矾CpG(50μg)明矶明矾无   IMIMIMIMIMIMIM
第4部分：
与第3部分的分组相同。2.第1部分：2.1.抗FG抗体：
FG/明矾/3D-MPL或FG/明矾/3D-MPL联用11价PS缀合疫苗诱导相似的抗RSVA中和抗体水平(图5)。实际上在联用两种疫苗时可以观察到对诱导RSVA中和抗体的轻微协同增效作用。
对各抗FG IgG1和IgG2a同种型滴度进行分析显示，FG/明矾/3D-MPL/11价PS缀合疫苗诱导的滴度相似于或稍低于FG/明矾/3D-MPL诱导的滴度(图6)。
分析IgG2a与IgG1的同种型比值显示，两种疫苗的存在不改变所述同种型比值，它仍然远低于FG明矾(一种公认的Th2诱导型佐剂)诱导的同种型比值。2.2.抗肺炎球菌多糖IgG
按照实施例1所述检测抗3、6B、14、19F和23F型多糖的血清IgG滴度。用11价PS缀合疫苗/明矾/3D-MPL制剂或用补加FG抗原的相同疫苗免疫接种时诱导相似的抗体应答(图7)。该结果证明，在明矾3D-MPL制剂中肺炎球菌PS缀合疫苗和RSV FG抗原联用不降低或改变抗肺炎球菌免疫应答。2.3.FG-特异性细胞免疫应答
对IL-5和IFN-γ产生量的分析提示，FG/明矾/3D-MPL与11价PS缀合疫苗的混合物确实只稍微影响这些细胞因子的产生水平(图8)。然而，该混合物不影响检测的细胞因子比值(Th型应答指标)，它与FG明矾制剂(Th2诱导型佐剂)观察到的比值仍相当不同。3.第2部分：DQ/3D-MPLin3.1.抗FG抗体：
FG DQ/3D-MPLin或FG DQ/3D-MPLin与11价PS缀合疫苗联用诱导相似的抗FG Ig抗体水平。
正如抗FG Ig分析所见，当FG DQ/3D-MPLin与11价PS缀合疫苗混合时没有观察到对抗RSVA中和抗体水平的干扰(图10)。
对各抗FG IgG1和IgG2a同种型滴度进行分析显示，FG DQ-MP/11价PS缀合疫苗诱导的滴度与常规FG DQ-MP相似(图11)。分析所述同种型比值显示，联用所述疫苗不改变所述同种型比值，它仍然远低于FG明矾(一种公认的Th2诱导型佐剂)诱导的同种型比值。3.2.抗肺炎球菌多糖IgG
按照实施例1所述检测抗3、6B、14、19F和23F型多糖的血清IgG滴度。用11价PS缀合疫苗/DQ/3D-MPLin制剂或用补加FG抗原的相同疫苗免疫接种时诱导相似的抗体应答(图12)。该结果证明，在DQ/3D-MPLin制剂中联用肺炎球菌PS缀合疫苗和RSV FG抗原不降低或改变抗肺炎球菌免疫应答。3.3.FG-特异性细胞免疫应答
对IL-5和IFN-γ产生量的分析初步提示，FG DQ/3D-MPLin与11价PS缀合疫苗的混合物确实只稍微影响IFN-γ的产生水平(图13)。对所测定细胞因子的比值(Th型应答指标)的进一步分析显示，FGDQ/3D-MPLin与11价PS缀合疫苗的混合物确实只稍微影响Th分布。然而，对于所述两种抗原与DQ/3D-MPLin的组合而言，保持IFN-γ相对于IL-5占优势，仍然远高于在FG明矾制剂(一种公认的Th2诱导型佐剂)观察到的这种优势。4.第3部分：CpG和CpG明矾4.1.抗FG抗体：
FG CpG或FG CpG与11价PS缀合疫苗联用诱导相似的抗FG Ig抗体水平(图14)。对于CpG明矾型制剂，还可观察到不存在FG CpG与11价PS缀合疫苗的混合物产生的干扰。
正如抗FG Ig分析所见，当FG CpG或FG CpG明矾与11价PS缀合疫苗混合时没有观察到对抗RSVA中和抗体水平的干扰(图15)。
对各抗FG IgG1和IgG2a同种型滴度进行分析显示，在向FG CpG或FG CpG明矾制剂中加入11价PS缀合疫苗时没有干扰(图16)。
进一步分析IgG1/IgG2a同种型比值显示，两种疫苗的混合物不改变所述同种型比值，它仍然远低于FG明矾(一种Th2佐剂)诱导的同种型比值。4.2.抗肺炎球菌多糖IgG
按照实施例1所述检测抗3、6B、7F、14、19F和23F型多糖的血清IgG滴度。在本实施例中，测试两种佐剂制剂：CpG和明矾/CpG。对于两种佐剂制剂，用11价PS缀合疫苗补加FG免疫动物的抗PS IgG滴度，至少类似于用11价PS缀合疫苗单独免疫动物的滴度(图17)。该结果证明，在CpG或明矾CpG制剂中联用肺炎球菌PS缀合疫苗和RSV FG抗原不降低或改变抗肺炎球菌免疫应答。针对7F和14血清型的抗体滴度使用CpG佐剂制剂在FG存在下甚至显著提高。4.3.FG-特异性细胞免疫应答
对IL-5和IFN-γ产生量的分析提示，FG CpG或CpG明矾与11价PS缀合疫苗的混合物既不影响这些细胞因子的产生水平，也不影响其IFN-γ/IL-5比值(图18)。因此，对于CpG和CpG明矾制剂中联用两种疫苗而言，保持IFN-γ(Th1应答标志)占优势。使用CpG佐剂制剂在FG存在下IFN-γ诱导甚至得到提高。5.第4部分：
评价了加入FG至PS缀合疫苗制剂中对针对D蛋白(PD)载体的IgG免疫应答的影响。PD是一种抗不能分型B型流感嗜血杆菌(NTHi)感染的保护性抗原。Th1型细胞免疫可能参与抗NTHi的保护作用。因此，还测试了为Th1应答良好指标的抗PD IgG2a抗体。5.1.抗FG抗体：
参见第3部分。5.2.抗肺炎球菌多糖IgG
参见第3部分。5.3.FG特异性细胞免疫应答
参见第3部分。5.4.抗PD血清IgG、IgG1、2a和2b的ELISA定量
如图19所示，肺炎球菌PS缀合疫苗制剂中存在的FG不明显影响针对PD载体的总血清IgG应答，无论使用哪种佐剂(CpG或明矾CpG)。将FG加入到所述制剂中没有改变用CpG或明矾CpG PS缀合疫苗制剂免疫接种时激发的高比例血清抗PD IgG2a抗体(约占总IgG的30％)(图20)。这种IgG2a应答表示强烈的Th1免疫。总而言之，这些结果证明，将在CpG或明矾CpG制剂中联用缀合PD的肺炎球菌PS与RSV FG抗原不改变抗PD免疫应答。讨论和结论第1部分：明矾/3D-MPL
所述结果证明，在明矾3D-MPL制剂中联用肺炎球菌PS缀合疫苗和RSV FG抗原不改变抗肺炎球菌体液免疫应答。所述混合物似乎稍微改变FG特异性体液和细胞免疫应答的水平，但不影响常规FG制剂的Th应答类型。第2部分：DQ/3D-MPLin
所述结果证明，在DQ/3D-MPLin制剂中联用肺炎球菌PS缀合疫苗和RSV FG抗原不改变抗肺炎球菌体液免疫应答或FG特异性体液免疫应答。进一步分析细胞免疫应答提示，在DQ/3D-MPLin制剂中联用两种抗原确实只略微影响IFN-γ的诱导。但是与单独的FG制剂相比，它不影响Th应答类型。第3部分：CpG/CpG明矾
所述结果证明，在CpG或明矾CpG制剂中联用肺炎球菌PS缀合疫苗和RSV FG抗原不降低或改变抗肺炎球菌体液免疫应答或FG特异性体液和细胞免疫应答。第4部分：CpG/CpG明矾
所述结果证明，在CpG或明矾CpG制剂中联用缀合PD的肺炎球菌PS和RSV FG抗原不降低或改变抗PD免疫应答。
总之，23价肺炎球菌疫苗与RSV FG 3D-MPL组合为有利组合，其中两种疫苗具有协同增效作用，因为某些免疫学测试显示两种疫苗的作用得到提高，而没有任何测试显示抑制作用。根据以上结果，当在一组Th1佐剂中联用11价缀合PD的肺炎球菌PS和RSV FG抗原时，也观测到为有利组合。实际上，在所测试的各种Th1佐剂的大多数免疫结果中，联合疫苗抗原不妨碍或仅稍微妨碍(就所涉及到的总体免疫应答而言不重要)任一疫苗预先存在的特性。正如在实施例1中联用FG和23价疫苗时所观测到的，在某些情况下在某些免疫测试中，一种或另一种疫苗的确显示改善。

Claims (15)

1.一种疫苗组合物，该组合物包含：
(a)与蛋白或肽缀合、或者非缀合的一种或多种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖；和
(b)RSV抗原
以及为Th1型应答选择性刺激剂的佐剂。
2.按照权利要求1的疫苗组合物，其中所述肺炎链球菌多糖优选与一种选自以下的蛋白缀合：B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzaeB)D蛋白或其片段、脂化型D蛋白(脂蛋白D)；破伤风毒素和白喉毒素。
3.按照权利要求1或权利要求2的疫苗组合物，它还包含载体。
4.按照权利要求1至3任一项的疫苗组合物，其中所述Th1型应答选择性刺激剂为至少一种选自以下的佐剂：3D-MPL、其中3D-MPL颗粒大小优选约100nm或100nm以下的3D-MPL、QS21、QS21和胆固醇的混合物以及CpG寡核苷酸。
5.按照权利要求4的疫苗组合物，其中所述Th1型应答选择性刺激剂包括3D-MPL。
6.按照权利要求5的疫苗组合物，它还包含QS21。
7.按照权利要求1至6任一项的疫苗组合物，其中所述肺炎链球菌多糖是23价肺炎球菌多糖疫苗。
8.按照权利要求1至7任一项的疫苗组合物，其中所述肺炎链球菌多糖是11价缀合肺炎球菌多糖疫苗。
9.按照权利要求1至8任一项的疫苗组合物，其中所述RSV抗原是人RSV包膜糖蛋白。
10.按照权利要求1至9任一项的疫苗组合物，其中所述RSV抗原是嵌合FG或其片段。
11.按照权利要求1至10任一项的疫苗组合物，其中还包含流感病毒抗原。
12.按照权利要求1至11任一项的疫苗组合物，其中所述载体选自氢氧化铝、磷酸铝和生育酚以及水包油乳剂。
13.一种制备按照权利要求1至12任一项的疫苗的方法，该方法包括混合肺炎链球菌抗原和RSV抗原以及Th1诱导型佐剂。
14.一种制备疫苗组合物的方法，该方法包括将缀合D蛋白或其片段的肺炎链球菌多糖和RSV抗原以及药学上可接受的赋形剂混合在一起。
15.一种预防或改善患者RSV和/或肺炎链球菌感染的方法，该方法包括给予所述患者有效量的按照权利要求1至12任一项的疫苗。
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