CN114867492A - 口服呼吸道疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的口服活犬副流感病毒疫苗和相关的多价疫苗。还提供了单独使用疫苗或在多价疫苗中与一种或多种其它保护性免疫原组合使用疫苗的方法。

Description

口服呼吸道疫苗
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2019年12月18日提交的临时申请美国系列号62/949,928的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及新的口服活犬副流感病毒疫苗和相关的多价疫苗。还提供了单独或在多价疫苗中与一种或多种其它保护性抗原组合制备和使用疫苗的方法。
背景技术
犬副流感(CPI)病毒是引起呼吸道疾病的高度传染性病毒，引起上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的收缩，也称为犬窝咳。虽然呼吸道症状可能类似于犬流感，但它们是不相关的病毒，需要不同的疫苗提供保护。CPI病毒在感染后从被感染动物的呼吸道排出长达两周，并通常通过空气传播。CPI病毒在大量犬聚集在一起的犬舍或收容所中迅速传播。临床症状包括干咳或湿咳、发低烧、流鼻涕、缺乏精力和食欲不振。
目前，有几种包含活的经修饰的CPI病毒的可皮下或肌内施用的商品化犬疫苗，其中包括
Figure BDA0003704094110000011
Canine 1-DAPPv，其是一种用于接种健康犬的经修饰的活病毒疫苗，其有助于预防由犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒和犬细小病毒引起的疾病。此外，还有商品化的鼻内疫苗，如
Figure BDA0003704094110000012
Intra-Trac3，其提供针对涉及气管支气管炎起因的药剂的三重保护，包括犬副流感病毒、犬腺病毒2型和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)。
然而，尽管口服接种具有优点，例如易于使用和在接种过程中和接种后没有动物不适感，但迄今为止还没有市售的含有CPI病毒的口服疫苗。因此，对将有助于保护犬对抗上呼吸道疾病和/或传染性气管支气管炎的针对犬副流感病毒的口服疫苗仍存在长期需求。
本文中任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
发明内容
本发明提供了用于对动物受试者(如犬科动物)口服施用的疫苗组合物，其包含免疫有效量的经修饰的活犬副流感(CPI)病毒，其有助于在接种疫苗的动物受试者的接受者中激发保护性免疫(和/或对其提供有效保护)。在某些实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.0log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.3log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.7log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.9log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.1log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.3log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.6log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.8log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于8.0log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于8.3log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于8.6log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于8.8log10HAID50/mL。
在口服疫苗的相关实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度为6.0log10HAID50/mL至9.5log10HAID50/mL。在口服疫苗的其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度为6.5log10HAID50/mL至9.5log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度为6.8log10HAID50/mL至9.5log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度为7.0log10HAID50/mL至9.5log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度为7.3log10HAID50/mL至9.5log10HAID50/mL。在其它实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒的滴度为7.3log10HAID50/mL至8.6log10HAID50/mL。
在包含经修饰的活CPI病毒的疫苗的具体实施方案中，所述CPI病毒具有经修饰的活CPI病毒(其具有ATCC保藏号PTA-126273)的独特/鉴定特征。在更具体的实施方案中，疫苗中经修饰的活CPI病毒具有ATCC保藏号PTA-126273。
本发明还提供了用于动物受试者口服施用的疫苗，其有助于在接种疫苗的动物受试者的接受者中激发(和/或激发起)保护性免疫(和/或提供有效的保护)，所述疫苗包含经修饰的活犬副流感(CPI)病毒并且还包含无毒的活支气管炎博德特氏菌。在特定的实施方案中，除了包含经修饰的活CPI病毒的上述量之一外，疫苗还包含滴度等于1×107cfu/mL至1×1012cfu/mL的无毒的活支气管炎博德特氏菌。在其它实施方案中，疫苗包含滴度等于1×108cfu/mL至1×1012cfu/mL的无毒的活支气管炎博德特氏菌。在其它实施方案中，疫苗包含滴度等于5×108cfu/mL至1×1012cfu/mL的无毒的活支气管炎博德特氏菌。在其它实施方案中，疫苗包含滴度为1×109cfu/mL至5×1011cfu/mL的无毒的活支气管炎博德特氏菌。
本发明的口服疫苗可包含经修饰的活的犬副流感病毒，有或没有无毒的活支气管炎博德特氏菌但具有一种或多种另外的免疫原。在某些实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬流感病毒。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬细小病毒。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬瘟热病毒。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬腺病毒2型。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒呼吸道犬冠状病毒。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬肺病毒。在其它实施方案中，疫苗还包含编码一种或多种蛋白免疫原的病毒载体，所述蛋白免疫原来自犬流感病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒(1型或2型)、呼吸道犬冠状病毒、犬肺病毒、马链球菌兽瘟亚种和/或犬支原体。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒马链球菌兽瘟亚种。在其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬支原体。此外，包含经修饰的活犬副流感病毒或具有无毒的活支气管炎博德特氏菌的经修饰的活犬副流感病毒的疫苗还可包含这些其它免疫原中的两种或更多种。本发明的疫苗可以是佐剂化的或非佐剂化的。
本发明还提供了有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法，其包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒的疫苗。在该方法的某些实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.0log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.3log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.7log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI的滴度等于或大于7.0log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.3log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI的滴度等于或大于7.6log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.8log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI的滴度等于或大于8.0log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于8.3log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI的滴度等于或大于8.6log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于8.8log10HAID50/剂。
在该方法的相关实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为6.0log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为6.3log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为6.5log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为6.8log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为7.0log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为7.3log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。在该方法的其它实施方案中，施用的经修饰的活CPI病毒的滴度为7.3log10HAID50/剂-9.0log10HAID50/剂。在口服施用包含经修饰的活CPI病毒的疫苗的方法的具体实施方案中，所述CPI病毒具有经修饰的活CPI病毒(其具有ATCC保藏号PTA-126273)的独特/鉴定特征。在本发明方法的更具体的实施方案中，经修饰的活CPI病毒具有ATCC保藏号PTA-126273。
在本发明的一个方面，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法包括向动物受试者(例如犬科动物)口服施用包含经修饰的活CPI病毒的疫苗，所述疫苗还包含无毒的活支气管炎博德特氏菌(即同时包含经修饰的CPI病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗)。在该方法的某些实施方案中，除了包含经修饰的活CPI病毒的上述量之一外，疫苗还包含滴度等于或大于1×107cfu/剂的无毒的活支气管炎博德特氏菌。在该方法的特定实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于5×107cfu/剂。在该方法的更具体的实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×108cfu/剂。在该方法的甚至更具体的实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于5×108cfu/剂。在具体实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×109cfu/剂。在该方法的相关实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为1×107cfu/剂至1×1012cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为1×109cfu/剂至1×1012cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为1×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为1×109cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×109cfu/剂至5×1011cfu/剂。
在该方法的更具体的实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。在该方法的更具体的实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。在该方法的更具体的实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于5×108cfu/剂。
在该方法的某些实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.0log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度是6.8log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂，无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度是6.8log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×109cfu/剂。在其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度为7.0log10HAID50/剂至9.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。在其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度是7.0log10HAID50/剂至9.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×109cfu/剂。
在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于5×109cfu/剂至5×1011cfu/剂。
在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度为6.0log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度为6.5log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度为6.5log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×109cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度是6.8log10HAID50/剂至9.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在该方法的其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度是6.8log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×109cfu/剂至5×1011cfu/剂。在其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度是7.0log10HAID50/剂至9.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。在其它实施方案中，经修饰的活CPI病毒的滴度为7.0log10HAID50/剂至9.0log10HAID50/剂且无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×109cfu/剂至5×1011cfu/剂。
在口服施用包含经修饰的活CPI病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗的方法的具体实施方案中。无毒的活支气管炎博德特氏菌病毒具有无毒的活支气管炎博德特氏菌(其具有ATCC保藏号PTA-126272)的独特/鉴定特征。在该方法的更具体的实施方案中，无毒的活支气管炎博德特氏菌具有ATCC保藏号PTA-126272。在更具体的实施方案中，经修饰的活CPI病毒具有ATCC保藏号PTA126273且无毒的活支气管炎博德特氏菌具有ATCC保藏号PTA-126272。
在其它实施方案中，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法包括口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒和一种或多种另外的免疫原的疫苗。在该方法的某些实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬流感病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬细小病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬瘟热病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬腺病毒2型。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒呼吸道犬冠状病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬肺病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含编码一种或多种蛋白免疫原的一种或多种病毒载体，所述蛋白免疫原来自犬流感病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒(1型或2型)、呼吸道犬冠状病毒、犬肺病毒、马链球菌兽瘟亚种和/或犬支原体。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒马链球菌兽瘟亚种。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬支原体。此外，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法可包括口服施用疫苗，所述疫苗包含与两种或更多种这些免疫原组合的经修饰的活犬副流感病毒。
在相关的实施方案中，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒、无毒的活支气管炎博德特氏菌病毒和一种或多种另外的减毒活免疫原的疫苗。在该方法的某些实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬流感病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬细小病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬瘟热病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬腺病毒2型。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒呼吸道犬冠状病毒。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬肺病毒。在该方法的其它实施方案中，口服疫苗还包含编码一种或多种蛋白免疫原的病毒载体，所述蛋白免疫原来自犬流感病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒(1型或2型)、呼吸道犬冠状病毒、犬肺病毒、马链球菌兽瘟亚种和/或犬支原体。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒马链球菌兽瘟亚种。在该方法的其它实施方案中，疫苗还包含活的减毒犬支原体。此外，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法可包括口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的支气管炎博德特氏菌与两种或更多种这些免疫原组合的疫苗。
在具体的实施方案中，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法包括口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬腺病毒2型和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗。
在某些实施方案中，本发明的有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法可包括向犬科动物口服施用单剂量疫苗。因此，在具体的实施方案中，该方法包括向犬科动物口服施用单剂量的包含经修饰的活犬副流感病毒的疫苗。在相关的实施方案中，该方法包括向犬科动物口服施用单剂量的包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗。
在备选的实施方案中，本发明的有助于保护(和/或为其提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法可以包括向犬科动物口服施用两个或更多个剂量的疫苗。因此，在具体的实施方案中，该方法包括向犬科动物口服施用两个或更多个剂量的包含经修饰的活犬副流感病毒的疫苗。在相关的实施方案中，该方法包括向犬科动物口服施用两个或更多个剂量的疫苗，所述疫苗包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌。
在具体的实施方案中，有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法包括向犬科动物口服施用非佐剂化的疫苗。这些方法的具体实施方案包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒的疫苗，其中所述疫苗是非佐剂化的疫苗。这些方法的更具体的实施方案包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗，其中所述疫苗是非佐剂化的疫苗。在这种类型的特定实施方案中，疫苗作为单剂量疫苗施用。
有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法的替代实施方案包括向犬科动物口服施用佐剂化的疫苗。这些方法的具体实施方案包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒的疫苗，其中所述疫苗包含佐剂。这些方法的相关实施方案包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗，其中所述疫苗包含佐剂。在这种类型的特定实施方案中，疫苗作为单剂量疫苗施用。
在有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法的某些实施方案中，本发明的疫苗以0.2mL至5mL的剂量口服施用。在相关的实施方案中，本发明的疫苗以0.2mL至4mL的剂量口服施用。在其它具体实施方案中，本发明的疫苗以0.3至1.5mL的剂量口服施用。在其它实施方案中，本发明的疫苗以0.2mL至3.0mL的剂量口服施用。在其它实施方案中，本发明的疫苗以0.2mL至2.5mL的剂量口服施用。在其它实施方案中，本发明的疫苗以0.2mL至2.0mL的剂量口服施用。在其它实施方案中，本发明的疫苗以0.5至2.5mL的剂量口服施用。在其它实施方案中，本发明的疫苗以0.75mL至2.0mL的剂量口服施用。在其他实施方案中，本发明的疫苗以0.5mL至2.0mL的剂量口服施用。在其它实施方案中，本发明的疫苗以0.5mL至1.5mL的剂量口服施用。在其他实施方案中，本发明的疫苗以0.75mL至1.5mL的剂量口服施用。在具体的实施方案中，本发明的疫苗以1.0mL的剂量口服施用。
通过参考以下详细描述，包括以下实施例，将更好地理解本发明的这些和其它方面。
具体实施方式
因此，本发明提供了经修饰的活犬副流感病毒疫苗，其中包括用作口服疫苗的多价疫苗。本发明还提供了对抗犬副流感病毒的口服免疫犬科动物的方法，其包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒(CPI)的疫苗。本发明还提供了包含经修饰的活犬副流感病毒的单剂量疫苗。这种疫苗有助于保护(和/或提供有效保护)接种疫苗的犬科动物抵抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎至少6个月，而不需要加强疫苗。在某些实施方案中，单剂量疫苗以1mL的剂量施用于犬科动物。
本发明还提供了包含与一种或多种其他犬科病原体和/或免疫原组合的经修饰的活犬副流感病毒的疫苗，所述其他犬科病原体和/或免疫原进一步引发针对犬科流感病毒(例如H3N2和/或H3N8)、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬呼吸道冠状病毒、犬肺病毒、支原体物种(例如犬支原体)和马链球菌兽瘟亚种的免疫。
更具体地，本发明还包括多价口服疫苗，其包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌。本发明还提供免疫犬科动物以抵抗犬副流感病毒和支气管炎博德特氏菌的方法，其包括向犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的疫苗。在本发明的具体实施方案中，只接受一个剂量的单剂量疫苗(或多价疫苗)的犬科动物可被保护以抵抗由野生型CPI病毒和野生型无毒的活支气管炎博德特氏菌引起的上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎至少6个月，所述疫苗包含经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌，不需要加强疫苗。在更具体的实施方案中，单剂量疫苗以1mL的剂量施用于犬科动物。
在特定的实施方案中，疫苗包含免疫有效量的经修饰的活CPI病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌，如由在接种疫苗的犬科动物中诱导的CPI病毒血清中和抗体和支气管炎博德特氏菌凝集和/或IgA抗体的量所测定的。在一个相关的方面，本发明提供了一种疫苗，该疫苗包含一种特异性的、最小量的每种抗原，该抗原有效地抵抗有毒的CPI病毒和有毒的支气管炎博德特氏菌。在另一个方面，本发明的疫苗既安全又有效，且有助于保护(和/或提供有效保护)犬科动物对抗犬中因CPI病毒和支气管炎博德特氏菌感染引起的上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎。
本发明还提供了包含活的减毒CPI病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌的多价疫苗与一种或多种其它犬病原体和/或免疫原的进一步组合，所述犬病原体和/或免疫原进一步引发针对犬流感病毒(例如H3N2和H3N8)、犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬呼吸道冠状病毒、犬肺病毒、支原体物种(例如犬支原体)和马链球菌兽瘟亚种的免疫。
本文所用，术语“大约”可与术语“约”互换使用，并且表示值在所示值的25％以内，即包含“大约”4.0mL的疫苗剂量可包含3.0至5.0mL。
除非另有说明，本文所用的术语“犬科动物”与术语“犬”可互换使用，并且包括所有家养的犬，即家犬亚种(Canis lupus familiaris)或家犬(Canis familiaris)。
如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。家猫、纯种和/或杂种伴侣猫，以及野生或野生猫都是猫科动物。
如本文所用，“疫苗”是适合应用于动物(例如犬科动物)且包含一种或多种抗原(即一种或多种免疫原)的组合物，其通常与药学上可接受的载体(例如含有无菌水的液体)组合，其在施用于动物后诱导足够强的免疫应答以最低限度地有助于保护(和/或提供有效保护)对抗由野生型微生物(例如病毒或细菌)感染引起的疾病，即足够强以有助于预防疾病、提供有效保护、预防或减轻疾病。在优选的实施方案中，疫苗足够强以提供针对由野生型微生物(例如病毒或细菌)感染引起的疾病的有效保护。如本文所用，术语“疫苗”包括单价疫苗和多价疫苗。用于对动物受试者的口服施用的疫苗也可称为“口服疫苗”。
本文所用的“多价疫苗”是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在这种类型的具体实施方案中，多价疫苗刺激接受者的免疫系统抵抗两种或更多种不同的病原体。
如本文所用，术语“保护”、“保护的”、“提供有效保护”、“提供有效的保护”、“有助保护”、“有助于保护”和“有助于引发保护性免疫”不需要完全保护对抗任何感染迹象。例如，“有助于保护”可指保护是足够的以使在攻击后潜在感染的症状至少减少，和/或导致症状的一种或多种潜在细胞、生理或生化原因或机制减少和/或消除。应当理解，本文所用的“减少”是指相对于感染状态，所述感染状态包括感染的分子状态，而不仅仅是感染的生理状态。
如本文所用，术语“提供有效保护”和“提供有效的保护”可互换使用。对于包含在本发明疫苗中的经修饰的活犬副流感病毒，通过发现在用活的野生型CPI病毒攻击后接种疫苗的犬和安慰剂-接种的对照犬之间CPI病毒脱落的持续时间和/或疾病的临床症状在统计学上显著减少，来确定为犬科动物“提供有效保护”使其对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎。对于包含在本发明的疫苗中的无毒的活支气管炎博德特氏菌，通过发现在用活的野生型支气管炎博德特氏菌攻击后接种疫苗的犬和安慰剂-接种的对照犬之间受影响的犬的数量在统计学上显著减少，来确定为犬科动物“提供有效保护”使其对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎。受影响的犬被定义为在攻击后观察期内连续两天或更多天有自发性咳嗽或有干呕的自发性咳嗽。
如本文所用，“病毒脱落的持续时间”是从病毒从犬科动物的鼻孔脱落的第一次到最后一次发生的天数，如通过从鼻拭子的病毒滴定所测定的。在本发明的特定实施方案中，确定CPI病毒的病毒脱落持续时间。
如本文所用，“细菌脱落的持续时间”是从细菌从犬科动物的鼻孔脱落的第一次到最后一次发生的天数，如通过从鼻拭子的细菌滴定所测定的。在本发明的特定实施方案中，确定支气管炎博德特氏菌的细菌脱落的持续时间。
如本文所用，“血清转化”的犬科动物是指针对特定抗原(例如CPI病毒或支气管炎博德特氏菌)的犬科动物的抗体滴度是特定抗原的基线值的至少2倍高。
本文所用的术语“活的减毒病毒”和“活的经修饰病毒”可互换使用，是免疫原性但非致病性的活的减毒病毒免疫原。
如本文所用，术语“活的减毒细菌”、“细菌的无毒的活培养物”和“无毒的活细菌”可互换使用，并且是具有免疫原性但非致病性的活的减毒细菌免疫原(例如无毒的活支气管炎博德特氏菌)。
如本文所用，当待施用至动物受试者的疫苗的“剂量”被定义为包含抗原的特定量或量的范围(例如，按重量计，例如4μg/剂或2至6μg/剂，按滴度，例如7.3log10HAID50/剂或7.3-8.6log10HAID50/剂)时，施用整个剂量可在单次施用中进行，或可选地，在3小时或更少的间隔内多次施用。在特定的实施方案中，疫苗剂量以单次施用一次全部口服施用于动物受试者。
如本文所用，“单剂量疫苗”是包含来自病原体的至少一种免疫原的疫苗(或多价疫苗)，其中所述疫苗(或多价疫苗)以单次施用于动物，或可选地，在短时间段内(即，在3小时或更少的间隔内)多次施用，并且在至少六个月内仍有助于保护(和/或提供有效保护)动物对抗病原体侵害，而不需要施用第二剂量的疫苗(例如，加强疫苗)。在这种类型的具体实施方案中，单剂量疫苗作为疫苗的单个可分量口服施用于动物受试者，例如犬科动物，全部以单次施用。在特定的实施方案中，单剂量疫苗以1mL剂量口服施用于动物受试者。因此，预期本发明的疫苗可作为单剂量疫苗口服施用于动物受试者，例如犬科动物，其免疫持续时间为至少6个月。在某些实施方案中，免疫的持续时间为至少9个月。在其它实施方案中，免疫的持续时间为至少12个月。在其它实施方案中，免疫的持续时间为至少18个月。
在可选择的方面，第二剂量的疫苗(或多价疫苗)是在初次口服剂量施用后6至18个月的持续时间内，在初次施用后的一周、多周或数月施用。加强疫苗可通过注射(例如肌内、皮下)、鼻内或口服施用。因此，在一些实施方案中，疫苗以至少两个剂量口服施用。在一些这样的实施方案中，例如，疫苗施用两次，第二剂量(例如加强疫苗)在第一次施用后至少约2周施用。在一些实施方案中，疫苗施用两次，第二剂量在第一次施用后不超过8周施用。在其它实施方案中，第二剂量在第一剂量后约2周至约4个月、在第一剂量后约2周至约8周、或在第一剂量后约3周至约4周施用。在一些实施方案中，第二剂量在第一剂量后约4周施用。第一和随后的给药可以变化，例如在量和/或形式上变化。然而，给药通常与数量和形式相同。无论以单剂量疫苗还是以多剂量[即加强疫苗]进行施用，应当理解，在6至18个月的免疫持续时间(或甚至更长)之后，例如在一年或每隔一年的施用方案中，可能需要向选定的动物受试者提供疫苗的后续施用。
当单剂量的本发明口服疫苗足以有助于保护(和/或提供有效保护)动物对抗病原体至少六个月时，该剂量中抗原的量通常包括6个月或更长持续时间的治疗有效量的疫苗。另一方面，当需要加强疫苗剂量以补充该初始剂量时，初始疫苗和加强疫苗的组合量可构成治疗有效量。
术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。
本文所用的“非佐剂化的疫苗”是不含佐剂的疫苗或多价疫苗。
如本文所用，术语“药学上可接受的”用作形容词以表示修饰的名词适用于药物产品。例如，当它用于描述药物疫苗中的赋形剂时，它将赋形剂表征为与组合物的其它成分相容并且对预期的受体动物(例如犬科动物)没有不利的损害。
在具体的实施方案中，本发明的疫苗还可以与药学上可接受的免疫刺激剂和/或佐剂和/或生物粘附性聚合物一起施用。在本文中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫应答。因此，“佐剂”是非特异性地增加对特定抗原的免疫应答的试剂，从而减少任何给定疫苗中必需的抗原量，和/或为了产生针对目标抗原的足够免疫应答所必需的注射频率。用于动物接种疫苗的合适佐剂包括但不限于矿物凝胶，如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂，如复合多元醇和油乳液。以下示例的一种佐剂CARBIGENTM是含有乳化组分的最终灭菌的基于卡波姆的
Figure BDA0003704094110000161
佐剂悬浮液，并且不含从MVPAdjuvants[位于4805"G"Street Omaha,NE]获得的动物来源成分。
Figure BDA0003704094110000162
是与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的丙烯酸均聚物。
PVP-K60是一种生物粘附性聚合物，是吸湿的无定形聚乙烯吡咯烷酮线性非离子聚合物，其可溶于水和有机溶剂，并且是pH稳定的(K60是指其分子量)。
关于佐剂和免疫测定的各个方面的信息公开于例如P.Tijssen,Practice andTheory of Enzyme Immunoassays,3rd Edition,1987,Elsevier,New York，其通过引入方式并入本文。药学上可接受的免疫刺激剂包括细菌和/或真菌细胞壁组分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽)、粘膜粘附聚合物、源自植物的各种复合糖(例如聚糖、乙酰吗喃)、源自动物的各种蛋白质和肽(例如激素、细胞因子、共刺激因子)、以及源自病毒和/或其它来源的新核酸(例如双链RNA、CpG)。
用于本发明疫苗的活的减毒CPI病毒可以通过常规方法制备。常规方法通常包括，例如，通过体外传代、冷适应修饰致病毒株，通过遗传操作修饰生物体的致病性，选择无毒性野生型毒株，和本领域技术人员熟知的其它方法。然后可以测试这些减毒的CPI病毒以确定它们是否适合于口服施用，如以下实施例所述。
通过细胞培养连续传代野生型病毒可以获得活的经修饰的CPI病毒株。在备选的实施方案中，通过利用实验动物和/或非宿主动物连续传代野生型病毒来获得活的经修饰的CPI病毒株。在这种传代过程中基因突变的积累通常导致生物体对原始宿主的毒力逐渐丧失。在一些实施方案中，通过冷适应制备减毒活病毒株。冷适应病毒具有仅在上呼吸道中发现的温度下复制的优点。冷适应马流感病毒的产生方法已描述于U.S.6,177,082中[其通过引用方式整体并入本文]。预期所得的冷适应病毒赋予一种或多种以下表型：冷适应性、温度敏感性、显性干涉和/或衰减。另外，经修饰的活犬副流感病毒和无毒的活支气管炎博德特氏菌先前已被公开并包括在市售犬疫苗中。
生物保藏物
在满足布达佩斯条约要求的条件下，以下生物材料的培养物已保藏于以下国际保藏单位：美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,U.S.A.。保藏人对保藏材料向公众的可用性施用的所有限制将在授予专利权时被不可撤销地去除。
微生物 保藏号 保藏日期
经修饰的活犬副流感病毒 PTA-126273 2019年12月5日
减毒的活支气管炎博德特氏菌B-C2 PTA-126272 2019年12月5日
以下实施例用于提供对本发明的进一步理解，但不意味着以任何方式限制本发明的有效范围。
实施例
实施例1
口服犬副流感病毒和支气管炎博德特氏菌疫苗与或不与生物粘附性聚合物或生物粘附性佐剂一起施用的功效。
材料和方法
疫苗：
实验疫苗包含无毒的活支气管炎博德特氏菌抗原B-C2(ATCC保藏号PTA-126272)和经修饰的活CPI病毒(毒株Cornell)抗原(ATCC保藏号PTA-126273)，将其与稳定剂溶液[水解明胶、N-ZAmine AS(获取自Millipore Sigma,Burlington,MA的酪蛋白的酶解物)、山梨醇-d、磷酸氢二钠]混合，然后冷冻干燥。处理组A、C和D中向犬施用的疫苗包含作为佐剂的10-15％CARBIGENTM。处理组C中向犬施用的疫苗还包含生物粘附性聚合物PVP-K60。
疫苗的CPI病毒的滴度在7.5-8.5log10HAID50/mL之间变化，而疫苗的支气管炎博德特氏菌的滴度在9.2×109-1.4×1010cfu/mL之间变化。所有疫苗在小瓶中冷冻干燥，并且在接种当天，用1mL无菌水再水化每个小瓶中的冻干疫苗，并汇集类似的制剂。CPI病毒的滴度以log10HAID50/mL表示，其是通过Spearman-Karber方法计算的通常用于估计样品中病毒浓度的单位。
动物：
将7只10周龄的比格犬(Marshall Bioresources)共同圈养在覆盖有木屑的混凝土地板上的BSL-2设施中。食物和水可随意获取。接种疫苗和血清收集：
在研究的第0天，通过口服途径用1mL剂量的由CPI病毒、支气管炎博德特氏菌(Bb)和15％CARBIGENTM组成的疫苗对处理组D中的犬接种疫苗。将喷洒装置连接到注射器上以将疫苗递送到咽喉后部。在研究的第14天，通过口服途径用它们各自汇集的疫苗对所有的犬接种疫苗[参见下表1]。在研究的第27天通过颈静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并储存在-10℃或更冷直到测试。
CPI病毒中和抗体的检测：
使用标准血清中和(SN)测定法检测CPI病毒中和抗体。将血清稀释液与CPI病毒疫苗株一起孵育并接种至犬肾细胞上。5-7天后，将单层固定并用荧光素缀合的CPI病毒抗血清染色，并将SN抗体滴度计算为引起50％病毒感染抑制的血清稀释度的倒数。
表1
研究设计
Figure BDA0003704094110000191
攻击：
在研究的第28天，用毒性CPI病毒攻击犬。
攻击后的观察结果和样品：
攻击后记录临床观察结果，持续11天，攻击后每天收集鼻拭子，持续11天。
结果
血清学：
接种疫苗前，所有犬的CPI病毒血清中和滴度均小于2，这表明犬在接种时是原始的。安慰剂-接种的对照犬在攻击前保持血清阴性(SN<2)。接种疫苗后每个处理组中几乎所有的犬血清转化(滴度>4)[参见下表2]。
表2
CPI病毒的血清抗体滴度
Figure BDA0003704094110000201
CPI病毒脱落：
CPI病毒脱落的持续时间是评价疫苗功效的主要变量。计算每只动物从第一次到最后一次病毒脱落的持续时间(以天为单位)，并确定每个处理组的平均脱落持续时间。安慰剂-接种对照组的平均病毒脱落持续时间为7天。相反，处理组A和C的平均脱落持续时间为0天，而处理组B和D的平均脱落持续时间为1天[参见下表3]。
表3
脱落的持续时间
Figure BDA0003704094110000202
Figure BDA0003704094110000211
这些结果表明CARBIGENTM和PVP-K60对疫苗犬中CPI病毒脱落的持续时间没有显著影响。
实施例2
含和不含佐剂的多价口服CPI病毒和支气管炎博德特氏菌疫苗的剂量反应
材料和方法
疫苗：
实验疫苗含有无毒的活支气管炎博德特氏菌抗原B-C2(ATCC登记号PTA-126272)和经修饰的活CPI病毒(毒株Cornell)抗原(ATCC登记号PTA-126273)，将其与稳定剂[水解明胶、N-Z Amine AS、山梨醇-d、磷酸氢二钠]混合，然后冷冻干燥。在处理组C和D中向犬施用的疫苗包含作为佐剂的15％CARBIGENTM。在接种疫苗当天，用1mL无菌水再水合每瓶冻干疫苗，并汇集类似的制剂。处理组A-D的疫苗中使用的CPI病毒的滴度分别为8.6、7.3、7.6和6.3log10HAID50/mL，如表5所示。
动物：
将15只17周龄的比格犬(Marshall Bioresources)共同圈养在覆盖有木屑的混凝土地板上的BSL-2设施中。食物和水可随意获取。接种疫苗和血清收集：
在研究第0天，通过口服途径用1mL剂量的它们各自汇集的疫苗对犬接种疫苗[参见下表4]。将喷洒装置连接到注射器上以将疫苗递送到咽喉后部。在研究的第27天通过颈静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并储存在-10℃或更冷直到测试。
CPI病毒中和抗体的检测：
使用标准SN测定法检测CPI病毒中和抗体。将血清稀释液与CPI病毒疫苗株一起孵育并接种到犬肾细胞上。5-7天后，将单层固定并用荧光素缀合的CPI病毒抗血清染色，并将SN抗体滴度计算为引起50％病毒感染抑制的血清稀释度的倒数。
攻击：
在研究第28天，用毒性CPI病毒攻击犬。
攻击后观察结果和样品：
连续14天记录临床观察结果，攻击后连续10天收集鼻拭子。
表4
研究设计
Figure BDA0003704094110000221
Figure BDA0003704094110000231
结果
血清学：
接种疫苗前，所有犬的CPI病毒血清中和滴度均小于2，这表明犬在接种时是原始的。安慰剂-接种的对照犬在攻击前保持血清阴性(SN<2)。接种疫苗后每个处理组中的几乎所有犬血清转化(滴度>4)[参见下表5]。
表5
CPI病毒的血清抗体滴度
Figure BDA0003704094110000232
CPI病毒脱落：
CPI病毒脱落的持续时间是评价疫苗功效的主要变量。计算每只动物从第一次到最后一次病毒脱落的持续时间(以天为单位)，并确定每个处理组的平均脱落持续时间。所有安慰剂-接种的对照犬(处理组E)脱落病毒，且平均脱落持续时间为6天。相反，处理组A-D的平均脱落持续时间分别为1、0、1和5[参见下表6]。
表6
脱落的持续时间
Figure BDA0003704094110000241
这些结果表明对于口服经修饰的活CPI病毒疫苗有效，则需要1mL剂量中≥6.3log10HAID50/mL经修饰的活CPI病毒，如病毒脱落持续时间的函数进行评估的。
实施例3
犬中的免疫原性研究以证实口服犬副流感和支气管炎博德特氏菌组合疫苗的CPI部分的功效
材料和方法
疫苗：
测试疫苗由经修饰的活CPI病毒株Cornell(ATCC登记号PTA-126273)和无毒的活支气管炎博德特氏菌(ATCC登录号PTA-126272)组成，将其与稳定剂[水解明胶、N-Z AmineAS、山梨醇-d、磷酸氢二钠]混合，然后冷冻干燥。安慰剂疫苗由测试疫苗中除CPI抗原外的所有组分组成。在接种当天，用1mL无菌水再水合每瓶冻干疫苗，并汇集类似的制剂。
动物：
将20只7周龄的比格犬(Marshall Bioresources)共同圈养在覆盖有木屑的混凝土地板上的BSL-2设施中，并将19只7周龄的比格犬(Marshall Bioresources)类似地圈养在另一房间中。食物和水可随意获取。
接种疫苗和血清收集：
在研究第0天，通过口服途径用1mL剂量的它们各自的汇集的疫苗对犬接种疫苗[参见下表7]。将喷洒装置连接到注射器上以将疫苗递送到口腔的后部(口咽)。在研究的第21天通过颈静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并储存在-10℃或更冷直到测试。
CPI病毒中和抗体的检测：
使用标准SN测定法检测CPI病毒中和抗体。将血清稀释液与CPI病毒疫苗株一起孵育并接种至犬肾细胞上。5-7天后，将单层固定并用荧光素缀合的CPI病毒抗血清染色，并将SN抗体滴度计算为引起50％病毒感染抑制的血清稀释度的倒数。
攻击：
在研究的第21天，用毒性CPI病毒攻击犬。
攻击后观察结果和样品：
连续14天记录临床观察结果，攻击后连续10天收集鼻拭子。
表7
研究设计
Figure BDA0003704094110000261
结果
血清学：
接种疫苗前，所有犬的CPI病毒血清中和滴度均小于2，这表明犬在接种时是原始的。用安慰剂接种不诱导CPI特异性的抗体，而用测试疫苗进行接种疫苗在20只接种疫苗者的15只(75％)中诱导4或更高的CPI血清中和滴度，其中在接种疫苗后3周滴度的范围为6至861(GMT＝31)[见下表8]。
表8
CPI血清抗体滴度
Figure BDA0003704094110000262
CPI病毒脱落：
CPI病毒脱落的持续时间是评价疫苗功效的主要变量。计算每只动物从第一次到最后一次病毒脱落的持续时间(以天为单位)，并确定每个处理组的平均脱落持续时间。除1只外，所有安慰剂-接种的对照犬(处理组B)脱落CPI病毒(即95％)；然而，仅有11只接种疫苗者脱落病毒(即55％)。安慰剂-接种的对照犬的CPI病毒脱落的中值持续时间为6天，相比之下接种疫苗的犬仅有1.5天的脱落的中值持续时间[参见下表9]。
表9
脱落的持续时间
Figure BDA0003704094110000271
*p值<0.0001
这些结果表明1mL剂量中7.1log10HAID50/mL的CPI病毒足以使口服经修饰的活CPI病毒疫苗有效，如作为病毒脱落持续时间的函数所评估的。
实施例4
证实口服犬副流感和支气管炎博德特氏菌组合疫苗的支气管炎博德特氏菌部分的功效的免疫原性研究
材料和方法
疫苗：
测试疫苗由经修饰的活CPI病毒株Cornell(ATCC登记号PTA-126273)和无毒的活支气管炎博德特氏菌抗原B-C2(ATCC登录号PTA-126272)组成，将其与稳定剂[水解明胶、N-Z Amine AS、山梨醇-d、磷酸氢二钠]混合，然后冷冻干燥。安慰剂疫苗由测试疫苗中除支气管炎博德特氏菌抗原以外的所有组分组成。在接种疫苗当天，用无菌水再水合每瓶冻干疫苗，并汇集类似的制剂。
动物：
将21只7周龄的比格犬共同圈养在覆盖有木屑的混凝土地板上的BSL-2设施中，并且将21只7周龄的比格犬类似地圈养在另一房间中。食物和水可随意获取。
接种疫苗：
在研究第0天，通过口服途径用1mL剂量的它们各自的汇集的疫苗对犬接种疫苗[参见下表10]。将喷洒装置连接到注射器上以将疫苗递送到口腔的后部(口咽)。
样品收集：
在研究的第34天，通过颈静脉穿刺收集全血。通过离心分离血清并储存在-10℃或更冷直到测试。在研究的第34天也收集鼻拭子以测试支气管炎博德特氏菌的存在。一旦收集，将拭子置于旋转包装袋中并立即测试。
支气管炎博德特氏菌凝集抗体的检测：
使用标准微量凝集试验检测支气管炎抗体。简言之，使用含有0.1％明胶的生理盐水作为稀释剂，在U形底微量滴定板中对测试血清(已知的阳性血清和已知阴性血清)的2倍连续稀释进行测试。向各孔中加入支气管炎博德特氏菌抗原(100μL)并在微量滴定板混合器上混合15-30秒。将板在36±2℃下孵育1-3小时，然后在2-7℃下孵育36-72小时。肉眼读取平板的凝集情况，将滴度表示为显示完全凝集的最高稀释度的倒数。
攻击：
在研究的第35天，用毒性支气管炎博德特氏菌攻击犬。
攻击后观察结果和样品：
在攻击后28天每天两次观察犬的临床症状至少30分钟，所述临床症状包括但不限于流鼻涕、呼吸困难、抑郁和咳嗽。在研究第42、45、49、52、58和63天收集鼻拭子以测定攻击生物体的脱落。
表10
研究设计
Figure BDA0003704094110000291
结果
血清学：
接种疫苗前，所有犬对支气管炎博德特氏菌具有低抗体滴度(≤4)，这表明在接种时犬是原始的。用测试疫苗进行接种疫苗诱导21只犬中的20只的支气管炎博德特氏菌凝集滴度，所述滴度在研究的第34天的范围为16至128；GMT＝<39。相反，所有安慰剂-接种的对照犬的抗体滴度保持较低，其范围<2至8；GMT＝<1[参见下表11]。
表11
支气管炎博德特氏菌血清抗体滴度
Figure BDA0003704094110000292
攻击后的临床症状：
攻击后，所有安慰剂-接种的对照犬都出现与支气管炎博德特氏菌感染相关的临床症状，特别是自发性咳嗽。受影响的犬被定义为在攻击后观察期内连续2天或更多天具有自发性咳嗽或伴有干呕的自发性咳嗽。所有20只安慰剂-接种的对照犬均受到影响，而21只接种疫苗的犬中只有9只(43％)受影响；p值<0.0001[参见下表12]。此外，在攻击后观察期内，没有连续两天咳嗽多于一次的疫苗接种者，而20只安慰剂-接种的对照中的18只(90％)连续两天咳嗽2-13次。
表12
受影响的犬的总结
Figure BDA0003704094110000301
*p值<0.0001
还分析了犬在攻击后28天的观察期内自发咳嗽的天数。处理组B中犬的自发性咳嗽的平均天数为16.6天，而处理组A犬仅为3.5天；p值<0.0001[参见下表13]。
表13
咳嗽的总结
Figure BDA0003704094110000302
*p值<0.0001
支气管炎博德特氏菌脱落：
攻击后每周收集鼻拭子两次，持续4周，以测定攻击生物体的脱落。在研究的第42天，安慰剂-接种对照组和疫苗组之间在细菌脱落方面没有差异。然而，到研究的第45天，安慰剂接种的对照组脱落38,141cfu/mL的支气管炎博德特氏菌，而接种疫苗组仅脱落1,523cfu/mL。安慰剂-接种对照组中的细菌脱落在攻击后16天(研究的第52天)达到峰值，为75,293cfu/mL。相反，接种疫苗组中的细菌脱落在攻击后6天(研究的第42天)达到峰值，仅4,173cfu/mL。接种疫苗的犬的细菌计数持续下降，直到研究结束。到研究的第63天，接种疫苗组中的细菌脱落仅为6cfu/mL，而安慰剂-接种对照组中的细菌脱落保持在35,400cfu/mL。
这些数据表明支气管炎博德特氏菌在接种组的鼻粘膜内定居的能力显著降低。安慰剂-接种的对照和接种者的总体平均细菌脱落分别为37,035cfu/mL和849cfu/mL[参见下表14]，在各采集日，接种疫苗的犬中脱落的支气管炎博德特氏菌的量在统计学上低于安慰剂-接种对照犬的量；p值≤0.0001。
表14
分离自攻击后的鼻拭子的支气管炎博德特氏菌生物体(CFU/ML)
Figure BDA0003704094110000311
*p值＝0.0001
**p值<0.0001
这些结果显示1mL剂量中3.9×108cfu/mL的支气管炎博德特氏菌无毒株B-C2(ATCC保藏号PTA-126272)足以使口服疫苗有效，如通过在攻击后观察期期间连续两天或更多天具有自发性咳嗽或伴有干呕的自发性咳嗽的犬的数目所评估的。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (37)

1.一种为犬科动物提供有效保护对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的方法，所述方法包括向所述犬科动物口服施用包含经修饰的活犬副流感(CPI)病毒的疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疫苗还包含无毒的活支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中施用的所述经修饰的活CPI病毒的滴度大于6.0log10HAID50/剂。
4.根据权利要求3的方法，其中施用的所述经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.3log10HAID50/剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中施用的所述经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.7log10HAID50/剂。
6.根据权利要求4所述的方法，其中施用的所述经修饰的活CPI病毒的滴度为6.8log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中施用的所述经修饰的活CPI病毒的滴度为7.0log10HAID50/剂至9.5log10HAID50/剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中施用的所述经修饰的活CPI病毒的滴度为7.3log10HAID50/剂至8.6log10HAID50/剂。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中施用的所述无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度等于或大于1×107cfu/剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中施用的所述无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为1×108cfu/剂至1×1012cfu/剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中施用的所述无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/剂至5×1011cfu/剂。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述经修饰的活CPI病毒具有ATCC保藏号PTA-126273。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的方法，其中所述无毒的活支气管炎博德特氏菌具有ATCC保藏号PTA-126272。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述疫苗是单剂量疫苗。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用加强疫苗。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述疫苗是非佐剂化的疫苗。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述疫苗还包含佐剂。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述疫苗还包含选自以下的活的减毒免疫原：活的减毒犬流感病毒、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒呼吸道犬冠状病毒、活的减毒犬肺病毒、活的减毒犬支原体、活的减毒马链球菌兽瘟亚种及其任何组合。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述疫苗还包含活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬瘟热病毒和活的减毒犬腺病毒2型。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述疫苗以0.2mL至5mL的剂量口服施用。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述剂量为0.5mL至2.0mL。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述剂量为0.75mL至1.5mL。
23.一种通过口服施用为犬科动物提供有效保护对抗上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎的疫苗，所述疫苗包含滴度等于或大于6.0log10HAID50/mL的经修饰的活CPI病毒。
24.根据权利要求23所述的疫苗，其还包含无毒的活支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)。
25.根据权利要求24所述的疫苗，其中所述疫苗中所述无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为1×107cfu/mL至1×1012cfu/mL。
26.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述疫苗中所述无毒的活支气管炎博德特氏菌的滴度为5×108cfu/mL至5×1011cfu/mL。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗中所述经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于6.8log10HAID50/mL。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗中所述经修饰的活CPI病毒的滴度等于或大于7.3log10HAID50/mL。
29.根据权利要求23-26中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗中所述经修饰的活CPI病毒的滴度为6.0log10HAID50/mL至9.5log10HAID50/mL。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的疫苗，其中所述经修饰的活CPI病毒具有ATCC保藏号PTA-126273。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的疫苗，其中所述无毒的活支气管炎博德特氏菌具有ATCC保藏号PTA-126272。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗用于单剂量疫苗。
33.根据权利要求23-31中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗专门用于加强疫苗。
34.根据权利要求23-33任一项所述的疫苗，其中所述疫苗是非佐剂化的疫苗。
35.根据权利要求23-33中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗还包含佐剂。
36.根据权利要求23-35中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗还包含选自以下的活的减毒免疫原：活的减毒犬流感病毒、活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬瘟热病毒、活的减毒犬腺病毒2型、活的减毒呼吸道犬冠状病毒、活的减毒犬肺病毒、活的减毒犬支原体、活的减毒马链球菌兽瘟亚种及其任何组合。
37.根据权利要求23-35中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗还包含活的减毒犬细小病毒、活的减毒犬瘟热病毒和活的减毒犬腺病毒2型。
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