TWI234463B - Vaccine composition for treating streptococcus pneumoniae and respiratory syncytial virus infection, and preparation method thereof - Google Patents

Vaccine composition for treating streptococcus pneumoniae and respiratory syncytial virus infection, and preparation method thereof Download PDF

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TWI234463B
TWI234463B TW089107452A TW89107452A TWI234463B TW I234463 B TWI234463 B TW I234463B TW 089107452 A TW089107452 A TW 089107452A TW 89107452 A TW89107452 A TW 89107452A TW I234463 B TWI234463 B TW I234463B
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Marguerite Deschamps
Craig Antony Joseph Laferriere
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Smithkline Beecham Biolog
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Description

1234463 ⑴ 坎、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 本發明係關於新穎疫苗配方、其製備法及其對疾病預防 與治療之用途。特定言之，本發明係關於投給兒童及老人 之組合疫苗。更特定言之，本發明係關於避免肺炎鏈球菌 及呼吸道細胞融合病毒（RSV)感染或致病之組合疫苗。 肺炎鏈球菌為革蘭氏陽性菌，可造成高發病率與死亡 率’對幼兒及老人傷害特重。其於呼吸道及中耳的擴張繁 衍’好發於幼童，是美國醫院求診的單一最常見原因。該 菌可成為具侵襲性，感染下肺部並造成肺炎。美國逾60 歲者而患有肺炎球菌肺炎之比率，估計為每1 〇萬人中有 3至8人。2 0 %的病例產生菌血症，其他症狀如腦膜炎， 即使以抗生素治療，也有近3 0 %的死亡率。圍繞肺炎鏈球 菌的莢膜多醣結構可決定其90種已知的血清型，而這也 是它的主要致病原因。 已知一種1 7價肺炎球菌疫苗（Moniarix)，是由侵襲性疾 病中最常見的肺炎球菌血清型之多醣類純化物為其基 礎。這些多醣類的純化法揭載於歐洲專利72513 B 1。較低 價疫苗之疫苗效力試驗，證明了對於呈現在該組合之血清 型，具有70至90%之效力。在美國對逾55歲者施用14 價疫苗之個案控制研究證明-*~70%的效力（Mills，O.F.，and Rhoads，G.G·，J· Clin· Epidemiol. (1996); Vol.49(6) 631-636)。即便臨 床效力數據不足，在適當的血液學反應之基礎上也接受納 入額外的多酷類（以製23價肺炎球菌疫苗）（K.R· Brown In ‘Combined Vaccines and Simultaneous Administration’，Ed· Williams 1234463 ,明懸懸, et al· New York Academy of Sciences 1995 pp 241-249) 0 使用2 3價肺炎球囷疫苗（Pnu-Immune 23 - Lederle USA)與流 行性感冒疫苗（Fluarix)之同時性免疫作用亦有人研究（TJ Fletcher, TW Tunnicliffe, K Hammond, K Roberts, JG Ayres; (1997) Br. Med· J. 314 : 1663)，而在同時性免疫作用及相隔一個月的免 疫作用之間，並無記錄顯示顯著的免疫學差異。 將肺炎球菌多醣類與蛋白載體耦合可增其對嬰兒之免 疫原性質。執行中的避免嬰兒中耳炎之臨床效力試驗將可 驗證此一概念。 對已施打過7至11價結合肺炎球菌疫苗之嬰兒，若再 施以2 3價單純多醣肺炎球菌疫苗，可增加其血清型保護 範圍與 IgG 濃度（Block，SL，JA· Hedrick，R.A· Smith，R.D· Tyler, M. Giordani，M.D. Blum，J· Sadoff，Ε· Keegan; Abstract G-88，37th ICAAC， Toronto (1997); Anderson，E.L·，Kennedy，D.J·，Geldmacher，K.M·， Donnelly, J.5 Mendelman, P; The Journal of Paediatrics, May 1996. Vo. 128, n05, Part 1，649-653)。 人類呼吸道細胞融合病毒（RSV)為病毒類副黏液病毒 科之成員，造成下呼吸道疾病，好發於幼童及嬰兒。近期 研究顯示RSV亦為成人之重要病原，老人尤其易受感染。 RSV被覆包膜，具有非分_段、負股核糖核酸（RNA)的基 因組，其1 5,222個核#酸編碼10種信息RNA，每一信息 RNA編碼單一多肽。十種蛋白中之三種為跨膜表面蛋 白·· G(黏附）、F(融合）及SH蛋白。二種蛋白為病毒基質 蛋白（M和M2)，三種蛋白為核蛋白殼之成分（N、P及L)， 1234463 (3) 發曝說明績頁 人 'y23:Al&:r‘Λ：^α/ί:":-二 二種蛋白為非結構蛋白（NS1和NS2)。存在二種不同抗原 性之RSV種系，稱為種系Α與Β。用以分組的種系特徵 決定於G蛋白上殘基的主要差異，而其F蛋白則是保守 的。 呼吸道細胞融合病毒（RSV)會季節性暴發，尖峰在溫和 氣候的冬季及較暖氣候的雨季（DeSilva LM & Hanlon MG. Respiratory Syncytial Virus · a report of a 5-year study at a children's hospital. J Med Virol 1986; 19 : 299-305)。不論發生地區為何， RSV常具規律而可預測的模式，且其甚少與其他呼吸道 病毒病原之暴發同時出現（Glezen WP & Denny FW. Epidemiology of acute lower respiratory disease in children. N. Engl. J. Med. 1973; 288 : 498-505)。 RSV為兒童嚴重下呼吸道疾病之主要原因。估計RSV 感染直接導致40至50%患細支氣管炎的兒童住院及25% 患肺炎的兒童住院。原發性RSV感染通常發生於不滿一 歲的兒童；9 5 %的兒童有在二歲前曾被感染的血清學證 據，而該群體在成人之前則1 0 〇 %皆為如此。 在嬰兒及幼兒，由上至下呼吸道的感染進程約占 4 0 % 病例，其臨床表現為細支氣管炎或肺炎。二至六個月的兒 童有受RSV感染而產生嚴多症狀（原發性呼吸衰竭）之最 高危險；而患有潛在心臟或肺-部疾病的任何年齡兒童、早 產嬰兒、免疫缺損的嬰兒，也同樣具有嚴重併發症的危險。 症候性再感染可發生於任何年齡，且RSV也同樣地更 被視為重要的成人病原，特別是對老人而言。
1234463 RSV感染幾乎確定不會在成人被診斷出，部分原因是 它被當作是兒童的感染。因此，並沒有進行成人病毒證據 的檢驗來解釋呼吸道疾病。此外，對該病毒具有某種程度 部分免疫力的人，是不易由其鼻部分泌物驗出RSV的， 而絕大多數的成人都是如此。青年至中年的成人若免RSV 感染，通常會發展成持續的感冒類似症狀。老年人或許會 發展成長久的呼吸道症狀而無法與流行性感冒實際區 別，其上呼吸道症狀可伴隨下呼吸道病症，包括肺炎。住 在機構的老人群體應予特別注意，因為他們是由許多易感 的個體聚集而成的。此種群體若經感染散佈，其中具多種 健康問題者將因容易受到感染，其疾病將更加嚴重而不易 控制。 更進一步，近期研究報告將RSV感染衝擊評價為成人 及社區在宅健康老人的住院原因，更指出RSV感染在這 些群體的重度下呼吸道疾病中扮演了重要角色（Dowell SF， Anderson LJ. & Gray Jr HE, et al. J. Infect Dis 1996; 174 ^ 456-462; Falsey AR, Cunningham CK, & Barker WH, et al. J. Infect Dis 1995;172 : 389-394)。Dowell鑑定出RSV為導致成人住院之重 度上呼吸道疾病的四種最常見病原之一（Dowell SF，Anderson LJ，& Gray Jr HE，et al· J. Infect Di^L996; 174 : 456-462)。Falsey 證明 了老人的嚴重RSV感染不限於護理之家或暴發的狀況。 當然，RSV感染對居住在社區的老人而言，也是嚴重疾 病的可預期原因。類似於A型流行性感冒的住院狀況， 那些RSV相關感染是與高度發病率有關連的，其證據為 -9- 1234463 發明雙;？頁. (5) 長久的住院日、高度密集照護住院率、及高度換氣支持率 (Falsey AR? Cunningham CK, & Barker WH5 et al. J. Infect Dis 1995;172 : 389-394)。 這些研究指出有效疫苗的醫療及經濟需要，該疫苗對於 嬰兒、成人及社區在宅健康老人與住在機構的老人兩者， 應能避免RSV感染的重度併發症。
對重組次單位疫苗或死體疫苗而言，使用佐劑是相當重 要的。明礬是目前唯一經核准使用在人體之佐劑。然而， 明礬在體液性反應上的補佐效果是有限的，且已知其所謗 導者主為 Th2 型免疫反應（ByarsNE，NakanoG，&WelchM，etal· Vaccine 1991;9 : 309-318)。 然而，已發現3 De-O-醯化單磷醯脂A(3D-MPL)與明礬 併用可增進體液性反應並刺激較佳的 Th 1型免疫。含 3D-MPL佐劑之鋁鹽記為Alum/3D-MPL。 本發明係為一疫苗組合物，其包含：
(a) —種或多種肺炎鏈球菌多醣類，不論其是否與蛋白 或胜肽結合；及 (b) —種與佐劑結合的RSV抗原、而佐劑為一 Thl型反 應之較佳刺激物。 疫苗朝組合疫苗發展，是由i其具有減低接受者的不適 感、易於排程、確保控制的完-整性等優點，但它也同時存 在降低疫苗效力的風險。因此，製造符合群體需要且不彼 此干擾的組合疫苗是有助益的。若疫苗的組合能產生综 效，改善一種或兩種疫苗效力，或改善一種或兩種疫苗的 -10- 1234463 ⑹ 相關保護能力，這就更有助益了。本發明之疫苗組合物可 實現此目標，將其施予特別容易罹患肺炎鏈球菌和/或 RSV感染的兒童或老人，能產生很大的好處。
本發明之疫苗組合物可視情況添加一種或多種某數量 的其他抗原’如流行性感冒病毒抗原。目前可講得的流行 性感冒疫苗包括完整不活化病毒疫苗、裂粒疫苗、及次單 位疫苗。所有的流行性感冒疫苗通常為三價疫苗。它們包 含了由兩種A型流行性感冒病毒種系和一種B型流行性 感冒病毒種系所衍製之抗原。其標準0.5毫升劑量大多含 有每一種系之紅血球凝集素成分1 5微克。 決定何種種系併入流行性感冒疫苗的步驟是複雜的過 程，需要世界衛生組織、國家衛生主管機關及疫苗製造商 的通力合作。 肺炎球菌多醣類可藉其與蛋白載體行化學耦合而成較 強免疫原，避免嬰兒中耳炎之臨床效力試驗正在執行中。
通常使用兩種結合法來生產免疫原多醣結構物：（1)碳 水化合物與蛋白之直接結合；及（2)碳水化合物與蛋白藉 雙官能性連結劑或間隔劑之間接結合。通常，直接及間接 結合法兩者皆要在衍生作用前，化學激活其碳水化合物份 額。實例見於美國專利 5,651，971 及 Dick與 Beurret之
Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens」結合疫苗， J.ML Cruse & R.E. Lewis (eds)，Vol. 10, 48-1 14 (1989)。 如本發明之組合物之肺炎鏈球菌多醣，其較佳者為結合 形態但不必要為此形態。非結合的肺炎鏈球菌多醣並未被 -11 - 1234463 ⑺ 排除。 肺炎鏈球菌多醣類，若其為結合形態，則與其結合者可 為蛋白或胜肽。多醣抗原與某數量之Τ幫助者蛋白結合， 對 Τ-幫助者提供表位。代表性蛋白包括白喉類毒素、破 傷風類毒素、及流感嗜血桿菌Β之蛋白D或其脂化衍生 物脂蛋白D。其他適當的蛋白載體包括白喉Crm 197及流 行性感冒之主要非結構性蛋白 NS 1 (特別是胺基酸 1至
8 1)。 蛋白 D是如本發明之疫苗之較佳組份，並與該疫苗之 肺炎鏈球菌多_類相結合。蛋白 D的片斷亦為可溶性。 蛋白D已述於歐洲專利0 5 94 6 1 0。供使用的可溶性片斷 包括了含有 T-幫助者表位之片斷。特定言之，較佳的蛋 白D片斷包含了 N-端1/3之該蛋白。
令人驚訝地，吾人發現將蛋白 D-結合肺炎鏈球菌多醣 與RSV抗原組合在如本發明之組合物中，並不會影響對 該結合物蛋白D組份之免疫反應。蛋白D為一保護性抗 原，用以抵抗非可分型的流感嗜血桿菌B(NTHi)感染。 因此，本發明更可供為疫苗，其包含一種RSV抗原及 至少一種肺炎鏈球菌多醣，而該多醣與蛋白 D或其斷片 結合，選擇性地添加佐劑如_工111佐劑。 本發明之疫苗中肺炎鏈球菌組份典型地包含多醣抗原 (結合者較佳），其中多醣類為衍生自至少四種血清型之肺 炎球菌。這四種較佳的血清型包括6B、14、19F及23F。 更佳者為該組合物包括至少 7種血清型，例如由血清沒 -12- 1234463
4、6B、9V、14、18C、19F及23F所衍生者。仍為更佳 者尚有包括至少1 1種血清型之該組合物，例如該組合物 之一個具體實施例包括由血清型1、3、4、5、6B、7F、 9V、14、18C、19F及23F所衍生之莢膜多醣類（結合者較 佳）。本發明之較佳的具體實施例中包括至少1 3種或至少 1 5種或至少1 7種多醣抗原（結合者較佳），雖然本發明也 考慮過更多的多醣抗原，例如2 3價者（如血清型1、2、3、 4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、 17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 及 33F)〇 老人用接種疫苗（立即預防肺炎）最好將血清型 8和 12F(最佳者15和22亦同）涵括至上述1 1價抗原性組合物 以製成15價疫苗，而嬰兒或幼童用者（重點在於中耳炎） 最好涵括血清型6A和19A以製成13價疫苗。 涵括在如本發明之疫苗中適當的RSV抗原，包括不活 化RSV病毒，如化學性不活化RSV病毒可使用福馬林使 其不活化。不活化病毒可由如減毒RSV製得，該RSV可 由如多代培養或基因操縱方式來減毒，而不活化病毒也可 由野生型RSV製得。重組RSV也可用於疫苗，該RSV是 經改造而包含不同RSV種系之包膜抗原，例如RSV種系 A之骨幹加上RSV B包膜蛋_白，可視需要進行減毒處理。 適當的RSV抗原包括，特別是由RSV病毒所衍生之抗 原’較佳者為人類RSV包膜糖蛋白，如RSV F或G蛋白 或其免疫原性斷片，其例揭載於美國專利5，1 4 9，6 5 0，或 含有至少一種RSV F和G蛋白兩者之免疫原性斷片之歲 -13- 1234463 'v ^ S Λ " Λ ^ , " - 發明說;明績頁 二,y二乂〜 (9) 合性多胜，較有助益的RSV FG嵌合性蛋白之例揭載於美 國專利5, 1 94,5 95，其較佳者由CHO細胞所表達。 較佳的RSV抗原為RSV包膜糖蛋白或其衍生物。較佳 的抗原由RSV種系A所衍生。替代的抗原可由種系B所 衍生，或可由每一種系A和B之組合物取得抗原。較佳 的抗原是由F糖蛋白、G糖蛋白或FG融合蛋白或其免疫 原性衍生物所選出的。
典型的免疫原性衍生物包括，其蛋白缺乏FZ\tm、G △ tm及FAtm GAtm跨膜區域。較佳的信號序列是由 G蛋白刪出的。若F或G蛋白上至少約5 0 %或至少約8 0 % 的胞外區域（連續序列）能呈現出，則為較佳者。其特例包 括F蛋白之1至526或1至489胺基酸、G蛋白之69至 298或替代的97至279胺基酸、及融合蛋 白。尚有一替代性融合包含了 F蛋白的1至489胺基酸 並接續G蛋白的97至279胺基酸。
如本發明之RSV/肺炎鏈球菌疫苗組合物含有佐劑，該 佐劑為 Th 1型反應之較佳謗導劑，可協助免疫系統之細 胞媒介分支。 對抗原之免疫反應是經由抗原與免疫系統的細胞之交 互作用而生成的。免疫反應的-Ιέ果可概括地區分為兩種極 端的類別，是為體液性或細胞媒介免疫反應（傳統上以抗 體及細胞性作用物之保護機理為其各別特徵）。這些反應 類別所用術語為Thl-型反應（細胞媒介反應）及Th2-免疫 反應（體液性反應）。 -14- 1234463 (10)
極端的 Th 1 -型免疫反應之特徵有特異性抗原的生成、 單套型限制性細胞毒性T淋巴球及自然殺手細胞反應。 小鼠Thl-型反應之特徵常為IgG2a亞型抗體的生成，而 於人體其相對應者為IgGl型抗體。Th2-型免疫反應之特 徵為多種類型之免疫球蛋白同類型原之生成，包括小鼠的 IgGl、IgA 及 IgMo
普遍認為這兩型免疫反應背後的驅動力為細胞素，這是 數種經驗定的蛋白信使，用來協助免疫系統細胞，並促進 最終的免疫反應，不論其為Thl或Th2反應。因此高水 平的 Th 1 -型細胞素傾向利於對特定抗原謗導產生細胞媒 介免疫反應，而高水平的 Th2-型細胞素傾向利於對該抗 原誘導產生體液性免疫反應。
必須謹記的是，Thl和 Th2-型免疫反應的區別並不是 絕對的。實際上個體所支持的免疫反應可描述為優勢Th 1 或優勢 Th2。然而，將細胞素視為不同家族是便利的想 法，其法述於Mosmann與Coffman所著之鼠科CD4 + ve T細 胞株（Mosmann，T.R. and Coffman，R.L. (1989) TH1 and TH2 cells : different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology，7, pl45-173) 〇 傳統上， Thl-型反應與T-淋巴球所產^生之INF- 7及IL-2細胞素相 關聯。其他常與T h 1 -型免疫反應之誘導相關聯的細胞素 並非產自T細胞，如IL-12。相對而言，Th2-型反應則與 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及腫瘤壞死因子-万（TNF-/S )之 分泌相關聯。 -15- (ii) 1234463
WMMKM 已知某些疫苗佐劑特別適於刺激Thl及Th2-型細胞素 反應。傳統上’在接種疫苗或感染後免疫反應之Thl ·· Th2 平衡的取好指標，包括直接測量T淋巴球在體外受抗原 重覆刺激後所產生之Th丨或Th2細胞素，和/或測量抗原 特異性抗體反應之IgGl ·· IgG2a比率。
從而’當分離的T細胞群體在體外受抗原重覆刺激時， Th 1型佐劑能刺激該τ細胞產生高水平之Th 1 -型細胞 素’且該佐劑能謗導與Th 1 -型同類型原相關聯的抗原特 異性免疫球蛋白反應。能促進優勢Th 1反應之適當補佐 系統，包括單磷醯脂A或其衍生物，特別是3 -去-0 -醯化 單磷醯脂A，及單磷醯脂a之組合，較佳者為3-去-0-醯 化單磷醯脂 A(3D-MPL)與鋁鹽。更適用的補佐系統描述 於下。 此種佐劑已述於國際專利申請號W0 94/〇〇丨53及W0 9 5/17209之實例中。
3D-MPL已述於英國專利2220211 (Ribi)。化學上’該物 為具有4，5或6醯化鏈的3 -去-Ο -醯化單磷臨脂A之混 合物，其製造商為RibilmmunochemMontana。較佳的3-去 醯化單磷醯脂A之型式已揭載於歐洲專利EP 〇 689 454B 。 一一 3 D-MPL之較佳粒子大小要小到足以通過〇·22微米之 無菌過濾薄膜（如歐洲專利EP 0 6 8 9 4 5 4所述） 3D-MPL之正常每劑用量在10微克至1〇0微克範圍 内，較佳者為25至50微克，其中抗原之典塑每劑用量在 -16 - 1234463 (12) 聲，說貧 2至50微克範圍内。 另較佳的佐劑包含QS2 1，是由Quillaja Saponaria Molina 樹皮衍生之急素之非毒性部分經Hpic純化而得。可視需 要將其與3-去-〇-酿化單磷醯脂a摻合，亦可視需要再與 載體摻合。 生產 QS21之方法已揭載（以 QS21)於美國專利號 5,057,540 。 含有QS21之非反應原性佐劑配方已揭載於W0 96/33739。將此種含有qS2i與膽固醇的配方與抗原一起 配製’可顯不其為有效刺激Th丨之佐劑。從而構成本發 明之一部之疫苗組合物可包括q s 2 1與膽固醇之組合。 尚有Th 1反應之較佳刺激劑可為佐劑，包括免疫調節 性寡核酸類’例如揭載於W〇 96/025 55之未甲基化CpG。 不同Th 1刺激佐劑之結合，如上述及者，亦被考慮以 其τ ^ 1型反應之較佳刺激效果用作佐劑。舉例而言， QS21(較佳者亦可含膽固醇）可與3D-MPL —起配製。 QS21:3D-MPL之比率典型為1: 10至1〇: 1之等級間； 較佳者為1 : 5至5 : 1，且實際常為1 : 1。理想综效之 3D-MPL : QS21的較佳範圍為2.5 : 1至i : i。 依本發明之疫苗組合物含^審載體者較佳。載體可為油含 於水之乳液，或鋁鹽。 - 較佳的油含於水之乳液包含了可代謝油，如鯊晞、α生 育酚及tween 8 0。尚有油含於水之乳液，其含span 8 5和/ 或卵磷脂和/或tricaprylin。 -17- (13) 1234463
^々作法疋’將氫氧化铭（明礬）或磷酸鋁加入本發明 之組合物中，以強化免疫原性。 诗佳的作法是’將如本發明之疫苗組合物之抗原與 3D-MPL及明礬給組合起來。 人類所用之QS21與3D-MPL ,其疫苗中之典型每劑用 曰在1微克土 200微克範圍内，如10至100微克，較佳 者為1 0至50微克。典型的油含水之乳液包含自2至1 〇% 的農缔、自2至10%的α生育酚及自〇·3至3%的tween 80。 農婦· α生θ紛之較佳比率為等於或小於1，如此可得較 I足的乳液S P an 8 5亦可以1 %的水平存在。在某些例 子中’本發明之疫苗若再加安定劑將會更有助益。 非毒性油含於水之乳液，較佳者為其水性載體，含有非 母陡油如農^或鯊烯、乳化劑如tween 80。其水性載體舉 例可為磷酸鹽緩衝液。 一特別有效的佐劑配方其油含於水之乳液中有QS2 1、
3D-MPL及生育紛，該配方已述於WO 95/17210。 n % < &苗將包含具有免疫保護性數量之抗原，並可 由常規技術所製備。 疫备製備法已概路述於Pharmaceutical Biotechnology，卷61 疫田口又冲一次單元與佐劑手，Powell和 Newman編輯， Plenum Press 出版，1995 ; New Trends and Developments in Vaccines， Voller等人編輯，university Park Press出版，巴爾的摩，馬里 蘭’美國，1 9 7 8。脂體包覆法，例如Fullerton所發明者， 已載於美國專利4,235,877。蛋白結合與巨分子之結合法， -18- 1234463 (14) 例如Likhite所發明者，已載於美國專利4,372, 945，而Armor 等人所發明者，載於美國專利4,474, 757。
每劑疫苗之蛋白量，其在典型疫苗中之選定，是該量可 謗導.出免疫保護性反應，而無顯著的、不良的副作用。此 量將隨所用之特定免疫原而改變。一般而言，咸認為每劑 可含1至1000毫克蛋白，較佳者為2至100毫克，最佳 者為4至4 0毫克。某特別疫苗所用之理想量，可由標準 研究來確定，該研究對受試者之抗體滴定數及其他反應進 行觀測。在初次疫苗接種之後，受試者在約4週内可接受 追加接種。特別對嬰兒而言，三劑是較佳的。 除了對肺炎鏈球菌或RSV感染易感者之疫苗接種外， 本發明之醫藥組合物尚可用於免疫治療性地醫療遭受該 感染之患者。
本發明進一步提供了所述疫苗配方之製作方法，其中該 法包含了將肺炎鏈球菌抗體及RSV抗體與Th-Ι謗導佐 劑、載體之混合動作，而佐劑例如3D-MPL，較佳的載體 則如明礬。 視需要可用任何方便的順序加入其他抗原，以製所述多 價疫苗組合物。 本發明更提供了疫苗組合j之生產方法，其包含了將和 蛋白D結合之肺炎鏈球菌與RSV抗原及醫藥上可接受之 賦形劑的混合動作。 在以下實例中，將RSV疫苗候選者FG與23-價肺炎球 菌疫苗商品（Wyeth-Lederle所製 Pneumune)進行組合，將在 -19- 蔘明爾賴 1234463 (15) 小鼠試驗中執行其效果的評價。本試驗檢定了組合的免疫 作用，而該疫苗經物理性混合並注射同一部位。本研究之 結果可證明共同综效，兩種疫苗之某些免疫學標記顯示出 改善的反應。
這些實例更可證明小鼠試驗中，與RSV疫苗候選者及 1 1價結合肺炎球菌疫苗組合之疫苗，本研究可證明對多 數免疫學標記而言，在抗原之間沒有干擾或只有輕微干 擾，但事實上對部分免疫學標記而言，卻有改善的反應而 有综效性效果。明顯地，蛋白 D組份不會減低其結合的 肺炎球菌多醣類之免疫反應。 圖式簡單說明 圖1表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，抗 -FG Ig抗體對具不同佐劑之FG反應之分析。
圖2表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，抗 -RSVA中和抗體對具不同佐劑之FG反應之分析。 圖3A表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 對於個體抗-FG之Ig、IgGl及IgG2a之同類型原對 具不同佐劑之F G反應之分析。 圖3 B表示於以各種調配物亍肌肉免疫作用之老鼠中， 對於個體抗-FG Ig、IgGl及IgG2a之同類型原對具 不同佐劑之FG反應分析中，抗-FG之IgGl/IgG2a 比率。 圖4表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，其 -20- 1234463 _ (16) 發明謂31績頁 (A )脾臟細胞；及（B )淋巴結細胞對具不同佐劑 之FG所謗導的FG-特異性淋巴增生之分析。 圖5表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，具 不同佐劑之FG或FG+ PS所謗導出的抗-RSVA中和 抗體反應之分析 圖6表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， (A)個體抗-FG同類型原；及（B ) IgGl對IgG2a 同類型原比率對具不同佐劑之F G或F G + P S反應之 分析。 圖7表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，具 不同佐劑之F G或F G + P S所謗導的抗體反應之分析。 圖8表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，體 外重複刺激1 〇微克/毫升劑量之具不同佐劑之F G或 FG+PS，其脾臟細胞之（A) IFN-r及（B) IL-5細 胞素分泌反應；及（C ) IFN- r對IL-5之比率分析。 圖9表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中，具 不同佐劑之FG或FG+ PS所謗導的抗- FG Ig抗體反 應之分析。 圖1 0表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 所謗導的抗-RSVA中抗體對具不同佐劑之FG或 FG+PS反應之分析。- 圖1 1表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， (A)個體抗-FG同類型原；及（B) IgGl對IgG2a 同類型原比率對具不同佐劑之F G或F G + P S反應 -21 - 1234463 (17) 圖12 圖13 圖14 圖15 圖16 之分析。 表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 具不同佐劑之FG或FG+ PS所謗導的抗體反應之 分析。 表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 體外重複刺激1 〇微克/毫升劑量之具不同佐劑之 FG或FG+PS，其脾臟細胞之（A) IFN-r及（B) IL-5細胞素分泌反應；及（C ) IFN- r對IL-5之比 率之分析。 表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 具不同佐劑之FG或FG+ PS所謗導的抗-FG Ig抗 體反應之分析。 表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 具不同佐劑之FG或FG+ PS所謗導的抗-RSVA中 和抗體反應之分析。 表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， (A)個體抗-FG同類型原；及（B) IgGl對IgG2a
圖17 同類型原比率對具不同佐劑之F G或F G + P S反應 之分析。 表示於以各種調配物導d亍肌肉免疫作用之老鼠中， 具不同佐劑之FG或FG+ PS所謗導的抗體反應之 圖18 分析。 表示於以各種調配物進行肌肉免疫作用之老鼠中， 體外重複刺激1 〇微克/毫升劑量之具不同佐劑之 -22- 1234463 (18)
FG或FG+PS，其脾臟細胞之（A) IFN-r及（B) IL-5細胞素分泌反應；及（C ) IFN- r對IL-5之比 率之分析。 圖19表示血清IgG對PS-共軛體之蛋白質-D載體成分之 反應之分析。 圖20表示血清IgG及同類型原對PS-共軛體之蛋白質-D 載體成分之反應之分析。 實例 實例1-組合的RSV + 23-價肺炎球菌疫苗之評價 1 .調配方法： 使加水稀釋的FG抗原（2微克：1/10 HD)吸附於50微 克Al(OH)3上15分鐘。使用時，將5微克3D-MPL加入 該配製液而成 1 〇 〇毫微米粒子之懸浮液，並使該液培釀 30分鐘。再以10倍濃縮的pH 7.4之PBS來缓衝該配製 液。使用時，在緩衝溶液加入1 5分鐘後，再加入2 3價肺 炎球菌疫苗（11.5微克：1/50 HD)。相同的配製順序也用 在無 FG之群組，故在加入 23價肺炎球菌疫苗之前， 3D-MPL會先吸附於Al(OH)3上。在濃縮緩衝劑或23價 肺炎球菌疫苗加入15分鐘後，再將苯氧基乙醇（5毫克/ 毫升）加入該配製液作為保存劚。 在室溫下攪動該液以進行培釀。在首次注射之前，配製 液同時用來製備2注射劑，而最終配方之成熟需7曰。 配方成分組成： 組分 批次號碼 濃度 (微克/毫升） 緩衝液 -23 - 1234463
FG 54/023 265 10 PO4,150NaCl pH6.8 A1(0H)3 96A0089 1 03 80 h2o 23-價 Pneumune 1150 食鹽水 3D-MPL 109 964 h2o 2 ·免疫作用準據： 1 1組小鼠每組10隻在第〇日與第2 8曰用不同的配方 以不同途徑（5 0微升）接種小鼠（見表1)。第7及8組用活 體RSV以鼻内途徑（60微升）接種。在第28日（第1劑後 28曰）及第42日（第II劑後14曰）抽取血清。在第42曰， 由第4、5、6、7、8、9組各取5隻小鼠，及5隻naive B alb/c 小鼠（第1組、未接種的），再將這些小鼠的脾臟及淋巴結 細胞取出。 3 .體液性反應。 3 · 1 ·抗F G抗體： 所有體液性反應結果由每組的1 〇隻小鼠進行（對於抗
FG滴定數的個體反應及其攙和血清之同類型原概況），而 細胞性反應結果則由每組5隻的小鼠呈現。 在第一次接種後第2 8日及第二次接種後第1 4日取得的 個體血清，將用以檢測其F G特異性I g抗體是否存在、 及其同類型原（IgG2a、IgGl)分布。 分析準據如下··以每井5ΊΧ微克純化的54/023(1微 克/毫升）在4°C添覆至隔夜，在37°C飽和1小時，在37 C以血清培釀1小時30分’在37 (:以抗小鼠ig生物素 1 /1 500(或1§〇1、4〇2&生物素 1/1000)培釀1小時3()分， 在 3 7°C 以 strepta-peroxydase 1/2500 培釀 3〇 分鐘，在室溫以 -24· 1234463
(20) OPDA Sigma培釀15分鐘，再以2NH2S04停止。 以490毫微米波長監測〇d，並以Softmaxpro (4參數方 程式）參照標準曲線決定出滴定數後用EU/毫升來表示。
在第二次接種後第1 4日取得的個體血清，將以如下準 據檢測其是否存有中和抗體：在雙份的96井盤中，將5〇 微升血清一倍連績#釋液（第一稀釋液為1 / 2 5 )，以$ 〇微 升某混合液於3 7 °C培釀1小時，而該混合液含有3 〇 〇 p fu 之RSV-A/Long (Lot 14)和天竺氣補體（1/25稀釋液）。將每 毫升含1 05個細胞之HEp-2細胞懸浮液，於每一井中加入 100微升，在5% C02存在下，於37 °C將該盤培釀4日。 先吸出上層液，加入100微升WST-1製備液（稀釋液為 1/12.5)之後，在5% C〇2存在下，於37°C將該盤再择釀 24小時。以595毫微米波長監測〇D，並使用線性迴歸 (y = a · 1 〇 g X + b)來決定其滴定數，其算法為：滿定數=使未 感染細胞測得之最大OD減少5 0 %的血清稀釋倍數。 類攙和物） Sandoz 生
檢測的對照組包括了隨機選取之人類血清（人 及 Sandoglobuline (lot 069，通稱為人類 ig(}，由 產）之攙和物。 3 · 2 ·抗肺炎球菌多gf I g G : 對肺炎球菌多醣型6B、1一4一、19F和23F之藏類Ig(}。 用由CDC準據所改之ELISA來測量。此準據包括 匕 了對j&i 清添加可溶性細胞壁多糖（C P S)以抑制c p s於轉、、 几月豆又測量。 CPS為鱗醯膽鹼，其含有常見於肺炎球菌的台口 。；、 ° 敗。該物 出現在莢膜之下，故對抗該物之抗體僅有微弱的保護力 -25- 1234463 (21)
由於CPS連結於荚膜多醣，故用於添覆ELISA盤之純化 莢膜多醣通常會有0·5至1%的CPS污染。因此，CPS抗 體的測量，會與莢膜多醣的ELISA結果之解釋相混淆。 將濃度各為20、5、10及20微克/毫升之6B、14、19F 及 23F型多醣之碳酸緩衝液添覆於 ELISA盤以利其進 行。將等價的5 0 0微克/毫升C P S預先混入未稀釋的血清 中，再將培釀30分鐘之混合血清加入ELISA盤。使用
Jackson ImmunoLab山羊抗鼠類IgG(H + L)過氧化酶之ι:2〇〇〇 稀釋液來檢測鼠類I g G。其滴定曲線係參照每一血清型已 知濃度之多醣特異性鼠類單株抗體，以符號邏輯對數比較 法，使用SoftMax Pro軟體算得。其、14、19F及23f 型所用單株細胞各為HASP4、PS 14/4 m , ’外、PS 19/5 及 23/22。 由於可得血清量有限，所檢測者為撸 、、 A幾和血清，因此無法得 統計分析值。 4 ·細胞性反應 由第4至9組及由作為陰性控制 、、’赴的 n a ϊ v e小鼠（筮 組），在第二次接種後第14日分離 ^ 胞，以進彳FG-特異性細胞性反應牌臟細胞及淋巴結細 丨+IL-5)分泌兩者之 FG-特異性淋巴增生與細胞素（ΙρΝ刀析4樣要進仃 分析。 、倍稀釋）的媒劑2 0 〇 上培釀9 6小時，再 ’ F G特異性增生反 井之每井有2.5xl〇6 使用含有10至〇.〇3微克/毫-升f Q 3 微升，在每井4x1 05個細胞的96井♦ 評價其增生作用。因3H-胸苷的加人 應可依吾人之標準準據進行測量。24 -26- (22) (22)1234463
個細胞，具1毫升的媒劑，其包含10微克至〇 〇ι微克之 FG(10倍稀釋液），在96小時培釀後評價其細胞素謗導作 用。收集其上層液’以吾人之標準準據，測定ELisa所 謗導IFN- 7和IL-5之量。 1 .群組。 1 〇個群組接受了兩劑不同配方的疫苗接種，配方本有 23價疫苗或FG或組合劑，兩劑都用了氫氧化铭與 3D-MPL或氫氧化铭來配製。第i組構成cmi研究的控制 組。第2和9組用來評價由腹腔接種的及由肌肉注射接種 的2 3價肺炎球菌疫苗之免疫原性，而文獻載有評價2 3 價肺炎球菌疫苗之腹腔接種法《第3和1 〇組可與第2和 9組平行分析，差別為其23價肺炎球菌疫苗具明蓉 /3D-MPL。因未與FG明礬/3D-MPL組合，第2和3組也 構成了明礬/3D-MPL對23價肺炎球菌疫苗影響之控制 組。由23價肺炎球菌疫苗與FG明礬/3D-MPL之組合劑 之肌肉注射接種所謗導的免疫反應，可用第4組來評價。 因未與2 3價肺炎球菌疫苗組合，第5和6組構成了評價 明礬/3D-MPL對FG影響之控制組。RSV活體接種為自然 R S V IN感染（第7組）所誘導之免疫反應的控制組。最後， 第9組是明礬/3D-MPL單獨—举響之控制組。 -27- 1234463
表1 組別 抗原 佐劑_· 途徑 • 1 /πΤ. ‘ 無 j \w 2 23 價 Pneumune(11.5pg) 無： 肌肉注射 3 23 價 Pneumune (11.5 pg) 明礬/3D-MPL 肌肉注射 4 23 價 Pneumune (11.5pg)/FG (2pg) 明礬/3D-MPL 肌肉注射 5 Ρ〇(2μ8) 明礬/3D-MPL 肌肉注射 6 FG (2pg) k 明礬 肌肉注射 7 RSV Live (Lot 14: 101 2 3 4PFU) 4rrC IN 8 4rrc. 撕 明礬/3D-MPL 肌肉注射 9 價 Pneumune (11.5μ§) 無 腹腔注射 10 23 價 Pneumune (11.5 pg) 明礬/3D-MPL 腹腔注射
•28· 1 .體液性反應 2 2.1.抗-FG抗體 第一次接種後第2 8日及第二次接種後第1 4日之特異性 抗FG抗體之分析顯示，以FG明礬/ 3D-MPL/23-價（第4 組）或單獨以較？0八111111/30-^1?1^/23-價具稍高效價之？0 明礬/ 3 D - MP L (第5組）來接種，能謗導出相似的抗體反應 (圖1 )。以FG明礬（第6_ :组）接種者，在兩個時點都謗 3 導出較預期為低的抗體滴定數。統計分析顯示，第一次接 種後第28日及第二次接種後第14日，在第4至6組所謗 導的抗-F G I g滴定數之間，確有顯著差異。 4 結果 1234463 〇 , ,Λ/於…?，从分•叫， (24) 縈明說明庸頁 抗-R S V A中和抗體的分析（圖2 )，顯示出如同在抗-F G I g反應中所觀測到的類似數據。 基於以上結果，可計算出抗-FG/抗RSV中和抗體比率 (第二次接種後第28日），而顯示出FG明礬/ 3D-MPL/23-價、FG明礬/ 3D-MPL及FG明礬之比率，與由RSVIN組 所謗導出之比率，其比較關係（表2)。 FG SB AS4 / 23 價 FG SB AS4 FG明礬 活鞲RSV 疫苗候選者 -4 ON Ul ^ w S3 3836 2713 1721 703 1 抗-FG ELISA Ig 第一劑接種後2S曰 抗體滴定數（GMT) 392 187 1 ί 117 35 1 RSV-A . Neutra k〇 — 一一 O LA Ul Ο r 53 择1 • / ·*- » i 12170*7 1 78079 26163 J7119 沆-FG ELISA \g 第二劑接種後14曰 1 5809 4664 2771 726 1 RSV-Λ ,Neutra S ^ t； ΰ ELISA/Neuira 比率’ 丨：ΐ
-29- 1234463 (25)
對個體抗-FG之Ig、IgGl及IgG2a之同類型原滴定數 之深度統計分析顯示，將 2 3 -價疫苗加入 F G 明礬 /3D-MPL，可保其Ig及IgGl反應，並能顯著增加其IgG2a 反應（圖3A)。此外，該分析也顯示，其IgGl/IgG2a比率 和FG明礬/3D-MPL/23價及FG明礬/3D-MPL之IgGl滴 定數是相似的，但與F G明礬的數據有顯著差異。這三種 配方所謗導之IgG2a有顯著差異。
2.2 .抗-肺炎球菌多醣I g G 小鼠與其他齧齒動物可產生對抗多St免疫原的I g Μ，但 牠們通常不產生對抗多醣的IgG。這是因為牠們的免疫系 統缺乏對 T-依賴性抗原如多醣之信號，而該信號可謗導 同類型原的轉換。因此，小鼠中抗-多酷IgG的測量，對 於改善的 T-依賴性免疫反應之謗導作用是一種靈敏的檢 測。
所謗導出對抗 23種多醣中之四種 IgG的濃度列於表 3。正如我們在其他實驗注意到的，並沒有產生對抗 6 B 及2 3F型多醣的IgG。然而，仍可測得對抗14及19F型 之 IgG 〇 不含 2 3 -價疫苗的組別亦可測得多醣類 1 4及 1 9 F之 I g G，而確認了該測量的特昙♦。 比較接種途徑顯示出，用明·礬/3D-MPL來補佐23-價疫 苗時，對1 9F型而言肌肉注射途徑顯得比腹腔注射要好， 但是對14型而言則剛好相反。使用單純的2 3 -價，也看 不出有顯著差異。 -30- 1234463 (26) 知、ϊ·" ^^ \ 發明說明績頁 與單獨的2 3 -價相比較，不論使用肌肉注射或IP接種 途徑，23價+明礬/3D-MPL都能對14及19F型謗導出更 多的I g G。然而，與F G組合時，該I g G反應會下降。但 是，23-價+FG/明礬/ 3D-MPL對1 9F之IgG反應，仍較單 純2 3 -價所謗導者為高（比較第3及4組），且其對1 4型之 反應也有改善。 CO ΰ C0 — Ό 00 •u CA 〇\ « Λ Λ to Λ ο Λ ΙΟ Λ —· ο •hJ ΰ， S to Λ C>i •00 ο ΟΝ Λ Π 匕7 ΰ驾 W 2j- UJ Λ Ki u Ο % > Λ 匚 tsi > 芸％! ο 厶 Λ π Λ ο ο /\ ΙΟ t ^ P Λ Λ π Λ ο Λ Π 〇 厶 Λ ο ο Λ Κ) 0 g、冴 3 r Fff CO Λ S： S Λ Π ΰ s ^ R+ a Λ s: 一 Λ Π > a s 欠s 顏 S ? ®ps ί、^n>RSVs涤铝»涊甜麵適 IgG(s^y*^) -31 - 1234463 (27) ^ r //, ^ 软^ 〜气 4/ <ϊ>?%· < s. 發明說隳績軍 八夕崩f ·Ά\ 3 .細胞性反應 脾臟細胞及淋巴結細胞用FG明礬/3D-MPL +/- 23價或 FG明礬所謗導的FG«特異性淋巴增生，並未顯示兩者有 任何差異。
分析IL-5及IFN-r的生產可發現，含FG明礬/ 3D-MPL
的2 3價疫苗並不會降低I ρ N - 7的生產，但卻能少量增加 IL-5的生產（圖4)。使用兩種劑量的FG(10和1微克FG/ 毫升）進行體外重覆刺激，可測得IFN- τ /IL-5比率有 2 至8倍的差異，故可確認上述分析結果。然而，F G明礬 /3D-MPL/23價疫苗仍較FG明礬能謗導出更高的IFN- r /IL-5比率。 結論
對被謗導的抗-FG Ig特異性及抗RSVA中和抗體之滴 定數進行分析可發現，FG明礬/3 D-MPL與23價肺炎球菌 疫苗之組合劑，並不會妨礙僅以FG明礬/3D-MPL所測得 的反應之謗導作用。以抗-FG/抗-RSVA中和抗體比率來 測量反應的品質，與由IN途徑受RSV自然感染所測得比 率相較，仍能保持不變或近似。 由謗導的F G特異性細胞媒介反應的分析可知，將2 3 價疫苗加至FG明礬/3D-MPI:並不會影響脾臟細胞及淋巴 結細胞兩者之淋巴增生的謗導作用。再者，用FG明礬 /3D-MPL所測得的典型Thl型反應之謗導作用’以FG特 異性脾臟及淋巴結細胞在體外所生產的細胞素進行測 量，結果不但不會對該Thl型反應之誘導作用造成妨礙， -32- 1234463
(28) 若以FG特異性同類型原抗體分步進行分析，還能發現有 增強的效果。確實，IFN- r作為Thl反應的標記，其生 產在23價疫苗加至FG明礬/3D-MPL的條件下仍保持不 ’交’而作為T h 2反應標記的11 · 5，其生產只輕微增加。 有趣的是，將23價疫苗加至FG明礬/3D-MPL能顯著增 加作為Thl反應標記之IgG2a抗體的生產，但並不影響 IgGl(Th2反應標記）和igGl/IgG2a反應。
因此，將FG明礬/3D-MPL與23價疫苗組合，並不會 影響用FG明礬/3D-MPL所測得的反應，故FG明礬 /3D-MPL之配方與FG明礬相較更具優勢，也就是說，仍 保有在IgG2a抗體存在下所測得的高度初級及次級中和 抗體反應和Thl反應之謗導作用，和高水平的IFN- 7謗 導作用。 23價疫苗與FG明礬/3D-MPL組合後能使4種受測多醣
中之2種增產igG，但最戲劇性的是，對19F型而言，23 價單獨與明礬/3D-MPL使用可得最高的IgG濃度。 總結來說，23-價肺炎球菌疫苗與RSV FG明礬/3D-MPL 的組合是有利的，如此對兩種疫苗而言都有综效，這兩種 疫苗在特定免疫學測試能顯示其改善效果，而在任何測試 都沒有抑制作用。 _ — 實例2-組合的RSV+1 1-價結合肺炎疫苗之評價方法 組合疫苗是以 3D-MPL+明蓉、具脂體之膽固醇含 3D-MPL + QS21、或具寡核酸之CpG(含或不含明礬）。
添加FG至PS結合物配方對於蛋白D(PD)載體對lgG -33- 1234463 mmm (29) 免疫反應之影響亦被測試。 PD為一保謾性抗原，可對杬非可分型的流感嗜血桿菌 B(NTHi)感染。因此，將PD-結合的肺炎球菌“與⑽組 合起來，可造成有效的保護來對抗三種病原：肺炎鏈球 菌、RS V及非可分型的沉感嗜血桿菌b。對抗NTHi的保 護作用可能涉及Th 1型免疫。因此，也測試了作為Th 1 反應良好指標之抗-PD IgG2a抗體。
本實例所用之1 1 -價候選疫苗包括了莢膜多醣血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 及 23F,而其 基本製法揭載於歐洲專利 725 1 3。可用 CDAP化學（W0 95/08348)來活化和衍生每一多醣，並將其結合於蛋白載 體。除了血清型3(減少體積以增加黏度）之外，所有的多 醣皆以其天自然型進行結合° 蛋白載體是由非可分蜇的流感嗜血桿菌製得的重組蛋 白D(PD)，由大腸桿菌表達
1 .配製過程： 配方應於首次注射前12曰製備。 1.1. QS21、3D-MPL 基礎配方 於需要時，將抗原FG(2微克）或/和非吸附的ps結合物 (0·5微克/價），稀釋於10倍J矣縮P H 7 ·4的P B S及水的混 合液中。將QS21 (5微克）加至含MPL之脂體中混合，使 其QS2 1/膽固醇之重量比率為1/5(參照如DQ/3D-MPLin)。 身 三十分鐘後再將1微克/毫升之thiomersal加入作為保存劑。 1.2. CpG或3D-MPL基礎配方 -34 -
1234463 (30) 於需要時，先將Al(OH)3稀釋於水，再加入抗原FG(2 微克）或/和非吸附的P s結合物（0 · 5微克/價）。吸附3 0分 鐘後，加入MPL或CpG。三十分鐘後以1 〇倍濃縮pH 6.8 的P04-NaCl來緩衝該配製液。加入1微克/毫升之thiomersal 或5毫克/毫升之phenoxy作為保存劑。 所有的培釀動作都在室溫下伴隨攪動而完成。在首次注 射之前，配製液同時用來製備2注射劑’而最終配方之成 熟需7曰。 1 . 3 .配方成分組成 組分. AG OR IMST 濃度 (pG/ML) AL+++ 濃度 (μσ/ML) 緩衝液 FG 484 P04/NaCl 10/150mM pH 6.8 Clinical undecaval non ads PSi .144 t NaCl 150mM pH6.1 PS3 149 ，丨 NaCl 150mM pH6.1 PS4 125 NaCl 150inM pH6.1 PS5 135 NaCl 150mM pH6.1 PS6b- 206 NaCl 150mM pH6.1 PS7 168 NaCl 150mM pH6.1 PS9 175 NaCl 150mM pH6.1 PS14 180 一 - NaCl 150niM pH6.1 PS18 127 NaCl 150mM pH6.1 PS19 140 NaCi 150mM pH6.1 PS23 158 NaCl 150mM -pH6.1 QS21 2000 h2o MPL 1019 h2o -35- 1234463 (31) y
CpG 5000 h2o SUV DOPC 40000 Choi 10000 MPL2000 PBS pH7.4 Α1Ρ〇4 1000 NaCl 150mM pH6.1 Α1(ΟΗ)3 10380 H20
2 .免疫作用準據： 14組小鼠每組10隻在第〇曰與第2 8曰用不同的配方 以肌肉注射途徑（5 0微升）接種小鼠（見結果節）。血清於第 42日取得。在第42日，由接種過fG抗原的每組中各取 5隻小鼠’及5隻naive Balb/c小鼠，再將這些小鼠的脾臟 細胞取出。 3 .體液性反應。
3 · 1 .抗F G抗體： 所有體液性反應結果由每組的1 〇隻小鼠進行（對於抗 FG Ig、IgGl及IgG2a之個體反應以及中和作用滴定數），而 細胞性反應結果則由每組5隻的小鼠共同呈現。 . '*· 在第二次接種後第1 4 /1 5 — 日-取得個體血清，並檢測其是 否存有FG特異性Ig抗體及其同類型原（IgG2a、1§(}1)分 布。分析準據如下：以每井5〇微克純化的DFGP 107(1 微克/耄升）在4 °C添覆至隔夜，在3 7艺飽和i小時，在3 7 C以血清培釀i小時3 〇分，在3 7它以抗小鼠工g生物素 -36- 1234463
(32) 1 / 1500(或IgGl、IgG2a生物素1 / 1000)培釀1小時3 〇八 刀’在 3 7°C 以 strepta-peroxydase 1 / 1500 培釀 30 分鐘，在室溫以 〇pDA Sigma培釀20分鐘，再以2NH2S04停止。 以490毫微米波長監測OD，並以Softmaxpro (4參數、 程式）參照標準曲線決定出滴定數後用EU/毫升來表示 在第二次接種後第1 4曰取得的個體血清，將以如下淮 據檢測其是否存有中和抗體：在雙份的9 6井盤中，艘c 册5 〇
微升血清二倍連續稀釋液（第一稀釋液為1 / 2 5 )，以5 〇微 升某w合液於3 7 C培釀1小時，而該混合液含有p ^ 之RSV-A/Long (Lot 14)和天竺鼠補體（1/25稀釋液）。將每 毫升含105個細胞之HEp-2細胞懸浮液，於每_井中力 入100微升，在5% C02存在下，於37t將該盤培釀* 曰〇 先吸出上層液，加入100微升WS1M製備液（稀釋液為 1/15)之後，在5%0〇2存在下，於37。〇將該盤再培釀24 小時。以490毫微米波長監測〇D ,並使用線性迴歸 (y=a.i〇gx+b)來決定其滴定數，其算法為：滴定數=使未儀» 感染細胞測得之最大0D減少50%的血清稀釋倍數。 3·2·抗肺炎球菌多jgG : 6BJr7F、14、19F 和 23F 之鼠類 對肺炎球菌多醣型
IgG可用由CDC準據所改之EUSA來測量。此準據包括了 對血清添加可溶性細胞壁多醣（cps)以抑制cps抗體之測 量。CPS為蹲酷膽驗’其含有常見於肺炎球菌的台口酸。 該物出現在莢膜之下’故對抗該物之抗體僅有微弱的保護 ，37- 1234463
(33) 力。由於CPS連結於莢膜多醣，故用於添覆ELIS A盤之純 化莢膜多醣通常會有0.5至1 %的CPS污染。因此，CPs 抗體的測量，會與莢膜多醣的ELIS結果之解釋相混清。 將濃度各為20' 5、5、20及20微克/毫升之6B、7F、 14、19F及23F型多醣之PBS緩衝液添覆於ELISA盤以利 其進行。將等價的500微克/毫升CPS預先混入未稀釋的 血清中，再將培釀3 0分鐘之混合血清加入ELISA盤。使 用Jackson ImmunoLab山羊抗鼠類IgG(H + L)過氧化酶之1. 5000稀釋液來檢測鼠類I g G。其滴定曲線係參照每—血 清型已知濃度之多醣特異性鼠類單株抗體，以符號邏輯對 數比較法，使用SoftMaxPro軟體算得。其6B、7F、14、 19F及23F型所用單株細胞各為HASP4、PS 7/19、PS 14/4、 PS 19/5 及 PS 23/22。 對於血清型3也進行了相似的ELISA，而差異處為其先 用甲基化人類血清蛋白（1微克/毫升於PBS, 2小時，37 °C)添覆該免疫盤，以促進PS3之添覆（2·5微克/毫升於 PBS，隔夜，4t；)。用作標準參照者為pS3/6單株抗體。 3 · 3 · ELIS A之抗P D血清I g G劑量 將MaxiS0rp Nimc免疫盤在37t培釀2小時，其中B至h 列具有每井1〇〇微升的2微-£/毫升pD抗原之pBs稀釋 液，而A列則具有每井100微升的i微克/毫升純化山羊 抗小氣Ig (Jackson)之PBS稀釋液。然後，加入純小鼠 IgG(Jackson)之2倍連續稀釋液（以含〇 〇5% Tween2〇之 稀釋，每井100微升）作為標準曲線（起始濃度丄微克 -38- 1234463 (34)
/毫升，置於A列），並將血清試樣（起始於1/20稀釋液， 置於B至Η列）於4°C培釀至隔夜。而後，將peroxydase-結合的山羊抗-小藏I gG( Jackson)，以含0 · 0 5 % Tween20之 PBS稀釋為1 /5000後，在20 °C伴隨攪動（每井100微升） 培釀3 0分鐘。洗滌數次後，將盤置於暗處與每井1 〇 〇微 升顯示緩衝液（含0.4毫克/毫升OPDA(Sigma)及0.05% H202 之100毫莫耳濃度pH 4.5檸檬酸緩衝液）在室溫培釀15 分鐘。每井加入50微升1N的HC1使顯示作用停止。使 用 Emax immunoreader (Molecular Devices)以 490 及 620 毫微 米波長項取其光學金度。使用SoftMaxPro軟體以4參數 數學法可算得抗體滴定數。 3.4.ELISA之抗PD血清IgG 1、2a及2b劑量 將Maxisorp Nunc免疫盤在4°C培釀至隔夜，其中^至H 列具有每井50微升的2微克/毫升pd抗原之PBS稀釋 液，而A列則具有每井5 0微升的5微克/毫升純化山羊抗 小鼠Ig(Boerhinger)之PBS稀釋液。先將該盤以PBS Tween20 0 · 0 5 % B S A 1 %緩衝液進行飽和，再加入純小鼠丨g 〇卜igG2a 或IgG2b單株抗體（Sigma)之2倍連續稀釋液（以飽和緩衝液· 稀釋’母井50微升）作為標準曲線（起始濃度2〇〇毫微克/ 毫升，置於A列），並將血清-芎樣（飽和緩衝液之稀釋液其 - 起始濃度為1/20稀釋液’置於B至Η列）伴隨擺動於37 - t培釀至隔夜。以NaCl 0.9%Tween20 0.05%緩衝液洗滌數 次後，將生物素化抗-小鼠IgC?l或抗-小鼠IgG2a或抗-小 鼠IgG2b goat IgG(Amersham)以飽和緩衝液稀釋為1/1〇〇〇, -39- 1234463 (35)
伴隨攪動於2 0 °C培釀（5 0微升/井）3 0分鐘。洗滌數次後， 將peroxydase-結合的streptavidin (Amersham)以飽和緩衝液稀 釋為1/1000，用該液將盤伴隨攪動於20°C培釀（50微升/ 井）3 0分鐘。經洗條後’每井加入5 0微升顯示緩衝液（含 〇·4毫克/毫升OPDA(Sigma)及0.05% H2〇2之100毫莫耳濃 度pH 4.5檸檬酸緩衝液）在暗處於室溫培釀2〇分鐘以進 行顯示作用。每并加入5 0微升1 N的H C1使顯示作用停 止。使用 Emax immunoreader (Molecular Devices) « 49 0 及 62 0 晕微米波長讀取其光學密度。使用SoftMaxPro軟體以4參 數數學法可算得抗體滴定數。 4 ·細胞性反應 由所有經FG接種的組別及由作為陰性控制組的na.ive 小藏，在第二次接種後第1 4日分離其脾臟細胞，以進行 F G -特異性細胞性反應之分析。試樣要進行F G -特異性淋 巴增生與細胞素（IFN-g + IL-5)分泌兩者之分析。
使用含有1〇至〇·〇3微克/毫升FG(3 -倍稀釋）的媒劑200 微升，在每井4 X 1 05個細胞的9 6井盤上培釀9 6小時，再 4 h其增生作用。因3 Η -胸嘗的加入，F g特異性增生反 應可依吾人之標準準據進行測量。 24井之每井有2.5xl〇Ml3 >卜胞，具1亳升的媒劑，其包 含10微克至0.01微克之FG(10倍稀釋液），在96小時培 釀後評價其細胞素誘導作用。收集其上層液，以吾人之標 準準據，測定ELISA所謗導IFN- 7和IL-5之量。 結果 -40· 1234463 (36)
1 .群組。 1 4組相隔2 8日接受不同配方的二次肌肉注射接種’配 方包含1卜價結合的疫苗或FG或與明礬3D_MPL、CpG、 Cp g明礬或明礬配製之該兩者的組合劑。 我們將討論列於段落1至4的結果。在每一段落’對於 具優勢Th2-型佐劑之特異性RSV免疫反應之謗導作用， FG明礬之結果將納為控制組。Naive小鼠組也納為FG· 特異性C ΜI分析之内部控制組。 段落1 : 組別 抗原 佐劑卜 途徑 A PS-PD (0.5 μδ) 明攀3D-MPL 肌肉年射 B FG(2pg) 明礬3D-MPL 肌肉注射 C PS，PD(0.5>g) + FG<2pg) 明礬3D-MPL 肌肉注射 D Ρ〇(2μ8) \ 明礬 肌肉注射 E 無 4τττ. ιιΓΕ j \ \\ _注射 段落2 : 組別 抗原 佐劑 途徑 A PS-PD (0.5 μδ) 3D-MPL + QS21 肌肉注射 B FG(2pg)—- 3D-MPL + QS21 肌肉注射 C PS-PD (0.5μ8) + ΡΘ (2 μ§) 3D-MPL + QS21 肌肉注射 D Ρ〇(2μ§) 明礬 肌肉注射 E 並 、、 irrr 腹腔注射 -41 - 1234463 (37)
段落3 : 組別 抗原 佐劑 ' 途徑 A PS-PD (0.5 μ%) CpG(50 μ§) 肌肉注射 B FG (2pg) CpG (50 μ§) 肌肉注射 C PS-PD (0.5 μΒ)^ΈΟ(2 μ§) CpG (50 μ%) 肌肉注射 D PS-PD (0.5 μ§) CpG (50㈣明礬 肌肉注射 E FG (2pg) CpG (50 pg)明礬 肌肉注射 F PS-PD (0.5 pg) + FG (2 pg) CpG (50 pg)明礬 肌肉注射 G FG(2pg) ， 明礬 肌肉注射 Η 迦 te 段落4 : 與段落3同組 2 .段落1 : 2.1 .抗F G抗體 由FG /明礬/ 3D-MPL或由與1 1 -價ps結合物相組合的 FG/明礬/ 3D-MPL所謗導出抗-RSVA中和抗體之水平是類 似的（圖5)。事實上，可由雨疫苗之組合物觀測出R s V A 中和抗體之謗導作用具輕微的综效效果。 分析個體抗-FG IgGl及IgG2a同類型原滴定數可得 出，FG/明礬/ 3D-MPL/1 1-價PS結合物相較於FG/明蓉 /3D-MPL，其謗導作用具相i以一或略低的滴定數（圖6)。 分析IgG2a對IgGl之同類型原比率可顯示，兩疫苗的 存在並不改變同類型原比率，該比率相較由公認Th2謗 導佐劑之FG明礬所謗導者為低。
2.2.抗肺炎球菌多醣IgG -42- 1234463 (38) *> y ^ ' y 〆、、 明:說明續頁 二“y:愈一一… 對於多醣3、6B、14、19F及23F之血清jgG滴定數之 測量已述於實例1。經由1 1 -價P S結合物/明蓉/ 3 d - Μ P L 配方或由F G抗體所補充的同樣疫苗’其接種而謗導之抗 體反應是相似的（圖7)。這個結果顯示出’將肺炎球菌p s 結合物與含RSV FG抗原之明礬3D-MPL配方相組合，並 不降低或改變其抗-肺炎球菌免疫反應。 2 · 3 · F G特異性細胞性反應
分析IL-5及IFN-7之生產可知，FG/明礬/ 3D-MPL和 1 1 -價P S結合物之混合物，對這些細胞素的生產水平具有 少許影響（圖8)。然而所測得的細胞素，亦為免疫反應之 Th概況之指標，並不會受該混合物的影響，且與Th2誘 導佐劑之FG明礬配方所測得之比率有很大的不同。 3.段落 2 : DQ/3D-MPLin 3.1.抗FG抗體
由FG DQ/3D-MPLin或由與1 1-價pS結合物組合的fG DQ/3D-MPLin所謗導出的抗-FG Ig抗體水平是類似的（圖 如抗-FG Ig分析所見，當 合物相混合時，並未觀測到 有影響（圖10)。 分析個體抗-FG IgGl及 出，FG DQ-MP/1 卜價 PS DQ-MP，其誘導作用具相似 類型原比率可顯示，將該疫ί FG DQ-MPLin 與 1 1-價 PS 結 對於抗-RSVA中和抗體水平
IgG2a同類型原滴定數可得 結合物相較於單獨的 FG 的滴定數（圖Π )。分析其同 作組合並不改變同類型原比 '43 . 1234463 (39) 羡 SIR?: 率，該比率相較由公認Th2誘導佐劑之F(}明礬所謗導者 低得多。 3 · 2 ·抗肺炎球菌多釀I g 〇 對於多醣3、6B、 測量已述於實例1。 14、19F及23F之血清igG滴定數之 經由1 1 -價PS結合物/DQ/3D-MPLin 配方或由F G抗體所補充的同樣疫苗，其接種而謗導之抗 體反應是相似的（圖1 2)。這個結果顯示出，將肺炎球菌
PS結合物與含RSV FG抗原之DQ/3D-MPLin配方相組 合’並不降低或改變其抗-肺炎球菌免疫反應。 3 · 3 . F G特異性細胞性反應
對 IL-5 及 IFN- r之生產之初步分析可得知，FG DQ/3D-MPLin和1 1 -價P S結合物之混合物，對IFN - τ的 生產水平具有少許影響（圖1 3)。細胞素為免疫反應之Th 概況之指標，進一步分析所測得的細胞素比率，顯示F G DQ/3D-MPLin與1 1-價PS結合物之混合物，對Th概況具 有少許影響。然而，優勢IF N - r比IL - 5之值’在二抗原 與DQ/3D-MPLin相組合時是保持不變的’且較公認Th2 誘導佐劑之F G明礬配方所測得之比率高出許多。 4.段落3 : CpG與CpG明礬 4.1 .抗F G抗體 _ - 由F G C p G或由與1 1 -價P S結合物相組合的F G c P G所 誘導出的抗- FG Ig抗體水平是類似的（圖14)。FG CPG與 1 1 -價P S結合物之組合這種不產生千擾的情形’也可由 CpG明礬基礎配方觀測得到。 -44- 1234463 (40) 螯明藏#碴頁 如抗-FGIg分析所見，當FGCpG或FGCpG明礬與11-價PS結合物相混合時，並未觀測到對於抗-RSVA中和抗 體水平造成干擾（圖15)。 分析個體抗-FG IgGl及 IgG2a同類型原滴定數可得 出，將11-價PS結合物加至FGCpG或FGCpG明礬配方， 並未發生干擾（圖16)。 進一步分析其同類型原比率可顯示，將兩疫苗作組合並 不改變同類型原比率，該比率相較由Th2謗導佐劑之FG 明礬所謗導者低得多。
4.2.抗肺炎球菌多醣IgG 對於多醣3、6B、7F、14、19F及23F之血清IgG滴定 數之測量已述於實例1。在該實例中測試了 CpG和明礬 / C p G這兩種佐劑配方。對兩種佐劑配方而言，施給 F G 補充的1 1 -價疫苗P S結合物之動物，與僅以1 1 -價疫苗 PS結合物接種之動物相較，其抗-PS IgG滴定數至少是相 似的（圖1 7)。這個結果顯示出，將肺炎球菌P S結合物與 含RSV FG抗原之CpG或明礬CpG配方相組合，並不降 低或改變其抗-肺炎球菌免疫反應。對血清型7F及1 4之 抗體效價於使用 CpG佐劑調配物時係顯著促進FG之存 在。 一- 4.3 . F G特異性細胞性反應 分析IL-5及IFN- τ之生產可知，FG CpG或CpG明礬 和1 1 -價P S結合物之混合物，不會對這些細胞素生產水 平或其IFN-r/IL-5比率造成影響（圖18)。因此，為Thl -45- 1234463 (41) 發明諱明績頁 反應標記之優勢IFN- T，對具CpG和CpG明礬的兩種組 合配方而言是不變的。在使用 CpG佐劑配方之FG存在 下，IFN- τ謗導作用甚至還會增進。 5.段落4 ··
添力口 FG至PS結合物配方對於蛋白D(PD)載體對IgG 免疫反應之影響亦有測試。PD為一保護性抗原，可對抗 非可分型的流感嗜血桿菌B(NTHi)感染。某Thl細胞-媒 介的免疫可能涉及對抗NTHi的保護作用。因此，也測試 了作為Thl反應良好指標之抗-PD IgG2a抗體。 5 . 1 .抗F G抗體 見段落3 5.2.抗肺炎球菌多醣IgG 見段落3 5 . 3 . F G特異性細胞性反應 見段落3
5.4. ELISA之抗PD血清IgG、IgG卜2a及2b劑量 如圖19所示，當使用佐劑時（CpG或 Alum CpG)，對 PD載體反應之總血清IgG不會被FG存在於肺炎球菌PS 結合體調配物影響。以CpG或Alum CpG PS接合體調配 物引發免疫之高比率血清抗IgG2a抗體（約總IgG之 3 0 %)不會因添加 F G於彼等調配物中而修飾（圖 2 0)。此 IgG2a反應係強Thl免疫之指標。综上，此等結果說明結 合PD-結合肺炎球菌PS及RSV FG抗原於CpG或Alum CpG調配物内不會改變抗-PD免疫反應。 -46-
a< t <^V f>^ »{> « / <· v / f 明說明讀買< PkdL·^ Ύ：ί：Ά ^ J 1234463 (42) 討論與結論
段落1 :明裝/3D-MPL 結果證明了肺炎球菌 PS結合物與具明礬 3D-MPL之 RSV FG抗原配方的組合，並不改變體液性抗-肺炎球菌免 疫反應。體液性及細胞性 F G -特異性免疫反應兩者的水 平，似乎僅受混合物輕微影響，但不會影響單純F G配方 之Th概況。
段落 2 : D0/3D-MPLin 結果證明了肺炎球菌PS結合物與具3D-MPLin之RSV F G抗原配方的組合，並不改變體液性抗-肺炎球菌免疫反 應。細胞性反應之進一步研究指出，具D Q / 3 D - Μ P L i η之 兩種抗體配方的組合，對 IFN- r之謗導作用有些許影 響。然而，與FG(單獨）配方相較，該組合並不影響Th概 況。 段落3 : CdG/CdG明礬
結果證明了肺炎球菌PS結合物與具CpG或CpG明礬 之RSV FG抗原配方的組合，並不降低或改變體液性抗-肺炎球菌免疫反應或體液性及細胞性F G -特異性反應。 段落4 : CpG/CpG明礬 結果證明了 PD-結合的肺來尊菌PS與具CpG或CpG明 礬之RSV FG抗原配方的組合，並不降低或改變抗-PD免 疫反應。 總結來說，23-價肺炎球菌疫苗與RSV FG 3D-MPL 6勺組 合是有利的，如此對兩種疫苗而言都有综效，這兩種疫苗 -47-
1234463 (43)
在特定免疫學測試能顯示其改善效果，而在任何測試都沒 有抑制作用。由上述結果可察知有利的組合，其為1 1 -價 PD-結合的肺炎球菌PS與具某特定Thl佐劑之RSV FG 抗原的組合。的確，大部分對不同受測 Th 1佐劑之免疫 讀取值而言，疫苗抗原的組合對原疫苗預存特性不會妨 礙，或僅有輕微妨礙（且對所關心的整體反應是不顯著 的）。如實例1中所觀測，當F G與2 3 -價疫苗組合時，在 某些免疫學測試中，部分狀況下一種或另一種疫苗呈現了 改善效果。
-48-

Claims (1)

1234463
107452號專利申請案 |請專利範圍替換本(94年2月） 拾、申請專利範圍 1 . 一種疫苗組合物，其包含： (a) —或多種肺炎鏈球菌多醣類，結合或未結合至蛋 白質或胜肽；及 (b) RSV 抗原， 其與佐劑結合，且該佐劑為Th 1型免疫反應之優勢刺 激物，其中該T h 1型反應之優勢刺激物為至少一種選 自下列所組成之群之佐劑：3D-MPL、其粒子大小宜近 似或小於100毫微米之3D-MPL、QS21、QS21與膽固 醇之混合物、及CpG寡核甞酸。 2. 如申請專利範圍第1項之疫苗組合物，其中肺炎鏈球 菌多醣係結合至包括下列蛋白所組成之群：流感嗜血 桿菌B之蛋白D或其斷片，蛋白D之脂化物（脂蛋白 D);破傷風毒素，及白喉毒素。 3. 如專利申請範圍第1或2項之疫苗組合物，其另包括 載體。 4. 如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該Th 1 型反應之優勢刺激物包含3 D - Μ P L。 5. 如申請專利範圍第 4項之疫苗組合物，其另包含 QS21。 6. 如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該肺 炎鏈球菌多醣為23 -價肺炎球菌多醣疫苗。 7.如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該肺 炎鏈球菌多醣為1 1 -價結合的肺炎球菌多醣疫苗。 1234463 :申請專利範圍續頁 8. 如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該RSV 抗原為人類RSV包膜糖蛋白。 9. 如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該RSV 抗原為嵌合性FG或其斷片。 1 0.如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中額外 存在流行性感冒病毒抗原。 1 1 .如申請專利範圍第1或2項之疫苗組合物，其中該載 體係選自下列所組成之群：氫氧化鋁、磷酸鋁及生育 酉分及水包油之乳液。 1 2 . —種製備如申請專利範圍第1至1 1項中任一項之疫 苗組合物之方法，該方法包含掺合肺炎鏈球菌抗原及 RSV抗原與Thl謗導佐劑，其中該Thl佐劑係選自下 列所組成之群之佐劑：3D-MPL、其粒子大小宜近似或 小於100毫微米之3D-MPL、QS21、QS21與膽固醇之 混合物、及CpG寡核菩酸。 1 3 . —種製備疫苗組合物之方法，其包含摻合結合至蛋白 D或其斷片之肺炎鏈球菌多醣，與RSV抗原及醫藥上 可接受的賦形劑。 1 4 · 一種如申請專利範圍1至1 1項中任一項之疫苗組合 物之用途，其係用於製備用於預防或改善病患受RSV 及/或肺炎鏈球菌之感染之藥物。 1234463
M鲭#无，本療f£〕 S0
♦滴定數 B平均. _
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