KR20080027973A - 보조제 배합물로서의 큐에스-21 및 아이엘-12 - Google Patents

보조제 배합물로서의 큐에스-21 및 아이엘-12 Download PDF

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Abstract

IL-12 및 QS-21 유효량을 포함하는 보조제 조성물이 기술된다. 항원과 IL-12 및 QS-21 유효량을 포함하는 보조제 조성물의 혼합물을 포함하는 면역원성, 백신 및 약학 조성물도 또한 기술된다. 이들 조성물은 적어도 하나의 항원에 대항하여 기능적인 세포성 및 체액성 면역 반응을 일으킨다. 기술된 조성물을 사용하는 방법도 또한 기술된다.
IL-12, QS-21, 보조제, 백신, 면역 반응

Description

보조제 배합물로서의 큐에스-21 및 아이엘-12{QS-21 AND IL-12 AS AN ADJUVANT COMBINATION}
본 발명은 QS-21 및 IL-12 유효량 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 보조제 조성물에 관한 것이다.
IL-12는 덴드라이트 세포, 대식세포 및 호중구에 의해 주로 생성되고, 제 1형 면역 반응의 발생 및 세포-매개 면역에서 필수적인 역할을 하는 헤테로 이량체 사이토카인이다(Brunda, J. Leukocyte Biol. 55: 280-288(1994); Scott 및 Trinchieri, Semin. Immunol. 9:285-291(1997)). 다양한 동물 모델내에서의 여러 연구의 결과는 rIL-12가 감염성 및 전이성 질병에 대한 예방용 또는 치료용 백신을 위한 보조제로서 작용할 수 있다는 생각을 뒷받침해 주었다(Rodolfo 및 Colombo, Methods 19:114-120(1999); Scott 및 Trinchieri, Semin. Immunol. 9:285-291(1997)). 최근에는, rIL-12가 RSV의 천연 F 단백질에 대한 보조제로서 잠재적으로 기여할 수 있음이 보고되었다(Hancock 등, Viral Immunol. 13:57-72(2000)). BALB/c 마우스에서, 결과는 알루미늄 하이드록사이드 보조제에 흡착된 경우(F/AlOH), rIL-12는 2형 표현형에 대해 극성화되지 않고 더욱 균형을 이룬 T 세 포 반응을 일으킬 수 있는 F 단백질의 능력을 향상시켰음을 제안하였다. 그러나, rIL-12와 공-제형된 것은 F/AlOH에 의해 촉발되는 제 2형 반응 모두를 완전히 조절하지는 못하였다. 즉, F/AlOH+rIL-12로 프라이밍된 마우스의 챌린지시, IL-5-의존 폐 호산구가 여전히 관찰되었다. 또한, 최근의 페이즈 I 임상적 시도(Atkins 등, Clin. Cancer Res. 3:409-417(1997))로부터의 데이터는 rIL-12의 고용량은 통상의 백신접종에 사용되기에는 너무 반응성일 수도 있다는 것을 제안하였다.
F 단백질에 대한 면역 반응을 질적으로 및 양적으로 개선시킬 수 있는 고정제 사포닌 QS-21의 능력(kensil 등, J. Immunol. 146:431-437(1991))이 보고된 바 있다(Hancock 등, Vaccine 13:391-400(1995); Hancock 등, J. Virol. 70:7783-7791(1996)). F/AlOH에 비해서, F/QS-21로 백신접종한 나이브 마우스는 우세한 G1 내지 G2a 서브클래스로부터 F-단백질-특이적 Ig 생산에서의 쉬프트와 관련된 증대된 혈청 중화 역가의 생성을 초래하였다. 챌린지시, CD8+ T 세포와 폐내 단백질-특이적 항원 분비 세포에 의해 제한되는 MHC 클래스 I에 의해 매개되는 항원 의존 킬러 세포 활성이 또한 증가되었다. 중요하게도, IL-5-의존 폐 호산구가 현저히 감소하였다. 그러나, 임상적 데이터는 이 제형물에서의 QS-21은 접종후 즉시 국부적 급성 독성과 관련되었음을 암시하였다.
본 발명은 QS-21 및 IL-12 유효량 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 보조제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 조성물이 실질적으로 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하지 않는, QS-21 및 IL-12 유효량 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 보조제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 조성물이 약 1 ㎍ 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A, 더욱 바람직하게는 약 0.5 ㎍ 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.0001 ㎍(1 Ug) 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하는, QS-21 및 IL-12 유효량 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 보조제 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 보조제 조성물은 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 함유하지 않는다. 본 발명은 또한 조성물이 약 0.05 ㎍ 미만의 IL-12를 포함하는, QS-21 및 IL-12 유효량 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 보조제 조성물에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 QS-21 및 IL-12 유효량 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클로 본질적으로 이루어지는 보조제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 양태에서, QS-21은 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 국부적인 독성을 야기하지 않을 정도의 양으로 존재한다. 본 발명의 다른 양태에서, Il-12는 척추 동물에게 적용되었을 때, 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, QS-21은 척추 동물에게 적용되었을 때, 실질적으로 국부적인 독성을 야기하지 않을 양으로 존재하며, IL-12는 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다. 바람직하게는 보조제 조성물은 QS-21 및 IL-12 유효량을 포함한다. 본원에서 사용된 QS-21 및 IL-12 유효량은, 조성물의 보조제 활성을 유지하면서, 유사한 면역학적 효과를 위해 요구되는 다른 것의 부재하에 각 성분의 양에 대해 상대적인, QS-21 또는 IL-21 중 하나, 또는 QS-21 및 IL-12 모두의 감소된 양의 사용을 허용하는 양이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, IL-12는 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 다른 바람직한 양태에서, QS-21은 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 바람직하게는, QS-21 및 IL-12의 배합물은 시너지 보조제 효과를 창출한다. 본 발명의 일 양태에서, IL-12는 재조합 인간 IL-12이다.
본 발명은 또한, IL-12 및 QS-21 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 보조제 조성물이 실질적인 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하지 않는, QS-21 및 IL-12 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 보조제 조성물이 약 1 ㎍ 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A, 더욱 바람직하게는 약 0.5 ㎍ 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.0001 ㎍(1 Ug) 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하는, IL-12 및 QS-21 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 보조제 조성물은 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 함유하지 않는다. 본 발명은 또한, 조성물이 약 0.05 ㎍ 미만의 IL-12를 포함하는, IL-12 및 QS-21 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 IL-12 및 QS-21 유효량과 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클로 본질적으로 이루어지는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
면역원성 조성물의 구체적인 양태에서, QS-21은 척추 동물에게 적용되었을 때, 실질적으로 국부적인 독성을 야기하지 않을 양으로 존재한다. 본 발명의 다른 양태에서, IL-12는 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다. 본 발명의 바람직한 양태에서 QS-21은 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 국부적 독성을 야기하지 않을 양으로 존재하며, IL-12는 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, IL-12는 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 또다른 바람직한 양태에서, QS-21은 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 바람직하게는 QS-21 및 IL-12는 시너지 보조제 효과를 창출한다. 본 발명의 일 양태에서, IL-12는 재조합 인간 IL-12이다. 본 발명의 일 양태에서, 항원은 바이러스 항원이다. 바람직한 양태에서, 항원은 호흡기 합포체 바이러스 F 단백질 또는 이것의 기능성 부분이다. 또다른 양태에서, 항원은 박테리아 항원이다. 이 양태에서, 바람직한 항원은 비-유형 분류 가능한 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) P4 단백질, 또는 이것의 기능성 부분이다.
본 발명은 또한 QS-21 및 IL-12 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물의 면역학적 유효량을 척추 동물에게 적용하여, 척추 동물내에서 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 조성물이 실질적인 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하지 않는, QS-21 및 IL-12 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물의 면역학적 유효량을 척추 동물에게 적용하여, 이로써 척추 동물내에서 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 조성물이 약 1 ㎍ 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 약 0.5 ㎍ 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A, 더욱 바람직하게는 약 0.0001 ㎍(1 Ug) 미만의 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하는, QS-21 및 IL-12 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물의 면역학적 유효량을 척추 동물에게 적용하여, 이로써 척추 동물내에서 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한, 조성물이 약 0.05 ㎍ 미만의 IL-12를 포함하는, QS-21 및 IL-12 유효량을 포함하는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물의 면역학적 유효량을 척추 동물에게 적용하여, 이로써 척추 동물내에서 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 방법을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 또한 QS-21 및 IL-12 유효량과 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클로 본질적으로 이루어지는 보조제 조성물 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물의 면역학적 유효량을 척추 동물에 게 적용하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다.
방법의 구체적인 양태에서, QS-21은 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 국부적 독성을 야기하지 않을 양으로 존재한다. 본 발명의 다른 양태에서, IL-12는 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, QS-21은 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 국부적 독성을 야기하지 않을 양으로 존재하며, IL-12는 척추 동물에게 적용되었을 때 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, IL-12는 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 다른 바람직한 양태에서, QS-21은 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 바람직하게는, QS-21 및 IL-12는 시너지 보조제 효과를 창출한다. 본 발명의 일 양태에서, IL-12는 재조합 인간 IL-12이다. 본 발명의 일 양태에서, 항원은 바이러스 항원이다. 바람직한 양태에서, 항원은 호흡기 합포체 바이러스 F 단백질 또는 이것의 기능성 부분이다. 다른 양태에서, 항원은 박테리아 항원이다. 이 양태에서, 바람직한 항원은 비-유형 분류 가능한 해모필러스 인플루엔자로부터의 P4 단백질, 또는 이것의 기능성 부분이다. 일 양태에서, 면역 반응은 체액성 반응, 세포-매개 반응, 또는 체액성 및 세포-매개 반응 모두로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
발명의 상세한 설명
백신접종에 의해 유도되는 보호 면역은 병원체를 제거하거나 또는 이에 대항하여 적절한 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신의 능력에 좌우된다. 병원체에 따라, 이는 세포-매개 및/또는 체액성 면역 반응을 요구할 수 있다. 면역 반응에서 헬퍼 T 세포의 역할에 대한 오늘날의 패러다임은, T 세포가 이들이 생산하는 사이토카인에 기초하여 서브셋으로 분리될 수 있으며, 이들 세포에서 관찰되는 별개의 사이토카인 프로파일이 이들의 기능을 결정한다는 것이다. 이 T 세포 모델은 두 가지 주요 서브셋을 포함한다: 세포성 및 체액성 면역 반응을 증대시키는 IL-2 및 인터페론-γ(INF-γ)를 생산하는 Th1 세포와, 체액성 면역 반응을 증대시키는 IL-4, IL-5 및 IL-10을 생산하는 Th2 세포(Mosmann 등, J. Immunol. 126:2348 (1986)). 면역화된 유기체내 더욱 강한 면역 반응, 특정 반응 유형에 대한 면역 반응의 성향, 및 항원-보유제에 대한 강화된 숙주 내성을 수득하기 위하여, 항원의 면역학적 잠재성을 향상시키는 것이 종종 바람직하다. 적용되었을 때 항원의 면역원성을 증가시키는 물질은 보조제로 알려져 있다.
다양한 동물 모델내 연구로부터의 결과는 재조합 IL-12(rIL-12)가 감염성 및 전이성 질환에 대한 예방용 또는 치료용 백신의 보조제로서 가능성을 가짐을 뒷받침한다(Rodolfo 및 Colombo, Methods 19: 114-120(1999); Scott 및 Trinchieri, Semin. Immunol. 146:431-427(1991)). RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 질적으로 또한 양적으로 개선시킬 수 있는 IL-12의 능력이 보고된 바 있다(Hancock 등, Vaccine 12:391-400(1995); Hancock 등, J. Virol 70:7783-7791(1996)).
본원의 연구는 QS-21은 IL-12와 시너지 효과를 낼 수 있으며, 전신 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 일으킬 수 있음을 지적하였다. 따라서, IL-12 및 QS-21은 함께 항원에 대한 기능적인 세포-매개 및 체액성 면역 반응을 일으키기 위한 잠재적인 보조제 배합물이다. 이 시너지 효과는, 총 보조제 양 감소 및/또는 단독으로 사용된 경우 바람직하지 않은 효과를 가질 수 있는 다른 보조제 성분의 양의 감소를 허용한다.
보조제 조성물은 QS-21 및 IL-12 유효량을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 QS-21의 유효량은, 적어도 하나의 항원에 대한 보조제 조성물의 보조제 활성(예를 들면, 체액성 반응을 일으키고, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 일으키거나, 체액성 반응 또는 CTL 반응 모두를 일으키는 것)을 유지하면서, 조성물내 IL-12의 감소된 양의 사용을 허용하는 양이다. IL-12의 유효량은 적어도 하나의 항원에 대한 보조제 조성물의 보조제 활성(예를 들면, 체액성 반응을 일으키고, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 일으키거나, 체액성 반응 또는 CTL 반응 모두를 일으키는 것)을 유지하면서, 조성물내 QS-21의 감소된 양의 사용을 허용하는 양이다. 본원에서 사용된 QS-21 및 IL-12 유효량은, 성분의 보조제 활성을 유지하면서, 적어도 하나의 항원에 관한 유사한 면역학적 효과를 위해 요구되는 다른 것의 부재하에 각 성분의 상대적인, QS-21 또는 IL-12 중 하나, 또는 QS-21 및 IL-12 모두의 감소된 사용을 허용하는 양이다.
*유효량은 합해질 수 있거나, 시너지 효과를 일으킬 수 있다; 그러나, 바람 직하게는 유효량은 시너지 효과를 일으킨다. 즉, IL-12 및 QS-21 배합물의 합 또는 시너지 효과는 원하는 면역 반응을 일으키기 위한 최적으로는 간주되지 않는 IL-12, 또는 QS-21 중 하나, 혹은 IL-12 및 QS-21 모두의 양의 사용을 허용한다. 본원에 사용된 배합 보조제(QS-21 및 IL-12)의 시너지 효과는, 각각 개별적으로 사용된 경우에, 특히 보조제 조성물내 사용된 수준에서 IL-12 보조제 효과와, 특히 보조제 조성물에서 사용된 수준에서 QS-21 보조제 효과의 합보다 더욱 큰 효과이다. IL-12 또는 QS-21의 감소된 양 혹은, IL-12 및 QS-21 모두의 감소된 양의 사용은 고용량의 IL-12 및 QS-21에 수반될 수 있는 독성이라든지 반응성과 같은 역효과를 감소시키는 데 유리할 수 있다. QS-21 및 IL-12의 유효량은, 원하는 보조제 활성이 유지되는 동안에, 한 가지 보조제의 특정 감소된 용량을 사용하여 용량 곡선 실험을 하고, 다른 보조제 증가량의 효과를 모니터링함으로써 측정할 수 있다.
바람직한 양태에서, IL-12는 보조제 조성물이 적용된 포유류에서 실질적으로 반응성이지 않을 양으로 존재한다. 즉, IL-12는 바람직하게는 조성물이 적용된 포유류에서 허용되지 않은 반응을 일으키지 않을 양으로 조성물내에 존재한다. 바람직한 양태에서, IL-12는 실질적인 발열, 오심, 구토, 구내염, 비정상 간 기능 징후, 림프구 감소, 빈혈, 호중구 감소증, 고혈당증, 트롬보사이토페니아 및/또는 하이포알부미네미아를 발생시키지 않을 양으로 존재한다. 일 양태에서, IL-12는 약 0.01 ng 내지 약 50 ㎍의 양으로 존재한다. 예를 들면, IL-12는 약 0.01 ng 내지 약 35 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 20 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 15 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 10 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 5 ㎍의 양으로 존재한다. 특 정 양태에서, IL-12는 약 0.01 ㎍ 내지 약 1.0 ㎍의 양으로 존재한다. 일 양태에서, IL-12는 약 0.05 ㎍ 미만의 양으로 존재한다. 구체적인 용량은 치료받을 포유류의 나이, 체중 및 임상적 조건, 및 투여 방법 및 항원에 따라 좌우될 것이다. 적당한 용량은 본원에서 제공되는 지침에 따라 당업자가 쉽게 결정할 것이다.
IL-12는 임의의 적당한 급원으로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는 IL-12는 재조합 IL-12(rIL-12)인데, 즉, 재조합 DNA 방법으로 생산할 수 있다; 예를 들면, 인간 IL-12를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 숙주 시스템에서 발현시키면, 순수한 인간 IL-12 다량을 생산한다. 또한 본 발명에서 유용한 것은 생물학적으로 활성인 IL-12의 서브유닛 또는 단편이다. 또한, 특정 T 림프구 라인은 높은 수준의 IL-12를 생산하는데, 따라서, 유용한 급원을 쉽게 제공한다. 재조합 인간 및 쥐 IL-12의 시판원은 Genetics Institute, Inc.(Cambridge, MA)를 포함한다(또한, 국제 특허 출원 WO 90/05147에서 공개된 것 참조).
QS-21은 Quillaja saponaria 조 추출물로부터 정제되며, Kensil 및 Marciani(미국 특허 번호 제5,057,540호)에 의해 기술된 사포닌이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, QS-21은 조성물이 투여된 포유류에서 실질적으로 국부적인 독성을 일으키지 않을 양으로 조성물내에 존재한다. 특정 양태에서, QS-21은 약 50 ㎍ 미만, 더욱 바람직하게는 약 20 ㎍ 미만의 양으로 존재한다. 바람직한 양태에서, QS-21은 약 10 ㎍ 미만, 더욱 바람직하게는 약 4 ㎍ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1 ㎍ 미만의 양으로 존재한다. 예를 들면, QS-21은 약 0.01 ng 내지 약 35 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 20 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 15 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 10 ㎍, 또는 약 0.01 ng 내지 약 5 ㎍의 양으로 존재할 수 있다. 일 양태에서, QS-21은 약 0.8 ㎍ 미만의 양으로 존재한다.
본 발명은 또한, 임의로는 생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 비히클과 함께 본원에 기술된 보조제 조성물 및 1 이상의 항원을 포함하는 면역원성, 백신 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 면역원성 조성물은, 조성물이 적용된 포유류에서 면역 반응을 일으키는 조성물이다. 유발된 면역 반응은 체액성 또는 세포-매개 반응일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 백신 조성물은 조성물이 적용된 포유류에서 면역 반응을 일으키고, 조성물의 항원 또는 관련된 유기체로의 후속적 챌린지 또는 감염으로부터 포유류를 보호하는 조성물이다.
본원에 사용된, RSV에 대항하는 보호와 같은, "보호"는 예를 들면, RSV와 같은 조성물내 항원 또는 관련 유기체에 의해 유발되는 질병의 발병에 대항하는 보호(부분적으로 또는 전체적으로)인, 척추 동물(예를 들면, 포유류)에서의 면역 반응의 발생을 말한다. RSV 바이러스에 의해 유발되는 질병에 대항하여 보호된 척추 동물은 RSV로 감염될 수는 있지만, 면역화 없이 발생하는 것보다는 적은 정도이고; RSV로 감염될 수는 있지만 질병 증후를 보이지 않거나; 또는 RSV로 감염될 수 있지만, 면역화 없이 발생하는 것보다는 적은 정도의 질병 증후를 보인다. 대안적으로, RSV에 의해 유발되는 질병에 대항하여 보호된 척추 동물은 바이러스에 노출되었음에도 불구하고, 전혀 RSV 바이러스로 감염되지 않을 수 있다.
조성물의 항원 성분은 실제적인 임의의 항원, 임상학적 또는 수의학적으로 흥미로운 항원 결정기 또는 합텐으로부터 선택될 수 있으며, 특히 면역원성(예를 들면, CTL 반응)을 증가시키는 항원이 바람직하다. 예를 들면, 항원은 박테리아, 바이러스, 리켓챠, 진균, 기생충 또는 이들의 산물, 또는 박테리아, 바이러스, 리켓챠, 곰팡이 또는 기생충의 추출물에서 유래하는 정제 또는 부분 정제 항원의 형태일 수 있으며, 또는 항원은 화분, 먼지, 비듬 또는 이들의 추출물과 같은 알러지원일 수 있다. 항원은 또한 독이 있는 곤충 또는 파충류에서 유래하는 독 또는 독액의 형태일 수 있다. 바람직하게는 항원은 이의 독성 또는 유독성이 감소되었거나 파괴되고, 본 발명의 조성물내에서 적당한 숙주에 도입하였을 때, 항원의 제조에 사용된 특정 미생물, 미생물의 추출물 또는 산물에 대항하는 항체의 생산에 의해 능동 면역을 유도하거나, 또는 알러지원의 경우에, 특정 알러지원 때문에 일어나는 알러지의 증후를 완화시키는 것을 도울 형태일 것이다. 항원은 단독으로 또는 배합하여 사용할 수 있으며, 예를 들면, 다중 박테리아 항원, 다중 바이러스 항원, 다중 미코플라스마 항원, 다중 리켓챠 항원, 다중 진균 항원, 다중 기생충 항원, 다중 박테리아 또는 유독성 톡소이드, 다중 알러지원 또는 전술한 산물의 배합물이 본 발명의 보조제 조성물과 배합될 수 있다.
본 발명의 보조제의 배합물은 인간 및 비-인간 척추 동물을 감염시키는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생 미생물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 것들을 포함하는 폭넓은 병원성 미생물, 또는 암세포 또는 종양 세포로부터의 폭넓은 항원을 함유하는 면역원성 조성물에서 사용하기에 적당하다. 항원은 단백질에서 유래한 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 하기 중 임의의 단편을 포함할 수 있다: 당류, 단백질, 폴리- 또는 올리고뉴클레오타이드, 암 또는 종양 세포, 또는 다른 거대분 자 성분. 일부 경우에, 1 이상의 항원이 면역원성 조성물에 포함된다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는 바람직한 바이러스 백신은 인간 면역결핍 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1-3형, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 단순포진 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 파필로마바이러스, 폴리오바이러스, 로타바이러스, 살리시바이러스, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 루벨라 바이러스, 아데노바이러스, 광견병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 코로나바이러스, 파르보바이러스, 감염성 리노트라키티스 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 조류 감염성 낭병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마렉병 바이러스, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스, 말 관절염 바이러스 및 각종 뇌염 바이러스(단, 이에 한정되지는 않음)에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는 바람직한 박테리아 백신은 해모필러스 인플루엔자(유형 및 비-유형 분류 가능한), 해모필러스 솜너스(Haemophilus somnus), 모락셀라 카타라리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피요진스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 아칼락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클 라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 사이태치(Chlamydia psittaci), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 시겔라(Shigella), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 미코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테륨 아비윰(Mycobacterium avium), 미코박테륨 인트라셀룰라 컴플렉스(Mycobacterium intracellulare complex), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리듐 테타니( Clostridium tetani), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 보렐리아 버그도페리(Borrelia burgdorferi), 파스튜렐라 해모리티카(Pasteurella haemolytica), 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 액티노바실러스 플류로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 및 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum)(단, 이에 한정되지는 않음)에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는 진균 병원체에 대항하는 바람직한 백신은 아스페르길리스(Aspergillis), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 코시디오데스(Coccidiodes), 크립토코커스(Cryptococcus) 및 히스토플라즈마(Histoplasma)(단, 이에 한정되지는 않음)에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는, 기생충에 대항하는 바람직한 백신은 레이시마니아 메이저(Leishmania major), 아스카리스(Ascaris), 트리쿠리스(Trichuris), 기아르디아(Giardia), 스키스토조마(Schistosoma), 크립토스포리듐(Crytosporidium), 트리코모나스(Trichomonas), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 뉴모사이스티스 카리니(Pneumocystis carinii)(단, 이에 한정되지는 않음)에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는, 척추 동물 숙주에서 치료적 또는 예방적 항암 효과를 일으키는 바람직한 백신은 전립선 특이적 항원, 카시노마엠브리오닉 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3(단, 이에 한정되지는 않음)을 포함하는 암 항원 또는 종양-관련 항원을 활용하는 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는, 척추 동물에서 알러지원에 대한 적절한 반응을 위한 바람직한 백신은 알러지원 또는 이들의 단편을 함유하는 것들을 포함한다. 이러한 알러지원의 예는 미국 특허 제5,830,877호에 기술되어 있고, 본원에 전부 참조로 인용되는 국제 특허 출원 번호 WO 99/51259에서 공개되었으며, 화분, 곤충 독액, 동물 비듬, 진균 및 약제(페니실린과 같은)를 포함한다. 백신은 알러지 반응의 알려진 원인인 IgE의 생성을 방해한다.
본 발명의 보조제 조성물을 함유하는, 척추 동물에서 아밀로이드 침착으로 특징지워지는 질병의 예방 또는 치료에 대한 바람직한 백신은 아밀로이드 펩타이드 단백질(APP)의 부분을 함유하는 것을 포함한다. 이 질병은 알쯔하이머병, 아밀로이 도시스 또는 아밀로이드생성 질병 등으로 다양하게 불린다. β-아밀로이드 펩타이드(또한 Aβ펩타이드로 언급)는 APP의 42개 아미노산 단편이며, 이는 β및 γ시크리타제 효소에 의해 APP가 가공됨으로써 생성되고, 하기 서열을 갖는다:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val
Gly Gly Val Val Ile Ala(서열번호 1).
일부 환자에서는, 아밀로이드 침착은 집합형 Aβ펩타이드 형태를 취한다. 놀랍게도, 분리된 Aβ펩타이드를 적용하면, 척추 동물 숙주에서 아밀로이드 침착의 Aβ펩타이드 성분에 대한 면역 반응을 유도함이 밝혀졌다(국제 특허 출원 번호 WO 99/27944에서 공개됨). 따라서, 본 발명의 백신은 본 발명의 보조제 조성물+Aβ펩타이드, 및 Aβ펩타이드의 단편 및 Aβ펩타이드 또는 이들의 단편에 대한 항원을 포함한다. 이러한 Aβ펩타이드의 한 단편은 하기 서열을 가지는 28개 아미노 펩타이드이다(미국 특허 제4,666,829호):
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(서열번호 2).
바람직한 양태에서, 항원은 호흡기 합포체 바이러스 항원이다. 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과(family)의 네거티브 스트랜드 바이러스인 호흡기 합포체 바이러스(RSV)는, 특히 어린 아이들과 유아에게서 하부 폐관 질환의 주요 원인이다. RSV는 2개 주요 인벨럽 외부 당단백질인, 융합(F) 단백질 및 부착(G) 단백질을 함유하며, 이는 유독성 감염에 중요하고, 따라서 서브유닛 백신을 RSV로 디자인하 기 위해 적절한 표적으로서 기여한다. 본 발명은 RSV F 단백질 항원에 대해 예시하였지만, 본 발명의 조성물에는, RSV F 단백질 항원의 사용에 한정되지는 않는 것으로 이해된다.
RSV F 단백질의 야생형(나이브) 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 당해 업계에 공지되어 있다(Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci(USA) 81:7683-7687(1984); 미국 특허 제5,639,853호; 미국 특허 제5,723,130호). 본 발명의 용도에 적당한 RSV 단백질은 완전한 RSV F 단백질 및 RSV F 단백질의 기능성 부분을 포함한다. 예를 들면, 기능성 부분은 포유류에게 적용되었을 때 항원 반응을 유도할 수 있는 능력을 보유하는 단백질의 부분일 수 있다. 이러한 면역학적 부분의 예는 RSV F 단백질의 아미노산 위치 283-315, 289-315 및 294-299를 포함하는 폴리펩타이드이다. 이들 영역은 항원을 중성화하고 항융합하는 것을 일으키는 RSV F 단백질의 에피토프를 포함한다(Paradiso 등, 미국 특허 제5,639,853호). 대안적으로, 네이티브 이량체 형태(140 kD)의 RSV F 단백질도 사용될 수 있다(Paradiso 등, 미국 특허 제5,223,254호).
본 발명의 F 단백질 및 폴리펩타이드는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된(예를 들면, 균질할 때까지 정제된), 및/또는 실질적으로 다른 단백질이 없는 형태일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 F 단백질 또는 펩타이드는 화학적으로 합성되거나 또는 당해 업계에 달려진 방법을 사용하여 재조합으로 생성될 수 있다(참조: 예를 들면, Broach 등, Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye(Academic Press, 1983) p. 83; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed, ed. Sambrook 등(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 및 17). 본 발명의 단백질 및 폴리펩타이드는 다양한 처리에 의해 재조합 세포 배양으로부터 분리되거나 정제(예를 들면, 균질해질 때까지)될 수 있다. 다양한 처리는 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 에탄올 침전, 친화 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용되는 구체적인 방법은 폴리펩타이드의 성질 및 숙주 세포의 선택에 좌우될 것이며, 적절한 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
적당한 RSV F 단백질은 또한 1 이상의 아미노산 변경을 가지는 RSV 단백질 또는 부분을 포함한다. 본원에서 사용된 "변경" 또는 이의 유도체는 아미노산의 변화를 의미하고자 한다. 변경은 1 이상 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 예를 들면, 변경(들)은 바람직하게는 보존적인 아미노산 변화일 수 있거나, 네이티브 F 단백질의 3차원 구조를 보존할 수 있다. 또한, F 단백질의 기능, 특히 면역원성에 필수적인 아미노산은 당해 업계에 공지된 방법에 의해 동정할 수 있다. 특히 유용한 방법은 보존된 아미노산의 동정, 부위-지향성 돌연변이유발 및 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(예를 들면, Cunningham 및 Wells, Science 244:1081-1085(1989)), 결정화 및 핵 자기 공명을 포함한다. 이들 방법에 의해 생성된 변경된 단백질 또는 폴리펩타이드는 면역원성 및 항원성을 포함하는 구체적인 생물학적 활성에 대해 시험될 수 있다.
구체적으로, 적절한 아미노산 변화는 소수성, 염기성 또는 산성 특성, 전하, 극성, 크기, 작용기의 유무(예를 들면, -SH 또는 글리코실화 부위), 및 방향족 특 성을 포함하는 몇 가지 기준에 근거하여 만들어질 수 있다. 상기 특성에 근거한 유사한 그룹으로 다양한 아미노산을 배당하는 것은 당업자에게 명백할 것이며, 추가적인 적절한 아미노산 변화도 Bowie 등(Science 247:1306-1310(1990))에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 단백질 항원(예를 들면, F 단백질 또는 폴리펩타이드)은 또한 추가의 성분과 융합된 단백질 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 방사성 동위원소 및 항원 태그와 같은 추가의 성분은 폴리펩타이드의 분리 및 정제를 도울 수 있도록, 또는 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키도록 선택될 수 있다. 일 양태에서, 단백질 항원은 RSV G 단백질 아미노산 서열의 전부 또는 일부와 융합된 F 단백질 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질인 F 단백질 또는 폴리펩타이드이다(Wertz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4075-4079(1985); Satake 등, Nucl. Acids Res. 13(21):7795-7810(1985)).
본 발명은 또한 항원(예를 들면, RSV F 단백질 또는 폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 분자 및 IL-12 및 QS-21 유효량을, 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 본원에서 면역원성 핵산 조성물 또는 면역원성 DNA 조성물이라고 언급되며, 척추 동물의 유전적 면역화에 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "유전적 면역화"는 척추 동물, 특히 포유류에 병원체, 특히 RSV에 대한 핵산 백신을 주사하여, 변역 반응을 일으키고, 바람직하게는, RSV에 대한 척추 동물의 보호를 초래하는 것을 말한다. 본원에 사용된 "면역원성 핵산 조성물" 또는 "면역원성 DNA 조성물"은 폴리펩타이드 항원, 특히 RSV F 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물이다. 핵산 작제물은 또한 전사 프로모터 인자, 인핸서 인자, 스플라이싱 시그널, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 및 다른 핵산 서열을 포함할 수 있다. 면역원성 핵산 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 IL-12 및 QS-21 유효량과 함께 적용된다.
면역원성 핵산 조성물은 표준 방법으로 만들 수 있다. 예를 들면, 공지된 방법을 사용하여, RSV F 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(예를 들면, DNA)을 발현 벡터에 삽입하여 면역원성 핵산 조성물을 작제한다(참조: Maniatis 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). 척추 동물 개체에 면역원성 핵산 조성물을 표준 방법을 사용하여 접종한다(즉, 면역원성 핵산 조성물이 적용된다). 척추 동물에 통상적으로 비독성이고, 생리학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 함유하는 제형물내 용량으로, 피하, 정맥, 복막내, 피내, 근육내, 국부, 경구, 직장, 비강, 구강, 질에 흡입 분무를 통해, 또는 이식된 보유숙주를 통해서 접종할 수 있다. 대안적으로는, 입자 가속 장치("유전자 건")를 사용하여 면역원성 핵산 조성물을 척추 동물에 접종한다. 적용되는 형태(예를 들면, 캡슐, 정제, 용액, 에멀션)는 적용하는 루트에 부분적으로 의존한다. 예를 들면, 근육 적용, 비강 드롭, 흡입 또는 좌약이 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산 작제물은 형질감염-촉진제와 함께 적용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 형질감염-촉진제는 부피비카인(미국 특허 제5,593,972호)이다.
항원 성분 또는 면역원성 조성물의 성분의 양은 항원의 정체, 및 숙주의 나이, 체중 및 임상학적 상태뿐만 아니라, 적용의 방법에 부분적으로 의존하여 다양 할 것이다. 또한, 적당한 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 면역원성 조성물에 대한 용량 횟수 및 용법은 당업자에 의해 또한 쉽게 결정된다. 일부 경우에, 보조제 배합물의 보조제 성질은 요구되는 용량의 횟수 또는 용법의 시간 코스를 감소시킬 수 있다.
면역원성 조성물은 보조제 조성물의 보조량을 사용한다. 본원에서 사용된 용어 "보조량"은 체액성 반응, CTL 반응, 또는 체액성 및 CTL 반응 모두를 일으키기에 충분한 보조제 조성물의 양(또는 QS-21 및 IL-12 이외의 보조제의 양)을 말한다. 바람직하게는 보조량은 면역원성 조성물의 1 이상의 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 변형시키기에 충분하다. 바람직하게는, 3개 이상의 보조제가 사용된 경우, 보조량은 면역원성 조성물 중 2개 이상의 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 변형시키기에 충분하다.
본 발명의 조성물은 식물성 오일 또는 이의 에멀션, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 계면 활성 물질, 예를 들면, 헥사데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 리소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N'-N 비스 (2-하이드록시에틸-프로판 디아민), 메톡시헥사데실글리세롤, 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예를 들면, 피란, 덱스트라설페이트, 폴리 IC, 아크르보폴; 펩타이드, 예를 들면, 뮤라밀 디펩타이드, 디메틸글리신, 터프트신; 면역 자극 복합체; 오일 에멀션; MPLR (3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana)과 같은 리포폴리사카라이드; 및 미네랄 겔과 같은, 추가의 보조제를 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 항원은 리포좀, 코킬레이터, 폴리-락타이드, 폴리-글리콜라이드 및 폴리-락타이드-코-글리시드와 같은 생분해성 중합체, 또는 ISCOMS(면역자극 복합체)에 혼입될 수 있으며, 및 보충 활성 성분이 사용될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 보조제, 면역원성, 백신 또는 약학 조성물은 실질적인 MPLR을 포함하지 않는다. 본원에 사용된 "실질적인 MPLR"은 조성물에 더이상의 보조제 활성을 부여하지 않는 MPL의 양을 의미하고자 한다. 대안적으로, 보조제, 면역원성, 백신 또는 약학 조성물은 약 1 ㎍ 미만, 바람직하게는 약 0.5 ㎍ 미만, 더욱 바람직하게는 약 1 Ug 미만의 양으로 MPLR을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 박테리아 톡신 및 이들의 감쇠된 유도체와 배합되어 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 IL-2, IL-3, IL-15, IFN-γ및 GM-CSF를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다른 림포카인과 배합하여 적용될 수도 있다.
본 발명의 RSV F 단백질은 면역 반응을 조절하거나 향상시키기 위하여 다른 분자와 커플링될 수 있다. 적당한 담체 단백질은 포유류에게 적용하기에 안전하고, 담체로서 면역원성으로 효율적인 박테리아 톡신을 포함한다. 이들의 예는 퍼투시스, 디프테리아, 및 테타누스 톡소이드 및 디프테리아 톡소이드 CRM197의 비-독성 변이체와 같은 비-독성 돌연변이 단백질(교차-반응 물질(CRM))을 포함한다. 적어도 하나의 T-세포 에피토프를 함유하는 네이티브 톡신 또는 톡소이드의 단편은 항원에 대한 담체로서 또한 유용하다. 항원 및 담체 분자의 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들면, Dick 및 Burret, Contrib Microbial Immunol. 10:48-114(Cruse JM, Lewis RE Jr, eds; Based, Krager (1989) 및 미국 특허 제5,360,897호(Anderson 등)에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 항원은 또한 명반에 흡착될 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 생리학적으로 또는 약학적으로 허용되는 비히클 또는 매질을 포함할 수 있다. 구체적인 생리학적 매질은 물, 완충 식염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 선택된 매질내 활성 성분(들)의 최적 농도는 공지된 방법에 따라 경험적으로 결정할 수 있으며, 궁극적으로 원하는 약학적 제형물에 좌우될 것이다. 조성물은 또한 면역학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 통상의 방법으로 혼합되어 주사용 액체 용액 또는 현탁액을 만들 수 있다. 다양한 적용 루트는 치료될 질병 또는 질환에 따라, 경구, 식이요법, 국부, 질, 직장, 복부, 경피(참조: 예를 들면, 본원에 참조로 인용되는 공개된 국제 특허 출원 WO 98/20734), 비경구(예를 들면, 정맥, 동맥, 근육, 피하 주사), 흡입(예를 들면, 기관지내, 안내, 비강내, 또는 구강 흡입, 비내 드롭)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다양한 것이 가능하다. 다른 적당한 적용 방법은 또한, 재충전 가능한 또는 생분해성 장치 및 서방성 중합체 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 다른 제제와 배합된 치료법의 부분으로서 적용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 척추 동물, 예를 들면 포유류 숙주에 IL-12 및 QS-21 유효 량 및 항원의 혼합물, 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 적용하는 것을 포함하는, RSV 항원과 같은 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, IL-12 및 QS-21 유효량 및 항원의 혼합물, 및 임의로는 생리학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 척추 동물에게 적용하는 것을 포함하는, 척추 동물내에서 체액성 또는 CTL-매개 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 면역원성 조성물의 "면역학적 유효" 용량은 면역 반응을 일으키기에 적당한 용량이다. 구체적인 용량은 나이, 체중에 좌우될 것이며, 조성물은 생리 식염수 또는 에탄올 폴리올(글리세롤 또는 프로필렌 글리콜과 같은)과 같은, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 비히클내에서 임의로 투여될 수 있다. 본원에 기술된 면역화에 적당한 척추 동물은 영장류(예를 들면, 인간), 암소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 쥐, 마우스 또는 다른 소, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류 또는 쥣과 종을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본원발명의 QS-21 및 IL-12의 조합적 사용은 면역원성 보조 효과의 상승적 작용을 유발하며, 이로 인해 비-지질화 박테리아 또는 바이러스 항원의 면역원성을 증가시킨다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 본원에 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 특허 출원의 전원은 참조로 본원에 인용된다.
하기 실시예는 상세히 기술된 것을 제외하고, 당업자에게 잘 알려져 있는 일상적인 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 하기 실시예는 설명의 목적을 위해 제시되었으며, 본 발명의 범위를 어떠한 식으로든 구속하지 않는다.
실시예 1
QS -21 및 재조합 (r) IL -12로 공- 제형된 RSV F 단백질로 백신접종한 BALB /c 마우스의 전신 체액성 반응
*이들 실험의 목적은 QS-21 및 재조합 IL-12로 제형된 RSV F 단백질로 면역화한 경우, 보조제 단독으로 면역화한 후 달성되는 것보다 더욱 큰 기능성 혈청 항체 역가를 유도할 수 있는지 측정하는 것이다. 실험에서 네이티브 F 단백질은 RSV의 A2 스트레인으로 감염된 Vero 세포(ATCC No. CCL 81)로부터 이온 교환 크로마토그래피하여 정제하였다. 단백질은 SDS-PAGE 및 항체 포획 ELISA에 의해 측정된 것보다 95% 이상 순수하였다. QS-21 및 rIL-12는 각각 Aquila BioPharmaceuticals, Inc.(Worcester, MA) 및 Genetics Institute(Cambridge, MA)로부터 입수하였다. 나이브 암컷 BALB/c 마우스(생후 8-10주)를 Charles River Laboratories(Wilmington, ME)로부터 입수하고, 천연 F 단백질(3 ㎍/용량)을 0 내지 4주에 근육내에 백신접종하였다. F 단백질을 점차 감소하는 용량(1.0, 0.1, 0.01 ㎍)의 rIL-12(F/rIL-12)로 제조하고 QS-21의 서브옵티말 양(0.8 ㎍)과 공-제형되도록 백신을 제조했다. 대조군 마우스를 QS-21 없이 F/rIL-12로, 20 또는 0.8 ㎍ QS-21과 혼합한 F 단백질로, PBS내 F 단백질만으로 주사했다. 추가의 대조군 마우스를 RSV A2 스트레인으로 실 험 감염(~2X106 pfu)시킨 후 백신접종했다. 비내 감염(0.05 ml)을 주사가능한 마취제(케타민(60 mg/kg) 및 자일라진(2-5 mg/kg), The Butler Co., Dublin OH) 하에 수행했다.
기하 평균 혈청 IgG 및 중화 항체 역가(±1 표준 편차)를 2차 백신 접종 2주 후, 각각, 종말점 ELISA 및 플라크 감소 중화 시험을 사용하여 측정하였다. 중화 역가는 보체(C)의 급원으로서 5%(V/V) 기니 피그 혈청(BioWhittaker, Walkersville, MD) 유(+)무(-)하에 바이러스의 A2 스트레인에 대해 측정하였다. 중화 역가는 웰당 병소 수에서 60% 감소(바이러스 대조군에 상대적으로)를 보이는 혈청 희석의 역수로서 계산되었다. JMPR 통계학적 발견 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 Tukey-Kramer HSD 다중 비교에 의해 로그 변환한 후, 유의차(<0.05)가 측정되었다. 그룹당 5마리 마우스가 있었다. 모든 동물을 Laboratory Animal Care의 인가를 위한 American Association에 의해 허용된 설비에서 길렀다.
결과
표 1에서 보여지는 결과는 이전의 데이터를 확증하고, IL-12 없이 QS-21의 최적 용량(20.0 ㎍)으로 백신접종한 것이, 실험 감염 후 관찰된 규모 및 기능과 유사한 전신 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 발생시킴을 증명한다. 항-F 단백질 IgG1 및 IgG2a 역가 및 보체 보조 중화 역가는 2차 백신접종 2주 후 상당히 증가되었다. 반면에 IL-12없이 QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)과 혼합된 F 단백질로 백 신접종한 것은, F/QS-21 (20.0 ㎍)과 비교하였을 때 상당히 작은 혈청 항체 역가를 초래했다. 이 결과는 또한 PBS 단독(QS-21 없이)에 제형된 F/rIL-12(0.01 내지 1.0 ㎍)로 면역화한 것은 상당한 보체-보조 혈청 중화 역가를 발생시키지 못함을 증명한다.
조합하면, 결과는 QS-21 및 rIL-12가 잠재적인 보조제 제형물을 형성함을 암시한다. 0.8 ㎍ QS-21 및 rIL-12 간의 시너지는 기능성 혈청 항체의 발생을 위해 명백했다. 표 1은 0.8 ㎍ QS-21 및 rIL-12과 제형된 F 단백질로 2차 접종한 2주 후 생성된 항체 역가를 묘사한다. 0.8 ㎍ QS-21에 1.0, 0.1 또는 0.01 ㎍ rIL-2를 첨가하면 QS-21 없이 F/rIL-12, 또는 F/QS-21(0.8 ㎍) 단독을 주입한 후 발생되는 것보다 상당히 큰 IgG2a 및 보체-보조 중화 역가를 초래하였다. 또한, 보체-보조 중화 역가는 실험 감염 후에 발생되는 것과 상당히 다르지 않았다. F/rIL-12(1.0 내지 0.01 ㎍)+0.8 ㎍ QS-21로 백신접종한 마우스의 혈청을 QS-21 없이 F/rIL-12로 면역화된 마우스의 혈청과 비교하였을 때, 항-F 단백질 특이적 IgG1 역가에서의 유의차는 관찰되지 않았다. RSV 중화 역가를 유도하는 rIL-12 및 QS-21간의 시너지는 수행된 4개 연구 중 3개에서 관찰되었다.
실시예 2
QS -21 및 rIL -12과 공- 제형된 F 단백질로 백신접종한 BALB /c 마우스의 비장내 항원 의존 킬러 활성의 측정
이들 실험의 목적은 QS-21 및 rIL-12과 제형된 F 단백질로 면역화한 경우, 보조제 단독으로 면역화한 후 달성되는 것보다 더욱 큰 항원 의존 킬러 세포 활성 을 일으킬 수 있는지 측정하는 것이다. 실험에서, 천연 F 단백질을 정제하고, 백신을 제조하였으며, 실시예 1에서 기술한 바와 같이 암컷 나이브 BALB/c 마우스에 적용하였다. 항원 의존 킬러 세포의 존재를 측정하기 위하여, 벌크 비장세포를 2차 접종 2주 후에 수집하고, 시너지 RSV-감염된 자극 세포의 존재하에 6일 동안 배양했다. 이후에, 효과기 세포(10% 가열-불활성화한 송아지 혈청으로 RPMI 1640에서 3배로 연속 희석)를 RSV-감염된 세포 및 대조군 시너지 표적 세포에 대해, 표준 51Cr 방출 시험으로 항원 의존 킬러 세포 활성에 관해서 시험했다. 도 1f에서, 효과기 대 표적의 비는 100:1이었다. 그룹당 5마리 마우스가 있었다.
결과
도 1a-1f에 보여지는 결과는 이전의 데이터를 확증하고, F/QS-21(20.0 ㎍)로 면역화하면 항원 의존 킬러 세포 활성에서의 현저한 증가를 생성시킴을 증명한다(도 1a 및 1f). 반면에, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)과 혼합된 F 단백질로의 백신접종은 항원 의존 킬러 세포 활성을 현저하게 일으키지는 못하였다(도 1c 및 f). 이 결과는 또한 PBS 단독으로 제형된 F/rIL-12(0.01 내지 1.0 ㎍)는 검출가능한 항원 의존 킬러 세포를 발생시키지 못함을 증명하는 초기의 보고와 또한 일치한다(도 1d 및 f).
그러나, 조합하면, QS-21 및 IL-12가 F 단백질에 대한 잠재적인 보조제 조성물을 형성하는 것을, 결과는 지적한다. 데이터는, 0.8 ㎍ QS-21이 1.0 또는 0.1 ㎍ rIL-12과 시너지를 일으키며, F/QS-21(20 ㎍)으로 실험 감염 또는 백신접종한 후 유도되는 것과 유사한 수준으로 BALB/c의 비장내 항원 의존 킬러 세포 전구체를 발생시킴을 증명하였다. 킬러 세포 활성은 F/rIL-12(1.0 ㎍)(도 1d) 또는, F/QS-21(0.8 ㎍)(도 1c)를 효과기 대 표적의 비 33:1로 백신접종 한 후 달성되는 것보다 각각 5 내지 3배 컸다. 도 1f는 0.8 ㎍ QS-21이 100:1의 효과기 대 표적의 비로, 0.1 또는 1.0 ㎍ rIL-12와 시너지를 일으키는, 2차 실험으로부터의 데이터를 묘사한다. 기능적 세포 매개 면역 반응의 발생에 대한 rIL-12 및 QS-21 간의 시너지는 20.0 ㎍ QS-21이 백신에 사용된 경우에 관찰되지 않았다(도 1a). 4.0 ㎍ QS-21 용량에서 시너지에 대한 경향은 없는 것으로 보였다. 눈에 띄게, 킬러 세포 활성은 F/AlOH로 백신접종한 마우스의 비장에서 관찰되지 않았다. RSV로 감염되지 않은 시너지 대조군 표적에 대한 세포파괴는 관찰되지 않았다(도 1). 항원 의존 킬러 세포 활성을 발생시키기 위한 IL-12 및 QS-21 간의 시너지는 수행된 3가지 연구 중 3가지에서 관찰되었다.
표 1: F/rIL-12+QS-21로 2차 백신접종 한 2주 후 BALB/c 마우스의 혈청 항체 역가
Figure 112008019162483-PAT00001
실시예 3
RSV G 단백질, Th2 헬퍼 T 세포를 유도하기 쉬운 항원에 의해 유발된 전신 체액성 면역 반응에 대한, QS-21 및 rIL-12로 이루어진 보조제의 효과
이 실험의 목적은, Th2 헬퍼 T 세포 반응을 유도하기 쉬운 바이러스 항원에 의해 유발되는 체액성 면역 반응에 대한 rIL-12+QS-21의 보조제 특성을 결정하는 것이다. 결국, 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)의 QS-21과 공-제형된 천연 G 단백질에 의해 유도된 면역 반응에 대한 rIL-12의 효과가 조사되었다. 실험에서, 나이브 암컷 BALB/c 마우스(생후 7-10주)를 1 ㎍의 천연 G 단백질로 근육내 프라이밍했다. A2 스트레인 RSV로 감염된 Vero 세포로부터 면역친화 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하였고, 이는 SDS PAGE 전기 영동에 의해 측정된 것보다 95% 더 순수했다. 이 단백질을 PBS 단독으로 제조하고, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)과 혼합하거나, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)+10배로 증가하는 용량의 rIL-12(0.01, 0.1 또는 1.0 ㎍ rIL-12)와 혼합했다. 대조군 마우스에는 옵티말 용량(20.0 ㎍)의 QS-21과 제형된 3 ㎍ F 또는 1 ㎍ G 단백질로 프라이밍했다.
기하 평균 종말점 IgG 항체 역가의 측정(ELISA에 의해)을 위해, 1차 백신접종 4주 후에 혈청을 수집하였다. 기하 평균 혈청 중화 항체 역가는 바이러스의 A2 스트레인에 대한 플라크 감소 중화 시험에 의해 짐작되었다. 중화 역가는 보체(C)의 급원으로서 5% 기니 피그 혈청의 유(+)무(-)하에 측정하였다. 중화 역가를 웰당 병소 수에 있어 60% 감소(바이러스 대조군에 대한 상대적인 것)를 보이는 혈청 희석의 역수로서 계산하였다. JMPR 통계 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 Tukey-Kramer HSD 다중 비교에 의해 로그 변환한 후, 유의차(p<0.05)가 측정되었다. IgG의 통계학적 분석을 위해, 100 미만의 종말점 역가를 50으로 할당했다.
결과
RSV G 단백질은 BALB/c 마우스에서 Th2 헬퍼 T 세포 반응의 잠재적 유발자로 오랫동안 연구되어 왔으며, 증명되었다. rIL-12가 QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)과 시너지를 일으킬 수 있고, RSV F 단백질(표 1 & 도 1)에 의해 Th1 헬퍼 T 세포 반응을 일으킬 수 있기 때문에, Th2 T 세포 반응을 일으키는 항원(G 단백질)에 의해 유발되는 것에 대한 rIL-12의 효과가 조사되었다. QS-21은 G 단백질에 의해 유도되는 Th2 헬퍼 T 세포 반응의 우월성을 제거하지 못한다. 실험에서, 생성되는 혈청 항-G 단백질 IgG1 및 IgG2a 역가는 각각 Th2 및 Th1 헬퍼 T 세포 반응의 발생에 대한 rIL-12의 효과를 모니터링하는 데 사용되었다. 표 2에 보여진 데이터는 0.01 ㎍ rIL-12는 QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)의 보조제 성질을 보전하고, 항-G 단백질 IgG1 역가를 유도함을 증명한다. IgG1 역가는 G/PBS에 비교하였을 때 증가되었으며, 놀랍지 않게도 최적 용량(20.0 ㎍)의 QS-21으로 백신접종한 후 유발되는 것과 상이하다. 0.01 ㎍보다 더욱 큰 rIL-12의 용량으로는, 항-G 단백질 IgG1 역가의 유의차는 관찰되지 않았다. 0.01 내지 1.0 ㎍ rIL-12에 G/QS-21(0.8 ㎍)를 첨가하면 IgG2a 역가의 발생에는 영향을 미치지 않았다. 뿐만 아니라, 보체의 존재하에 측정되었던 중화 역가는 검출 불가능하고, log10 1.3보다 작았다. G 단백질+최적 용량(20.0 ㎍)의 QS-21로 백신접종한 마우스로부터의 혈청만 제외였다(중화 역가=log10 1.7). 따라서, rIL-12는 Th2 헬퍼 T 세포 반응을 일으키기 쉬운 항원에 대항하는 보조제 반응에 대한, 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)의 QS-21의 능력을 보존할 수 있음을 데이터는 입증한다.
표 2
1차 백신접종 4주 후, BALB/c 마우스내 천연 G 단백질에 대한 혈청 IgG1 역가를 일으키는 QS-21의 서브옵티말 용량의 보조제 성질을 보존하기 위한 rIL-12의 능력.
Figure 112008019162483-PAT00002
실시예 4
*폐 호산구에 대해 BALB/c 마우스를 프라이밍 하기 위해 QS-21과 공-제형된 RSV G 단백질의 능력을 보존하기 위한 rIL-12의 능력
본 실험의 목적은 rIL-12 및 QS-21을 포함하는 보조제가 어떻게 챌린지 후 폐 호산구에 대해 마우스를 프라이밍하기 위한 천연 G 단백질에 영향을 주는지 확실히 하는 것이다. 호산구는 CD4+ 헬퍼 Th2 세포 및 사이토카인, 인터루킨-5에 의존한다. 이 실험에서, 나이브 암컷 BALB/c 마우스(생후 7-10주)를 1 ㎍ 천연 G 단백질로 근육내 프라이밍했다. RSV의 A2 스트레인으로 감염된 Vero 세포로부터 면역친화 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제했고, 이는 SDS PAGE 전기 영동에 의해 측정된 것보다 95% 더 순수했다. 이 단백질을 PBS 단독으로 제조했고, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)과 혼합하거나, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)+10배로 증가하는 용량의 rIL-12(0.01, 0.1 또는 1.0 ㎍ rIL-12)과 혼합했다. 대조군 마우스에는 옵티말 용량(20.0 ㎍)의 QS-21과 혼합된 3 ㎍ F 또는 1 ㎍ G 단백질로 프라이밍했다.
1차 백신접종 4주 후 마우스를 후속적으로 챌린지했다. 비강 챌린지(0.05 ml)를 주사가능한 마취제(케타민 및 자일라진)하에 수행했다. 5일 후에 기관지 절개(BAL)를 수행했다. 호산구의 상대적인 %를 Diff-Quik(Dade International, Miami, FL)으로 염색한 슬라이드 위에서 적어도 400개 백혈구를 시험한 후에 기술된 것으로서 확인했다. JMPR 통계 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 Tukey-Kramer HSD 다중 비교에 의해 로그 변환한 후, 유의차(p<0.05)가 측정되었다.
결과
표 3에서 보여지는 결과는 점점 늘어나는 용량의 rIL-12와 공-제형된 G/QS-21(0.8 ㎍)로 프라이밍된 BALB/c 마우스를 챌린지 한 5일 후, 폐에서의 호산구 평균 %를 묘사한다. 데이터는 rIL-12가 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)의 QS-21의 보조제 성질을 향상시키고, Th2 헬퍼 T 세포 반응을 일으키는 G 단백질의 천연 성향을 촉진할 수 있음을 암시한다. G/QS-21(0.8 ㎍)에 첨가되는 rIL-12의 양이 증가함에 따라, 폐 호산구는 최적 용량(20.0 ㎍)의 QS-21과 공-제형된 G 단백질로 백신접종한 후 관찰된 것과 동등한 수준까지 통계학적으로 증가되었다. 따라서, G/QS-21(0.8 ㎍)+1.0 ㎍ rIL-12로 프라이밍된 마우스의 폐 호산구는 챌린지 후 G/QS-21(20.0 ㎍)으로 프라이밍된 것과 동등하였다. 데이터는 1.0 ㎍ rIL-12가 G/QS-21(20.0 ㎍)에 의해 생성된 Th2 헬퍼 T 세포 반응의 우월성을 감소시키지는 못함을 추가로 증명하였다. F/QS-21로 면역화하는 것은 챌린지 후, 폐 호산구에 대해 BALB/c 마우스를 감염되기 쉽게 하지 않게 하였다.
표 3. Th2 헬퍼 T 세포 반응을 생성시키기 위한 QS-21의 서브옵티말 용량과 혼합된 G 단백질의 능력에 대한 rIL-12의 효과
Figure 112008019162483-PAT00003
Figure 112008019162483-PAT00004
실시예 5
QS-21과 공-제형된 비-유형 분류 가능한 해모필러스 인플루엔자로부터의 재조합 비-리피드화 P4 단백질에 의해 유도된 전신 체액성 면역 반응에 대한 rIL-12의 영향
본 발명의 목적은, 박테리아 항원에 의해 발생되는 체액성 면역 반응에 대한, rIL-12 및 QS-21을 포함하는 보조제의 영향을 확증하는 것이다. 최종적으로, QS-21과 혼합된 경우, 비-유형 분류 가능한 헤모필러스 인플루엔자로부터의 비-지질화 재조합 P4(rP4) 단백질에 의해 유도되는 면역 반응에 대한, rIL-12의 영향이 조사되었다. 이 실험에서, 나이브 암컷 BALB/c 마우스(생후 7-10주)를 10 ㎍ rP4 단백질로 0주 및 4주에 피하 백신접종했다. 단백질을 PBS 단독으로 제조하고, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)과 혼합하거나, QS-21의 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)+10배로 증가하는 용량의 rIL-12(0.01, 0.1 또는 1.0 ㎍ rIL-12)과 혼합했다. 추가의 대조군 마우스는 최적 용량(20.0 g)의 QS-21 또는 rIL-12 없이 알루미늄 포스페이트(AIPO, 100.0 ㎍/용량)로 제형된 rP4 단백질로 면역화했다. 1차 및 2차 백신접종 한 후, 각각 4 및 2주 후에, 기하 평균 종말점 IgG 역가의 측정(ELISA에 의한)을 위해 혈청을 수집했다. JMPR 통계 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 Tukey-Kramer HSD 다중 비교에 의해 로그 변환한 후, 유의차(p<0.05)가 측정되었다.
결과
표 4에 보여지는 결과는 QS-21의 서브옵티말 용량과 함께 rIL-12가 작용할 수 있고, 박테리아 항원, 비-유형 분류 가능한 H. 인플루엔자의 P4 단백질에 의해 생성되는 전신 체액성 면역 반응을 증대시킬 수 있음을 증명한다. rIL-12 없이 rP4/QS-21(0.8 ㎍)로 면역화했을 때에 비해, rP4/QS-21(0.8 ㎍/용량)+0.01, 0.1, 또는 1.0 ㎍ rIL-12로 면역화한 것은 2차 백신접종 2주 후, 상당히 큰 혈청 항-rP4 IgG2a 역가를 초래한다. IgG2a 역가는 또한 rP4/AIPO로 백신접종한 후에 생성되는 것보다 상당히 크다. 이들 역가는 rIL-12 없이 최적 용량(20.0 ㎍)의 QS-21과 혼합된 rP4 단백질에 의해 유도되는 마우스의 그것과 별로 차이나지 않는다. QS-21의 서브옵티말 용량과 혼합된 rP4 단백질에 1.0 ㎍ rIL-12를 첨가하는 것은 또한, rP4/PBS 또는 rP4/AIPO로 백신접종한 것에 비교한 경우, 상당히 증가된 IgG1 역가를 초래한다. 따라서, 데이터는 박테리아 및 바이러스 항원 모두에 대해, rIL-12는 서브옵티말 용량(0.8 ㎍)의 QS-21의 보조제 성질을 증대시킬 수 있음을 확증한다. 1차 백신접종 4주 후에 항-rP4 IgG 역가에서 통계학적으로 유의차는 없었다.
표 4
BALB/c 마우스에서 전신 체액성 면역 반응을 일으키는 QS-21의 서브옵티말 용량과 공-제형된 비-유형 분류 가능한 헤모필러스 인플루엔자의 rP4 단백질의 능력에 대한 rIL-12의 효과
Figure 112008019162483-PAT00005
*실시예 6
QS-21과 혼합한 비-유형 분류 가능한 헤모필러스 인플루엔자로부터의 재조합 리피드화 P4 단백질에 의해 발생한 전신 체액성 면역 반응에 대한 rIL-12의 영향
본 실험의 목적은 리피드화 박테리아 항원에 의해 유발된 체액성 면역 반응에 대한 rIL-12 및 QS-21을 포함하는 보조제의 효과를 측정하는 것이다. 결국, 비-유형 분류 가능한 헤모필러스 인플루엔자로부터의 재조합 리피드화 P4(rLP4) 단백질에 의해 유도되는 면역 반응에 대한 rIL-12 및 QS-21의 효과를 시험했다. 실험에서, 나이브 암컷 BALB/c 마우스(생후 8-10주)를 rLP4 단백질 5 ㎍으로 0 및 4주에 근육내 백신접종했다. 단백질을 PBS 단독으로, QS-21의 5배로 증가하는 용량(0.8 내지 20 ㎍), 10배로 증가하는 용량의 쥐 rIL-12(0.01, 0.1 또는 1.0 ㎍ rIL-12)와 혼합하여, 또는 QS-21 및 rIL-12의 배합물로 제조했다. 1차 및 2차 백신접종 후에 각각, 4 및 2주 후에, 기하 평균 종말점 IgG 역가의 측정(ELISA에 의해)을 위해 혈청을 수집했다. JMPR 통계 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 Tukey-Kramer HSD 다중 비교에 의해 로그 변환한 후, 유의차(p<0.05)가 측정되었다.
결과
표 5와 표 6은 각각 1차 및 2차 백신접종 4 및 2주 후의 항-rLP4 IgG 역가를 묘사한다. 결과는, QS-21 및 rIL-12 단독은 rLP4에 대한 체액성 면역 반응의 발생을 향상시키기 위한 훌륭한 보조제임을 증명한다. 이는 증가된 항-rLP4 IgG2a 역가에 의해 최상으로 관찰되었다. 예를 들면, rLP4/rIL-12(0.01 ㎍) 또는 rLP4/rIL-12(1.0 ㎍)로 프라이밍된 마우스의 역가를 면역화한 후, 4주 후에는 PBS 단독(표 5)으로 제조된 rLP4로 주사한 마우스로부터의 혈청과 비교했을 때 10배 내지 100배 각각 증가되었다. 마찬가지로, rLP4/QS-21(4.0 ㎍) 또는 rLP4/QS-21(20.0 ㎍)로 프라이밍된 마우스의 IgG2a 역가는 100배(표 5)로 증대되었다. 2차 백신접종(표 6) 2주 후에 유사한 결과가 관찰되었다. 그러나, 리피드화 박테리아 항원에 대해서는, rIL-12 및 QS-21의 서브옵티말 용량이 배합되어 사용된 경우에, 어떠한 시너지도 보이지 않았다.
표 5
QS-21+IL-12로 공-제형된 rLP4 단백질로 1차 면역화한 4주 후 BALB/c 마우스의 혈청 IgG 역가
Figure 112008019162483-PAT00006
Figure 112008019162483-PAT00007
표 6
QS-21+IL-12로 공-제형된 rLP4 단백질로 2차 면역화한 2주 후 BALB/c 마우스의 혈청 IgG 역가
Figure 112008019162483-PAT00008
Figure 112008019162483-PAT00009
본 발명은 바람직한 양태를 참조로 하여 구체적으로 제시되고 설명되었지만, 당업자는 첨부되는 청구의 범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위에서 일탈하지 않고 다양한 형태로 자세히 변화시킬 수 있는 것으로 이해할 것이다.
도 1a-1f는 rIL-12 및 QS-21로 공-제형된 RSV F 단백질로 백신접종한 BALB/c 마우스의 비장내 항원 의존 킬러 세포 전구체를 보인다. 도 1a-1f에서, F 단백질을 1.0 ㎍ rIL-12/용량(채워진 원) 또는 PBS 단독(열린 원)으로 제조했다. 백신을 20.0(도 1a), 4.0(도 1b), 0.8(도 1c) 또는 0.0(도 1d) ㎍의 QS-21/용량과 공-제형했다. 대조 마우스(도 1e)에 PBS 단독내의 QS-21(20 ㎍, 열린 사각형)로 주사하였으며, 또는 RSV의 A2 스트레인으로 실험적으로 감염시켰다(~2X106 PFU, 열린 삼각형). 도 1f는 F 단백질이 PBS 단독에서 제조되었거나, 또는 0.8 ㎍ QS-21 및 rIL-12의 감소하는 용량(1.0 내지 0.01 ㎍)과 제조된 분리 실험을 묘사한다. 효과기 세포를 RSV-감염(굵은 선 또는 채워진 막대기)과, 항원 의존 킬러 세포 활성에 대한 대조군(대시 또는 열린 막대기) 시너지 표적 세포에 대해 시험하였으며; 효과기 대 표적의 비는 100:1이었다.
<110> AMERICAN CYANAMID COMPANY <120> QS-21 AND IL-12 AS AN ADJUVANT COMBINATION <130> ACY33390-00 <150> PCT/US01/19805 <151> 2001-06-21 <150> 60/213143 <151> 2000-06-22 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25

Claims (11)

  1. i) 면역원성의 증가가 요구되는 비-지질화(non-lipidated) 박테리아 또는 바이러스 항원,
    ii) 약학적으로 허용가능한 담체, 및
    iii) 상승 작용(synergistic effect)을 갖는 0.8 ㎍의 QS-21 및 0.01 ㎍ 내지 1.0 ㎍의 IL-12의 배합으로 이루어지는 보조제형물
    을 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-12는 재조합 인간 IL-12인 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 보조제형물 내의 IL-12는 0.01 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 보조제형물 내의 IL-12는 0.05 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 보조제형물 내의 IL-12는 0.1 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 보조제형물 내의 IL-12는 0.5 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 보조제형물 내의 IL-12는 1.0 ㎍의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항원은 박테리아 단백질인 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원은 비-유형분류 가능한(non-typable) 헤모필러스 인플루엔자 P4 단백질인 면역원성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 단백질인 면역원성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항원은 호흡기 합포체 바이러스 F 단백질인 면역원성 조성물.
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