JP2002542204A

JP2002542204A - ストレプトコッカス・ニューモニエ及び呼吸性シンシチウムウィルス（ｒｓｖ）に対する複合ワクチン

Info

Publication number: JP2002542204A
Application number: JP2000611937A
Authority: JP
Inventors: デシャン，マルゲリテ; ラフェルリール，クレ，アントニー，ジョセフ
Original assignee: スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 1999-04-20
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2002-12-10
Also published as: MY125000A; TR200103012T2; CN1192797C; TWI234463B; EP1171159B1; WO2000062801A3; AU5523300A; ES2304960T3; GB9909077D0; ATE395079T1; DE60038877D1; BR0010682A; IL145981A0; ZA200108620B; AU754101B2; KR100632835B1; HK1045100A1; HUP0201905A2; NO20015074D0; NO20015074L

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ａ）タンパク質若しくはペプチドと複合している、又は複合していない、そのいずれかの１又は複数のストレプトコッカス・ニューモニエの多糖；及び（ｂ）ＲＳＶ抗原を、Ｔｈ１型免疫応答の優先的な刺激因子であるアジュバントと一緒に含んで成るワクチン組成物に関する。本発明によって提供される組み合わせたワクチンは、子供及び高齢者にとって特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明は新規ワクチン製剤、それを製造する方法並びに予防及び治療におけ
るその使用に関する。特に、本発明は子供及び高齢者への投与のための複合ワク
チンに関する。更に具体的には、本発明はストレプトコッカス・ニューモニエ及
び呼吸性シンシチウムウィルス（ＲＳＶ）の感染又は疾患に対する防護のための
複合ワクチンに関する。

【０００２】ストレプトコッカス・ニューモニエは、特に若者及び老齢者のかなりの罹病及
び死亡の原因であるグラム陽性細菌である。特に幼い子供の気道及び中耳の膨張
性転移増殖は、米国の病院に通院する、一致した最も一般的な原因である。前記
細菌は侵入性となり、下方の肺に感染し、そして肺炎を引き起こすことがある。
米国における６０才以上の人々の肺炎球菌性肺炎の割合は１００，０００人当た
り３〜８人であると見積もられている。２０％の症例において、これは菌血、及
び他の徴候、例えば髄膜炎を導き、そして抗生物質処置にもかかわらず３０％近
い死亡率を伴う。ストレプトコッカス・ニューモニエの９０の知られている血清
型が存在し、これは前記細菌を覆う莢膜の多糖の構造によって決定され、そして
これはその主要な毒性因子である。

【０００３】１７価の肺炎球菌ワクチン（Ｍｏｎｉａｒｉｘ）が、侵入性の疾患に最も一般
的に関与している肺炎球菌の血清型の精製された多糖に基づいて知られている。
これら多糖の精製方法は欧州特許第７２５１３Ｂ１号に開示された。低い結合価
のワクチンを用いるワクチンの有効性試験は、前記の複合に存在する血清型に関
して、７０〜９０％の有効性を示した。１４価のワクチンを用いての、５５才以
上の人の米国における症例の比較試験は、７０％の有効性を示した（Mills, O.F
., and Rhoads, G.G; J. Clin. Epidermiol. (1996); Vol. 49 (6) 631-636）。
追加の多糖の含有（２３価の肺炎球菌ワクチンを製造すること）は、十分な血清
学的な反応に基づき認められたが、臨床的な有効性のデータを欠いていた（K.R.
Brown In“Combined. Vaccines and Simultaneous Administration”, Ed. Wil
liams et al. New York Academy of Sciences 1995 pp 241-249）。

【０００４】２３価の肺炎球菌ワクチン（Pnu-Immune 23-Lederle USA)及びインフルエンザ
ワクチン（Ｆｌｕａｒｉｘ）による同時の免疫感作が研究され（TJ Fletcher, T
W Tunnicliffe, K Hammond, K Roberts, JG Ayres; (1997) Br. Med. J. 314. 1
663)、そして有意な免疫学的差異が、同時の免疫感作、又は１ヶ月間を空けた免
疫感作の間に示されなかった。

【０００５】肺炎球菌の多糖は、タンパク質担体にそれを化学的に結合させることによって
、幼児において更なる免疫原性を与えることができる。臨床的な有効性の試験は
、幼児の中耳炎の予防における有効性のためのこの概念を証明するために行われ
ている。

【０００６】７〜１０価の複合肺炎球菌ワクチンで初回刺激を受けた幼児は、前記血清型の
適用範囲及びＩｇＧ濃度を増大させるために、２３価の単純多糖肺炎球菌ワクチ
ンで高められることがある（Block, SL, JA. Hedrick, R.A. Smith, R.D. Tyler
, M. Giordani, M.D. Blum, J. Sadoff, E. Keegan; Abstract G-88, 37^th ICAA
C, Toronto (1997); Anderson, E.L., Kennedy, D.J., Geldmacher, K.M., Donn
elly, J., Mendelman, P; The Journal of Paediatrics, May 1996. Vo. 128; n
°5, Part 1, 649-653）。

【０００７】ヒト呼吸性シンシチウムウィルス（ＲＳＶ）は、ウィルスのパラミクソウィル
ス科ファミリーのメンバーであり、そして特に幼い子供及び乳児において、下気
道の疾患を引き起こす。最近の報告は、ＲＳＶが成人、特に高齢者における重大
な病原であることを示している。

【０００８】ＲＳＶはそれぞれが単一のポリペプチドをコードする、１０個のメッセンジャ
ーＲＮＡをコードする１５，２２２のヌクレオチドの、区分されていない、負の
らせんのリボ核酸（ＲＮＡ）のゲノムを有する、エンベロープ型ウィルスである
。前記の１０個のタンパク質のうち３つは膜貫通表面タンパク質：Ｇ（付着）、
Ｆ（融合）及びＳＨタンパク質である。２つのタンパク質がビリオンマトリック
スタンパク質（Ｍ及びＭ２）であり、３つのタンパク質がヌクレオキャプシド（
Ｎ，Ｐ及びＬ）の成分であり、そして２つのタンパク質が非構造性（ＮＳ１及び
ＮＳ２）である。ＲＳＶの２つの抗原的に異なる菌株が存在し、菌株Ａ及びＢと
表わされる。これらの群に由来する菌株の特徴は、重大な差異が前記のＧタンパ
ク質に存在し、一方前記Ｆタンパク質は保存されていることを決定した。

【０００９】呼吸性シンシチウムウィルス（ＲＳＶ）は季節的な大発生において発生し、温
帯性の気候における冬の間、及び温暖な気候における雨季の間がピークである（
DeSilva LM & Hanlon MG. Respiratory Syncytial Virus : a report of a 5-ye
ars study at a children's hospital. J Med Virol 1986; 19 : 299-305）。ど
この地域でも、ＲＳＶは一定かつ予測可能なパターンを有する傾向があり、そし
て大発生において生ずる他の呼吸性ウィルスの病原体は、めったに同時に存在し
ない（Glezen WP & Denny FW. Epidemiology of acute lower respiratory dise
ase in children. N. Engl. J. Med. 1973; 288 : 498-505）。

【００１０】ＲＳＶは子供の深刻な下気道の疾患の主要な原因である。細気管支炎で入院し
た子供の４０〜５０％及び肺炎で入院した子供の２０〜２５％が、ＲＳＶ感染の
直接的な結果として入院していると見積もられる。主なＲＳＶの感染は、通常１
才以下の子供において起こり；９５％の子供が２才までに過去の感染の血清学的
な証拠を有し、そして前記母集団の１００％が成人までに感染した。

【００１１】幼児及び幼い子供において、感染は症例の約４０％において上気道から下気道
へと進行し、そして臨床的な徴候は細気管支炎又は肺炎のものである。２〜６ヶ
月の子供は、ＲＳＶによる感染の深刻な徴候（主に呼吸系の疾患）の進行のとて
も大きな危険性があるが；潜在的な心臓又は肺の疾患を有するあらゆる年齢の子
供、早産の幼児、及び免疫無防備状態の子供は、更に深刻な合併症の危険性があ
る。

【００１２】徴候的な再感染は生涯を通じて起こり、そしてＲＳＶが特に高齢者にとって、
更に重大な成人の病原体であることが段々明らかになってきた。

【００１３】ＲＳＶの感染が成人においてほぼ間違いなく診断されないのは、主にそれが子
供の感染症であると考えられているからである。従って、成人における前記ウィ
ルスの証拠は呼吸系の病気を説明するために探索されない。更に、前記ウィルス
に対してある程度の部分的な免疫を有する個体由来の鼻の分泌液において、ＲＳ
Ｖを同定することは難しく、これは成人の大部分が免疫を有するためである。若
者から中年までの大人は、ＲＳＶに感染した場合、典型的に持続性の風邪様症候
群が発現する。高齢の個体は延長される呼吸器系の症候群を発現することがあり
、これは事実上インフルエンザと区別がつかず、肺炎を含む、下気道に関連して
いるものが付随することがある上気道系症候群を伴う。施設に収容されている高
齢者の集団が特に心配されるのは、それらが互いに密集した多くの感染しやすい
個体を含んで成るからである。その様な集団を通じての感染の蔓延は、彼等の多
くが、前記の病気のより深刻な進行に自身を感染しやすくし得るという複数の医
学的な問題を抱えており、調節することは困難である。

【００１４】更に、ＲＳＶ感染の衝撃を評価する最近の研究の報告は、成人及び共同施設に
住む健康な高齢者の入院の原因として、更にこれらの集団における深刻な下気道
の疾患におけるＲＳＶ感染の重大な役割を指摘している（Dowell SF, Anderson
LJ, & Gary Jr HE, et al. J. Infect Dis 1996; 174 : 456-462; Falsey AR, C
unningham CK, & Barker WH, et al. J. Infect Dis 1995; 172 : 389-394)。Do
wellは、深刻な下気道疾患を引き起こし、成人の入院をもたらす４つの最も一般
的な病原体の１つとしてＲＳＶを同定した（Dowell SF, Anderson LJ, & Gary J
r HE, et al. J. Infect Dis 1996; 174 : 456-462）。Falseyは、高齢者におけ
る深刻なＲＳＶ感染が、老人ホーム又は大発生の状況に限定されないことを示し
た。むしろ、ＲＳＶ感染は共同体に住む高齢の患者の間の深刻な病気の、予測可
能な原因である。インフルエンザＡの入院に類似して、ＲＳＶ感染に関係してい
るものは、病院の滞在の延長、高い集中治療の入院率、及び高い換気装置の支持
率によって証明される様な、事実上の罹病率に関連していた（Falsey AR, Cunni
ngham CK, & Barker WH, et al. J. Infect Dis 1995; 172 : 389-394)。

【００１５】これらの研究は、幼児、成人並びに共同施設に住む健康かつ特殊施設に収容さ
れた高齢者、その両方のＲＳＶ感染の深刻な合併症を予防することができる有効
なワクチンの医学的及び経済的な必要性を指摘する。

【００１６】組換えサブユニットワクチン又は死菌ワクチンにとって、アジュバントの使用
は主に重要である。ミョウバンは、ヒトの使用のために最近認可された唯一のア
ジュバントである。しかしながら、ミョウバンは体液性応答に対して限定された
アジュバント効果を有し、そして主にＴｈ２型免疫応答を誘導することが知られ
ている（Byars NE, Nakano G, & Welch M, et al. Vaccine 1991; 9 : 309-318
）。しかしながら、ミョウバンと組合わせた３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリ
ル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）は体液性応答を向上させ、そして優先的にＴｈ１型の
免疫性を刺激することが見出された。３Ｄ−ＭＰＬを有するアルミニウム塩のア
ジュバントはミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬとして表わされる。

【００１７】本発明は：（ａ）タンパク質又はペプチドに複合しているか、あるいは複合していない１又
は複数のストレプトコッカス・ニューモニエ：及び（ｂ）ＲＳＶ抗原を、Ｔｈ１型応答の優先的な刺激因子であるアジュバントと一緒に含んで成る組成物
を提供する。

【００１８】複合ワクチンに対する傾向は、受容者の苦痛を軽減し、日程の作製を容易にし
、そして養生法の完了を確実にすることの利点を有するが；ワクチンの有効性を
減少させる、付随の危険性も存在する。従って、個体群の要求に合致し、そして
更に互いに干渉しないワクチンの組合わせを生成することは有利であるだろう。
ワクチンの組合わせが結果として１又は両方のワクチン有効性の向上を有する共
同作用をもたらすか、あるいは１又は両方のワクチンの防護の相関物を向上する
ならば更に有利であるだろう。このことは本発明のワクチン組成物によって達成
され、これは特にストレプトコッカス・ニューモニエ、及び／又はＲＳＶの感染
の危険性があるであろう子供又は高齢者への投与にとって、大きな利益である。

【００１９】任意に、本発明のワクチン組成物は、１又は複数のいくつかの他の抗原、例え
ばインフルエンザウィルス抗原を更に含んで成る。現在利用可能なインフルエン
ザワクチンは、全体を弱毒化したウィルスのワクチン、スプリット粒子ワクチン
、及びサブユニットワクチンを含む。あらゆる種類のインフルエンザワクチンが
、通常３価のワクチンである。それらは２つのインフルエンザＡウィルスの菌株
及び１つのインフルエンザＢの菌株を含む。それらの大部分の標準的な０．５ml
投与量は、各菌株由来の１５μｇのヘマグルチニン成分を含む。

【００２０】インフルエンザワクチンに組入れられるべき前記菌株の決定手順は世界保健機
構、国家の保健当局及びワクチン製造業者の間の協調を含む複雑な過程である。

【００２１】肺炎球菌の多糖は、それらをタンパク質の担体に化学的に結合させることによ
って更に免疫原性を与えられることがあり、そして臨床学的な有効性の試験は幼
児の中耳炎の予防における有効性にとっての、この概念を証明するために行われ
ている。

【００２２】免疫原性多糖コンストラクトの製造のために一般に使用される２つの複合方法
：（１）炭水化物とタンパク質との直接的複合；並びに（２）二機能性リンカー
又はスペーサー試薬を経由する炭水化物とタンパク質との間接的複合がある。一
般に、直接的及び間接的複合、その両方が誘導化前に前記炭水化物部分の化学的
活性化を必要とする。例えば米国特許第５，６５１，９７１号及びDick & Beurr
et, “Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens”, Conjugate Va
ccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds), Vol. 10, 48-114 (1989）を参照のこ
と。

【００２３】本発明に従う組成物におけるストレプトコッカス・ニューモニエの多糖は、好
ましくは複合した形態において存在するが、必ずしもそうではない。複合してい
ないＳ．ニューモニエの多糖は除外されない。

【００２４】ストレプトコッカス・ニューモニエの多糖は、複合しているならばタンパク質
又はペプチドのいずれかに複合する。多糖の抗原はいくつかのＴヘルパータンパ
ク質に複合されてきた。これらはＴヘルパーのエピトープを提供する。代表的な
タンパク質はジフテリア毒素、破傷風毒素、及びプロテインＤ又はヘモフィルス
・インフルエンザＢ（ＨａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ）由
来のその脂質化した誘導リポプロテインＤを含む。他の適当なタンパク質担体は
、ジフテリアＣｒｍ１９７及びインフルエンザ由来の主要な非構造性タンパク質
、ＮＳ１（特にアミノ酸１−８１）を含む。

【００２５】プロテインＤは本発明に従うワクチンの好ましい成分であり、これにストレプ
トコッカス・ニューモニエの多糖が複合される。プロテインＤのフラグメントも
また適している。プロテインＤは欧州特許第０５９４６１０号に記載されて
いる。使用に適したフラグメントはＴヘルパーのエピトープを包含するフラグメ
ントを含む。特にプロテインＤのフラグメントは、好ましくは前記タンパク質の
Ｎ末端の１／３を含むだろう。

【００２６】驚いたことに、本発明に従う組成物における、ＲＳＶ抗原とプロテインＤ−複
合ストレプトコッカス・ニューモニエの多糖とを組合わせることが前記複合体の
プロテインＤ成分に対する免疫応答に影響しないことが更に明らかになった。プ
ロテインＤは分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザＢ（ＮＴＨｉ）感染に
対する防御抗原である。

【００２７】従って、本発明は更に、ＲＳＶ抗原及びプロテインＤ又はそのフラグメントに
複合した少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエの多糖を、任意に
アジュバント、例えばＴｈ１アジュバントと一緒に含んで成るワクチンを提供す
る。

【００２８】典型的に本発明のワクチンのストレプトコッカス・ニューモニエ成分は、多糖
抗原を含んで成り（好ましくは複合したもの）、ここで前記の多糖は少なくとも
４つの肺炎球菌の血清型に由来するだろう。好ましくは、前記の４つの血清型は
６Ｂ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆを含む。更に好ましくは、少なくとも７つの血清
型が前記組成物に含まれ、例えば血清４，６Ｂ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ及
び２３Ｆに由来するものである。より更に好ましくは、少なくとも１１の血清型
が前記組成物に含まれ、例えば１つの態様における本組成物は、血清型１，３，
４，５，６Ｂ，７Ｆ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ及び２３Ｆ（好ましくは複合
したもの）に由来する莢膜多糖を含む。本発明の好ましい態様において、少なく
とも１３又は少なくとも１５又は少なくとも１７の多糖抗原（好ましくは複合し
たもの）が含まれるが、更に多糖抗原、例えば２３価（例えば血清型１，２，３
，４，５，６Ｂ，７Ｆ，８，９Ｎ，９Ｖ，１０Ａ，１１Ａ，１２Ｆ，１４，１５
Ｂ，１７Ｆ，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ，２０，２２Ｆ，２３Ｆ及び３３Ｆ）もま
た本発明によって考慮される。

【００２９】高齢者のワクチン接種（例えば肺炎の予防のため）にとって、１５価のワクチ
ンを形成するために、上述した１１価の抗原性組成物に対する血清型８及び１２
Ｆ（並びに最も好ましくは更に１５及び２２）を含めることは有利であり、一方
幼児又はよちよち歩きの幼児にとって（より関心があるのが中耳炎である場合）
、血清型６Ａ及び１９Ａは１３価のワクチンを形成するために有利に含まれる。

【００３０】本発明に従うワクチンの包含に適当なＲＳＶ抗原は、不活性化ＲＳＶウィルス
、例えば化学的に弱毒化した、例えばホルマリンで弱毒化したＲＳＶウィルスを
含む。例えば、前記不活性化ウィルスは例えば継代又は遺伝子操作によって弱毒
化された弱毒化ＲＳＶから製造することができ、あるいは野生型ＲＳＶから製造
することができる。組換えＲＳＶを使用することができ、これは異なる菌株のＲ
ＳＶ由来のエンベロープ抗原を含めるように操作されたものであり、例えば中心
となるものがＲＳＶの菌株Ａのものであり、ＲＳＶＢのエンベロープタンパク
質を有するものであり、任意に弱毒化される。

【００３１】適当なＲＳＶ抗原は以下のものを含み、特に前記のＲＳＶウィルス由来の抗原
、好ましくはヒトＲＳＶエンベロープ糖タンパク質、例えばＲＳＶＦ若しくは
Ｇタンパク質又は例えば米国特許第５，１４９，６５０号に開示された様なそれ
らの免疫原性フラグメント、あるいはＲＳＶＦ及びＧタンパク質の両方に由来
する少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含んで成るキメラポリペプチドで
あり、ここで例えば米国特許第５，１９４，５９５号で開示された様なＲＳＶ
ＦＧキメラタンパク質が有利であり、好ましくはＣＨＯ細胞で発現する。

【００３２】好ましくは、前記ＲＳＶ抗原はＲＳＶエンベロープタンパク質又はその誘導体
である。好ましくは、前記抗原はＲＳＶの菌株Ａに由来する。あるいは、前記抗
原は菌株Ｂに由来することがあり、又は前記組成物において菌株Ａ及びＢのそれ
ぞれに由来の抗原で存在することがある。好ましい抗原はＦ糖タンパク質、Ｇ糖
タンパク質、あるいはＦＧ融合タンパク質又はその免疫原性誘導体から選択され
る。

【００３３】典型的に、免疫原性誘導体は、前記タンパク質が膜貫通ドメインを欠いたもの
、すなわちＦΔｔｍ，ＧΔｔｍ及びＦΔｔｍＧΔｔｍを含む。好ましくは、シグ
ナル配列は前記Ｇタンパク質から欠失している。前記Ｆ又はＧタンパク質の細胞
外ドメインの少なくとも約５０％又は少なくとも約８０％（隣接配列）が存在す
るのが好ましい。具体的な例は、前記Ｆタンパク質の１〜５２６又は１〜４８９
アミノ酸、前記Ｇタンパク質のアミノ酸６９〜２９８又は代わりの位置９７〜２
７９、及びＦ_1-526 Ｇ_69-298融合タンパク質を含む。別の融合体はＦ由来の１〜
４８９アミノ酸、それに続くＧタンパク質の９７〜２７９を含んで成る。

【００３４】本発明に従うＲＳＶ／ストレプトコッカス・ニューモニエのワクチン組成物は
、免疫系の細胞性部分を補助するための応答の、Ｔｈ１型の優先的なインデュー
サーであるアジュバントを含んで成る。

【００３５】免疫応答は免疫系の細胞と抗原の相互作用を通じて、抗原に対して起こる。結
果として生ずる免疫応答を、広く２つの大きなカテゴリーに分けることができ、
これは体液性又は細胞性免疫応答である（それぞれ伝統的に抗体及び細胞のエフ
ェクターによる防御機構を特徴とする）。これらの応答のカテゴリーは、Ｔｈ１
型応答（細胞性応答）、Ｔｈ２型免疫応答（体液性応答）と称されてきた。

【００３６】極度なＴｈ１型免疫応答は、抗原特異的な、ハプロタイプ制限細胞毒性Ｔリン
パ球、及びナチュラルキラー細胞の応答の産生を特徴とすることがある。マウス
において、Ｔｈ１型応答は、しばしばＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の産生を特徴
としており、一方ヒトにおいて、これらはＩｇＧ１型の抗体に相当する。Ｔｈ−
２型免疫応答は、マウスにおけるＩｇＧ１，ＩｇＡ及びＩｇＭを含む広範な免疫
グロブリンのイソ型の産生を特徴とする。

【００３７】これら２つの型の免疫応答の展開の背後に働く力はサイトカインであるとみな
すことができ、これは免疫系の細胞を助け、そして来たるべき免疫応答をＴｈ１
又はＴｈ２のいずれかの応答に進めることを行う、いくつかの同定されたタンパ
ク質メッセンジャーである。従って、高レベルのＴｈ１型サイトカインは、前記
の与えられる抗原に対する細胞性免疫の誘導に有利な傾向があり、一方高レベル
のＴｈ２型サイトカインは前記抗原に対する体液性免疫の誘導に有利な傾向があ
る。

【００３８】Ｔｈ１及びＴｈ２型の免疫応答の違いは絶対ではないことを覚えておくことは
重要である。現実において、支配的にＴｈ１又は支配的にＴｈ２であるとして記
述される免疫応答をそれぞれが支持するだろう。しかしながら、マウスのＣＤ４
＋ｖｅＴ細胞クローンにおいてＭｏｓｍａｎｎ及びＣｏｆｆｍａｎによって記述
されたものからサイトカインのファミリーを判断することはしばしば都合が良い
（Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells : different p
atterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.
Annual Review of Immunology, 7, p145-173)。伝統的に、Ｔｈ１型応答はＴリ
ンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの産生に関係している。Ｔｈ
１型の免疫応答の誘導にしばしば直接的に関係する他のサイトカインは、Ｔ細胞
によって産生されず、例えばＩＬ−１２である。対照的に、Ｔｈ２型の応答はＩ
Ｌ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１０及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）と
関係している。

【００３９】あるワクチンのアジュバントがＴｈ１又はＴｈ２型のいずれかのサイトカイン
の応答の刺激に特に適していることが知られている。伝統的に、ワクチン接種又
は感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２の平衡の最良の指標は、抗原による再刺激
後のｉｎｖｉｔｒｏでのＴリンパ球によるＴｈ１又はＴｈ２のサイトカインの
産生の直接的測定、及び／又は抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比
率の測定を含む。

【００４０】従って、Ｔｈ１型アジュバントはｉｎｖｉｔｒｏでの抗原による再刺激の際
に、高レベルのＴｈ１型サイトカインを産生する単離されたＴ細胞集団を刺激し
、そしてＴｈ１型イソ型と関連する抗原特異的免疫グロブリン応答を誘導するも
のである。支配的にＴｈ１応答を促進する適当なアジュバント系はモノホスホリ
ル脂質Ａ又はその誘導体、特に３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ、
及びモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル
脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組合わせを含む。更に適当なアジ
ュバント系を以下に記述する。

【００４１】その様なアジュバントは、例えば国際特許出願番号ＷＯ９４／００１５３及び
ＷＯ９５／１７２０９に記載されている。

【００４２】３Ｄ−ＭＰＬは英国特許第２２２０２１１号に記載されている（Ｒｉｂｉ）。
化学的に、それは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと４，５又は６
位のアシル化鎖との混合物であり、そしてRibi Immunochem Montana によって製
造される。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、欧州
特許ＥＰ０６８９４５４Ｂに開示されている。

【００４３】好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの粒子サイズは、０．２２マイクロンの膜を通して
濾過滅菌するのに十分なほど小さい（欧州特許ＥＰ０６８９４５４に記載
）。

【００４４】３Ｄ−ＭＰＬは、通常投与量当たり１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２５〜
５０μｇの範囲内で存在し、ここで前記抗原は投与量当たり２〜５０μｇの範囲
内に存在するだろう。

【００４５】別の好ましいアジュバントは、Ｈｐｌｃ精製した、Quillaja Saponaria Molin
a の樹皮由来のサポニンの無毒性画分、ＱＳ２１を含んで成る。任意に、これを
３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）と、任意に担体
と一緒に混合することができる。

【００４６】ＱＳ２１の製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に（ＱＳ２１として
）開示されている。

【００４７】ＱＳ２１を含む非反応性のアジュバント製剤が国際公開第９６／３３７３９号
に記載されている。ＱＳ２１及びコレステロールを含んで成る、その様な製剤は
、抗原と一緒に調製された場合、成功的なＴｈ１を刺激するアジュバントである
ことが示されてきた。従って、本発明の一部を形成するワクチン組成物はＱＳ２
１及びコレステロールの組合わせを含む。

【００４８】更にＴｈ１応答の優先的な刺激因子であるアジュバントは、免疫調節的オリゴ
ヌクレオチド、例えば国際公開第９６／０２５５５号に開示されているメチル化
されていないＣｐＧ配列を含む。

【００４９】異なるＴｈ１を刺激するアジュバントの組合わせ、例えば上述したものはまた
、Ｔｈ１型応答の優先的な刺激因子であるアジュバントを提供すると考えられて
いる。例えば、ＱＳ２１（好ましくはコレステロールも有する）を、３Ｄ−ＭＰ
Ｌと一緒に調製することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比率は、典型的に
１：１０〜１０：１程度、好ましくは１：５〜５：１であり、そしてしばしば事
実上１：１であるだろう。適当な共同作用にとって好ましい範囲は２．５：１〜
１：１の３ＤＭＰＬ：ＱＳ２１である。

【００５０】好ましくは、担体もまた本発明に従うワクチン組成物中に存在する。前記担体
は水中油乳濁液、又はアルミニウム塩であってもよい。

【００５１】好ましい水中油乳濁液中は代謝可能な油、例えばスクアレン、アルファトコフ
ェロール及びｔｗｅｅｎ８０を含んで成る。更に前記水中油乳濁液はＳｐａｎ８
５及び／又はレシチン及び／又はトリカプリリンを含んでもよい。

【００５２】好ましい観点において、水酸化アルミニウム（ミョウバン）又はリン酸アルミ
ニウムは、免疫原性を増大せしめるために本発明の組成物に加えられるだろう。

【００５３】特に好ましい観点において、本発明に従うワクチン組成物中の抗原は、３Ｄ−
ＭＰＬ及びミョウバンと組合わされる。

【００５４】典型的に、ヒトの投与のために、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬは、投与量当たり
１μｇ〜２００μｇ、例えば１０〜１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇ
の範囲においてワクチン中に存在するだろう。典型的に、前記の水中油は２〜１
０％のスクアレン、２〜１０％のアルファトコフェロール及び０．３〜３％のｔ
ｗｅｅｎ８０を含んで成るだろう。好ましくは、スクアレン：アルファトコフェ
ロールの比率が等しいか又は１以下であるのは、これがより安定な乳濁液を提供
するからである。Ｓｐａｎ８５もまた、１％の濃度で存在することがある。いく
つかの場合において、本発明のワクチンが更に安定化剤を含むであろうことは有
利であるだろう。

【００５５】非毒性の水中油乳濁液は、好ましくは水性担体中の非毒性の油、例えばスクア
ラン又はスクアレン、乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ８０を含む。前記水性担体は、
例えばリン酸緩衝塩溶液であることがある。

【００５６】水中油乳濁液においてＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む、特
に強力なアジュバント製剤は、国際公開第９５／１７２１０号に記載されている
。

【００５７】本発明のワクチンは前記抗原の免疫防御的な量を含み、そして常用の技術によ
って製造することができる。

【００５８】ワクチンの調製法はPowell及びNewman編集のPharmaceutical Biotechnology,
Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Plenurn Press,
1995; Voller等編集のNew Trends and Developments in Vaccines, University
Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に一般的に記載されている。
リポソーム内にカプセルで包むことは、例えばＦｕｌｌｅｒｔｏｎによって米国
特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の複合は
、例えばＬｉｋｈｉｔｅによって米国特許第４，３７２，９４５号に及びＡｒｍ
ｏｒ等によって米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。

【００５９】各ワクチンの投与量におけるタンパク質量は、典型的なワクチンにおける重大
な、有害の副作用の無い免疫防御応答を誘導する量として選択される。その様な
量は、適用される特異的な免疫原に依存して変化するだろう。一般に、各投与量
は１〜１０００mgのタンパク質、好ましくは２〜１００mg、最も好ましくは４〜
４０mgを含んで成るだろう。特定のワクチンにとって適当な量を、抗体の力価及
び対象者における他の応答の観察を含む標準的な研究によって確かめることがで
きる。最初のワクチン接種の後、対象者は約４週間の追加免疫を受けることがあ
る。特に幼児にとって３回の投与が好ましいであろう。

【００６０】ストレプトコッカス・ニューモニエ又はＲＳＶの感染を受けやすい人のワクチ
ン接種に加えて、本発明の医薬組成物を、前記の感染病に苦しむ患者を免疫治療
的に処置するために使用することができる。

【００６１】本発明の更なる観点において、本明細書に記載したワクチン製剤の製造方法で
あって、ストレプトコッカス・ニューモニエの抗原及びＲＳＶの抗原と、アジュ
バント、例えば３Ｄ−ＭＰＬ及び好ましくは担体、例えばミョウバンを含むＴｈ
１と混合することを含んで成る方法が提供される。

【００６２】所望ならば、他の抗原をあらゆる都合の良い順序において、本明細書に記載の
多価のワクチン組成物を提供するために加えることができる。

【００６３】更に本発明は、プロテインＤに複合したストレプトコッカス・ニューモニエの
多糖と、ＲＳＶ抗原及び医薬として許容される補形薬とを混合することを含んで
成るワクチン組成物の製造方法を提供する。

【００６４】下文の例において、マウスのモデルにおける、ＲＳＶワクチン候補、ＦＧを商
業的に入手可能な２３価の肺炎球菌ワクチン（Ｗｙｅｔｈ−ＬｅｄｅｒｌｅのＰ
ｎｅｕｍｕｎｅ）と組合わせる効果の評価を行った。このモデルは組合わせた免
疫感作を試験し、ここで前記ワクチンは物理的に混合され、そして同一の部位に
注射される。この研究の結果は、両方のワクチンについてのある免疫学的なマー
カーのための向上した応答をもたらす、相互の共同作用を示している。

【００６５】本件の例は、マウスのモデルにおいてＲＳＶワクチンの候補及び１１価の複合
肺炎球菌ワクチンと組合わせたワクチンを示す。この研究は免疫学的なマーカー
にとって、前記抗原間の干渉が無いか、又はごく僅かな干渉があるが、事実、い
くつかの免疫学的なマーカーにとって、向上した応答及びそれに従う相乗効果が
存在することを示している。特に、前記の複合した肺炎球菌の多糖のプロテイン
Ｄ成分に対する免疫応答の減少は存在しない。

【００６６】例例１−組み合わせたＲＳＶ＋２３価の肺炎球菌ワクチンの評価１．調剤方法：Ｈ₂ Ｏ希釈したＦＧ抗原（２μｇ：１／１０ＨＤ）を、１５分間、５０μｇ
のＡｌ（ＯＨ）₃ 上に吸着した。使用するときに、５μｇの３Ｄ−ＭＰＬを１０
０nmの粒子の懸濁液として調製物に加え、そして３０分間インキュベートした。
次に、製剤を１０倍濃縮の、pH７．４のＰＢＳで緩衝化した。使用するときに、
前記の２３価の肺炎球菌ワクチン（１１．５μｇ：１／５０ＨＤ）を、前記緩
衝溶液の添加の１５分後に加えた。ＦＧ無しの群のために、同一の調剤の順序が
続き、前記の２３価の肺炎球菌ワクチンの添加前に、前記３Ｄ−ＭＰＬをはじめ
に吸着せしめる。前記の濃縮緩衝液又は前記の２３価の肺炎球菌ワクチンの添加
の１５分後に、フェノキシエタノール（５mg／ml）を保存剤として前記製剤に加
えた。

【００６７】全てのインキュベーションを撹拌しながら室温で行った。前記製剤を、２回の
注射のために、最初の注射の前に仕上げた製剤の７日間の熟成と同時に調製した
。

【表１】

【００６８】２．免疫感作プロトコール：１０匹のマウスの１１の群を異なる経路によって、０及び２８日目に様々な製
剤（表１を参照のこと）を用いて免疫感作した（５０μｌ）。第７及び８群を鼻
腔内経路（６０μｌ）によって、生きているＲＳＶで免疫感作した。血清を２８
日目（２８ｄＰｏｓｔＩ）及び４２日目（１４ｄＰｏｓｔII）に得た。４２
日目に、脾臓及びリンパ節細胞を第４，５，６，７，８，９群の５匹のマウス、
及び５匹の未投薬のＢａｌｂ／ｃマウス（第１群、免疫されていない）から採取
した。

【００６９】３．体液性応答３．１．抗ＦＧ抗体：全ての体液性の結果を１０匹のマウス／群で行い（抗ＦＧの力価及びイソ型の
プロファイルのために集めた血清の、個々の応答）、そして細胞性の結果を５匹
のマウス／群で示した。

【００７０】個々の血清は、第１の免疫感作の２８日後及び第２の免疫感作の１４日後に得
られ、そしてＦＧ特異的Ｉｇ抗体の存在及びそれらのイソ型（ＩｇＧ２ａ，Ｉｇ
Ｇ１）の分布について試験された。

【００７１】本アッセイのプロトコールは次の様にした：穴当たり５０μｌの精製ＦＧ５４
／０２３（１μｇ／ml）による４℃での一晩のコーティング、３７℃での１時間
の飽和、３７℃での１時間３０分の血清とのインキュベーション、３７℃での１
時間３０分の抗マウスＩｇビオチン１／１５００（又はＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａビ
オチン１／１０００）とのインキュベーション、３７℃での３０分のストレプト
−ペルオキシダーゼ１／２５００とのインキュベーション、室温での１５分のＯ
ＰＤＡＳｉｇｍａとのインキュベーション、２ＮのＨ₂ ＳＯ₄ による停止。

【００７２】ＯＤを４９０nmで監視し、そして前記力価は標準曲線を参照してＳｏｆｔｍａ
ｘｐｒｏ（４つのパラメーター方程式）によって決定され、そしてEU／mlで表し
た。

【００７３】１４ｄＰｏｓｔIIから得た個々の血清は、以下のプロトコールを用いて中和
抗体の存在について試験した：５０μｌの血清の連続二倍希釈液（第１希釈１／
２５）を１時間、３７℃で、２回１組で、９６穴プレートにおいて３００pfu の
ＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇ（ロット番号１４）及びモルモットの補体（１／２５希釈
）を含む５０μｌの混合液とインキュベートした。次に１０⁵ 細胞／mlの１００
μｌのＨＥｐ−２細胞懸濁液を各穴に加え、そしてプレートを５％ＣＯ₂ の存在
下、３７℃で４日間インキュベートした。

【００７４】次に上清を吸引し、そして１００μｌのＷＳＴ−１調製物（１／１２．５希釈
）の添加後、前記プレートを５％ＣＯ₂ の存在下、３７℃で２４時間更にインキ
ュベートした。ＯＤを５９５nmで監視し、そして力価を直線回帰（ｙ＝ａ．ｌｏ
ｇｘ＋ｂ）によって決定し、ここで：力価＝感染していない細胞で観察された最
大ＯＤの５０％の減少を与える血清の希釈である。

【００７５】試験におけるコントロールは、無作為に選択したヒトの血清のプール（ヒトの
プール）及びＳａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ（ロット番号０６９のＳａｎｄｏｚ
によって製造された商標登録してないヒトＩｇＧ）を含んだ。

【００７６】３．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧ：肺炎球菌の多糖、６Ｂ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆ型に対するマウスＩｇＧをＣ
ＤＣのプロトコールに適合した方法のＥＬＩＳＡによって測定した。このプロト
コールは、ＣＰＳ抗体の測定を阻害するために、前記血清への可溶性細胞壁の多
糖（ＣＰＳ）の添加を含む。ＣＰＳは全ての肺炎球菌に共通のテイコ酸を含むホ
スホリルコリンである。それは前記のカプセルのもと存在し、そしてそれに対す
る抗体はわずかに弱く保護的である。ＣＰＳが莢膜多糖に結合するので、前記の
ＥＬＩＳＡプレートをコートするために使用される精製莢膜多糖が混入している
ＣＰＳが通常０．５〜１％存在している。従って、前記ＣＰＳ抗体の測定は、前
記莢膜多糖に関するＥＬＩＳＡの結果の解釈を混乱させることがある。

【００７７】本件のＥＬＩＳＡは、６Ｂ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆ型のそれぞれのための、
炭酸緩衝液中の２０，５，１０及び２０μｇ／mlでコートした多糖を用いて行っ
た。血清を、希釈していない血清中で５００μｇ／ml ＣＰＳに等しくなる様に
あらかじめ混合し、そしてＥＬＩＳＡプレートへの添加前に３０分間インキュベ
ートした。マウスのＩｇＧを、１：２０００希釈のＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎ
ｏＬａｂのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼを用いて検出した。
滴定曲線はＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによるロジスティックな対数比較を用いて各
血清型の、知られている濃度の多糖特異的マウスモノクローナル抗体を参照した
。使用したモノクローナル抗体は、６Ｂ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆ型についてそ
れぞれＨＡＳＰ４，ＰＳ１４／４，ＰＳ１９／５及びＰＳ２３／２２とした。利
用可能な血清の量を限定して集めた血清を試験したので、統計解析は利用可能で
はない。

【００７８】４．細胞性応答脾臓及びリンパ節の細胞を、第４〜９群及び、ＦＧ特異的細胞性応答解析のた
めのネガティブコントロールとしての使用のための未処置のマウス（第１群）か
ら１４ｄＰｏｓｔIIに単離した。試料はＦＧ特異的リンパ球増殖及びサイトカ
イン（ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−５）分泌、その両方について解析された。

【００７９】１０〜０．０３μｇ／mlのＦＧ（３倍希釈）を含む２００μｌの培地を有する
９６穴プレートの、４×１０⁵ 細胞／穴の９６時間のインキュベーション後、増
殖を評価した。 ³Ｈ−チミジンの組込みによって、ＦＧ特異的増殖を我々の標準
的なプロトコールに従い測定した。１０μｇ〜０．０１μｇのＦＧ（１０倍希釈
）ＦＧを含む１mlの培地を有する２４穴の、穴当たり２．５×１０⁶ 細胞の９６
時間のインキュベーション後、サイトカインの誘導を評価した。次に上清を採収
し、我々の標準的なプロトコールに従うＥＬＩＳＡによって誘導されたＩＦＮ−
γ及びＩＬ−５の量を決定した。

【００８０】１．群１０の群は、水酸化アルミニウム及び３Ｄ−ＭＰＬ又は水酸化アルミニウムで
調製した２３価のワクチン又はＦＧ又はその両方の組み合わせのいずれかを含む
様々な製剤で免疫感作を受けた。第１群はＣＭＩ研究のためのコントロールを構
成する。第２及び９群は、２３価の肺炎球菌ワクチンの評価のための文献におい
て使用された腹腔内の免疫感作、及びＩＭ免疫感作に対する２３価の肺炎球菌ワ
クチンの免疫原性の評価を与え、第３及び第１０群は、前記の２３価の肺炎球菌
ワクチンがミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬによって調製されることを除いて、第２及
び第９群に対しての平行解析を与える。第２及び第３群もまた、前記の２３価の
肺炎球菌ワクチンに対して、それがＦＧミョウバン／３Ｄ／ＭＰＬと組合わされ
ないとき、ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬの衝撃のためのコントロールを構成する。
第４群は前記の２３価の肺炎球菌ワクチン及びＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬの
組合わせのＩＭ免疫感作によって誘導される免疫応答の評価を与えるだろう。第
５及び第６群はＦＧに対して、それが前記の２３価の肺炎球菌ワクチンと組合わ
されないとき、ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬの衝撃の評価のためのコントロールを
構成する。生ＲＳＶの免疫感作は、天然のＲＳＶのＩＮ注射によって誘導された
免疫応答のためのコントロールとした（第７群）。最後に、第９群はミョウバン
／３Ｄ−ＭＰＬ単独の衝撃のためのコントロールである。

【表２】

【００８１】２．体液性応答２．１．抗ＦＧ抗体２８ｄＰｏｓｔＩ及び１４ｄＰｏｓｔIIの特異的な抗ＦＧ抗体の解析は、
ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ／２３価で観察されるわずかに高い力価と、ＦＧ
ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ／２３価（第４群）又はＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰ
Ｌ単独（第５群）を用いる免疫感作に対する類似の抗体応答の誘導を示す（図１
）。ＦＧミョウバンによる免疫感作（第６群）は、両方の時点で予想より低い抗
体の力価を誘導する。統計的な解析は、２８ｄＰｏｓｔＩ及び１４ｄＰｏｓ
ｔIIで第４〜６群によって誘導される抗ＦＧＩｇの力価間に実際に有意な差異
が存在することを示す。

【００８２】結果抗ＲＳＶＡ中和抗体の解析（図２）は、抗ＦＧＩｇ応答について観察される
ものと平行のプロファイルを示す。

【００８３】上文の結果に基づき、抗ＦＧ／抗ＲＳＶ中和抗体の比（２８ｄＰｏｓｔII）
が計算され、そしてＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ／２３価と、ＦＧミョウバン
／３Ｄ−ＭＰＬと、ＦＧミョウバンとの比を、ＲＳＶＩＮ群によって誘導され
る比率と比較して示された（表２）。

【表３】

【００８４】個々の抗ＦＧＩｇ，ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのイソ型の力価に対する徹底的
な統計解析は、ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬへの前記の２３価ワクチンの添加
がＩｇ及びＩｇＧ１応答を維持し、そしてＩｇＧ２ａ応答を有意に増大させるこ
とを示した（図３Ａ）。更に前記解析は、ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ／２３
価及びＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬのＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比及びＩｇＧ１
の力価が類似しているが、ＦＧミョウバンと有意に異なることを示した（図３Ｂ
）。前記の３つの製剤は、それらのＩｇＧ２ａの力価において有意な差異を有し
ていた。

【００８５】２．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧマウス及び他のげっ歯類は多糖の免疫原に対してＩｇＭを産生しうるが、それ
らは通常多糖に対してＩｇＧを産生しない。これは、それらの免疫系が非依存性
Ｔ抗原、例えば多糖へのイソ型スイッチを誘導するシグナルを欠いているためで
ある。この様に、マウスにおける抗多糖ＩｇＧの測定は向上したＴ依存性免疫応答の
誘導についての高感度試験である。

【００８６】２３の多糖のうち４つに対して誘導されるＩｇＧの濃度を表３に示す。我々が
他の実験で述べた様にＩｇＧは多糖６Ｂ及び２３Ｆ型に対して産生されなかった
。しかし、測定可能なＩｇＧが１４及び１９Ｆに対して産生された。

【００８７】２３価のワクチンを含まない群は、測定値の特異性を確認する、多糖１４及び
１９Ｆに対するいずれかの検出可能なＩｇＧを示す。

【００８８】免疫感作の経路の比較は、前記の２３価のワクチンがミョウバン／３Ｄ−ＭＰ
Ｌで免疫賦活される場合、１９Ｆ型にとっては筋肉内経路が腹腔間より好ましい
ようであり、一方１４型にとっては反対の事が真実であることを示す。単純な２
３価なものと、有意に異ならない様である。

【００８９】２３価＋ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬは、２３価単独と比較した場合、ＩＭ及び
ＩＰ免疫感作経路、その両方において、１４及び１９Ｆ型でより大きなＩｇＧを
誘導する。しかし、ＦＧと組み合わせた場合、ＩｇＧ応答の低下がある。それに
もかかわらず、２３価＋ＦＧ／ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬにおける１９Ｆに対す
るＩｇＧ応答は、２３価単独によって誘導されるものよりも更に大きく（第３群
と第４群を比較）、そして１４型に対する応答が向上する。

【表４】

【００９０】３．細胞性応答誘導したＦＧ特異的リンパ球増殖は脾臓細胞及びリンパ節細胞、その両方にお
いて、ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ＋／−２３価とＦＧミョウバンとの間に全
く差異を示さなかった。

【００９１】ＩＬ−５及びＩＦＮ−γの産生の解析は、ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬを有
する２３価ワクチンの混合物がＩＦＮ−γの産生を妨害しないが、ＩＬ−５の産
生をやや増大しうることを示唆する（図４）。この観察は、ｉｎｖｉｔｒｏで
の再刺激に使用されるＦＧの２つの投与量（１０及び１μｇＦＧ／ml）で観察
されるＩＦＮ−γ／ＩＬ−５の比における２〜８倍の差異によって確認されてい
る。しかし、前記のＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ／２３価ワクチンは、ＦＧミ
ョウバンよりもはるかに高いＩＦＮ−γ／ＩＬ−５の比を更に誘導する。

【００９２】結論誘導した抗ＦＧＩｇ特異的抗体及び抗ＲＳＶＡ中和抗体の力価の解析は、Ｆ
Ｇミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬと前記の２３価ワクチンとの組み合わせが、ＦＧミ
ョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ単独で観察される応答の誘導を妨害しないことを示す。
抗ＦＧ／抗ＲＳＶＡ中和抗体の比によって測定される応答の質も、未変化かつＩ
Ｎ経路を介する天然の感染で観察される比に近いままである。

【００９３】誘導したＦＧ特異的細胞性応答の解析は、前記２３価ワクチンのＦＧミョウバ
ン／３Ｄ−ＭＰＬへの添加が脾臓細胞及びリンパ節細胞、その両方におけるリン
パ球増殖の誘導に影響しないことを示唆する。更に、ＦＧミョウバン／３Ｄ−Ｍ
ＰＬにより典型的に観察されるＴｈ１型応答の誘導は、ＦＧ特異的脾臓及びリン
パ節の細胞のｉｎｖｉｔｒｏでのサイトカイン産生によって測定される様に前
記の２３価のものの添加によって妨害されず、そしてＦＧ特異的イソ型抗体の分
布を解析する場合に増強される様である。事実、Ｔｈ１応答のマーカーである、
ＩＦＮ−γの産生は、前記の２３価ワクチンのＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬへ
の添加に対して未変化のままであるが、Ｔｈ２応答のマーカーである、Ｉｌ−５
の産生は非常にわずかに増大する。興味深いことに、前記の２３価ワクチンのＦ
Ｇミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬへの添加は、Ｔｈ１応答のマーカーである、ＩｇＧ
２ａ抗体の産生を有意に増大するが、それはＩｇＧ１（Ｔｈ２応答のマーカー）
又はＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの応答のいずれにも影響しない。

【００９４】この様に、ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬと２３価のものとの組み合わせは、
ＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬで観察される応答に影響せず、そしてそれ故にＦ
Ｇミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ製剤又はＦＧミョウバンと結合する利点、すなわち
高度な１次及び２次中和抗体の応答並びにＩｇＧ２ａ抗体の存在によって測定さ
れる様なＴｈ１応答の誘導及び高レベルのＩＦＮ−γによる誘導は維持される。

【００９５】２３価の肺炎球菌とＦＧミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせは、試験した
４つの多糖のうち２つのＩｇＧ産生の増大をもたらしたが、１９Ｆ型の場合が最
も劇的である。ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬを有する２３価単独が最大のＩｇＧ濃
度を与えた。

【００９６】結論として、２３価の肺炎球菌ワクチンとＲＳＶＦＧミョウバン／３Ｄ−Ｍ
ＰＬの組み合わせが好ましく、この中で両方のワクチンがある免疫学的試験にお
ける向上を示し、そしていずれの試験においても阻害を示さないという、両方の
ワクチンについての相乗効果がある。

【００９７】例２−組み合わせたＲＳＶ＋１１価複合肺炎球菌ワクチンの評価組み合わせのワクチンは、３Ｄ−ＭＰＬ＋ミョウバン、３Ｄ−ＭＰＬ＋ＱＳ２
１／コレステロール含有リポソーム、又はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ミョ
ウバン有り又は無し）のいずれかで評価した。

【００９８】プロテインＤ（ＰＤ）担体に対するＩｇＧの免疫応答への組み合わせのワクチ
ンの衝撃も評価した。

【００９９】ＰＤは、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザＢ（ＮＴＨｉ）の感染に
対する防御抗原である。従って、ＰＤ複合肺炎球菌ＰＳ及びＦＧの組み合わせは
、３つの病原：Ｓ．ニューモニエ、ＲＳＶ及び分類不可能なヘモフィルス・イン
フルエンザＢに対する有効な防御を与えうる。Ｔｈ１型免疫は、おそらくＮＴＨ
ｉに対する防御に関与する。従って、Ｔｈ１応答の良好な指標である抗ＰＤＩ
ｇＧ２ａ抗体も試験した。

【０１００】この例で使用した１１価の候補ワクチンは、莢膜多糖の血清型１，３，４，５
，６Ｂ，７Ｆ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ及び２３Ｆを含み、これらは本質的
にＥＰ７２５１３に記載されている様に調製した。各多糖はＣＤＡＰ化学（Ｗ
Ｏ９５／０８３４８）を用いて活性化され、そして誘導体化され、そして前記タ
ンパク質の担体と複合される。全ての多糖がそれらの天然の型で複合されるが、
但し血清型３（粘度を低下させるためにサイズを縮少したもの）を除く。

【０１０１】前記タンパク質の担体は、Ｅ．コリで発現した、分類不可能なヘモフィルス・
インフルエンザ由来の組み換えプロテインＤとした。

【０１０２】１．調製方法：製剤は最初の注射の１２日前に調製した。１．１．ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬに基づいた製剤必要とされるときに、抗原（ＦＧ（２μｇ）又は／及び吸着されていないＰＳ
複合体（０．５μｇ／価））を、１０倍濃縮の、pH７．４のＰＢＳ及びＨ₂ Ｏの
混合物中で希釈した。ＱＳ２１（５μｇ）は、１／５のＱＳ２１／コレステロー
ル重量比でリポソームを含むＭＰＬとの混合物として加えた（ＤＱ／３Ｄ−ＭＰ
Ｌｉｎと称する）。３０分後、チオメルサールを保存剤として加えた。

【０１０３】１．２．ＣｐＧ又は３Ｄ−ＭＰＬに基づいた製剤必要とされるときに、前記抗原（ＦＧ（２μｇ）又は／及び非吸着型ＰＳ複合
体（０．５μｇ／価））の添加前にＡｌ（ＯＨ）₃ をＨ₂ Ｏ中で希釈した。３０
分の吸着後、ＭＰＬ又はＣｐＧを加えた。３０分後、前記製剤は１０倍濃縮の、
pH６．８のＰＯ₄ −ＮａＣｌで緩衝化した。続いて１mg／mlのチオメルサール又
は５mg／mlのフェノキシを保存剤として加えた。

【０１０４】全てのインキュベーションを室温で撹拌しながら行った。前記製剤は、最初の
注射の前に仕上げた製剤の７日の熟成と同時に、２つの注射のために調製した。

【表５】

【０１０５】２．免疫感作プロトコール：１４の群の１０匹のマウスを、様々な製剤で０及び２８日目にＩＭ経路（５０
μｌ）により免疫感作した（結果の項目を参照のこと）。血清は４２日目に得た
（１４ｄＰｏｓｔII）。４２日目、脾臓細胞がＦＧ抗原で免疫感作した群の５
匹のマウス及び５匹の未処置のＢａｌｂ／ｃマウスから摘出した。

【０１０６】３．体液性応答３．１．抗ＦＧ抗体全ての体液性の結果は、１０匹のマウス／群（抗ＦＧＩｇ，ＩｇＧ１及びＩ
ｇＧ２ａについての個々の応答並びに中和の力価）について行い、そして細胞性
の結果を５匹のマウス／群についてプール上に提示した。

【０１０７】個々の血清は２次免疫感作の１４／１５日後に得られ、そしてＦＧ特異的Ｉｇ
抗体の存在及びそのイソ型（ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ１）分布について試験された。

【０１０８】本アッセイのプロトコールは次の様にした：穴当たり５０μｌの精製ＦＧＤ
ＦＧＰ１０７（１μｇ／ml）で一晩コーティングし、３７℃で１時間飽和させ、
３７℃で１時間血清とインキュベーションし、３７℃で１時間３０分抗マウスＩ
ｇビオチン１／５００（又はＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａビオチン１／１０００）とイ
ンキュベーションし、３７℃で３０分ストレプタ−ペルオキシダーゼ１／１５０
０とインキュベーションし、室温で２０分ＯＰＤＡＳｉｇｍａとインキュベー
ションし、２ＮのＨ₂ ＳＯ₄ で停止する。

【０１０９】ＯＤを４９０nmで監視し、そして前記力価は標準曲線を参照してＳｏｆｔｍａ
ｘｐｒｏ（４つのパラメーター方程式）によって決定され、そしてEU／mlで表し
た。

【０１１０】１４ｄＰｏｓｔIIから得た個々の血清は、以下のプロトコールを用いて中和
抗体の存在について試験した：５０μｌの血清の連続二倍希釈液（第１希釈１／
２５）を１時間、３７℃で、２回１組で、９６穴プレートにおいて３０００pfu
のＲＳＶ−Ａ／Ｌｏｎｇ（ロット番号１４）及びモルモットの補体（１／２５希
釈）を含む５０μｌの混合液とインキュベートした。次に１０⁵ 細胞／mlの１０
０μｌのＨＥｐ−２細胞懸濁液を各穴に加え、そしてプレートを５％ＣＯ₂ の存
在下、３７℃で４日間インキュベートした。

【０１１１】次に上清を吸引し、そして１００μｌのＷＳＴ−１調製物（１／１５希釈）の
添加後、前記プレートを５％ＣＯ₂ の存在下、３７℃で２４時間更にインキュベ
ートした。ＯＤを４９０nmで監視し、そして力価を直線回帰（ｙ＝ａ．ｌｏｇｘ
＋ｂ）によって決定し、ここで：力価＝感染していない細胞で観察された最大Ｏ
Ｄの５０％の減少を与える血清の希釈である。

【０１１２】３．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧ：肺炎球菌の多糖、３，６Ｂ，７Ｆ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆ型に対するマウス
ＩｇＧをＣＤＣのプロトコールに適合した方法のＥＬＩＳＡによって測定した。
このプロトコールは、ＣＰＳ抗体の測定を阻害するために、前記血清への可溶性
細胞壁の多糖（ＣＰＳ）の添加を含む。ＣＰＳは全ての肺炎球菌に共通のテイコ
酸を含むホスホリルコリンである。それは前記のカプセルのもと存在し、そして
それに対する抗体はわずかに弱く保護的である。ＣＰＳが莢膜多糖に結合するの
で、前記のＥＬＩＳＡプレートをコートするために使用される精製莢膜多糖が混
入しているＣＰＳが通常０．５〜１％存在している。従って、前記ＣＰＳ抗体の
測定は、前記莢膜多糖に関するＥＬＩＳＡの結果の解釈を混乱させることがある
。

【０１１３】本件のＥＬＩＳＡは、６Ｂ，７Ｆ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆ型のそれぞれのた
めの、ＰＢＳ緩衝液中の２０，５，５，２０及び２０μｇ／mlでコートした多糖
を用いて行った。血清を、希釈していない血清中で５００μｇ／mlのＣＰＳに等
しくなる様にあらかじめ混合し、そしてＥＬＩＳＡプレートへの添加前に３０分
間インキュベートした。マウスのＩｇＧは、１：５０００希釈のＪａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＬａｂのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼを用い
て検出した。滴定曲線はＳｏｆｔｍａｘＰｒｏによるロジスティックな対数比
較を用いて各血清型の、知られている濃度の多糖特異的マウスモノクローナル抗
体を参照した。使用したモノクローナル抗体は、６Ｂ，７Ｆ，１４，１９Ｆ及び
２３Ｆ型についてそれぞれＨＡＳＰ４，ＰＳ７／１９，ＰＳ１４／４，ＰＳ１９
／５及びＰＳ２３／２２とした。

【０１１４】血清型３の場合、ＰＳ３コーティング（２．５μｇ／ml ＰＢＳ、一晩、４℃
）を向上させるために免疫プレートをメチル化したヒト血清アルブミンで最初に
コーティングしたことを除いて同様のＥＬＩＳＡを行った。モノクローナル抗体
ＰＳ３／６は対照標準として使用した。

【０１１５】３．３．抗ＰＤ血清ＩｇＧのＥＬＩＳＡ投与量ＭａｘｉｓｏｒｐＮｕｎｃの免疫プレートは、ＰＢＳ中で希釈した２μｇ／
mlのＰＤ抗原を穴当たり１００μｌ用いて（プレートのＢ〜Ｈ列）、ＰＢＳ中の
１μｇ／mlの精製ヤギ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を１００μｌ用いて（列
Ａ）、３７℃で２時間コートした。続いて、標準曲線（１μｇ／mlで開始し、そ
して列Ａに添加する）及び血清試料（１／２０希釈で開始し、そして列Ｂ〜Ｈに
添加する）として加えた純粋なマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）の連続２倍希釈
液（ＰＢＳＴｗｅｅｎ２００．０５％緩衝液、穴当たり１００μｌ）を、４
℃で一晩インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴｗｅｅｎ２００．０５％緩
衝液中で１／５０００に希釈したペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ）を撹拌しながら２０℃で３０分間インキュベートした（１００μ
ｌ／穴）。数回の洗浄の後、１００μｌ／穴の顕色緩衝液（ＯＰＤＡ０．４mg
／ml（Ｓｉｇｍａ）及びＨ₂ Ｏ₂ ０．０５％／１００mM pH４．５のクエン酸緩
衝液）を用いて、暗室でプレートを室温で１５分間インキュベートした。顕色は
１ＮのＨＣｌを５０μｌ／穴加えることで停止させた。吸光度はＥｍａｘｉｍ
ｍｕｎｏｒｅａｄｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０
及び６２０nmで読んだ。抗体の力価は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏのソフトウェアを
用いて４つのパラメーターの計算方法を用いて計算した。

【０１１６】３．４．抗ＰＤ血清ＩｇＧ１，２ａ及び２ｂのＥＬＩＳＡ投与量ＭａｘｉｓｏｒｐＮｕｎｃの免疫プレートは、ＰＢＳ中で希釈した２μｇ／
mlのＰＤ抗原を５０μｌ／穴（プレートの列Ｂ〜Ｈ）、又はＰＢＳ中の５μｇ／
ml精製ヤギ抗マウスＩｇ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を５０μｌ（列Ａ）用いて、
４℃で一晩コートした。ＰＢＳＴｗｅｅｎ２００．０５％ＢＳＡ１％の緩
衝を用いるプレートの飽和後、標準曲線（２００ng／mlで開始し、そして列Ａに
添加する）及び血清試料（飽和緩衝液中で１／２０希釈から開始し、そして列Ｂ
〜Ｈに添加する）として加えた純粋マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ
モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）の連続２倍希釈液（飽和緩衝液中、穴当たり
５０μｌ）を、撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。ＮａＣｌ０．
９％Ｔｗｅｅｎ２００．０５％の緩衝液を用いる数回の洗浄の後、ビオチン
化した抗マウスＩｇＧ１又は抗マウスＩｇＧ２ａ又は抗マウスＩｇＧ２ｂヤギＩ
ｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を飽和後衝液中で１／１０００に希釈し、これを撹拌
しながら２０℃で３０分間インキュベートした（５０μｌ／穴）。追加の洗浄の
後、プレートは、飽和緩衝液（５０μｌ／穴）中で１／１０００に希釈したペル
オキシダーゼ複合ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、撹拌しな
がら２０℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、顕色は５０μｌ／穴の顕色
緩衝液（ＯＰＤＡ０．４mg／ml（Ｓｉｇｍａ）及びＨ₂ Ｏ₂ ０．０５％／１０
０mM pH４．５のクエン酸緩衝液）を加えることによって、暗室において室温で
２０分間行った。顕色は、１ＮのＨＣｌを５０μｌ／穴加えることによって停止
させた。吸光度はＥｍａｘｉｍｍｕｎｏｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることにより４９０及び６２０nmで読んだ。抗体の力価
は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏのソフトウェアを用いる４つのパラメーターの計算方
法によって計算した。

【０１１７】４．細胞性応答脾臓細胞はＦＧで免疫感作した全ての群及びＦＧ特異的細胞性応答の解析のた
めのネガティブコントロールとしての使用のための未処置のマウスから、１４ｄ
ＰｏｓｔIIに摘出した。試料はＦＧ特異的リンパ球増殖及びサイトカイン（Ｉ
ＦＮ−ｇ＋ＩＬ−５）の分泌、その両方について解析された。

【０１１８】増殖は、１０〜０．０３μｇ／mlのＦＧ（３倍希釈）を含む２００μｌの培地
を有する４×１０⁵ 細胞／穴の９６穴プレートを９６時間インキュベーションし
た後に評価した。 ³Ｈチミジンの取り込みにより、ＦＧ特異的は我々の標準のプ
ロトコールに従い測定した。サイトカインの誘導は、１０μｇ〜０．０１μｇの
ＦＧ（１０倍希釈）を含む１mlの培地を有する２．５×１０⁶ 細胞／穴の２４穴
を９６時間インキュベーションした後に評価した。続いて、我々の標準のプロト
コールに従うＥＬＩＳＡによって誘導したＩＦＮ−γ及びＩＬ−５の量を決定す
るために、上清を採集した。

【０１１９】結果１．群１４の群は、１１価複合ワクチン又はＦＧのいずれか、あるいはミョウバン３
Ｄ−ＭＰＬ，ＣｐＧ，Ｃｐｇミョウバン又はミョウバンと一緒に調製した両方の
組み合わせを含む様々な製剤の２回の免疫感作を２８日離して受けた。

【０１２０】１〜４項に提示した結果を論じる。各項において、ＦＧミョウバンの結果は、
支配的にＴｈ２型アジュバントによる特異的な免疫応答の誘導のコントロールと
して含まれる。未処置のマウス群も、ＦＧ特異的ＣＭＩ解析の内部標準としての
使用のために加えた。

【表６】

【表７】

【表８】４項：３項と同一の群

【０１２１】２．１項：２．１．抗ＦＧ抗体：類似の抗ＲＳＶＡ中和抗体のレベルはＦＧ／ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬ又は１
１価のＰＳ複合体と組み合わせたＦＧ／ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬによって誘導
した（図５）。ＲＳＶＡ中和抗体の誘導についてのわずかな相乗効果が、実際に
両方のワクチンの組み合わせによって観察することができる。

【０１２２】個々の抗ＦＧＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのイソ型の力価の解析は、ＦＧ／ミョ
ウバン／３Ｄ−ＭＰＬ／１１価のＰＳ複合体による、ＦＧ／ミョウバン／３Ｄ−
ＭＰＬと比較して同一又はそれよりわずかに低い力価の誘導を示した（図６）。

【０１２３】ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａのイソ型の比の解析は、両方のワクチンの存在が
イソ型の比を変えず、認識されているＴｈ２誘導アジュバント、ＦＧミョウバン
によって誘導されるものよりかなり低いままであることを示唆している。

【０１２４】２．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧ多糖３，６Ｂ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆに対する血清ＩｇＧの力価は、例１に
記載されている様に測定した。類似の抗体応答が、１１価のＰＳ複合体／ミョウ
バン／３Ｄ−ＭＰＬ製剤又はＦＧ抗原を添加した同一のワクチンによる免疫感作
で誘導された（図７）。この結果は、肺炎球菌ＰＳ複合体及びＲＳＶＦＧ抗原
をミョウバン３Ｄ−ＭＰＬ製剤中で組み合わせることが、抗肺炎球菌免疫応答を
低下又は変化させないことを証明した。

【０１２５】２．３．ＦＧ特異的細胞性応答ＩＬ−５及びＩＦＮ−γの産生の解析は、ＦＧ／ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬと
１１価のＰＳ複合体との混合物がこれらのサイトカインの産生レベルにやや影響
を及ぼすことを示唆している（図８）。しかし、前記応答のＴｈプロファイルの
指標である、測定したサイトカインの比は前記混合物によって影響されず、そし
てＴｈ２誘導アジュバント、ＦＧミョウバン製剤について観察される比とかなり
異なったままである。

【０１２６】３．２項：ＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎ３．１．抗ＦＧ抗体：類似の抗ＦＧＩｇ抗体レベルがＦＧＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎ又は１１価の
ＰＳ複合体と組み合わせたＦＧＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎによって誘導された（
図９）。

【０１２７】抗ＦＧＩｇ解析について見られる様に、ＦＧＤＱ−ＭＰＬｉｎを１１価の
ＰＳ複合体と混合するときに、抗ＲＳＶＡ中和抗体のレベルへの干渉は観察され
ない（図１０）。

【０１２８】個々の抗ＦＧＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのイソ型の力価の解析は、ＦＧＤＱ
−ＭＰ／１１価のＰＳ複合体による、単純なＦＧＤＱ−ＭＰと類似の力価の誘
導を示した（図１１）。イソ型の比の解析は、前記ワクチンを組み合わせること
がイソ型の比を変えず、認識されているＴｈ２誘導アジュバント、ＦＧミョウバ
ンによって誘導されるものよりもかなり低いままであることを示唆する。

【０１２９】３．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧ多糖３，６Ｂ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆに対する血清ＩｇＧの力価は、例１に
記載した様に測定した。類似の抗体応答が、１１価のＰＳ複合体／ＤＱ／３Ｄ−
ＭＰＬｉｎ製剤又はＦＧ抗原を添加した同一のワクチンによる免疫感作で誘導さ
れた（図１２）。この結果は、肺炎球菌ＰＳ複合体及びＲＳＶＦＧ抗原を、Ｄ
Ｑ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎ製剤中で組み合わせることが抗肺炎球菌免疫応答を低下又
は変化させないことを証明している。

【０１３０】３．３．ＦＧ特異的細胞性応答ＩＬ−５及びＩＦＮ−γの産生の解析は、最初にＦＧＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉ
ｎと１１価のＰＳ複合体との混合物が、ＩＦＮ−γの産生レベルにやや影響を及
ぼすことを示唆する（図１３）。前記応答のＴｈプロファイルの指標である、測
定したサイトカインの比の更なる解析は、ＦＧＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎと１１
価のＰＳ複合体との混合物が、Ｔｈプロファイルにやや影響を及ぼすことを示し
ている。しかし、ＩＬ−５以上のＩＦＮ−γの支配が前記の２つの抗原とＤＱ／
３Ｄ−ＭＰＬｉｎの組み合わせで維持され、そして認識されているＴｈ２誘導ア
ジュバント、ＦＧミョウバンで観察されるものよりもかなり高いままである。

【０１３１】４．３項：ＣｐＧ及びＣｐＧミョウバン４．１．抗ＦＧ抗体：類似の抗ＦＧＩｇ抗体レベルが、ＦＧＣｐＧ又は１１価のＰＳ複合体と組
み合わせたＦＧＣｐＧによって誘導された（図１４）。ＦＧＣｐＧと１１価
のＰＳ複合体との混合物による干渉がないことは、ＣｐＧミョウバンに基づいた
製剤についても観察されうる。

【０１３２】抗ＦＧＩｇ解析で見られる様に、ＦＧＣｐＧ又はＦＧＣｐＧミョウバン
を１１価のＰＳ複合体と混合するときに、抗ＲＳＶＡ中和抗体のレベルへの干渉
が観察されない（図１５）。

【０１３３】個々の抗ＦＧＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのイソ型の力価の解析は、ＦＧＣｐ
Ｇ又はＦＧＣｐＧミョウバン製剤への１１価のＰＳ複合体の添加による干渉を
示さなかった（図１６）。

【０１３４】ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａのイソ型の比の更なる解析は、両ワクチンの混合物がＦ
Ｇミョウバン、Ｔｈ２アジュバントによって誘導されるものよりも依然としてか
なり低いままのイソ型の比率を変えないことを示唆している。

【０１３５】４．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧ多糖３，６Ｂ，７Ｆ，１４，１９Ｆ及び２３Ｆに対する血清ＩｇＧの力価は、
例１に記載の様に測定した。当該例において、２つのアジュバント製剤、ＣｐＧ
とミョウバン／ＣｐＧとを試験した。両アジュバント製剤について、抗ＰＳＩ
ｇＧの力価は、１１価のＰＳ複合体のみで免疫化した動物と比較して、ＦＧを添
加した１１価のＰＳ複合体が与えられた動物に少なくとも類似していた（図１７
）。この結果は、ＣｐＧ又はミョウバンＣｐＧ製剤内で肺炎球菌ＰＳ複合体及び
ＲＳＶＦＧ抗原を組み合わせることが、抗肺炎球菌の免疫応答を低下させず又
は変えないことを示した。血清型７Ｆ及び１４に対する抗体の力価は、ＣｐＧア
ジュバント製剤を用いて、ＦＧの存在下でより有意に向上した。

【０１３６】４．３．ＦＧ特異的細胞性応答ＩＬ−５及びＩＦＮ−γの産生の解析は、ＦＧＣｐＧ又はＣｐＧミョウバン
と、１１価のＰＳ複合体との混合物が、これらのサイトカインの産生レベル又は
それらのＩＦＮ−γ／ＩＬ−５の比に影響を及ぼさないことを示唆している（図
１８）。従って、Ｔｈ１応答のマーカーである、ＩＦＮ−γの優勢は、ＣｐＧ及
びＣｐＧミョウバン製剤内での両方の組合わせについて維持される。ＩＦＮ−γ
の誘導は、ＣｐＧアジュバント製剤を用いて、ＦＧの存在下で更に向上した。

【０１３７】５．４項：プロテインＤ（ＰＤ）担体に対するＩｇＧ免疫応答への、ＰＳ複合体製剤中に
ＦＧを添加することの衝撃が評価された。ＰＤは、分類不可能なインフルエンザ
Ｂ（ＮＴＨｉ）の感染に対する防御抗原である。Ｔｈ１型細胞性免疫は、おそら
くＮＴＨｉに対する防御において向上する。従って、Ｔｈ１応答の良好な指標で
ある、抗ＰＤＩｇＧ２ａ抗体も試験された。

【０１３８】５．１．抗ＦＧ抗体：３項を参照のこと。

【０１３９】５．２．抗肺炎球菌多糖ＩｇＧ３項を参照のこと。

【０１４０】５．３．ＦＧ特異的細胞性応答３項を参照のこと。

【０１４１】５．４．抗ＰＤ血清ＩｇＧ，ＩｇＧ１，２ａ及び２ｂのＥＬＩＳＡ量図１９に示す様に、ＰＤ担体に対する全血清ＩｇＧ応答は、どの様なアジュバ
ントを使用しても（ＣｐＧ又はミョウバンＣｐＧ）、肺炎球菌ＰＳ複合体製剤中
でのＦＧの存在によって有意に影響を受けなかった。ＣｐＧ又はミョウバンＣｐ
ＧＰＳ複合体製剤を用いるワクチン接種によって誘発される血清抗ＰＤＩｇ
Ｇ２ａ抗体（全ＩｇＧのうち約３０％）の高い比率は、それらの製剤中へのＦＧ
の添加によって修飾されなかった（図２０）。その様なＩｇＧ２ａ応答は、強力
なＴｈ１免疫を暗示していた。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、Ｃ
ｐＧ又はミョウバンＣｐＧ製剤中でＰＤ複合型肺炎球菌ＰＳとＲＳＶＦＧ抗原
とを組み合わせることが、抗ＰＤ免疫応答を変えないことを示した。

【０１４２】考察及び結論１項：ミョウバン／３Ｄ−ＭＰＬこの結果は、ミョウバン３Ｄ−ＭＰＬ製剤中で肺炎球菌ＰＳ複合体とＲＳＶ
ＦＧ抗原とを組み合わせることが、体液性抗肺炎球菌免疫応答を変えないことを
示した。体液性及び細胞性ＦＧ特異的免疫応答のレベルは共に、混合によってわ
ずかに影響を受けている様であるが、単純なＦＧ製剤のＴｈプロファイルに影響
を及ぼさない。

【０１４３】２項：ＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎこの結果は、ＤＱ／３Ｄ−ＭＰＬｉｎを有する製剤中で肺炎球菌ＰＳ複合体と
ＲＳＶＦＧ抗原とを組み合わせることが、体液性抗肺炎球菌免疫応答又は体液
性ＦＧ特異的応答を変えないことを示した。細胞性応答の更なる解析は、ＤＱ／
３Ｄ−ＭＰＬｉｎを有する製剤中での両抗原の組合わせが、ＩＦＮ−γの誘導に
いくらか影響を及ぼすことを示唆している。しかしながら、これはＦＧ（単独）
製剤と比較してＴｈプロファイルに影響を及ぼさない。

【０１４４】３項：ＣｐＧ／ＣｐＧミョウバンこの結果は、ＣｐＧ又はミョウバンＣｐＧを有する製剤中での肺炎球菌ＰＳ複
合体とＲＳＶＦＧ抗原との組合わせが、体液性抗肺炎球菌免疫応答又は体液性
及び細胞性ＦＧ特異的応答を低下させず又は変えないことを示した。

【０１４５】４項：ＣｐＧ／ＣｐＧミョウバンこの結果は、ＣｐＧ又はミョウバンＣｐＧを有する製剤中でのＰＤ複合型肺炎
球菌ＰＳとＲＳＶＦＧ抗原との組合わせが、抗ＰＤ免疫応答を低下させず又は
変えないことを示した。

【０１４６】結論として、２３価の肺炎球菌ワクチンとＲＳＶＦＧ３Ｄ−ＭＰＬとの好
ましい組合わせが存在しており、この中で、両ワクチンがある免疫学的試験にお
いて向上を示し、そしてある試験においては全く阻害を示さないという、両ワク
チンについての相乗効果が存在している。上文で提示した結果から、好ましい組
合わせは、一連のＴｈ１アジュバント中で１１価のＰＤ複合型肺炎球菌ＰＳとＲ
ＳＶＦＧ抗原とを組み合わせる場合にも観察される。実際、試験した様々なＴ
ｈ１アジュバントについての多くの免疫学的読み出しのための、ワクチン抗原の
組合わせは、全く、又はほとんど（そして全体的な応答に関する限り有意には）
、前から存在しているいずれのワクチンの特性も妨害しない。例１においてＦＧ
を２３価のワクチンと組み合わせたときに観察される様に、いくつかの場合にお
いて、一方又は他方のワクチンが、ある免疫学的試験において向上を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｋ 39/145 39/155 39/155 39/39 39/39 47/02 47/02 47/22 47/22 Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 25/00 25/00 31/04 31/04 31/14 31/14 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ラフェルリール，クレ，アントニー，ジョセフベルギー国，ベー−1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニムＦターム(参考） 4C076 AA17 CC01 CC15 CC31 CC35 DD26 DD30 DD39 DD59 FF12 FF43 GG41 4C085 AA04 AA05 AA38 BA10 BA11 BA12 BA14 BA18 BA57 BB12 BB13 BB24 CC07 CC08 CC21 DD62 DD86 FF02 FF11 FF17 FF18 4C086 AA01 AA02 AA04 EA20 MA03 MA05 MA22 NA05 NA14 ZA01 ZA59 ZB02 ZB05 ZB33 ZB35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）タンパク質又はペプチドと複合しているか、あるいは
複合していない、そのいずれかの１又は複数のストレプトコッカス・ニューモニ
エ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の多糖類；及び（ｂ）ＲＳＶ抗原を、Ｔｈ１型応答の優先的な刺激因子であるアジュバントと共に含んで成る、ワクチ
ン組成物。
【請求項２】ストレプトコッカス・ニューモニエの多糖がヘモフィルス・
インフルエンザＢ（ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ）由来
のプロテインＤ又はそのフラグメント、プロテインＤの脂質化版（リポタンパク
質Ｄ）；破傷風毒素、及びジフテリア毒素を含んで成る群由来のタンパク質に優
先的に複合する、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】更に担体を含んで成る、請求項１又は２に記載のワクチン組
成物。
【請求項４】Ｔｈ１型応答の優先的な刺激因子が、３Ｄ−ＭＰＬ，３Ｄ−
ＭＰＬの粒子サイズは好ましくは約１０００nm又は１０００nm未満である３Ｄ−
ＭＰＬ，ＱＳ２１，ＱＳ２１及びコレステロールの混合物、並びにＣｐＧオリゴ
ヌクレオチドを含んで成るアジュバントの群から選択される少なくとも１つのア
ジュバントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】Ｔｈ１型応答の前記の優先的な刺激因子が３Ｄ−ＭＰＬを含
んで成る、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】更にＱＳ２１を含んで成る、請求項５に記載のワクチン組成
物。
【請求項７】前記のストレプトコッカス・ニューモニエの多糖が２３価の
肺炎球菌の多糖ワクチンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン
組成物。
【請求項８】前記ストレプトコッカス・ニューモニエの多糖が１１価の複
合型肺炎球菌多糖ワクチンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチ
ン組成物。
【請求項９】前記ＲＳＶ抗原がヒトＲＳＶエンベロープ糖タンパク質であ
る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】前記ＲＳＶ抗原がキメラＦＧ又はそのフラグメントである
、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】インフルエンザウィルス抗原が追加として存在する、請求
項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】前記担体が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及
びトコフェロール及び水中油乳濁液を含んで成る群から選択される、請求項１〜
１１のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】ストレプトコッカス・ニューモニエ抗原及びＲＳＶ抗原を
、Ｔｈ１誘導アジュバントと混合することを含んで成る、請求項１〜１２のいず
れか１項に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１４】プロテインＤ又はそのフラグメントに複合したストレプト
コッカス・ニューモニエの多糖を、ＲＳＶ抗原及び医薬として許容される補形薬
と混合することを含んで成る、ワクチン組成物の製造方法。
【請求項１５】患者のＲＳＶ及び／又はストレプトコッカス・ニューモニ
エの感染の予防又は回復方法であって、前記患者に有効量の請求項１〜１２のい
ずれか１項に記載のワクチンを投与することを含んで成る方法。