JPH11504020A - サポニンおよびステロールを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗原、免疫学的に活性なサポニンフラクションおよびステロールを含有してなるワクチン組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 サポニンおよびステロールを含有するワクチン 本発明は、新規ワクチン製剤、その調製方法および医薬におけるそれらの使用 に関する。特に、本発明は、抗原、ＱＳ２１などのキラジャ・サポナリア・モリ ナ（Ｑuillaja Ｓaponaria Ｍolina）の樹皮から得られた免疫学的に活性なフラ クション、およびステロールを含有するワクチンに関する。 南米の樹木であるキラジャ・サポナリア・モリナの樹皮から得られたアジュバ ント活性を有する免疫学的に活性なサポニンフラクションは、当該技術分野で知 られている。例えばキラジャ・サポナリア・モリナの木からのＨｐｌｃ精製フラ クションであるＱＡ２１としても知られているＱＳ２１およびその製造方法は、 US特許第5,057,540号に（ＱＡ２１として）開示されている。キラジャサポニン は、Scottら，Int．Archs．Allergy Appl．Immun.，1985，77，409によってもア ジュバントとして開示された。しかしながら、アジュバントとしてのＱＳ２１の 使用は、ある欠点と関連している。例えば、ＱＳ２１が遊離分子として哺乳動物 に注射されると、該注射部位で、壊死、すなわち、限局性組織死が生じることが 観察された。 今、驚くべきことに、注射部位での壊死は、ＱＳ２１およびステロールの混合 物を含有する製剤の使用により回避することができることが見いだされた。好ま しいステロールとしては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴス テロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが挙げられる。これら のステロールは、当該技術分野でよく知られており、例えば、コレステロールは 、動物脂肪中に見られる天然ステロールとしてMerck Index，第11版，第341頁に 開示されている。 したがって、第１の態様において、本発明は、抗原、免疫学的に活性なサポニ ンフラクションおよびステロールを含有してなるワクチン組成物を提供するもの である。好ましくは、本発明の組成物は、免疫学的に活性なサポニンフラクショ ンを実質的に純粋な形態で含有する。好ましくは、本発明の組成物は、実質的に 純粋な形態のＱＳ２１を含有する、すなわち、該ＱＳ２１は、少なくとも純度９ ０％、好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９８％ である。本発明の組成物において有用な他の免疫学的に活性なサポニンフラクシ ョンとしては、ＱＡ１７／ＱＳ１７が挙けられる。Ｑ２１およびコレステロール を含有してなる本発明の組成物は、コレステロールを含まない組成物と比較する と、低下した反応原性（reactogenicity）を示すが、アジュバント効果は、維持 されている。さらに、ＱＳ２１は、pＨが約７以上である塩基性条件下で分解す ることが知られている。本発明の組成物のさらなる長所は、塩基媒介加水分解に 対するＱＳ２１の安定性がコレステロールを含有する製剤において増強されると いうことである。 本発明の好ましい組成物は、リポソーム構造を形成するものである。ステロー ル／免疫学的に活性なサポニンフラクションがＩＳＣＯＭ構造を形成する組成物 もまた本発明の態様を形成する。 Ｑ２１：ステロールの比は、典型的には、１：１００〜１：１（重量対重量） のオーダーであろう。好ましくは、過剰なステロールが存在し、Ｑ２１：ステロ ールの比は、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）である。典型的には、ヒト投与につい て、ＱＳ２１およびステロールは、投与当たり、約１μg〜約１００μg、好まし くは、約１０μg〜約５０μgの範囲でワクチン中に存在するであろう。 リポソームは、好ましくは室温で非晶質である中性脂質、例えば、ホスファチ ジルコリン、例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコ リンまたはジラウリルホスファチジルコリンを含有するのが好ましい。リポソー ムは、飽和脂質からなるリポソームについてリポソーム−ＱＳ２１構造の安定性 を増加させる荷電脂質（charged lipid）を含有してもよい。これらの場合、荷 電脂質の量は、好ましくは１−２０％ｗ／ｗ、最も好ましくは５−１０％である 。リン脂質に対するステロールの比率は、１−５０％（モル／モル）、最も好ま しくは２０−２５％である。 好ましくは、本発明の組成物は、ＭＰＬ（３−デアシル化モノホスホリル脂質 Ａ、３Ｄ−ＭＰＬとしても知られている）を含有する。３Ｄ−ＭＰＬは、４、５ または６個のアシル化鎖を有する３つのタイプのデ−Ｏ−アシル化モノホスホリ ル脂質Ａの混合物としてGB 2 220 211（リビ（Ribi））により知られており、モ ンタナ州のリビ・イムノケム（Ｒibi Ｉmmunochem）により製造されている。好 ましい形態は、国際特許出願92／116556に開示されている。 本発明の好適な組成物は、まずＭＰＬなしでリポソームを調製し、次いで、Ｍ ＰＬを好ましくは１００nmの粒子として添加したものである。したがって、ＭＰ Ｌは、小胞膜内には含有されていない（ＭＰＬアウトとして知られている）。Ｍ ＰＬが小胞膜内に含有されている（ＭＰＬインとして知られている）組成物もま た本発明の態様を形成する。抗原は、小胞膜内に含有され得るか、または、小胞 膜の外部に含有され得る。好ましくは、可溶性抗原は外部にあり、疎水性または 脂質化抗原は膜の内部または外部のいずれかに含有される。 しばしば、本発明のワクチンは、特定の担体を必要としないであろうし、水性 または他の医薬的に許容されるバッファー中で処方されるであろう。いくつかの 場合、本発明のワクチンがさらにミョウバンを含有するか、または水中油型エマ ルジョン、または、例えばリポソーム、マイクロスフェアもしくは被包化抗原粒 子などの他の適切なビヒクル中で提供されるであろうという点で優れている。 好ましくは、ワクチン製剤は、ヒトまたは動物の病原体に対する免疫応答を導 き出すことができる抗原または抗原組成物を含有するであろう。当該技術分野で 知られている抗原または抗原組成物は、本発明の組成物において用いることがで きる、例えば、以下ものから得られた多糖類抗原、抗原または抗原組成物：ＨＩ Ｖ−１（例えば、gp１２０またはgp１６０）、ネコ免疫不全ウイルス、ヒトもし くは動物ヘルペスウイルス（例えば、gＤもしくはその誘導体またはＨＳＶ１も しくはＨＳＶ２からのＩＣＰ２７などの即時型初期タンパク質（Ｉmmediate Ｅa rly protein））、サイトメガロウイルス（特にヒト）（gＢまたはその誘導体） 、水痘帯状疱疹ウイルス（例えばgpＩ、IIまたはIII）、または、Ｂ型肝炎ウイ ルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型 肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルス、または例えばＲ Ｓウイルス（Ｒespiratory Ｓyncytial virus）（例えば、US特許第5,149,650号 に開示されているＨＳＲＶ ＦおよびＧタンパク質もしくはその免疫原性断片、 またはUS特許第5,194,595号に開示されているＦＧ糖タンパク質などのＨＳＲＶ タンパク質ＦおよびＧからの免疫原性断片を含有するキメラポリペプチド）など の他のウイルス性病原体；以下ものから得られた抗原：髄膜炎Ａ、ＢおよびＣな どの髄膜炎菌株、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓtreptococcus Ｐneumo nia）、ヒト乳頭腫ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘモフィルスインフル エンザＢ（Ｈib）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、またはサルモネラ 属（Ｓalmonella）、ナイセリア属（Ｎeisseria）、ボレリア属（Ｂorrelia）（ 例えば、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢまたはその誘導体）またはクラミジア属（Ｃhl amydia）、またはボルデテラ属（Ｂordetella）（例えばＰ.６９、ＰＴおよびＦ ＨＡ）などの細菌性病原体、またはプラスモディウム属（Ｐlasmodium）もしく はトキソプラスマ属（Ｔoxoplasma）などの寄生生物。 ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ（gＤ）またはその誘導体は、好ましいワクチン抗原で ある。それは、ウイルス膜上にあり、感染細胞の細胞質中にも見られる（Eisenb erg R．J.ら； J of Virol 1980 35 428-435）。それは、シグナルペプチドを含 む３９３アミノ酸からなり、約６０kＤの分子量を有する。全てのＨＳＶエンベ ロープ糖タンパク質のうち、これは、おそらく最もよく特徴付けられたものであ る（Cohenら，J．Virology 60 157-166）。それは、イン・ビボで、細胞膜への ウイルス付着における中心的な役割を果たすことが知られている。さらにまた、 糖タンパク質Ｄは、イン・ビボで中和抗体を導き出し、致死攻撃から動物を保護 することができることを示した。gＤ分子のトランケート形態は、Ｃ末端アンカ ー領域が欠けており、細胞培養上清中に輸出される可溶性タンパク質として哺乳 動物中で生成され得る。かかる可溶性形のgＤが好ましい。gＤのトランケート形 態の生成は、EP 0 139 417に開示されている。好ましくは、gＤは、ＨＳＶ−２ から誘導される。本発明の具体例は、アミノ酸１−３０６個の天然糖タンパク質 ならびに膜アンカー領域が欠けているトランケートタンパク質のＣ末端にさらな るアスパラギンおよびグルタミンを含有してなる３０８個のアミノ酸か らなるトランケートＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄである。該タンパク質のこの形態 としては、成熟可溶性２８３アミノ酸タンパク質を宿主細胞から分泌させるよう に切断されるシグナルペプチドが挙げられる。 本発明のもう１つの態様では、Ｂ型肝炎表面抗原は、好ましいワクチン抗原で ある。 本明細書で用いる場合、「Ｂ型肝炎表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」なる表現 としては、ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すＨＢｓＡｇ抗原またはその断片が挙げ られる。ＨＢｓＡｇ抗原の２２６アミノ酸配列に加えて（Tiollaisら，Nature， 317，489（1985）およびそれらにおける引用文献を参照）、本明細書に記載のＨ ＢｓＡｇは、所望により、前記文献およびEP-A-0 278 940に開示されているプレ −Ｓ配列の全部または一部を含有してよい。特に、ＨＢｓＡｇは、アド血清型（ ad serotype）のＢ型肝炎ウイルス上のオープンリーディングフレームに関する ＨＢｓＡｇのＬ−タンパク質の残基１２−５２、次いで、残基１３３−１４５、 次いで、残基１７５−４００からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有 してよい（このポリペプチドは、Ｌ＊と称される；EP 0 414 374を参照）。本発 明の範囲内のＨＢｓＡｇとしては、EP 0 198 474（エンドトロニクス（Ｅndotro nics））に開示されているプレ−Ａ１−プレＳ２−ＳポリペプチドまたはEP 0 3 04 578（マコーミック（Ｍc Ｃormick）およびジョーンズ（Ｊones））に開示さ れているもののような密接な類似体も挙げられる。本明細書に記載のＨＢｓＡｇ は、突然変異体、たとえばWO 91／14703または欧州特許出願0 511 855A1に開示 されている「エスケープ突然変異体」、特に、１４５位でグリシンからアルギニ ンにアミノ酸置換されたＨＢｓＡｇを引用することもできる。 通常、ＨＢｓＡｇは、粒子形態であろう。該粒子は、例えば、Ｓタンパク質の みからなっているか、または、複合粒子、例えば（Ｌ＊,Ｓ）（Ｌ＊は、前記定 義と同じであり、Ｓは、ＨＢｓＡｇのＳタンパク質を示す）であってもよい。該 粒子は、酵母において発現される形態であるのが好都合である。 Ｂ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質の調製は、よく開示されている。例えば、Harf ordら（1983）Develop．Biol．Standard 53，第125頁、Greggら（1987） Biotechnology，5，第479頁、EP 0 226 846、EP 0 299 108およびそれらにおけ る引用文献を参照。 本発明の範囲内の製剤は、抗腫瘍抗原を含有してもよく、免疫治療的に処置さ れた癌に有用でもある。 ワクチン製剤は、一般的に、New Trends and Developments in Vaccines，Vol lerら編，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A．1978 に開示 されている。リポソーム内への被包化は、例えば、FullertonによるU.S.特許4,2 35,877に開示されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲーションは、例 えば、LikhiteによるU.S.特許4,372,945およびArmorらによるU.S.特許4,474,757 に開示されている。 各ワクチン投与量中のタンパク質の量は、典型的なワクチン接種者において有 意な副作用を伴わない免疫防御応答を含む量として選択される。かかる量は、特 定の免疫原を用いることおよびその提供方法に依存して変化するであろう。一般 的に、各投与量は、タンパク質１−１０００mcg、好ましくは、２−１００mcg、 最も好ましくは、４−４０mcgからなるであろう。特定のワクチンについての至 適量は、患者における適切な免疫応答の観察を含む標準的な研究によって確かめ ることができる。初回予防接種の後、患者は、適当に間隔をおいて１回または数 回のブースター免疫感作を受けてよい。 本発明の処方は、予防目的および治療目的の両方のために用いてもよい。 したがって、さらなる態様では、本発明は、ヒト患者の治療のための本発明の ワクチンの使用を提供するものである。本発明は、本発明のワクチンの有効量を 患者に投与することを特徴とする治療方法を提供するものである。特に、本発明 は、本発明のワクチンの有効量を患者に投与することを特徴とする、ウイルス感 染、細菌感染、寄生生物感染または癌の治療方法を提供するものである。 以下の実施例およびデータにより、本発明を説明する。 実施例 １.１ リポソームの調製方法： 脂質（卵黄由来または合成したホスファチジルコリンなど）およびコレステロ ールの有機溶媒中混合物を真空下（または、別法としては、不活性ガス流下）で 乾燥させる。次いで、水溶液（リン酸緩衝生理食塩水など）を添加し、全ての脂 質が懸濁液になるまで、容器を撹拌する。次いで、この懸濁液を、リポソームサ イズが１００nmに減少するまで微小流動化し、次いで、０.２μmフィルターを介 して濾過滅菌する。エキストゥルージョン（extrusion）または音波処理をこの 工程に代えて用いることができる。典型的には、コレステロール：ホスファチジ ルコリン比は１：４（ｗ／ｗ）であり、水溶液を添加して、５〜５０mg／mlの最 終コレステロール濃度を得る。有機溶液中の該脂質に有機溶液中のＭＰＬを添加 すると、最終リポソームは、膜中にＭＰＬを含有する（ＭＰＬインと称される） 。該リポソームは、所定のサイズ１００nmを有しており、ＳＵＶ（小さな単ラメ ラ小胞）と称される。この溶液が繰り返し冷凍および解凍されると、該小胞は、 縮合して、５００nm〜１５μmの範囲のサイズの大きな多重ラメラ構造体（ＭＬ Ｖ）を形成する。リポソーム自体は、期間じゅう安定であり、融合原性（fusoge nic）能を持っていない。 １.２ 処方工程： 該リポソームに水溶液中のＱＳ２１を添加する。次いで、この混合物を、所望 により１００nm粒子の形態でＭＰＬを含有していてもよい抗原溶液に添加する。 １.３ ＱＳ２１の溶解活性は、コレステロールを含有するリポソームによっ て阻害される。 赤血球にＱＳ２１を添加すると、赤血球は溶解してヘモグロビンを放出する。 この溶解活性は、膜中にコレステロールを含有するリポソームおよび捕獲した蛍 光性色素カルボキシフルオレセインを用いて測定することもできる − リポソー ムが溶解されると、該色素が放出され、蛍光分光学によってモニターすることが できる。蛍光リポソームが膜中にコレステロールを含有しない場合、リポソーム の溶解は、観察されない。ＱＳ２１が、赤血球に添加される前にコレステロール を含有するリポソームと一緒にインキュベートされると、赤血球の溶解は、ＱＳ ２１に対するコレステロールの比率に依存して減少する。１：１の比率を用いる と、溶解活性は検出されない。リポソームがコレステロールを含有しない場合、 溶解の阻害は、ＱＳ２１よりも１０００倍過剰のリン脂質を必要とする。 溶解活性を測定するために蛍光リポソームを用いても同じことが当てはまる。 下記グラフにおいて、コレステロールを欠いているリポソーム（ml当たり卵黄レ シチン１mg）またはコレステロールを含有しているリポソーム（ml当たりレシチ ン１mg、コレステロール５００μg）で処理したＱＳ２１ ４μgの溶解活性を蛍 光により測定した。 データは、ＱＳ２１が膜中のコレステロールと特定の方法で結合しており、か くして、（細胞または蛍光リポソームの）溶解を生じることを示す。 ＱＳ２１がまずリポソーム中のコレステロールと結合すると、もはや、細胞ま たは他のリポソームに対して溶解しなくなる。これは、コレステロール：ＱＳ２ １の最小比０：１（ｗ／ｗ）を必要とする。 コレステロールは、水溶液に不溶性であり、安定な懸濁液を形成しない。リン 脂質の存在下、コレステロールは、リポソームと称される小胞の安定な懸濁液を 形成することができるリン脂質二重層内に存する。リン脂質を添加する必要性を 回避するために、可溶性誘導体を試みた。ポリオキサエタニルコレステロールセ バシン酸は、６０mg／mlで、ＱＳ２１よりも２０００倍過剰（ｗ／ｗ）でさえ水 に溶けるが、しかしながら、ＱＳ２１の溶解活性の低下は検出されなかった。 １.４ コレステロールを含有するリポソームによるＱＳ２１の増加した安定 性 ＱＳ２１は、pＨ７以上で加水分解に非常に高感度である。この加水分解は、 逆相ＨＰＬＣでＱＳ２１に対応するピークの減少を測定することによってモニタ ーすることができる。例えば、下記グラフは、pＨ９で、３７℃の温度で、ＱＳ ２１の９０％が１６時間以内に加水分解される。コレステロールを含有するリポ ソームが２：１（コレステロール：ＱＳ２１（ｗ／ｗ））の割合でＱＳ２１に添 加されると、ＱＳ２１の加水分解は、同一条件下で検出されない。比率が１：１ である場合、ＱＳ２１の１０％が分解する。 ＱＳ２１がコレステロールを含有するリポソームと結合すると、塩基媒介加水 分解に対してあまり感度が良くないようになると推断される。加水分解産物は、 非経口投与されるとアジュバント活性を有しないと開示されており、かくして、 ＱＳ２１を含有するワクチンは、酸性pＨで処方され、４℃に維持してアジュバ ント組成物を維持しなければならない。リポソームの使用は、この要求に打ち勝 つ。 １.５ 反応原性研究： 増加する量のリポソーム（コレステロールのμgによって表される）に添加し たＱＳ２１（またはジギトニン）５μgをマウスの脛側筋に注射する。溶解活性 は、試料と同一の溶血を達成するのに必要なＱＳ２１の量を意味する、等価のＱ Ｓ２１のμgとして表す。 注射部位での筋肉における赤み、壊死および毒性を、マウスを殺した後に視覚 的に評価した。 データは、溶解活性がコレステロールを含有するリポソームの添加によって完 全に破壊されると、ＱＳ２１による毒性もまた完全に破壊されることを示す。 １.６ ウサギにおける筋肉内反応原性 Ｕ.Ｉ.／Ｌにおける値 データは、処方へのコレステロール含有リポソームの添加が、ＱＳ２１によっ て生じるＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）の上昇を有意に低下させることを 示す。ＣＰＫ増加は筋肉損傷の尺度なので、これは、減少した筋肉損傷を示し、 組織病理学によって確認される。 １.７ リポソーム−ＱＳ２１複合体のミョウバンへの結合 ＱＳ２１を、過剰のコレステロールおよび放射性コレステロールを含有する中 性リポソームと一緒にインキュベートし、次いで、ＰＢＳ中のミョウバン（Ａl( ＯＨ)₃）と一緒にインキュベートした。単独では、中性リポソームもＱＳ２１も ＰＢＳ中のミョウバンに結合せず、負に荷電したリポソームは、結合する。しか しながら、一緒にすると、ＱＳ２１および中性リポソームは、ミョウバンに結合 する。上清は、ＱＳ２１（オルシノール試験によってアッセイする）も放射性コ レステロールも含有しなかった。 これは、ＱＳ２１がリポソームに結合し、リポソーム−ＱＳ２１混合物をミョ ウバンに結合させることを示す。これは、ＱＳ２１によりリポソームに負荷され た負の電荷により生じるか、またはリポソーム上の疎水性領域の暴露に対して生 じる。結果は、ＱＳ２１が膜からコレステロールを抽出しないことをも意味する 。 これは、本発明の組成物がミョウバンをベースとするワクチンにおいて用いる ことができることを示す。 １.８ 抗体およびＣＭＩ誘発についてのリポソームＱＳ２１／ＭＰＬおよび 遊離ＱＳ２１＋ＭＰＬの比較 ＳＵＶは、エキストゥルージョンにより調製した（ＥＹＰＣ：コレステロール ：ＭＰＬ２０：５：１）。 ＭＰＬアウトについて、リポソームは、ＭＰＬなしで調製し、ＭＰＬは、１０ ０nmの粒子として添加した。 ＱＳ２１は、抗原の前に添加した。コレステロール：ＱＳ２１＝５：１（ｗ／ ｗ）。 ＭＬＶは、抗原添加前に、冷凍−解凍ＳＵＶ３ｘによって調製した。 捕獲された抗原を有するように、抗原は、冷凍−解凍の前にＳＵＶに添加し、 ＱＳ２１は、冷凍−解凍後に添加した。抗原被包化＝５％イン、９５％アウト。 マウス（ｇＤについてはbalb／c、ＮＲＴＳについてはＢ１０ＢＲ）のフット パッドに２回注射した。 ｇＤは、単純疱疹ウイルス由来の糖タンパク質Ｄである。ＲＴＳは、プラスモ ジウム・ファルシパルム・スポロゾイト（Ｐlasmodiium falciparum sporozoit ）由来のエピトープを含有するように遺伝学的に修飾されたＢ型肝炎表面抗原（ ＨＢｓＡｇ）である。 データは、ＳＵＶ／ＱＳ＋ＭＰＬ(アウト)が少なくともＱＳ２１＋ＭＰＬと同 様に良好な高い抗体力価を誘発し、細胞媒介免疫性のマーカーＩＬ２を誘発する が、ＱＳ２１反応原性をクエンチすることを示す。 抗原としてＨＳＶ ｇＤを用いてbalb／cマウスにおけるＱＳ２１およびコレス テロール（ＳＵＶ）の存在下でのＱＳ２１を比較する第２の実験からのさらなる 結果を以下に示す： １.９ gp１２０＋リポソームＭＰＬ／ＱＳ２１と遊離ＭＰＬ／ＱＳ２１との 比較 リポソーム＝膜中にＭＰＬを含有するＳＵＶ コレステロール：ＱＳ２１＝６：１ １回の免疫感作の２週間後に応答を試験した。 ２回目の免疫感作後： データは、コレステロール含有リポソームおよびＭＰＬと結合したＱＳ２１が ＭＰＬ＋ＱＳ２１と同等のＴh１／Ｔh０応答を誘発することを示す。 第２の実験では、balb／cマウスをフットパッド内で、ＱＳ２１またはＱＳ２ １＋コレステロール含有ＳＵＶの存在下、gp１２０で免疫感作した。脾臓細胞に おける細胞毒性Ｔ−リンパ球活性を測定した。 これは、ＱＳ２１単独がＣＴＬ活性を誘発すること、およびコレステロールを 含有するリポソームの存在下でのＱＳ２１がＱＳ２１単独と少なくとも同様に良 好またはＱＳ２１単独よりも良好なＣＴＬ活性を有することを示す。 ２．ワクチン ２.１ ＨＢｓＡｇ Ｌ＊,Ｓ粒子の処方 ＨＢｓＡｇ Ｌ＊,Ｓ粒子は、以下のとおり処方する： ＨＢｓＡｇ Ｌ＊,Ｓ粒子１０μg／投与を、撹拌下、室温で１時間インキュベ ートする。注射用水およびＰＢＳ溶液を用いて容量を調節し、ＱＳ２１の水溶液 （１０μｇ／容量）を用いて最終容量７０μl／容量に完成する。pＨを７±０. ５に維持する。 ＨＢｓＡｇ Ｌ＊,Ｓ １μgおよび５０μgを用い、ＨＢｓＡｇ Ｓ抗原を用いて 同様の処方を調製してもよい。 これらの処方は、モデルとしてウッドチャック（Ｗoodchuck）ＨＢＶ抗原を用 いて、ウッドチャック代用治療モデルにおいて試験してよい。 ウッドチャックモデル ＤＱ ＱＳ２１（すなわち、ＱＳ２１／コレステロールまたはクエンチしたＱ Ｓ２１）は、動物が慢性的にウイルスに感染しているウッドチャック治療モデル において試験してよい。特定のウッドチャック肝炎ウイルスワクチンをそのまま のＱＳ２１またはＭＰＬを含有するかしないＤＱと混合し、６カ月間、毎月１回 動物に投与してよい。ワクチンの効果は、ウイルスＤＮＡクリアランスを介して 評価してよい。 ２.２ モルモットモデル（ＨＳＶ） ２.２.１ 予防モデル １２匹の雌性ハートリィ種モルモットのグループに０日目および２８日目に以 下の処方で筋肉内注射した： 第１の実験： gＤ ５μg＋ＱＳ２１ ５０μg＋コレステロール５０μg含有ＳＵＶ gＤ ５μg＋ＱＳ２１ １００μg＋コレステロール１００μg含有ＳＵＶ gＤ ５μg＋ＱＳ２１ ５０μg＋コレステロール２５０μg含有ＳＵＶ gＤ ５μg＋ＱＳ２１ ５０μg 第２の実験： gＤ ５μg＋ＭＰＬ １２.５μg＋ＱＳ２１ １２.５μg＋コレステロール６２. ５g含有ＳＵＶ、または未処置のまま。 第２の免疫感作の後、１４日目および２８日目に動物から採血し、血清を、g Ｄ特異的ＥＬＩＳＡ抗体力価について試験した。 次いで、動物をＨＳＶ−２ ＭＳ株１０⁵pfuで膣内抗原投与した。それらは、 原発性疱疹性病変の評価のために４〜１２日間毎日評価した。評価は、以下のと おり行った： 膣病変： − 出血＝０.５ − 出血なしで１日または２日間の赤み＝０.５ − １日間赤みおよび出血＝１ − 少なくとも３日後に出血なしで赤み＝１ 外部の疱疹性小胞： − ＜４個の小さな小胞＝２ − ＞＝４個の小さな小胞または１個の大きな小胞４＞＝４個の大きな病変８ 融合する大きな病変＝１６ − 全外部生殖器領域における融合する大きな病変＝３２。 結果は、下記表に示す： 予防モデル 実験１（cholは、コレステロールを含有するＳＵＶを表す） 実験２ 表およびグラフは、予防モデルにおいて、gＤ／ＭＰＬ／ＱＳ２１／ＳＵＶに よる免疫感作により一次疾患に対する非常に高いレベルの防御が誘発されたこと を示す。外部病変の発生率および病変重篤度は、共に、gＤ／ＭＰＬ／ＱＳ２１ ／ＳＵＶで免疫感作された動物のグループにおいて非常に低下した。 ２.２.２ 治療モデル 治療モデルにおいて、雌性ハートリィ種モルモットをまずＨＳＶ−２ ＭＳ株 １０⁵pfuで抗原投与した。次いで、疱疹性病変を有する動物を任意に１６匹から なるグループに分配した。 ２１日目および４２日目に、それらを以下の処方の１つで免疫感作した： − gＤ＋ＭＰＬ ５０μg＋ＱＳ２１ ５０μg＋コレステロール２５０μg含有 ＳＵＶ − gＤ＋Ａl(ＯＨ)₃＋ＭＰＬ ５０μg＋ＱＳ２１ ５０μg＋コレステロール２ ５０μg含有ＳＵＶ、または未処置のまま。 再発性疾患の評価のために、２２〜７５日間毎日それらをモニターした。評価 は、予防モデルについて記載したと同様であった。結果は、下記表およびグラフ に示す。 治療モデル 結果は、良好なレベルの防御が、ＨＳＶ−２感染の治療モデルにおいても誘発 されたことを示す。ミョウバンを有するかまたは有しないgＤ／ＭＰＬ／ＱＳ２ １／ＳＵＶによる免疫感作は、再発性疾患のメジアン重篤度に対して顕著な効果 を有した。症状発現数および期間もわずかに減少した（表を参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/39 ＡＤＺ Ａ６１Ｋ 39/39 ＡＤＺ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フリード，マーティン ベルギー、ベー−1330リクセンザルト、リ ュ・デュ・ランスティテュート89番 スミ スクライン・ビーチャム・バイオロジカル ス・ソシエテ・アノニム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原、免疫学的に活性なサポニンフラクションおよびステロールを含有し てなるワクチン組成物。 ２．免疫学的に活性なサポニンフラクションがＱＳ２１である請求項１記載の ワクチン組成物。 ３．ステロールがコレステロールである請求項１または２記載のワクチン組成 物。 ４．ＱＳ２１：ステロールの比率が１：１００〜１：１である請求項２または ３記載のワクチン組成物。 ５．さらにＭＰＬを含有する請求項１〜４のいずれか１項記載のワクチン組成 物。 ６．ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、 Ｉ型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイ ルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスもしくはＥ型肝 炎ウイルス、ＲＳウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｈ ib、髄膜炎ウイルス、サルモネラ属（Ｓalmonella）、ナイセリア属（Ｎeisseri a）、ボレリア属（Ｂorrelia）、クラミジア属（Ｃhlamydia）、ボルデテラ属（ Ｂordetella）、プラスモディウム属（Ｐlasmodium）またはトキソプラスマ属（ Ｔoxoplasma）のいずれかから得られる抗原または抗原組成物を含有してなる請 求項１〜５のいずれか１項記載のワクチン組成物。 ７．抗原が腫瘍抗原である請求項１〜５のいずれか１項記載のワクチン。 ８．ウイルス感染、細菌感染、または寄生生物感染の予防的処置用ワクチンの 製造のための請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物の使用。 ９．ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染または癌の免疫治療的処置用ワク チンの製造のための請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物の使用。 １０．請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物の安全かつ有効な量を投与す ることを特徴とする、病原性感染に罹患しているかまたは罹病し易い哺乳動物の 処置方法。 １１．請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物の安全かつ有効な量を投与す ることを特徴とする、癌に罹患している哺乳動物の処置方法。 １２．免疫学的に活性なサポニンフラクションおよびコレステロールならびに 抗原または抗原組成物を混合することを特徴とする、請求項１記載のワクチン組 成物の製造方法。