CN103221065A

CN103221065A - Hiv疫苗

Info

Publication number: CN103221065A
Application number: CN201180025999XA
Authority: CN
Inventors: P.布圭吉翁; M.C.库特索科斯; C.洛林; L.麦克纳利; G.H.沃斯
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2013-07-24
Also published as: AU2011231574A1; JP2013523617A; SG184188A1; KR20130063493A; CA2794558A1; ZA201207030B; WO2011117408A1; US20140234399A1; EA201290956A1; IL222228A0; EP2552480A1; MX2012011189A

Abstract

本发明涉及包含HIV-1的免疫组合物及其在预防和/或治疗HIV-1中的用途。尤其是，本发明涉及来自一个进化支的HIV-1抗原在预防和/或治疗与异源HIV-1进化支的HIV-1感染有关的疾病。

Description

HIV疫苗

发明领域

本发明涉及包含HIV-1抗原的免疫原性组合物及其在预防和/或治疗HIV-1中的用途。具体来说，发明涉及来自一个进化支的HIV-1抗原在预防和/或治疗疾病中的用途，所述疾病与异源HIV-1进化支的HIV-1感染相关。

发明背景

人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是被认为是全球主要健康问题之一的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要致病原因。在全球有三千两百万以上的感染人口，因此开发安全和有效的抗HIV-1疫苗是全球健康领域的研究重点。

HIV-1是逆转录病毒科的RNA病毒。HIV-1基因组编码被分为三类的至少9个蛋白质：主要的结构蛋白Gag、Pol和Env；调控蛋白Tat和Rev；以及辅助蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。

HIV-1可以分为几个不同的进化支，例如A、B、C、D、E、F、G、H、J和K，它们在世界上的盛行率各有不同。例如，HIV-1B进化支多见于北美和欧洲，而HIV-1C进化支主要造成了南美、印度和中国的HIV-1蔓延。已知还有被称为流行重组型(CRFs)的HIV-1进化支的重组形式流行。这些重组形式是当不同进化支在感染者细胞内重组形成新的杂交病毒时产生的。但多数杂交形式生存期短，那些继续感染一个以上人的被称为CRFs。例子包括A/E，它被认为是由A亚型和某种其它“亲代”E亚型杂交产生的。但目前还未发现纯的E亚型形式。

在塞浦路斯分离的一株病毒原本被归于新的I亚型，后来被重新分类为重组形式A/G/I。现在认为该病毒代表一种由A、G、H、K亚型和未分类区域组成的更复杂的CRF。

每个进化支(clade)包含不同的HIV-1株，这些株根据它们的遗传相似度被归类到一起。因此来自不同进化支的HIV-1株的遗传差别比同一进化支中的不同HIV-1株大。

HIV-1的遗传多样性使得开发一种能够在全球使用，抗来自多个HIV-1进化支的病毒株的安全有效疫苗极端困难。目前仍需要可以解决这些需求的疫苗。

过去二十年间，进行了大量工作来开发预防性疫苗。至今只有三种候选HIV-1疫苗进行了IIb或III期试验，全都未能防止HIV-1感染[Flynn NM，Forthal DN，Harro CD，Judson FN，Mayer KH，et al.(2005)Placebo-controlledphase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1infection.J Infect Dis 191：654-665；Pitisuttithum P，Gilbert P，Gurwith M，Heyward W，Martin M，et al.(2006)Randomized，Double-Blind，Placebo-Controlled Efficacy Trial of a Bivalent Recombinant Glycoprotein 120HIV-1 Vaccine among Injection Drug Users in Bangkok，Thailand.J Infect Dis194：1661-1671；Buchbinder SP，Mehrotra DV，Duerr A，Fitzgerald DW，MoggR，et al.(2008)Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine(the Step Study)：a double-blind，randomised，placebo-controlled，test-of-concepttrial.Lancet 372：1881-1893]。开发能够防止感染，产生消除性免疫的预防性疫苗是一项重点工作，但也希望能有基于诱导强烈T细胞介导的免疫反应的治疗性或疾病调节性疫苗。

CD8+T细胞应答在控制持续性病毒感染中的作用已被广泛接受[Barouch DH，Letvin NL(2001)CD8+cytotoxic T lymphocyte responses tolentiviruses and herpesviruses.Curr Opin Immunol 13：479-482]。就HIV-1感染而言，病毒特异性CD8+T细胞的出现与原发HIV-1感染时发生的病毒血的下降紧密关联[Koup RA，Safrit JT，Cao Y，Andrews CA，McLeod G，et al.(1994)Temporal association of cellular immune responses with the initial controlof viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.J Virol68：4650-4655]，而且CD8+T细胞的消除导致猴免疫缺陷病毒(SIV)病毒血症发生极具恶化[Schmitz JE，Kuroda MJ，Santra S，Sasseville VG，Simon MA，etal.(1999)Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection byCD8+lymphocytes.Science 283：857-860；Jin X，Bauer DE，Tuttleton SE，LewinS，Gettie A，et al.(1999)Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+)T celldepletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques.J Exp Med 189：991-998]。还发现那些在没有高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)的情况下感染不恶化的患者，体内优先保持多能性CD8+T细胞[Betts MR，Nason MC，West SM，De Rosa SC，Migueles SA，et al.(2006)HIV nonprogressorspreferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+T cells.Blood 107：4781-4789]。

病毒特异性CD4+T细胞已知在许多病毒(包括HIV-1)感染的免疫控制中有关键作用[Day CL，Walker BD(2003)Progress in defining CD4 helper cellresponses in chronic viral infections.J Exp Med 198：1773-1777；Klenerman P，Hill A(2005)T cells and viral persistence：lessons from diverse infections.NatImmunol 6：873-879]。更具体地说，CD4+T细胞对于功能性CD8+T细胞的诱发和维持是必须的[Bourgeois C，Veiga-Fernandes H，Joret AM，Rocha B，Tanchot C(2002)CD8 lethargy in the absence of CD4 help.Eur J Immunol 32：2199-2207；Janssen EM，Lemmens EE，Wolfe T，Christen U，von Herrath MG，etal.(2003)CD4+T cells are required for secondary expansion and memory inCD8+T lymphocytes.Nature 421：852-856；Shedlock DJ，Shen H(2003)Requirement for CD4T cell help in generating functional CD 8T cell memory.Science 300：337-339；Sun JC，Bevan MJ(2003)Defective CD8 T cell memoryfollowing acute infection without CD4T cell help.Science 300：339-342；Sun JC，Williams MA，Bevan MJ(2004)CD4+T cells are required for the maintenance，not programming，of memory CD 8+T cells after acute infection.Nat Immunol 5：927-933；Yang TC，Millar J，Groves T，Zhou W，Grinshtein N，et al.(2007)Onthe role of CD4+T cells in the CD8+T-cell response elicited by recombinantadenovirus vaccines.Mol Ther15：997-1006]。HIV-1感染患者体内存在的多能和具有增殖能力的HIV-1特异性CD4+T细胞与长期感染不恶化相关[BoazMJ，Waters A，Murad S，Easterbrook PJ，Vyakarnam A(2002)Presence ofHIV-1Gag-specific IFN-gamma+IL-2+and CD28+IL-2+CD4T cell responsesis associated with nonprogression in HIV-1 infection.J Immunol 169：6376-6385；Harari A，Petitpierre S，Vallelian F，Pantaleo G(2004)Skewedrepresentation of functionally distinct populations of virus-specific CD4 T cellsin HIV-1-infected subjects with progressive disease：changes after antiretroviraltherapy.Blood 103：966-972；Kannanganat S，Kapogiannis BG，Ibegbu C，Chennareddi L，Goepfert P，et al.(2007)Human immunodeficiency virus type 1controllers but not noncontrollers maintain CD4 T cells coexpressing threecytokines.J Virol 81：12071-12076；Potter SJ，Lacabaratz C，Lambotte O，Perez-Patrigeon S，Vingert B，et al.(2007)Preserved central memory andactivated effector memory CD4+T-cell subsets in human immunodeficiencyvirus controllers：an ANRS EP36 study.J Virol 81：13904-13915]。此外，在急性HIV-1感染后HIV-1特异性CD8+T细胞增殖的丧失可以利用疫苗诱发的HIV-1特异性CD4+T细胞(体外和体内产生IL-2)来恢复[Lichterfeld M，Kaufmann DE，Yu XG，Mui SK，Addo MM，et al.(2004)Loss of HIV-1-specificCD8+T cell proliferation after acute HIV-1 infection and restoration byvaccine-induced HIV-1-specific CD4+T cells.J Exp Med 200：701-712]。这些发现表明有效的AIDS疫苗必须也能够诱发强CD4+T细胞应答。

考虑到HIV-1的强大遗传多样性，有效的疫苗应当能够有利地诱发可以覆盖广谱流行HIV-1株的CD4+T细胞应答。仍存在对这样的疫苗的需求。

本发明致力于解决这些需求。

发明概述

本发明提供了用于诱导预防和/或治疗HIV的免疫反应的组合物。更具体地说，本发明提供了含有HIV抗原的组合物，所述组合物用于诱导抗一个以上HIV进化支的免疫反应和/或诱导抗与组合物中使用的HIV抗原异源的进化支的免疫反应。

附图简述

图1：F4的核苷酸序列

图2：F4的氨基酸序列

图3：F4co的核苷酸序列

图4：p24氨基酸序列比对

图5：RT氨基酸序列比对

图6：Nef氨基酸序列比对

图7：p17氨基酸序列比对

图8：不同进化支的序列同一性和表位保守性分析

图9A：F4的考马斯染色胶和western印迹

图9B：p24-RT-Nef-p17溶解性测定

图10：F4co的考马斯染色胶和western印迹

图11：F4co纯化复查

图12：CB染色的SDS胶和抗F4western印迹

图13：抗F4中单个的抗原的Western印迹

图14：三个纯化批次的SEC分析

图15：抗大肠杆菌Western印迹

图16：批次3制备过程中采集的所有组分的SDS胶和抗F4western印迹

图17：F4/AS01_B和F4/WFI群的致反应性

图18：表达IL-2和至少一种其它标记蛋白的CD4+T细胞

图19：对以F4/AS01_B-辅佐的HIV-1疫苗候选物的CD4+T细胞应答：响应率

图20：对辅以F4/AS01_B的HIV-1疫苗候选物的CD4+T细胞应答：每种抗原的响应百分比

图21：表达IL-2和至少一种其它标记物、且应答F4融合蛋白的CD4+T细胞的百分比

图22：给予剂II两周后，10μgF4/AS01_B组中F4特异性CD4+CD40L+T细胞的细胞因子共表达谱

图23：F4特异性CD4+CD40L+T细胞的细胞因子共表达谱：10μgF4/AS01_B组的所有时间点的饼图

图24：抗原特异性CD4+T细胞的细胞因子共表达谱

图25：抗原特异性CD4+T细胞的细胞因子共表达谱

图26：CD4+T细胞应答的交叉反应性

图27：CD4+T细胞应答的交叉反应性

图28：抗F4融合蛋白的体液免疫反应

图29：对Nef、RT、p17、p24抗原的抗体反应

图30：A进化支特异性CD4+T细胞应答

图31：B进化支特异性CD4+T细胞应答

图32：C进化支特异性CD4+T细胞应答

图33：A进化支特异性CD8+T细胞应答

图34：B进化支特异性CD8+T细胞应答

图35：C进化支特异性CD8+T细胞应答

图36：交叉进化支T细胞应答总结

发明详述

本发明提供了免疫原性组合物，其包含

a.一或多种多肽，其包含一或多种选自Nef、Pol和/或Gag的抗原；

其中所述一或多种抗原是选自来源于一或多种HIV-1进化支的一或多种病毒株；和

b.优选是Th1型免疫反应诱导剂的佐剂，

所述组合物用于治疗或预防由来自和免疫组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支的HIV-1病毒株引起的疾病或感染。

发明人发现包含来自一个特定进化支的HIV-1病毒株的HIV-1蛋白抗原的免疫原性组合物可以诱发对来自其它不同的HIV-1进化支的HIV-1病毒株产生强CD4+T细胞应答。例如，来自HIV-1B进化支病毒株的HIV-1抗原可以诱发对来自不是HIV B进化支病毒株的HIV-1抗原的交叉免疫反应，或者对来自HIV-1B进化支的不同病毒株的HIV-1抗原的交叉免疫反应，其中所述不是HIV B进化支病毒株的HIV-1抗原是例如来自进化支A、进化支C或者诸如重组进化支CRF-01(进化支A和E的流行重组形式)的HIV-1抗原。

该交叉反应性是除了可以看到的抗来自相同HIV-1株的HIV-1抗原的“同源”免疫反应之外的活性。相应地，例如包含来自B进化支HIV-1株的HIV-1抗原的免疫原性组合物，可以用于治疗或预防由下述HIV-1株引起的感染和疾病：相同HIV-1株、来自B或其它进化支的不同HIV-1株、非B进化支的HIV株，例如来自A进化支和/或C进化支和/或CRF-01进化支的病毒株。

对抗原产生的免疫反应是通过抗原与免疫系统的细胞的相互作用形成的。得到的免疫反应可以大概分成两个主要类别：先天性免疫反应，多样性不高但作用独立；和适应性免疫反应，多样性极高，但对先天性免疫有强依赖性，因此自主性有限。

有效的抵抗入侵病原体的宿主防御是通过复杂的将先天性和适应性免疫系统联系在一起的信号转导网络的协作实现的。抗病毒感染的保护作用主要是通过适应性免疫介导的，既有体液也有细胞介导的。体液免疫的抗病毒效果是通过产生能够阻断病毒进入/感染靶细胞的中和抗体介导的。CD4+和CD8+T细胞是细胞介导的免疫的效应子成分，它们通过分泌细胞因子和杀伤已被病毒感染的靶细胞来介导抗病毒效应。

多项研究有力地支持了HIV-1特异性T细胞应答在控制病毒复制和防止HIV-1相关疾病中的保护性作用。

当与诸如树突细胞(DCs)的抗原呈递细胞所呈递的抗原发生相互作用时，CD4+T细胞可以分化成各种效应细胞亚群，包括经典的Th1细胞和Th2细胞、Th17细胞、滤泡辅助T(Tfh)细胞，和诱导型调节性T(iTreg)细胞。分化的决定主要是由细胞因子的存在以及从某种程度上由抗原和T细胞抗原受体之间的相互作用的强度决定的。

Th1细胞的特征在于它们能够产生IFN-γ，和参与抗细胞内微生物的细胞免疫。IL-12由先天免疫细胞产生，它引导细胞走向Th1细胞分化程序，以及由NK细胞和T细胞产生的IFN-γ。

Th2细胞产生IL-4、IL-5和IL-13，是控制蠕虫和其它胞外病原体的体液免疫所必需的。Th2细胞分化需要IL-4和Stat6下游的GATA3的作用。

Th17细胞产生IL-17A、IL-17F和IL-22，在清除胞外，特别是粘膜表面的细菌和真菌中有重要作用。Th17细胞分化需要类视黄醇相关孤核受体(ROR)gt，所述受体是由TGF-β联合促炎性细胞因子IL-6、IL-21和IL-23a诱导的转录因子，它们都能激活Stat3磷酸化。

Tfh细胞是辅助性T细胞的一个亚群，调节B细胞应答的成熟。这些细胞的分化需要细胞因子IL-21，并且可能要依赖转录因子Bcl-6。

效应T细胞应答的严格调控对于有效地控制感染和避免自身免疫和免疫病理疾病是必需的。

除了已知的在许多病毒感染的免疫控制中发挥着关键作用，病毒特异性CD4+T细胞也是功能性CD8+T细胞的诱导和维持所必需的，其中的功能性CD8+T细胞正如以上讨论过的已知在控制持续性病毒感染，包括HIV-1感染中有作用。

HIV-1基因组编码多种不同蛋白。包膜蛋白包括例如gp120和它的前体gp160。HIV-1的非包膜蛋白包括例如内部结构蛋白(比如gag和pol基因的产物)和其它非结构蛋白(比如Rev、Nef、Vif和Tat)。

因为这类能够抗最可能广泛的流行性HIV-1病毒株谱的CD4+T细胞应答是有利的，期望的HIV-1疫苗含有来自各种病毒蛋白的尽可能多的不同CD4表位。含有最大数量的保守T细胞表位的病毒抗原是Gag、Pol和Nef。

发明的免疫原性组合物包含一或多种含有一或多种这些抗原的多肽。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物包含一或多种含有Nef的多肽。

HIV-1Nef是一种早期蛋白，即它是在感染早期并且没有结构蛋白的情况下表达的。Nef基因编码早期辅助性HIV-1蛋白，该蛋白已被证实具有几种活性。例如，Nef蛋白已知造成CD4、HIV-1受体和来自细胞表面的MHCI型分子的下调，虽然这些功能的生物学重要性还未定论。此外，Nef与T细胞的信号途径能够相互作用，诱发活化状态，这种活化状态随之又能促进更有效的基因表达。某些HIV-1分离株在该区域带有突变，导致它们不能编码有功能的蛋白并且它们的体内复制和发病机制被严重损害。

提及Nef时，是指全长Nef以及全长Nef的片段、变体和衍生物。该术语还包括包含Nef的多肽，包括含有Nef的片段、变体和衍生物的多肽。

在实施方案中，Nef来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

方便地，Nef来自B进化支的HIV-1病毒株。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物包含一或多种含有Pol的多肽。

Pol基因编码两种含有早期感染中病毒所需两种活性的蛋白、RT和病毒DNA整合到细胞DNA所需要的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒粒子蛋白酶切割产生氨基端RT肽，该肽含有DNA合成所需要的活性(RNA和DNA依赖性DNA聚合酶活性和RNase H功能)；和羧基端整合酶蛋白。因此RT是Pol的片段的例子。HIV-1RT是全长RT(p66)和缺少羧基端RNase H结构域的切割产物(p51)的杂二聚体，p66和p51也是Pol的片段的例子。

提及Pol时，是指全长Pol和全长Pol的片段、变体和衍生物。该术语还包括包含Pol的多肽，包括含有Pol的片段、变体和衍生物的多肽。

在实施方案中，Pol包含RT片段。RT片段是Pol的片段的例子。提到的RT也是全长RT和全长RT的片段、变体和衍生物。该术语还包括包含RT的多肽，包括含有RT的片段、变体和衍生物的多肽。按照这种方式，RT可以包含p66片段、p51片段和/或p66和/或p51的片段、变体和衍生物。

在实施方案中，Pol来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

方便地，Pol来自B进化支的HIV-1病毒株。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物包含一或多种含有Gag的多肽。

Gag基因被翻译为前体多肽，后者经蛋白酶切割产生的产物包含基质蛋白(p17)、衣壳蛋白(p24)、核衣壳(p9)、p6和两个间隔臂肽(p2和p1)，这些都是Gag的片段的例子。

Gag基因能够产生由未被剪切的病毒mRNA表达的55-千道尔顿(kD)Gag前体蛋白，又称为p55。在翻译过程中，p55的N端被豆蔻酰化，触发它与细胞膜的胞浆面结合。膜结合的Gag多聚蛋白召集两个拷贝的病毒基因组RNA以及其它病毒蛋白和细胞蛋白，它们引发病毒颗粒从被感染细胞的表面出芽。出芽后，在病毒的成熟过程中，p55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)切割成四个小一些的蛋白，被命名为MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6，它们都是Gag的片段的例子。

p17(MA)多肽来自p55的N端豆蔻酰化末端。多数MA分子保持与毒粒脂双层内表面的附着，使颗粒稳定。一个MA亚群被召集到毒粒的更深层，在这里它成为将病毒DNA护送到细胞核的复合体的一部分。这些MA分子能够促进病毒基因组的核转运，因为MA上的亲核信号能被细胞的核输入机制识别。这个现象使得HIV-1能够感染非分裂细胞。

p24(CA)蛋白形成病毒颗粒的圆锥形。亲环蛋白A经证实与p55的p24区域相互作用，导致它被整合到HIV-1颗粒中。Gag和亲环蛋白A之间的相互作用非常重要因为环孢素A打断该相互作用时会抑制病毒的复制。

Gag的NC区域负责特异识别HIV-1的所谓包装信号。所述包装信号由位于病毒RNA的5’端附近的四个茎环结构构成，并且能有效介导异源RNA整合到HIV-1毒粒中。NC通过两个锌指基元介导的相互作用与包装信号结合。NC还能促进逆转录。

p6多肽区域介导p55Gag和辅助性蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr整合到正在组装的毒粒中。p6区域还含有所谓晚期结构域，该结构域是出芽毒粒从感染细胞有效释放所必需的。

在实施方案中，Gag来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

方便地，Gag来自B进化支的HIV-1病毒株。

在实施方案中，Gag是p17。在这种实施方案中，p17来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。方便地，p17来自B进化支的HIV-1病毒株。

在实施方案中，Gag是p24。在这种实施方案中，p24来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。方便地，p24来自B进化支的HIV-1病毒株。

在实施方案中，Gag包含了作为分开的蛋白抗原成分或者融合在一起的p17和p24。

方便地，p17和p24融合在一起，由异源氨基酸序列隔开。

本发明中描述的抗原是全长抗原，例如全长Nef、全长Pol、全长Gag。发明还涵盖不是全长的抗原，包括抗原的片段或变体，所述片段或变体可能是或者可能不是与全长对应。合适地，片段是免疫原性片段，变体是免疫原性变体。

一般来说，“片段”，无论是否具有免疫原性，都含有来自包含HIV-1抗原的多肽的连续氨基酸序列，其中所述“片段”是所述多肽的片段。方便地，所述片段含有来自它们是其片段的多肽的至少5-8个氨基酸、至少9-15个氨基酸，至少20个，至少50个或者至少100个连续氨基酸。

用于本文的“免疫原性片段”包含抗原的至少一种表位并且展示出HIV-1抗原性。这类片段独立或者在合适构建物中呈递时，能够诱发抗天然抗原的免疫反应，所述在合适构建体中呈递是比如与其它HIV-1表位或抗原融合、与蛋白性和/或免疫原性融合伙伴融合，或者在载体上或者在载体中呈递时。

用于本文的术语“变体”包括与它们的非变体对应分子相比，发生了有限的改变的多肽。这包括点突变，所述点突变能够通过例如提高在表达系统中的表达或者去除不希望的活性(包括不希望的酶活性)来改变多肽特性。但是，包含HIV-1抗原的多肽变体必须保留与天然多肽的足够相似性，以便保留在免疫原性组合物或疫苗中所希望具有的抗原特性，从而仍能够引发抗天然抗原的免疫反应。特定变体是否能够引发这种免疫反应可以在合适的免疫学检验中测定，比如ELISA(对于抗体反应)或者利用合适的细胞标记物和细胞因子染色进行的流式细胞术(对于细胞应答)。

方便地，本发明的“变体”包含一或多种氨基酸的添加、缺失或取代。它们涵盖截断的抗原，其中抗原的C端和/或N端被切割去一或多种氨基酸。方便地，“变体”包括截断分子或者片段，其中从抗原的C端和/或N端切割去1-5个氨基酸、6-10个氨基酸、11-15个氨基酸、16-20个氨基酸、21-25个氨基酸或25个以上氨基酸。

本发明的变体可以引入一或多种含有一或多种氨基酸的缺失、添加或取代。相应地，抗原截断分子可以在肽的不同部分另外包含一或多种氨基酸的缺失、添加或取代。

本发明的变体还包括与Nef、Pol和/或Gag的多肽序列具有70、80、90、95或98％同一性的多肽序列。

在发明的实施方案中，免疫原性组合物包含两个含有一或多种抗原的多肽、三个含有一或多种抗原的多肽、四个含有一或多种抗原的多肽或者五个含有一或多种抗原的多肽。

Nef、Pol和/或Gag中的每一个可以在免疫原性组合物中出现一次以上。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含两个或以上含有Nef的多肽、两个或以上含有Pol的多肽和/或两个或以上含有Gag的多肽。

在其它实施方案中，一或多种多肽中的每一个可以包含一个Nef、Pol和/或Gag、两个Nef、Pol和/或Gag、三个Nef、Pol和/或Gag、四个Nef、Pol和/或Gag等等。如果组合物中存在一个以上多肽，每个多肽可以包含相同的抗原数量和/或组分，或者每个多肽可以包含不同的抗原数量和/或组分。如果组合物中存在三个或以上多肽，两个或以上的多肽可以包含相同的抗原数量和/或组分，而其余的多肽可以包含不同的抗原数量和/或组分。

众多文献记载表明这些抗原的多肽序列在不同病毒株中，包括不同HIV-1进化支的病毒株中的保守性很好。

但是，对跨越不同进化支的HIV-1抗原的CD4+T细胞表位保守性进行的分析显示虽然这些抗原的序列在不同进化支之间保守性较好，CD4+T细胞表位表现出令人惊奇的不太好的保守性(见图8的分析)。

分析观察“已知”CD4+T细胞表位并“预测”CD4+T细胞表位。表位“预测”使用三种软件：SVMHC (www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC)、ProPred(www.imtech.res.in/raghava/propred/)和一个GSKbio程序(Tepitope)。为了被选为潜在的“表位”，9聚体肽需要被这三种程序预测是白人群体中最有代表性的17种等位基因中给定HLA等位基因的表位。然后计算预测的在这些序列中保守的CD4+T细胞表位的数量。

尽管在研究的进化支中只观察到较小程度的表位保守性，发明人惊奇地发现交叉反应的程度被预期的大得多。

交叉反应在本文意味着本发明的免疫原性组合物诱发识别HIV-1病毒株的免疫反应的能力，所述病毒株来自免疫原性组合物中没有的进化支。例如，发明的免疫原性组合物包含的多肽含有来自B进化支HIV-1病毒株的抗原，如果被该组合物诱发的HIV特异性免疫反应(比如HIV特异性CD4+T细胞应答)能够与组合物中没有的不同HIV-1病毒株反应，例如与B进化支之外的HIV-1病毒株反应，则该组合物被认为具有交叉反应性。

组合物诱发的对来自不同进化支的HIV-1病毒株的免疫反应取决于被诱发的免疫反应的类型。对于CD4特异性免疫反应，这可能包括相关细胞因子的分泌。CD8特异性免疫反应可能包括溶细胞活性的诱导和/或相关细胞因子的分泌。抗体特异性反应可能包括例如中和抗体的诱导。

在本发明中，优选被发明所述免疫原性组合物中没有的进化支的HIV-1病毒株诱发的免疫反应是CD4特异性免疫反应。

交叉反应性免疫反应可以针对多肽上的免疫原性区域，即表位，所述表位在不同HIV-1进化支的不同病毒株的序列中是保守的；或者可以针对在不会取消免疫识别的情况下容忍一定程度序列变异的表位。

交叉反应性可以利用给定免疫反应的强度和/或应答物百分比来测量。

当考虑免疫反应的强度时，可以表述为由来自与免疫原性组合物中的进化支相同的进化支的多肽诱发的给定免疫反应，相对由来自与免疫原性组合物中的进化支不同的多肽诱发的免疫反应的强度。

为了分析免疫反应的强度，免疫原性组合物中包含抗原的多肽可以用于免疫学分析检验中，例如以蛋白的形式分析抗体反应，或者以重叠的合成肽组的形式分析T细胞应答。合适的免疫学分析检验是本领域技术人员熟知的，在以下实施例中有描述。

免疫反应的强度还可以表述为通过合适的血清学检测确定的免疫原性组合物诱发的抗原特异性抗体的效价(或浓度)。T细胞应答的强度可以表述为免疫原性组合物诱发的抗原特异性细胞在总的T细胞群体中的出现频率(或者数量)，这可以通过细胞因子的产生进行监测。

免疫反应，例如交叉反应性免疫反应的强度，会被完全或部分保守的表位的数量以及被识别的表位的优势度影响。

例如，高强度免疫反应可能是由于识别大量较弱保守表位造成的，或者是识别少数优势表位造成的。

方便地，观察到的交叉反应水平是总的T细胞群体中免疫原性组合物诱发的抗原特异细胞中的最多10％、最多15％、最多20％、最多25％、最多30％、最多35％、最多40％、最多45％、最多50％、最多55％、最多60％、最多65％、最多70％、最多80％、最多90％或最多100％，或者免疫原性组合物诱发的抗原特异性抗体效价(或浓度)的最多10％、最多15％、最多20％、最多25％、最多30％、最多35％、最多40％、最多45％、最多50％、最多55％、最多60％、最多65％、最多70％、最多80％、最多90％或最多100％。

从对来自不同进化支的HIV-1病毒株有应答者百分比的角度测量交叉反应性时，可以测量接种了疫苗的个体在后续攻击后在免疫学检验中表现出阳性反应的数量或百分比。所述有应答者可以对抗原上的一或多种表位有反应。有应答者还可以对发明所述免疫原性组合物中的一或多种多肽，和/或发明所述免疫原性组合物中的一或多种抗原有反应。

可以用于分析有应答者百分比或者免疫反应强度的免疫学检验和血清学检查是本领域已知的。这类检验的例子是本领域技术人员已知的，在下文实施例部分有描述。

优选地，样品中观察到的交叉反应水平最多10％、最多15％、最多20％、最多25％、最多30％、最多35％、最多40％、最多45％、最多50％、最多55％、最多60％、最多65％、最多70％、最多80％、最多90％或最多100％的受试对象是有应答者。

无论使用哪种测量方法，本发明不要求对来自免疫原性组合物中不存在的进化支的HIV-1病毒株有完全的交叉反应性，例如100％交叉反应性。

发明的免疫原性组合物包含佐剂，所述佐剂是Th1免疫反应的优选诱导剂。

Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant Approach，edited by Powell andNewman，Plenum Press，New York，1995中概括描述了佐剂，该文献通过引用并入本文。

作为免疫刺激剂的例子的佐剂是指免疫原性组合物中能够加强或者强化对抗原的特异性免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的成分。

佐剂可以诱发Th1型和Th2型免疫反应。Th1型细胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)倾向于诱发细胞介导的针对给定抗原的免疫反应，而Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、Il-6、IL-10)倾向于诱发对抗原的体液免疫反应。

在本发明中，佐剂是Th1免疫反应的优选诱导剂。

Th1和Th2型免疫反应的区别不是绝对的。现实中，个体支持的免疫反应会被描述为Th1优势或Th2优势型。但是，按照Mosmann and Coffman(Mosmann，T.R.and Coffman，R.I.(1989)TH1 and TH2 cells：different patternsof lymphokine secretion lead to different functional properties.Annual Review ofImmunology，7，p145-173，通过引用并入本文)描述过的鼠CD4+T细胞克隆来考虑细胞因子的家族往往是方便的。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2细胞因子关联。其它经常直接与Th1型免疫反应诱导相关的细胞因子不是由T细胞产生的，比如IL-12。相反，Th2型反应与Il-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌关联。促进Th1优势型反应的合适的佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物(或者一般的脱毒的脂质A-参见例如WO2005107798)，尤其是3-de-O-酰基化的单磷酰脂质A(3D-MPL)(其制备见GB 2220211 A)；和单磷酰脂质A、优选3-de-O-酰基化的单磷酰脂质A以及铝盐(例如磷酸铝或者氢氧化铝)或者水包油乳剂的组合。在这种组合中，抗原和3D-MPL被包含在相同的颗粒结构中，从而能够更有效地递送抗原性和免疫刺激性信号。研究显示3D-MPL能够进一步加强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen et al.Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1，均通过引用并入本文]。

加强型系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是WO94/00153(通过引用并入本文)中公开的QS21和3D-MPL的组合；或者致反应性较低的组合物，其中正如WO 96/33739(通过引用并入本文)中描述的QS21被胆固醇进行了抑制。WO 95/17210中描述了一种特别强力的在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的佐剂制剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含可以是QS21的皂苷。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚(WO 95/17210，通过引用并入本文)。

在发明的实施方案中，佐剂包含的一或多种成分选自有免疫活性的皂苷组分和/或脂多糖和/或免疫刺激性寡核苷酸。

在实施方案中，佐剂包含有免疫活性的皂苷组分和脂多糖。

方便地，所述有免疫活性的皂苷组分是QS21，和/或所述脂多糖是脂质A衍生物。合适地，脂质A衍生物是3D-MPL。

合适的佐剂是3D-MPL和QS21的组合(EP 0 671 948 B1，通过引用并入本文)，包含3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO 95/17210，WO 98/56414，均通过引用并入本文)或者与其它载体一起配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1，通过引用并入本文)。

3D-MPL可以从Glaxo SmithKline Biologicals North America获得，它主要促进带有IFN-γ(Th1)表现型的CD4+T细胞应答。可以根据GB 2 220211A中公开的方法进行制备。从化学上讲，它是带有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选在本发明的组合物中使用的是小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的颗粒大小使得它可以通过0.22μm的滤膜进行过滤除菌。这种制品在WO 94/21292中有描述，该专利申请通过引用并入本文。

适合本发明使用的另一种佐剂是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美树种智利皂荚树(Quilaja Saponaria Molina)分离的皂苷制品，由Dalsgaard等在1974年首次描述具有佐剂活性(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamteVirusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254，通过引用并入本文)。已经通过HPLC分离到保持了Quil A的佐剂活性而没有相关毒性的纯化Quil A片段(EP 0362278，通过引用并入本文)，例如QS7和QS21(又称为QA7和QA21)。QS21是从智利皂荚树的树皮得到的天然皂苷，能够诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞和优势性IgG2a抗体反应，是就本发明来说优选的皂苷。

具体的特别合适的QS21制剂已有描述，这些制剂包含固醇(WO96/33739，通过引用并入本文)。构成本发明一部分的皂苷在与胆固醇和脂质配制时，可以是分开的胶束形式、混合的胶束(优选，但不是排他地含有胆汁盐)或者是ISCOM母体的形式(EP 0 109 942 B1，通过引用并入本文)、脂质体或相关的胶体结构，比如虫样的或者环样的多聚复合体或者脂质层状结构和片层，或者处于水包油乳剂的形式(例如象WO 95/17210中那样，通过引用并入本文)。皂苷可以与金属盐结合，比如氢氧化铝或者磷酸铝(WO98/15287，通过引用并入本文)。

加强型系统涉及单磷酰脂质A(或脱毒的脂质A)和皂苷衍生物的组合，特别是象WO 94/00153(通过引用并入本文)中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者是象WO 96/33739(通过引用并入本文)中公开的其中的QS21用胆固醇进行了抑制的致反应性较低的组合物。WO 95/17210(通过引用并入本文)中描述的一种特别强力的佐剂制剂涉及生育酚和水包油乳剂中有或没有QS21和/或3D-MPL。

在实施方案中，佐剂包含固醇，合适的是胆固醇。合适的固醇(例如胆固醇)能够在保持皂苷的佐剂效应的情况下减少组合物的反应原活性。

在发明的实施方案中，佐剂包含脂质体载体。

在实施方案中，佐剂包含的皂苷和固醇的比率是皂苷∶固醇在1∶1-1∶100(w/w)。方便地，皂苷∶固醇的比率在1∶1-1∶10(w/w)或者皂苷∶固醇的比率在1∶1-1∶5(w/w)。

在实施方案中，佐剂包含的皂苷和脂多糖的比率是皂苷∶脂多糖为1∶1。

方便地，佐剂包含脂多糖，所述脂多糖在每剂中的量是1-60μg。合适地，脂多糖在每剂中的量是50μg、25μg、10μg或者5μg。

方便地，佐剂包含皂苷，所述皂苷在每剂中的量是1-60μg。合适地，皂苷在每剂中的量是50μg、25μg、10μg或者5μg。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂苷(例如QS21)。

在发明的实施方案中，佐剂包含水包油乳剂。

方便地，所述水包油乳剂包含角鲨烯和/或α生育酚。合适地，水包油乳剂是可以代谢的水包油乳剂。具体来说，水包油乳剂适合包含诸如Tween 80的乳化剂。

佐剂可以方便地包含皂苷和脂多糖。具体来说，佐剂可以包含皂苷∶脂多糖比率在1∶10-10∶1(w/w)范围的皂苷和脂多糖。

佐剂可以方便地包含皂苷和固醇。具体来说，佐剂可以包含皂苷∶固醇比率在1∶1-1∶20(w/w)范围的皂苷和固醇。

佐剂可以方便地包含皂苷和可代谢的油。具体来说，佐剂可以包含可代谢油∶皂苷比率在1∶1-250∶1(w/w)范围的皂苷和可代谢油。

佐剂可以方便地包含α生育酚。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10-11mg)可代谢油(比如角鲨烯)。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg(例如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化剂(比如Tween 80)。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7mg(例如11-13、5-6或2-3mg)母生育酚(比如α生育酚)。

在实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg (例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)。

另一个实施方案中，佐剂包含金属盐和脂质A衍生物。

这类感兴趣的佐剂系统包括那些基于与脂多糖3-de-O-酰基化单磷酰脂质A组合的铝盐的佐剂。抗原和3-de-O-酰基化单磷酰脂质A可以一起吸附在相同的金属盐颗粒上或者吸附在不同金属盐颗粒上。

合适地，佐剂包含(每个0.5mL剂量)100-750、200-500或300-400μgAl，例如以磷酸铝的形式。这类实施方案中，佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60，10-50，or 20-30μg(e.g.5-15，40-50，10，20，30，40or 50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。

在发明的实施方案中，佐剂包含含有CpG基元的免疫刺激性寡核苷酸。

免疫刺激性寡核苷酸可以用于本发明的免疫原性组合物中。用于佐剂或本发明的免疫原性组合物中的优选寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，优选寡核苷酸含有两个或以上的二核苷酸CpG基元，所述基元被至少三个，更优选至少六个或以上的核苷酸隔开。CpG基元是胞嘧啶核苷酸跟着一个鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。在优选实施方案中，寡核苷酸中的寡核苷酸间是二硫代磷酸酯，或者更优选硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其它核苷酸间连键也在发明的范围内。还包括在发明范围内的是带有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。制备硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中有描述，这些文献均通过引用并入本文。

优选的寡核苷酸的例子具有以下序列。这些序列优选含有硫代磷酸修饰的核苷酸间键合。

OLIGO 1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

OLIGO 2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT

OLIGO 3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT

OLIGO 5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT

OLIGO 6(SEQ ID NO：6)：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G

替代的CpG寡核苷酸可以包含以上的优选序列，其中含有不连续的缺失或添加。

本发明使用的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法合成(例如，参见EP 468520，通过引用并入本文)。这类寡核苷酸可以方便地利用自动合成仪来合成。

根据发明的一个方面，本发明的免疫原性组合物是用于治疗或预防由来自与免疫原性组合物中的一或多种进化支不同的一或多种进化支的HIV-1病毒株引起的疾病或感染。

另外，在发明的实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于治疗或预防由免疫原性组合物中的一或多种进化支的HIV-1病毒株引起的疾病或感染。

相应地，免疫原性组合物能够诱导对组合物中存在的进化支的同源免疫反应，也能诱导对组合物中存在的抗原株未涵盖的进化支的交叉免疫反应。免疫原性组合物因此能够广泛地治疗或预防由来自多个进化支的多个HIV-1病毒株引起的疾病或感染。

方便地，在发明的所有实施方案中，组合物中的一或多种HIV-1进化支选自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支或者HIV-1的流行重组形式(CRF)。具体来说，免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支是进化支B。

同样方便地，在发明的所有实施方案中，与免疫原性组合物中存在的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支选自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支或者HIV-1的流行重组形式(CRF)。具体来说，与免疫原性组合物中存在的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支选自A或C进化支。合适地，与免疫原性组合物中存在的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支是A和C进化支。

这些HIV-1进化支在全世界的流行率不同。相应地，发明的免疫原性组合物的适用地域不应当受到限制，可以用于治疗和预防全世界的HIV-1感染和疾病。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于诱发抗HIV-1病毒株的体液免疫反应，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种进化支不同的一或多种进化支。方便地，在这类实施方案中，也可以诱发抗来自免疫原性组合物中的一或多种进化支HIV-1病毒株的体液免疫反应。

在本发明中，体液免疫反应的特征在于强的抗原特异性抗体效价。免疫反应是通过基于ELISA的分析检测的。诱发了强体液反应表明本发明的免疫原性组合物具有广泛的免疫原性。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于给感染了HIV-1病毒株的个体赋予长期不进展者状态，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。方便地，在这类实施方案中，也可以给感染了来自免疫原性组合物中的一或多种进化支HIV-1病毒株的个体赋予长期不进展者状态。

长期不进展者(LTNPs)是这样的感染了HIV-1的患者，所述患者能够控制HIV-1感染，从而阻止疾病的进展。这样的状态往往是与存在多功能和有增殖能力的HIV-1特异性CD4+T细胞有关。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于诱发能够产生多重细胞因子的抗病毒CD4+T细胞，所述T细胞能够抗来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支的HIV-1病毒株。方便地，在这类实施方案中，可以诱导能够产生多重细胞因子的抗病毒CD4+T细胞，所述T细胞抗来自免疫原性组合物中的一或多种进化支的HIV-1病毒株。

方便地，CD4+T细胞产生IL2、IFNγ和TNFα中的两种或更多种。这些细胞可以被认为是多功能的。在这方面，CD4+T细胞产生IL2和IFNγ，或者CD4+T细胞产生IL2和TNFα，或者CD4+T细胞产生IFNγ和TNFα。合适地，CD4+T细胞产生IL2、IFNγ和TNFα。在实施方案中，CD4+T细胞表达CD40L。

展示出多功能表现型的CD4+T细胞的诱发表明了本发明的免疫原性组合物的广泛免疫原性。这类多功能CD4+T细胞的存在与控制HIV-1感染和病毒血症相关，例如在长期不进展者中感染和/或疾病没有进展。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于防止感染了HIV-1病毒株的个体中的进展型CD4+T细胞下降，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。方便地，在这类实施方案中，还防止了感染来自免疫原性组合物中一或多种进化支的HIV-1病毒株的个体中的进展型CD4+T细胞下降。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于减少或消除感染了HIV-1病毒株的个体中的病毒储库，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。方便地，在这类实施方案中，可以减少或消除感染了来自免疫原性组合物中的一或多种进化支的HIV-1病毒株的个体的病毒储库。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于在感染了HIV-1病毒株的个体中引发大量长期的HIV-1特异性多功能CD4+T细胞，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。方便地，在这类实施方案中，可以在感染了免疫原性组合物中存在的一或多种进化支的HIV-1病毒株的个体中引发大量长期的HIV-1特异性多功能CD4+T细胞。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于控制或减轻感染了HIV-1病毒株的个体中的病毒血症，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。方便地，在这类实施方案中，可以控制或减轻感染了HIV-1病毒株的个体的病毒血症，所述HIV-1病毒株来自免疫原性组合物中的一或多种进化支。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物是用于诱发抗HIV-1病毒株的抗病毒免疫反应的长期记忆，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。方便地，可以诱发抗病毒免疫反应的长期记忆，所述抗病毒免疫反应能够抵抗来自免疫原性组合物中的一或多种进化支的HIV-1病毒株。

合适地，抗病毒免疫反应包括诱导持久性的抗病毒CD4+T细胞。这种T细胞是应答来自免疫原性组合物中存在的进化支以及免疫原性组合物中没有的进化支的抗原而诱发的，因此根据本发明是交叉反应性免疫反应。

方便地，CD4+T细胞保持至少6个月。“保持”意味着CD4+T细胞能够以和它们开始被诱导时的表型状态等同的状态存在相当一段时间。例如，如果CD4+T细胞在最初被诱导时释放两种或更多种特异性细胞因子，保持的CD4+T细胞会在延续一段时间后，例如至少6个月后仍展现出相同的细胞因子特性。

合适地，CD4+T细胞保持6-24个月或者9-18个月，例如保持12个月。

相应地，本发明还提供了治疗或预防HIV感染的方法，所述方法包括将免疫原性组合物给予受试对象，诱发受试对象体内抗HIV-1病毒株的免疫反应，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。在其它实施方案中，本发明提供了本文描述的组合物的使用方法。

WO2006/013106中公开了包含本发明免疫原性组合物中可以有的一或多种抗原的融合蛋白，该申请通过引用并入本文。抗原Pol、Nef、Gag以及它们的变体和片段曾被选中包含在融合蛋白中以用于免疫原性组合物，因为它们被认为在不同HIV病毒株间有较好的保守性，因此比不太保守的抗原更可能与来自不同HIV病毒株的抗原发生交叉反应。但是，融合蛋白中引入这些抗原可能会招致无法预见的并发症，因为其中的抗原没有对应的天然蛋白。相应地，不能直接地产生融合蛋白，并且不应当假设融合蛋白与天然蛋白作用方式相同。

在发明的实施方案中，免疫原性组合物中的两、三、四或更多种抗原被融合形成融合蛋白。

方便地，将Gag融合到Pol上，或者Pol融合到Gag上；将Pol融合到Nef上或者Nef融合到Pol上，和/或Nef融合到Gag上或者Gag融合到Nef上。

合适地，在发明的融合蛋白中，Gag是p17和/或p24，和/或Pol是RT。

具体来说，将免疫原性组合物中的抗原融合形成融合蛋白是方便的，所述融合蛋白包含处于任何顺序的Nef、RT、p17和p24。合适地，抗原被融合形成包含p24-RT-Nef-p17的融合蛋白。该融合蛋白被称为F4，在实施例中有描述。

融合蛋白中的抗原可以直接相互融合或者借助连接分子融合。这类连接分子可以包含含有一或多种氨基酸的异源氨基酸序列。

融合蛋白中的抗原可以来自相同的HIV病毒株，可以来自相同HIV-1进化支中的不同病毒株，或者可以来自不同HIV-1进化支中的不同病毒株。

在一个实施方案中，融合蛋白中的抗原来自两、三或四种不同HIV-1进化支的HIV-1病毒株。替代地，融合蛋白中的所有抗原来自相同HIV-1进化支中的HIV-1病毒株(们)。

发明所述的肽可以与其它抗原联用。具体来说，这包括HIV-1env蛋白及其片段或变体。优选的env形式是gp120、gp140和gp160。所述env可以是例如WO 00/07631中描述的来自被称为R2的HIV-1B进化支包膜克隆的包膜蛋白，或其片段或变体。Env也可以是被称为W61.D的gp120颗粒，或其片段或变体。

因此发明还提供了根据发明还包含HIV-1env蛋白或其片段或变体的免疫原性组合物。为了清楚起见，这里使用的术语“片段”和“变体”的含义如上文的定义。

在实施方案中，本发明的包含融合蛋白的免疫原性组合物还包含一或多种含有抗原的非融合多肽。

在实施方案中，非融合多肽中的抗原所来自的HIV-1病毒株与融合蛋白中的至少一种抗原是来自相同进化支。

替代地，非融合多肽中的抗原所来自的HIV-1病毒株与融合蛋白中的一或多种进化支不同。

在实施方案中，非融合多肽包含Env。例如，所述非融合多肽包含gp120、gp140或gp160中的一或多种。

HIV-1包膜糖蛋白gp120是用于附着在宿主细胞上的病毒蛋白。gp120蛋白是中和抗体的主要靶点，但不幸的是蛋白中最有免疫原性的区域(V3环)也是蛋白中最多变的部分。gp120蛋白还含有能被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位。这些效应细胞能够清除感染了病毒的细胞，因此构成了第二种主要的抗病毒免疫机制。较之中和抗体的靶点区域，一些CTL表位在不同HIV-1病毒株之间似乎较为保守。因为这个原因，gp120和gp160可以作为用于引发细胞介导的免疫反应(特别是CTL)的疫苗中的抗原成分。

在一个实施方案中，发明所述免疫原性组合物中的一或多种抗原之一来自HIV-1，所述HIV-1来自选自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的任何一个进化支或者HIV-1流行重组型(CRF)。当免疫原性组合物中存在一个以上抗原时，则所有抗原可以来自相同的进化支。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物中的一或多种抗原之一来自B进化支的HIV-1病毒株。

例如在某些实施方案中，当免疫原性组合物中存在两种抗原时，两种抗原都是来自B进化支的HIV-1病毒株；或者当免疫原性组合物中存在三种抗原时，三种抗原都是来自B进化支的HIV-1病毒株；或者当免疫原性组合物中存在四种抗原时，四种抗原都是来自B进化支的HIV-1病毒株等等。

替代地，在发明的免疫原性组合物中，免疫原性组合物中的一或多种抗原之一来自C进化支的HIV-1病毒株。

例如在某些实施方案中，当免疫原性组合物中存在两种抗原时，两种抗原都是来自C进化支的HIV-1病毒株；或者当免疫原性组合物中存在三种抗原时，三种抗原都是来自C进化支的HIV-1病毒株；或者当免疫原性组合物中存在四种抗原时，四种抗原都是来自C进化支的HIV-1病毒株等等。

本发明的免疫原性组合物或疫苗含有免疫保护或免疫治疗量的多肽，可以通过常规技术进行制备。

在实施方案中，单个剂量免疫原性组合物中每种抗原的总量是0.5-25μg、2-20μg、5-15μg或大约10μg。

合适地，单个剂量免疫原性组合物中的融合蛋白的总量是10μg，和/或单个剂量免疫原性组合物中的非融合多肽的总量是20μg。

在实施方案中，单个剂量免疫原性组合物中所有抗原的总量是0.5-50μg、2-40μg、5-30μg、7-20μg或者大约30μg、大约20μg或大约10μg。

免疫原性组合物剂量中的蛋白含量要挑选能够在典型受体中诱发免疫反应，但没有明显的有害副作用的量。根据采用的具体免疫原和所选的给剂或接种方案，这个量会有所变化。通过包括对受试对象中的相关免疫反应进行观察的标准研究可以明确对于特定免疫原性组合物来说最佳的用量。

药物组合物的给药可以采取一个或者一个以上的个别剂量，例如以含有相同多肽的组合物的重复剂量，或者异质“初免-强化”接种方案的形式。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物首先以两个或三个剂量给予受试对象，其中所述剂量间隔两周到三个月的时间，优选一个月。

方便地，将组合物每6-24或9-18个月，例如每年一次给予受试对象(例如作为加强剂)。例如，将组合物以6个月或1年的间隔给予受试对象(例如作为加强剂)。

合适地在这方面，之后将组合物给予受试对象能够加强先期给予相同受试对象的组合物引发的免疫反应。

在实施方案中，发明的免疫原性组合物被作为治疗或预防HIV-1病毒株引起的疾病或感染的初免-强化方案的一部分，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。

方便地，组合物是初免剂量。替代地，组合物是强化剂量。

合适地，给予了两种或更多种初免和/或强化剂量。

异质初免-强化方案在初免和强化步骤中给予的是不同形式的免疫原性组合物或疫苗，其中每个本身可以包括两次或更多次给药。初免组合物和强化组合物应当有至少一种共同的抗原，虽然不一定是抗原的相同形式，但可以是相同抗原的不同形式。

根据本发明，初免强化接种可以是同质初免强化方案或者异质初免强化方案。同质初免强化方案使用相同的组分进行初免和强化，例如本发明的免疫原性组合物.

异质初免强化方案可以用基于蛋白和DNA的制剂来进行。这种策略被认为可以有效地诱发广泛的免疫反应。有佐剂辅佐的蛋白疫苗主要诱发抗体、CD4+T细胞免疫反应，而以质粒或重组载体形式递送DNA可以诱发强烈的CD8+T细胞应答。因此，联合接种蛋白和DNA可以提供更多样的免疫反应。这对HIV来说特别相关，因为中和抗体、CD4+T细胞和CD8+T细胞被认为对抗HIV-1的免疫防御是重要的。

在一个实施方案中，以病毒载体来递送DNA。例如，病毒载体可以衍生自腺病毒。在其它实施方案中，病毒载体可以是象US20100055166中描述的，该申请对病毒载体和初免强化方法的公开通过引用并入本文。在另一个实施方案中，病毒载体可以衍生自麻疹病毒。在其它实施方案中，病毒载体可以是象WO2010/023260中描述的重组麻疹病毒，该申请对病毒载体和初免强化方法的公开通过引用并入本文。

相应地，本发明还提供了治疗或预防HIV感染的方法，所述方法包括将第一组合物给予受试对象和随后将第二组合物给予受试对象，其中给药后，受试对象有可检测到的抗HIV-1株的免疫反应，所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。在替代实施方案中，方法可以是同质初免加强方案或者异质初免加强方案。

在发明其它方面中，本发明的免疫原性组合物身疫苗组合物。

New Trends and Developments in Vaccines，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中概括描述了疫苗的制备，该文献通过引用并入本文。

在发明其它方面中，提供了发明的免疫原性组合物或疫苗在制造用于治疗或预防HIV-1病毒株引起的疾病或感染的药物中的用途。

在发明其它方面中，提供了根据以上描述的所有情况治疗或预防HIV-1疾病或感染的方法，所述方法包括将发明的免疫原性组合物或疫苗给予受试对象的步骤。

发明人希望本文中的术语“包含(comprising、comprise和comprises)”在任何情况下任选可以分别被术语“由...构成(consisting of、consist of和consistsof)”代替。

文中与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案还适用于与本发明的“疫苗”相关的实施方案，反之亦然。

为了更好地理解本发明，给出了以下实施例。这些实施例仅用于阐述的目的，无论如何也不应当理解为对发明范围的限制。

实施例

以下实施例和数据用于对发明的阐述，而非限制。

1.制备佐剂

溶于有机溶剂的脂质(比如来自卵黄的或者合成的磷脂酰胆碱)和胆固醇以及3D-MPL混合物在真空下(或者替代地在惰性气体气流下)干燥。然后加入水溶液(比如磷酸盐缓冲液)，搅动容器直至所有的液体悬浮起来。然后将悬浮液高压微射流均质，直至脂质体大小被减小到大约100nm，然后经0.2μm滤膜过滤除菌。可以用挤压或超声处理代替该步骤。

一般地，胆固醇∶磷脂酰胆碱的比率是1∶4(w/w)，加入水溶液使胆固醇的终浓度达到10mg/ml。

脂质体大小约100nm，以SUV(小单室囊泡(small unilamelar vesicles))来称呼。脂质体本身随时间推移是很稳定的，没有致融合能力。

将大体积无菌SUV加入PBS。PBS成分是Na₂HPO₄：9mM、KH₂PO₄：48mM、NaCl：100mM pH 6.1。将溶于水溶液的QS21加入SUV。3D-MPL和QS21的终浓度是各100μg/ml。在每次加入成分时，将中间产物搅拌5分钟。检查pH，需要时用NaOH或HCl调节到6.1+/-0.1。

2.制备HIV-1抗原

2.1构建和表达HIV-1p24-RT-Nef-p17融合(“F4”)以及密码子优化的F4(co)(“F4co”)。

2.1.1未经密码子优化的F4

HIV-1gag p24(衣壳蛋白)和p17(基质蛋白)、逆转录酶以及Nef蛋白在大肠杆菌B834菌株(B834(DE3)，是BL21(DE3)的甲硫氨酸营养缺陷型亲代)中表达，受噬菌体T7启动子(pET表达系统)调控。

它们被表达为单个融合蛋白，含有四种蛋白的完整序列。成熟的p24编码序列来自HIV-1BH10分子克隆，成熟p17序列和RT基因来自HXB2，Nef基因来自BRU分离物。

诱导后，重组细胞表达相当高水平的p24-RT-Nef-p17融合蛋白，达到总蛋白的10％。

当在22℃培养和诱导细胞时，p24-RT-Nef-p17融合蛋白主要局限在细菌裂解物的可溶组分中(即使是冷冻/解冻后)。当在30℃培养时，大约30％的该重组蛋白与不溶组分结合。

融合蛋白p24-RT-Nef-p17由1136个氨基酸构成，分子量约为129kDa。全长蛋白在SDS胶上迁移到大约130kDa。根据其氨基酸序列预期其理论等电点(pI)为7.96，通过2D凝胶电泳证实了这一点。

重组质粒的详情：

名字： pRIT15436(或实验室名字pET28b/p24-RT-Nef-p17)

宿主载体：pET28b

复制子：colE1

选择方法：卡那霉素

启动子： T7

插入片段：p24-RT-Nef-p17融合基因

重组蛋白的详情：

p24-RT-Nef-p17融合蛋白：1136个氨基酸.

N末端-p24：232个氨基酸-铰链：2个氨基酸-RT：562个氨基酸-铰链：2个氨基酸-Nff：206个氨基酸-P17：132个氨基酸-C末端

核苷酸和氨基酸序列：

核苷酸序列

ggccccattagccctattgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagctgagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta

ggtgggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatg ggcctactgtaagggaaaggaatgagacgagctgaggccaggcaggcaggatggggtgggaggcaggcatctcgagacctgggaaaaacatgggaggcaatcacaagtag caatacaggcaggctaccaatgctgcttgtgcctgggctagaaggcacaaggaggagggagggagggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact tacaagggcaggctgtagatcttaggccactttttaaaagaaaaggggggactgggaaggggctaattcactcccaacggaaggacaaggatatccttggatctgtgggatcta ccacacacaagggctacttccctgattggcagaactacacaccaggggccaggggtcagatatccactgacctttgggatggtgctacaaggctagtaccagttggag ccagataaggtaggaagaggccaataaaggagagaacaccaggcttgttacaccctgtgagcctgcatgggaatggatgaccctgagagaggaagtgttagagtg ggaggtttggacaggccggcctaggcatttcatcacgtgggcccgaggagctgcatccgggagtacttcaaggaactggc

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa[SEQ ID NO：7]

p24序列是粗体

Nef序列带有下划线

序列框：经基因构建引入的核苷酸

氨基酸序列

GPISPIETVSVKLKPG 250

MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300

KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350

FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400

KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450

TPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLN 500

WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550

GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV 600

KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE 650

FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700

VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750

ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV

MGGK 800

WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850

CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900

RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950

EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000

NC

MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050

NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100

TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 1136

[SEQ ID NO：8]

P24序列：氨基酸1-232(粗体)

RT序列：氨基酸235-795

Nef序列氨基酸798-1002

P17序列：氨基酸1005-1136

序列框：通过基因构建引入的氨基酸

K(赖氨酸)：取代了色氨酸(W)。引入来消除酶活性的突变。

重组蛋白的表达：

在pET质粒中，靶基因(p24-RT-Nef-p17)处于强噬菌体T7启动子的调控下。该启动子不被大肠杆菌RNA聚合酶识别，依赖于宿主细胞中的T7RNA聚合酶来源。B834(DE3)宿主细胞含有处于lacUV5调控下的T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝，可以通过向细菌培养物中加入IPTG来诱导其表达。

预培养物于37℃在摇瓶中生长至log中期(A620：0.6)，然后在4℃保持过夜(以避免稳定期培养物)。将培养物生长在补充有1％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的LBT培养基中。培养基中加入葡萄糖的优点是能够减少基础重组蛋白表达(以避免cAMP介导的对lacUV5启动子的抑制)。

用4℃过夜保存的10ml培养物接种200ml含有卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在30℃和22℃生长，当O.D.620达到0.6时，加入IPTG(终浓度1mM)。培养物再温育3、5和18小时(过夜)。采集诱导前和诱导3、5和18小时后的样品。

提取物的制备如下：

将细胞沉淀悬浮在裂解缓冲液*中(理论O.D.为10)，通过在French挤压仪(20.000psi或1250巴)中挤压四次破碎。粗提取物(T)于20.000g离心30分钟，将溶解的(S)和不溶的(P)组分分开。

*裂解缓冲液：50mM Tris-HCL pH 8.0、1mM EDTA、1mM DTT+蛋白酶抑制剂混合液(Complete/Boerhinger)。

SDS-PAGE和Western印迹分析：

将对应于不溶沉淀(P)、上清液(S)和粗提取物(T)的组分在10％还原型SDS-PAGE上跑胶。通过考马斯蓝染色和Western印迹(WB)检测p24-RT-Nef-p17重组蛋白。

考马斯染色：p24-RT-Nef-p17蛋白呈现为：

位于±130kDa的一个条带(与计算的MW相符)

理论MW：128.970道尔顿

表观MW：130kDa

Western印迹分析：

试剂＝-抗RT(p66/p51)单克隆抗体

购自ABI(Advanced Biotechnologies)

稀释度：1/5000

-偶联了碱性磷酸酶的抗小鼠抗体

稀释度：1/7500

表达水平： -20小时后非常强的p24-RT-Nef-p17特异性条带

在22℃诱导，代表多达10％总蛋白(见图9A)。

重组蛋白“溶解性”：

“新鲜的”细胞提取物(T、S、P组分)：经22℃/20h的生长/诱导，几乎全部p24-RT-Nef-p17融合蛋白从细胞提取物的可溶组分中回收到(图9A)。经30℃/20h的生长/诱导，大约30％的p24-RT-Nef-p17蛋白与不溶组分结合(图9A)。

“冷冻/解冻(Freezing/thawing)”(S2、P2组分)：

将可溶(S1)组分(22℃诱导20h)保存在-20℃。解冻并离心20.000g/30分钟：S2和P2(重新悬浮在1/10体积中)。

裂解缓冲液加DTT：几乎所有p24-RT-Nef-p17融合蛋白仍然可溶(只有1-5％沉淀)(见图9B)

裂解缓冲液不加DTT：85-90％的p24-RT-Nef-p17仍然可溶(图9B)

F4蛋白用下述纯化方法纯化。

2.1.2密码子优化的F4密码子

以下多核苷酸序列经过密码子优化使得密码子的使用类似大肠杆菌中高表达的基因的密码子使用。氨基酸序列与上文中给出的没有密码子优化的F4的氨基酸序列相同。

F4co的核苷酸序列：

ggcccgatatctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatggatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagagatttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtacaatacaccggtatttgcaataaagaaaaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagattttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactagggatcccacatccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatattttagtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaacaatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtctccggcgatatttcagagctgtatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccggatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattgggcagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactactcccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccggacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgatattcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtccgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacggaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggggtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaatggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgcatgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattactactgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaaacatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaatttgtcaacacgccgccacttgttaagctttggtaccagcttgaaaaggagccgatagtaggggcagagaccttctatgtcgatggcgccgcgaatcgcgaaacgaagctaggcaaggcgggatacgtgactaataggggccgccaaaaggtcgtaacccttacggataccaccaatcagaagactgaactacaagcgatttaccttgcacttcaggatagtggcctagaggtcaacatagtcacggactctcaatatgcgcttggcattattcaagcgcagccagatcaaagcgaaagcgagcttgtaaaccaaataatagaacagcttataaagaaagagaaggtatatctggcctgggtccccgctcacaagggaattggcggcaatgagcaagtggacaagctagtcagcgctgggattcgcaaggttctt

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[SEQ ID NO：9]

p24序列以粗体表示

Nef序列带有下划线

序列框：经基因构建引入的核苷酸

将与非密码子优化的F4有关的过程应用到密码子优化的序列。

重组质粒的详情：

名称： pRIT15513(实验室名称：pET28b/p24-RT-Nef-p17)

宿主载体： pET28b

复制子： colE1

选择方法：卡那霉素

启动子： T7

插入： p24-RT-Nef-p17融合基因，经密码子优化的

经密码子优化的F4基因在大肠杆菌BLR(DE3)细胞中表达，该细胞是B834(DE3)菌株的recA-衍生物。RecA突变防止有可能产生λ噬菌体。

预培养物于37℃在摇瓶中生长至log中期(A₆₂₀：0.6)，然后在4℃保存过夜(以避免稳定期培养物)。

将培养物生长在补充有1％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的LBT培养基中。生长培养基中加入葡萄糖的优点是能够减少基础重组蛋白表达(以避免cAMP介导的对lacUV5启动子的抑制)。

用4℃过夜保存的10ml培养物接种200ml含有卡那霉素的LBT培养基(不含葡萄糖)。培养物在37℃生长，当O.D.620达到0.6时，加入IPTG(终浓度1mM)。培养物再在22℃温育19小时(过夜)。采集诱导前和诱导19小时后的样品。

如下进行提取物制备：

将细胞沉淀重新悬浮在样品缓冲液中(理论O.D.为10)，煮沸并直接加样到SDS-PAGE中。

SDS-PAGE和Western印迹分析：

粗提取物样品在还原型SDS-PAGE上跑胶。

p24-RT-Nef-p17重组蛋白通过考马斯染色(图10)和Western印迹检测。

考马斯染色：p24-RT-Nef-p17蛋白呈现为：

位于±130kDa的一个条带(与计算的MW相符)

理论MW：128.967道尔顿

表观MW：130kDa

Western印迹分析：

试剂＝-兔多克隆抗RT(兔PO3L16)

稀释度：1/10.000

-兔多克隆抗Nef-Tat(兔388)

稀释度1/10.000

-偶联碱性磷酸酶的抗兔抗体

稀释度：1/7500

于22℃诱导19小时以上后，重组BLR(DE3)细胞以非常高水平表达F4融合蛋白，占总蛋白的10-15％。

与来自天然基因的F4相比，由密码子优化基因得到的F4重组产物的蛋白谱略微简单。60kDa处主要的F4相关条带以及下面的小条带都消失了(见图10)。

2.2制备F4co GMP批次

利用大肠杆菌B1977株的冷冻菌种制备预培养物。所述菌株是转化了pET28b衍生物的BLR(DE3)株，其中所述质粒衍生物含有编码F4的密码子优化序列(F4co)。菌种培养力经确定约为1E+10菌落形成单位/ml。

将菌种解冻至室温，取500μl接种2升Erlenmeyer摇瓶(没有挡板)，其中含有补充了50μg/ml卡那霉素的400ml预培养培养基(根据Zabriskie etal.(J.Ind.Microbiol.2：87-95(1987)改进的)，通过引用并入本文)。

然后将接种过的摇瓶在37℃(±1℃)和200rpm(New BrunswickScientific，Innova 4430，震荡距离为1时)温育。650nm的光密度达到(OD_650nm)2时(对应大约5个半小时的温育)，中止预培养。中止培养后立即将预培养物用于接种。

当需要接种大规模发酵罐时，可以将多个批次的预培养物合并。

2.3纯化F4co(p24-RT-Nef-p17)-大肠杆菌菌株B1977

2.3.1概述

为了纯化融合构建体蛋白F4co，可以使用的纯化过程包含两个层析步骤，和最后的缓冲液交换及蛋白重新折叠的渗滤步骤。所述方法包含以下主要步骤：

●OD90的细胞糊匀浆，加入8M脲

●在CM hyperZ(正离子模式)上进行阳离子交换层析

●在QAE 550C(正离子模式)上进行阴离子交换层析

●切向流过滤

●过滤除菌

在最终规模1.5L的匀浆OD 90处成功生产了三个重现批次。由三个不同细胞培养回收物获得的一致结果显示了纯合方法的稳定性。

三个批次产生了1.3-1.6g的F4co。由于产物的异质性，全长产物的纯度约为93-94％(考马斯蓝染色的SDS胶的密度扫描)。

以下呈现了由三个重现批次获得的结果。

3.3.2分析方法

利用Lowry分析确定总蛋白浓度。

为了进行SDS-PAGE，样品在还原或非还原SDS-PAGE样品缓冲液(+/-β-mercaptoethanol)中制备，并于95℃加热5分钟。蛋白在150V下在4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离90分钟，使用的是1mm厚的预制NuPage胶或Criterion XT胶(Bio-Rad)。蛋白用考马斯蓝R250显现。

为了进行抗F4western印迹，在4℃下将蛋白从未染色的SDS胶转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)，70V转移2小时或者30V过夜转移。利用抗F4抗体检测F4。偶联碱性磷酸酶的抗兔抗体(Promega)与一抗结合，利用BCIP和NBT作为底物使蛋白条带显现。

为了进行抗大肠杆菌western印迹，蛋白如上经SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜。利用多克隆抗大肠杆菌抗体检测残余宿主细胞蛋白。如上所述利用碱性磷酸酶反应显现蛋白条带。

样品在无菌条件下在Eppendorf杯中进行了不同温度(通常是-20℃、4℃、RT、30℃)的稳定性测试。将样品温育指定的时间，然后在还原条件下经SDS-PAGE分析来检测F4降解或者在非还原条件下检测F4凝聚。

为进行分析性SEC，蛋白在分析型Superdex 200 HR10/30柱子(Amersham Biosciences)中的10mM Tris缓冲液pH 8.5-0.4M精氨酸-10mM亚硫酸钠-1mM EDTA(流速0.5ml/min)中进行分离。于280nm在线监测洗脱蛋白。

使用Bio Whittaker的试剂盒采用LAL测试来测量纯化批次中的内毒素。大肠杆菌055：B5内毒素作为标准。37℃在96孔分光光度计(Spectramax 250，Molecular Devices)中记录动力学曲线，使用SoftmaxPro分析动力学曲线。

用Roche的脲/氨溶液试剂盒测量残存的脲。用分光光度计(Ultraspec II，Pharmacia)在340nm监测NADH的消失。

3.3.3纯化过程

匀浆OD90

50mM Tris pH 8.0，10mM DTT

↓

加入8M脲，调节至pH 7.0

↓

(+)CM hyperZ层析(Streamline 100，1l)

PO4缓冲液pH 7.0-8M脲-2mM DTT，预洗脱液130mM NaCl，洗脱液

350mM NaCl

↓

5×稀释至4mS/cm，并调节至pH 9.0

↓

(+)QAE 550C层析(Vantage 60/55，0.76l)

Tris缓冲液pH 9.0-8M脲-2mM DTT，预洗脱70mM NaCl，洗脱200mM

NaCl

↓

TFF浓缩/渗滤(Omega 30kDa，0.1m²)

10体积10mM Tris缓冲液pH 8.5-0.4M精氨酸-10mM亚硫酸钠-1mM

EDTA

↓

无菌过滤(Millipak 20)

2.3.4各重现批次的结果

随访

图11中显示了作为典型例子的批次1的纯化随访。该SDS-PAGE和相应的抗F4Western印迹上只分析了F4co阳性组分。

在图3A中的凝胶上，可以看到随着蛋白纯度的提高位于大约130kDa处的全长F4co条带增加。泳道2显示了匀浆中的F4co的比例。从CM洗脱物中回收到F4co，许多HCP被除去(泳道3)。第二个纯化步骤后在QAE洗脱物中已经达到了最终的产物纯度(泳道4)。超滤后的截留物中F4co没有变化(泳道5)，泳道6代表纯化的产物。由于产物的异质性，在SDS胶上可以看到几个低分子量条带；图3B的抗F4co Western印迹中也检测到了这些条带。

纯度

为了确认产物的一致性，图12A和12B中显示了三个纯化批次(threepurified bulks)的CB染色SDS胶和抗F4 Western印迹的比较。此外，用抗个别蛋白(图13A-13D中的抗p24、抗RT、抗Nef-Tat和抗p17-His)的抗体进行了Western印迹。

SEC分析

还通过在分析型Superdex 200柱子上进行的大小排阻层析SEC分析比较了三个纯化批次。下图14中比较了三个层析结果。

图12A中SDS凝胶上的和图12B以及13A-13D中的Western印迹上的F4co蛋白模式的相似性表明批次之间有非常好的一致性。

全长F4co和低分子量(LMW)条带在凝胶和Western印迹上显示的密度相似。凝胶上看到的LMW条带显然与产物相关：在下图15中，它们能被抗F4的抗体和/或针对个别蛋白的抗体识别，但在抗大肠杆菌的Western印迹中没有检测到。

抗大肠杆菌western印迹是用每个纯化批次每泳道10μg蛋白进行的。没有可见条带进一步表明了产物的纯度和SDS胶上的可见条带与产物有关。与标准品(0.1-1μg匀浆)的比较表明，残留的HCP杂质在所有三个纯化批次中一致地低于1％。

总和来看，这些数据全都展示了产物的纯度和不含杂质，也展示了F4co的异质性。重要的是，数据显示了来自不同发酵批次的纯化物质在批次之间有优良的一致性。

回收和产量

根据CB染色的SDS胶和总蛋白回收量(利用Lowry测试测量的蛋白浓度)估计每个纯化步骤后的F4co回收量。

作为例子，图16展示了批次3的生产过程中收集到的所有组分。沉积在凝胶上的样品体积与每个收集到的组分的体积等同，并且与图16中的泳道2中匀浆体积直接相关。因此目测全长F4co条带的密度可以估计出回收量。

SDS凝胶显示了泳道2中的匀浆和F4co起始含量。CM柱子捕获了粗匀浆中的所有F4co；而大量HCP在pH 7.0与树脂没有相互作用，而是与FT一起被清除(泳道3)。在预洗脱中可以看到少量流失，导致产物的条带样式简化且HCP去除增多。用350mM NaCl几乎定量地将全长F4co回收到CM洗脱物中(泳道5)。

之后的步骤中几乎没有检测到F4co的流失。FT和QAE柱子的预洗脱物中可以看到进一步的HCP和LMW F4co条带去除(泳道7和8)。在QAE洗脱物中得到高F4co回收和终产物纯度(泳道9)。

超滤步骤后可以发现一些产物流失。该流失估计有大约10-15％，可能原因是蛋白吸附到了UF膜上因为滤过液中没有发现较大量的蛋白(泳道11和12)。

根据这些SDS胶，所有三个批次中F4co的整体回收率似乎高于50％。

3.F4在人受试对象中的免疫原性

3.1方法学

在本实施例中，HIV-1疫苗候选物每剂含有作为活性成分的10、30或90μg的F4重组蛋白，辅佐以AS01_B或者用水重溶用于注射(WFI)。

疫苗抗原被制备为冻干小团，其中在磷酸盐缓冲液中含有F4抗原、蔗糖、EDTA、精氨酸、聚山梨醇酯80和亚硫酸钠。基于AS01_B脂质体的佐剂系统含有50μg MPL和50μg QS21，是按照以上实施例1制备的。

含有F4抗原的冻干组分和含有AS01_B佐剂系统或WFI的液体组分，都装在单剂量的3ml玻璃瓶中，由给予疫苗的人员在注射前不久重溶。瓶中的内容物溶解后，用注射器汲取0.5ml重溶的疫苗溶液以便进行肌内给药。

试验参与人是HIV-1感染风险低的年龄在18-40岁的健康男性和女性成年人，他们以前没有参与过其他HIV-1疫苗研究或者接受过MPL。要求受试对象在首次接种疫苗前的8周内对于抗HBV核心抗原(HBc)、丙肝病毒(HCV)、HIV-1和HIV-2抗体是血清阴性的，并且是HBV表面抗原(HBs Ag)和HIV-1p24抗原阴性的(所有测试使用Abbott AxSYM)。参与人员的录用使用了标准的入选标准，详情见ClinicalTrials.gov注册表。

180名受试对象被5∶1随机分到佐剂组和无佐剂组中。三个各有50名受试对象的组接受逐渐增量的溶于AS01B的10、30或90μg F4，三个各有10名受试对象的组接受逐渐增量的溶于注射用水(WFI)的F4。研究的观察人员不知道佐剂情况，但对抗原含量知道。每名受试对象在第0个月接受第一剂疫苗，第1个月接受第二剂，是注射到非优势臂的三角肌。采集接种疫苗前(第0天)、第二剂疫苗后的两周(第44天)和一个月(第60天)以及第6个月(第180天)和12个月(第360天)时的血样进行安全性和免疫反应评估。

研究参与者的平均(±SD)年龄是22.3(±4.62)岁(范围：18-40岁)，63.3％是女性，群体主要是白种人/高加索人(96.7％)。六个试验组之间没有观察到基础人口统计学差别。所有受试对象接受了两个剂量的测试疫苗，180名受试对象中的176个完成了试验。第12个月的免疫原性实验方案同期组包括了150名受试对象(83.3％)。被排除在分析之外的原因总结如下。

3.2安全性

每次疫苗给剂后，在日程卡上连续7天记录诱发的局部症状(注射部位疼痛、发红、肿胀)、整体症状(发烧、疲劳、头痛、出汗、肌肉疼痛)和肠胃症状(恶心、呕吐、腹泻、腹痛)。按照1到3的等级给症状严重程度打分，其中第3等级的症状定义为直径超过50mm的发红或肿胀，或者39.0℃以上高烧以及其他任何会妨碍日常行动的症状。每次疫苗给剂后对非诱发性症状(unsolicited symptom)记录30天，而严重不良事件(SAEs)在整个试验过程中都要记录。

对所有接种疫苗的同期组进行了致反应性和安全性分析。以正好95％置信区间(CI)计算报告诱发和/或非诱发性局部和整体症状的受试对象的数量和百分比。未对安全性数据进行正式的统计比较。

每次疫苗给剂后，与F4/WFI组相比，F4/AS01_B组在接种后的7天内观察到明显更高的致反应性(图17)。在F4/AS01_B组中接种疫苗后的7天内诱发和非诱发性症状的全部发生率是总给剂数的99.0-100.0％，而在F4/WFI组中是45.0-75.0％。而且，第二次疫苗给剂后，F4/AS01_B组中的整体症状发生率更高。在F4/AS01_B组中，全部剂量的约三分之一出现第3等级的症状。相反，在F4/WFI组中，没有报告与接种疫苗有关的诱发或非诱发性第3等级的症状。

F4/AS01_B组中不同抗原剂量水平之间没有观察到致反应性的差别。注射部位疼痛是最常见的诱发性局部症状。F4/AS01_B组中在96.0-98.0％的剂量后出现，而在F4/WFI组中10.0-30.0％的剂量后出现。F4/AS01_B组中≤10.1％剂量后发生第3等级严重程度的注射部位疼痛。只有F4/AS01_B组报告了发红和肿胀，分别在19.0-35.0％和20.0-25.0％的剂量后发生。最常见的整体诱发性症状在F4/AS01_B和F4/WFI组中分别是疲劳(66-77％、30-45％的剂量)和头痛(58-62％、20-25％的剂量)。F4/AS01_B组中给定第3等级诱发性整体症状的总体每剂量发生率是≤12.1％。

在接种疫苗后的30天期间内，F4/WFI组中50.0-70.0％的受试对象报告了非诱发性症状，而F4/AS01_B组中有60.0-84.0％的受试对象有报告。F4/AS01_B组中30.0-44.0％的受试对象的症状(最常见寒战和注射部位反应)被认为与接种有因果关系，只有少数达到第3等级的严重程度。症状总体上是暂时性的，消退后没有后遗症，通常在两到三天内消退。整个研究期间，F4/AS01_B组中报告了6个SAEs。全部被认为与接种无关，并且消退后没有后遗症。研究期间没有发生死亡，没有受试对象因为不良事件而退出研究。

3.3T细胞应答

用p17、p24、RT和Nef肽集合仅刺激后，通过细胞内细胞因子染色(ICS)来评价白介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CD40配体(CD40L)的表达，从而评估CD4+T细胞应答。采血后6小时内，用标准的Ficoll-Isopaque密度梯度离心从全血细胞分离外周血单核细胞(PBMC)，根据以前描述的方法学[参见Maecker HT，Maino VC，Picker LJ(2000)Immunofluorescence analysis of T-cell responses in health and disease.J ClinImmunol 20：391-399和Maecker HT，Dunn HS，Suni MA，Khatamzas E，PitcherCJ，et al.(2001)Use of overlapping peptide mixtures as antigens for cytokineflow cytometry.J Immunol Methods 255：27-40，分别通过引用并入本文]改进后进行ICS，所得细胞在液氮中冷冻保藏用于进一步分析。

简单来说，在有抗CD28和抗CD49d抗体(BD Biosciences，Belgium)的情况下，解冻的PBMC在体外用重叠11个氨基酸的多个15聚体肽的集合(Eurogentec，Belgium)进行刺激，所述15聚体肽覆盖B进化支p17、p24、RT或Nef匹配的抗原的序列。37℃温育两小时后，加入胞内阻断剂布雷菲德菌素(Brefeldin)A(BD Biosciences，Belgium)来抑制另外的过夜温育期间的细胞因子分泌。随后收集细胞，进行表面标记物CD4+和CD8+(BD Biosciences)染色，然后固定(Cytofix/Cytoperm kit，BD Biosciences)。然后将固定的细胞透化并用IL-2，IFN-γ，TNF-α和CD40L的标记抗体(BD Biosciences)染色，洗涤，重悬于含有胎牛血清的磷酸盐缓冲液中，利用FACSCanto流式细胞仪和FACSDiva软件(BD Biosciences)或FlowJo软件(Tree Star)经流式细胞术分析。

为了评估疫苗诱发的CD4+T细胞的进化支交叉反应性，利用由A和C进化支HIV-1病毒株的共有序列得到的肽集合，经ICS分析第0和44天收集的PBMC中CD40L的表达以及IL-2、IFN-γ和TNF-α的产生情况。给p24和p17使用的A进化支序列来自天然分离物TZA173(Tanzania)，RT和Nef使用的A进化支序列来自天然分离物KE MSA4070(Kenya)。所有抗原使用的C进化支序列来自病毒株ZM651。这项探索性调查如上所述进行，但只使用了F410μg/AS01_B组的受试对象的样品。

ICS结果分别表示为应答p17、p24、RT或Nef抗原时，表达免疫标记物IL-2，IFN-γ，TNF-α和/或CD40L的总CD4+和CD8+T细胞的频率(百分数表示)。如果抗原特异性CD4+应答比截止值高或者相等，受试对象被认为是有反应者。根据处于95百分位数的全部双阳性抗原特异性CD4+T细胞(即表达IL-2、IFN-γ、TNF-α和CD40L标记物中的至少两种的细胞)中的最大值，给不同抗原选择截止值为0.03％双阳性抗原特异性CD4+T细胞。

在遵照规定免疫原性(according-to-protocol immunogenicity，ATP)同期组中进行了免疫原性分析。在每个时间点，确定每种个别抗原和至少1、2、3和所有4种抗原体外刺激后，表达IL-2和至少一种其他标记物的CD4+T细胞的频率以及有反应者的百分比。F4特异性CD4+T细胞应答界定为应答每种个别抗原时的特异性CD4+T细胞频率的总和。

第二次疫苗给剂两周后，对表达IL-2和至少一种其他标记物的CD4+T细胞频率进行双因素ANOVA统计检验，以便比较有或没有佐剂的F4的三个剂量。ANOVA模型包括剂量(10、30和90μg)和佐剂(AS01_B和WFI)作为固定的效应。为了获得常态分布的反应，分析在log10(CD4+T细胞频率)上进行。佐剂和无佐剂组之间不符合方差齐性标准。

因为对于多数抗原(除了p17)的体外刺激，剂量和佐剂之间的相互作用非常显著(p≤0.05)，并且因为AS01_B和WFI之间的差别显然很大，对log10(表达IL-2和至少一种其他标记物的CD4+T细胞频率)进行了单因素ANOVA，以比较二次给剂两周后(第44天)，AS01_B组的三个F4剂量。单因素ANOVA模型包括剂量(10、30和90μg)作为固定的效应。三个AS01_B组之间符合方差齐性标准。给针对F4抗原及其每个成分的CD4+T细胞应答进行了ANOVA分析。

进行了多重比较(Tukey-Kramer adjustment)，还评估了剂量和CD4+T细胞应答之间的关系。将几何平均值(GM)比率和它们的CI制表。给针对F4抗原及其每个成分的CD4+T细胞应答进行了分析。

3.4抗同源抗原的CD4+T细胞应答

在所有无佐剂疫苗组中，表达至少两种免疫标记物(包括IL-2)的抗原特异性CD4+T细胞频率在多数情况下低于或者接近截止值(见图18)。相反，在所有F4/AS01_B组中都观察到了非常高的有反应者比率(图19)。最高的反应者百分比出现在10μgF4/AS01_B组中，第二次疫苗给剂后两周(第44天)所有接种受试对象对至少三种抗原有反应，80.4％对所有四种抗原有反应。当考察每个抗原的CD4+T细胞反应者比率(图20)时，可以清楚看到F4/AS01_B组的反应更广泛，针对全部四种抗原，但在用RT抗原刺激后频率更高。

疫苗诱导的CD4+T细胞应答是长期的，因为10μg F4/AS01_B组中97.7％受试对象在第360天仍对两种抗原有反应，对三种和四种抗原有反应的受试对象分别是84.1％和59.1％(图19)。对F4融合蛋白的整体反应在F410μg/AS01_B组中更大并且更持久(p＜0.0001，第44天)(图21)。在该组中，产生IL-2和至少一种其他标记物的F4特异性CD4+T细胞的频率几何平均值在第44天到达几乎1.2％的峰值。

正如10μg F4/AS01_B组的细胞因子共表达谱(图22)显示的，F4/AS01_B疫苗诱导了多功能F4特异性CD4+T细胞。多数特异性CD4+T细胞表达CD40L并且产生单独的IL-2，或者与TNF-α和/或IFN-γ的组合。大约50％的F4特异性CD4+T细胞分泌至少两种细胞因子，并且这样的细胞因子共表达谱维持到了第12个月(图23)。所有抗原均观察到类似的特性(见图24&25)。

3.5CD8+T细胞应答

基于ICS方法，目前还没有检测到疫苗诱导的CD8+T细胞。

3.6抗异源抗原的CD4+T细胞应答(进化支交叉反应性)

为了评估第44天时，10μgF4/AS01_B组中疫苗诱导的CD4+T细胞应答与HIV-1非B进化支抗原的交叉反应性，用来自A和C进化支的抗原，以及作为对照的B进化支抗原进行体外刺激后分析了反应。利用p17、p24、RT和Nef肽集合进行的ICS和流式细胞术分析揭示对全部四种A和C进化支抗原的广泛交叉反应性CD4+T细胞应答(图26)。有趣的是，每个接受了10μgF4co剂量的志愿者对来自同源B进化支的RT和p24都发生了反应，并且表现出对A和C进化支相应抗原的反应(图27)。

较之这些抗原在不同进化支之间的较低水平的表位保守性，观察到这样高水平的交叉反应性是令人吃惊的。

3.7体液免疫反应

利用酶联免疫吸附检验(ELISA)分析血清中是否存在抗p17、p24、RT、Nef和F4的免疫球蛋白G(IgG)抗体反应。在每个板上包括阳性对照和校正样品以便评估每个测试样品的相对浓度，以及阴性对照来保证特异性。在VersaMax plate读数仪(Molecular Devices，Berkshire，United Kingdom)上，450nm读板，用SoftMax Pro 3.1.1.软件(Molecular Devices)进行分析。血清阳性定义为抗体浓度大于或者等于分析的截止值(对于p17，≥187mEU/ml；对于p24，≥119mEU/ml；对于RT，≥125mEU/ml；对于Nef，≥232mEU/ml；对于F4，≥42mEU/ml)。截止值的选择基于所有受试对象的接种前反应。选择对于Nef是基于接种前的95％百分位数，对于F4co、p17、p24和RT是基于接种前的99％百分位数。

用95％CI计算了每个个别抗原和融合蛋白的血清阳性比率和抗体浓度几何平均值(GMCs)。对于血清阳性比率，利用二项变量的精确法计算95％CI。GMCs的95％CI是通过取平均log10(转化的抗体的浓度)的95％CI的反log计算的。该分析的截止值以下的抗体浓度被给予截止值的一半的任意量，以便计算GMC。

体液免疫反应的特征在于AS01_B组中抗F4融合蛋白的抗体浓度强(图28)。所有含佐剂组中都观察到对F4的100％血清转换率，全部剂量水平的IgG效价类似，可以持续至第12个月。此外，引发了抗每个个别F4抗原成分的IgG抗体。在无佐剂组中，诱导了非常低的反应(见图29)。

3.8结论

结果显示F4/AS01_B辅佐的HIV-1疫苗的致反应性特性是可以接受的，没有任何安全隐患。此外，免疫原性结果表明F4/AS01_B辅佐的HIV-1候选疫苗引发了大量且持久的HIV-1特异性多功能CD4+T细胞。特别明显的是含佐剂疫苗组中反应者的整体高比率，引发了抗所有疫苗抗原的反应。有趣的是，最高反应者比率是在最低抗原剂量组(10μgF4/AS01)中观察到的，其中100％参与人员对三种HIV-1抗原有反应，80％对所有四种HIV-1抗原有反应。含佐剂疫苗组的特征在于非常高频率的F4特异性CD4+T细胞，持续至第12个月。

疫苗诱导的CD4+T细胞表达CD40L并且单独产生或者与TNF-α和/或IFN-γ组合产生IL-2，这一发现是重要和有潜力的观察，因为产生多重细胞因子的抗病毒CD4+T细胞被认为从功能上优于产生单一细胞因子的细胞。

而且，该项研究的结果显示，仅包含B进化支抗原的F4/AS01_B辅佐的HIV-1疫苗还能够引发对来自A和C进化支的全部四种抗原的广泛交叉反应性CD4+T细胞应答。鉴于HIV-1病毒在全世界的多样性，能够诱发广泛的交叉反应性和长效的免疫反应在开发HIV-1疫苗中是重要的一个考虑方面。

总之，该项研究的结果证实，F4/AS01_B辅佐的HIV-1候选疫苗的安全性和免疫原性。两种含有10μgF4蛋白并佐以AS01的疫苗剂量诱发了强的多功能、广泛反应性和持久的CD4+T细胞应答。该免疫反应的特性使该疫苗成为有潜力的AIDS疫苗候选物，不仅是预防意义上的也可以作为改变病情的治疗性疫苗。

4.来源于不同进化支的F4co的免疫原性

在本实施例中，测试了来源于B和C进化支的密码子优化F4所引发的T细胞应答对来自A、B和C进化支的肽的交叉反应性。

4.1方法学

用于免疫接种的B进化支F4co蛋白如实施例2所述制备，并具有相同的序列。

用于免疫接种的C进化支F4co利用具有以下序列的共有C进化支序列制备：

F4co C进化支共有抗原的氨基酸序列

MVIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTSNPPIPVGDIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIKQGPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQATQEVKNWMTDTLLVQNANPDCKTILRALGPGATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLHMGPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALTAICEEMEKEGKITKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEGFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRAQNPEIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRAKIEELREHLLKWGFTTPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKWTVQPIQLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGAKALTDIVPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGHDQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAKMRTAHTNDVKQLTEAVQKIAMESIVIWGKTPKFRLPIQKETWETWWTDYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKEPIAGAETFYVDGAANRETKIGKAGYVTDRGRQKVVSLTETTNQKTELQAIQLALQDSGSEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQLIKKERVYLSWVPAHKGIGGNEQVDKLVSSGIRKVLAMGGKWSKSSIVGWPAIRERMRRTEPAAEGVGAASQDLDKHGALTSSNTATNNADCAWLEAQEEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKAAFDLSFFLKEKGGLEGLIYSKKRQDILDLWVYHTQGFFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVDPREVEEANEGENNCLLHPMSQHGMEDEDREVLKWKFDSHLARRHMARELHPEYYKDCRPMGARASILRGGKLDKWEKIRLRPGGKKHYMLKHLVWASRELERFALNPGLLETSEGCKQIIKQLQPALQTGTEELRSLYNTVATLYCVHAKIEVRDTKEALDKIEEEQNKSQQKTQQAKAADGKVSQNYHHHHHH[SEQ ID NO：10]

编码C进化支F4co的经密码子优化的核苷酸序列：

ATGGTTATTGTTCAGAATCTGCAGGGTCAGATGGTTCATCAGGCAATTTCTCCGCGTACCCTGAATGCATGGGTGAAAGTGATTGAAGAAAAAGCCTTTTCTCCGGAAGTTATTCCGATGTTTACCGCACTGAGCGAAGGTGCAACACCGCAGGATCTGAATACCATGCTGAATACCGTTGGTGGTCATCAGGCAGCAATGCAGATGCTGAAAGATACCATTAATGAAGAGGCAGCAGAATGGGATCGTCTGCATCCGGTTCATGCAGGTCCGATTGCACCGGGTCAGATGCGTGAACCGCGTGGTAGCGATATTGCAGGTACAACCAGCACCCTGCAAGAGCAGATTGCATGGATGACCAGCAATCCTCCGATTCCGGTTGGTGATATTTATAAACGCTGGATTATTCTGGGCCTGAATAAAATTGTGCGTATGTATTCTCCGGTTAGCATTCTGGATATTAAACAGGGTCCGAAAGAACCGTTTCGTGATTATGTGGATCGCTTTTTTAAAACCCTGCGTGCAGAACAGGCAACCCAAGAGGTTAAAAATTGGATGACCGATACCCTGCTGGTTCAGAATGCAAATCCGGATTGCAAAACCATTCTGCGTGCACTGGGTCCGGGTGCAACACTGGAAGAAATGATGACCGCATGTCAGGGTGTTGGTGGTCCGGGTCATAAAGCACGTGTTCTGCACATGGGTCCGATTAGCCCGATTGAAACCGTTCCGGTGAAACTGAAACCGGGTATGGATGGTCCGAAAGTTAAACAGTGGCCTCTGACCGAAGAAAAAATCAAAGCCCTGACCGCAATTTGTGAAGAAATGGAAAAAGAAGGCAAAATTACCAAAATTGGTCCGGAAAATCCGTATAACACACCGGTGTTTGCCATTAAAAAAAAAGATAGCACCAAATGGCGTAAACTGGTGGATTTTCGCGAACTGAATAAACGTACCCAGGATTTTTGGGAAGTTCAGCTGGGTATTCCGCATCCGGCAGGTCTGAAAAAAAAAAAATCCGTGACCGTTCTGGATGTTGGTGATGCCTATTTTTCTGTTCCGCTGGATGAAGGTTTTCGTAAATATACCGCCTTTACCATTCCGAGCATTAATAATGAAACACCGGGTATTCGCTATCAGTATAATGTTCTGCCGCAGGGTTGGAAAGGTTCTCCGGCAATTTTTCAGAGCAGCATGACCAAAATTCTGGAACCGTTTCGCGCACAGAATCCGGAAATTGTGATTTATCAGTATATGGATGATCTGTATGTTGGTAGCGATCTGGAAATTGGTCAGCATCGTGCCAAAATTGAAGAACTGCGTGAACATCTGCTGAAATGGGGTTTTACCACACCGGATAAAAAACATCAGAAAGAACCGCCGTTTCTGAAAATGGGTTATGAACTGCATCCGGATAAATGGACCGTTCAGCCGATTCAGCTGCCGGAAAAAGATAGCTGGACCGTGAATGATATTCAGAAACTGGTGGGCAAACTGAATTGGGCAAGCCAGATTTATCCGGGTATTAAAGTTCGTCAGCTGTGTAAACTGCTGCGTGGTGCAAAAGCACTGACCGATATTGTTCCGCTGACAGAAGAAGCAGAACTGGAACTGGCCGAAAATCGTGAAATTCTGAAAGAACCGGTGCATGGTGTTTATTATGATCCGAGCAAAGATCTGATTGCCGAAATTCAGAAACAGGGTCATGATCAGTGGACCTATCAGATTTATCAGGAACCGTTTAAAAATCTGAAAACCGGCAAATATGCAAAAATGCGTACCGCACATACCAATGATGTTAAACAGCTGACCGAAGCCGTTCAGAAAATTGCCATGGAAAGCATTGTGATTTGGGGTAAAACACCGAAATTTCGTCTGCCGATTCAGAAAGAAACCTGGGAAACATGGTGGACCGATTATTGGCAGGCAACCTGGATTCCGGAATGGGAATTTGTTAATACACCGCCGCTGGTTAAACTGTGGTATCAGCTGGAAAAAGAACCGATTGCAGGTGCAGAAACCTTTTATGTTGATGGTGCAGCAAATCGCGAAACCAAAATTGGCAAAGCCGGTTATGTTACCGATCGTGGTCGTCAGAAAGTTGTTAGCCTGACCGAAACCACCAATCAGAAAACCGAACTGCAGGCAATTCAGCTGGCCCTGCAGGATAGCGGTAGCGAAGTTAATATTGTGACCGATAGCCAGTATGCACTGGGTATTATTCAGGCACAGCCGGATAAAAGCGAAAGCGAACTGGTGAATCAGATTATTGAACAGCTGATTAAAAAAGAACGCGTGTATCTGAGCTGGGTTCCGGCACATAAAGGTATTGGTGGCAATGAACAGGTTGATAAACTGGTTAGCAGCGGTATTCGTAAAGTTCTGGCCATGGGTGGTAAATGGTCTAAAAGCAGCATTGTTGGTTGGCCGGCAATTCGTGAACGTATGCGTCGTACCGAACCGGCAGCAGAAGGTGTTGGCGCAGCAAGCCAGGATCTGGATAAACATGGTGCACTGACCAGCAGCAATACCGCAACCAATAATGCAGATTGTGCATGGCTGGAAGCACAGGAAGAAGAAGAAGAAGTTGGTTTTCCGGTTCGTCCGCAGGTTCCGCTGCGTCCGATGACCTATAAAGCAGCATTTGATCTGAGCTTTTTTCTGAAAGAAAAAGGTGGTCTGGAAGGTCTGATTTATAGCAAAAAACGCCAGGATATTCTGGATCTGTGGGTTTATCATACCCAGGGTTTTTTTCCGGATTGGCAGAATTACACACCGGGTCCGGGTGTGCGTTATCCGCTGACCTTTGGTTGGTGTTATAAACTGGTTCCGGTTGATCCGCGTGAAGTTGAAGAAGCAAACGAAGGCGAAAATAATTGTCTGCTGCATCCGATGAGCCAGCATGGTATGGAAGATGAAGATCGCGAAGTGCTGAAATGGAAATTTGATAGCCATCTGGCTCGTCGTCACATGGCACGCGAACTGCATCCGGAATATTATAAAGATTGCCGTCCGATGGGTGCACGTGCAAGCATTCTGCGTGGTGGTAAACTGGATAAATGGGAAAAAATTCGTCTGCGTCCGGGTGGTAAAAAACATTATATGCTGAAACATCTGGTTTGGGCAAGCCGTGAACTGGAACGTTTTGCACTGAATCCGGGTCTGCTGGAAACCAGCGAAGGTTGCAAACAAATTATTAAACAGCTGCAGCCGGCACTGCAGACCGGCACCGAAGAACTGCGCAGCCTGTATAATACCGTTGCAACCCTGTATTGTGTGCATGCGAAAATTGAAGTGCGCGATACCAAAGAAGCACTGGATAAAATTGAAGAAGAACAGAATAAAAGCCAGCAGAAAACCCAGCAGGCAAAAGCAGCAGATGGTAAAGTGAGCCAGAATTATCACCACCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO：11)

对于每次免疫，用AS01_B作为F4co蛋白的佐剂。

6到8周龄的雌性CB6F1(C57Bl/6和Balb/C小鼠的交配后代)在第0、14和28天用50μl在AS01_B佐剂系统中配制的F4co(进化支B或C)(3或9μg)肌内免疫三次。

将小鼠分配到四个组(每组40只动物)：

组1：9μgB进化支F4co/AS01_B

组2：3μgB进化支F4co/AS01_B

组3：9μgC进化支F4co/AS01_B

组4：3μgC进化支F4co/AS01_B

第二和第三次免疫7天后(分别是7d pII和7d pIII)采血进行测试。第二和第三次给剂后7天确定分泌IFN-γ和/或IL-2和/或TNFα的F4co特异性CD4+和CD8+T细胞的频率。

简单来说，给40只小鼠/组采集外周血淋巴细胞(PBLs)并汇合在一起(10只小鼠/组，共4个集合)。进行红细胞裂解，然后将细胞以每孔一百万细胞加样到圆形96孔板。然后用覆盖B进化支、C进化支或者A进化支序列的含有重叠序列的15聚体肽(1μg/ml/肽)集合，于37℃在有抗CD28和抗CD49d的情况下对细胞进行6小时的体外再刺激。给p24和p17使用的A进化支肽的序列来自天然分离物TZA173(Tanzania)，给RT和Nef使用的A进化支肽的序列来自天然分离物KE MSA4070(Kenya)。(给p24、p17、Nef和RT使用的)C进化支肽的序列来自ZM651病毒株。B进化支肽覆盖F4co B进化支抗原的序列(p24和p17来自病毒株BH10、RT来自病毒株HXB2，Nef来自病毒株Bru-Lai)。

培养基中残余的细胞(没有肽刺激)作为确定背景反应的阴性对照。与肽集合共培养2小时后，向小孔中加入布雷菲德菌素A(以抑制细胞因子外泌)，细胞再温育4小时，转移至℃过夜。然后给细胞进行以下标记物染色：CD4、CD8、IL-2、IFN-γ和TNF-α，使用LSRII(BD Biosciences，USA)和FlowJo软件(Three Star)经流式细胞术分析。

4.2CD4+T细胞应答

通过测量抗A、B和C进化支肽的HIV特异性CD4⁺T细胞应答的强度，在小鼠中评估了F4co B进化支或者F4co C进化支抗原所诱导的特异性CD4+T细胞应答的交叉反应能力。总的来说，F4co B进化支和C进化支抗原均诱导了F4co特异性CD4+T细胞应答，并且观察到所述细胞应答以不同强度抗所有进化支的肽。HIV特异性CD4+T细胞的频率在B进化支和C进化支F4co抗原给剂三次后都有提高。

F4co B进化支抗原诱发了抗B进化支肽的最高水平的CD4+T细胞应答，可能原因在于所述肽与免疫所使用的F4co B进化支抗原具有完全相同的序列这一事实。观察到了F4co B进化支诱导的CD4+T细胞应答有针对A进化支和C进化支肽的交叉反应性。针对A和C进化支肽的特异性CD4⁺T细胞应答的强度是观察到的针对B进化支肽的细胞应答强度的大约一半(图30-32和36)。

由F4co C进化支和F4co B进化支抗原引发的C进化支特异性CD4+T细胞应答的强度相当(图32)。有趣的是，F4co C进化支抗原诱导了有交叉反应性的HIV特异性CD4+T细胞应答，其中抗A和B进化支肽的CD4⁺T细胞应答强度超过用C进化支肽达到的细胞应答强度的一半(图30-32和36)。

正如预期的，抗A进化支肽的应答性CD4+T细胞的百分比是最低的，无论用于免疫的抗原是哪种(图30和36)，因为这些肽与F4co蛋白中使用的B进化支和C进化支序列的同一性百分比最低(图8)。

此外，发现第二和第三次免疫后分离到的F4co特异性CD4+T细胞是多功能的，每个细胞群体中超过一半既表达IL2，又表达IFNγ和/或TNFα(数据未显示)。

4.3CD8+T细胞应答

B进化支和C进化支抗原诱导的F4co特异性CD8+T细胞水平整体上低于观察到的CD4+T细胞应答的水平，但在一些动物集合中仍可检测到。与CD4+T细胞的数据一样，最强的CD8+T细胞应答由F4co B进化支抗原诱导且特异于B进化支肽。针对C进化支和A进化支肽的交叉反应性都非常低(图33-35和36)。F4co C进化支抗原引发了非常低的C进化支特异性CD8+T细胞应答，但是可以检测到抗B进化支和A进化支肽的交叉反应性，虽然强度很低。

因为反应性CD8+T细胞的低百分比，无法对多功能性进行可靠的分析。

4.4结论

图36总结了该临床前研究得到的跨进化支试验结果。B进化支F4co和C进化支F4co抗原均诱发了抗A、B和C进化支的强烈交叉反应性F4co特异性CD4+T细胞应答，并且所述应答是多功能的。F4co特异性CD8+T细胞频率没有这么强，但测试的三个进化支中都检测到了进化支交叉反应。

Claims

1.免疫原性组合物，其包含

a.一或多种多肽，包含选自Nef、Pol和/或Gag的一或多种抗原；

其中所述一或多种抗原选自一或多种HIV-1进化支中的一或多种病毒株；和

b.佐剂，所述佐剂是Th1型免疫反应的优选诱导剂，

所述组合物用于治疗或预防由来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支的HIV-1病毒株引起的疾病或感染。

2.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含一或多种含有Nef的多肽。

3.权利要求2所述的免疫原性组合物，其中Nef来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

4.权利要求2或3所述的免疫原性组合物，其中Nef来自B进化支的HIV-1病毒株。

5.权利要求1-4所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含一或多种含有Pol的多肽。

6.权利要求5所述的免疫原性组合物，其中Pol是RT片段。

7.权利要求5或6所述的免疫原性组合物，其中Pol来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

8.权利要求5-7所述的免疫原性组合物，其中Pol来自B进化支的HIV-1病毒株。

9.权利要求1-8所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含一或多种含有Gag的多肽。

10.权利要求9所述的免疫原性组合物，其中Gag来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

11.权利要求9或10所述的免疫原性组合物，其中Gag来自B进化支的HIV-1病毒株。

12.权利要求9-11所述的免疫原性组合物，其中Gag是p17。

13.权利要求12所述的免疫原性组合物，其中p17来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

14.权利要求12或13所述的免疫原性组合物，其中p17来自B进化支的HIV-1病毒株。

15.权利要求9-14所述的免疫原性组合物，其中Gag是p24。

16.权利要求15所述的免疫原性组合物，其中p24来自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支的HIV-1病毒株或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

17.权利要求15或16所述的免疫原性组合物，其中p24来自B进化支的HIV-1病毒株。

18.权利要求9-17所述的免疫原性组合物，其中Gag包含p17和p24，它们作为分开的蛋白抗原成分或者融合在一起。

19.权利要求18所述的免疫原性组合物，其中p17和p24被融合在一起并由异源氨基酸序列隔开。

20.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其(a)部分包含两个或以上的多肽。

21.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含一或多种成分，所述成分选自有免疫活性的皂苷组分和/或脂多糖和/或免疫刺激性寡核苷酸。

22.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含有免疫活性的皂苷组分和脂多糖。

23.权利要求20或21所述的免疫原性组合物，其中所述有免疫活性的皂苷组分是QS21。

24.权利要求20-22所述的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。

25.权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。

26.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含固醇。

27.权利要求25所述的免疫原性组合物，其中所述固醇是胆固醇。

28.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含脂质体载体。

29.权利要求1-27所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷:固醇的比率在1:1-1:100(w/w)的皂苷和固醇。

30.权利要求28所述的免疫原性组合物，其中皂苷:固醇的比率是1:1-1:10(w/w)。

31.权利要求28或29所述的免疫原性组合物，其中皂苷:固醇的比率是1:1-1:5(w/w)。

32.权利要求1-30所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷:脂多糖的比率是1∶1(w/w)的皂苷和脂多糖。

33.权利要求1-32所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含脂多糖并且所述脂多糖在每个剂量中的量为1–60μg。

34.权利要求33所述的免疫原性组合物，其中所述脂多糖在每个剂量中的量为50μg。

35.权利要求33所述的免疫原性组合物，其中所述脂多糖在每个剂量中的量为25μg。

36.权利要求1-32所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷并且所述皂苷在每个剂量中的量为1–60μg。

37.权利要求36所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷在每个剂量中的量为50μg。

38.权利要求36所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷在每个剂量中的量为25μg。

39.权利要求1-32所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)。

40.权利要求1-32所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。

41.权利要求1-32所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂苷(例如QS21)。

42.权利要求1-27所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂。

43.权利要求42所述的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂包含角鲨烯和/或α生育酚。

44.权利要求41或42所述的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂是可代谢的水包油乳剂。

45.权利要求42-44所述的免疫原性组合物，其中所述水包油乳剂包含乳化剂如Tween 80。

46.权利要求42-45所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷和脂多糖。

47.权利要求46所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷:脂多糖的比率范围在1:10-10:1(w/w)的皂苷和脂多糖。

48.权利要求42-46所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷和固醇。

49.权利要求48所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷:固醇的比率范围在1:1-1:20(w/w)的皂苷和固醇。

50.权利要求42-49所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷和可代谢的油。

51.权利要求50所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含皂苷:可代谢油的比率范围在1:1-250:1(w/w)的皂苷和固醇。

52.权利要求42-51所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含α生育酚。

53.权利要求42-52所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg(例如2-3、5-6或10-11mg)可代谢油(比如角鲨烯)。

54.权利要求42-52所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg(例如0.9-1.1、2-3或4-5mg)乳化剂(比如Tween 80)。

55.权利要求42-52所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7mg(例如11-13、5-6或2-3mg)母生育酚(比如α生育酚)。

56.权利要求42-52所述的免疫原性组合物42-52，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。

57.权利要求42-52所述的免疫原性组合物42-52，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg)固醇(例如胆固醇)。

58.权利要求42-52所述的免疫原性组合物42-52，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)皂苷(例如QS21)。

59.权利要求1-21所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含金属盐和脂质A衍生物。

60.权利要求59所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)100-750、200-500或300-400μgAl，例如磷酸铝。

61.权利要求59或60所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含(每个0.5mL剂量)5-60、10-50或20-30μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。

62.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含含有CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸。

63.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于治疗或预防由来自该免疫组合物中一或多种进化支的HIV-1病毒株引起的疾病或感染。

64.权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支选自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

65.权利要求63或64所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中的HIV-1进化支是B进化支。

66.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中与组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支选自A、B、C、D、E、F、G、H、J、K进化支或者HIV-1的流行重组型(CRF)。

67.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支选自A或C进化支。

68.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支是A和C进化支。

69.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于诱导体液免疫反应的组合物，所述体液免疫反应抵抗与所述免疫原性组合物中一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支的HIV-1株。

70.权利要求69所述的免疫原性组合物，是用于诱导体液免疫反应的组合物，所述体液免疫反应抵抗所述免疫原性组合物中的一或多种进化支的HIV-1株。

71.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于给个体赋予长期不进展者状态的组合物，所述个体感染了与所述免疫原性组合物中一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支的HIV-1株。

72.权利要求71所述的免疫原性组合物，是用于给个体赋予长期不进展者状态的组合物，所述个体感染了所述免疫原性组合物中一或多种HIV-1进化支的HIV-1株。

73.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于针对与免疫原性组合物中一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支的HIV-1株，而诱导能产生多种细胞因子的抗病毒CD4+T细胞。

74.权利要求73所述的免疫原性组合物，是用于针对所述免疫原性组合物中一或多种HIV-1进化支的HIV-1株，而诱导能产生多种细胞因子的抗病毒CD4+T细胞。

75.权利要求73或74所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞产生IL2、IFNγ和TNFα中的两种或更多种。

76.权利要求73-75所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞产生IL2和IFNγ。

77.权利要求73-75所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞产生IL2和TNFα。

78.权利要求73-75所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞产生IFNγ和TNFα。

79.权利要求73-75所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞产生IL2、IFNγ和TNFα。

80.权利要求73-79所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞表达CD40L。

81.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于防止感染了HIV-1病毒株的个体中的进展型CD4+T细胞下降，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。

82.权利要求81所述的免疫原性组合物，是用于防止感染了HIV-1病毒株的个体中的进展型CD4+T细胞下降，其中所述HIV-1病毒株来自所述免疫原性组合物中的一或多种进化支。

83.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于减少或消除感染了HIV-1病毒株的个体中的病毒储库，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。

84.权利要求83所述的免疫原性组合物，是用于减少或消除感染了HIV-1病毒株的个体中的病毒储库，其中所述HIV-1病毒株来自所述免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支。

85.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于在感染了HIV-1病毒株的个体中引发大量且长期的HIV-1特异性多功能CD4+T细胞，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。

86.权利要求85所述的免疫原性组合物，是用于在感染了HIV-1病毒株的个体中引发大量且长期的HIV-1特异性多功能CD4+T细胞，其中所述HIV-1病毒株来自所述免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支。

87.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于控制或减轻感染了HIV-1病毒株的个体中的病毒血症，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。

88.权利要求87所述的免疫原性组合物，是用于控制或减轻感染了HIV-1病毒株的个体中的病毒血症，其中所述HIV-1病毒株来自所述免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支。

89.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原中的两、三、四种或更多种被融合在一起形成融合蛋白。

90.权利要求89所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白包含Gag融合到Pol上，或者Pol融合到Gag上。

91.权利要求89或90所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白包含Pol融合到Nef上或者Nef融合到Pol上。

92.权利要求89-91所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白包含Nef融合到Gag上或者Gag融合到Nef上。

93.权利要求90或92所述的免疫原性组合物，其中Gag是p17和/或p24。

94.权利要求90或91所述的免疫原性组合物，其中Pol是RT。

95.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原被融合形成以任何顺序包含Nef、RT、p17和p24的融合蛋白。

96.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原被融合形成包含p24-RT-Nef-p17的融合蛋白。

97.权利要求89-96所述的免疫原性组合物，其中融合蛋白中的抗原来自两、三或四种不同HIV-1进化支的HIV-1病毒株。

98.权利要求89-96所述的免疫原性组合物，其中融合蛋白中的所有抗原来自相同HIV-1进化支的HIV-1病毒株。

99.权利要求89-98所述的免疫原性组合物，还包含一或多种含有抗原的非融合的多肽。

100.权利要求99所述的免疫原性组合物，其中所述非融合多肽中的抗原与所述融合蛋白中的至少一种抗原来自相同进化支的HIV-1病毒株。

101.权利要求99所述的免疫原性组合物，其中所述非融合多肽中的抗原来自与所述融合蛋白中的一或多种进化支不同的进化支的HIV-1病毒株。

102.权利要求99-101所述的免疫原性组合物，其中非融合多肽包含Env。

103.权利要求99-102所述的免疫原性组合物，其中非融合多肽包含gp120、gp140或gp160中的一或多种。

104.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物中的一或多种抗原之一来自B进化支的HIV-1病毒株。

105.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中当免疫原性组合物中存在两种抗原时，两种抗原均来自B进化支的HIV-1病毒株。

106.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中当免疫原性组合物中存在三种抗原时，三种抗原均来自B进化支的HIV-1病毒株。

107.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中当免疫原性组合物中存在四种抗原时，四种抗原均来自B进化支的HIV-1病毒株。

108.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中单个剂量免疫原性组合物中每个抗原的总量是0.5-25μg、2-20μg、5-15μg或大约10μg。

109.权利要求95-98所述的免疫原性组合物，其中单个剂量免疫原性组合物中的融合蛋白的总量是10μg。

110.权利要求99-103所述的免疫原性组合物，其中单个剂量免疫原性组合物中的非融合多肽的总量是20μg。

111.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中单个剂量免疫原性组合物中所有抗原的总量是0.5-50μg、2-40μg、5-30μg、7-20μg或者大约30μg、大约20μg或大约10μg。

112.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于诱发对抗HIV-1病毒株的抗病毒免疫反应的长期记忆，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支。

113.权利要求112所述的免疫原性组合物，是用于诱发对抗HIV-1病毒株的抗病毒免疫反应的长期记忆，其中所述HIV-1病毒株来自免疫原性组合物中的一或多种进化支。

114.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于诱发持久性抗病毒CD4+T细胞。

115.权利要求114所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞保持至少6个月。

116.权利要求114-115所述的免疫原性组合物，其中所述CD4+T细胞保持6-24个月或者9-18个月，例如保持12个月。

117.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于治疗或预防HIV-1病毒株导致的疾病或感染，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支，其中组合物首先以两个或三个剂量被给予受试对象，其中所述各剂量间隔两周到三个月的时间，优选一个月。

118.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，是用于治疗或预防HIV-1病毒株导致的疾病或感染，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支，其中组合物被每6-24或9-18个月，例如每年一次给予受试对象(例如作为加强剂)。

119.权利要求1-117所述的免疫原性组合物，是用于治疗或预防HIV-1病毒株导致的疾病或感染，其中所述HIV-1病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支，其中所述组合物被以6个月或1年的间隔给予受试对象(例如作为加强剂)。

120.权利要求118或119所述的免疫原性组合物，其中所述组合物对受试对象的后续给药加强所述组合物对相同受试对象的在先给药所引发的免疫反应。

121.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物用于治疗或预防HIV-1病毒株导致的疾病或感染，其中所述病毒株来自与免疫原性组合物中的一或多种HIV-1进化支不同的一或多种进化支，其中所述组合物被作为初免-强化方案的一部分。

122.权利要求121所述的免疫原性组合物，其中所述组合物是初免剂。

123.权利要求121所述的免疫原性组合物，其中所述组合物是加强剂。

124.权利要求121-123所述的免疫原性组合物，其中给予了两种或更多种初免和/或强化剂量。

125.前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物是疫苗组合物。

126.权利要求1-124所述的免疫原性组合物或权利要求125所述的疫苗在制备用于治疗或预防权利要求1-125所述的HIV-1病毒株导致的疾病或感染的药物中的用途。

127.治疗或预防权利要求1-125所述的HIV-1疾病或感染的方法，所述方法包括将权利要求1-124所述的免疫原性组合物或权利要求125所述的疫苗给予受试对象的步骤。