KR20010085348A - 면역능을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원 및 이를이용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HSV 감염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 HSV 항원을 제공한다. 이하 본 명세서에는 항원들 및/또는 포진성 병변으로부터 유도된 T-세포에 의해 인식되어 지는 것으로 확인된 그들의 구성 에피토프들을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 항원들에 대한 특이성을 갖는 T-세포들이 바이러스에 감염된 세포에 대해 세포독성 효과를 가지고 있음이 입증되었다. T-세포 특이성을 담당하는 면역원성 항원들의 동정은 개선된 항-바이러스성 치료 및 예방 전략의 개발을 용이하게 한다. 본 발명의 항원들 또는 상기 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 HSV 감염의 예방 및 치료를 위한 효과적인 표적 백신(targeted vaccine)을 제공한다.

Description

면역능을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원 및 이를 이용하는 방법{Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof}
HSV 타입 1 및 타입 2의 완전하게 밝혀진 DNA 서열은 약 160 kb 정도로 이들은 약 85개의 유전자를 암호화하며, 각각의 유전자는 적어도 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 각각의 에피토프는 약 9 내지 12개의 아미노산으로 구성되어 있으며 바이러스의 감염에 대한 효과적인 T-세포 면역 반응(T cell immune response)을 촉발할 수 있지만, 이들 단백질들 내의 면역학적 에피토프(immunological epitope)에 대해서는 알려져 있지 않다.
세포성 면역 반응(cellular immune response)은 인간에게 있어서 재발성 HSV감염의 심각성을 제어하는데 요구되어 진다. HSV-특이적인 CD4 T-세포들은 바이러스성-감염 세포들에게 세포독성을 나타낼 수 있다(M. Yasykawa et al., 1991,J. Immunol., 146:1341-1347; M. Yasukawa et al., 1984,J. Immunol., 133:2736-42). HSV-특이적인 CD4 T-세포들(HSV-specific CD4 T cells)은 또한 HSV-감염 HLA 세포에서 HSV 복제의 역가를 감소시키고, 항바이러스성 또는 면역중재(immunomodulatory) 활성을 갖는 림포카인(lymphokines)을 생산하고, 또는 항바이러스성 항체 반응(antiviral antibody response)을 촉발하는 특이적인 B 세포를 생산할 수 있다. HSV-특이적인 T-세포의 항원 특이성에 대한 문헌들이 다음과 같이 보고되어 있다: A. G. Laggenberg et al., 1995,Ann. Int. Med., 122:889-898; A. Mikloska et al.,J. Gen. Virol., 79:353-361; J. W. Torseth et al., 1987,J. Virol., 61:1532-1539; M. Yasukawa et al., 1985,J. Immunol., 134:2679-2687.
그러나, 여전히 HSV 감염에 대한 면역 반응을 효과적으로 유발할 수 있는 특이적인 에피토프를 분리해내는 것이 과제로 남아있다. 상기 자료들은 HSV 감염의 예방 및 치료에 유용한 보다 효과적인 면역원성 항원(immunogenic antigens)을 분리하는데 이용할 수 있을 것이다.
본 발명은 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 감염의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있는 분자(molecules), 조성물(compositions) 및 방법(method)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HSV-특이 면역 반응(HSV-specific immunity)을 자극하거나 증가시키는 방법, 분자 및 조성물의 개발에 사용될 수 있는 HSV 단백질의 에피토프(epitope)에 관한 것이다.
도 1의A는 0.67-0.73 지도 단위(map unit) 지역 내에서 HSV 게놈의 구성을 나타내는 모식도로서, 경계면은 대략적이며 HSV-1 X HSV-2 종간 재조합 바이러스(intertypic recombinant virus, IRV) 또한 보여주고 있다. HSV-2 DNA는 실선으로표시되어 지고 HSV-1 DNA는 점선으로 표시되어 지며, 불명확한 부위는 이중선으로 표시되어 졌다. 유전자 발현 클로닝을 위해 사용된 HSV-2BamHⅠw 단편 역시 나타내었다.
도 1의B는 표시적 IRV에 대한 T-세포 클론들(TCC)의 증식반응을 나타내는 막재 그래프이다. 결과는 각각의 경우에서 500 cpm 이하인 배지 단독일 경우와 비교한 델타 CPM[3H] 싸이미딘 삽입(delta CPM[3H] thymidine incorporation) 정도이다.
도 2는 IRV DX22의 UL49 유전자 산물(VP22)의 HSV 바이러스성 표현형질(viral phenotype)의 결정을 나타내는 면역블럿(immunoblot) 결과이다. 거짓-감염(mock-infected) 세포 및 바이러스성 세포주 DX32, HSV-1 또는 HSV-2에 감염된 세포들의 세포추출액(lysate)을 SDS-PAGE로 분리하여 블럿팅한 후 VP22-특이적인 mAB 탐침을 이용하여 혼성화하였다. 표지 단백질의 분자량(molecular weights, kD)이 오른쪽에 기재되어 있다.
도 3a는 TCC 4.2E1을 사용하여 HSV-2의 VP22 내 다양한 펩타이드 에피토프들에 의해 촉발되는 T-세포 증식을 나타내는 막대 그래프이다. 항원 제공 세포들(APCs)은 자가유래(autologous) EBV-LCL이다. β-갈락토시다제와 융합 단백질을 포함하는 항원들은 10 ㎍/㎖ 농도로 사용하였고 펩타이드들은 3 μM 농도로 사용하였다. 결과는 각각의 경우에서 500 cpm 이하인 배지 단독일 경우와 비교한 델타 CPM[3H] 싸이미딘 삽입 정도이다.
도 3b는 TCC 1.L3D5.10.8을 사용하여 HSV-2의 VP22 내 다양한 페티드 에피토프들에 의해 촉발되는 T-세포 증식을 나타내는 막대 그래프이다. APCs는 자가유래 PBMC이다. β-갈락토시다제와 융합 단백질을 포함하는 항원들은 10 ㎍/㎖ 농도로 사용하였고 펩타이드들은 1 μM 농도로 사용하였다. 결과는 각각의 경우에서 500 cpm 이하인 배지 단독일 경우와 비교한 델타 CPM[3H] 싸이미딘 삽입 정도이다.
도 3c는 TCC ESL4.9를 사용하여 HSV-2의 VP22 내 다양한 페티드 에피토프들에 의해 촉발되는 T-세포 증식을 나타내는 막대 그래프이다. APCs는 자가유래 PBMC이다. β-갈락토시다제와 융합 단백질을 포함하는 항원들은 10 ㎍/㎖ 농도로 사용하였고 펩타이드들은 1 μM 농도로 사용하였다. 결과는 각각의 경우에서 500 cpm 이하인 배지 단독일 경우와 비교한 델타 CPM[3H] 싸이미딘 삽입 정도이다.
도 4는 HSV-2 VP16의 펩타이드 437-449에 대한 T-세포 클론 BM.17 반응을 위한 HLA 제한 요소(restriction element)를 나타내는 선 그래프이다. 증식적 반응은 바이러스성 펩타이드의 농도에 따라 곡선으로 표시되어 졌다. APCs는 자가유래(막힌 동그라미), HLA DQB1*0501에 대한 동종유래(homozygous)(열린 동그라미) 또는 HLA DQB1*0201에 대한 동종유래(네모)인 EBV-LCL이다.
본 발명은 HSV 항원, HSV 항원을 구성하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스, 상기 폴리펩타이드를 표현하는 항원 제공세포(antigen presenting cells, APCs), HSV에 대한 면역세포 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 예방학적 및 치료학적 목적 모두에 사용될 수 있다. 본 발명의 항원들은 포진성 병변(herpetic lesions)으로부터 회복된 T-세포들에 의해 인식되어 진다. 또한 본 발명은 HSV 감염의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함하여 HSV-감염 세포들을 사멸하는 방법, 바이러스 복제를 억제하는 방법, 항바이러스성 및/또는 면역조절 림포카인의 분비를 증가시키는 방법 및 HSV-특이적인 항체의 생산을 증가시키는 방법 등을 제공한다. HSV 감염의 예방 및 치료를 위하여, 항바이러스성 및/또는 면역조절 림포카인의 분비를 증가시키기 위하여 및 일반적으로 HSV-특이적인 면역 반응을 자극하거나 및/또는 증가시키기 위하여, 상기 방법은 피험체에 본 발명의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 바이러스, APC, 면역세포 또는 약학적 조성물의 투여를 포함한다. HSV-감염 세포의 사멸 및 버이러스 복제의 억제를 위한 방법들은 HSV-감염 세포를 본 발명의 면역세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 면역세포는 본 발명의 항원 또는 본 발명의 항원을 표현하는 APC에 의해 자극되어 지는 세포들이다. 이와 같은 면역세포를 생산하는 방법 역시 본 발명에 의해 제공되어 진다. 상기 방법은 APC, 바람직하게는 본 발명의 항원을 표현하도록 변형되어진 수지상 세포(dentritic cells)와 면역세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 면역세포는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포와 같은 T-세포이다.
바람직한 실시예로서, 본 발명은 HSV 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 UL19, UL21, UL49 또는 UL50 단백질 또는 그의 단편, 또는 UL19의 1078-1319 아미노산; UL21의 148-181 아미노산; UL49의 105-190 또는 177-220 아미노산; UL50의 118-312 아미노산; 당단백질 E(glycoprotein E, gE)의 1-273 아미노산; VP16의 185-197, 209-221 또는 430-449 아미노산; 및 이들의 대체가능한 유사체(substitutional variants)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드와 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 부가적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하기 위하여 유전학적으로 변형된 재조합 바이러스와 상기 재조합 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 바이러스는 종두종 바이러스(vaccinia virus), 카나리 폭스 바이러스(canary pox virus), HSV, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)이다. 본 발명의 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 및/또는(면역) 보강제(adjuvant)를 포함할 수 있다.
본 발명은 부가적으로 바이러스, 세균 또는 기생충과 같은 감염성 생물(infectious organism)의 면역원성 에피토프를 분리하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 생물성 게놈(organismal genome)의 무작위적 단편들의 집합을 제조하는 과정을 포함한다. 더 나아가 본 발명의 방법은 상기 집합의 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 발현시키는 단계 및 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 불용성 β-갈락토시다제 융합 단백질(β-galactosidase fusion protein)을 발현하기 위한 pUEX 벡터와 같은 벡터를 사용하여 융합 단백질 형태로 발현되어 진다. 그리고나서 발현된 폴리펩타이드가 세포성 면역을 촉발하는 능력이 분석되어 진다. 세포성 면역 반응을 촉발하는 능력은 면역원성 항원의 존재를 나타내는 것이다.
상기 단계들은 게놈 단편들의 부속단편들을 이용하여 반복되어 질 수 있다. 더 나아가 상기 방법은 게놈 단편의 염기서열을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 분석은 T-세포 증식 분석방법(T cell proliferation assay)을 수행하는 것을 포함한다. 분석은 상기 감염성 생물에 노출되어진 피험체로부터 얻은 면역세포를 이용하여 수행되어질 수 있다. 바람직한 일예로서, 세포는 피부 또는 경부(cervix)와 같이 감염이 활발한 부위나 감염된 대상의 혈액으로부터 얻어진다.
본 발명은 더 나아가 본 발명의 방법에 의해 선별된 면역원성 에피토프, 상기 에피토프를 구성하는 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 구성하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 적당한 감염체는 세균, 기생충 및 바이러스를 포함한다. 바이러스로는 모두 이중 가닥 및 단일 가닥을 가지는 DNA 및 RNA 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 생물체의 핵산 염기에 대한 지식이 요구되지 않는 바와 같이 상당한 변이성(variability)을 가지고 있는 감염성 생물의 다양성과 싸울 수 있는 전략을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HSV 감염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 HSV 항원을 제공한다. 이하 본 명세서에는 항원들 및/또는 포진성 병변으로부터 유도된 T-세포에 의해 인식되어 지는 것으로 확인된 그들의 구성 에피토프들을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 항원들에 대한 특이성을 갖는 T-세포들이 바이러스에 감염된 세포에 대해 세포독성 효과를 가지고 있음이 입증되었다. T-세포 특이성을 담당하는 면역원성 항원들의 동정은 개선된 항-바이러스성 치료 및 예방 전략의 개발을 용이하게 한다. 본 발명의 항원들 또는 상기 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 HSV 감염의 예방 및 치료를 위한 효과적인 표적 백신(targeted vaccine)을 제공한다.
용어의 정의
본 발명의 명세서에 사용되는 모든 과학적 및 기술적 용어는 다른 특정이 있지 않는 한 당해분야에서 일반적으로 통용되는 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되고 있는 바와 같이, 하기 단어와 문구는 특정된 의미를 갖는다.
이하 사용되는 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 자연자원(natural sources)으로부터 분리되었든지, 재조합 기술에 의해 생산되었든지 또는 화학적으로 합성되었든지 간에 단백질, 단백질의 단편 및 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 펩타이드들은 전형적으로 적어도 약 8개의 아미노산으로 구성된다.
이하 사용되는 "HSV 폴리펩타이드"는 다른 지시가 없는 한 HSV-1 및 HSV-2를 포함한다. HSV 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 자료는 A. Dolan et al., 1998,J. Virol., 72(3):2010-2021에 기재되어 있는 HSV-2에 관한 게놈 염기서열 정보를 기초로 하였다.
이하 사용되는 "대체가능한 유사체(substitutional variants)는 상기 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환(substitution) 또는 결실(deletion)된, 그러나 면역세포에 의해 인지되어질 수 있는 능력은 여전히 보유하고 있는 분자를 의미한다. 상기 분자가 면역세포에 의해 인식되어 질 수 있는지를 결정하는 하나의 방법은 D. M. Koelle et al., 1994, J. Virol., 68(5):2803-2810에 기재되어 있는 증식 분석방법(proliferation assay)을 사용하였다.
이하 사용되는 "벡터(vector)"는 숙주세포에서 대상 유전자(들) 또는 서열(들)을 운반할 수 있는, 바람직하게는 발현할 수 있는 유전자 컨스트럭트(construct)를 의미한다. 한정하는 것은 아니지만, 이러한 벡터의 예로서 바이러스성 벡터들, 노출 DNA(naked DNA) 또는 RNA 발현벡터들(RNA expression vectors), 플라스미드(plasmids), 코스미드(cosmids) 또는 파아지 벡터(phage vectors), 리포좀(liposomes)을 봉입한 DNA 또는 RNA 발현벡터들 및 생산 세포(producer cell)와 같은 특정 진핵세포들을 포함한다.
이하 사용되는, "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 핵산의전사를 지시하는 핵산 염기서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 지속성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터와 같은 프로모터 또는 증폭자(enhancer)일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사되어 지는 핵산 염기서열에 연결되어 작동된다.
이하 사용되는, "핵산(nucleic acid)" 또는 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)"는 다른 한정이 없는 한 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오타이드 폴리머(ribonucleotide polymer)를 의미하며 자연적으로-유발되는(naturally-occuring) 뉴클레오타이드들과 유사한 방식으로 핵산에 혼성화되는 자연성 뉴클레오타이드들의 알려진 유사체(analogs)를 포함한다.
이하 사용되는, "항원 제공 세포(antigen-presenting cell)" 또는 "APC"는 임파구(lymphocyte)에 항원을 조종 및 표현할 수 있는 세포를 의미한다. 한정하는 것은 아니지만, APCs의 예로는 대식세포들(macrophages), 랑게르한스-수지상 세포(Langerhans-dendritic cells), 여포(follicular) 수지상 세포, B 세포, 단핵구(monocytes), 섬유상 세포(fibroblasts) 및 섬유아 세포(fibrocytes)를 포함한다. 수지상 세포는 항원 표현 세포 형태가 바람직하다. 수지상 세포는 많은 비-림프계 조직(non-lymphoid organs)에서 발견되지만, 구심성(afferent lymphoid) 림프 또는 혈류를 통하여 림프계 조직의 T-의존성 부위(T-dependent area)로 이동할 수 있다. 비-림프계 조직에서, 수지상 세포는 랑게르한스 세포 및 장내(intestinal) 수지상 세포를 포함한다. 림프 및 혈액 내에서, 이들은 구심성림프 막(veiled) 세포들 및 혈액 수지상 세포들을 각각 포함한다. 림프계 조직에서, 이들은 림프계 수지상 세포들 및 지상돌기접착성(interdigiting) 세포들을 포함한다. 이하, 사용되는, 이들 세포 형태의 각각과 그들의 자손들은 다른 한정이 없는 한 "수지상 세포"로서 언급되어 진다.
이하 사용되는, 에피토프에 대한 "변형(modified)"은 자연적으로 또는 재조합 방법에 의해 에피토프를 표현하도록 조작되어진 항원 제공 세포를 언급한다. 예를 들면, APCs는 단독 또는 혼합물의 일부로 분리되어진 항원에 노출되거나 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 발현하도록 APC로 유전공학적으로 변형될 수 있다.
이하 사용되는, "약학적으로 허용가능한 염(pharmaceutical acceptable salt)"은 비경구 화합물(parent compound)의 요구되는 생물학적 활성은 유지하면서 어떤 바람직하지 못한 독성학적 효과(toxicological effects)도 가져오지 않는 염을 의미한다. 한정하는 것은 아니지만, 이러한 염의 종류로는 염산(hydrochloric acid), 브롬산(hydrobromic acid), 황산(sulfuric acid), 인산(phosphoric acid), 질산(nitric acid) 및 그의 유사체 등의 무기산 형태(inorganic acid)의 산부가염(acid addition salt)(a); 아세트산(acstic acid), 옥살산(oxalic acid), 타르타르산(tartaric acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid), 퓨마르산(fumaric acid), 글루콘산(gluconic acid), 시트르산(citric acid), 말산(malic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 벤조산(benzoic aicd), 탄산(tannic acid), 파모산(pamoic acid), 알긴산(alginic acid), 폴리글루탐산(polyglutamic acid),나프탈렌설폰산(naphthalenesulfonic aicd), 나프탈렌다이설폰산(naphthalenedisulfonic aicd), 폴리갈락튜론산(polygalacturonic acid) 등의 유기산 형태의 염; 아연, 칼슘, 비스무스(bismuth), 바륨(barium), 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 및 유사체 등의 다가 금속 양이온(polyvalent netal cation)을 갖는 염(b); 또는 N,N'-디벤질에틸렌디아민(N,N'-dibenzylethylenediamine) 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine)으로부터 형성된 유기 양이온을 갖는 염(c); 또는(a) 및(b) 또는(c)의 조합(d), 예를 들면 아연 탄산 염(zinc tannate salt); 및 유사체를 포함한다. 바람직한 산부가염은 트리플루오로아세트산 염(trifluoroacetate salt) 및 아세트산 염(acetate salt)이다.
이하 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성성분과 혼합되는 경우 상기 성분이 생물학적 활성을 유지할 수 있게 하고, 대상의 면역시스템과 비-반응성(non-reactive)인 어떠한 물질도 포함한다. 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline solution), 물, 지용성/수용성 에멀젼(oil/water emulsion)과 같은 에멀젼들 및 다양한 형태의 습윤제(wetting agent)들과 같은 일반적인 약학적 담체들이 사용될 수 있다. 분무(aerosol) 또는 비경구 투여를 위한 바람직한 희석제(diluents)로는 인산염 완충 식염수 또는 정상(0.9%) 식염수가 사용될 수 있다. 이와 같은 담체들을 포함하는 조성물은 통상적으로 잘 알려진 공지의 방법(예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science, Chapter 43, 14th Ed., Mark Publishing Co, Easton PA 18042, USA)들에 의해 제형화된다.
이하 사용되는 "(면역) 보강제(adjuvants)"는 당해분야에서 면역 반응을 자극시키는 데 일반적으로 사용되는 모든 보강제가 사용될 수 있다. 이를 한정하는 것은 아니지만, 보강제의 예로는 헬퍼 펩타이드(helper peptide); 알루미늄 히드록사이드 겔(aluminum hydroxide gel, alum) 또는 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate) 등의 알루미늄 염(aluminum salt); 프레운드 불완전 보강제(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 보강제(Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크(Merck) 보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(Smith-Kline Beecham); QS-21(Aquilla); MPL 또는 3d-MPL(Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); LEIF; 칼슘, 철, 아연의 염; 아실화 티로신(acylated tyrosine)의 불용성 상등액(insoluble suspension); 아실화 당(acylated sugars); 양이온화 또는 음이온화로 유도된 다당류(polysaccharide); 폴리포스파젠(polyphosphazens); 생분해성 마이크로스피어(biodegradable microspheres); 일인산 지질 A(monophosphoryl lipid A) 및 퀼 A(quil A); 뮤라밀 트리펩타이드 포스파티딜 에탄올아민(muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine) 또는 사이토카인(cytokines)(예를 들면 GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7 또는 -12) 및 면역증강성(immunostimulatory) DNA를 포함하는 면역증강 복합체(immunostimulating complex)가 있다. 몇몇 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드 백신의 사용과 같이 헬퍼 펩타이드 또는 사이토카인 등의 보강제는 보강제를 암호화하는 폴리뉴클리오티드로 제공되어 질 수 있다.
이하 사용되는, "a" 또는 "an"은 다른 명확한 정의가 있지 않는 한 적어도 하나를 의미한다.
HSV 폴리펩타이드들
한 실시예에서, 본 발명은 분리된 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 폴리펩타이드를 제공하는데, 상기 폴리펩타이드는 UL19(주요 캡시드 항원, VP5), UL21, UL49(VP22) 또는 UL50 단백질 또는 그의 단편으로 구성된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 UL19의 1078-1319 아미노산; UL21의 148-181 아미노산; UL49의 105-190 또는 177-220 아미노산; UL50의 118-312 아미노산; 당단백질 E(gE; US8)의 1-273 아미노산; VP16의 185-197, 209-221 또는 430-449 아미노산; 및 이들의 대체가능한 유사체(substitutional variants)로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함한다. 아미노산 잔기들에 대한 자료는 A. Dolan et al., 1998,J. Virol., 72(3):2010-2021에 기술된 바에 따라 HSV-2 게놈의 단백질을 고려하여 만들어졌다.
폴리펩타이드는 융합 단백질이 될 수 있다. 한 실시예에서, 융합 단백질은 수용성이다. 본 발명의 수용성 융합 단백질은 대상에게 주사되어 면역 반응을 촉발하기에 적당하다. 특정 실시예에서, 폴리펩타이드는 이하에 기술되어지는 다중 폴리펩타이드로 구성되거나 이하에 관련이 없는 서열로서 기술되어지는 적어도 하나의 폴리펩타이드로 구성된 융합 단백질이 될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 T 헬퍼 에피토프(T helper epitope), 바람직하게는 인간에 의해 인식되어지는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 보조하거나 천연 재조합 단백질 보다 고수율로 단백질을 발현하는 것을 보조하게 된다. 특정의 바람직한 융합 파트너는 면역학적인, 발현 증강 융합 파트너이다. 다른 융합 파트너로는 단백질의 용해도를 증가시키거나 단백질이 목적하는 세포내 구획에 표적되도록 선택되어질 수 있다. 이외에도 더 나아가 융합 파트너는 단백질의 분리·정제를 용이하게 하는 친화 표지(affinity tags)를 포함한다.
융합 단백질은 화학적 결합(chemical conjugation)을 포함하여 일반적인 기술을 사용하여 제조되어 진다. 바람직하게는, 융합 단백질은 발현 시스템에서 비-융합 단백질에 비하여 생산 수율의 증가를 가져오면서 재조합 단백질로서 발현된다. 다시 말하면, 폴리펩타이드 구성성분을 암호화하는 DNA 서열을 독립적으로 조합한 후 적당한 발현벡터에 삽입하였다. 첫 번째 폴리펩타이드 구성성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단은 두 번째 폴리펩타이드 구성성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 펩타이드 링커(peptide linker)를 사용하거나 사용하지 않고 연결되어져 서열의 리딩 프레임(reading frame)이 하나의 상으로 놓여진다. 이렇게 함으로써 두개의 폴리펩타이드 요소의 생물학적 활성을 모두 가지는 하나의 융합 단백질로 번역된다.
첫번째와 두번째 폴리펩타이드 요소가 각각의 2차 및 3차 구조를 형성하기에 충분한 정도의 거리로 떨어지도록 펩타이드 링커 서열이 도입될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 기술 분야에서 잘 알려진 표준 방법을 사용하여 융합 단백질 속으로 도입된다. 적당한 펩타이드 링커 서열은 하기의 요소에 근거해서 선택될 수 있다; 1) 구부릴수 있는 연장된 형태를 만들 수 있는 능력; 2) 첫번째와 두번째 폴리펩타이드의 기능 에피토프와 작용할 수 있는 2차 및 3차 구조를 만들 수 없는 능력; 및 3) 폴리펩타이드의 기능 에피토프와 작용할 수 있는 소수성의 혹은 전하를 띄는 잔기의 결여. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. 또한, Thr와 Ala같은 중성에 가까운 다른 아미노산들도 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열에는 Maratea 등(1985,Gene, 40:39-46; 1986,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8258-8262), 미국 특허 제 4,935,233 및 미국 특허 제 4,751,180)에서 기술된 것들을 포함한다. 링커 서열은 일반적으로 1 내지 50개의 아미노산 길이일 수 있다. 첫번째와 두번째 폴리펩타이드에 필수적이지 않은 N-말단의 아미노산 부위가 있어서 기능 도메인을 분리하여 공간적으로 상호작용하는 것을 방지하는 경우에는 링커 서열이 요구되지 않는다.
접합된 DNA 서열은 적당한 전사 혹은 번역 조절 인자와 기능적으로 연결되어 있다. DNA 발현에 관여하는 조절 인자들은 첫번째 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 유사하게, 번역을 중지하기 위하여 필요한 정지 코돈(stopcodon)과 전사 종결 신호는 두번째 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 3'에 존재한다.
또한, 융합 단백질은 연관되지 않은 면역원성(immunogenic) 단백질과 함께 본 발명의 폴리펩타이드를 구성하도록 제공된다. 바람직하게는 면역원성 단백질은 되부름(recall) 반응을 유발할 수 있다. 그러한 단백질들은 테라누스(teranus), 결핵균(tuberculosis) 및 간염균(hepatitis)의 단백질들을 포함한다(Stoute et al., 1997,New Engl. J. Med., 336:869).
바람직한 실시예에서, 면역학적 융합 파트너(partner)는 그람 음성 세균인 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B(WO 91/18926)의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유래된다. 바람직하게는 단백질 D의 유도체는 단백질의 처음 약 1/3을 차지하고(e.g., N-말단의 처음 100 내지 110 아미노산) 또한 지질화(lipidate) 될 수 있다. 어떤 바람직한 실시예에서, 지질단백질(Lipoprotein) D 융합 파트너의 처음 109 잔기는 추가적인 외인성(exogenous) T-세포 에피토프를 가지는 폴리펩타이드를 제공하거나 대장균에서의 발현량을 증가하도록(즉, 발현 증폭자로 작용하도록) N-말단에 포함된다. 지질 꼬리(lipid tail)는 항원제공세포에게 항원을 최적으로(optimal) 제공하도록 한다. 다른 융합 파터너에는 인플루엔자 바이러스의 비-구조(non-structural) 단백질인 NS1(hemaglutinin)이 포함된다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 다른 단편이 사용될 수도 있지만, 일반적으로는 N-말단의 81 아미노산이 사용된다.
다른 실시예에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 알려진 단백질이나 그의 일부분(바람직하게는 C-말단 부분)이 사용된다. LYTA는 아미다제(amidase) NYTA로 알려진 N-아세틸(acetyl)-L-알라닌(alanine) 아미다제(LytA 유전자에 의해 코딩됨;Gene, 1986, 43:265-292)를 합성하는 스트렙토코구스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한다. LYTA는 펩티도글리칸 백본(backbone)에 있는 어떤 결합을 특이적으로 분해하는 자기분해제(autolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린(choline) 또는 DEAE와 같은 어떤 콜린 유사체(analogue)에 친화력(affinity)을 가지게 한다. 이러한 성질은 융합 단백질의 발현에 유용하게 사용되는 대장균의 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용되었다. 아미노 말단의 C-LYTA 단편을 포함하는 교잡(hybrid) 단백질의 정제는 기술된 방법을 따랐다(1992,Biotechnology, 10:795-798). 바람직한 실시예에서, LYTA의 반복되는 부분은 잔기 178에서 시작하는 C-말단 부분에서 발견된다. 특별히 바람직한 반복되는 부분은 잔기 188-305이다.
어떤 실시예에서, 치료 물질(therapeutic agent)을 본 발명의 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드와 결합시키는(couple) 것이 바람직하다. 예를 들면, 하나 이상의 물질 또는 폴리펩타이드는 본 발명의 첫번째 폴리펩타이드 또는 부착(attachment)할 수 있는 여러 부위를 제공하는 링커와 직접 결합될 수 있다. 다르게는(alternatively) 담체(carrier)가 사용될 수 있다. VP22를 포함하는(그러나 VP22에 국한되지는 않는) 어떤 분자들은 세포간 교통(trafficking)이나 단백질 운반에 특별히 적합하다(Elliott and O'hare, 1997,Cell, 88:223-233; Kim et al., 1997,J. Immunol., 159:1666-1668; Rojas et al., 1998,Nature Biotechnology, 16:370; Kato et al., 1998,FEBS Lett., 427(2):203-208; Vives et al., 1997,J. Biol. Chem., 272(25):16010-7; Nagahara et al., 1998,Nature Med., 4(12):1449-1452).
담체는 직접 또는 링커 그룹을 통한 공유결합을 포함하는 다양한 방법으로 물질(agent)이나 폴리펩타이드를 포함할(bear) 수 있다. 적당한 담체는 알부민(e.g., Kato 등의 미국 특허 제 4,507,234), 펩타이드 및 아미노덱스트란(aminodextran) 같은 다당류(polysaccharide)(e.g., Shih 등의 미국 특허 제 4,699,784)를 포함한다. 또한, 담체는 비공유 결합 또는 리포좀 소낭(liposome vesicle)(미국 특허 제 4,429,008 및 4,873,088) 같은 캡슐화(encapsulation)에 의해 물질을 포함할 수 있다.
일반적으로, 융합 단백질을 포함하는 폴리펩타이드와 본 발명에서 기술한 폴리뉴클레오타이드가 분리된다. "분리된(isolated)" 폴리펩타이드 또는 폴리튜클레오타이드는 각각이 기원한(original) 환경으로부터 제거된(removed) 것이다. 예를 들면, 자연계(natural system)에서 함께 존재하는(coexisting) 일부의 또는 모든물질로부터 분리되면(separated) 자연적으로 발생하는(naturally-occurring) 단백질은 분리된(isolated) 것이다. 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 적어도 약 90% 정제되고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 정제되고, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 정제된 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 자연 환경(natural environment)의 부분이 아닌 벡터로 클로닝될 때 분리되었다고 간주된다.
폴리펩타이드는 재조합 방법이나 화학적 합성에 의해 제조되는, 자연적으로 발생하는(naturally-occurring) 형태로부터 분리될 수 있다. 본 발명에서 기술된 DNA 서열에 의해 코딩되는 재조합 폴리펩타이드는 이전 기술에서 알려진 일반적인(ordinary) 다양한 발현 벡터 중 어느 것을 사용하여 DNA 서열로부터 쉽게 준비될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되거나(transformed) 또는 형질감염된(transfected) 어떤 적당한 숙주 세포에서 발현이 일어날 수 있다. 적당한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵세포를 포함한다. 바람직하게는 숙주 세포는 대장균, 효모 또는 COS나 CHO 같은 포유동물의 세포주이다. 재조합 단백질 또는 폴리펩타이드를 배양액으로 분비하는 가용성 숙주/벡터 시스템으로부터 얻은 상등액은 상업적으로 얻을 수 있는 필터를 사용하여 최초로 농축될 수 있다. 농축 후에, 농축액은 친화 매트릭스나 이온 교환 수지같은 적당한 정제 매트릭스에 적용될 수 있다. 최종적으로, 하나 또는 그 이상의 역상 HPLC 단계가 도입되어서 재조합 폴리펩타이드를 추가로 정제할 수 있다.
또한, 약 100개보다 적은 수의 아미노산을 가지거나 일반적으로 약 50개 보다 적은 수의 아미노산을 가지는 단편들과 다른 유도체들은 이전 기술에서 잘 알려진 다양한 일반적인 방법들을 사용한 합성 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 그러한 펩타이드들은 자라는 아미노산 사슬로 아미노산이 순차적으로 첨가되는 메리필드(Merrifield)의 고체상 합성 방법같은, 상업적으로 얻을 수 있는 고체상(solid-phase) 방법을 사용하여 합성될 수 있다(Merrifield, 1963,J. Am. Chem. Soc., 85:2146-2149). 폴리펩타이드의 자동화 합성 장치는 Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City, CA)같은 상업적으로 이용 가능한 공급업체로부터 구입할 수 있으며 제조사의 지침에 따라 작동할 수 있다.
본 발명에 의한 폴리펩타이드의 유도체는 HSV 또는 HSV가 감염된 세포에 대한 면역 반응을 일으키는 능력을 유지하는 폴리펩타이드가 생기도록 하는, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실, 첨가 그리고/또는 삽입이 아미노산 서열에서 일어날 수 있다. 상기 유도체는 일반적으로 본 발명에서 기술된 폴리펩타이드 서열 중 하나를 변경하거나, 본 발명에서 기술한 T-세포 분석 같은 알려진 방법을 사용하여 변경된 폴리펩타이드의 반응성을 평가함으로써 동정될(identify) 수 있다. 바람직하게는 폴리펩타이드 유도체는 동정된 폴리펩타이드에 대해서 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다. 이러한 아미노산의 치환에는 이전 기술에서"보존적인(conservative)"으로 알려진 아미노산의 치환(그러나 여기에 국한되지는 않는)을 포함한다.
"보존적인" 치환은 펩타이드 화학 분야의 숙달된 사람이 폴리펩타이드의 2차 구조와 하이드로패틱(hydropathic) 성질이 대체적으로는 변하지 않았음을 예측할 수 있을 정도로 아미노산이 유사한 성질을 가지는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 아미노산의 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 그리고/또는 양친화성(amphipathic) 성질에 대한 유사성에 근거해서 이루어진다. 예를 들면, 음전하를 띄는 아미노산에는 아스파라긴산과 글루탐산이 있다; 양전하를 띄는 아미노산에는 리신과 아르기닌이 있다; 전하를 띄지않는 유사한 소수성을 가지는 극성 그룹에는 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파리긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 있다. 보존적인 변화를 나타내는 다른 아미노산 그룹은 1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; 2) cys, ser, tyr, thr; 3) val, ile, leu, met, ala, phe; 4) lys, arg, his; 및 5) phe, tyr, trp, his를 포함한다. 유도체는, 또한 혹은 다르게는(alternatively) 비보존적인(nonconservative) 변화를 포함할 수도 있다. 바람직한 실시예에서, 유도체 폴리펩타이드는 5개의 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 첨가되어서 본래 서열과 다르다. 유도체는 또한(혹은 다르게는) 예를 들면, 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 양친화성 성질에 최소한의 영향을 미치도록 하는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해서 변경될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포 및 재조합 바이러스
본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함될 수 있다. 또한, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 기능적으로 연관되어(linked) 있는 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 벡터는 관심있는 다른 분자를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 한 실시예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 추가적인 폴리뉴클레오타이드는 융합 단백질을 코딩하도록 연관될 수 있다.
어떤 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 포유동물의 세포에 들어가서 그곳에서 발현되도록 처방된다(formulated). 상기 처방은 하기에 기술한 치료용 목적의 경우에 특별히 유용하다. 이전 기술에서 표적 세포에서 폴리뉴클로에타이드를 발현시키는 많은 일반적인 방법들이 있으며, 어떤 적당한 방법도 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드가 아데노바이러스, 아데노-연관(adeno-associated) 바이러스, 레트로바이러스, 또는 종두종나 다른 폭스(pox) 바이러스(e.g., 애비안(avian) 폭스 바이러스) 같은, 그러나 여기에 국한되지는 않는, 바이러스 벡터로 삽입될(incorporated) 수 있다. DNA를 상기의 벡터로 삽입시키는 방법들은 이전 기술의 일반적인 방법에서 잘 알려져 있다. 레트로바이러스 벡터는 선택 마커(형질전환된 세포의 동정과 선택을 도와주기 위하여)로 사용하는 유전자 그리고/또는 벡터를 표적-특이적으로 하기 위하여 특별한 표적 세포의 수용체에 대한 리간드(ligand)를 코딩하는 유전자 같은 표적 부분(targeting moiety)을 추가적으로 전달 또는 삽입할 수 있다. 또한, 표적화(targeting)는 이전 기술의 일반적인 방법들에 의한 항체를 사용하여 획득될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 숙주 세포를 배양하고 생산된 폴리펩타이드를 회수하는(recovering) 것을 포함한다. 회수된 폴리펩타이드는 배양 상등액으로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 벡터는 생체내(in vivo), 엑스 비보(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 세포를 유전적으로 변형(modify)시키기 위하여 사용될 수 있다. 직접 또는 레트로바이러스 생산 세포를 통한 바이러스 벡터를 형질전환(transduction) 또는 감염(infection)시키는 것, 칼슘 인산염 침전, DNA를 포함하는 세균 원형질체(bacterial protoplast)를 가지는 수용 세포와의 융합, 수용 세포를 DNA를 포함하는 리포좀 또는 마이크로스피어에 처리하기, DEAE 덱스트란, 수용체-매개 엔도시토시스(endocytosis), 일렉트로포레이션(electroporation), 미세-주입(micro-injection), 및 이전 기술에서 알려진 다른 많은 방법들을 포함하는 세포를 유전적으로 변형시키기위한 몇몇 방법들이 알려져 있다(e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd ed., 1-3, 1989; 및 F.M. Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons, Inc., 1994).
바이러스 벡터에는 예를 들면, HIV, SIV, 설치류 레트로바이러스, 긴팔원숭이(gibbon ape) 백혈병 바이러스 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 아데노바이러스 같은 바이러스에 기초한 레트로바이러스 벡터를 포함한다(그러나 여기에 국한되지는 않는다)(Miller et al., 1990,Mol. Cell Biol., 10:4239; J. Kolberg, 1992,NIH Res., 4:43 및 Cornetta et al., 1991,Hum. Gene Ther., 2:215). 널리 사용되고 있는 레트로바이러스 벡터에는 설치류 백혈병 바이러스(MuL V), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GalV), 에코트로픽(ecotropic) 레트로바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합에 근거한 것들이 있다(e.g., buchscher et al., 1992,J. Virol., 66(5):2731-2739; Johann et al., 1992,J. Virol., 66(5):1635-1640; Sommerfelt et al., 1990,Virol., 176:58-59; Wilson et al., 1989,J. Virol., 63:2374-2378; Miller et al., 1991,J. Virol., 65:2220-2224 및 Rosenberg and Fauci, Fundamental Immunology, 3rd ed., W.E. Paul(ed.) Raven Press, Ltd., New York, 1993; Miller et al., 1990,Mol. Cell. Biol., 10:4239; R. Kolberg, 1992,J. NIH Res., 4:43; 및 Cornetta et al., 1991,Hum. Gene Ther., 2:215).
발현 벡터로 써브클로닝할 서열을 증폭하기 위한 적당한 시험관내 증폭 방법이 알려져 있다. PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), Qβ-레플리카제(replicase) 증폭 및 다른 RNA 중합효소 매개 방법들(e.g., NASBA)을 포함하는 상기 시험관내 증폭 방법의 예들이 Sambrook 등의 분자 클로닝(Molecular Cloning - A Laboratory Manual(2nd Ed) 1-3, 1989; 및 미국 특허 제 4,683,202; PCR Protocols - A guide to Methods and Applications(Innis et al. eds.), Academic Press Inc., San Diego, CA, 1990)에 기재되어 있다. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 향상된 방법들은 미국특허 제 5,426,039에 기재되어 있다.
본 발명은 추가적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 미생물을 제공한다. 재조합 미생물은 백신으로 유용하게 사용할 수 있으며, 이전 기술에서 알려진 생존 희박 백신(live attenuated vaccine)의 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 살아있는(live) 백신으로 사용하기 위한 미생물의 예에는 바이러스와 세균을 포함한다(그러나 여기에 국한되지는 않는다). 바람직한 실시예에서, 재조합 미생물은 바이러스이다. 적당한 바이러스의 예에는 종두종 바이러스, 카나리 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, HSV 및 아데노바이러스가 있다(그러나 여기에 국한되지는 않는다).
조성물(composition)
본 발명은 HSV 감염을 치료하고 예방하는데 유용한 조성물을 제공한다. 조성물은 바이러스 복제를 억제하고 바이러스가 감염된 세포를 죽이는데 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 조성물은 약학적 조성물이다. 조성물은 치료적으로(therapeutically) 또는 질병예방적으로(prophylactically) 효과적인 양의 본 발명의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 바이러스, APC 또는 면역 세포를 포함한다. 효과적인 양은 T-세포를 활성화하는 것과 같은 면역 반응을 나타내거나 증가시키기에(augment) 충분한 양이다. T-세포의 활성을 측정하는 한 방법은 분열 분석이다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68(5):2803-2810). 한 실시예에서, 조성물은 백신이다.
조성물은 선택적으로(optionally) 약학적으로 허용 가능한 담체같은 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로는 투약되는 특정 조성물에 의해서 결정되거나 조성물을 투약하는 특정 방법에 의해서 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 적당한 형태는 매우 다양하다. 예를 들면, 관절내(intraarticular), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 및 상피 경로(subcutaneous route)에 의한 비경구(parenteral) 투약의 적당한 형태(formulation) 및 담체에는 항산화제, 완충액, 세균발육 저지제(bacteriostat), 및 상기 형태를 원하는 수용자(recipient)의 혈액과 등장으로 만드는 용질(solute)을 포함할 수 있는 살균된 등장의 주사 용액과 현탁제, 용해제, 농후제(thickening agent), 안정제, 방부제, 리포좀, 마이크로스피어 및 유화제(emulsion)를 포함하는 수용성의 및 비-수용성의 멸균 현탁액을 포함한다.
아울러, 본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 보강제(adjuvant)를 포함한다. 보강제의 예에는 헬퍼 펩타이드, 명반(alum) 프레운드(freund) 보강제, 무라밀 트리펩타이드 포스파티딜 에탄올아민(muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine) 또는 사이토카인(cytokine)을 포함하는 면역증강 복합체(immunostinulating complex)를 포함한다(그러나 여기에 국한되지는 않는다). 어떤 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드 백신을 사용한 경우처럼, 헬퍼 펩타이드 또는 사이토카인같은 보조제는 보조제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 통하여 제공될 수 있다. 백신의 조제(preparation)는 일반적인 방법을 따른다(예를 들면, M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press(NY, 1995)). 또한, 본 발명의 범위에 의한 약학적 조성물과 백신은 생물학적으로 활성적인 또는 비활서적인 다른 화합물을 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 다른 바이러스 항원의 면역원성 부분이 융합 폴리펩타이드 속으로 삽입되거나 또는 독립된 화합물의 형태로 조성물 또는 백신에 존재할 수 있다.
약학적 조성물 또는 백신은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 본래위치(in situ)에서 만들어진 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 상기에서 기술한 바와 같이, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스 발현 시스템을 포함하는 이전 기술에서 알려진 일반적인 방법을 사용한 어떠한 다양한 운반 시스템에도 존재할 수 있다. 매우 많은 유전자 운반 기술들이 잘 알려져 있다(Rolland, 1998,Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 15:143-198 및 그 안에 인용된 참고문헌). 적당한 핵산 발현 시스템은 환자에서 발현하기 위하여 필요한 적당한 프로모터와 종결 신호같은 DNA 서열을 포함한다. 세균 운반 시스템은 세포 표면에 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 발현하거나 그러한 에피토프를 분비하는Bacillus-Calmette-Guerrin같은 세균의 투여(administration)를 포함한다. 바람직한 실시예에서, DNA는 비-병원성(defective), 복제 반응성(replication competent) 바이러스의 사용을 포함할 수 있는 바이러스 발현 시스템(e.g., 종두종 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입된다. 적당한 시스템의 예들이 기술되어 있다(Fisher-Hoch et al., 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:317-321; Flexner et al., 1989,Ann. My Acad. Sci., 569:86-103; Flexner et al., 1990,Vaccine, 8:17-21; 미국 특허 제 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 911102805; Berkner, 1988,Biotechniques, 6:616-627; Rosenfeld et al., 1991,Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993,Circulation, 88:2838-2848; 및 Guzman et al., 1993,Cir. Res., 73:1202-1207). DNA를 상기 발현 시스템에 삽입하는 방법은 해당 분야의 일반적인 기술을 가진 사람들에게 잘 알려져 있다. 또한, DNA는 "노출된(naked)" 것일 수 있다(Ulmer et al., 1993,Science, 259:1745-1749, and reviewed by Cohen, 1993,Science, 259:1691-1692). 노출된 DNA의 섭취는 세포내로 효율적으로 운반되는 생분해성의(biodegradable) 비드(bead)로 DNA를 코팅함으로써 증가될 수 있다.
해당 분야의 일반적인 기술을 가진 사람들에게 알려진 어떤 적당한 담체도 본 발명의 약학적 조성물에 도입될 수 있지만, 담체의 유형은 투약되는 방법에 따라 다양할 것이다. 본 발명의 조성물은 국소의(topical), 구강의(oral), 코의(nasal), 정맥내의(intravenous), 두개내의(intracranial), 복강내의(intraperitoneal), 상피내의(subcutaneous) 또는 근육내의 투약을 포함하는 어떤 적당한 투약 방법으로도 정형화될 수 있다.
상피내 주사같은 비경구 투여를 위하여, 담체는 바람직하게는 물, 생리식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여를 위하여, 상기에 기술한 모든 담체들 또는 만니톨(mannitol), 락토즈(lactose), 전분, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린(sodium saccharine), 탈쿰(talcum), 셀룰로스, 포도당, 과당, 및 마그네슘 카보네이트같은 고형(solid) 담체들이 도입될 수 있다. 또한, 생분해성 마이크로스피어(e.g., 폴리락테이트(polylactate), 폴리글리콜레이트(polyglycolate))가 본 발명의 약학적 조성물을 위한 담체로 도입될 수 있다. 적당한 생분해성 마이크로스피어의 예는 미국 특허 제 4,897,268 및 5,075,109에 기재되어 있다.
또한, 상기 조성물은 완충액(e.g., 중성 완충 생리식염수 또는 인산염 완충 생리식염수), 탄수화물(e.g., 포도당, 만노즈, 과당 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 글리신같은 아미노산, 항산화제, EDTA 또는 글루타치온(glutathione)같은 킬레이팅 물질, 보강제(e.g., 알루미늄 하이드록사이드) 그리고/또는 방부제를 포함할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 조성물은 동결건조되어 제조될 수 있다. 또한, 화합물은 잘 알려진 기술을 사용하여 캡슐화될(encapsulated) 수 있다.
다양한 보강제 중 어느 것도 본 발명의 백신에 도입될 수 있다. 대부분의 보강제는 항원을 빠른 이화작용(catabolism)으로부터 보호하도록 디자인된 알루미늄 하이드록사이드 또는 미네랄 오일같은 물질들과 리피드(lipid) A, 볼타델라 페르투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 단백질같은 면역 반응의 자극제(stimulator)를 포함한다. 적당한 보강제는 상업적으로 이용 가능한데 예를 들면, 프레운드 불완전 및 완전 보강제(Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크(Merck) 보강제 65(Merck and company, Inc., Rahway, NJ); 알루미늄 하이드록사이드 겔(alum) 또는 알루미늄 인산염같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신과 아실화된 당의 불용성 현탁액; 양이온 또능 음이온으로 유도된 다당류; 폴리포스파젠(polyphosphazene); 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴(monophosphoryl) 리피드 A 및 퀼(quil) A가 있다. 또한, GM CSF 또는 인터루킨(interleukin)-2, -7, 또는 -12같은 사이토카인이 보강제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공된 백신에서, 보강제 조성물은 바람직하게는 Th1 타입의 면역 반응을 현저하게(predominantly) 유도하도록 디자인된다. 많은 양(level)의 Th1-타입 사이토카인(e.g., IFN-γ, IL-2 및 IL-12)은 투입된 항원에 세포 매개성(cell mediated) 면역 반응을 유발한다. 반면에, 많은 양의 Th2-타입 사이토카인(e.g., IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 TNF-β)은 체액성(humoral) 면역 반응을 유발한다. 본 발명에서 제공된 백신을 적용한 후, 환자는 Th1- 및 Th2-타입 반응을 포함하는 면역 반응을 지원한다(support). 현저하게 Th1-타입의 반응이 일어나는 바람직한 실시예에서, Th1-타입 사이토카인의 양은 Th2-타입 사이토카인의 양보다 많이 증가할 것이다. 상기 사이토카인의 양은 표준 분석 방법을 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 사이토카인의 목록(family)은 모스만과 코프만의 문헌에 기재되어 있다(Mosmann and Coffman, 1989,Ann. Rev. Immunol., 7:145-173).
현저하게 Th1-타입 반응을 유발하기 위하여 사용되는 바람직한 보강제에는 예를 들면, 모노포스포릴(monophosphoryl) 리피드 A, 바람직하게는 3-de-O-이실화(acylated) 모노포스로릴 리피드 A(3D-MPL) 및 알루미늄 염의 조합을 포함한다. MPL 보강제는 Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton, MT)에서 구입할 수 있다(미국 특허 제 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 및 4,912,094). 또한,CpG를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(여기에서 CpG는 메틸화되어 있지 않음)는 현저하게 Th1 반응을 유발한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 잘 알려져 있으며 WO 96/02555 같은 곳에 기재되어 있다. 다른 바람직한 보강제는 사포닌(saponin)이며, 바람직하게는 QS21인데 단독으로 사용되거나 다른 보강제와의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 향상된 시스템은 QS21과 3D-MPL의 조합같은 모노포스로필 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합을 포함한다(째 95/17210). 다른 보강제로는 AS-2(Smith-Kline Beecham)가 사용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 모든 백신은 항원, 면역 반응 증폭자(enhancer) 및 적당한 담체 또는 부형제(excipient)의 조합을 만드는 잘 알려진 방법들을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 지속된 방출 형태(sustained release formulation)(e.g., 투약 후 화합물을 느리게 방출하는 작용을 하는 캡슐 또는 스폰지 같은 형태)의 부분으로 투약될 수 있다. 상기 형태는 일반적으로 잘 알려진 방법들을 사용하여 제조될 수 있으며, 경구, 항문 또는 피하 이식, 또는 원하는 표적 부위에 이식하는 방법으로 투약될 수 있다. 지속된 방출 형태는 담체 매트릭스에 퍼져있거나 그리고/또는 속도 조절 막으로 둘러싸인 저장소(reservoir)안에 포함된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체를 포함할 수 있다. 상기 형태에 사용되는 담체는 생체적합하고(biocompatible) 또한 생분해성이어야 한다; 바람직하게는 형태(formulation)는 활성 화합물의 방출이 상대적으로 일정한 수준으로 일어나게 한다. 지속된 방출 형태에 포함된 활성 화합물의 양은이식(implantation) 부위, 방출되는 속도와 예상 기간 및 치료 또는 예방하기 위한 상태(condition)의 성질에 의존한다.
어떤 다양한 운반체(delivery vehicle)도 HSV가 감염된 세포에 대한 항원-특이적 면역 반응이 생기는 것을 촉진하는 약학적 조성물과 백신에 도입될 수 있다. 운반체는 수지상 세포(dendritic cell), 마크로파지(macrophage), B 세포, 단핵구(monocyte) 및 효율적인 APC가 되도록 만들어진(engineered) 세포들 같은 항원제공세포(APC)를 포함한다. 상기 세포는, 반드시 요구되지는 않지만, 항원을 제공하는 능력을 증가시키고, T-세포 반응의 활성 그리고/또는 유지를 향상시키고, 자체로서(per se) 항바이러스 효과를 가지고 그리고/또는 수령인(receiver)과 면역학적으로 양립하도록(compatible)(i.e., 일치하는 HLA 하플로타입(haplotype)) 유전적으로 변경될 수 있다. APC는 일반적으로 종양 또는 종양주위 조직을 포함하는 어떤 다양한 생물학적 유체(fluid)와 기관으로부터 분리될 수 있으며, 자가(autologous), 동종(allogeneic), 합성 또는 이종(xenogeneic) 세포일 수 있다.
본 발명의 어떤 바람직한 실시예에서는 수지상 세포 또는 그의 전구세포(progenitor)를 항원제공세포로 사용한다. 수지상 세포는 매우 강력한 APC이며(Banchereau and Steinman,Nature, 1998, 392:245-251), 예방(prophylactic) 또는 치료용 면역을 일으키기 위한 생리학적 보강제로 효과적이라고 알려져 있다(Timmerman and Levy, 1999,Ann. Rev. Med., 50:507-529). 일반적으로, 수지상 세포는 그들의 전형적인 형태(자체로는(in situ) 별모양이고(stellate), 시험관내에서는 두드러진 세포질 돌기(덴드라이트)를 가지는)와 B 세포(CD19 및 CD20), T-세포(CD3), 단핵구(CD14) 및 자연 살해 세포(natural killer cell)(CD56)의 분화 마커의 부재(lack)에 근거해서 일반적인 분석 방법으로 동정될 수 있다. 물론, 수지상 세포는 생체내에 또는 엑스 비보(ex vivo)에서 수지상 세포에서는 흔히 발견되지 않는 특별한 세포 표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 만들어질(engineered) 수 있으며, 상기 변형된 수지상 세포는 본 발명에 의해 예측된다(contemplate). 수지상 세포의 대안(alternative)으로 분비체(secreted vesicle) 항원-적하(load) 수지상 세포(엑소좀(exosome)이라 불림)가 백신에 사용될 수 있다(Zitvogel et al., 1998,Nature Med., 4:594-600).
수지상 세포와 그의 전구 세포는 말초혈액, 골수, 종양-침투 세포, 종양주위 조직-침투 세포, 림프절, 비장(spleen), 피부, 제대혈(umbilical cord blood) 또는 다른 어떤 적당한 조직이나 유체로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포는 말초 혈액에서 수집한 단핵구 배양액에 GM-CSF, IL-4, IL-13 그리고/또는 TNFα같은 사이토카인의 조합을 첨가함으로써 엑스 비보에서 분화될 수 있다. 다르게는, 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 얻은 CD34 양성 세포는 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 그리고/또는 수지상 세포의 성숙과 분열을 유발하는 다른 화합물들의 조합을 배양액에 첨가함으로써 수지상 세포로 분화될 수 있다.
수지상 세포는 편리하게는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류되는데, 이것은 두 가지의 잘 특성화된 표현형을 구별하는 간단한 방법을 제공한다. 그러나, 이러한 명명법은 모든 가능한 분화의 중간 단계를 배제하는 것은 아니다. 미성숙 수지상 세포는 항원 섭취와 처리(processing) 능력이 높은 APC로 특징되는데, 이것은 Fcγ수용체, 만노즈(mannose) 수용체 및 DEC-205 마커의 높은 발현과 잘 일치한다. 성숙한 표현형은 전형적으로는 상기 마커들의 낮은 발현과 클래스 I 및 클래스 II MHC, 점착(adhesion) 분자(e.g., CD54 및 CD11) 및 동시자극성(costimulatory) 분자들(e.g., CD40, CD80 및 CD86)과 같은 T-세포의 활성에 관여하는 세포 표면 분자의 높은 발현으로 특징된다. APC는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 부분이 세포 표면에 발현되도록 폴리펩타이드(또는 부분 또는 그의 다른 유도체)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된다. 상기 형질전환은 엑스 비보에서 일어날 수 있으며, 상기 형질전환 세포를 구성하는 조성물 또는 백신은 본 발명에 기술한 치료용 목적으로 사용될 수 있다. 다르게는, 수지상 세포 또는 다른 항원 제공 세포로 향하는 유전자 운반체가 환자에 투여되어서 생체내에서 형질전환이 일어나게 할 수 있다. 예를 들면, 생체내 또는 엑스 비보에서의 수지상 세포의 형질전환은 WO 97/24447에서 기술된 방법이나 마비 등에 의해 기술된 유전자 총(gene gun) 방법(Mahvi et al., 1997,Immunology and Cell Biology, 75:456-460)을 사용할 수 있다. 수지상 세포에 의한 항원의 로딩(loading)은 수지상 세포 또는 전구세포를 종양 폴리펩타이드, DNA(노출되거나 또는 플라스미드 벡터 안에 있는) 또는 RNA; 또는 항원 제공재조합 세균 또는 바이러스(e.g., 종두종, 파울폭스(fowlpox), 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 배양함으로서 이루어진다. 로딩하기 전에, 폴리펩타이드는 T-세포를 도와주는(e.g., 담체 분자) 면역학적 파트너에 공유적으로 결합될 수 있다. 다르게는, 수지상 세포는 독립적으로 또는 펩타이드의 존재하에서 비-결합(non-conjugate) 면역학적 파트너에 전해질(pulsed) 수 있다.
조성물의 투여
처리(treatment)는 예방(prophylaxis)과 치료를 포함한다. 예방 또는 치료는 일회 한번 또는 여러번 직접 주사(direct injection)되어 수행되어 질 수 있다. 투여는 또한 여러 부위에 거의 동시에 주사되어 질 수 있다.
환자들 또는 대상물들은 인간, 소과, 말과(equine), 개과(canine), 고양이과(feline), 돼지과(pocrine) 및 양과(ovine) 동물들과 같은 초유동물을 포함한다.
조성물은 전형적으로 정맥내(intravenous), 피하(subcutaneous) 및 근육내(intramuscular)와 같은 비경구투여(parenteral)를 통해 생체내로 투여되거나 협/설하의(buccal/sublingual), 직장의(rectal), 구강의(oral), 비의(nasal), 국소적의(topical)(transdermal 및 ophthalmic), 질의(vaginal), 폐의(pulmonary), 동맥내의(intraarterial), 복강내의(intraperitoneal) 또는 비강내의(intranasal)경로들과 같은 다른 통상적인 직접 경로를 통하거나 특이 조직으로 직접 투여된다.
조성물은 어떠한 적당한 방식으로 투여되어 지는데, 주로 약학적으로 허용가능한 담체들과 함께 투여된다. 본 발명의 범위에서 환자에 대한 상기 투여 세포들의 적당한 방법들이 이용가능하고, 하나의 경로 이상이 특정 세포 조성물의 투여자(administer)로 사용될 수 있을지라도 주로 특정한 경로가 다른 경로보다 보다 직접적이고 보다 효과적인 반응으로 제공될 수 있다.
환자에게 투여되는 투여량은 본 발명의 범위 내에서 시간이 경과함에 따라 환자에게서 유익한 치료 반응효과를 나타내거나 감염을 억제하거나 감염으로 인한 질병을 억제하기에 충분해야만 한다. 따라서, 조성물은 특정 항원들에 대한 효과적인 면역 반응을 촉발하거나 및/또는 증상 및/또는 질병 또는 감염으로부터 합병증(complications)을 경감시키고, 감소시키고, 치료하고 적어도 부분적으로는 정지시키기에 충분한 양으로 투여되어 진다. 이를 수행하기에 적당한 양을 "치료학적으로 효과적인 투여량(therapeutically effective dose)"라 정의한다.
투여량은 치료되어질 환자의 체중 또는 표면적 뿐 아니라 생산된 조성물의 활성 및 환자의 상태를 고려하여 결정되어 질 것이다. 투여량의 크기는 또한 특정 환자에게서 특정 조성물의 투여에 의해 동반되는 어떠한 불리한 부작용의 여부, 특성 및 정도에 의해 결정되어 질 수 있다. HSV 감염과 같은 질병의 치료 또는 예방을 위하여 투여되는 조성물의 효과적인 투여량을 결정하는데 있어서, 의사는 바이러스에 대한 면역 반응의 생성, 질병의 진행정도 및 특정 치료-관련 독성을 평가하는 것이 필요하다.
예를 들면, 소단위 HSV 단백질을 포함하는 백신 또는 다른 조성물은 투여량 당 10 내지 1000 마이크로그램의 HSV 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 10 내지 1000 마이크로그램의 HSV 단백질은 보다 바람직한 실시예로서 10 내지 100 마이크로그램의 HSV 단백질을 포함하는 각각의 투여량을 포함된다. 바람직하게는, 유효량(dosage)은 단일 투여량으로 충분히 투여하거나 또는 대체 수단으로 여러번의 투여량을 몇 달의 기간동안 투여하는 방법으로부터 선택되어 진다. HSV 폴리뉴클레오타이드들 또는 펩타이드들을 포함하는 조성물에는 유사한 양이 투여량 당 투여될 수 있다.
한 실시예에서, 1 내지 10 사이의 투여가 52주 동안 투여되어 진다. 바람직하게는, 6번의 투여가 1달 간격으로 투여되며, 추가 예방접종(booster vaccination)이 그후에 주기적으로 시행될 수 있다. 대체적인 방법들이 개별적인 환자들을 위하여 적당하게 사용될 수 있다. 상기에 기술된 방식에 따라 투여하는 경우, 적당한 투여량은 항바이러스성 면역 반응을 자극시킬 수 있고 적어도 기저 수준(예를 들면 처리하지 않은 경우의)의 적어도 10 내지 50% 이상을 자극시킬 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 백신들은 또한 비-예방접종된 환자에 비하여 예방접종된 환자에서 향상된 임상 효과를 유도하는 염녁 반을 야기할 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드들로 구성된 약학적 조성물 또는 백신을 위해서는, 투여량에 존재하는 각각의 폴리펩타이드의 양이 숙주 무게 당 100 ㎍ 내지 5 ㎎ 범위이다. 바람직하게는, 양은 투여량 당 약 10 내지 1000 ㎍ 범위이다. 투여를 위한 적당한 부피는 환자의 크기, 연령 및 면역 상태에 따라변화될 수 있으나, 전형적으로 약 0.1 ㎖ 내지 5 ㎖ 범위이고 가장 일반적으로는 약 1 ㎖ 이하의 부피를 갖는다.
면역 세포로 구성된 조성물은 조성물이 투여되어질 대상으로부터 얻은 면역세포로부터 제조되는 것이 바람직하다. 대체적으로, 면역 세포들은 HLA-적합성 공여자(HLA-compatible donner)로부터 제조되어 질 수 있다. 상기 면역 세포들은 해당분야에서 잘 알려진 통상적인 기술을 이용하여 대상 또는 공여자로부터 얻어지며, 본 발명의 에피토프를 표현하기 위하여 변형된 APCs에 노출되고, 생체 외에서 연장되어 대상에게 투여된다. 생체 외 치료(ex vivotherapy)를 위한 방법들은 Rosenberg et al., 1990,New England J. Med., 9:570-578에 기술되어 있다. 더우기, 조성물은 본 발명의 에피토프를 표현하기 위하여 변형된 APCs를 포함할 수 있다.
면역 세포들은 일반적으로 이에 기술된 시험관내 성장에 의해 입양면역요법(adoptive immunotheraphy)를 위해 충분한 양으로 얻어진다. 단일 항원-특이적 효과기 세포들(single antigen-specific effector cells)을 생체내(in vivo) 항원 인식의 체류(retention)를 갖는 수십억개의 세포들로 증가시키기 위한 배양 조건들은 당해분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 생체내 배양 조건들은 주로(IL-2와 같은) 싸이도카인(cytokine) 및 비-분열성 영양 세포들(non-dividing feeder cells)의 존재시에 전형적으로 항원을 이용한 간헐적인 자극(intermittent stimulation)을 사용한다. 상기에서 지적한 바와 같이, 여기에 제공되는 면역 반응성(immunoreactive) 폴리펩타이드들은 면역요법을 위한 충분한 세포의 수를 생성하기 위하여 항원-특이적인 T-세포 배양(antigen-specific T cell culture)을 강화하고 재빨리 증가시키기 위하여 사용되어 진다. 구체적으로, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 섬유아 세포 및/또는 B 세포와 같은 항원 제공 세포들은 면역 반응성 폴리펩티들에 의해 자극되어지거나(pulsed) 당해분야에 잘 알려져 있는 공지의 기술을 사용하여 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드들로 형질감염되어 진다(transfected). 예를 들면, 항원 제공 세포들은 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템에서 발현을 증가시키기에 적당한 프로모터를 가지는 폴리뉴클레오타이드에 의해 형질감염될 수 있다. 치료를 위해 사용된 배양된 효과기 세포들은 성장하여 넓게 분포하고 생체내에서 장기간 동안 생존할 수 있어야만 한다. 현재까지 연구 결과 배양된 효과기 세포들이 생체내에서 성장하고 IL-2가 부가된 항원을 이용한 반복적인 자극에 의하여 상당한 수로 장기간 동안 성장하도록 유도될 수 있음이 밝혀졌다(Cheever et al., 1997,Immunological Reviews, 157:177).
여기에 기술된 또는 당해분야에 잘 알려진 다른 수많은 투여 경로들에 의한 투여는 주사바늘(needle), 카테터(catheter) 또는 이와 관련된 장치를 이용하여 단번에 또는 여러번으로 직접 투여에 의해 간단히 수행되러 질 수 있다.
분리된 항원들의 생체내 검사
분리된 HSV 항원들의 생체내 효과를 확인하기 위하여 통상적인 기술들이 사용되어 질 수 있다. 예를 들면, 한 기술은 마우스 챌린지 모델(mouse challange model)을 이용한다. 그러나, 당해분야에 잘 알려진 기술들이 일반적으로 사용될수 있고 다른 동물 모델들이 사용될 수 있다.
일단 검사되어질 화합물 또는 조성물이 준비되면 마우스 또는 다른 대상을 일련의 주사로 면역화시킨다. 예를 들면, 10번의 주사까지는 수개월 동안에 걸쳐서 투여될 수 있으며 전형적으로 투여 사이에 1 내지 4주의 간격을 둔다. 일련의 마지막 투여 후에, 대상은 균등하게 치사적인 투여량(lethal dose)으로 확립되어진 바이러스의 투여량이 투여된다(challanged).
대조군은 플라시보를 받은 반면, 실험군은 화발하게 예방접종되어 진다(vaccinated). 대체적으로, 연구는 치사량 이하의(sublethal) 투여량을 사용하여 계획되어 질 수 있다. 선택적으로, 투여량-반응 연구(dose-response study)가 포함될 수 있다. 본 연구에서 측정되어 지는 최종 순간들(end points)은 사망과 심각한 신경학적 손상(neurological impairments)을 포함하는데, 그 증거로서 에를 들면 척수 보행(spinal cord gait)을 포함한다. 생존자들은 또한 척수, 뇌 및 주사 부위를 포함하는 중심 기관의 정량적인 바이러스성 배양(quantitative viral culture)을 위하여 희생되어 질 수 있다. 상기 조직 시료들에 존재하는 바이러스의 양은 측정되어 질 수 있다. 조성물은 또한 치료용 백신(therapeutic vaccine)으로서의 효과를 확인하기 위하여 재발(recurrence)을 감소시키기 위하여 이전에 감염된 동물들을 대상으로 검사할 수도 있다.
효과는 IC50을 계산하여 결정되어 질 수 있는데, IC50은 대상의 50%를 사망으로부터 보호하기 위해 요구되는 체중 ㎏ 당 ㎍ 백신을 나타낸다. IC50은 사용되는챌린지 투여량(challange dose)에 의존한다. 게다가, LD50도 계산할 수 있는데, 이는 얼마나 많은 감염 단위(infectious units)가 백신의 특정 투여량이 주입되는 대상의 절반을 죽이는데 요구되는 가를 나타낸다. 포스트 모템 바이러스 역가(post mortem viral titer)의 결정은 바이러스 복제가 면역 시스템에 의해 제한된다는 것에 대한 확신을 제공한다.
검사의 연이은 단계는 질 접종 챌린지(vaginal inoculation challange)일 수 있다. 급성 방어(acute protection) 연구를 위하여, 마우스가 사용될 수 있다. 이들은 급성 방어와 재발의 방지 모두를 위해 연구되어 질 수 있기 때문에 기니아 피그들(ginuea pigs)은 인간에 대한 보외법(ectrapolation)을 위한 생리학적으로 보다 관련이 있는 대상으로 제공된다. 이러한 형태의 챌린지에는, 비-치사적 투여량(non-lethal dose)이 투여되고, 기니아 피그 대상들은 치유되고 재발하는 병소(lesions)가 발생한다. 측정은 급성 질환 회복(amelioration) 및 병소의 재발 모두를 포함한다. 백신 또는 다른 조성물을 이용한 간섭(intervention)은 연구자가 예방과 치료 중 어느 쪽을 원하느냐에 따라 접종 전 또는 후에 제공되어 질 수 있다.
방법들
본 발명은 대상에 있어서 HSV 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 조성물은 치료목적 또는 예방목적의 백신으로 사용될 수 있다. 한 실시예에서, HSV는 HSV-2이다. 이와 대체적으로, HSV는 HSV-1일 수 있다. 본 발명은 부가적으로 HSV 복제(replication)를 억제하기 위하여, HSV-감염 세포들을 사멸하기 위하여, 항바이러스성 및/또는 면역중재성 활성을 가지는 림포카인(lymphokines)의 분비를 증가시키기 위하여, 그리고 헤르페스-특이적인 항체들(herpes-specific antibodies)의 생산을 증가시키기 위하여 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 상기 방법은 HSV-감염 세포를 본 발명의 항원에 의하여 유도된 면역 세포와 접촉하는 단계를 포함하는데, 에를 들면 여기에 나타낸 실시예에 기술된 바와 같다. 접촉은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 수행되어 질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 면역 세포는 T-세포이다. T-세포들은 CD4 및 CD8 세포들을 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 헤르페스 각막염(herpese keratitis) 등의 눈병 질환과 같은 면역병리학적 질환(immunopathological disease)에 대한 내성제(tolerizing agents)로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 HSVDP 대하여 유도된 면역 세포들을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역 세포를 항원 제공 세포와 접촉하는 단계를 포함하는데, 여기서 항원 제공 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 항원을 표현하도록 변형된 것이다. 바람직하게는, 항원 제공 세포는 수지상 세포이다. 예를 들면, 세포는 펩타이드 로딩(peptide loading) 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 유전학적 변형(genetic modification)에 의해 변화될 수 있다. 한 실시예에서, 면역 세포는 T-세포이다. T-세포들은 CD4 및 CD8 세포를 포함한다. 또한 본발명은 상기 방법에 의해 생산된 면역 세포들을 제공한다. 면역 세포들은 HSV 복제를 억제하고, 시험관내 또는 생체내에서 HSV-감염 세포들을 사멸하고, 항바이러스성 및/또는 면역중재성 활성을 갖는 림포카인의 분비를 촉진하고, 헤르페스-특이적인 항체들의 생산을 증가시키고, 또는 대상에게 있어서 HSV 감염의 치료 또는 예방을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 감염된 생물체와 관련된 면역원성 에피토프를 분리하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 생물성 게놈의 무작위적 단편들의 집합을 제조하는 단계를 포함하다. 상기 제조는 전체 게놈(full genome)을 가지고 시작할 필요가 없다 할지라도 전체 게놈을 분해하는 단계를 포함한다. 분해는 요구되는 길이 범위를 가지는 무작위적 단편들의 집합을 얻기 위하여 게놈을 하나 또는 그 이상의 제한효소들과 접촉시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이와 대체적으로, 게놈에 음파처리(sonicate)를 하고, 연무하거나(nebulize) 그렇지 않으면 대상이 되는 게놈을 포함하는 물질을 처리하고 적당한 크기의 겔 단편으로부터 분리할 수 있다.
분해, 및 제한효소들의 선별은 T-세포 에피토프의 평균 길이보다 더 긴, 즉 약 30 뉴클레오타이드의 길이보다 더 긴 게놈의 단편을 얻기 위하여 계획되어 진다. 단편들은 유전적 정지(genetic stops)가 약 200 내지 500 베이스 페어(base pairs) 길이로 좀처럼 일어나지 않을 정도로 충분히 적다. 대상이 되는 생물체의 게놈 서열 또는 제한효소 지도가 알려져 있고 만약 여기에 적당한 제한효소를 적용한다면 적당한 길이를 갖는 단편들을 목적하는 수만큼 얻게 되는 제한효소 부위를분리하기 위하여 게놈을 분석할 수 있다. 제한효소들은 또한 사용되어 지는 클로닝 벡터(cloning vector) 내의 제한효소 부위들과 상응하는 부위를 목적하여 선별되어 질 수 있다.
그리고 나서 무작위적 단편들은 단편들에 의해 암호화되는 폴리펩타이드들을 발현하기 위하여 사용되어 진다. 단편들은 개별적으로 발현될 수 있는데, 바람직하게는 폴리펩타이드의 풀(pool)로서 단독으로 또는 융합 단백질의 형태로서 발현될 수 있다. 폴리펩타이드들이 출발물질로서 DNA 또는 RNA로부터 발현되어 질 수 있다는 것은 당해분야에서는 공지된 사실이다. 예를 들면, RNA로부터 폴리펩타이드들의 발현은 우선 RNA 단편으로부터 cDNA를 제조한 후 폴리펩타이드를 발현하기 위하여 상기 cDNA를 사용하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 불용성 봉입체(insoluble inclusion body)로서 발현되어 진다. 불용성 봉입체로서 폴리펩타이드의 발현은 손쉽게 APCs에 의해 진행되고 표현되는 형태로 폴리펩타이드의 다량 발현을 가능하게 한다. 봉입체 형태로 발현된 단백질들은 분리가 용이하고 발현과 생산을 위한 고효율 방법으로 제공되며 서열이 밝혀지지 않은 생물체들에게도 상기 방법을 적용하기 쉽게 한다.
폴리펩타이드는 게놈의 단편을 포함하고 있는 벡터로부터 발현될 수 있다. 바람직한 실시예로서, 벡터는 pUEX 벡터와 같은 플라스미드(plasmid)이다. 삽입체(insert)로부터 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 다른 벡터들이 사용될 수 있음을 당해분야에 잘 알려진 사실이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 융합 단백질로서 발현된다. 바람직한 융합 단백질의 일예가 불용성 β-갈락토시다제 융합 단백질(insoluble β-galactosidase fusion protein)이다. 한 실시예에서, 발현은 게놈의 단편을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 바람직한 실시에로서, 단편들은 세 개의 서로 다른 리딩 프레임 내로, 그리고 양 방향 모두로 발현벡터 내에 삽입되어 진다.
더 나아가 상기 방법은 발현된 폴리펩타이드들을 회수하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 배양된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩타이드는 배양된 세포로부터 상등액만을 모으는 단계에 의해 회수될 수 있다. 회수된 폴리펩타이드는 더 나아가 일반적인 기술들을 사용하여 상등액으로부터 정제되어질 수 있다. 불용성 봉입체 형태로 발현된 폴리펩타이드는 예를 들면 음파처리(sonication), 라이소자임(lysozyme) 및 불용성 봉입체의 계면활성제-연합 분리(detergent-associated isolation)(Neophytou et al., 1996,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93:2014-2018)에 의하여 회수되어질 수 있다.
더 나아가 상기 방법은 발현된 폴리펩타이드가 면역 반응을 촉발하는 활성을 분석하는 단계를 포함한다. 면역 반응을 촉발하는 활성은 상기 폴리펩타이드 내에 면역원성 에피토프가 존재함을 나타내는 것이다. 한 실시예에서, 면역 반응은 세포성 면역 반응(cellular immune response)이다. 분석은 T-세포 자극(T cell stimulation) 또는 활성(activation)을 측정하는 분석방법을 수행하는 단계를 포함한다. T-세포들의 예로는 CD4 및 CD8 T-세포를 포함한다.
T-세포 자극 분석의 일예로서 하기 실시예 1 또는 D. M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68(5):2803-2810에 기술된 바와 같이 T-세포 증식 분석방법(Tcell proliferation assay)이 있다. 예를 들면, T-세포 증식 분석방법은 발현된 폴리펩타이드를 항원 제공 세포 및 바이러스에 의해 유도된 T-세포와 접촉시키고 T-세포 증식을 측정하는 단계를 포함한다. T-세포 증식은3H-싸이미딘(3H-thymidine) 또는 다른 증식 표지자(proliferation marker)의 삽입(incorporation)을 측정함으로써 측정될 수 있다. 만약 증식이 증가되었다면, T-세포 자극은 대조군 항원에 대한 T-세포 증식과 비교하여 검사 항원에 노출된 T-세포에서 검출된다. 증가된 증식에 대한 하나의 예시적인 기준(exemplary criterion)은 대조군 세포 배양과 비교하여 검체의 침전된 핵산 시료(presipitated nucleic acid preparations) 내로 삽입된3H-싸이미딘의 액체 씬틸레이션 카운팅(liquid scintillation counting)을 기초로 하여 분당 횟수(counts per minute, cpm)에 있어서의 통계적으로 눈에 띄는 증가이다. T-세포 자극 분석 또는 활성을 분석하기 위한 또 다른 일예로서 세포용해 분석방법(cytolysis assay)이 있다. 세포용해 분석방법의 일예가 이하 실시예 1에 제공되어 진다.
분석은 활성 활성 성분들(active moieties)을 포함하는 풀을 분리하기 위하여 폴리펩타이드들의 풀 상에서 수행되어질 수 있다. 그리고 나서 더 나아가 분석은 대상이 되는 폴리펩타이드들을 분리하기 위하여 기존 풀의 점차적으로 보다 적어지는 소단위(subset) 상에서 수행되어질 수 있다. 데상이 되는 단편을 포함하는 물질, 예를 들면 바이러스 유래 삽입체를 가지는 플라스미드는 분리·정제되어 지고 바이러스 유래 단편은 염기서열이 분석되어 질 수 있다. 상기 서열분석으로부터 얻은 정보를 기초로 하여, 합성 펩타이드(synthetic peptide)가 연속적인 검사와 분리된 항원들의 확인을 위하여 준비되어 질 수 있다. 단편들의 서열분석은 또한 신규 유전자의 분리를 이끌 수도 있다.
상기 방법 단계들은 반복되어 질 수 있는데, 여기서 게놈 단편들의 소단편들(subfragments)이 준비되어 진다. 점차적으로 보다 작아지는 단편들은 발현되어 최소한의 에피토프(minimal epitope)를 결정하기 위하여 검사되어 질 수 있다.
본 발명의 방법은 세균, 기생충 및 바이러스 등의 다양한 감염성 생물체들에 적용되어 질 수 있다. 바이러스로는 인트론이 없는(intronless) DNA 또는 대부분이 암호화되는 서열(coding sequence)을 포함하는 것이 바람직하다. 바이러스의 예로는 이중-가닥 DNA 바이러스들, 단일-가닥 DNA 바이러스들, 이중-가닥 RNA 바이러스들 및 단일-가닥 RNA 바이러스들이 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 이중-가닥 DNA 바이러스의 예로는 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus EBV), 싸이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV), 헤르페스 심플렉스 바이러스-1(herpes simplex virus-1, HSV-1), HSV-2, 바리셀라-조스터 바이러스(varicella-zoster virus, VZV), 인간 헤르페스 바이러스-6(human herpes virus), HHV-7, HHV-8, 폭스바이러스(poxvirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)가 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 단일-가닥 DNA 바이러스의 예로는 파르보바이러(parvovirus)스가 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 이중-가닥 RNA 바이러스의 예로는 레트로바이로스들(retroviruses) 및 레오바이러스들(reoviruses)이 있다. 이에 한정되는것은 아니지만, 단일-가닥 RNA 바이러스의 예로는 파라믹소바이러스들(paramyxoviruses), 믹소바이러스들(myxoviruses) 및 플라비바이러스들(flaviviruses)이 있다.
상기 방법은 생물체의 핵산 염기서열에 대한 지식이 요구되지 아노기 때문에, 매우 대단한 정도의 생물학적 다양성(예를 들면, HIV 및 HCV)을 나타내는 감염성 생물체들과 싸우기 위한 전략을 제공한다. 고도의 다양성을 나타내는 바이러스에 대해서는 특정 환자, 특정 부위(예를 들면 혈액, 피부, 자궁), 공지된 핵산 서열을 갖는 원형 균주(prototypical strains)와는 구별되는 지리학적으로(geographical) 특정 위치 또는 특정 환자 인구 내에서 순환하는 대표적인 바이러스성 균주(viral strains)로부터 유래된 바이러스성 핵산 물질 자원(source)을 사용하는 것이 유리하다.
본 발명은 또한 진단 분석방법(diagnostic assay)을 제공한다. 진단 분석방법은 포진성 감염(herpeptic infection)을 가지고 있을 것으로 의심되는 환자의 면역학적 반응을 밝히고 치료의 특정 과정에 대한 환자의 반응을 예상하는 데 사용될 수 있다. 상기 분석방법은 적당한 APC 범위 내에서 본 발명의 항원에 대한 대상의 T-세포들을 노출시키고 면역 반응을 조사하는 단게로 구성되는데, 예를 들면 INFγ, 증식 또는 세포독성을 측정하는 것이다. 적당한 분석방법은 실시예에 보다 자세하게 기술되어 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> HSV-2 외피 단백질에 있는 바이러스 에피토프의 동정
본 실시예에서는 T-세포의 항원을 동정하기 위하여 전체길이의 바이러스 DNA를 사용한 발현 클로닝(expression cloning)을 사용하는 것을 보여준다. 본 실시예에서는 발현 클로닝으로 발견된 병변침투(lesion-infiltrating) T-세포에 의해 인식되는 다섯 개의 HSV 에피토프를 제공한다. 또한, 본 실시예에서는 발현 클로닝 이외의 방법으로 발견된 VP16의 몇가지 에피토프를 제공한다.
바이러스와 세포
HSV-1 종 E115(S.L. Spruance and F.S. Chow, 1980,J. Infect. Dis., 142:671-675), HSV-2 종 333(S. Kit et al., 1983,Biochim. Biophys. Acta., 741:158-170), 상호유형의(intertypic) 재조합 바이러스 RS1G31(M.F. Para et al., 1983,J. Virol., 45:1223-1227), DX32(V.G. Preston et al., 1978,J. Virol., 28:499-517) 및 RP-2(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810)를 Vero 세포(D.M. Koelle et al., 1993,J. Clin. Invest., 91:961-968)에서 배양하고 정량한다. 에프스테인-바 바이러스가 형질전환된 임파구 연속 세포주(EBV-LCL, Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line, D.M. Koelle et al., 1993,supra,)는 생식기 헤르페스(genital herpes), AMAI, HLA DPB1*0402의 동형(homozygous), HOM2, HLA DQB10501의 동형, MAT, HLA DQB1*0201의 동형, ARENT, HLA DPB1*2001의 동형인 공여체(donor)로부터 기원한 자가 세포주(autologous line)를 포함한다(J.G. Bodmer et al., 1996,Tissue Antigens, 49:297-321).
HSV-특이적 T-세포는 제도위원회(Institutional Review Board)의 승인을 얻은 후 획득하였다. 대부분의 클론은 항원으로 시험관내(in vitro)에서의 2차 자극없이 획득하였다. 공여체 1, 2 및 4는 이전기술(D.M Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810)에 따라 번호를 매겼고, 각각 병변유래(lesion-derived) 클론인 1.L3D5.10.8, 2.3 및 4.2E1의 근원(source)이 되었다. 클론 2.3과 4.2E1은 이전 기술에 설명하였다(D.M. Koelle et al., 1994,supra). 다른 병변유래 클론들은 2차, 3차 및 4차 병변 샘플(각각 일년 간격으로 구분됨)로 ESL2.20, ESL3.335, ESL4.34 및 ESL4.9을 제공하는 공여체 ES, 공여체 RH 및 KM으로부터 유래되었다. 클론 2.3, 4.2E1, ESL2.20, RH.13 및 KM.17은 헤르페스에 감염된 수포액(herpetic vesicle fluid)으로부터 직접 획득하였다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Infect. Dis., 169:956-961). CD4 TCC ESL4.9를 획득하기 위하여, 재발성 생식기 HSV-2 병변을 증상후 3일에 생검(biopsy)하였고, 전체(bulk) 병변침투 세포는기술된 것처럼 아시클로비어(acyclovir)의 존재하에서(D.M. Koelle et al., 1998,J. Clin. Invest., 101:1500-09) PHA와 IL-2에의해 확장되었다(expanded)(Schiaperelli Biosystems, Columbia, MD). 16일 후에 세포들을 웰당 1개 세포로(1 cell/well) 클론하였다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Infect. Dis., 169:956-961). 이전에 기술된 VP16-특이적 클론인 1A.B.25, ESL3.334 및 ESL4.34(D.G. Doherty et al., 1996,Human Immunol., 47:149; K.R. Jerome et al., 1998,J. virol., 72:436-441; D.M. Koelle et al., 1997,Human Immunol., 53:195-205)는 전체 배양세포로부터 동시에 획득하였다.
어떤 클론은 항원으로 시험관내에서 2차 자극을 하여 획득하였다. 공여체 1로부터 다른 TCC를 획득하기 위하여(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810), 클론 1A.B.25가 유래된 재발부위가 6년이 경과한 후 증상후 5일에 각각 4개의 2 ㎜ 생검을 취하여 PHS-유래 전체 배양세포를 획득하였다. 16일 후 하나의 생검 배양세포로부터 유래된 1.5×106전체 임파구를 10 ㎍/㎖ HSV-2 VP22 105-190로 자극하였고 동일한 수의 자가조직(autologous)을 2 ㎖ T-세포 배양액의 PBMC에 3300 rad로 방사선 조사하였다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Infect. Dis., 169:956-961). IL-2(32 U/㎖)를 6일째에 첨가하였으며, 12일째에 기술한 방법을 사용하여 TCC 1.L3D5.10.8을 상기 라인(line)으로부터 획득하였다(D.M. Koelle et al., 1994, supra). PBMC-유래 TCCSB.17과 BM.17을 제조하기 위하여,HSV-2 혈청양성(seropositive) 공여체인 SB와 SM의 1.5×106PBMC(peripheral blood mononuclear cells)를 4 ㎍/㎖의 배큘로바이러스(baculovirus) 유래 전체길이 VP16으로 12일 동안 25웰 플레이트에서 자극하였고, 반응하는 세포들을 웰당 1개 세포로(1 cell/well) 클론하였다. TCC와 라인(line)들은 마지막 자극 후 10 내지 14일 경과 후에 사용하였다.
모든 세포주들은 ARENT를 제외하고는 마이코플라즈마(mycoplasma)에 음성을 나타내었다. ARENT는 초기에는 DNA 탐침 시험(Genprobe, San Die해, CA)에 의해 마이코플라즈마 양성을 나타내었고, 10 ㎍/㎖ 농도의 씨프로플록사신(ciprofloxacin)으로 사용하기 전 2주동안 처리하여(S.M. Gignac et al., 1991,Leukemia, 5:162-165) 시험에서 음성을 나타내도록 변환시켜(conversion) 사용하였다.
유세포 분석(Flow Cytometry)
설치류의 mAb를 인간의 CD4(클론 SFCI 12T4D11)와 CD8(인간 CD8의 α 사슬을 인식하는 클론 SFC 21Thy2D3)(Coulter, Hialeah, FL)에 결합시킨 것을 유세포 분석에 사용하였다.
면역블롯(Immunoblot)
HSV-감염된 Vero 세포의 파쇄물(lysate)을 준비하여 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후 기술된 방법으로(R.A. Ashley et al., 1988,J. Clin. Microbiol., 26:662-667) 니트로셀룰로스 막에 전달시켰다. 블롯은 0.05% PBS와 1% Tween 20이 첨가된 비지방 건조 우유(nonfat dried milk)로 차단(block)시켰다. UL49 유전자의 생성물인 VP22(G.D. Elliott et al., 1992,J. Gen. Virol., 73:723-736)에 특이적인 mAb P43을 1:100으로 희석한 용액, 친화력(affinity)으로 분리한 염소의 항-생쥐 IgM-퍼옥시다제(peroxidase) 결합체(Sigma, St. Louis, MO) 및 TMB 기질 시스템(Kirkegaard and Perry, Gaithersberg, MD)에 순차적으로 배양하고 각 단계마다 PBS-Tween으로 5분간 3회씩 세척하여 항원을 검출하였다.
바이러스 DNA 라이브러리(library)와 클로닝
써브게놈(subgenomic) DNA를 제조하기 위하여, HSV-2 종인 HG-52BamHIw 단편을BglIIi 단편으로부터 써브클론하여 겔로 분리하였다. 바이러스 DNA를SmaI으로 절단하였고BamHI 말단은 클레나우(Klenow) DNA 중합효소를 사용하여 무디게(blunt) 하였으며, 페놀 추출과 알코올 침전으로 DNA 단편을 분리하였다. 전체 바이러스 DNA를 제조하기 위하여, HSV-2 종 HG52를 가득 자란(confluent) Vero 세포에 감염시켰다. 단백질 분해효소(proteinase) K 절단(digestion), 클로로포름-페놀 추출, 이소프로판올 침전으로 세 개의 150 ㎝2배양 세포로부터 전체 핵산을 수획하였다. 최종 생성물을 Range H로 처리하였고 재추출 및 침전시켰다.당량(1 ㎍)의 HG52 DNA를SmaI 또는AluI으로 절단하였고, 발현 라이브러리를 제조하기 위하여 이들중 80%를 회복시켰다(recover).
발현 클론은 pUEX 벡터(G.M. Bressan et al., 1987,Nucleic Acids Res., 15:10056)를 사용하여 제조하였다. pUEX-1, -2 및 -3 DNA를SmaI을 사용하여 선형화(linearize)하였으며, 송아지 장 탈인산화효소(calf intestinal phosphatase)를 사용하여 탈인산화하였고 겔로 DNA를 분리하였다. 약 100 ng의 벡터와 500 ng의 DNA 단편을 접합시켰고(ligated) 10%의 에탄올-침전 반응 혼합물을 사용하여E. coli종 DH10 Electromas(GIBCO)를 1 ㎜ 큐벳(cuvette)에서 전기천공법(electroporation, BTX, San Diego, CA)으로 형질전환시켰다. 1 ㎖의 SOC 배양액에서 1시간 동안 회수(recovery)한 후 분획을 각각 100 ㎕의 글리세롤 스톡(stock)으로 동결시켜 30℃ 250 ㎕의 암피실린 플레이트에서 적정(titer)하거나 또는 직접(250 ㎕) 융합 단백질 라이브러리를 제조하기 위한 단백질 유도(induction)에 사용하였다. 매 형질전환시 마다 수천개의 암피실린-저항성 콜로니를 획득하였다. 게놈 라이브러리를 증폭하기 위하여 글리세롤 스톡을 30℃ I n2YT-암피실린에서 밤새 배양하였고 재동결시켰다.
VP22 105-190, UL50 118-312 및 UL50 118-250의 확증하는(confirmatory) 써브클로닝은 각각 262 bp의 UL49SmaI-StuI 단편, 583 bp의 UL50SmaI 단편 또는 397bp의 UL50SmaI-StuI 단편을 분리하여 수행하였다. 단편들은 선형인, 겔을 사용하여 분리한 적당한 pUEX 벡터와E. ColiDH5I에서 발현하는 단백질에 클로닝하였다. 구조물(construct)은 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다.
항원
108내지 109pfu/㎖의 전체 바이러스 침전물을 30분간 UV 조사하여 불활성화시켰으며(A. Mikloska and A.L. Cunningham,J. Gen. virol., 79, 353-361, 1998) 최종적으로 1:100으로 희석한 용액을 사용하였다. VP22의 펩타이드를 이전 기술에 따라 합성하였고(D.M. Koelle et al., 1997,Human Immunol., 53:195-205) DMSO에서 2 ㎎/㎖의 농도로 스톡하여 사용하였다. 13개 아미노산 길이이고 4개의 아미노산이 겹치는(overlapping) UL48의 펩타이드, 아미노산 1-416인 HSV-2의 VP16 및 전체길이의 VP16은 Chiron Corporatioin, Emeryville, CA로부터 구입하였다.
세균기원의(bacterial-derived) 단백질 항원은 30℃ 2YT-암피실린 브로스(broth)에서 대수적으로(logarithmically) 자라는 세포에서(OD6000.4 내지 0.6) 42℃에서 두시간 동안 유도하여 발현시켰다. 단백질은 이전 기술의 방법으로 분리하였고(P.I. Neophytou et al, 1996,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2014-2018) 겔 분리과정은 생략하였다. 50 ㎖(라이브러리) 또는 5 내지 10 ㎖(풀(pool)및 클론)의 세균 배양으로 200 내지 400 ㎕의 Ca2+, Mg2+가 제거된 PBS에서 우수한 입자 현탁액을 획득하였다. 단백질 농도는 60℃에서 10분동안 1% SDS에 단백질을 용해시킨후 BCA(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 결정하였다. 몇 번의 실험에서는 열에의해 유도된(heat-induced) 세균을 PBS 및 PBS/10 mM EDTA로 세척하였고 56℃에서 10분간 가열하였으며 항원으로 사용하기 전에 PBS로 세척하였다.
바이러스 DNA의 활성(active) 라이브러리를 동정(identification)한 후, 써브게놈 바이러스 DNA 분획을 위하여 30 내지 60 클론을 사용하거나 전체길이의 바이러스 DNA를 위하여 2,000 내지 3,000 클론을 사용하여 항원을 동정하였다. 좀더 복잡하지 않은 라이브러리를 제조하기 위하여, 각 클론의 1 ㎖ 배양액을 6 내지 8 클론의 풀(pool)로 처리하였다(processed). 활성 풀에서의 각 클론과 알려진 바이러스 DNA 분획을 포함하는 확증하는 써브클론은 5 ㎖ 배양액에서 처리하였다. 전체 바이러스 DNA로부터 라이브러리를 검색하기 위하여 결합 방법(combinatorial method)을 사용하였다(P.I. Neophytou et al., 1996,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2014-2018). 형질전환 세균의 증폭된 라이브러리 글리세롤 스톡은 암피실린 플레이트에 적정하였다; 회전하는 혼합기(rotating shaker)에서 20 내지 30 콜로니/웰의 농도로 96-웰 플레이트에서 30℃로 밤새 배양하였다. 배양액은 1:100으로 희석하여 1 ㎖로 만들었고 상기 기술한 방법으로 융합 단백질의 합성을 유도하였다. 임파구분열 분석(lymphoproliferation assay)으로 단백질 정제 및평가(evaluation)를 하기 위하여 배양액의 분획(400 ㎕)을 열과 종으로(row- and column-wise) 수집하였다(pooled). 만일 하나 이상의 열과 종에서 양성이면(positive) 양성 열들과 하나의 양성 종의 교차점에 있는 웰을 사용하여 5 내지 10 ㎖의 배양액으로부터 양성 웰을 동정하기 위하여 단백질을 분리하였다. 양성 웰을 희석한 브로스(broth)로 접종한(seeded) 암피실린 플레이트로부터 세균의 배양(96 콜로니)을 실시하였다. 상기 배양은 12개의 세균 콜로니의 풀로써 평가하였고(evaluated) 이후에 개별 콜로니로 평가하였다.
임파구 기능 분석(Lymphocyte Functional Assay)
3중(triplicate) 분열 분석 웰은 항원제공세포(APC, antigen presenting cell)로 104클론의 T-세포, 105의 방사선 조사된(3300 rad) PBMC 또는 2.5×104의 방사선 조사된(8000 rad) EBV-LCL을 사용하였고 항원으로는 96-웰 U-바텀(bottom) 플레이트에 있는 200 ㎕의 T-세포 배양액(D.M. Koelle et al., 1997,Human Immunol., 53:195-205)을 사용하였다. 열로 죽인(heat-killed) 세균을 항원으로 사용한 경우에는 불활성화 전에 105cfu/웰 상당(equivalent)과 젠타미신(gentamicin) 20 ㎍/㎖을 첨가하였다. 72시간 후에, 웰당 1 μCi의[3]H 싸이미딘(thymidine)을 첨가하여 18시간 동안 배양하였고 세포를 수확한 후 액체 섬광 계수법(liquid scintillation counting)으로 싸이미딘의 유입(incorporation)을 측정하였다. 표준 편차는 평균값의 10%보다 적었다. 결과를 평균 cpm으로 나타내거나 실험 항원의 평균 cpm에서 대조군 항원의 평균 cpm을 뺀 값인 델타(delta) cpm으로 나타내었다. 대조군 항원은 전체 바이러스 항원에 대해서는 허위-감염된(mock-infected) 세포 파쇄물을 사용하였고 재조합 단백질의 경우에는 pUEX2-유래 β-갈락토시다제(galactosidase)를 사용하였다. 전체배양된 병변유래 T-세포의 반응성을 결정하기 위하여 융합 단백질 또는 대조군 β-갈락토시다제를 10 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 당단백질(glycoprotein) B와 D 및 HSV-2의 VP16을 1 ㎍/㎖의 농도로 사용하였고 이전에 기술한 방법으로 분석을 실시하였다(D.M. Koelle et al., 1998,J. Clin. Invest., 101:1500-09). HLA 제한 부위(restricting loci)를 결정하기 위하여, HLA DR-특이적 mAb L243(V.G. Preston et al., 1978,J. Virol., 28:499-517), HLA DP-특이적 mAb B7.21(A.J. Watson et al., 1983,Nature, 304:358-360) 또는 HLA DQ-특이적 mAb SpV-L3(H. Spits et al., 1984,Eur. J. Immunol., 14:299-304)을 이전에 기술한 방법으로 사용하였다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810).
세포용해 분석(cytolysis assay)은 이전 기술한 방법에 따라 4시간에서의[51]Cr 방출(release)을 3중으로 수행하여 실시하였다(D.M. Koelle et al., 1993,J. Clin. Invest., 91:961-968). 표적 EBV-LCL은 HSV-3을 사용하여 MOI(multiplicity of infection) 30으로 18시간 감염시키거나 이전 기술처럼(W.W. Kwok et al., 1996,J. Exp. Med., 183:1253-1258) 세척하기 전에 1.0 μM의 펩타이드로 90분간적용하였다(pulsed). 효과기(effector)와 표적의 비율은 20:1이었다. 자연적인 방출(spontaneous release)은 28%보다 낮았다.
DNA 서열분석(sequencing)
활성 단백질을 생산하는 세균에 있는 플라스미드의 바이러스 삽입체(viral insert) 서열은 양방향에서서열번호 1로 기재되는 삽입체의 5'-말단 프라이머와서열번호 2로 기재되는 삽입체의 3'-말단 프라이머를 사용하여 분석하였고 필요한 경우 내부 프라이머(internal primer)를 사용하였다.
HLA 타이핑(typing)
HLA DR과 DQ 타이핑을 혈청학적 방법(serologic method)에 의한 클래스(class) II 대립유전자(allele)에 대해서 실시하거나 역 점 블롯 교잡법(reverse dot blot hybridization)에 의한 DNA 수준에서 실시하였다(E. Mickelson et al., 1993,Tissue Antigens, 41:86-93). HLA DP 타이핑은 서열을 분석하여 실시하였다(HLA DP 키트, Perkin Elmer ABI).
결과
T-세포 에피토프의 우수한 위치(fine localization)
발현 클로닝에서 라이브러리의 복잡성을 줄이기 위하여, HSV-1과 HSV-2의 인터타입 재조합 바이러스(IRV, intertypic recombinant virus)를 사용하여 부분적으로 맵핑(mapping)된 TCC를 인식하는 항원(들)을 선별하였다. 0.7 지도 단위(map unit) 근처의 HSV DNA는 VP16 이외의 T-세포 항원을 코딩한다. TCC 4.2 EI와 2.3을 맵핑하는 에피토프(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810)는 IRV DX32를 사용하여 향상되었다(improved)(도 1). 상기 HSV-2에 기초한 바이러스는 0.7 지도 단위 근처에서 일단(block)의 HSV-1 DNA를 포함한다(V.G. Preston et al., 1978,J. Virol., 28:499-517). UL48 유전자 생성물은 HSV-2 타입-특이적, VP16-특이적(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810) T-세포 클론인 1A.B.25와의 반응에서 보여지는 것처럼 HSV-2 표현형(phenotype)을 가지고 있다. UL49(도 2)와 UL50 유전자 생성물(M.V. Williams, 1987,Virology, 156:282-292; F. Wohlrab, 1982,J. Virol., 43:935-942) 또한 HSV-2 표현형을 가진다. 따라서, IRV DX32에 존재하는 HSV-2 DNA는 UL48, UL49, UL50 및 가장 적당하게는(likely) 사이에있는(intervening) UL49.5를 포함한다. TCC 4.2E1과 2.3은 RS1G31과 DX32과는 반응하지만 RP2와는 반응하지 않기 때문에(도 1의B), UL49, UL49.5 또는 UL50을 인식하는 것이 가장 타당하다(likely).
T-세포 항원을 결정하기 위한 발현 클로닝
UL49, UL49.5 및 대부분의 UL50 코딩 서열을 포함하는(A. Cress and S.J. Triezenberg, 1991,Gene, 103:235-238; G.D. Elliott and D.M. Meredith, 1992,J. Gen. Virol., 73:723-736; N.J. Maitland et al., 1982,Infect. Immun., 38:834-842) HSV-2의BamHIw 단편을 발현 클로닝을 위하여 선택하였다. 무작위로 선택한 콜로니의 70 내지 90%가 삽입체(insert)를 포함하였으며 모두 바이러스 기원이었다. 각 TCC에 대해서 가장 활성적인(active) 라이브러리(TCC 4.2E1에 대해서는 pUEX1, TCC 2.3에 대해서는 pUEX 3)를 선택하였고(표 1), 개개의 활성 세균 클론은 풀(pool)과 개개 콜로니를 순차적으로 테스트(sequential testing)해서 검출하였다(표 2). 클론 1.1.3은 TCC 4.2E1에 의해 분열작용을 나타내는 융합 단백질을 코딩한다. 상기 클론은 UL49의SmaI 단편의 후방(backward) 80 bp, 아미노산 서열 105 내지 190을 코딩할 것으로 추측되는 HSV-2 UL49 DNA의SmaI 단편 262 bp, β-갈락토시다제의 전방(forward) 및 프레임 가운데(in-frame), UL49의SmaI 단편의 전방이지만 262 bpSmaI 단편과 242 bpSmaI 단편의 접합부(junction)의 한 개의 C 잔기(residue)가 삭제되어 프레임 밖에 있는(out of frame) 246 bp를 포함한다. 클론 3.19는 UL50의 아미노산 서열 118-312를 코딩하는SmaI 단편 583 bp와 뒤따르는 UL49의SmaI 단편 후방 80 과 96 bp를 포함한다.
HSV-특이적 TCC의 분열작용을 나타내는 단백질 라이브러리의 동정([3H]싸이미딘 유입의 평균 cpm]. 자가 EBV-LCL(클론 4.2E1과 2.3) 또는 PBMC를 APC로 사용하였고 라이브러리-유래 융합 단백질 항원은 1:300으로 희석하였다. 데이터는 [3H]싸이미딘 유입의 평균 cpm을 나타낸다.
라이브러리1 대조 자극2
TCC pUEX1-BamHI"w"-SmaI pUEX2-BamHI"w"-SmaI pUEX2-BamHI"w"-SmaI 배지 HSV-2
4.2E1 10,105 4,150 1,903 286 21,591
2.3 418 785 2,279 102 11,014
pUEX1-HG52-SmaI-AluI pUEX2-HG52-SmaI-AluI pUEX3-HG52-SmaI-AluI
ESL4.9 -52 16,235 146 66,013
ESL2.20 1 5,427 123 13,359
1 : 라이브러리 이름은 발현 벡터, HSV-2 제한 단편이나 전체길이 바이러스 DNA 종의 이름 및 바이러스 DNA를 절단하기 위해 사용된 제한 효소를 나타낸다.
2 : 105자가 방사선 조사된(3300 rad) PBMC이거나 허위-감염된 세포 파쇄물 또는 UV 처리된 HSV-2 항원.
T-세포 항원의 동정은 표적화된 써브클로닝(targeted subcloning)과 겹치는 펩타이드(overlapping peptide)로써 확인하였다. 아미노산 105-190을 코딩하는 HSV-2의 UL49의SmaI 단편 262 bp를 pUEX3로 써브클로닝하여 플라스미드 49.262.12를 제조하였다. 상기 단백질은 TCC 4.2E1을 자극하였다(표 2). HSV-2의 VP22의서열번호 3으로 기재되는 105-126 펩타이드만이 자극적(stimulatory)이었다(도 3). UL50 118-312 및 118-250을 코딩하는 DNA 단편들은 pUEX3으로 써브클로닝하였다. 상기 단편들을 발현하는 융합 단백질들은 활성적(active)이었다(표 2).
HSV-2에 활성적인 TCC의 항원 특이성. 세균-유래 재조합 융합 단백질의 항원은 1:900으로 희석하여 사용하였다. 자가 EBV-LCL(클론 4.2E1) 또는 PBMC를 APC로 사용하였다. 데이터는 배지와 비교한 [3H]싸이미딘 유입의 델타 cpm을 나타내었으며, 각각의 경우에 배지는 500 cpm보다 낮았다.
재조합 항원 대조군 항원
TCC 클론 이름 바이러스 서열1 cpm pUEX2 β-gal HSV-1 HSV-2
4.2E1 1.1.3 VP22 105-190 4,875 93 nd nd
49.262.122 VP22 105-190 6,898
2.3 3.19 UL50 118-312 43,971 231 543 53,032
50.583.443 UL50 118-312 34,453
50.3973 UL50 118-250 66,501
ESL4.9 C11 VP22 177-220 59,400 166 112,803 64,685
ESL2.20 C9D10 UL21 148-181 23,543 173 0 37,989
1 : β-갈락토시다제의 전방 및 프레임 가운데(in-frame) 서열 데이터로부터 유추한 아미노산 서열.
2 : pUEX3의 전방 및 프레임 가운데 UL49 DNA의 262 bpSmaI 단편만을 포함하는 1.1.3의 확증하는(confirmatory) 써브클론.
3 : pUEX3의 전방 및 프레임 가운데 UL50 DNA의 583 bpSmaI 단편 또는 397 bpSmaI-StuI 단편을 포함하는 3.19의 확증하는 써브클론.
전체길이의 HSV-2 DNA 라이브러리로부터 무작위로 선택한 콜로니를 확인한 결과 80 내지 100%가 삽입체를 가진 플라스미드를 포함하였으며 삽입체의 80 내지 100%가 바이러스 기원이었다. TCC ESL4.9와 ESL2.20의 경우에는 pUEX3 단백질 라이브러리만이 임파구분열을 보였다(표 1). 상기 라이브러리들은BamHIw 단편으로부터 만들어진 라이브러리보다 더 복잡했기 때문에 2,000 내지 3,000개의 세균 형질전환체(transformant)가 결합방법(combinatorial method)에 의해 검색되었다. 예비 실험에서, 열을 사용하여 죽인(heat-killed) 세척한 세균은 풀(5 내지 12 세균 클론)과 최종 분석 단계의 임파구분열 분석에서 단백질의 봉입체(inclusion body)를 대체하였다.
양성 세균에 있는 플라스미드의 서열분석 결과 TCC ESL4.9는 UL49 유전자 생성물인 VP22(아미노산 177-220)의 44 아미노산 분획을 인식한 반면 TCC ESL2.20은 UL21(아미노산 148-181)의 34 아미노산 분획을 인식하였다(표 2). 두가지 경우 모두에서 HSV-2 DNA의 하나의 AluI 분획만이 프레임 가운데와 전방에 삽입되었다. 펩타이드 맵핑(mapping) 결과 아미노산 187-206(도 3c)이 TCC ESL4.9를 자극하였음을 확인하였다.
전체(bulk) 병변침투 T-세포의 탐침으로서의 융합 단백질
새롭게 발명한 T-세포 항원들을 전체 병변침투 T-세포의 탐침으로 사용하는 HSV 항원 패널(panel)에 추가하였다. 사용가능한 첫 번째 검체(specimen)는 환자 1에서 HSV-2가 재발한지 5일째에 엉덩이(buttock)로부터 획득한 각각 2 ㎜인 네 개 생검(biopsy) 세트를 사용하였다(D.M. Koelle et al., 1998,J. Clin. Invest.,101:1500-09; D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810). 모든 네 개 생검들은 VP22 105-190과는 반응을 보였지만 β-갈락토시다제, 당단백질 B와 D, 또는 VP16과는 반응을 보이지 않았다. TCC는 VP22 105-190 융합 단백질을 사용하여 한 싸이클동안 최초 전체 배양(original bulk culture)을 재자극한 후에 유도되었다. VP22(105-190)과 구성 펩타이드(constituent peptide)들에 TCC 1.L3D5.10.8(도 3b)가 분열반응을 보이는 것으로부터 아미노산 125-146에 포함된 VP22에 세 번째 T-세포 에피토프가 있음을 알수 있다.
외피 단백질 VP16에 있는 다른(additional) T-세포 에피토프의 확인(definition)
모두 HSV-2 형에 특이적인, VP16에 있는 세 개의 에피토프(표 3)는 이전 기술에서 확인되었으며(K.R. Jerome et al., 1998,J. virol., 72:436-441) 7명중 4환자(57%)로부터 생식기 HSV-2 병변침투 임파구 전체 배양에 있는 전체길이의 VP16에 분열반응을 보이는 것도 알려졌다(D.M. Koelle et al., 1998,J. Clin. Invest., 101:1500-09). VP16에 있는 다른 펩타이드 에피토프는 두가지 방법으로 확인하였다. 첫 번째 방법은 HSV-2의 재조합 VP16과 반응하는 병변 소낭 유체(lesion vesicle fluid)로부터 회복된 클론의 패널을 검색하고 펩타이드를 사용하여 에피토프 맵핑을 실시하였다. 아미노산 185-197 및 겹치는 쌍(overlapping pair)인 209-221와 213-225를 포함하는 펩타이드는 각각 TCC RH.13과 KM.7에 대해 자극적(stimulatory)이었다(표 3). 다른 모든 VP16 펩타이드들은 음성이었다(<500cpm). 두 번째 방법은 PBMC를 출발물질로 사용하고 2차 시험관내 자극은 배큘로바이러스 유래 재조합 VP16을 사용하였다. 두명으로부터 얻은 클론들(BM.17 및 SB.17)은 β-gal-VP16 융합 단백질과 전체(whole) 바이러스 뿐만 아니라 동일한 펩타이드(아미노산 437-449)를 인식하였다. 새롭게 발명한 세 개의 모든 VP16 에피토프들은 보통유형(type-common)이었으며, 서열 데이터로부터 예측된 것처럼 HSV-1과 HSV-2 전체 바이러스와 공유(share)되었다(A. Cress and S.J. Triezenberg, 1991,Gene, 103:235-238).
병변 및 PBMC 유래 CD4 TCC에 의해 인식되는 HSV-2의 VP16에 있는 에피토프. 데이터는 배지와 비교한 [3H]싸이미딘 유입의 델타(delta) cpm을 나타내었으며, 각각의 경우에 배지는 500 cpm보다 낮았다.
TCC 전체 바이러스 항원 재조합 HSV-2 단백질1 HSV-2 VP16 펩타이드
이름 기원 HSV-1 HSV-2 VP16 1-492 β-gal-VP16 180-492 아미노산 델타 cpm
새로운 에피토프
RH.13 병변 3,340 3,407 32,991 nd 185-197 55,614
KM.7 병변 6,093 5,847 5,627 nd 209-221 10,075
BM.17 PBMC 30,784 13,777 nd 45,958 437-449 79,723
SB.17 PBMC 2,207 4,187 nd 12,178 437-449 36,442
이전 에피토프
ESL4.34 병변 256 8,780 17,302 nd 389-401 12,968
393-405 95,942
ESL3.334 병변 253 14,232 22,754 16,434 430-444 27,283
1A.B.25 병변 414 33,493 24,919 41,123 431-440 38,664
1 : 배큘로바이러스 유래 VP16 1-492는 1 ㎍/㎖로 사용하였고 β-gal-VP16 180-492는 1:1,000으로 희석하여 사용하였다.
2 : 펩타이드는 1 μM 농도로 사용하였다.
na : 가용하지 않음(not available)
nd : 행하지 않음(not done)
HLA 제한(restriction)
0.7 지도 단위 근처에서 코딩되는 TCC를 인식하는 항원의 HLA 제한을 상세히 결정하였다. VP22 105-126에 특이적인 TCC 4.2E1의 분열은 항-DP mAb에 의해서 84% 억제되었지만 항-DR 또는 항-DQ mAb에 의해서는 20% 이하로 억제된다. TCC 4.2E1은 DPB1*2001과 DPB1*0402의 이형 공여체(heterozygous donor)로부터 유래된다. 동종의(allogeneic), DPB1*0402가 아닌 DPB1*2001을 생산하는 EBV-LCL은 항원을 제공하여 DPB1*2001에 의해 제한되었다(표 4). UL50에 특이적인 TCC2.3의 분열은 항-DR mAb에 의해서는 억제되었지만 항-DP 또는 항-DQ mAb에 의해서는 억제되지 않았다. 상기 클론은 DRB1*0301과 BRB1*0701의 이형 공여체로부터 유래된다. DRB1*0301 공여체로부터 유래되는 동종의 PBMC는 항원을 제공하였고 항원성 펩타이드는 상기 알릴(allele)에 결합하였다. 그러나, 연관된 DR 유전자 생성물인 DRw52 또는 DRw53에 의해 제공되는 가능성도 배제될 수 없다. 추가적인 HLA 제한 실험 결과를표 5에 요약하였다.
병변유래 CD4 TCC 4.2E1 및 2.3에서의 제한 HLA 알릴의 결정. 항원은 β-gal 융합 단백질(표 2)을 1:900으로 희석하여 사용하였다. 데이터는 배지와 비교한 [3H]싸이미딘 유입의 델타(delta) cpm을 나타내었으며, 각각의 경우에 배지는 500 cpm보다 낮았다.
T-세포 클론 항원 APC HLA 유형1 델타 cpm2
4.2E1 1.1.3 자가 EBV-LCL DPB1*0402, 2001 30,719
AMAI EBV-LCL DPB1*0402 2,732
ARENT EBV-LCL DPB1*2001 26,218
2.3 50.583.44 자가 PBMC DRB1*0301, 0701 8,964
동종 PBMC A DRB1*0701, 1001 45
동종 PBMC B DRB1*0301, 1301 19,223
1 : mAb에 의한 억제로부터 결정한 HLA 클래스 II 부위에서의 HLA 유형.
2 : 각각의 경우에 [3H]싸이미딘 유입이 500 cpm을 넘지않는 동일한 APC를 사용하여 1:1,000으로 희석한 pUEX 대조 단백질과의 비교값.
병변유래이고 외피 특이적인 CD4 TCC의 세포용해 활성과 특이성 및 HLA 제한의 요약. 결과들은 ESL4.34(10:1)의 경우를 제외하고는 효과기(effector)와 표적의 비율이 20:1일 때의 특이방출 백분율(percent specific release)이다. auto=표적 세포로 자가 EBV-LCL; allo=대응하는 HLA 좌(locus)(알려져 있는 경우)에 일치하지 않거나 HLA DR 및 DQ에 일치하지 않는 동종 EBV-LCL.
세포용해 분석 표적
TCC 특이성1 HLA 제한2 자가 HSV-2 자가 펩타이드 자가 허위(mock) 동종 HSV-2 동종 펩타이드 동종 허위
새로운 에피토프
4.2E1 VP22 105-126 DPB1*2001 20.7 44.2 -4.1 -2.9 -1.7 4.6
ESL4.9 VP22 187-206 DR3 -0.6 20.2 1.3 0 0 0
ESL2.20 UL21 148-181 DR3 2.7 na 0.9 0 na 0
1.L3D5.10.8 VP22 125-146 DR4 1.1 61.1 -0.3 -0.4 -0.6 -0.4
1.L3D5.10.12 VP22 125-146 DR4 2.5 57.6 1.6 -0.1 -2.5 -1.4
RH.13 VP16 185-197 DR4 62.5 55.2 -0.9 9.6 0.3 1.8
KM.7 VP16 209-221 DR4 38.7 43.6 2.7 -2.2 4.3 -1.1
BM.17 VP16 437-449 DQB1*0501 10.1 28.5 -0.3 nd nd nd
SB.17 VP16 437-449 DQB1*0501 48.7 60.6 5.4 nd nd nd
2.3 UL50 118-250 DRB1*0301 0.8 na 0 1.1 na 0
이전 에피토프
ESL4.34 VP16 393-405 DRB1*0402 2.1 10.4 1.0 0.5 0.6 0.3
ESL3.334 VP16 430-444 DQB1*0302 12.3 33.6 0.7 1.4 0.3 2.2
1A.B.25 VP16 431-440 DQB1*0201 24.3 42.2 1.9 1.7 2.1 -0.4
na=에피토프 맵핑이 이루어지지 않았고 합성 항원성 펩타이드가 만들어지지 않았기 때문에 가용하지 않음(not available).
nd=행하지 않음(not done).
1 : 선별된 TCC에 대한 CTL 분석에서 표적을 로드(load)하기 위하여 사용된(1 μM) 펩타이드를 가리킨다.
2 : HLA 제한좌(restricting locus) 및/또는 대립형질(allele)의 최대 범위(maximum extent of definition). RH와 KM의 경우에는 혈청학적으로 분류되었고(typed) 다른 경우에는 DNA 수준에서 분류되었다.
3 : 실험재료(subject)는 HLA DRB1*0402 및 DRB1*1301에 대해서 이형(heterozygous)이고 제한 대립형질은 결정되지 않았다.
4 : 실험재료는 HLA DRB1*0301 및 DRB1*1102에 대해서 이형이고 제한 대립형질은 결정되지 않았다.
TCC BM.17의 HLA 제한은 상세하게 연구되어 졌다. TCC BM.17 및 그와 유사한 클론인 SB.17의 분열은 항-DQ mAb에 의해서 90% 저해되었으나 항-DR 또는 항-DP mAb에 의해서는 25% 이하만이 저해되었다. 공여체 BM과 SB는 HLA DQB1*0201/0501에 대해서 이형이었다. 높은 펩타이드 농도에서는 DQB1*0201- 및 DQB1*0501 동형 EBV-LCL 모두 TCC BM.17에 항원을 제공하는 것처럼 보였다. 그러나, DQB1*0501 동형 세포는 DQB1*0201 동형 세포보다 훨씬 더 효과적으로 펩타이드를 제공한다(도 4). 따라서, VP16 431-449에 있는 세 개의, 서로 다르지만 겹치는 에피토프들은 HLA DQB1*0302, DQB1*0201 및 DQB1*0501에 의해 제공된다.
외피 특이적 CD4 T-세포 클론의 CTL 활성
새로운 및 기존에 알려진 특이성을 갖는 CD4 TCC의 세포독성(cytotoxic) 활성은 EBV-LCL 표적 세포를 사용하여 조사하였다(표 5). 조사한 모든 클론은 펩타이드가 가해진(peptide-loaded) 표적 세포에 대해서 세포독성 활성을 나타내었다. HSV-2가 감염된 표적 세포에 대한 세포용혈 활성은 매우 다양하였다. VP22 특이적 TCC 4.2E1은 활성적(active)인 반면에 다른 공여체로부터 유래된 VP22 특이적 TCC는 활성적이지 않았다. 조사된 7개의 VP16 특이적 T-세포 클론들 중에서 6개는 HSV-2가 감염된 표적 세포에 대해서 10% 이상의 세포독성을 나타내었다. 한 개의 UL21- 및 UL50- 특이적 TCC는 바이러스가 감염된 표적 세포에 대해서 활성을 나타내지 않았다.
토의
HSV 특이적 T-세포는 재발하는 생식기 HSV-2 병변을 선택적으로 침투한다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Infect. Dis., 169:956-961). CD4 및 CD8에 의해 매개되는 요소들에 의한 국소 CTL 활성은 바이러스의 제거(clearance)와 연관되어 있다(D.M. Koelle et al., 1998,J. Clin. Invest., 101:1500-09). 국소 HSV 특이적 T-세포에 의해 인식되는 항원은 매우 다양하며 많은 경우에는 알려져 있지 않다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68:2803-2810). 본 실시예는 외피 단백질 VP22, UL21 및 바이러스 dUTPase의 인식을 보여주며 외피 단백질 VP16에대한 새로운 정보를 제공한다.
본 발명의 발현 클로닝 시스템은 HSV에 대해서 잘 작용한다. HSV 게놈에서는 인트론(intron)이 드물기 때문에 게놈에 있는 이중 사슬 DNA는 직접적으로 사용될 수 있다. 병변유래 TCC 후보자(candidate)를 검색하고 단백질 라이브러리를 만들기 위하여 동일한 HSV-2 종인 HG52(A. Dolan et al., 1998,J. Virol., 72:2010-2021)를 사용하였다. 공여체와 HG52에서 HSV-2 종 사이의 상대적으로 낮은 정도의 다양성(variability, M.J. Novotny et al., 1996,Virology, 221:1-13) 때문에 생체내에서(in vivo) 인식되는 에피토프(들)이 생략되는 경우는 드물다; 자가 격리(autologous isolate)를 사용하는 것이 종간 다양성이 더 큰 바이러스에 적용하는데 유익할 것이다.
특별히, 두 공여체로부터 얻은 병변 침투 TCC를 사용한 두 번의 독립적인 발현 클로닝 실험에서 VP22의 반응성이 관찰되었다. 또한, VP22의 반응성은 전체 병변 침투 임파구 배양의 첫 번째 사용가능한 세트를 검색하는 동안에도 관찰되었다. 세명의 환자로부터 얻은 열 개의 추가적인 클론들은 UL49, UL21 및 UL50의 밝혀진 단편에 대해서 음성이었다.
외피 항원은 풍부하게 존재하기 때문에 병변 침투 CD4 T-세포의적당한 표적일 수 있다. VP16과 VP22는 많은 양이 존재한다; 1.6×103분자의 VP16(Y. Zhang and J.L.C. McKinght, 1993,J. Virol., 67:1482-1492)과 2.5 내지 2.8. ×103분자의 VP22(J. Leslie et al., 1996,Virology, 220:60-68)가 HSV-1의 각 바이러스에 존재한다. UL21에 대해서는 알려진 정보가 별로 없다(J.D. Baines et al., 1994,J. Virol., 68:2929-2936; J.A. Blaho et al., 1994,J. Biol. Chem., 269:17401-17410). 바이러스 dUTPase는 HSV 특이적인 CD4 T-세포 반응의 표적으로 알려진 최초의 바이러스 외적인(non-virion) 요소이다. 상기 효소는 VP16 및 VP22와 마찬가지로 HSV-2(HSV-1은 아니지만)가 감염된 세포의 핵에 존재한다(F. Wohlrab et al., 1982,J. Virol., 43:935-942). 생체내에서의 항원 제공(antigen presentation)은 감염된 세포에서의 dUTPase의 내인성(endogenous) 합성 이후에 일어나거나 감염된 세포 파편(debris)으로부터 dUTPase 항원을 이용할(scavenging) 때 일어날 수 있다. dUTPase 특이적 TCC 4.2E1에 의해 HSV가 감염된 세포가 용혈되는 것은 적어도 시험관내에서는 내인성 항원의 제공이 일어날 수 있다는 것을 의미한다.
VP22와 C-말단이 융합되어 발현된 폴리펩타이드가 세포내로 동시에 전달될(co-transported) 수 있기 때문에, VP22와 융합된 단백질의 발현은 보강제(adjuvant)의 형태로서 중요성을 가진다. 이것은 VP22에 있는 이형 에피토프의 발현에 의해 확인될 수 있다. HSV-1의 VP16과 VP22는 동시면역침전(coimmunoprecipitation)에 의해 보여지는 것처럼 감염된 세포와 강력하게 비공유적으로 결합한다. 상기 단백질들은 세포의 핵주위(perinuclear area)에 함께위치(co-localize)한다(G. Elliott et al., 1995,J. Virol., 69:7932-7941; G.D. Elliott et al., 1992,J. Gen. Virol., 73:723-736). 이러한 결합은 VP16에 대한 명확한 높은 수준의 CD4 T-세포 반응을 자극하는데 중요한 역할을 할 수 있다.
결론적으로, 발현 클로닝으로 새로운 HSV T-세포 항원을 발명하였다. 병변에서 항원 특이적 CD4 T-세포를 본래위치 증식(in situ enrichment)하면 항원의 시험관내 2차 자극에 의한 정확한(unbiased) 항원 목록(repertoire) 연구를 할 수 있다. HSV 게놈의 특성 때문에 전체 바이러스 DNA 라이브러리의 직접적인 사용이 가능하다. 외피 단백질은 막에 존재하는 당단백질(glycoprotein)과 함께 인간에게 HSV 백신으로 사용할 수 있는 후보자이다.
<실시예 2> 다른 HSV-2 바이러스 에피토프의 동정
상기 실시예 1의 발현 클로닝 방법을 HSV-2의 다른 T-세포 항원을 동정하는데 사용하였고 그 결과 두 개의 다른 항원을 발명하였다. 하나는 UL19의 아미노산 1078-1319에서 발견된다. 또한, UL19는 주된 캡시드(capsid) 항원 또는 VP5로 알려져 있다. 다른 항원은 당단백질 E로 알려져 있는 US8의 아미노산 1-273이다. US8 항원은 자궁경부 샘플 유래의 T-세포를 사용하여 동정되었다.
<실시예 3> 전체길이 UL49와 UL50의 효능(efficacy)
본 실시예는 T-세포의 분열을 자극하는데 전체길이 UL49와 UL50 단백질이 유용함을 보여준다. 데이터는 대장균과 Cos-7 세포에서 발현된 전체길이 UL49와 Cos-7 세포에서 발현된 전체길이 UL50의 항원성(antigenicity)을 보여준다. 이러한 결과들로부터 상기에 기술된 항원들이 실제로 동정되었음을 확인한다.
원핵생물 시스템에서 HSV-2의 전체길이 UL49 단백질을 발현하기 위하여, HSV 타입 2 종인 HG52로부터 얻은 유전자를서열번호 4로 기재되는 5'-말단 프라이머와서열번호 5로 기재되는 3'-말단 프라이머를 사용하여 PCR로 클로닝하였다. PCR 생성물을BglII와EcoRI을 사용하여 절단하여 TA 클로닝 벡터인 pcR2.1-Topo(Invitrogen)의BglII와EcoRI 부위에 클로닝하였다. 다음으로 유전자를 pTrcHisB(Invitrogen) 벡터에 써브클로닝하고 다시 pGEX-2T(Pharmacia)에 써브클로닝하였다. HSV-2 UL49 클론의 서열분석 결과 알려진 서열(Lolan 1998)의 코딩부위에 하나의 돌연변이가 발견되었다: 아미노산 244의 세린이 프롤린으로 치환되었다. 또한, 발현된 단백질의 아미노산 서열을 예측한 결과 첫 번째 아미노산인 메티오닌이 결손된다. UL49는 pGEX2T 벡터 유래의 N-말단 융합 도메인을 포함한다. 상기 플라스미드를 pGEX2T-UL49HSV2로 명명하였다.
원핵생물에서 발현되는 HSV-2의 전체길이 UL49를 제조하기 위하여, pGEX2T-UL49HSV2 또는 대조군 빈(empty) 벡터를 대장균 종인 BL21에 형질전환시켰다. 로그-페이스(log-phase) 성장기의 세균을 LB-암피실린(ampicillin) 배지에서 OD600값이 0.4되도록 조정하였다. 몇몇 튜브에 IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside)를 0.3 mM 첨가하였다. 세균은 회전하면서 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 세균을 원심분리하여 모으고 1 mM EDTA를 포함하는 PBS에 3회 세척한 후 65℃에서 10분간 가열하였다. 상기 세균을 두차례 더 PBS로 세척한 후 약 1×109세균/㎖의 농도로 T-세포 배지에 배부유시켰다. 열로 죽인 세균 부유물을 시험 항원으로 사용하였다.
진핵생물 시스템에서 HSV-2의 전체길이 UL49 단백질을 발현하기 위하여, 교정(proof-reading) 기능이 있는 고-정밀(high-fidelity)의 DNA 중합효소를 사용한 PCR로 유전자를 개별적으로 재증폭하였다. 동일한 프라이머와 주형을 사용하였다. 유전자는 pEGFP-C1(Clontech)의BglII와EcoRI 부위에 직접 클로닝하였다. 전체 UL49 유전자의 서열을 분석한 결과 알려진 서열과 일치하였다. 발현된 단백질의 아미노산 서열을 예측한 결과 첫 번째 아미노산인 메티오닌이 결손된 것을 제외하고는 예측된 바이러스 UL49 서열과 동일하였다. 또한, pEGFP-C1 벡터 유래의 N-말단융합 도메인이 발현되는 것으로 예측되었다. 상기 플라스미드를 pEGFP-C1-UL49HSV2라 명명하였다.
진핵세포에서 발현되는 HSV-2의 전체길이 UL49를 제조하기 위하여, pEGFP-C1-UL49HSV2 플라스미드 DNA 또는 pEGFP-C1 벡터 대조군 DNA를 리포펙션(lipofection) 방법으로 Cos-7 세포에 형질전환시켰다. 48시간 후에 세포를 긁어서 초음파분쇄하고 상등액과 펠렛(pellet) 상을 분리하였다. 9.4 ㎝2디쉬로부터 모은 세포를 상등액 300 ㎕를 준비하기 위하여 사용하였다. 9.4 ㎝2디쉬로부터 모은 펠렛을 300 ㎕ 배지에 재부유시켰다. 준비된 상등액과 펠렛을 항원으로 사용하였다.
진핵세포 시스템에서 HSV-2의 전체길이 UL50 단백질을 발현하기 위하여, HSV 타입 2 종인 HG52로부터 얻은 유전자를서열번호 6으로 기재되는 5'-말단 프라이머와서열번호 7로 기재되는 3'-말단 프라이머를 사용하여 교정(proof-reading) 기능이 있는 고-정밀(high-fidelity)의 DNA 중합효소를 사용한 PCR로 클로닝하였다. 표적 DNA를 pUC9에 클론된BglIIi 단편의 클론으로 사용하였다. PCR 생성물을KpnI과PstI을 사용하여 절단하였고, 동시에 절단된 pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen) 벡터로 클로닝하였다. 벡터와 삽입체 사이의 접합부위의 염기서열을 확인하였고, 상기 플라스미드를 pcDNA3.1-myc-his-B-UL50HSV2라 명명하였다.발현된 단백질의 아미노산 서열을 예측한 결과 예측된 바이러스 UL50 서열과 동일하였다. 또한, pcDNA3.1-myc-his-B 벡터 유래의 N-말단 융합 도메인이 발현되는 것으로 예측되었다. 시험 항원(test antigen)으로 사용할 진핵세포에서 발현되는 HSV-2의 전체길이 UL50을 제조하기 위하여, 상기 UL49의 경우에서 기술한 것과 정확하게 동일한 Cos-7 시스템을 사용하였다. UL50에 대한 대조 항원은 Cos-7 세포를 pcDNA3.1-myc-his-B로 형질전환시켜 제조하였다. 웰당 1×105의 자가 방사선 조사된 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)와 1×104의 병변유래 CD4 T-세포 클론 ESL4.9(UL49의 경우) 또는 2.3(UL50의 경우)을 포함하는 200 ㎕의 T-세포 배지가 있는 분석 웰(96-웰, U-바텀(bottom))에 시험 항원들을 첨가하였다(Koelle et al., 1994 and 1998 및 원본 특허 출원). 분석은 2중(duplicate) 또는 3중(triplicate)으로 실시하였다. 3일 경과후에, 상기 실시예 1에서 기술한 방법으로 [3H]싸이미딘 유입을 측정하였다. 실험 결과는 자극 수치(테스트 항원의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm/배지 대조군의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm)와 델타 cpm(테스트 항원의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm - 배지 대조군의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm)으로 표현한다. 양성 및 음성 대조군 항원들은 실시예 1에서 기술한대로 작용하였다.
원핵세포인 대장균 BL21에서 발현된 HSV-2의 전체길이 UL49의 항원성
항원 최종 희석 비율 델타 cpm 자극 수치
UV HSV-2 1:100 26,823 386
열로 죽인 pGEX2 1:4 -11 0.84
열로 죽인 pGEX2 1:40 -25 0.64
열로 죽인 pGEX2 1:400 -8 0.89
열로 죽인 pGEX2-UL49HSV2 1:4 9,413 135
열로 죽인 pGEX2-UL49HSV2 1:40 10,526 152
열로 죽인 pGEX2-UL49HSV2 1:400 5,021 73
진핵세포인 Cos-7에서 발현된 HSV-2의 전체길이 UL49의 항원성
항원 최종 희석 농도 델타 cpm 자극 수치
UV-허위 바이러스 1:100 -4 0.96
UV HSV-2 1:100 46,510 470
대조군이 형질전환된 세포의 상등액 1:4 8 1.08
대조군이 형질전환된 세포의 펠렛 1:4 131 2.32
UL49가 형질전환된 세포의 상등액 1:4 1,512 16.3
UL49가 형질전환된 세포의 펠렛 1:4 84,951 859
UL49가 형질전환된 세포의 펠렛 1:40 35,753 362
UL49가 형질전환된 세포의 펠렛 1:400 29,854 302
진핵세포인 Cos-7에서 발현된 HSV-2의 전체길이 UL50의 항원성
항원 최종 희석 농도 델타 cpm 자극 수치
UV-허위 바이러스 1:100 -43 0.89
UV HSV-2 1:100 52,990 135
대조군이 형질전환된 세포의 상등액 1:5 302 1.86
대조군이 형질전환된 세포의 펠렛 1:5 34 1.09
UL50이 형질전환된 세포의 상등액 1:5 26,910 77.7
UL50이 형질전환된 세포의 상등액 1:20 33,063 95.2
UL50이 형질전환된 세포의 상등액 1:100 20,438 59.2
UL50이 형질전환된 세포의 상등액 1:500 2,346 7.7
UL50이 형질전환된 세포의 펠렛 1:5 42,820 123.0
UL50이 형질전환된 세포의 펠렛 1:20 18,487 53.7
UL50이 형질전환된 세포의 펠렛 1:100 8,947 26.5
UL50이 형질전환된 세포의 펠렛 1:500 864 3.5
<실시예 4> 전체길이 U L 21의 효능
진핵세포 시스템에서 HSV-2의 전체길이 UL21 단백질을 발현하기 위하여, HSV 타입 2 종인 HG52로부터 얻은 유전자를서열번호 8로 기재되는 5'-말단 프라이머와서열번호 9로 기재되는 3'-말단 프라이머를 사용하여 교정(proof-reading) 기능이 있는 고-정밀(high-fidelity)의 DNA 중합효소를 사용한 PCR로 클로닝하였다. PCR 생성물을BamHI과XhoI을 사용하여 절단하였고, 동시에 절단된 pGEX-5T 벡터로 클로닝하였다.BamHI과XhoI을 사용하여 벡터를 절단하였고, 동시에 절단된 pcDNA3.1-myc-his-C(Invitrogen) 벡터로 클로닝하였다. 벡터와 삽입체 사이의 접합부위의 염기서열을 확인하였고, 상기 플라스미드를 pcDNA3.1-myc-his-C-UL21HSV2라 명명하였다. 발현된 단백질의 아미노산 서열을 예측한 결과 예측된 바이러스 UL21 서열과 동일하였다. 또한, pcDNA3.1-myc-his-B 벡터 유래의 N-말단 융합 도메인이 발현되는 것으로 예측되었다. 시험 항원(test antigen)으로 사용할 진핵세포에서 발현되는 HSV-2의 전체길이 UL21을 제조하기 위하여, 상기 UL49의 경우에서 기술한 것과 정확하게 동일한 Cos-7 시스템을 사용하였다. UL21에 대한 대조 항원은 Cos-7 세포를 pcDNA3.1-myc-his-B로 형질전환시켜 제조하였다. 웰당 1×105의 자가 방사선 조사된 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)와 1×104의 병변유래 CD4 T-세포 클론 ESL2.20을 포함하는 200 ㎕의 T-세포 배지가 있는 분석 웰(96-웰, U-바텀(bottom))에 UL21 시험 항원들을 첨가하였다(Koelle et al., 1994 and 1998 및 상기 실시예 1). 분석은 3중(triplicate)으로 실시하였다. 3일 경과후에, 상기 실시예 1에서 기술한 방법으로 [3H]싸이미딘 유입을 측정하였다. 실험 결과는 자극 수치(테스트 항원의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm/배지 대조군의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm)와 델타 cpm(테스트 항원의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm - 배지 대조군의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm)으로 표현한다. 양성 및 음성 대조군 항원들은 실시예 1에서 기술한대로 작용하였다. 결과를표 9에 나타내었다.
진핵세포인 Cos-7에서 발현된 HSV-2의 전체길이 UL21의 항원성
항원 최종 희석 농도 델타 cpm 자극 수치
UV-허위 바이러스 1:100 43 1.75
UV HSV-2 1:100 5,620 97.9
대조군이 형질전환된 세포의 상등액 1:20 -9 0.83
대조군이 형질전환된 세포의 펠렛 1:20 -9 0.83
UL21이 형질전환된 세포의 상등액 1:20 1,870 33.25
UL21이 형질전환된 세포의 상등액 1:100 3,242 56.9
UL21이 형질전환된 세포의 상등액 1:500 4,472 78.11
UL21이 형질전환된 세포의 상등액 1:2000 2,526 46.79
UL21이 형질전환된 세포의 펠렛 1:20 3,606 63.24
<실시예 5> 개체군(population)에서 항원의 이환율(prevalence)
본 실시예는 개체군에서 본 발명의 항원에 대한 반응의 이환율를 보여줌으로써 상기 항원을 예방 및 치료용으로 사용하는 용도를 제공한다. 이를 위하여, 타입-특이적 혈청반응에 의해 확인된 HSV-2가 감염된 7명의 인간들을 조사하였다. 상기 인간들은 HSV-2의 병변로부터 회복된 인덱스(index) T-세포 클론을 제공한 인간들과는 다른 인간이다.
각각의 경우에, PBMC를 분리하여 2 ㎖의 T-세포 배지에 2×106세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하였고 UV로 방사선 조사한 HSV-2 종 333을 1:500으로 희석한 용액을 첨가하여 5일 동안 시험관내에서 자극시켰다. 이때에, 40 유니트/㎖의 재조합 인간 IL-2를 첨가한 후 5 내지 6일간 방치하여 단기의(short-term) HSV-특이적 세포주인 B1 세포주를 제조하였다.
각각의 HSV-2 단백질에 대한 반응성은 하기의 방법으로 측정하였다. 분열 분석은 96-웰의 둥근 바닥 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 실시하였고, 각각 3중(triplicate)으로 실시하였다. 각 웰에 대해서, 1×105의 자가 방사선 조사된(3300 rad 감마) PBMC를 첨가하여 항원제공 세포(antigen presenting cell)로 사용하였다. 각 웰에 1×104B1 세포를 첨가하였고, 배지, 1:500으로 희석한 UV 처리된 허위 바이러스, 1:500으로 희석한 UV 처리된 HSV-2 종 333, 당단백질 B 또는 D 또는 최종농도 4 ㎍/㎖인 정제된 HSV-2의 VP16 단백질을 첨가하였다. UV 처리된 HSV-2에 대한 반응은 양성이라고 예측되었고, 생존능력(viability) 및 세포에 대한 특이성에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 당단백질 B와 D 및 VP16은 이전 기술에서 HSV 특이적 T-세포의 표적이라고 알려졌다(D.M. Koelle et al., 1994,J. Virol., 68(5):2803-2810).
새롭게 발명한 항원 UL21, UL49 및 UL50에 대해서, 전체길이 유전자의 클로닝과 진핵세포인 Cos-7 시스템에서의 그들의 발현 및 빈(empty) 벡터에 기초한 대조군 항원의 준비(preparation)는 상기에 기술하였다. 새롭게 발명된 항원 gE2(US8)에 대해서, 전체길이 유전자는 HSV 타입 2 종인 HG52 DNA에서 얻은 DNA를서열번호 10으로 기재되는 5'-말단 프라이머와서열번호 11로 기재되는 3'-말단 프라이머를 사용하여 교정(proof-reading) 기능이 있는 고-정밀(high-fidelity)의 내열성(thermostable) DNA 중합효소를 사용하여 클로닝하였다. PCR 생성물은ACC65I과XbaI을 사용하여 절단하였으며, 동시에 절단된 pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen) 벡터로 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 pcDNA3.1-myc-his-B-US8로 명명하였다. 벡터와 삽입체 사이의 접합부위 염기서열을 확인하였다. 발현된 단백질의 아미노산 서열을 예측한 결과 예측된 바이러스 US8 서열과 동일하였다. 또한, pcDNA3.1-myc-his- 벡터 유래의 N-말단 융합 도메인이 발현되는 것으로 예측되었다. 진핵세포에서 발현되는 HSV-2의 전체길이 US8을 제조하기 위하여, 상기에서 기술한 Cos-7 시스템을 사용하였다. 각각의 새로운 네 항원(UL21, UL49, UL50 및 US8) 및 대조군에 대해서, 형질전환된 Cos-7 세로를 초음파분쇄한 후 얻은 상등액과 펠렛을 최종농도 1:20으로 희석하여 3중(triplicate) 분열 분석에 사용하였다. 자극 수치(테스트 항원의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm/상응하는 대조군 항원의 평균 [3H]싸이미딘 유입 cpm)가 4.0과 같거나 그 이상일 때 양성 반응으로 간주하였다. UV HSV-2 항원에 대해서, 상응하는 대조군 항원은 UV-허위 바이러스를 사용하였다. gB2, gD2 및 VP16에 대해서는 대조군으로 배지를 사용하였다. Cos-7 세포에서 발현되는 새로운 항원에 대해서, 대조군 항원은 대조군 빈 벡터로 형질전환된 Cos-7 세포의 펠렛이나 상등액을 사용하였다. 결과를표 10에 나타내었다. 새롭게 발명된 각 항원의 반응성은 적어도 하나의 실험체(study object)를 대상으로 하였다. 그 결과, UL49의 반응성은 더 자주 관찰되었고 알려진 항원인 gB2 및 gD2의 반응성과 유사하였다. 상기 데이터로부터, T-세포의 반응성이 알려진 대상(subject) 이외의 개개 인간들도 HSV 유래의 본 발명의 항원 단백질에 반응할 수 있음을 확인하였다.
임의로 선택한 7명의 HSV-2가 감염된 면역 반응성(immunocompetent) 인간 그룹에 대한 알려진 그리고 새롭게 발명된 HSV-2 항원의 항원성(antigenicity).
항원
HSV-2 gB2 gD2 HSV-2의 VP16 HSV-2의 VP49 HSV-2의 UL50 HSV-2의 UL21 HSV-2의 US8
n 7 5 5 0 5 1 1 2
% 100 71 71 0 71 14 14 28
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 HSV 바이러스 유래 T-세포 항원은 T-세포에 의해 특이적으로 인식되므로 HSV 바이러스 유래 질병의 예방과 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (29)

  1. 분리된 HSV(herpes simplex virus)의 UL19, UL21, UL49 또는 UL50 단백질 또는 그의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 폴리펩타이드로 구성되는 약학적 조성물.
  2. a) UL19의 아미노산 1078-1319;
    b) UL21의 아미노산 148-181;
    c) UL49의 아미노산 105-190 또는 177-220;
    d) UL50의 아미노산 118-312;
    e) 당단백질 E(gE)의 아미노산 1-273;
    f) VP16의 아미노산 185-197, 209-221 또는 430-449; 및
    g) 단계 a) 내지 f)의 치환 가능한 변이체(substitutional variants)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 분리된 HSV(herpes simplex virus)의 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 폴리펩타이드는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 융합단백질은 가용성(soluble)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. a) UL19의 아미노산 1078-1319;
    b) UL21의 아미노산 148-181;
    c) UL49의 아미노산 105-190 또는 177-220;
    d) UL50의 아미노산 118-312;
    e) 당단백질 E(gE)의 아미노산 1-273;
    f) VP16의 아미노산 185-197 또는 209-221; 및
    g) 단계 a) 내지 f)의 치환 가능한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제 5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  7. 제 6항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포(host cell).
  8. 1) 제 7항의 숙주 세포를 배양하는 단계;
    2) 상기 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
    3) 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계로 구성되는 HSV 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  9. 제 8항의 방법에 의해 생산된 HSV 폴리펩타이드.
  10. UL19, UL21, UL49 또는 UL50 단백질 또는 그의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 HSV 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 구성되는 약학적 조성물.
  11. 제 5항의 폴리뉴클레오타이드와 약학적으로 허용 가능한 담체로 구성되는 약학적 조성물.
  12. UL19, UL21, UL49 또는 UL50 단백질 또는 그의 단편을 발현하도록 유전적으로 변형된(genetically modified) 재조합 바이러스.
  13. 제 5항의 폴리펩타이드를 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 바이러스.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 바이러스는 종두종 바이러스(vaccinia virus), 카나리 폭스 바이러스(canary pox virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤르페스 바이러스(herpes virus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  15. 제 14항의 바이러스와 약학적으로 허용 가능한 담체로 구성되는 약학적 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 4항, 제 10항 내지 제 11항 또는 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 보강제(adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. a) UL19의 아미노산 1078-1319;
    b) UL21의 아미노산 148-181;
    c) UL49의 아미노산 105-190 또는 177-220;
    d) UL50의 아미노산 118-312;
    e) 당단백질 E(gE)의 아미노산 1-273;
    f) VP16의 아미노산 185-197 또는 209-221; 및
    g) 단계 a) 내지 f)의 치환 가능한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 존재하거나 UL19, UL21, UL49 또는 UL50 단백질에 존재하는 에피토프를 제공하도록 변형된 항원 제공 세포(antigen-presenting cell)에 면역 세포가 접촉하는(contacting) 것으로 구성되는 HSV에 직접적으로 대항하는 면역 세포를 생산하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항 내지 제 19항의 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 면역 세포.
  21. 제 20항의 면역 세포에 HSV가 감염된 세포를 접촉하는 것으로 구성되는 HSV 감염 세포를 사멸하는 방법.
  22. 제 20항의 면역 세포에 HSV가 감염된 세포를 접촉하는 것으로 구성되는 HSV 복제를 억제하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 4항, 제 10항 내지 제 11항 또는 제 15항 내지 제 16항의 어느 한 항의 조성물 또는 제 20항의 면역 세포를 대상(subject)에게 투여하는(administering) 것으로 구성되는 대상(subject)에서 HSV 감염을 치료하는(treating) 방법.
  24. 제 1항 내지 제 4항, 제 10항 내지 제 11항 또는 제 15항 내지 제 16항의 어느 한 항의 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 것으로 구성되는 대상에서 HSV 감염을 방지하는 방법.
  25. 제 20항의 면역 세포에 HSV가 감염된 세포를 접촉하는 것으로 구성되는 항바이러스 또는 면역중재성 림포카인(antiviral or immunomodulatory lymphokine)의 분비를 증가시키는(enhancing) 방법.
  26. 제 20항의 면역 세포에 HSV가 감염된 세포를 접촉하는 것으로 구성되는 HSV-특이적 항체의 생산을 증가시키는 방법.
  27. a) UL19의 아미노산 1078-1319;
    b) UL21의 아미노산 148-181;
    c) UL49의 아미노산 105-190 또는 177-220;
    d) UL50의 아미노산 118-312;
    e) 당단백질 E(gE)의 아미노산 1-273;
    f) VP16의 아미노산 185-197 또는 209-221; 및
    g) 단계 a) 내지 f)의 치환 가능한 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드에 존재하거나 UL19, UL21, UL49 또는 UL50 단백질에 존재하는 에피토프를 제공하도록 변형된 항원 제공 세포를 대상에게 투여하는 것으로 구성되는 대상에서 HSV 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 항원 제공 세포는 에피토프의 발현을 중재할(mediating) 수 있는 바이러스, 펩타이드 또는 마이크로스피어(microsphere)에 의해 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항 내지 제 28항의 어느 한 항에 있어서, HSV는 HSV-2인 것을 특징으로 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7517952B1 (en) 1997-02-25 2009-04-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US20060024301A1 (en) * 1997-02-25 2006-02-02 Corixa Corporation Prostate-specific polypeptides and fusion polypeptides thereof
US20030185830A1 (en) * 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
EP2272859B1 (en) * 1998-08-07 2014-10-22 University of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
EP1568779A1 (en) 2000-01-21 2005-08-31 BioVex Limited HSV strains for the oncolytic treatment of cancer
US7217770B2 (en) * 2000-05-17 2007-05-15 Samyang Corporation Stable polymeric micelle-type drug composition and method for the preparation thereof
US6821519B2 (en) * 2000-06-29 2004-11-23 Corixa Corporation Compositions and methods for the diagnosis and treatment of herpes simplex virus infection
US7048931B1 (en) * 2000-11-09 2006-05-23 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
CA2454750C (en) 2001-07-31 2012-09-18 David M. Koelle Immunologically significant herpes simplex virus antigens and methods for using same
EP2011510B1 (en) 2002-07-18 2011-01-12 University of Washington Pharmaceutical compositions comprising immunologically active herpes simplex virus (HSV) protein fragments
JP2007505147A (ja) * 2003-09-12 2007-03-08 アンティジェニクス インコーポレーテッド 単純ヘルペスウイルス感染の治療および予防用ワクチン
US7211272B2 (en) * 2003-12-22 2007-05-01 Bausch & Lomb Incorporated Drug delivery device
WO2008011609A2 (en) 2006-07-20 2008-01-24 Vical Incorporated Compositions and methods for vaccinating against hsv-2
JP5639361B2 (ja) * 2006-09-08 2014-12-10 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｈｓｖ−１及びｈｓｖ−２ワクチン並びにその使用方法
US20100055132A1 (en) * 2007-04-04 2010-03-04 Thomas Dag Horn Non-specific delayed-type hypersensitivity response to treat herpes simplex virus infection
US8460674B2 (en) * 2009-02-07 2013-06-11 University Of Washington HSV-1 epitopes and methods for using same
US9044447B2 (en) 2009-04-03 2015-06-02 University Of Washington Antigenic peptide of HSV-2 and methods for using same
MY159500A (en) * 2009-05-22 2017-01-13 Genocea Biosciences Inc Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response
US20130224236A1 (en) * 2010-11-03 2013-08-29 University Of Washington Hsv-1 epitopes and methods for using same
US9782474B2 (en) 2010-11-24 2017-10-10 Genocea Biosciences, Inc. Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response
US20120263754A1 (en) 2011-02-15 2012-10-18 Immune Design Corp. Methods for Enhancing Immunogen Specific Immune Responses by Vectored Vaccines
EA027236B1 (ru) * 2011-04-08 2017-07-31 Иммьюн Дизайн Корп. Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа
US20120288515A1 (en) * 2011-04-27 2012-11-15 Immune Design Corp. Synthetic long peptide (slp)-based vaccines
CA2845872C (en) 2011-08-22 2023-03-28 Nanobio Corporation Herpes simplex virus nanoemulsion vaccine
EP2782597B1 (en) 2011-11-23 2022-04-13 Genocea Biosciences, Inc. Nucleic acid vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response
MX350274B (es) * 2012-05-16 2017-08-31 Immune Design Corp Vacunas para hsv-2.
WO2014164699A1 (en) * 2013-03-11 2014-10-09 The Regents Of The University Of California Herpes virus vaccines and treatments
ES2738582T3 (es) 2014-02-14 2020-01-23 Immune Design Corp Inmunoterapia del cáncer a través de combinación de inmunoestimulación local y sistémica
CA2955015A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
KR20160073707A (ko) 2014-12-17 2016-06-27 삼성중공업 주식회사 액화천연가스 운반선의 운용방법
KR102533463B1 (ko) 2015-02-26 2023-05-16 스퀘어렉스 파마슈티컬 코포레이션 단순 포진 바이러스 감염을 치료하기 위한 비특이적 지연형 과민성 반응
PT3411388T (pt) * 2016-02-01 2021-12-20 Simplexia Ab Glicoproteína g truncada do vírus herpes simplex 2
SG11201808783XA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2017181148A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110088127A (zh) 2016-07-28 2019-08-02 高山免疫科学股份有限公司 Cd155变体免疫调节蛋白及其用途
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018064232A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Genocea Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating herpes
WO2018170023A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
NZ756395A (en) 2017-03-16 2024-01-26 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
ES2963638T3 (es) 2017-03-16 2024-04-01 Alpine Immune Sciences Inc Proteínas inmunomoduladoras de variantes de PD-L1 y usos de las mismas
WO2018176103A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 The University Of Queensland "chimeric molecules and uses thereof"
US20190031739A1 (en) * 2017-07-30 2019-01-31 Raymond Joel Rairie Pinball herpes antibody system
CA3198255A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2019079520A2 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Alpine Immune Sciences, Inc. ICOS VARIANT LIGAND IMMUNOMODULATORY IMMUNOMODULATORY PROTEINS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
CA3087149A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR20210089146A (ko) 2018-09-19 2021-07-15 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 변이체 cd80 단백질 및 관련 구축물의 방법 및 용도
JP2022510276A (ja) 2018-11-30 2022-01-26 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８６バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
CA3136816A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant icos ligand (icosl) fusion proteins
WO2021226551A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Alpine Immune Sciences, Inc. April and baff inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof
IL308336A (en) 2021-05-07 2024-01-01 Alpine Immune Sciences Inc Methods of dosing and treatment with TACI-FC modulatory fusion protein
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
CN115808528B (zh) * 2022-09-21 2023-08-01 武汉滨会生物科技股份有限公司 溶瘤单纯疱疹病毒vp5蛋白与人白细胞抗原e的互作方法及应用
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4429008B1 (en) 1981-12-10 1995-05-16 Univ California Thiol reactive liposomes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
JPS59116229A (ja) 1982-12-24 1984-07-05 Teijin Ltd 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法
US4873088A (en) 1983-09-06 1989-10-10 Liposome Technology, Inc. Liposome drug delivery method and composition
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
EP0297924A3 (en) * 1987-07-01 1990-07-11 City Of Hope Recombinant vaccinia virus expressing hsv 1 gb
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
CA2088600C (en) * 1990-08-02 1999-11-16 Rae L. Burke Herpes simplex virus vp16 vaccines
JPH05236967A (ja) * 1991-05-07 1993-09-17 Medical Res Council ヘルペスウイルス粒子及びワクチン
CA2090295A1 (en) 1992-02-03 1993-08-04 Anthony B. Nesburn Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein e and methods of use
UA40597C2 (uk) 1992-06-25 2001-08-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Вакцинна композиція,спосіб лікування ссавців, що страждають або сприйнятливі до інфекції, спосіб лікування ссавців, що страждають на рак, спосіб одержання вакцинної композиції, композиція ад'ювантів
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
GB9325496D0 (en) * 1993-12-14 1994-02-16 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2560114A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
ES2264136T3 (es) * 1995-02-21 2006-12-16 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Preparaciones virales, vectores, inmunogenos y sus vacunas.
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
BR9610058A (pt) 1995-07-28 1999-07-27 Marie Curie Cancer Care Uso de vp22 ou uma porção ativa fragmento ou homólogo do mesmo proteína de transporte ácido nucleíco vetor de expressão célula hospedeira de mamíferos ou microbiana e processos para transportar uma proteína ou peptídeo desejado para uma população de marcaç o de células e para transportar uma molécula desejada em uma população de células
EP0871747A1 (en) 1996-01-02 1998-10-21 Chiron Viagene, Inc. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
GB9615726D0 (en) * 1996-07-26 1996-09-04 Medical Res Council Anti-viral agent 11
EP0948508A4 (en) * 1996-11-04 2001-11-07 Smithkline Beecham Corp NEW CODING SEQUENCES FOR HERPES SIMPLEX TYPE 2 VIRUS
US6635258B2 (en) * 1997-06-02 2003-10-21 Chiron Corporation Herpes simplex virus VP22 vaccines and methods of use
EP2272859B1 (en) * 1998-08-07 2014-10-22 University of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
GB9825953D0 (en) * 1998-11-26 1999-01-20 Medical Res Council Protein fragments for use in protein targeting
BR0014408A (pt) * 1999-09-30 2002-07-02 Univ Washington Antìgenos do vìrus do herpes simples imunologicamente significativos; e métodos para identificação e utilização dos mesmos
US6821519B2 (en) * 2000-06-29 2004-11-23 Corixa Corporation Compositions and methods for the diagnosis and treatment of herpes simplex virus infection
EP2011510B1 (en) * 2002-07-18 2011-01-12 University of Washington Pharmaceutical compositions comprising immunologically active herpes simplex virus (HSV) protein fragments
WO2008011609A2 (en) * 2006-07-20 2008-01-24 Vical Incorporated Compositions and methods for vaccinating against hsv-2
US8865185B2 (en) * 2006-09-08 2014-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of use for HSV-1 and HSV-2 vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
US6855317B2 (en) 2005-02-15
DK2272859T3 (en) 2015-01-19
US20120027790A1 (en) 2012-02-02
US20100215693A1 (en) 2010-08-26
NO20010576L (no) 2001-04-02
BR9912671A (pt) 2001-05-02
US20030118611A1 (en) 2003-06-26
NO20010576D0 (no) 2001-02-02
EP1102790B1 (en) 2014-05-07
IL141044A0 (en) 2002-02-10
EP1102790A2 (en) 2001-05-30
AU5467899A (en) 2000-02-28
EP2272859A3 (en) 2011-06-08
WO2000008051A3 (en) 2000-08-03
CA2336523A1 (en) 2000-02-17
AR020134A1 (es) 2002-04-10
US8067010B2 (en) 2011-11-29
EP2272859B1 (en) 2014-10-22
US8852602B2 (en) 2014-10-07
WO2000008051A2 (en) 2000-02-17
US20050163794A1 (en) 2005-07-28
CN1348463A (zh) 2002-05-08
PL346213A1 (en) 2002-01-28
US7744903B2 (en) 2010-06-29
NZ509974A (en) 2003-10-31
US6375952B1 (en) 2002-04-23
JP2002522451A (ja) 2002-07-23
CA2336523C (en) 2015-06-30
TR200100373T2 (tr) 2001-09-21
EP2272859A2 (en) 2011-01-12

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CA2780120A1 (en) Immunologically significant herpes simplex virus antigens and methods for using same

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