CZ337997A3

CZ337997A3 - Prostředek s vakcinačním účinkem a jeho použití pro výrobu vakciny

Info

Publication number: CZ337997A3
Application number: CZ973379A
Authority: CZ
Inventors: Nathalie Marie-Josephe Claude Garcon; Martin Friede
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1995-04-25
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 1998-03-18
Also published as: EP0822831B2; ES2140076T5; SK144297A3; WO1996033739A1; DE69637254T2; NZ305365A; EP0955059A3; EP0884056A1; DE69605296T3; IL118004A0; EP0955059B1; SK282017B6; EP0822831A1; EP0955059A2; MA23850A1; DE69637254D1; TR199701252T1; ES2140076T3; BG63491B1; HU227944B1

Description

(57) Anotace:

Prostředek s vakcinačním účinkem obsahuje antigen, Imunologicky aktivní saponinovou frakci a sterol.

CZ 3379-97 A3

A Wf-ft ^{9 r} V · · * · * _{φ f f} * * · * · · r _r.· * · ·· · 9 · ♦ · -.- j4 * · ♦ · · „ _.

- | « ·»·**·· · · · · · * «

Prostředek s vakcinačním účinkem a jeho použití pro výrobu vakciny

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových prostředků s vakcinačním účinkem, způsobu jejich výroby a jejich použití v lékařství. Vynález se zvláště týká vakcin s obsahem antigenu, imunologicky aktivní frakce odvozené z kůry Quillaja Saponaria Molina jako je QS21 a sterolu.

io Dosavadní stav techniky

Imunologicky aktivní saponinové frakce s adjuvantním účinkem, odvozené z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina jsou známy v oboru. V US patentu No. 5,057,540 se popisuje frakce Quillaja Saponaria Molina čištěná HPLC, známá jako QS21 nebo is QA21. Saponin stromu Quillaja se popisuje jako adjuvans také v Scott a další, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409. Použití QS21 jako adjuvans je však spojeno s určitými nevýhodami. Například pokud je QS21 injikován savci jako volná molekula, bylo pozorováno, že se v místě injekce vyskytuje nekróza, tedy místní odumření tkáně.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že nekróza v místě injekce může být odstraněna použitím prostředků obsahujících kombinaci QS21 a sterolu. Výhodné steroly zahrnují β-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, ergokalciferol a cholesterol. Tyto steroly jsou v oboru dobře známy, například cholesterol se popisuje v Merckově indexu,

11. vydání, str. 341, jako přírodně se vyskytující sterol, nalézající se v živočišném tuku.

-2Podstata vynálezu

První hledisko předkládaného vynálezu tedy poskytuje prostředek s vakcinačním účinkem obsahující antigen, imunologicky aktivní saponinovou frakci a sterol. S výhodou prostředky podle vynálezu obsahují imunologicky aktivní saponinovou frakci ve v podstatě čisté formě. Prostředky podle vynálezu obsahují s výhodou QS21 ve v podstatě čisté formě, tedy QS21 s čistotou alespoň 90 %, s výhodou alespoň 95 % a nejvýhodněji alespoň 98 %. Další imunologicky účinné saponinové frakce použitelné v prostředcích podle vynálezu jsou QA17/QS17. Prostředky podle vynálezu obsahující QS21 a cholesterol vyvolávají ve srovnání s prostředky, ve kterých cholesterol přítomen není, sníženou reakci, zatímco adjuvantní účinek je zachován. Navíc je známo, že QS21 se za zásaditých podmínek, kde pH má hodnotu přibližně 7 nebo vyšší, rozkládá. Další výhodou předkládaných prostředků obsahujících cholesterol je, že se zvýší stabilita QS21 vůči zásadité hydrolýze.

Výhodné prostředky podle vynálezu jsou prostředky, které vytvářejí lipozomovou strukturu. Dalším hlediskem vynálezu jsou také prostředky, ve kterých sterol/ímunologicky aktivní saponinová frakce vytváří strukturu ISCOM.

Hmotnostní poměr QS21 : sterol bude typicky řádově 1 : 100 až 1 : 1 . S výhodou je přítomen přebytek sterolu, tedy hmotnostní poměr QS21 : sterol je alespoň 1 : 2. Pro podávání člověku bude přítomen QS21 a sterol ve vakcíně typicky v rozmezí přibližně 1 pg až přibližně 100 pg, s výhodou přibližně 10 pg až přibližně 50 pg na dávku.

Lipozomy s výhodou obsahují neutrální lipid, například fosfatidylcholin, který není s výhodou při pokojové teplotě krystalický, například fosfatidylcholin vaječného žloutku, dioleoylfosfatidylcholin nebo dilaurylfosfatidylcholin. Lipozomy mohou také obsahovat nabitý lipid, který zvyšuje pro lipozomy složené z nasycených lipidů stabilitu struktury lipozom - QS21. V těchto případech je množství nabitého • * lipidu s výhodou 1 až 20 % hmotnostních, nejvýhodněji 5 až 10 % hmotnostních. Poměr sterolu k fosfolipidu je 1 až 50 % molárních, nejvýhodněji 20 až 25 % molárních.

Prostředky podle vynálezu obsahují s výhodou MPL (3deacylovaný monofosforyllipid A, známý také jako 3D-MPL). 3D-MPL je znám z GB 2 220211 (Ribi) jako směs tří typů De-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci a je vyráběn firmou Ribi Immunochem, Montana. Výhodná forma se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce 92/116556.

Vhodné prostředky podle vynálezu jsou takové, kde lipozOmy se na počátku připravují bez přítomnosti MPL a potom se přidá MPL s výhodou jako částice o velikosti 100 nm. MPL se proto nevyskytuje uvnitř memberány nosiče (známo pod názvem MPL out). Prostředky, ve kterých je MPL přítomen uvnitř membrány nosiče (známé jako MPL in) tvoří další hledisko vynálezu. Antigen může být obsažen uvnitř membrány nosiče nebo mimo membrány nosiče. Rozpustné antigeny jsou s výhodou přítomny vně a hydrofobní nebo lipidované antigeny jsou buď přítomny uvnitř nebo vně membrány.

Vakcíny podle vynálezu často nebudou vyžadovat nějaký specifický nosič a budou obsaženy ve vodném nebo jiném farmaceuticky přijatelném pufru. V některých případech může být výhodné, když vakcíny podle předkládaného vynálezu budou dále obsahovat hydroxid hlinitý nebo budou přítomny v emulzi olej ve vodě nebo jiném vhodném nosiči, jako jsou například lipozomy, mikročástice nebo zapouzdřené částice antigenu.

S výhodou budou prostředky s vakcinačním účinkem obsahovat antigen nebo směs antigenu, schopnou vyvolat imunologickou odpověď proti lidskému nebo zvířecímu patogenu. Antigen nebo antigenní směsi používané v prostředcích podle vynálezu mohou být v oboru známé, a zahrnují polysacharidové antigeny, antigeny nebo směsi antigenu odvozené z HIV-1 (jako je gp 120 nebo gp 160), ♦ » r 9 · * «> ♦ · » 99· * » * ·»»·» • 999 t ·>*>»** r 9 9 9 9> » t r - * 9 9 * · 9 9 9 9» · ···

- 4 kterýkoliv z virů imunodeficience koček, lidské nebo zvířecí herpetické viry, jako je gD nebo jeho deriváty nebo časný protein (Immediate Early protein) jako je ICP27 z HSV1 nebo HSV2, cytomegalovirus (zvláště lidský) (jako je gB nebo jeho deriváty), virus pásového oparu 5 (jako je gpl, II nebo III) nebo antigen viru hepatitidy, jako je antigen viru hepatitidy B, například povrchový antigen hepatitidy B nebo jeho derivát, viru hepatitidy A, hepatitidy C a hepatitidy E nebo jiných virových patogenů, jako je viru napadající syncytium dýchacího traktu (například HSRV F a G proteiny nebo jejich imunogenní io fragmenty, popisované v US patentu 5,149,650 nebo chimérické polypeptidy, obsahující imunogenní fragmenty HSRV proteinů F a G, například FG glykoprotein, popisovaný v US patentu 5,194,595), antigeny odvozené z kmenů meningitidy, jako je meningitida A, B a C, Streptococcus pneumoniae, lidský papilomavirus, chřipkový virus, 15 Haemophilus influenzae B (Hib), virus Epstein-Barrové (EBV), nebo antigeny odvozené z bakteriálních patogenů jako je Salmonella, Neisseria, Borrelia (například OspA nebo OspB nebo jejich deriváty), nebo Chlamydia nebo Bordetella, například P.69, PT a FHA, nebo odvozené z parazitů, jako jsou plazmodia nebo toxoplazmy.

Výhodným vakcinovým antigenem je glykoprotein D (gD) HSV nebo jeho deriváty. Nachází se v membráně viru a je rovněž nalézán v cytoplazmě infikovaných buněk (Eisenberg R. J., a další; J. of Virol 1980 35 428 - 435). Obsahuje 393 aminokyselin včetně signálního peptidu a má molekulovou hmotnost přibližně 60 kD. Tento 25 glykoprotein je ze všech glykoproteinů obalu HSV pravděpodobně nejlépe charakterizován (Cohen a další, J. Virology 60 157 - 166). Je známo, že hraje klíčovou úlohu in vivo při přisedávání viru k buněčným membránám. Navíc se ukázalo, že glykoprotein D je schopen vyvolat in vivo vznik neutralizačních protilátek a chránit 30 zvířata při testování letální dávkou HSV. Zkrácená forma molekuly dG obsahuje C-koncovou ukotvovací oblast a může být produkována v savčích buňkách jako rozpustný protein, který je exportován do • »

supernatantu buněčné kultury. Výhodné jsou takové rozpustné formy gD. Produkce zkrácených forem gD se popisuje v EP 0 139 417. S výhodou se gD odvozuje z HSV-2. Provedením vynálezu je zkrácený glykoprotein D HSV-2 o délce 308 aminokyselin, který obsahuje aminokyseliny 1 až 306 v přírodě se vyskytujícího glykoproteinu s přídavkem asparaginu a glutaminu na C-konci zkráceného proteinu postrádající svou ukotvovací oblast na membránu. Tato forma proteinu obsahuje signální peptid, který se odštěpí, aby mohl být maturní rozpustný protein o délce 283 aminokyselin vylučován z hostitelské buňky.

V dalším hledisku vynálezu je výhodným vakcinovým antigenem povrchový antigen hepatitidy B.

Jak se zde používá, povrchový antigen hepatitidy B nebo HBsAg zahrnuje jakýkoliv antigen HBsAg nebo jeho fragment, který má antigenicitu povrchového antigenu HBV. Rozumí se, že navíc k sekvenci 226 aminokyselin antigenu HBsAg (viz Tiollais a další, Nátuře. 317, 489 (1985) a tam uvedené reference) může HBsAg jak je zde popisován v případě potřeby obsahovat celou nebo část pre-S sekvence, jak je popsána ve výše uvedených odkazech a v EP-A-0 278 940. HBsAg může obsahovat zvláště polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin se zbytky 12-52, následovanými zbytky 133145, následovanými zbytky 175-400 proteinu L HBsAg vzhledem k otevřenému čtecímu rámci viru hepatitidy B sérotypu ad (tento polypeptid se označuje jako L*; viz EP 0 414 374). HBsAg v rámci vynálezu může také obsahovat pre-S1-pre-S2-S polypeptid, popisovaný v EP 0 198 474 (Endotronics) nebo jeho uzavřené analogy, jako jsou látky popisované v EP 0 304 578 (Mc Cormick a Jones). HBsAg zde také může označovat mutanty, např. únikové mutanty, popisované ve WO 91/14703 nebo evropské patentové přihlášce No 0 511 855 A1, zvláště HBsAg, kde je nahrazen glycin v poloze 145 za arginin.

·* * ? ? 9 99 9 9 < f 9 9 > · ' 9 999 • r e * #ř ♦♦ • · » - · · 9 * * '9 θ '.·· .:.

Normálně se bude vyskytovat HBsAg ve formě částic. Částice mohou například obsahovat samotný S protein nebo může jít o kompozitní částice, například (L*, S), kde L* je jak definováno výše a S označuje S-protein HBsAg. Uvedená částice je s výhodou 5 ve formě, ve které je exprimována v kvasinkách.

Příprava S-proteinu povrchového antigenu hepatitidy B je dobře popsána. Viz například Harford a další (1983) v Develop. Biol. Standard 54, str. 125, Gregg a další (1987) v Biotechnoloqy, 5, str. 479, EP 0 226 846, EP 0 299 108 a tam uvedené odkazy. Prostředky iq v rámci vynálezu mohou také obsahovat antitumorový antigen a mohou být použitelné pro imunoterapeutické léčení karcinomů.

Příprava vakcín se obecně popisuje v: New Trends and Developments in Vaccines, red. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do lipozomů se is například popisuje v: Fullerton, US patent 4,235,877. Konjugace proteinů do makromolekul se popisuje například v: Likhite, US patent 4,372,945 a v: Armor a další, US patent 4,474,757.

Množství proteinu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď bez výrazných nepříznivých 20 vedlejších účinků typických vakcín. Takové množství se bude lišit v závislosti na tom, kterého specifického imunogenu se použije, a v jaké formě se nachází. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 2 až 100 pg, nejvýhodněji 4 až 40 pg. Optimální množství pro konkrétní vakcínu je 25 možno určit standardními studiemi zahrnujícími pozorování imunologických odpovědí u pacientů. Po počáteční vakcinaci mohou pacienti dostat jednu nebo několik zesilujících imunizačních dávek ve vhodném odstupu.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity jak

3o pro preventivní tak i léčebné účely.

* • ♦ f r 9 » 9 r » · 9 9 »» f « r r · 9 ·· ♦ r « « f r · · ♦ * · ♦· ~ 9 *-» *·· r **»·»· · * i- ··· * *· ·

Podle dalšího hlediska vynález poskytuje použití vakciny podle vynálezu při léčení člověka. Vynález poskytuje způsob léčení zahrnující podávání účinného množství vakciny podle předkládaného vynálezu pacientovi. Zvláště vynález poskytuje způsob léčení virových, bakteriálních a parazitických infekcí nebo nádorového onemocnění, které zahrnuje podávání účinného množství vakciny podle předkládaného vynálezu pacientovi.

Vynález je ilustrován následujícími příklady a údaji.

Příklady provedení vynálezu

1.1 Způsob přípravy lipozomů

Směs lipidu (jako je fosfatidylcholin buď z vaječného žloutku nebo syntetický) a cholesterolu v organickém rozpouštědle se suší pod vakuem (nebo alternativně v proudu inertního plynu). Potom se přidá vodný roztok (např. fyziologický roztok s fosfátovým pufrem) a nádoba se míchá, dokud není všechen lipid v suspenzi. Suspenze se potom mikrofluidizuje, dokud se velikost lipozomů nesníží na 100 nm a potom se sterilně filtruje přes filtr 0,2 pm. Tento krok by mohla nahradit extruze nebo sonikace. Typicky je hmotnostní poměr cholesterol : fosfatidylcholin 1:4a přidá se vodný roztok pro získání konečné koncentrace cholesterolu 5 až 50 mg/ml. Jestliže se přidá k lipidu v organickém roztoku MPL v organickém roztoku, hotové lipozomy obsahují MPL v membráně (označované jako MPL in).

Lipozomy mají definovanou velikost a označují se jako SUV (znamená malé jednovrstevné váčky, smáli unilamellar vesicles). Jestliže se roztok opakovaně zmrazuje a taví, váčky se spojují za vytvoření větších vícevrstevných struktur (MLV, large multilamellar structures) velikosti od 500 nm do 15 pm. Samotné lipozomy jsou při skladování stabilní a nemají schopnost fúzovat.

* * r f * · ··· ** * f r · ····· ♦ r · *··♦ • ♦ P P 9 · * » · ·· ♦ r * · · ·· ···· »* ··· ·· · ·

1.2 Postup výroby

K lipozomům se přidá QS21 ve vodném roztoku. Směs se potom přidá k roztoku antigenu, který může v případě potřeby obsahovat MPL ve formě částic o velikosti 100 nm.

1.3 Lvtická aktivita QS21 je inhibována lipozomy s obsahem cholesterolu

Když se přidá QS21 k erytrocytům, lyžují za uvolnění hemoglobinu. Tato lytická účinnost může být také měřena s použitím lipozomů, které obsahují v membráně cholesterol a uvnitř fluorescenční barvivo, karboxyfluorescein, protože lipozomy se lyžují a uvolňuje se barvivo, které může být sledováno fluorescenční spektroskopií. Jestliže fluorescenční lipozomy neobsahují ve své membráně cholesterol, lyže není pozorována.

Jestliže se QS21 inkubuje s lipozomy s obsahem cholesterolu před přídavkem k erytrocytům, lyže erytrocytů se zmenšuje v závislosti na poměru cholesterolu k QS21. Jestliže se použije poměru 1:1, není detekována žádná lytická aktivita. Jestliže lipozomy neobsahují cholesterol, inhibice lyže vyžaduje tisícinásobný přebytek fosfolipidu proti QS21.

Totéž platí, když se používá pro měření lytické aktivity fluorescenčních lipozomů. V níže uvedeném grafu se pomocí fluorescence měří lytická aktivita 4 pg QS21 uvedeného do styku s lipozomy bez cholesterolu (1 mg lecitinu vaječného žloutku na ml) nebo s obsahem cholesterolu (1 mg lecitinu a 500 pg cholesterolu na ml).

r - 9 I Srovnání inhibice lyže QS21 lipozomy s obsahem nebo bez obsahu cholesterolu

10 20 μΙ lipozomú «— s chol bez chol

Data ukazují, že se QS21 spojuje specifickým způsobem s io cholesterolem v membráně a tím je způsobena lyže (buněk nebo fluorescenčních lipozomú).

Jestliže se QS21 nejprve spojí s cholesterolem v lipozomech, není už dále lytický vůči buňkám nebo jiným lipozomům. To vyžaduje minimální hmotnostní poměr cholesterol : QS21 0,5 : 1.

Cholesterol je ve vodných roztocích nerozpustný a nevytváří stabilní suspenze. V přítomnosti fosfolipidú zůstává cholesterol přítomen uvnitř fosfolipidové dvojvrstvy, která může vytvářet stabilní suspenzi váčků nazývaných lipozomy. Aby bylo možno vyhnout se přídavku fosfolipidú, bylo zkoušeno použití rozpustného derivátu.

2o Polyoxyethanylcholesterolsebakát je rozpustný ve vodě v koncentraci 60 mg/ml, avšak i při 2000 násobném hmotnostním přebytku oproti QS21, nebylo detekováno žádné snížení lytické aktivity QS21.

1.4 Zvýšená stabilita QS21 způsobená lipozomy obsahujícími

2S cholesterol

QS21 je při pH vyšším než 7 velmi náchylný k hydrolýze. Hydrolýza může být monitorována měřením snížení vrcholu, který odpovídá QS21 na HPLC s reverzní fází. Například níže uvedený graf

9 ·

• · r

- 10 ukazuje, že při pH 9 a teplotě 37 °C se v průběhu 16 hod hydrolyzuje % QS21. Jestliže se přidají lipozomy obsahující cholesterol ve hmotnostním poměru cholesterol : QS21 2:1, není za stejných podmínek detekována žádná hydrolýza QS21. Jestliže je poměr 1:1, 5 je degradováno 10 % QS21.

Inkubace 20 pg QS21 v přítomnosti SUV s obsahem cholesterolu při pH 9 po dobu 16 hodin při teplotě 37 °C

5 10 15 20 25 30 35 40 pg přítomného cholesterolu li)

Z toho vyplývá, že pokud se QS21 spojí s lipozomy obsahujícími cholesterol, stane se mnohem méně náchylný k hydrolýze způsobené bázemi. Hydrolytický produkt nemá podle známých pramenů žádnou adjuvantní aktivitu při parenterálním podání, a proto musí mít vakciny 2o s obsahem QS21 kyselé pH a být udržovány při 4 °C, aby bylo zachováno složení adjuvans. Použití lipozomů může tento požadavek obejít.

1.5 Studie vyvolávání reakce

Do holenního svalu myší bylo injikováno 5 pg QS21 (nebo digitoninu), přidaného ke stoupajícímu množství lipozomů (vyjádřeno jako mikrogramy cholesterolu). Lytická aktivita je vyjádřena jako mikrogramy ekvivalentu QS21, což znamená, že stejné množství QS21 ř * • 4 je nutné pro dosažení stejné hemolýzy vzorku. Zarudnutí, nekróza a toxicita ve svalu v místě injekce byly vizuálně hodnoceny po usmrcení myši.

Složení	Lytická aktivita M9	Zarudnutí	Nekróza	Toxicita
QS21 + PBS	5	+++	±	+++
QS21 + 1 pg chol (SUV)	4	+++	+	++++
QS21 + 5 pg chol (SUV)	0			+
QS21 + 25 pg chol (SUV)	0	±		+
SUV samotný	0	-	-	-
digitonin	5	-	-	+
PBS	0	-	-	-

Data ukazují, že když se sníží lytická aktivita přídavkem lipozomů s obsahem cholesterolu, toxicita způsobená QS21 se sníží také.

1.6 Vyvolávání reakce intramuskulárně u králíků

Hodnoty v U.l./I

Experiment	Prostředek	Den 0	Hemolýza	Den 1	Hemo- lýza	Den 3	Hemolýza
Králík 1 Králík 2 Králík 3 Králík 4 Králík 5	QS21 50 pg	1078 1116 660 592 3400	+	8650 4648 4819 5662 7528		1523 1435 684 684 1736
Střední SD	hodn.	1369 1160		6261 1757		1212 495

Experiment	Prostředek	Den 0	Hemolýza	Den 1	Hemo- lýza	Den 3	Hemo- lýza
Králík 6	QS21	596		1670		460
Králík 7	50 pg	540		602		594
Králík 8	chol v SUV	611		1873		803
Králík 9	50 pg	521		507		616
Králík 10	(1:1)	1092	±	787		555
Střední SD	hodn.	672 238		1088 636		606 125

Experiment	Prostředek	Den 0	Hemolýza	Den 1	Hemolýza	Den 3	Hemolýza
Králík 11	QS21	332		344		387
Králík 12	50 pg	831		662		694
Králík 13	chol v SUV	464		356		519
Králík 14	150 pg	528		720		614
Králík 15	(1:3)	1027		568		849
Střední	hodn.	637		530		613
SD		285		173		175

* »

Experiment	Prostředek	Den 0	Hemolýza	Den 1	Hemolýza	Den 3	Hemolýza
Králík 16	QS21	540		769		745
Králík 17	50 pg	498		404		471
Králík 18	chol v SUV	442		717		(4535)
Králík 19	250 pg	822		801		925
Králík 20	(1:5)	3182	+	2410		960
Střední SD	hodn.	1097 1175		1020 793		775 224	(1527) (1692)

Experiment	Prostředek	Den 0	Hemolýza	Den 1	Hemolýza	Den 3	Hemolýza
Králík 21		321		290		378
Králík 22		660		535		755
Králík 23	PBS	650		603		473
Králík 24		1395		(3545)		(5749)
Králík 25		429	±	323		263
Střední	hodn.	691		438	(1059)	467	(1523)
SD		419		155	(1396)	210	(2369)

Data ukazují, že přídavek lipozomů s obsahem cholesterolu k prostředku výrazně sníží nárůst CPK (kreatin fosfokinázy), způsobený QS21. Protože zvýšení CPK je mírou poškození svalu, znamená tento jev snížené poškození svalů, což je také potvrzeno histopatologicky.

·> · * · ' · r r ₉ »··♦ ♦ * ** · * · · · · I»

- » · ·»»

-14- ...... .. .......

1.7 Vazba komplexu lipozom - QS21 na hydroxid hlinitý

QS21 byl inkubován s neutrálními lipozomy obsahujícími přebytek cholesterolu a radioaktivní cholesterol a potom inkubován s hydroxidem hlinitým (alum) v PBS. Ani neutrální lipozomy ani QS21 se samotné v PBS na hydroxid hlinitý neváží, avšak negativně nabité lipozomy ano. QS21 a neutrální lipozomy společně se však na hydroxid hlinitý váží. Supernatant neobsahoval ani QS21 (testováno orcinolovým testem) ani radioaktivní cholesterol.

To ukazuje, že QS21 se navázal na lipozomy a byla umožněna vazba kombinace lipozom - QS21 na hydroxid hlinitý. To může být způsobeno vznikem negativního náboje lipozomů působením QS21 nebo expozicí hydrofobních oblastí lipozomů. Z výsledků také vyplývá, že QS21 neextrahuje cholesterol z membrány.

To ukazuje, že prostředky podle vynálezu mohou být použity ve vakcínách založených na hydroxidu hlinitém.

1.8 Porovnání lipozomálního QS21/MPL a volného QS21 + MPL z hlediska indukce protilátky a CMI

SUV byla připravena extruzí EYPC : chol : MPL v poměru 20 : 5 : 1. Pro vnější MPL byly lipozomy připraveny bez MPL a MPL bylo přidáno ve formě částic o velikosti 100 nm.

QS21 bylo přidáno před antigenem, chol : QS21 =5:1 hmotnostních.

MLV bylo připraveno trojnásobným zmrazením/roztáním SUV před přídavkem antigenu. Pro dosažení pohlcení antigenu byl antigen přidán do SUV před procesem zmrazení/tání a QS21 byl přidán po zmrazení/tání. Bylo dosaženo zapouzdření antigenu 5 % uvnitř a 95 % vně částic. Myším (balb/c pro gD, B10BR pro RTSs) byly podány dvě injekce do chodidla. gD je glykoprotein D viru Herpes simplex. RTSs

- 15 je povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg), geneticky modifikovaný tak, aby obsahoval epitop sporozoita Plasmodium falciparum.

Antigen = 10 pg RTSs	Titr anti HBsAg 15 dnů po zesilující dávce
Prostředek	lgG1	lgG2a	lgG2b
SUV/QS+MPL(_Vnější) ⁺ Ag	1175	10 114	71 753
MLV/QS+M Plavnější) + Ag	2247	11 170	41 755
MLV/QS/MPL(_Vnitřní) + Ag	969	7073	18 827
MI_V/QS/MPL(vnitřní)/Ag_(Vnitřní) ** Ag	1812	2853	9393
QS + MPL + Ag	372	9294	44 457
Ag	< 100	< 100	< 100
SUV/QS + MPL_(vnějši)	< 100	< 100	< 100
MLV/QS/MPL_(Vnitřní)	< 100	< 100	< 100

Antigen = 20 pg gD	anti-gD	CMI
Prostředek	IgG	IFN-y96 h (pg/ml)	IL2 48 h (pg/ml)
SUV/QS+MPL(vnější) ⁺ Ag	2347	1572	960
SUV/QS+MPL(_Vnitřní) + Ag	2036	1113	15
MLV/QS+MPL(vnéjší)⁺ Ag	1578	863	15
MLV/QS/MPL(_Vnitřní)/Ag(vnitřní) Ag	1064	715	15
QS + MPL + Ag	1177	764	15
Ag	< 100	567	44
SUV/QS + MPL_(Vnéjší)	< 100	181	15
MLV/QS/MPL_(vnitřni)	< 100	814	105

Data ukazují, že kombinace SUV/QS + MPL(_Vnejši) indukuje vysoké titry protilátky alespoň stejně dobře jako kombinace QS21 + MPL a zároveň indukuje markér buňkami zprostředkované imunity IL2, přičemž snižuje vyvolávání reakce látkou QS21.

- 16 Další výsledky z druhého experimentu, porovnávajícího QS21 a QS21 v přítomnosti cholesterolu (SUV) u myši balb/c s HSV gD jako antigenem jsou ukázány dále:

	Izotypy 7	dnů po II
Pro stř.	Antigen	IgG 7 po II (GMT)	IgG 14 po II (GMT)	lgG1 pg/ml	%	IgG 2a pg/ml	%	IgG 2b pg/ml	%
1	gD(5pg)	20290	16343	331	26	716	56	222	17
* 2	gD(5pg)	12566	10731	418	44	412	44	111	12
3*	gD(5pg)	10504	10168	200	34	285	48	107	18
* 4	žádný	0	0	0	0	0	0	0	0
* 5	gD(5pg)	3468	4132	156	66	67	28	14	6
6*	gD(5pg)	11253	11589	484	57	304	36	65	8

SUV/QS21+MPL(_Vnějši)

2* SUV/QS21/MPL₍vnitřní)

3* QS21+MPL

4* SUV/QS21+MPL_(Vnějši)

5' QS21

6* QS21 io 1,9 Porovnání qp 120 plus lipozomální MPL/QS21 s volným MPL/QS21

Lipozomy = SUV s obsahem MPL v membráně

Chol : QS21 =6:1

Odpověď byla testována dva týdny po jedné imunizaci.

Prostředek	Proliftn	IFN-g ng/ml	IL2 pg/ml	IL5 pg/ml
SUV/MPL/QS21+Ag	12 606	16,6	59	476
MPL+QS21+Ag	16 706	15,8	60	404

- 17 Po druhé imunizaci:

Prostředek	Proliftn	IFN-g ng/ml	IL2 pg/ml	IL5 pg/ml
SUV/MPL/QS21+Ag	12 606	135	0	250
MPL+QS21+Ag	16 726	60	0	500

Data ukazují, že QS21 spojený s lipozomy obsahujícími cholesterol a MPL indukuje odpověď Th1/Th0 stejnou jako MPL+QS21.

Při tomto poměru cholesterolu k QS21 není QS21 toxický pro králíky (metodou CPK).

Ve druhém experimentu byly myši balb/c imunizovány do chodidla gp 120 v přítomnosti QS21 nebo QS21 + SUV s obsahem cholesterolu. Byla měřena cytotoxická aktivita T-lymfocytú ve slezině.

To ukazuje, že samotný QS21 indukuje aktivitu CTL a že QS21 v přítomnosti lipozomú obsahujících cholesterol indukuje aktivitu CTL stejně nebo ještě lépe než samotný QS21.

2. Vakciny

2.1 Vytvoření prostředku s částicemi HBsAg L*. S

Částice HBsAg L*, S mohou být vytvořeny následujícím způsobem: 10 pg částic HBsAg L*, S/dávku se inkubuje 1 hodinu za s míchání při pokojové teplotě. Objem se nastaví s použitím vody pro injekce a roztoku PBS a doplní se na konečný objem 70 pl/dávku vodným roztokem QS21 (10 pg/dávku). Hodnota pH se udržuje na 7 ±0,5.

Podobné prostředky mohou být připraveny s použitím 1 a 50 pg io HBsAg L*, S a také s použitím antigenu HBsAg S.

Prostředky je možno testovat na náhražkovém terapeutickém modelu podle Woodchucka s použitím Woodchuckových antigenů HBV jako modelu.

Woodchuckův model

DQ QS21 (tj. QS21/cholesterol nebo inhibovaný QS21) může být testován ve Woodchuckově terapeutickém modelu, ve kterém jsou zvířata chronicky infikována virem. Specifická Woodchuckova vakcína proti viru hepatitidy může být smísena s QS21 jako takovým nebo DQ 20 as nebo bez MPL a podávána zvířatům každý měsíc po dobu 6 měsíců. Účinnost vakciny je možno stanovit pomocí vylučování virové DNA.

2.2 Model na morčeti (HSV)

2.2.1 Model prevence

Skupina 12 samic morčat Hartley byla injikována intramuskulárně v den 0 a den 28 následujícími prostředky:

První experiment:

gD 5 pg + QS21 pg + SUV obsahující 50 pg cholesterolu gD 5 pg + QS21 gD 5 pg + QS21

100 pg + SUV obsahující 100 pg cholesterolu pg + SUV obsahující 250 pg cholesterolu gD 5 pg + QS21 50 pg

Druhý experiment: gD 5 pg + MPL 12,5 pg + QS21 12,5 pg + SUV obsahující 62,5 pg cholesterolu nebo byla zvířata ponechána neošetřena.

Zvířatům byly 14 a 28 dnů po druhé imunizaci odebrány vzorky krve a séra byla testována na titry gD - specifických protilátek ELISA.

Zvířatům pak bylo podáno intravaginálně 10⁵ pfu HSV kmene 2 MS. Ve dnech 4 až 12 byla denně vyšetřována na primární herpetické opary. Vyšetření bylo hodnoceno následujícím způsobem: Vaginální opary:

- krvácení = 0,5

- zarudnutí 1 nebo 2 dny bez krvácení = 0,5

- zarudnutí a krvácení 1 den = 1

- zarudnutí bez krvácení v trvání alespoň 3 dnů = 1

Vnější herpetické puchýřky:

- < 4 malé puchýřky = 2

- >- 4 malé puchýřky nebo 1 velký puchýřek = 4

- >= 4 velké opary nebo 8 spojených velkých oparů = 16

- spojené velké opary v celé oblasti vnějších genitálií = 32.

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

9

O CXJ <0 TJ o ε

-X o L-í JZ ra > <♦o

CL _3 O L. Φ tn

0) O xz υ E φ JC

CQ tn -Q

O tn > D ω ra c <D E CQ C N Ó XZ

O c <D E φ o.

X UJ

	oparů*	(C	CD	xr	(0	CD
	c
	<D
	O
	O c			c 'CO			o	o		id	O
	TJ			Ό			m	LO		b-
	o T			<u 2				(XÍ		o	55
						<U
				ížen	O U-	O u. r-	3 %	vg θ' co	xp θ' O	>s θ' ID	1
	«			Sn	CL	o	CD	OJ		CD
c	CL				Jxí
><u
c	<U
υ	X3
o	tz
E 0) c							73	bco	o	V ID	CD CD CD
o
Έ

'CQ
E	•w >1	x: o	•3
Pr	-X tn	>tn	par	θ'			b-	CO T	o	r^ t—	ID
	>	c	o
		>
		JC
		o
	>x	c	•3
	Výsk	'CQ C O)	opar	θ'			33	oo	o	co co	O
		CQ
		>
		•3
	ra	OJ
	CQ >u_ '>	CL O N		xp			50	xr CD	o o	o ID	ID CXJ
	N	(U
		JQ
								lO	V“
										x·^
								V	T“	x—
								o	o	o
								JC	£	xz
								o	O	o
							CD	CD	CD	CD
							CL	CL	3.	CL
							O	O	o	O
lek							lO	lO V“	tO 7	tn V	O c 0)
u Φ >u-							(XI	CX\|	CXJ	CXJ	>L.
						ω	ω	ω	co	Φ
U)							a	O	σ	σ	>ω
											o
o u.							0	Q	Q	Q	CD
CL							O)	OJ	O)	CD	c
							CXJ	V“	CXJ	CXJ	CXJ
C							r—	v		V“

r r >·

e r ♦ r * · »

CN

Experiment 2

		c	io	O V“

	·□
	u.
	flj Q. O			dián			o o	o to
	Έ φ			φ 5				T“
	o
	o
	c
	ό o			c Φ		uí	xp
	I			>N	O	c	Tf	1
				Sn	Q.	o	CD
	« « El X Φ T3 c		37,50	587,50
	skyt	jších	>□ ra				33	,00
		»Φ	o.				co	UJ
	>	C	o				b~
		>

1-							co CO
s o	sky	c CD	Ό u. CO				CO co
	>.	ra	Q.				CO	co
látek	>	>	O				co


^4 o	ra	N	»□				co	b-
k_	(Π	Im·				co	CD
Q.	>k-	Φ	tu	o⁵
> L.	Zví	J2	do				58	<0
h·				C
	ZD	<		Φ	—»		01	O
	UJ	Qí			o		T	in
	Z	H		oo	Q.		xr	v
				CN
	<			28.	O Q. C Φ	₌	·<· Nin	o o v v
	ω				Ό		CO
	—1 Lil				c	₌	CD O	o
				^r T	de	od	O rn·	<4C
							-1
							0-

							>
							D
Stl							ω	O
(D								c
Ό Φ >1—							S21	Φ )1_ +* Φ
C/J							o	>OT
o								O
k.							Q	Φ
CL							O)	C
							CN	CN
C							r-

in • >

- » · r .* · -- * · r ? * ♦

- * · ♦ β r-22 Tabulka a graf ukazují, že v profylaktickém modelu byla po imunizaci gD/MPL/QS21/SUV dosažena velmi vysoká úroveň ochrany proti primárnímu onemocnění. Jak výskyt vnějších oparů, tak i jejich vážnost se jevila ve skupině zvířat imunizovaných gD/MPL/QS21/SUV 5 podstatně snížena.

2.2.2 Terapeuticky model

V terapeutickém modelu bylo samicím morčete Hartley nejprve podáno 10⁵ pfu HSV-2 kmene MS. Zvířata s herpetickými opary byla io náhodně seskupena do skupin po 16.

V den 21 a 42 byla buď imunizována jedním z následujících prostředků:

- gD + MPL 50 pg + QS21 50 pg + SUV s obsahem 250 pg cholesterolu, is - gD + AI(OH)₃ + MPL 50 pg + QS21 50 pg + SUV s obsahem 250 pg cholesterolu, nebo zůstala neošetřena.

Zvířata byla denně monitorována v den 22 až 75 pro vyhodnocení recidivy onemocnění. Hodnocení probíhalo jak bylo 20 popsáno pro profylaktický model. Výsledky jsou uvedeny v tabulce a grafu níže:

* · • ·

• · * ·» · • . · »· <η Ol

Φ σ o E ·>

o '*3 □ (D Q. (Q i_ Φ I—

o	o	o
o	o_	in
co	co	co

c >« >

i— I—

a>
c 2
<u — t“ §	cr
c	oo oo
% s proti	t— v

>

TJ <U >Ltn O v. Q

> Z) ω + v 04	ω σ + —1 CL s
ω	+
σ	co z·—»
+	T
	o
CL
S	<	>
+	+	Ώ
Q	Q	V)
O)	O)	+

in

(hodnocení >2). Imunoterapeutické ošetření bylo provedeno v den 21 a 42.

¢0

-24 Výsledky ukazují, že i v terapeutickém modelu infekce HSV-2 bylo dosaženo dobré míry ochrany. Imunizace gD/MPL/QS21/SUV s nebo bez hydroxidu hlinitého měla významný efekt na střední vážnost recidivujícího onemocnění. Imunizace rovněž mírně snížila 5 počet recidiv a jejich trvání (viz tabulka).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek s vakcínačním účinkem obsahující antigen, imunologicky aktivní saponinovou frakci a sterol, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr saponin : sterol je od 1 : 1 do 1 : 100.
2. Prostředek s vakcínačním účinkem podle nároku 1, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr saponin : sterol je v rozmezí od 1 : 1 do 1 : 5.
3. Prostředek s vakcínačním účinkem podle nároku 1, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr saponin : sterol je 1 : 2.
4. Prostředek s vakcínačním účinkem podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že imunologicky aktivní saponinovou frakcí je QS21.
5. Prostředek s vakcínačním účinkem podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že sterolem je cholesterol.
6. Prostředek s vakcínačním účinkem podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že dále obsahuje 3D-MPL.

- 26
7. Prostředek s vakcinačním účinkem podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že dále obsahuje nosič.

5
8. Prostředek s vakcinačním účinkem podle nároku 7, vyznačující se tím, že nosič je zvolen ze skupiny zahrnující: emulze typu olej ve vodě, hydroxid hlinitý, mikrosféry a zapouzdřené částice antigenu.

io
9. Prostředek s vakcinačním účinkem podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dáie obsahuje antigen nebo antigenový prostředek odvozený z jakéhokoliv viru lidské imunodeficience, viru kočičí imunodeficience, viru pásového oparu, viru Herpes simplex typ 1, viru Herpes is simplex typ 2, lidského cytomegaloviru, viru hepatitidy A, B, C nebo E, viru napadajícího syncytium respiračního traktu, lidského papilomaviru, viru chřipky, Hib, viru meningitidy, a mikroorganismů Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium nebo Toxoplasma.
10. Prostředek s vakcinačním účinkem podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dále obsahuje antigen odvozený z tumoru.

25
11. Prostředek podle některého z nároků 1 až 10 pro použití v lékařství.

r r

-27• ·♦ ♦ · » · • · • « *
12. Použití prostředku podle některého z nároků 1 až 9 pro výrobu vakciny pro preventivní ošetření virových, bakteriálních nebo parazitárních infekcí.
13. Použití prostředku podle některého z nároků 1 až 10 pro výrobu vakciny pro imunoterapeutické léčení virových, bakteriálních a parazitárních infekcí nebo karcinomů.
14. Způsob léčení savce s patogenní infekcí nebo s podezřením na » ni zahrnující podávání bezpečného a účinného množství prostředku podle některého z nároků 1 až 9.
15. Způsob léčení savce s karcinomem nebo s podezřením na něj zahrnující podávání bezpečného a účinného množství prostředku podle nároku 10.
16. Způsob výroby prostředku s vakcinačním účinkem podle některého z nároků 1až10, vyznačující se tím, ž e zahrnuje míšení imunologicky aktivní saponinové frakce a cholesterolu s antigenem nebo směsí antigenů.