ES2526996T3

ES2526996T3 - Inmunógenos desintoxicados de Escherichia coli

Info

Publication number: ES2526996T3
Application number: ES10752175.9T
Authority: ES
Inventors: Laura Serino; Maria Rita Fontana; Danilo Gomes Moriel
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2015-01-19
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: WO2011007257A1; US8871214B2; EP2464658A1; CN102770443A; US20150110830A1; AU2010272243A1; SI2464658T1; US20120207777A1; CA2768343A1; EP2837386B1; PT2464658E; PL2464658T3; EP2464658B1; HRP20141270T1; DK2464658T3; IL217539A0; US10058600B2; MX2012000734A; ES2670799T3; ZA201200833B

Abstract

Un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf 3526) de E. coli que comprende una mutación con respecto a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli, en el que la mutación se selecciona de una deleción completa o parte de un dominio de zinquina metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de la zinquina metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa y en el que polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmunitaria sustancialmente similare en un sujeto como la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli.

Description

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Inmunógenos desintoxicados de Escherichia coli

Descripción

CAMPO TÉCNICO

[0001] Esta invención se refiere a la inmunización contra las cepas patógenas de Escherichia coli.

ANTECEDENTES

[0002] Las cepas de E. coli tradicionalmente se han clasificado como comensales o patógenos, y las cepas patógenas se subclasifican además como cepas intestinales o extraintestinales. Las E. coli patógenas se discuten con más detalle en la referencia 1, y se pueden agrupar en diferentes patotipos, es decir, un grupo de cepas de E. coli que causa una enfermedad común utilizando un conjunto común de factores de virulencia. La tipificación patogénica de las cepas es una técnica rutinaria que se realiza genotípica o fenotípicamente. Un método reciente de tipificación patogénica basado en el genotipo [2] utiliza un microarray de ADN.

[0003] Entre las cepas intestinales se conocen al menos seis patotipos bien descritos: enteropatógeno (EPEC), enterohemorrágico (EHEC), enteroagregativo (EAEC), enteroinvasivo (EIEC), enterotoxigénico (ETEC) y con adherencia difusa (DAEC).

[0004] Las cepas patógenas extraintestinales (o cepas “ExPEC” [3,4] de E. coli incluyen cepas uropatógenas (UPEC), cepas de meningitis neonatal (NMEC), y cepas asociadas con septicemia (SEPEC). ExPEC es la causa más común de infecciones del tracto urinario y una de las principales causas de meningitis neonatal y sepsis neonatal en humanos que pueden causar graves complicaciones y muerte. Otros tipos de infecciones extraintestinales incluyen osteomielitis, infecciones pulmonares, intraabdominales, de tejidos blandos, e infecciones asociadas a dispositivos intravasculares. Otro patotipo ExPEC no exclusivo de humanos es el patógeno aviar (APEC) que causa infecciones extraintestinales en aves de corral.

[0005] La mayoría de las vacunas anteriores de ExPEC se han basado en lisados celulares o en estructuras celulares. SOLCOUROVAC™ incluye diez bacterias diferentes inactivadas por calor incluyendo seis cepas ExPEC. URO – VAXOM™ es una vacuna en comprimidos que contiene lisados bacterianos liofilizados de 18 cepas seleccionadas de E. coli. Baxter Vaccines desarrolló una vacuna contra UTI basada en los pili de 6 a 10 cepas diferentes. MedImmune desarrolló un producto denominado MEDI 516 basado en el complejo de adhesina FimH. Por el contrario, las referencias 5 y 6 describen inmunógenos específicos de cepas ExPEC que pueden ser utilizados como la base de vacunas definidas contra las cepas NMEC y UPEC.

[0006] Un objeto de la invención es proporcionar más y mejores antígenos para su uso en la inmunización contra las cepas patógenas de E. coli, y más particularmente contra los patotipos intestinales (por ejemplo, cepas EAEC, EIEC, EPEC y ETEC), así como los patotipos ExPEC y en particular antígenos que han sido detoxificados para permitir su uso como componentes de inmunización o que se han acortado sin reducir la respuesta inmune formulada para mejorar la expresión y purificación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0007] Uno de los muchos antígenos descritos en la referencia 5 se anota como el precursor del factor de colonización accesorio D (“AcfD”) (orf3526) (SECs ID Nº: 7051 y 7052; SEC ID Nº 1 en la presente). La referencia 5 describe la secuencia de la cepa NMEC IHE3034, y la presente invención se basa en la variantes del “precursor de AcfD” (orf3526) ExPEC que se han identificado en otros patotipos, incluyendo cepas APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC. A diferencia de la descripción de la referencia 5, estas variantes pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de patotipos intestinales. De este modo, la invención proporciona dichas variantes junto con su uso en la inmunización de pacientes contra las infecciones de E. coli. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli en los que el fragmento tiene una mayor solubilidad en comparación a la de longitud completa mientras que se mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la mejorada por la proteína completa. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli en los que el fragmento tiene toxicidad reducida en comparación con la proteína completa mientras que mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la mejorada por la proteína completa. Además, esta descripción incluye fragmentos y mutantes de la proteína AcfD (orf3526) de todos los patotipos de E. coli en los que el fragmento mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la mejorada por la proteína completa mientras que tienen características mejoradas con respecto a la purificación cuando se expresa en E. coli.

Polipéptidos utilizados en la invención

[0008] La invención presenta un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli que comprende una mutación en relación con la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del

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polipéptido inmunogénico en comparación con la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, en el que la mutación se selecciona a partir de una deleción de todo o una parte del dominio zinquina – metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de zinquina -metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa y en el que el polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0009] La proteína AcfD (orf3526) de E. coli puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SECs ID Nº 1 – 19.

[0010] Ejemplos de mutaciones que disminuyen la toxicidad incluyen una deleción de todo o una parte del dominio zinquina – metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio zinquina – metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa. En ciertos casos, la mutación puntual es una mutación de un residuo de unión a zinc o una mutación de un residuo catalítico. Una mutación puntual preferida es la sustitución del número de aminoácido 1305 basado en base al alineamiento con la SEC ID Nº 1.

[0011] Las deleciones ejemplares incluyen la eliminación de, al menos, los últimos 100 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 200 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 300 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 400 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 500 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 600 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 700 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 750 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los últimos 758 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli

o no comprenden, al menos, los primeros 100 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 200 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 300 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 400 aminoácidos N

– terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 500 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 600 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 700 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 750 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o, al menos, los primeros 760 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0012] La invención proporciona un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli, en el que el polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a): la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo entre las SECs ID Nº 20 a 38, y 58 a 76;

(b): al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SECs ID Nº 20 a 38 y 58 a 76; o

(c): tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones de aminoácidos individuales (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las SECs ID Nº 20 a 38 y 58 a 76;

(d): cuando se alinea con cualquiera de las SECs ID Nº 20 a 38, y 58 a 76 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde N – terminal a C – terminal (tal como un alineamiento que se extiende a p aminoácidos, donde p > x, hay p – x + 1 de estas ventanas) tiene al menos x . y aminoácidos alineados idénticos, donde x es 30; y es 0,75; y si x.y no es un número entero, entonces se redondea al número entero más próximo,

en el que el polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0013] El algoritmo de alineamiento por pares es el algoritmo de alineamiento global Needleman – Wunsch [7], que utiliza parámetros por defecto (por ejemplo, con penalización por abertura de hueco = 10,0, y penalización por extensión de hueco = 0,5, utilizando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta aguja en el paquete EMBOSS [8].

[0014] Estos polipéptidos incluyen otras variantes detoxificadas de las SECs ID Nº 20 a 38 y 58 a 76, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

[0015] El valor puede seleccionarse a partir del 85 %, 87,5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más.

[0016] Los polipéptidos inmunogénicos anteriores pueden contener además una deleción con relación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli que aumenta la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la

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proteína AcfD (orf3526) de E. coli mientras que el polipéptido inmunogénico aún mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0017] Las deleciones ejemplares que aumentan la solubilidad incluyen la eliminación de sustancialmente todos los aminoácidos N – terminales hasta la región gly – ser, la eliminación completa o una parte de la repetición rica en prolina N – terminal, o ambos. El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 7, en el que la deleción se elimina de al menos, los primeros 20 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 30 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 38 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 40 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 50 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 60 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 70 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 80 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 90 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los primeros 94 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0018] La invención también proporciona un fragmento de polipéptido inmunogénico de un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli, en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a): la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo entre las SECs ID Nº 77 a 95;

(b): al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SECs ID Nº 77 a 95; o

(c): tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones de aminoácidos individuales (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación a las SECs ID Nº 77 a 95;

(d): cuando se alinea con cualquiera de las SECs ID Nº 77 a 95 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde N – terminal a C – terminal (tal como un alineamiento que se extiende a p aminoácidos, donde p > x, hay p – x + 1 de estas ventanas) tiene al menos xy aminoácidos alineados idénticos, donde x se selecciona de; y se selecciona de 0,75; y si x.y no es un número entero, entonces se redondea al número entero más próximo,

en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico tiene menor toxicidad que la proteína AcfD (orf3526) de E. coli y en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0019] El algoritmo de alineamiento por pares preferido es el algoritmo de alineamiento global Needleman – Wunsch [7], que utiliza parámetros por defecto (por ejemplo, con penalización por abertura de hueco = 10,0, y penalización por extensión de hueco = 0,5, utilizando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta aguja en el paquete EMBOSS [8].

[0020] Estos polipéptidos incluyen otras variantes detoxificadas de las SECs ID Nº 77 a 95, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

[0021] El valor puede seleccionarse a partir del 85 %, 87,5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más.

[0022] El fragmento de polipéptido inmunogénico en ciertas realizaciones no comprenderá, al menos, los primeros 10 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 20 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 25 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 30 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los primeros 33 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0023] El fragmento de polipéptido inmunogénico en ciertas realizaciones (que se puede combinar con las realizaciones anteriores) no comprenderá, al menos, los últimos 125 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 150 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 175 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 200 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 210 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los últimos 217 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0024] La invención proporciona adicionalmente una composición inmunogénica que comprende un fragmento de polipéptido inmunogénico de un polipéptido AcfD (orf3526) de E. coli, en el que el fragmento de polipéptido

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inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende, al menos, un % de identidad de secuencia en cualquiera de las SECs ID Nº 77 a 95, en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli y en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico no comprende, al menos, los últimos 125 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 150 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 175 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 200 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 210 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los últimos 217 aminoácidos C

– terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0025] El algoritmo de alineamiento por pares preferido es el algoritmo de alineamiento global Needleman – Wunsch [7], que utiliza parámetros por defecto (por ejemplo, con penalización por abertura de hueco = 10,0, y penalización por extensión de hueco = 0,5, utilizando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta aguja en el paquete EMBOSS [8].

[0026] Estos polipéptidos incluyen otras variantes detoxificadas de las SECs ID Nº 77 a 95, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.

[0027] El valor puede seleccionarse a partir del 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 85,7 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más.

[0028] El fragmento de polipéptido inmunogénico de la composición inmunogénica en ciertas realizaciones no comprenderá al menos, los primeros 10 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 20 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 25 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 30 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los primeros 33 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.

[0029] La composición inmunogénica puede comprender además un adyuvante que, en ciertas realizaciones, puede comprender un 1 – 12 % en volumen de un aceite metabolizable, y 0,2 % a 2,5 % en peso de un agente emulsionante, en la que el aceite metabolizable y el agente emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua con gotas de aceite sustancialmente inferiores a 1 micra de diámetro; 4 – 5 % en peso de escualeno, y (b) un 1 % de un agente emulsionante que comprende polioxietilensorbitán monooleato y trioleato de sorbitán, en el que el escualeno y el agente emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua con gotas de aceite sustancialmente inferiores a 1 micra de diámetro; o MF59 (TM).

[0030] Los polipéptidos inmunogénicos detoxificados y los fragmentos de polipéptido inmunogénico anteriores retienen preferentemente al menos un epítopo o fragmento inmunogénico de las SECs ID Nº 1 a 19. Un epítopo dentro de un fragmento puede ser un epítopo de células B y / o un epítopo de células T. Tales epítopos pueden ser identificados empíricamente (por ejemplo utilizando PEPSCAN [9,10] o métodos similares), o se pueden predecir (por ejemplo utilizando el índice antigénico Jameson – Wolf [11], técnicas con base de matriz [12], MAPITOPE [13], TEPITOPE [14,15], redes neurales [16], OptiMer y EpiMer [17, 18], ADEPT [19], Tsites [20], hidrofilicidad [21], índice antigénico [22] o los métodos descritos en las referencias 23 – 27, etc). Los epítopos son las partes de un antígeno que son reconocidas por y se unen a los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos o receptores de células T, y también se pueden referir como “determinantes antigénicos”.

[0031] Los polipéptidos inmunogénicos detoxificados y los fragmentos de polipéptido inmunogénicos incluyen, sin limitación, polipéptidos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes listados o discutidos en la sección “composiciones y medicamentos inmunogénicos” a continuación), o un portador adecuado acoplado al polipéptido, inducen una respuesta inmune mediada por células T o anticuerpos que reconocen el polipéptido de longitud completa de la SECs ID Nº 1 a 19, respectivamente, del que se deriva el polipéptido inmunogénico.

[0032] Los polipéptidos inmunogénicos detoxificados y los fragmentos de polipéptido inmunogénicos incluyen, sin limitación, polipéptidos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes listados o discutidos en la sección “composiciones y medicamentos inmunogénicos” a continuación), o un portador adecuado acoplado al polipéptido, inducen una respuesta inmune mediada por células T o anticuerpos que reconocen el polipéptido aislado de longitud completa de la SECs ID Nº 1 a 19, respectivamente, del que se deriva el fragmento inmunogénico.

[0033] Los polipéptidos inmunogénicos detoxificados y los fragmentos de polipéptido inmunogénicos incluyen, sin limitación, polipéptidos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes listados o discutidos en la sección “composiciones y medicamentos inmunogénicos” a continuación), o un portador adecuado acoplado al polipéptido, inducen una respuesta inmune mediada por células T o anticuerpos que reconocen el polipéptido aislado de longitud completa de la SECs ID Nº 1 a 19, respectivamente, del que se deriva el fragmento inmunogénico.

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[0034] Un polipéptido detoxificado de la invención puede, en comparación con cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 19, incluir una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc), tales como sustituciones conservadoras (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, tritópfano, y tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto mayor en la actividad biológica.

[0035] Un polipéptido detoxificado puede incluir una o más deleciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc) en relación con cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 19. Del mismo modo, un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc) inserciones (por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con cualquiera de las SECs ID Nº 1 a 19.

[0036] En general, cuando un polipéptido o fragmento de polipéptido inmunogénico detoxificado de la invención comprende una secuencia que no es idéntica a una completa de las SECs ID Nº 1 a 19 (por ejemplo, cuando comprende un listado secuencial con < 100 % de identidad de secuencia de la misma, o cuando comprende un fragmento del mismo) se prefiere que el polipéptido pueda producir un anticuerpo que reconoce un polipéptido que consiste en la secuencia SEC ID completa, es decir, el anticuerpo se une a una o más de dichas SECs ID Nº 1 a 19. Dicho anticuerpo puede unirse de manera específica a las SECs ID Nº 1 a 19, respectivamente mientras que no se una a las proteínas no AcfD (orf3526) con afinidad significativamente mayor que la afinidad no específica del anticuerpo a albúmina de suero humano como una norma de referencia de unión no específica.

[0037] Los polipéptidos utilizados con la invención pueden adoptar varias formas (por ejemplo, nativa, fusiones, glicosilada, no glicosilada, lipidada, no lipidada, fosforilada, no fosforilada, miristoilada, no miristoilada, monomérica, multimérica, en partículas, desnaturalizada, etc). Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede tener una cisteína N – ternimal lipidada (por ejemplo, Cys – 24 de las SECs ID Nº 1 a 19).

[0038] Los polipéptidos utilizados con la invención se pueden preparar por varios medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación de cultivo celular, síntesis química, etc). Se prefieren las proteínas expresadas de forma recombinante.

[0039] Los polipéptidos utilizados con la invención se proporcionan de manera preferente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos (por ejemplo, libres de polipéptidos de origen natural), particularmente de otros polipéptidos de E. coli o células huésped, en general son al menos un 50 % puros (en peso), y generalmente al menos un 90 % puros, es decir, menos del 50 %, y más preferentemente menos del 10 % (por ejemplo, 5 %) de una composición compuesta por otros polipéptidos expresados. De esta manera, los antígenos en las composiciones se separan del organismo completo con el que se expresa la molécula.

[0040] Los polipéptidos utilizados con la invención son preferentemente polipéptidos de E. coli. Tales polipéptidos pueden seleccionarse adicionalmente de polipéptidos de E. coli NMEC, APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC.

[0041] El término “polipéptido” se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

[0042] La invención describe polipéptidos que comprenden una secuencia –P – Q – o – Q – P -, donde: -P – es una secuencia de aminoácidos como se define anteriormente y – Q – no es una secuencia como se define anteriormente, es decir, la invención proporciona proteínas de fusión. Cuando el codón N – terminal de – P – no sea ATG, aunque este codón no esté presente en el N – terminal de un polipéptido, se traducirá como el aminoácido estándar para ese codón en lugar de un Met. Cuando este codón esté en el N – terminal de un polipéptido, sin embargo, se traducirá como Met. Los ejemplos de restos – Q – incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de histidina (es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), una proteína de unión a maltosa, o glutatión – S – transferasa (GST).

[0043] La invención describe además una proteína oligomérica que comprende un polipéptido de la invención. El oligómero puede ser un dímero, un trímero, un tetrámero, etc. El oligómero puede ser un homo – oligómero o un hetero -oligómero. Los polipéptidos en el oligómero pueden estar asociados de forma covalente o de forma no covalente.

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[0044] La comparación de la respuesta inmune mejorada en un sujeto por el polipéptido con la respuesta inmune mejorada por la proteína de longitud completa se puede llevar a cabo por el uso de cualquier medio disponible para el experto en la técnica. Un método simple, tal como se utiliza en los ejemplos posteriores comprende la inmunización de un sujeto modelo, tal como un ratón y luego estimulación con una dosis letal de E. coli. Para una comparación apropiada, un experto en la técnica seleccionará de manera natural el mismo adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund. En esta prueba, los fragmentos de polipéptido inmunogénico de la presente invención mejorarán una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto (por ejemplo, proporcionarán sustancialmente la misma protección contra la estimulación letal) si, por ejemplo, el polipéptido proporciona al menos, el 70 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos, el 80 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos, el 85 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos, el 90 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos, el 95 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos, el 97 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos, el 98 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, o al menos, el 99 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa.

[0045] La proteína de longitud completa AcfD (orf3526) contra la que se comparará el fragmento de polipéptido inmunogénico (para solubilidad, toxicidad y respuesta inmune mejorada) puede ser cualquier proteína AcfD (orf3526) de E. coli representativa incluyendo sin limitación las SECs ID Nº 1 a 19. La proteína AcfD (orf3526) será la proteína correspondiente de longitud completa de la que se obtiene el fragmento de polipéptido inmunogénico.

[0046] La invención también proporciona un proceso para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped transformada con ácido nucleico de la invención en condiciones que inducen la expresión del polipéptido. El polipéptido entonces se puede purificar, por ejemplo, a partir de sobrenadantes de cultivo.

[0047] La invención proporciona una célula de E. coli, que contiene un plásmido que codifica un polipéptido de la invención. El cromosoma de la célula de E. coli puede incluir un homólogo de AcfD (orf3526), o este homólogo puede estar ausente, pero en ambos casos el polipéptido de la invención se puede expresar en el plásmido. El plásmido puede incluir un gen que codifica un marcador, etc. Estos y otros detalles de plásmidos adecuados se proporcionan a continuación.

[0048] Aunque la expresión de los polipéptidos de la invención puede tener lugar en una cepa de E. coli, la invención utilizará normalmente un huésped heterólogo para la expresión. El huésped heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. Los huéspedes adecuados incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc.

[0049] La invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de sintetizar, al menos, parte del polipéptido por medios químicos.

[0050] Cualquiera y todas las proteínas anteriores, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos pueden estar en cualquier forma que incluyen, sin limitación, recombinante, aislada o sustancialmente purificada (a partir de materiales coexistentes con dichas proteínas, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos en su estado natural).

Ácidos nucleicos

[0051] La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica polipéptidos y polipéptidos híbridos de la invención. También proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más polipéptidos o polipéptidos híbridos de la invención.

[0052] La invención también proporciona ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia en estas secuencias de nucleótidos. La identidad entre secuencias se determina preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith – Waterman como se describe anteriormente. Dichos ácidos nucleicos incluyen aquellos que utilizan codones alternativos para codificar el mismo aminoácido.

[0053] La invención también proporciona ácido nucleico que puede hibridar en estos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferente “severidad”. Las condiciones que incrementan la severidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicadas en la técnica (por ejemplo, página 7.52 de la referencia 211). Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de severidad creciente): temperaturas de incubación de 25 ºC, 37 ºC, 50 ºC, 55 ºC y 68 ºC; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (donde SSC es NaCI 0,15 M y tampón citrato de 15 mM) y sus equivalentes utilizan otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida al 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempo de incubación de 5 minutos a 24 horas, 1, 2, o más etapas de lavado; tiempo de incubación de lavado de 1, 2, o 15

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minutos; y soluciones de lavado 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las referencias 28, 29, 211, 213, etc).

[0054] En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la invención se hibrida a una diana en condiciones de baja severidad, en otras realizaciones, se hibrida en condiciones de severidad intermedia; en realizaciones preferentes, se hibrida en condiciones de alta severidad. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de baja severidad es 50 ºC y 10 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de severidad intermedia es 55 ºC y 1 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de alta severidad es 68 ºC y 0,1 x SSC.

[0055] La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a estas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para el uso como cebadores).

[0056] Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar en reacciones de hibridación (por ejemplo, transferencias Northen o Southern, o en microarrays de ácido nucleico o “chips génicos”) y reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc) y otras técnicas de ácido nucleico.

[0057] El ácido nucleico según la invención puede adoptar varias formas (por ejemplo, monocatenaria, bicatenaria, vectores, cebadores, sondas, marcada, etc). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares o ramificados, pero en general serán lineales. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de la invención que utiliza un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias que constituyen la forma bicatenaria. Los cebadores y las sondas son generalmente monocatenarios, como son los ácidos nucleicos antisentido.

[0058] Los ácidos nucleicos de la invención se proporcionan preferentemente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, libres de ácidos nucleicos de origen natural), particularmente de otros ácidos nucleicos de E. coli o célula huésped, siendo en general, al menos, un 50 % puros (en peso), y normalmente al menos, un 90 % puros. Los ácidos nucleicos de la invención son preferentemente ácidos nucleicos de E. coli.

[0059] Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo por síntesis química (por ejemplo, fosforamidita para la síntesis de ADN) en su totalidad o en parte, al digerir ácidos nucleicos más largos utilizando nucleadas (por ejemplo, enzimas de restricción), al unir ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, utilizando ligasas o polimerasas), de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc.

[0060] El ácido nucleico de la invención se puede unir a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, portaobjetos, soporte de microarray, resina, etc). El ácido nucleico de la invención se puede marcar por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente, o una etiqueta de biotina. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico se va a utilizar en técnicas de detección, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es un cebador o una sonda.

[0061] El término “ácido nucleico” incluye, en general, una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y / o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbrido de ADN / ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tales como aquellos que contienen estructuras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) o fosforotioatos) o bases modificadas. De esta manera, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. Cuando el ácido nucleico de la invención adopta la forma de ARN, puede tener o no una cofia 5´.

[0062] Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser parte de un vector, es decir, parte de un constructo de ácido nucleico diseñado para la transducción / transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, “vectores de clonación”, que se diseñan para el aislamiento, la propagación y la repetición de nucleótidos insertados, los “vectores de expresión” se diseñan para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula huésped, los “vectores virales” se diseñan para dar como resultado la producción de un virus recombinante o partículas tipo virus, o los “vectores lanzadera” comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferentes son plásmidos, como se menciona anteriormente. Una “célula huésped”, incluye una célula individual o un cultivo celular que puede ser o ha sido destinataria del ácido nucleico exógeno. Las células huésped incluyen progenie de una célula huésped individual, y la progenie no necesariamente puede ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parental original debido al cambio y / o mutación natural, accidental o deliberada. Las células huésped incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con ácido nucleico de la invención.

[0063] Cuando un ácido nucleico es ADN, se apreciará que “U” en una secuencia de ARN se reemplazará por “T” en el ADN. De manera similar, cuando un ácido nucleico es ARN, se apreciará que “T” en una secuencia de ADN se reemplazará por “U” en el ARN.

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[0064] El término “complemento” o “complementario” cuando se utiliza con relación a los ácidos nucleicos se refiere al apareamiento de bases de Watson – Crick. De este modo, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U), y el complemento de T (o U) es A. Asimismo, es posible utilizar bases tales como I (purina inosina), por ejemplo para complementar pririmidas (C o T).

[0065] Pueden utilizarse ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos en muestras biológicas; para generar copias adicionales de ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como sondas o cebadores de ADN monocatenario;

o como oligonucleótidos tricatenarios.

[0066] La invención proporciona un proceso para producir ácido nucleico de la invención, en el que el ácido nucleico se sintetiza en parte o en su totalidad utilizando medios químicos.

[0067] La invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o de expresión) y células huésped transformadas con dichos vectores.

[0068] La amplificación del ácido nucleico según la invención puede ser cuantitativa y / o en tiempo real.

[0069] Para ciertas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos son preferentemente de, al menos, 7 nucleótidos (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más largos).

[0070] Para ciertas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos son preferentemente como máximo de 500 nucleótidos (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o más cortos).

[0071] Los cebadores y la sondas de la invención, y otros ácidos nucleicos utilizados para la hibridación, oscilan preferentemente entre 10 y 30 nucleótidos (por ejemplo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos).

Composiciones y medicamentos inmunogénicos

[0072] Los polipéptidos de la invención son útiles como ingredientes activos (inmunógenos) en composiciones inmunogénicas, y estas composiciones pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas según la invención pueden ser profilácticas (es decir, para impedir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas.

[0073] Las composiciones inmunogénicas serán farmacéuticamente aceptables. Normalmente, incluirán componentes además de los antígenos por ejemplo, incluirán normalmente uno o más portador(es), excipiente(s) y /

o adyuvante(s) farmacéutico(s). Una discusión completa de los portadores y excipientes está disponible en la referencia 208. Las discusiones completas de adyuvantes de vacunas están disponibles en las referencias 30 y 31.

[0074] Las composiciones se administrarán en general a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se elaboran en forma acuosa, luego se rellenan, se distribuyen, y se administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la elaboración y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento del uso. De este modo, una composición de la invención se puede secar, tal como una formulación liofilizada.

[0075] La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2 – fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la vacuna esté sustancialmente libre de (es decir, menos de 5 µg / ml) material mercurial por ejemplo, libre de tiomersal. Son más preferentes las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren de forma particular vacunas libres de conservante.

[0076] Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura.

[0077] Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere cloruro de sodio (NaCI), que puede estar presente entre 1 y 20 mg / ml, por ejemplo, 10 ± 2 mg / ml de NaCI. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro potásico, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

[0078] En general, las composiciones tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm / kg y 400 mOsm / kg, preferentemente entre 240 – 360 mOsm / kg, y oscilarán preferentemente entre 290 – 310 mOsm / kg.

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[0079] Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones normales incluyen: un tampón fosfato, un tampón Tris, un tampón borato, un tampón succinato, un tampón histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio), o un tampón citrato. Los tampones se incluirán normalmente en el intervalo de 5 – 20 mM.

[0080] El pH de una composición oscilará en general entre 5,0 y 8,1 y normalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8.

[0081] La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica por ejemplo, contiene < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferentemente < 0,1 UE por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten.

[0082] La composición puede incluir material para la inmunización única, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit de “múltiples dosis”. La inclusión de un conservante se prefiere en disposiciones de múltiple dosis. Como alternativa (o además) de incluir un conservante en las composiciones de múltiples dosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para eliminar material.

[0083] Las vacunas humanas se administran normalmente en un volumen de dosis de 0,5 ml, aunque se pueden administrar dosis medias (es decir, 0,25 ml) a niños.

[0084] Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. De manera preferente, uno o más agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y / o un adyuvante TH2, discutidos adicionalmente a continuación.

[0085] Los adyuvantes que se pueden utilizar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a:

A. Composiciones que contienen mineral

[0086] Las composiciones que contienen mineral adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas “CAP” descritas en la referencia 32). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc, con las sales que adoptan cualquier forma adecuada (por ejemplo, en gel, cristalina, amorfa, etc). Se prefiere la adsorción a estas sales. Las composiciones que contienen mineral también se pueden formular como una partícula de sal metálica [33].

[0087] Se pueden utilizar adyuvantes conocidos tales como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se utilizan sólo por conveniencia, puesto que no es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (véase, por ejemplo, el capítulo 9 de la referencia 30). La invención puede utilizar cualquiera de los adyuvantes de “hidróxido” o “fosfato” que son de uso general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como “hidróxido de aluminio” son normalmente sales de oxihidróxido de aluminio, que normalmente son, al menos, parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son normalmente hidroxifosfatos de aluminio, que también contienen frecuentemente una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato hidroxifosfato de aluminio). Se pueden obtener por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal.

[0088] Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es normal para los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es normalmente de 11, es decir, el mismo adyuvante tiene una carga superficial positiva en pH fisiológico. Se han mostrado capacidades de adsorción de entre 1,8 – 2,6 mg de proteína por mg de Al+++ en pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

[0089] Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen en general una relación molar de PO4 / Al entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2 y más preferentemente 0,95 ± 0,1. El fosfato de aluminio en general, será amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante normal es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4 / Al entre 0,84 y 0,92, incluido en 0,6 mg Al 3+ / ml. El fosfato de aluminio estará en general en forma de partículas (por ejemplo, morfología tipo placa como se observa en micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros normales de las partículas oscilan entre 0,5 – 20 µm (por ejemplo, 5 – 10 µm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se han mostrado capacidades de adsorción de entre 0,7 – 1,5 mg de proteína por mg Al +++ en pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.

[0090] El punto de carga cero (PZC) de fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y de la concentración de los reactivos utilizados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera al cambiar la concentración de iones libres de fosfato en solución (más fosfato = más PZC ácido) o al añadir

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un tampón, tal como un tampón histidina (que hace al PZC más básico). Los fosfatos de aluminio utilizados según la invención tendrán, en general, un PZC de entre 4,0 y 7,0, preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, 5,7.

[0091] Las suspensiones de sales de aluminio utilizadas para preparar las composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuosos libres por ejemplo, presentes en una concentración de entre 1,0 y 20 nM, preferentemente entre 5 y 15 mM, más preferentemente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

[0092] La invención puede utilizar una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una relación en peso de al menos:

2:1 por ejemplo, ≥ 5:1, ≥ 6:1, ≥ 7:1, ≥ 8:1, ≥ 9:1, etc.

[0093] La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es preferentemente inferior a 10 mg / ml por ejemplo ≤ 5mg / ml, ≤ 4 mg / ml, ≤ 3 mg / ml, ≤ 2 mg / ml, ≤ 1 mg / ml, etc. Un intervalo preferente está entre 0,3 y 1 mg / ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg / dosis.

B. Emulsiones de aceite

[0094] Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno en agua, tal como MF59 (capítulo 10 de la referencia 30, véase, también la referencia 34] (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formuladas en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador). Se puede utilizar también el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).

[0095] Se conocen varios adyuvantes de emulsión de aceite en agua, y normalmente incluyen, al menos, un aceite y, al menos, un surfactante, con el (los) aceite(s) y surfactante(s) que es (son) biodegradable(s) (metabolizable(s)) y biocompatible(s). Las gotas de aceite en la emulsión en general son inferiores a 5 µm de diámetro, y de manera ideal tienen un diámetro submicrónico, estos tamaños pequeños se logran con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotas con un tamaño inferior a 220 nm, puesto que se pueden someter a un filtrado esterilizante.

[0096] La emulsión puede comprender aceites, tales como los de una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Se puede utilizar aceite de jojoba por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de sésamo, y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede utilizar el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6 – 10 carbonos de glicerol y 1, 2 – propanodiol, mientras no se presenten de manera natural en los aceites de semilla, se pueden preparar por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados a partir de los aceites de frutos secos y de semillas. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y por tanto se pueden utilizar en la práctica de la invención. Los procedimientos de separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de pescados contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena, tal como esperma de ballena, ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden utilizar en la presente. Se sintetizan bioquímicamente varios aceites de cadena ramificada en unidades de isopreno de 5 carbonos y en general se refieren como terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene terpenoides ramificados insaturados conocidos como escualeno, 2, 6, 10, 15, 19, 23 – hexametil – 2, 6, 10, 14, 18, 22 – tetracosahexaeno, que es particularmente preferente en la presente. El escualano, el análogo saturado en escualeno, también es un aceite preferente. Los aceites de pescado, que incluyen escualeno y escualano, están fácilmente disponibles en fuentes comerciales o se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferentes son los tocoferoles (véanse a continuación). Se pueden utilizar mezclas de aceites.

[0097] Los surfactantes se pueden clasificar por su “HLB” (equilibrio hidrófilo / lipófilo). Los surfactantes preferentes de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La invención se puede utilizar con surfactantes, que incluyen, pero no se limitan a: los surfactantes de ésteres de polioxietileno – sorbitán (referidos comúnmente como Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), y / u óxido de butileno (BO), vendidos con el nombre comercial DOWFAX™, tales como copolímeros en bloque lineales de EO / PO; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos repetitivos etoxi (oxi – 1, 2 – etanodiilo), con octoxinol – 9 (Triton X – 100 o t – octifenoxipolietoxietanol) siendo de interés particular; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA – 630 / NP – 40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina), etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes láurico, cetílico, esteárico y oleílico (conocidos como surfactantes Brij), tales como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30) y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren surfactantes no iónicos.

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Los surfactantes preferentes para incluirse en emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietileno -sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X – 100.

[0098] Se pueden utilizar mezclas de surfactantes, por ejemplo, mezclas de Tween 80 / Span 85. Una combinación de un éster de polioxietileno – sorbitán, tal como monooleato de polioxietileno – sorbitán (Tween 80) y también es adecuado un octoxinol, tal como t – octilfenoxipolietoxietanol (Triton X – 100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietileno – sorbitán y / o un octoxinol.

[0099] Las cantidades preferentes de surfactantes (% en peso) son: éster de polioxietileno – sorbitán (tal como Tween 80) 0,01 a 1 %, en particular 0,1 %; octil – o nonilfenoxi – polioxietanoles (tal como Triton X – 100, u otros detergentes en la serie Triton) 0,001 a 0,1 %, en particular 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) 0,1 a 20 %, preferentemente 0,1 a 10 % y en particular 0,1 a 1 % o 0,5 %.

[0100] Los adyuvantes de emulsión preferentes tienen un tamaño medio de gota de < 1 µm por ejemplo, ≤ 750 nm, ≤ 500 nm, ≤ 400 nm, ≤ 300 nm, ≤ 250 nm, ≤ 220 nm, ≤ 200 nm, o menor. Estos tamaños de gota se pueden conseguirse de manera conveniente por técnicas como la microfluidización.

[0101] Los adyuvantes específicos de emulsión de aceite en agua útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a:

 Una emulsión submicrónica de escualeno, Tween 80 y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser escualeno al 5 %, polisorbato 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %. En términos de peso, estas relaciones llegan a ser escualeno al 4,3 %, polisorbato 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,48%. Este adyuvante se conoce como “MF59” [35 -37], como se describe con más detalle en el capítulo 10 de la referencia 38 y en el capítulo 12 de la referencia 39. La emulsión MF59 incluye de manera ventajosa iones citrato, por ejemplo, 10 mM de tampón citrato de sodio.

 Una emulsión de escualeno, tocoferol, y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, 1 %) y / o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0,3 a 3 % de Tween 80, y la relación en peso de escualeno: tocoferol es preferentemente ≤ 1 puesto que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden estar presentes en una relación de volumen 5:2. Esta emulsión se puede producir al disolver Tween 80 en PBS para dar una solución al 2 %, después se mezclan 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL – α – tocoferol y 5 ml de escualeno), después se microfluidiza la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotas de aceite submicrónicas, por ejemplo, con un diámetro medio de 100 y 250 nm, preferentemente 180 nm.

 Una emulsión de escualeno, tocoferol, y detergente Triton (por ejemplo, Triton X – 100). La emulsión también puede incluir 3d – MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

 Una emulsión que comprende polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), detergente Triton (por ejemplo, Triton X – 100) y tocoferol (por ejemplo, un succinato de α – tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación en masa de 75:11:10 (por ejemplo 750 µg / ml de polisorbato 80, 110 µg / ml de Triton X – 100 y 100 µg / ml de succinato de α – tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d – MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

 Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 (“Pluronic™ L121”). La emulsión se puede formular en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de distribución útil para muramil – dipéptidos, y se ha utilizado con treonil – MDP en el adyuvante “SAF – 1” [40] (0,05 – 1 % de Thr – MDP, escualano al 5 %, Pluronic L 121 al 2,5 % y polisorbato 80 al 0,2 %). También se puede utilizar sin el Thr – MDP, como en el adyuvante “AF”: [41] (escualano al 5 %, Pluronic L 121 al 1,25 % y polisorbato 80 al 0,2 %). Se prefiere la microfluidización.

 Una emulsión que comprende escualeno, disolvente acuoso, surfactante no iónico hidrófilo de polioxietileno

– alquil – éter (por ejemplo, polioxietileno éter cetoestarílico (12) y surfactante no iónico hidrófobo (por ejemplo, éster de sorbitán o éster de manida, tal como monoleato de sorbitán o “Span 80”). La emulsión es preferentemente termorreversible y / o tiene al menos un 90 % de las gotas de aceite (en volumen) con un tamaño inferior a 200 nm [42]. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltosida y / o sacarosa); y / o un alquilpoliglicósido. Estas emulsiones se pueden liofilizar.

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 Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil -Care [43]. La concentración final (en peso) de estos componentes en vacunas adyuvadas es escualeno al 5 %, poloxámero 105 (poliol plurónico) al 4 % y Abil – Care 85 al 2 % (Bis – PEG / PPG – 16 / 16 PEG / PPG – 16 / 16 dimeticona; triglicérido caprílico / cáprico).

 Una emulsión que tiene un 0,5 – 50 % de un aceite, 0,1 – 10 % de un fosfolípido, y 0,05 – 5 % de un surfactante no iónico. Como se describe en la referencia 44, los componentes preferentes de fosfolípidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños submicrónicos de gota son ventajosos.

 Una emulsión de aceite en agua submicrónica de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un surfactante (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tales como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina – lipófilo (tal como GPI – 0100, descrito en la referencia 45, producido por la adición de amina alifática en desacilsaponina mediante el grupo carboxilo de ácido glucurónico), bromuro de dimetiidioctadecilamonio y / o N, N – dioctadecil – N, N – bis (2 – hidroxietil) propanodiamina.

 Una emulsión en la que están asociados saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) como micelas helicoidales [46].

 Una emulsión que comprende aceite mineral, alcohol grado etoxilado lipófilo no iónico, y surfactante hidrófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y / o copolímero en bloque polioxietileno – polioxipropileno) [47].

 Una emulsión que comprende aceite mineral, alcohol grado etoxilado hidrófilo no iónico, y surfactante lipófilo no iónico (por ejemplo un alcohol graso etoxilado y / o copolímero en bloque polioxietileno – polioxipropileno) [47].

[0102] En algunas realizaciones, se puede mezclar una emulsión con antígeno de forma extemporánea, en el momento de la distribución, y de ese modo, el adyuvante y el antígeno se pueden mantener de forma separada en una vacuna envasada o distribuida, lista para la formulación final en el momento del uso. En otras realizaciones, una emulsión se mezcla con antígeno durante la elaboración, y de esta manera, la composición se envasa en una forma líquida con adyuvante. El antígeno estará en general en forma acuosa, de manera que la vacuna se prepara finalmente al mezclar dos líquidos. La relación en volumen de los dos líquidos para la mezcla puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero en general es de 1:1. Cuando se dan concentraciones de componentes en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son normalmente para una composición no diluida, y la concentración después de la mezcla con una solución de antígeno disminuirá de esta manera.

[0103] Cuando una composición incluye un tocoferol, se puede utilizar cualquiera de los α, β, у, δ ε o ξ tocoferoles, pero se prefieren los α – tocoferoles. El tocoferol puede adoptar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y / o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se pueden utilizar tanto D – α -tocoferol como DL – α -tocoferol. Los tocoferoles se incluyen de manera ventajosa en vacunas para su uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo, con 60 años o más) debido a que se ha mostrado que la vitamina E tiene un efecto positivo en la respuesta inmune en este grupo de pacientes [48]. También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [49]. Un α -tocoferol preferente es DL – α -tocoferol, y la sal preferente de este tocoferol es el succinato. Se ha descubierto que la sal de succinato coopera con los ligandos relacionados con el TNF in vivo.

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 30]

[0104] También se pueden utilizar formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de esterol – glicósidos y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso en flores de una amplia variedad de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol de Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también se puede obtener de forma comercial en Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculada (velo de novia), y Saponaria officianalis (raíz jabón). Las formulaciones con adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOM. El QS21 se comercializa como Stimulon™.

[0105] Las composiciones de saponina se han purificado utilizando HPLC y RP – HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas utilizando estas técnicas, que incluyen QS7, QS17, QS18, QH – A, QH – B y QH –

C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la referencia 50. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [51].

[0106] Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden utilizar para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 de la referencia 30]. Los ISCOMs incluyen también normalmente un fosfolípidos, tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede utilizar cualquier saponina

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conocida en los ISCOMs. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más QuilA, QHA y QHC. Los ISCOMs se describen adicionalmente en las referencias 51 – 53. Opcionalmente, los ISCOMs pueden estar desprovistos de detergente adicional [54].

[0107] En las referencias 55 y 56 se puede encontrar una revisión de desarrollo de adyuvantes basados en saponina.

D. Virosomas y partículas tipo virus

[0108] También se pueden utilizar virosomas y partículas tipo virus (VLPs) como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen en general una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. En general, no son patógenos, no son replicantes y en general, no contienen genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden ser producidas en forma recombinante o se aíslan a partir de virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para el uso en los virosomas o VLPs incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tal como HA o NA), virus de la hepatitis B (como proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus de Sindbis, rotavirus, virus de la enfermedad de pies y boca, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, ARN – fagos, Qβ – fago (tal como proteínas de la cubierta), GA – fago, fr – fago, fago AP205, y Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón Ty). Los VLPs se discuten adicionalmente en las referencias 57 – 62. Los virosomas se discuten adicionalmente, por ejemplo, en la referencia 63.

E. Derivados bacterianos o microbianos

[0109] Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores, toxinas ADP – ribosilantes y derivados detoxificados de los mismos.

[0110] Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil – lípido A (MPL) y MPL 3 – O – desacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de monofosforil – lípido A 3 – des – O – acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferente de “partícula pequeña” del monofosforil – lípido A 3 – des – O – acilado se describe en la referencia 64. Estas “partículas pequeñas” de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas de forma estéril a través de una membrana de 0,22 µm [64]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil – lípido A, tales como derivados de aminioalquil glucosaminida fosfato, por ejemplo RC – 529 [65, 66].

[0111] Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli, tales como OM – 174. El OM – 174 se describe por ejemplo en las referencias 67 y 68.

[0112] Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citocina no metilada unida por un enlace de fosfato a una guanosina). Los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) también han mostrado que son inmunoestimulantes.

[0113] Los CpGs pueden incluir modificaciones de nucleótidos / análogos, tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 69, 70 y 71 describen posibles sustituciones análogas por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2´ -desoxi – 7 – desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se describe adicionalmente en las referencias 72 – 77.

[0114] La secuencia CpG se puede dirigir a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [78]. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, tal como un CpG – A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como CpG – B ODN. CpG – A y CpG – B ODN se describen en las referencias 79 – 81. Preferentemente, el CpG es un CpG – A ODN.

[0115] Preferentemente, el oligonucleótido está construido de modo que el extremo 5´ es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3´ para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, las referencias 78 y 82 – 84.

[0116] Un adyuvante útil de CpG es CpG7909, también conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa, o además, al utilizar una secuencia CpG, se pueden utilizar secuencias TpG [85], y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de timidina (por ejemplo, TTTT, como se describe en la referencia 85), y / o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % de timidina (por ejemplo > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de citocina (por ejemplo, CCCC, como se describe en la referencia 85), y / o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % de citocina (por ejemplo > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Normalmente, los oligonucleótidos inmunoestimulantes comprenderán, al menos, 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

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[0117] Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC – 31™ [86]. De este modo, un adyuvante utilizado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15 – 40 nucleótidos) que incluye al menos un (y preferentemente múltiples) motivo Cpl (es decir, una citocina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5 – 20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente múltiples) secuencia(s) tripeptídica(s) de Lys – Arg – Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia 26 – mer 5´ -(IC)13-3´ (SEC ID Nº 110). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 11 – mer KLKLLLLLKLK (SEC ID Nº 111).

[0118] Se pueden utilizar toxinas bacterianas ADP – ribosilantes y derivados detoxificados de las mismas como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina “LT” térmicamente lábil de E. coli), cólera (“CT”), o pertussis (“PT”). El uso de toxinas ADP – ribosilantes detoxificadas como adyuvantes mucosos se describe en la referencia 87 y como adyuvantes parenterales en la referencia 88. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de holotoxina, que comprende tanto subunidades A como B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación detoxificante; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT detoxificado, tal como LT – K63, LT – R72, y LT – G192. El uso de toxinas ADP – ribosilantes y derivados detoxificados de las mismas, particularmente LT – K63 y LT – R72, como adyuvantes se puede encontrar en las referencias 89 – 96. Un mutante CT útil es CT – E29H [97]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de las toxinas ADP – ribosilantes descritas en la referencia 98.

F. Inmunomoduladores humanos

[0119] Los inmunomoduladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL – 1, IL – 2, IL – 4, IL – 5, IL – 6, IL – 7, IL – 12 [99], etc) [100], interferones (por ejemplo, interferón – у, factor estimulante de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferente es IL – 12.

G. Bioadhesivos y mucoadhesivos

[0120] Se pueden utilizar también bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [101] o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados de poli (ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. Se pueden utilizar también quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [102].

H. Micropartículas

[0121] Se pueden utilizar también micropartículas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula con un diámetro de ~ 100 nm a ~ 150 µm, más preferentemente de un diámetro de ~ 200 nm a ~ 30 µm, y más preferentemente un diámetro de ~ 500 nm a ~ 10 µm) formadas de materiales biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli (α – hidroxi – ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc), con poli (lactido – co – glicólido) son preferentes, opcionalmente tratadas para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (capítulos 13 y 14 de la referencia 30)

[0122] Los ejemplos de las formulaciones de liposoma adecuadas para el uso como adyuvantes se describen en las referencias 103 – 105.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

[0123] Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [106]. Estas formulaciones incluyen además surfactantes de éster de polioxietileno – sorbitán en combinación con un octoxinol [107] así como surfactantes de éster o éter de alquilo de polioxietileno en combinación con, al menos, un surfactante no iónico adicional, tal como octoxinol [108]. Los éteres de polioxietileno preferentes se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietileno – 9 – lauril (laureth 9), éter de polioxietileno – 9 – esteorilo, éter de polioxietileno – 8 – esteorilo, éter de polioxietileno – 4 – laurilo, éter de polioxietileno – 35 – laurilo, y éter de polioxietileno – 23 – laurilo.

K. Fosfacenos

[0124] Se puede utilizar un fosfaceno, tal como poli [di(carboxilatofenoxi) fosfaceno] (“PCPP”) como se describe, por ejemplo, en las referencias 109 – 110.

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L. Péptidos de muramilo

[0125] Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para el uso como adyuvantes de la invención incluyen N – acetil – muramil – L – treonil – D – isoglutamina (Thr – MDP), N – acetil – normuramil – L – alanil – D – 5 isoglutamina (nor – MDP), y N – acetilmuramil – L – alanil – D – isoglutaminil – L – alanina – 2 – (1´ -2’ – dipalmitoil

–: sn – glicero – 3 – hidroxifosforiloxi) – etilamina MTP – PE).

M.: Compuestos de imidazoquinola

[0126] Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para el uso como adyuvantes de la invención incluyen Imiquinod (“R – 837”) [111, 112], Resiquimod (“R – 848”) [113], y sus análogos; y sales de los mismos ( por ejemplo, las sales de clorhidrato). Los detalles adicionales sobre las imidazoquinolinas inmunoestimulantes se pueden encontrar en las referencias 114 a 118.

15 N. Ureas sustituidas

[0127] Las ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen compuestos de la fórmula I, II o III, o sales de los mismos:

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como se define en la referencia 119, tal como “ER 803058”, “ER 803732”, “ER 804053”, “ER 804058”, “ER 804059”,

“ER 804442”, “ER 804680”, “ER 804764”, “ER 803022” o “ER 804057” por ejemplo:

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O. Adyuvantes adicionales

[0128] Los adyuvantes adicionales que se pueden utilizar con la invención incluyen:

 Un derivado de fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como RC – 529 [120, 121].

35  Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como los descritos en la referencia 122. Los métodos para formular, elaborar y cribar compuestos activos también se describen en la referencia 122. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF – α.

 Un compuesto de triptantrina, tal como los descritos en la referencia 123. Los métodos para formular, elaborar y cribar compuestos activos también se describen en la referencia 123. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF – α.

45  Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA – 245; 7 – tia – 8 – oxoguanosina):

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y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA – 025 – 1; (d) ANA380; (e) los compuestos descritos en las referencias 124 a 126, Loxoribina (7 – alil – 8 – oxoguanosina) [127].

 Compuestos descritos en la referencia 128, que incluyen: compuestos de acilpiperazina, compuestos de

5 indoldiona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [129, 130], compuestos de hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol [131], compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina, y compuestos de benzazol [132].

 Compuestos que contienen lípidos unidos a un segmento acíclico que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 [133, 134]:

 Un polímero de polioxidonio [135, 136] u otro derivado de polietileno – piperazina N – oxidado.

15  Metil 5´ -inosina -monofosfato (“MIMP”) [137].

 Un compuesto polihidroxilado de pirrolizina [138], con la fórmula:

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donde R se selecciona del grupo formado por hidrógeno, grupos acilo, alquilo, (por ejemplo cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo, lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos, saturados o no saturados, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivados de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina – 6 – α – D – glucopiranosa, 3 – epi – casuarina, 7 – epi – casuarina, 3, 7 – diepi -casuarina, etc.

 Un ligando CD1d, tal como α – glucosilceramida [139, 146] (por ejemplo, α – galactosilceramida), α – glucosilceramidas que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S, 3S, 4R) – 1 – O – (α – D – galactopiranosil) – 2 – (N – hexacosanoilamino) – 1, 3, 4 – octadecanotriol], CRONY – 101, 3” – O – sulfo – galactosilceramida, etc.

 Una gamma – inulina [147] o derivado de la misma, tal como algammulina.

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Combinaciones de adyuvantes

[0129] La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más adyuvantes

55 identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden utilizar las siguientes composiciones de adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [148]; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [149]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL – 12 (opcionalmente + un esterol) [150]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y / o emulsiones de aceite en agua [151]; (6) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80 ™ al 0,4 %, polímero en bloque plurónico L121 al 5 %, y thr – MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitado en vórtice para generar una emulsión con tamaño de partícula mayor; (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 %, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste

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en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y un esqueleto de pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

[0130] Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de la referencia 30.

[0131] El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y / o fosfato de aluminio es particularmente preferido, y los antígenos se adsorben en general en estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferente. Otras combinaciones preferentes de adyuvantes incluyen combinaciones de adyuvantes de Th1 y Th2, tal como CpG y aluminio o resiquimod y aluminio. Se puede utilizar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

[0132] Las composiciones de la invención pueden producir tanto una respuesta inmune mediada por células así como una respuesta inmune humoral. Esta respuesta inmune inducirá preferentemente anticuerpos de duración prolongada (por ejemplo, neutralizadores) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente a la exposición de pneumococos.

[0133] En general, se piensa que son necesarios dos tipos de células T, células CD4 y CD8, para iniciar y / o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Las células T CD8 pueden expresar un co – receptor de CD8 y se refieren comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL). Las células T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos exhibidos en las moléculas MHC clase I.

[0134] Las células T CD4 pueden expresar un co – receptor de CD4 y se refieren comúnmente como células auxiliares T. Las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas MHC clase II. En la interacción con una molécula MHC clase II, las células CD4 pueden segregar factores tales como citocinas. Estas citocinas segregadas pueden activar células B, células T citotóxicas, macrófagos, y otras células que participan en una respuesta inmune. Las células T auxiliares o células CD4+ se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo TH y fenotipo TH2 que difieren en su función efectora y citocina.

[0135] Las células TH1 activadas mejoran la inmunidad celular (incluyendo un incremento en la producción de CTL específicas del antígeno) y por lo tanto, son de valor particular en la respuesta a infecciones intracelulares. Las células TH1 activadas pueden segregar uno o más IL – 2, IFN – у y TNF – β. Una respuesta inmune de TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, células NK (asesinas naturales), y células T citotóxicas CD8 (CTL). Una respuesta inmune de TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmune al estimular el crecimiento de células B y T con IL – 12. Las células B estimuladas con TH1 pueden segregar IgG2a.

[0136] Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y por lo tanto tienen valor en la respuesta a infecciones extracelulares. Las células TH2 activadas pueden segregar una o más IL – 4, IL – 5, IL – 6, e IL – 10. Una respuesta inmune de TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y células B de memoria para una protección futura.

[0137] Una respuesta inmune mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmune de TH1 mejorada y una respuesta inmune de TH2.

[0138] Una respuesta inmune de TH1 puede incluir uno o más de un incremento en CTL, un incremento en una o más citocinas asociadas con una respuesta inmune con TH1 (tal como IL – 2, IFN – у, e TNF – β), un incremento en macrófagos activados, un incremento en la actividad de NK, o un incremento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmune de TH1 mejorada incluirá un incremento en la producción de IgG2a.

[0139] Una respuesta inmune de TH1 se puede producir utilizando un adyuvante de TH1. Un adyuvante de Th1 producirá en general niveles aumentados de producción de IgG2a con respecto a la inmunización del antígeno sin el adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para el uso en la invención pueden incluir por ejemplo formulaciones de saponina, virosomas y partículas tipo virus, derivados no tóxicos de lipopolisacárido entobacteriano (LPS), y oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes TH1 preferidos para el uso en la invención.

[0140] Una respuesta inmune de TH2 puede incluir uno o más de un incremento en una o más citocinas asociadas con una respuesta inmune de TH2 (tal como IL – 4, IL – 5, IL – 6 e IL – 10), o un incremento en la producción de IgG1, IgE, IgA y células B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmune de TH2 mejorada incluirá un incremento en la producción de IgG1.

[0141] Una respuesta inmune de TH2 se puede producir utilizando un adyuvante de TH2. En general, un adyuvante de TH2 producirá niveles aumentados de produción de IgG1 con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para el uso en la invención incluyen por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite, toxinas ADP – ribosilantes y derivados detoxificados de las mismas.

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Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio son adyuvantes de TH2 preferidos para el uso en la invención.

[0142] Preferentemente, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, esta composición produce una respuesta de TH1 mejorada y de TH2 mejorada, es decir, un aumento en la producción de IgG1 y de IgG2a con respecto a la inmunización sin adyuvante. Preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y de TH2 produce una respuesta inmune de TH1 incrementada y / o de TH2 incrementada con respecto a la inmunización con un único adyuvante (es decir, con respecto a la inmunización con un adyuvante de TH1 solo o inmunización con un adyuvante de TH2 solo).

[0143] La respuesta inmune puede ser una o ambas de una respuesta inmune de TH1 y una respuesta de TH2. Preferentemente, la respuesta inmune proporciona una o ambas de una respuesta de TH1 mejorada y una respuesta de TH2 mejorada.

[0144] La respuesta inmune mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmune sistémica y de la mucosa. Preferentemente, la respuesta inmune proporciona una o ambas de una respuesta inmune sistémica mejorada y de la mucosa mejorada. Preferentemente, la respuesta inmune de la mucosa es una respuesta inmune de TH2. Preferentemente, la respuesta inmune de la mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

[0145] E. coli puede provocar enfermedad en varias localizaciones anatómicas [4] y por tanto, las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, como suspensiones o soluciones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por pulverización). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo, como ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como una pulverización o como un jarabe (opcionalmente con sabor). La composición se puede preparar para la administración pulmonar por ejemplo, como un inhalador, utilizando un polvo fino o una pulverización. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para la administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de tal forma que se reconstituye una composición combinada justo antes de la administración a un paciente. Estos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida o uno o más antígenos liofilizados.

[0146] Cuando se prepara de forma extemporánea una composición antes de su uso, (por ejemplo, cuando está presente un componente en forma liofilizada) y está presente como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa ya rellena y un vial, con el contenido de la jeringa que se utiliza para reactivar los contenidos del vial antes de la inyección.

[0147] Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígenos, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se refiere a que la administración de dicha cantidad a un individuo, ya sea en una única dosis o como parte de una serie, es eficaz en el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, edad, grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado deseado de protección, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica por parte del médico, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos rutinarios.

Métodos de tratamiento y administración de la vacuna

[0148] La invención también proporciona un método para mejorar una respuesta inmune en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención. La respuesta inmune es preferentemente protectora y comprende preferentemente anticuerpos y / o inmunidad mediada por células. El método puede mejorar una respuesta de refuerzo.

[0149] La invención también proporciona un polipéptido de la invención para el uso como un medicamento, por ejemplo, para el uso en la mejora de una respuesta inmune en un mamífero.

[0150] La invención también proporciona el uso de un polipéptido de la invención en la elaboración de un medicamento para mejorar una respuesta inmune en un mamífero.

[0151] La invención también proporciona un dispositivo de administración precargado con una composición inmunogénica de la invención.

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[0152] Al mejorar una respuesta inmune en el mamífero por estos usos y métodos, el mamífero se puede proteger contra la infección de E. coli, incluyendo cepas ExPEC y no ExPEC. La invención es particularmente útil para proporcionar una amplia protección contra E. coli, patógenos, incluyendo patotipos intestinales, tales como patotipos de EPEC, EAEC, EIEC, ETEC y DAEC. De este modo, el mamífero se puede proteger contra enfermedades que incluyen, pero no se limitan a peritonitis, pielonefritis, cistitis, endocarditis, prostatitis, infecciones del tracto urinario (UTI), meningitis (particularmente meningitis neonatal), sepsis (o SIRS), deshidratación, neumonía, diarrea (infantil, de viajero, aguda, persistente, etc), disentería bacilar, síndrome urémico hemolítico (HUS), pericarditis, bacteriuria, etc.

[0153] Las SECs ID Nº: 21, 30, 35, 40, 49, 54, 59, 68 y 73 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EAEC, y por tanto para prevenir la diarrea (aguda y crónica).

[0154] Las SECs ID Nº: 22, 28, 36, 41, 47, 55, 56, 60, 66, 74 y 75 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles para la inmunización contra el patotipo UPEC, y por tanto para prevenir UTI, incluyendo, sin limitación, pielonefritis, cistitis (aguda y recurrente), peritonitis, UTI asociado al catéter, prostatitis y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática).

[0155] Las SECs ID Nº: 23, 42 y 61 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EIEC, y por tanto para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños).

[0156] Las SECs ID Nº: 24, 27, 29, 43, 46, 48, 62, 65 y 67 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo ETEC, y por tanto para prevenir la diarrea (incluyendo diarrea del viajero e infantil).

[0157] Las SECs ID Nº: 25, 26, 33, 34, 45, 53, 63, 64 y 72 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EAEC, y por tanto para prevenir la diarrea (aguda y crónica).

[0158] Las SECs ID Nº: 79, 85, 93, y 94 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo UPEC, y por tanto para prevenir UTI, incluyendo, sin limitación, pielonefritis, cistitis (aguda y recurrente), peritonitis, UTI asociado al catéter, prostatitis y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática).

[0159] La SEC ID Nº: 80 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EIEC, y por tanto para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños).

[0160] Las SECs ID Nº: 81, 84 y 86 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo ETEC, y por tanto para prevenir la diarrea (incluyendo diarrea del viajero e infantil).

[0161] Las SECs ID Nº: 82, 83 y 91 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EPEC, y por tanto para prevenir la diarrea (incluyendo diarrea infantil).

[0162] Las SECs ID Nº: 21, 30, 35, 40, 49, 54, 59, 68 y 73 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EAEC, y por tanto para prevenir la diarrea (aguda y crónica).

[0163] Las SECs ID Nº: 22, 28, 36, 41, 47, 55, 56, 60, 66, 74 y 75 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles para la inmunización contra el patotipo UPEC, y por tanto para prevenir UTI, incluyendo, sin limitación, pielonefritis, cistitis (aguda y recurrente), peritonitis, UTI asociado al catéter, prostatitis y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática).

[0164] Las SECs ID Nº: 23, 42 y 61 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EIEC, y por tanto para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños).

[0165] Las SECs ID Nº: 24, 27, 29, 43, 46, 48, 62, 65 y 67 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo ETEC, y por tanto para prevenir la diarrea (incluyendo diarrea del viajero e infantil).

[0166] Las SECs ID Nº: 25, 26, 33, 34, 45, 53, 63, 64 y 72 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EAEC, y por tanto para prevenir la diarrea (aguda y crónica).

[0167] Las SECs ID Nº: 79, 85, 93, y 94 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo UPEC, y por tanto para prevenir UTI, incluyendo, sin limitación, pielonefritis, cistitis (aguda y recurrente), peritonitis, UTI asociado al catéter, prostatitis y bacteriuria (incluyendo bacteriuria asintomática).

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[0168] La SEC ID Nº: 80 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EIEC, y por tanto para prevenir disentería (en particular disentería bacilar) y HUS (por ejemplo, en niños).

[0169] Las SECs ID Nº: 81, 84 y 86 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo ETEC, y por tanto para prevenir la diarrea (incluyendo diarrea del viajero e infantil).

[0170] Las SECs ID Nº: 82, 83 y 91 y sus otras variantes detoxificadas son particularmente útiles en la inmunización contra el patotipo EPEC, y por tanto para prevenir la diarrea (incluyendo diarrea infantil).

[0171] El mamífero es preferentemente humano, pero puede ser por ejemplo una vaca, un cerdo, un pollo, un gato

o un perro, ya que la enfermedad de E. coli también es problemática en estas especies [4]. Cuando la vacuna tenga uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo un bebé o un niño) o un adolescente; cuando la vacuna tenga uso terapéutico, el humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos por ejemplo, para valorar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

[0172] Una forma de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico comprende el control de la infección de E. coli después de la administración de las composiciones de la invención. Una forma de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico comprende el control de las respuestas inmunes, de manera sistemática (controlando el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y / o por vía mucosa (controlando el nivel de producción de IgA), contra los antígenos en las composiciones de la invención después de la administración de la composición. Normalmente, las respuestas de anticuerpo en suero específicas de antígeno se determinan después de la inmunización pero pre – estimulación en tanto que las respuestas de antígeno de la mucosa específicas de antígeno se determinan después de la inmunización y después de la estimulación.

[0173] Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas de forma recombinante para el cribado de sueros del paciente o de la secreción en las mucosas por inmunotransferencia y / o microarrays. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha aumentado una respuesta inmune en la proteína en cuestión. Este método también se puede utilizar para identificar antígenos inmunodominantes y / o epítopos dentro de antígenos.

[0174] La eficacia de las composiciones de vacuna también se puede determinar in vivo al estimular modelos de animal de infección por E. coli, por ejemplo, cobayas o ratones, con las composiciones de vacuna. Un modelo murino de ExPEC y sepsis letal se describe en la referencia 152. En la referencia 153 se describe un modelo de rata de algodón.

[0175] Las composiciones de la invención se administrarán, en general, de forma directa a un paciente. La administración directa se puede lograr por inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, o en el espacio intersticial de un tejido), o por vía mucosa, rectal, oral (por ejemplo comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración mucosa. Las nuevas formas de administración directa también pueden incluir la expresión transgénica de los polipéptidos descritos en la presente en alimentos por ejemplo, expresión transgénica en una patata.

[0176] La invención se puede utilizar para producir inmunidad sistémica y / o mucosa, preferentemente para producir una inmunidad sistémica y / o mucosa mejorada.

[0177] Preferentemente, la inmunidad sistémica y / o mucosa mejorada se refleja en una respuesta inmune de TH1 y / o TH2 mejorada. Preferentemente, la respuesta inmune mejorada incluye un aumento en la producción de IgG1 y / o IgG2a y / o IgA.

[0178] La dosis puede ser por un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Se pueden utilizar dosis múltiples en un programa de inmunización primaria y / o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiple, se pueden administrar varias dosis por la misma o diferentes vías, por ejemplo, una sensibilización parenteral y refuerzo de la mucosa, una sensibilización de la mucosa y refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán normalmente con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 16 semanas, etc).

[0179] Las vacunas de la invención se pueden utilizar para tratar tanto a niños como adultos. De este modo, un paciente humano puede tener menos de 1 año, 1 – 5 años, 5 – 15 años, 15 – 55 años, o al menos, 55 años. Los pacientes preferentes para recibir las vacunas son los pacientes de edad avanzada (por ejemplo ≥ 50 años, ≥ 60 años, y preferentemente ≥ 65 años), jóvenes (por ejemplo, ≤ 5 años), pacientes hospitalizados, personal sanitario, militares y fuerzas armadas, mujeres embarazadas, pacientes inmunodeficientes o enfermos crónicos. Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, y sin embargo, se pueden utilizar más generalmente en una población.

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[0180] Las vacunas de la invención son particularmente útiles para pacientes que están esperando una operación quirúrgica, u otros pacientes hospitalizados. También son útiles en pacientes a los que se les pondrá un catéter. También son útiles en mujeres adolescentes (por ejemplo, 11 – 18 años) y en pacientes con infecciones crónicas del tracto urinario.

[0181] Las vacunas de la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un centro de atención sanitaria profesional o vacunación) otras vacunas por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo como una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubéola, una vacuna contra MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna contra MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna contra DTP, una vacuna contra la H. influenzae tipo b conjugada, una vacuna contra el virus de la polio inactivada, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna meningocóccica conjugada (tal como la vacuna tetravalente A – C – W135 – Y), una vacuna contra el virus sinticial respiratorio, etc.

Inmunización del ácido nucleico

[0182] Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente incluyen antígenos de polipéptido. En todos los casos, sin embargo, los antígenos de polipéptido se pueden reemplazar por ácidos nucleicos (normalmente ADN) que codifican estos polipéptidos, para dar composiciones, métodos y usos en base a la inmunización del ácido nucleico. La inmunización del ácido nucleico es ahora un campo desarrollado (por ejemplo, véanse las referencias 154 a 161 etc).

[0183] El ácido nucleico que codifica el inmunógeno se expresa in vivo después de la administración a un paciente y el inmunógeno expresado estimula el sistema inmunitario. El ingrediente activo adoptará normalmente la forma de un vector de ácido nucleico que comprende: (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica el inmunógeno unida operativamente al promotor; y opcionalmente (iii) un marcador seleccionable. Los vectores preferentes pueden comprender además (iv) un origen de replicación; y (v) un terminador de transcripción aguas abajo de y unido operativamente a (ii). En general, (i) y (v) serán eucarióticos y (iii) y (v) serán procarióticos.

[0184] Los promotores preferentes son promotores virales, por ejemplo, de citomegalovirus (CMV). El vector también puede incluir secuencias reguladoras transcripcionales (por ejemplo, potenciadores) además del promotor y que interactúan de forma funcional con el promotor. Los vectores preferentes incluyen el potenciador / promotor de CMV inmediato -temprano, y los vectores más preferentes incluyen el intrón A de CMV. El promotor está unido operativamente aguas abajo a una secuencia que codifica un inmunógeno, de manera que la expresión de la secuencia que codifica el inmunógeno está bajo el control del promotor.

[0185] Cuando se utiliza un marcador, funciona preferentemente en un huésped microbiano (por ejemplo, en una procariota, en una bacteria, en una levadura). El marcador es preferentemente un marcador seleccionable procariótico (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariótico). Por conveniencia, los marcadores típicos son genes de resistencia a antibióticos.

[0186] El vector de la invención es preferentemente un vector extracromosómico o episódico autónomamente replicante, tal como un plásmido.

[0187] El vector de la invención comprende preferentemente un origen de replicación. Se prefiere que el origen de replicación esté activo en procariotas pero no en eucariotas.

[0188] Los vectores preferentes incluyen de este modo un marcador procariótico para la selección del vector, un origen procariótico de replicación, pero un promotor eucariótico para la activación de la transcripción de la secuencia que codifica el inmunógeno. Los vectores por lo tanto se (a) amplificarán y seleccionarán en huéspedes procarióticos sin expresión del polipéptido, pero (b) se expresarán en huéspedes eucarióticos sin que se amplifiquen. Esta disposición es ideal para vectores de inmunización de ácido nucleico.

[0189] El vector de la invención puede comprender una secuencia terminadora transcripcional eucariótica aguas abajo de la secuencia codificadora. Esto puede mejorar los niveles de transcripción. Cuando la secuencia codificadora no la tiene, el vector de la invención comprende preferentemente una secuencia de poliadenilación. Una secuencia de poliadenilación preferente es una hormona del crecimiento bovina.

[0190] El vector de la invención puede comprender un sitio de clonación múltiple.

[0191] Además de las secuencias que codifican el inmunógeno y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia codificadora eucariótica. El vector también puede comprender un IRES aguas arriba de dicha segunda secuencia para permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariótico del mismo transcripto que el inmunógeno. Alternativamente, la secuencia que codifica el inmunógeno puede estar aguas abajo de un IRES.

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El vector de la invención puede comprender motivos CpG no metilados, por ejemplo, secuencias de ADN no metiladas que tienen en común una citocina que precede una guanosina, flanqueada por dos purinas 5´ y dos pirimidinas 3´. En su forma no metilada, estos motivos de ADN han demostrado que son potentes estimuladores de varios tipos de células inmunes.

[0193] Se pueden administrar vectores de manera específica. Las técnicas de administración de ADN mediadas por el receptor se describen, por ejemplo, en las referencias 162 a 167. Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico se administran en un intervalo de 100 ng a 200 mg de ADN para la administración local en un protocolo de terapia génica. Los intervalos de concentración de 500 ng a 50 mg, de 1 µg a 2 mg, de 5 µg a 500 µg, y de 20 µg a 100 µg de ADN también se pueden utilizar durante un protocolo de terapia génica. Los factores como el método de acción (por ejemplo, mejoran o inhiben los niveles del producto génico codificado) y la eficicacia de transformación y expresión son consideraciones que afectarán a la dosis requerida para la eficacia final. Cuando se desea mayor expresión en un área mayor de tejido, grandes cantidades del vector o las mismas cantidades se vuelven a administrar en un protocolo sucesivo de administraciones o varias administraciones en diferentes partes de tejidos adyacentes o próximos pueden ser necesarias para efectuar un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación rutinaria en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para el efecto terapéutico óptimo.

[0194] Se pueden administrar vectores utilizando vehículos de administración génica. El vehículo de administración génica puede ser de origen viral o no viral (véanse, en general, las referencias 168 a 171).

[0195] Los vectores basados en virus para la administración de un ácido nucleico deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos de base viral ejemplares incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (por ejemplo, las referencias 172 a 182), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus de bosque Semliki (ATCC VR – 67; ATCC VR – 1247), virus de Ross River (ATCC VR – 373; ATCC VR – 1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR – 923; ATCC VR – 1250; ATCC VR 1249; ATCC VR – 532); se pueden utilizar también híbridos y quimeras de estos virus), vectores poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, vaccinia Ankara modificado, etc), vectores de adenovirus, y vectores de virus adeno – asociados (AAV) (véanse, por ejemplo, las referencias 183 a 188). También se puede emplear la administración de ADN unido a adenovirus aniquilado [189].

[0196] Los vehículos de administración no virales y métodos también se pueden emplear, incluyendo, pero no se limitan a, ADN condensado policatiónico unido o no unido a adenovirus aniquilado solo [por ejemplo, 189], ADN unido al ligando [190], vehículos de administración de células eucarióticas [por ejemplo, las referencias 191 a 195] y la neutralización de carga nucleica o fusión con otras membranas celulares. También se puede emplear ADN desnudo. Los métodos de introducción de ADN desnudo ejemplares se describen en las referencias 196 y 197. Los liposomas (por ejemplo, inmunoliposomas) que pueden actuar como vehículos de administración génica se describen en las referencias 198 a 202. Los enfoques adicionales se describen en las referencias 203 y 204.

[0197] La administración no viral adicional adecuada para el uso incluye sistemas de administración mecánica, tales como el enfoque descrito en la referencia 204. Además, la secuencia codificadora y el producto de expresión de esta se pueden administrar a través de la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados o el uso de radiación ionizante [por ejemplo, las referencias 205 y 206]. Otros métodos convencionales para la administración génica que se pueden utilizar en la administración de la secuencia codificadora incluyen, por ejemplo, el uso de la pistola de partículas portátil de transferencia génica [207] o el uso de la radiación ionizante para activar los genes transferidos [205 y 206].

[0198] El ADN de administración que utiliza micropartículas de PLG {poli (láctido – co – glicólico)} es un método particularmente preferente por ejemplo, por adsorción a las micropartículas, que se tratan opcionalmemte para tener una superficie cargada negativamente, (por ejemplo, tratadas con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, tratadas con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Aspectos generales

[0199] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, las referencias 208 – 215, etc.

[0200] El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste” por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo, X + Y.

[0201] El término “aproximadamente” con respecto a un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10 %.

[0202] Se utiliza en la presente la numeración “GI”. Un número GI, o “GenInfo Identifier”, es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por NCBI cuando las secuencias se añaden a

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25

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55

sus bases de datos. El número GI no tiene ninguna semejanza con el número de acceso del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para la corrección o para añadir más anotación o información), entonces recibe un nuevo número GI. Por tanto, la secuencia asociada con un número GI dado nunca se cambia.

[0203] Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es igual al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se puede determinar utilizando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 216. Se determina un alineamiento preferido por el algoritmo de búsqueda de homología Smith – Waterman utilizando una búsqueda de huecos afines con penalización por abertura de hueco de 12 y penalización por extensión de hueco de 2 utilizando la matriz de puntuación de afinidad, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith – Waterman se describe en la referencia 217.

[0204] Un experto en la técnica entenderá que “aislado” significa alterado “ por la mano del hombre” de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está “aislado” cuando está en este organismo vivo, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, tal y como el término se utiliza en esta descripción. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro método de recombinación se entenderá que está “aislado” incluso si todavía está presente en dicho organismo, el organismo puede estar vivo o no vivo, excepto cuando tal transformación, manipulación genética u otro método de recombinación produce un organismo que, de otro modo, es indistinguible del organismo que se produce de forma natural.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0205]

La Figura 1 muestra un alineamiento CLUSTALW de las SEC ID Nº 2 a 16. Las regiones N – terminales que se pueden eliminar para incrementar la solubilidad mientras mantienen sustancialmente la misma inmunogenicidad se muestran en la parte inferior del alineamiento. La región N – terminal hasta el conector gly – ser o la región gly – ser se representa con “G” y la región rica en prolina se representa con “P”.

La Figura 2 muestra la entidad de aminoácidos entre pares de secuencias.

La Figura 3 muestra el análisis en gel de la proteína purificada con bandas de alto PM visibles en ausencia de DTT.

La Figura 4 muestra la membrana de Western de cepas patógenas y no patógenas de E. coli utilizando un suero anti – AcfD (orf3526). La imagen (A) es una membrana de Western del lisado celular total. La imagen

(B): es una membrana de Western del sobrenadante del cultivo. Los carriles en cada una de las imágenes

(A): y (B) de izquierda a derecha son los siguientes: Carril M – proteínas marcadoras con peso molecular en kDA de cada proteína marcadora mostrada en el lado izquierdo de la imagen (A); 1 -IHE3034; 2 -CFT073; 3 -536; 4 -BL21; 5 -MG 1655; 6 -W3110; 7 -NISSLE1917; 8 -IHE3034ΔAcfD. Como se observa en el análisis, las cepas patógenas (IHE3034, carril 1; 536, carril 3) expresan y segregan AcfD (orf3526) mientras que las cepas no patógenas (MGL 655, carril 5; W3110, carril 6; Nissle 1917, carril 7) expresan la proteína pero su secreción es defectuosa. Las cepas CFT073 (carril 2) e IHE3034ΔAcfD (carril 8) se utilizan como control negativo, ya que no contienen el gen AcfD (orf3526). La cepa BL21 (carril 4) es una cepa de laboratorio utilizada como control positivo, ya que expresa y segrega AcfD (orf3526).

La Figura 5 muestra una comparación de la solubilidad de la proteína AcfD (orf3526) y varios fragmentos de la proteína. La imagen (A) es un gel gradiente de SDS – PAGE (tampón MOPS al 4 – 12 %) de muestras a 37 ºC que compara el pellet (carril izquierda para cada proteína o fragmento) con el sobrenadante (carril derecha para cada proteína o fragmento). Los carriles de izquierda a derecha son: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 KDa, 97 KDa y 64 KDa), bacterias de control transformadas con el vector de expresión pET sin inserción, expresión bacteriana de 3526 (etiqueta his, péptido líder suprimido), expresión bacteriana de L3526 (etiqueta his, longitud completa), expresión bacteriana de L3526 – 2 finalizadora (longitud completa con un codón finalizador antes de la etiqueta His), expresión bacteriana de Δ3526 (etiqueta His, supresión del N – terminal AcfD (orf3526) en el conector flexible de glicina – serina), y la expresión bacteriana de ΔP3526 (etiqueta his + supresión del N – terminal de AcfD (orf3526) a través de la región rica en prolina). La imagen (B) es un gel gradiente de SDS – PAGE (tampón MOPS al 4 – 12 %) de muestras a 25 ºC que siguen el mismo orden que los carriles de la imagen (A).

La Figura 6 muestra una comparación de la expresión y purificación de la proteína AcfD (orf3526) y varios fragmentos de la proteína. La imagen (A) es un gel de SDS – PAGE (tampón MOPS al 12 %) de muestras de bacterias que expresan 3526 (etiqueta his, péptido líder suprimido), cultivadas a 25 ºC que comparan

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fracciones de varias etapas de la purificación. Los carriles de izquierda a derecha son: M: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 KDa, 97 KDa y 64 KDa), TOT: lisado bacteriano total, INS: fracción insoluble de lisado bacteriano, SM: fracción soluble de lisado bacteriano, FT: flujo a través de columna de níquel; E1, E2 y E3 tres eluciones con tampón de imidazol de 500 mM. La imagen (B) muestra 5 un gel SDS – PAGE (tampón MOPS al 12 %) de muestras de bacterias que expresan ΔG3526 (etiqueta his, supresión del N – terminal de AcfD (orf3526) en el conector flexible de glicina – serina) cultivadas a 25 ºC que comparan fracciones de varias etapas de la purificación. Los carriles de izquierda a derecha son: M: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 KDa, 97 KDa y 64 KDa), TOT: lisado bacteriano total, INS: fracción insoluble de lisado bacteriano, SM: fracción soluble de lisado bacteriano, FT: flujo a través de columna de níquel; E1, E2 y E3 tres eluciones con tampón de imidazol de 500 mM. La imagen (C) es un gel SDS – PAGE (tampón MOPS al 12 %) de muestras de bacterias que expresan ΔP3526 (etiqueta his, supresión del N – terminal de AcfD (orf3526) a través de la región rica en prolina), cultivadas a 25 ºC que comparan fracciones de varias etapas de la purificación. Los carriles de izquierda a derecha son: M: marcadores de peso molecular (se marcan las bandas 191 KDa, 97 KDa y 64 KDa), TOT: lisado bacteriano

La Figura 7 muestra la entidad de aminoácidos entre pares adicionales de secuencias. Se descubrió que dieciséis E. coli enterohemorrágicas (EHEC) no tienen el gen AcfD (orf3526) (no se muestra). Las secuencias (donde se representan) de izquierda a derecha o de arriba a abajo son las siguientes: 10 cepas no patógenas o comensales (1: cepa comensal de E. coli, 2: cepa DH10B, 3: cepa MG1655, 4: cepa W3110 (SEC ID Nº 14); 5: cepa HS (SEC ID Nº 13); 9: otra cepa comensal de E. coli; y 10: otra cepa comensal de

E. coli); tres cepas NMEC (1: cepa NMEC RS218; 2: cepa NMEC IHE3034 (SEC ID Nº 2); y 3: cepa NMEC S88 (SEC ID Nº 141)); una cepa APEC (1: cepa APECO1); seis cepas UPEC (2: cepa UPEC 536 (SEC ID

25 Nº 4); 3: UTI89; 4: cepa UPEC F11 (SEC ID Nº 10); 5: cepa UPEC IAI39 (SEC ID Nº 133); y 6: cepa UPEC UMN026 (SEC ID Nº 137)); tres cepas EAEC (1: cepa EAEC 101 – 1 (SEC ID Nº 3); 2: cepa EAEC 042 (SEC ID Nº 12; y 3: cepa EAEC 55989 (SEC ID Nº 129)); una cepa EIEC (1: cepa EIEC 53638 (SEC ID Nº 5)); cuatro cepas EPEC (2: cepa EPEC E22 (SEC ID Nº 8)); 3: cepa EPEC E2348 / 69 (SEC ID Nº 16); y 4: cepa EPEC E110019 (SEC ID Nº 7)); tres cepas ETEC (1: cepa ETEC B7A (SEC ID Nº 6); 2: cepa ETEC E24377A (SEC ID Nº 9); y 3: cepa ETEC H10407 (SEC ID Nº 11)); y una cepa resistente a antibióticos (1: cepa resistente a antibióticos SECEC (SEC ID Nº 15)).

La Figura 8 muestra los motivos de secuencia identificados en AcfD (orf3526) incluidos de izquierda a derecha: un motivo de lipidación; una región rica en prolina, un motivo WxxxE, un motivo de unión a zinc, y

35 un dominio RGD.

La Figura 9 muestra las relaciones familiares de varias zinc metaloproteasas. Las zinquinas se resaltan con un cuadro gris puesto que el motivo zinquina es el motivo encontrado en AcfD (orf3526) (véase la Figura 8).

La Figura 10 muestra un SDS – PAGE (gradiente al 4 – 12 %, Bis – Tris) de la expresión de orf3526C. Los carriles están marcados a través de la parte superior de la siguiente manera: (1) lisado celular total sin IPTG, 6 horas a 25 ºC; (2) lisado celular total – IPTG 1 mM, 3 horas a 25 ºC; (3) lisado celular total – IPTG 1 mM, 6 horas a 25 ºC; (M) marcadores (se indican los tamaños en KDa en el lado izquierdo del gel); (4) fracción soluble después del tratamiento con ultrasonidos IPTG 1 mM, 3 horas a 25 ºC; y (5) fracción

45 soluble después del tratamiento con ultrasonidos IPTG 1 mM, 6 horas a 25 ºC.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO SECUENCIAL

[0206]

55

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SEC ID: Descripción

SECs ID Nº 1 – 19 = secuencias de aminoácidos de longitud completa

1: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC IHE3034

2: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587)

3: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC 536 (GI: 110643204)

4: Secuencia de aminoácidos de la cepa EIEC 53638 (GI: 75515237)

5: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC B7A (GI: 75227618)

6: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E110019 (GI: 75239450)

7: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E22 (GI: 75259912)

8: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC E24377A (GI: 157156747)

9: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC F11 (GI: 75241179)

10: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC H10407

11: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 042

12: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal HS (GI: 157162442)

13: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal W3110 (GI: 89109748)

14: Secuencia de aminoácidos de la cepa resistente a antibióticos SECEC

15: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E2348/69

16: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 55989

17: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC IAI39

18: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC UMN026

19: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC S88

SECs ID Nº 20 – 38 = secuencias de aminoácidos de deleción C -terminal

20: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC IHE3034 con deleción C -terminal

21: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC (GI: 83587587) con deleción C – terminal

22: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC 536 (GI: 110643204) con deleción C – terminal

23: Secuencia de aminoácidos de la cepa EIEC 53638 (GI: 75515237) con deleción C – terminal

24: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con deleción C – terminal

25: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) con deleción C – terminal

26: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con deleción C -terminal

27: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con deleción C – terminal

28: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC F11 (GI: 75241179) con deleción C – terminal

29: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC H10407 con deleción C – terminal

30: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC O42 con deleción C – terminal

31: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal HS (GI: 157162442) con deleción C – terminal

32: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal W3110 (GI: 89109748) con deleción C – terminal

33: Secuencia de aminoácidos de la cepa resistente a antibióticos SECEC con deleción C – terminal

34: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E2348/69 con deleción C – terminal

35: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 55989 con deleción C – terminal

36: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC IAI39 con deleción C – terminal

37: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC UMN026 con deleción C – terminal

38: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC S88 con deleción C -terminal

SECs ID Nº 39 – 57 = secuencias de aminoácidos de deleción N -terminal

39: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC IHE3034 con deleción N -terminal

40: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) con deleción N -terminal

41: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC 536 (GI: 110643204 con deleción N – terminal

42: Secuencia de aminoácidos de la cepa EIEC 53638 (GI: 75515237) con deleción N – terminal

43: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con deleción N – terminal

44: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) con deleción N – terminal

45: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con deleción N – terminal

46: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con deleción N -terminal

47: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC F11 (GI: 75241179) con deleción N – terminal

48: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC H10407 con deleción N – terminal

49: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC O42 con deleción N – terminal

50: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal HS (GI: 157162442) con deleción N – terminal

51: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal W3110 (GI: 89109748) con deleción N – terminal

52: Secuencia de aminoácidos de la cepa resistente a antibióticos SECEC con deleción N – terminal

53: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E2348/69 con deleción N – terminal

54: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 55989 con deleción N -terminal

55: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC IAI39 con deleción N – terminal

56: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC UMN026 con deleción N – terminal

57: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC S88 con deleción N -terminal

SECs ID Nº 58 – 76 = secuencias de aminoácidos de mutación puntual E1305A

58: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC IHE3034 con una mutación puntual E1305A

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59: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) con una mutación puntual E1305A

60: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC 536 (GI: 110643204 con una mutación puntual E1305A

61: Secuencia de aminoácidos de la cepa EIEC 53638 (GI: 75515237) con una mutación puntual E1305A

62: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con una mutación puntual E1305A

63: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) con una mutación puntual E1305A

64: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con una mutación puntual E1305A

65: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con una mutación puntual E1305A

66: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC F11 (GI: 75241179) con una mutación puntual E1305A

67: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC H10407 con una mutación puntual E1305A

68: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC O42 con una mutación puntual E1305A

69: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal HS (GI: 157162442) con una mutación puntual E1305A

70: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal W3110 (GI: 89109748) con una mutación puntual E1305A

71: Secuencia de aminoácidos de la cepa resistente a antibióticos SECEC con una mutación puntual E1305A

72: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E2348/69 con una mutación puntual E1305A

73: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 55989 con una mutación puntual E1305A

74: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC IAI39 con una mutación puntual E1305A

75: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC UMN026 con una mutación puntual E1305A

76: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC S88 con una mutación puntual E1305A

SECs ID Nº 77– 95 = secuencias de aminoácidos del fragmento orf3526C

77: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC IHE3034 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

78: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 101-1 (GI: 83587587) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

79: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC 536 (GI: 110643204 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

80: Secuencia de aminoácidos de la cepa EIEC 53638 (GI: 75515237) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

81: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC B7A (GI: 75227618) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

82: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E110019 (GI: 75239450) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

83: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E22 (GI: 75259912) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

84: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC E24377A (GI: 157156747) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

85: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC F11 (GI: 75241179) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

86: Secuencia de aminoácidos de la cepa ETEC H10407 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

87: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC O42 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

88: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal HS (GI: 157162442) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

89: Secuencia de aminoácidos de la cepa comensal W3110 (GI: 89109748) con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

90: Secuencia de aminoácidos de la cepa resistente a antibióticos SECEC con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

91: Secuencia de aminoácidos de la cepa EPEC E2348/69 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

92: Secuencia de aminoácidos de la cepa EAEC 55989 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

93: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC IAI39 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

94: Secuencia de aminoácidos de la cepa UPEC UMN026 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

95: Secuencia de aminoácidos de la cepa NMEC S88 con región ΔG N – terminal y la parte C – terminal que incluye el motivo de unión a zinc suprimido

96 / 97: Motivos de unión a zinc

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98 – 109: Cebadores

110 -111: Secuencias IC31

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

[0207] Uno de los antígenos descritos en la referencia 5 se anota como accesorio del precursor del factor de 5 colonización D (AcfD) (orf3526) (SEC ID Nº 2 de aminoácidos de la presente) de la cepa NMEC IHE3034. Esta proteína se ha expresado y purificado, y confiere protección contra cepas ExPEC en un modelo de sepsis animal.

[0208] Se obtuvieron secuencias para los ortólogos en otras cepas de E. coli. Las secuencias de aminoácidos observadas en IHE3034 también se vieron en las cepas APECO1 y UTI89, pero se encontraron 14 secuencias extra 10 (SECs ID Nº 3 a 16). La Figura 1 muestra un alineamiento de SECs ID Nº 2 a 16.

[0209] Se conservaron al 100 % 30 aminoácidos N – terminales, y estos incluyen el péptido señal (aa 1 – 23) y la cisteína N – terminal de la lipoproteína nativa.

15 [0210] Algunas cepas tienen una mutación del marco de lectura en el gen AcfD (orf3526), que da como resultado la no expresión del polipéptido. El gen acfD estuvo totalmente ausente en las cepas CFT073, EDL933, Sakai y B171.

[0211] La Figura 2 muestra el % de identidad entre las secuencias de aminoácidos. Las etiquetas son SECs ID Nº, excepto para MG1655, RS218, DH10B, APECO1 y UTI89 donde se utiliza el nombre de la cepa. El nivel más bajo20 de identidad (marcado en cuadro en la Figura 2) fue del 85,9 %, entre las SECs ID Nº 2 y 4 (ambas cepas ExPEC).

Ejemplo 1. Inmunogenicidad de AcfD (orf3526) de longitud completa

[0212] La secuencia AcfD (orf3526) de la cepa IHE3034 se clonó y se expresó en un plásmido como una proteína

25 etiquetada con His recombinante sin un péptido líder en un huésped de E. coli. La proteína se purificó y analizó. La filtración en gel mostró un peso molecular mucho mayor que el predicho basándose solo en la secuencia de aminoácidos. El análisis en gel en ausencia de DTT, pero no en su presencia, muestra formas de mayor peso molecular de la proteína (Figura 3). Por tanto, es probable que la proteína forme oligómeros.

30 [0213] Se utilizaron sueros formulados contra AcfD (orf3526) en transferencias Western contra lisados celulares totales (Figura 4A)) o sobrenadantes de cultivo precipitados con TCA al 60 % (Figura 4(B)). Los sueros reconocieron una proteína de ~ 150 KDa en los lisados de cepas tanto patógenas como comensales. No reaccionan con esta banda en lisados de CFT073 o de un mutante knockout de IHE3034. La reactividad con estas proteínas en los sobrenadantes indica que la proteína se puede segregar.

35 [0214] Se inmunizaron subcutáneamente ratones CD1 (5 semanas de edad) utilizando 20 µg del antígeno más el adyuvante de Freund (u otro adyuvante como se indica a continuación). Los ratones se inocularon en 0, 21 y 35 días. Catorce días después de la tercera inoculación, los ratones se estimularon con una dosis letal (LD80) de una cepa patógena de E. coli. La sangre se recogió de la cola 24 horas después de la estimulación para evaluar la

40 bacteremia. La mortalidad se controló durante cuatro días después del estímulo. La proporción de protección se puede calcular como (% muertes en grupo de control (sin inmunización -% muertes en grupo experimental (inmunizados)) / % muertes en grupo de control x 100.

TABLA 1

45

Candidatos: Modelo de sepsis animal

Supervivencia con vacunación (%): Supervivencia sin vacunación (%) Valor P

20 µg 3526 / aluminio: 64 / 78 (82) 9 / 80 (11) 0,0001

[0215] De este modo, el precurso AcfD (orf3526) es un candidato eficaz para el uso como vacuna o componente de vacuna.

50 [0216] Para demostrar adicionalmente la utilidad del precursor AcfD (orf3526) como candidato para una vacuna o un componente de vacuna, el precursor AcfD (orf3526) se probó por su capacidad para proporcionar protección cruzada contra otras cepas patógenas de E. coli utilizando el modelo de sepsis animal como se indica anteriormente. Los resultados de estas pruebas se indican en la Tabla 2 a continuación (con los resultados de la Tabla 1 incluidos para fines de comparación).

55

imagen33

TABLA 2

20 µg 3526 / aluminio, cepa de estímulo (porcentaje: Modelo de sepsis animal

de identidad en IHE3024): Supervivencia con vacunación (%) Supervivencia sin vacunación (%) Valor P

IHE3024 (100): 64 / 78 (82) 9/80 (11) 0,0001

9855 / 93 (87): 9/16 (56) 4/15 (26) 0,14

BK658 (98): 4/8 (50) 1/8 (12,5) 0,28

B616 (100C): 6/8 (78) 0/8 (0) 0,007

536 (86): 6/7 (85) 3/8 (37,5) 0,11

[0217] Por tanto, el precursor AcfD (orf3526) es un candidato eficaz para el uso como vacuna o componente de

5 vacuna no solo contra la cepa de la que se derivó la proteína, sino también contra proteínas relacionadas, aumentando de este modo la utilidad. En base a la similitud entre la respuesta al precursor AcfD (orf3526) y la respuesta a los tres fragmentos inmunógenos probados a continuación (3526A, 3526B, y 3526C), se esperaría que estos tres fragmentos proporcionen también protección cruzada similar.

10 Ejemplo 2. Fragmentos de AcfD (orf3526) con solubilidad aumentada

[0218] De forma inesperada, la proteína AcfD (orf3526) mostró baja solubilidad a pesar de que la proteína es una proteína segregada. Como se muestra en la Figura 5(B), la supresión del N – terminal de AcfD (orf3526) a través del conector gly – ser o región gly – ser incrementó de manera significativa la solubilidad cuando se expresó a 25 ºC

15 (véase, pK1 – ΔG3526, Figura 5B)). De manera similar, la supresión del N – terminal de AcfD (orf3526) a través de la región rica en prolina aumentó de manera significativa la solubilidad cuando se expresó a 25 ºC (véase pK1 – ΔP3526, Figura 5(B)).

[0219] Para confirmar que los dos fragmentos tienen sustancialmente la misma inmunogenicidad que la AcfD

20 (orf3526) de longitud completa, se purificaron los fragmentos. Los fragmentos purificados se utilizaron en tres experimentos de inmunización en ratones, con adyuvante completo de Freund. A continuación, los ratones inmunizados se estimularon con una dosis subletal de E. coli. La inmunización con AcfD (orf3526) con el N – terminal a través del conector gly – ser o región gly – ser suprimida protegió de la muerte al 100 % de los ratones, ya que la muerte ocurrió en el 90 % de los animales en el grupo de control sin inmunizar. La inmunización con AcfD

25 (orf3526) con el N – terminal hasta la región rica en prolina suprimida protegió de la muerte al 90 % de los ratones, ya que la muerte ocurrió en el 90 % de los animales en el grupo de control sin inmunizar.

Expresión y purificación

30 [0220] Las bacterias con uno de los tres constructos que expresan variantes etiquetadas con his de AcfD (orf3526) se cultivaron en 30 ml de medio y se indujeron para expresar la variante de AcfD (orf3526) a 25 ºC AcfD (orf3526) sin el péptido líder (3526), AcfD (orf3526) con el N – terminal suprimido a través del conector gly – ser o región gly – ser (ΔG3526), y AcfD (orf3526) con el N – terminal suprimido a través de la región rica en prolina (ΔP3526). Las bacterias se recogieron y se lisaron por tratamiento con ultrasonidos. Las fracciones solubles se aislaron y se

35 cargaron en una columna IMAC. La columna se lavó tres veces con 20 mM de tampón imidazol. Las variantes AcfD (orf3526) se eluyeron con tres lavados de 500 mM de tampón imidazol. Como se muestra en la Figura 6, la supresión del N – terminal de AcfD (orf3526) a través del conector gly – ser o región gly – ser aumentó de manera significativa la solubilidad y el rendimiento de la proteína purificada. El rendimiento obtenido se estimó por el ensayo de Bradford de la siguiente manera: 0,18 mg de 3526 y 2,4 mg de ΔG3526.

40

Ejemplo 3. Mutantes de AcfD (orf3526) con toxicidad reducida

[0221] Se identificó un motivo de unión a zinc en la proteína AcfD (orf3526) (véase la Figura 8). El motivo de zinc – metaloproteasa de zinquina también se encuentra en StcE (proteasa segregada del inhibidor de la esterasa C1 de

45 EHEC) que es una proteína segregada por EHEC que está implicada en la patogénesis de dicha E. coli.

StcE HEVGHNYGLGH (SEC ID Nº 96) AcfD (orf3526) HEVGHNAAETP (SEC ID Nº 97)

50 [0222] Dado que este motivo está conservado en todas las variantes de AcfD (orf3526) y EHEC fue el único patotipo en el cual no se identificó AcfD (orf3526), se supuso que AcfD (orf3526) de manera similar en una zinc – metaloproteasa implicada en la patogenia de los patotipos de E. coli en los que se expresa y se segrega. Por tanto, se busca la inactivación de la toxicidad de AcfD (orf3526). Un experto en la técnica no tendrá dificultad en modificar AcfD (orf3526) para inactivar la metaloproteasa. Puesto que el residuo Glu del motivo es conocido por ser el más

55 importante en la actividad catalítica mientras que los dos residuos His coordinan el Zinc, el Glu se mutó a Ala como una mutación ejemplar que inactiva la actividad de la metaloproteasa – SECs ID Nº 58 – 76 (Véase, por ejemplo, Microbiology and Molecular Biology Reviews, septiembre de 1998, págs 597 – 635, vol 62, Nº 3). Además, se diseñaron dos variantes adicionales detoxificadas: una con el C – terminal suprimido – SECs ID Nº 20 – 38, y una con el N – terminal suprimido – SECs ID Nº 39 – 57.

imagen34

5 Prueba de toxicidad in vitro de AcfD (orf3526) de longitud completa

[0223] Se probaron dos líneas celulares diferentes por su capacidad para valorar la toxicidad de la proteína AcfD (orf3526): células endoteliales de médula ósea humana (HEMEC) y células de ovario de hámster chino (células CHO). Para HEMEC, el efecto de aumentar las dosis de la proteína AcfD (orf3526) (0,1 µg / ml, 1 µg / ml, y 10 µg / ml) se comparó a TNF – α (como control positivo). Las células tratadas con TNF – α mostraron un promedio de muerte celular de ~ 22,5 % (promedio de tres experimentos) ya que la dosis más alta de la proteína AcfD (orf3526) mostró solo un promedio de muerte celular de ~ 5 % (promedio de tres experimentos) en comparación con el control negativo que mostró solo un promedio de muerte celular de ~ 2,5 % (promedio de tres experimentos). Para células CHO, el efecto de aumentar las dosis de proteína de AcfD (orf3526) (0,1 µg / ml, 1 µg / ml, y 10 µg / ml) se comparó

15 a TNF – α (como control positivo) al medir el cambio en la diferencia potencial con el paso del tiempo debido a la alteración del citoesqueleto de las células CHO. En el nivel más alto de la prueba de la proteína AcfD (orf3526), se detectó una disminución significativa después de 46 horas, pero la disminución en la respuesta en TNF – α fue notablemente mayor.

[0224] Por lo tanto, puesto que no se ha identificado una prueba preferente para la toxicidad con una señal fuerte, los fragmentos identificados a continuación aún tienen utilidad significativa. Como se analizó anteriormente, estos tres fragmentos deben proporcionar un grado similar de protección cruzada al igual que la versión de longitud completa probada anteriormente. Adicionalmente, el comensal de E. coli es una cepa preferente para la expresión de la proteína AcfD (orf3526). Sin embargo, como se indica en la Figura 4, el comensal de E. coli expresa una

25 versión de la proteína AcfD (orf3526), pero no segrega la proteína. De esta modo, la expresión de un fragmento de una proteína AcfD (orf3526) tiene la ventaja de permitir la separación del fragmento de la proteína AcfD (orf3526) endógena en base a la diferencia y tamaño sin necesidad de una etiqueta de purificación por afinidad.

Clonación y expresión 3526A y 3526B

[0225] Se obtuvieron mutantes utilizando el sistema de mutagénesis dirigida al sitio de GeneTailor (Invitrogen). Los genes se clonaron en los vectores pET – 21b (Novagen) y se transformaron en células químicamente competentes DH5α – T1 para la propagación (Invitrogen). Se utilizaron para la expresión células químicamente competentes BL21 (DE3). Todos los candidatos se clonaron y se expresaron sin la secuencia de señal y como proteínas de fusión de

35 etiqueta his, siendo purificadas por cromatografía de afinidad.

Cebadores utilizados para la amplificación de fragmentos (columna final es SEC ID Nº):

[0226]

3526A: 3526F GGAATTCCATATGTGTGATGGTGGTGGTTCA NdeI 98

3526AR: CCGCTCGAGGTTGTTCACCACCGATTT XhoI 99

3526B: 3526BF GGAATTCCATATGGATCCGCAAGGGTATCC NdeI 100

3526R: CCGCTCGAGCTCGGCAGACATCTTATG XhoI 101

Cebadores utilizados para la mutación:

45 [0227]

Muestra: Nombre oligo Secuencia de nucleótidos (5’ -3’)

3526E1305A: 3526GTF1 ACGACTGGCTGATTTGGCACGCAGTCGGTCATA 102

3526GTR1: GTGCCAAATCAGCCAGTCGTTCAGCGGCGT 103

Inmunogenicidad – 3526 y 3526B

[0228] Para confirmar que los dos fragmentos y la mutación puntual tienen sustancialmente la misma inmunogenicidad que la AcfD (orf3526) de longitud completa, se purificaron dos fragmentos. Los fragmentos purificados se utilizaron en tres experimentos de inmunización en ratones, con adyuvante completo de Freund. Los ratones inmunizados se estimularon con una dosis letal de E. coli. Los resultados de la estimulación se muestran en

55 la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3

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Candidatos: Modelo de sepsis animal

Supervivencia vacunación (%): con Supervivencia sin vacunación (%) Valor P

3526A (AcfD – deleción C – terminal): 7/8 (87,5) 1/8 (12,5) 0,01

3526B (AcfD – deleción N – terminal): 6/8 (75) 1/8 (12,5) 0,04

Clonación y expresión – ΔG3526C

[0229] Como confirmación adicional, se diseñó un constructo que combinó la deleción N – terminal de ΔG3526 que 5 mejoró la solubilidad con la deleción del C – terminal a través del motivo de zinc (ΔG3526C). Los constructos ejemplares se proporcionan como SECs ID Nº 77 a 95.

[0230] Un vector de expresión no etiquetado con his para el constructo ΔG3526C (cepa E. coli IHE3034 – SEC ID Nº 77) se obtuvo por PCR utilizando cebadores indicados a continuación (ΔG3526A / C_For y ΔG3526C_NatRev). El

10 fragmento purificado por PCR se digirió con NdeI y XhoI, se ligó en un vector pET – 24b (+) (Novagen) y se transformó en células clínicamente competentes DH5α – T1 para la propagación (Invitrogen). Para la expresión se utilizaron células químicamente competentes BL21 (DE3).

[0231] Un vector de expresión etiquetado con his para el constructo ΔG3526C (cepa E. coli IHE3034 – SEC ID Nº

15 77) se obtuvo utilizando extensión de cebador incompleta de polimerasa (PIPE) utilizando cebadores indicados a continuación (ΔG3526A / C_For y ΔG3526C_Nat para I – PCR y p – pet1 y pet3 para V – PCR del vector pET – 21b (Novagen)). El vector de expresión se transformó en células clínicamente competentes DH5α – T1 para la propagación (Invitrogen). Para la expresión se utilizaron células químicamente competentes BL21 (DE3).

20 [0232] La versión etiquetada con his de ΔG3526C se expresó (véase, por ejemplo, la Figura 10) sin la secuencia de señal y se purificó por cromatografía de afinidad en base a la etiqueta de his.

Cebadores utilizados para la amplificación del fragmento no marcado con his (SECs ID Nº 104 y 105)

25 [0233]

ΔG3526C: ΔG3526A / C_For (Ndel) gaaggagatatacatatgGATACGCCGTCTGTAGATTCTGG

ΔG3526C_NatRev (Xhol): gtggtggtgctcgagTTACCAAATCAGCCAGTCGTTCAGC

Cebadores utilizados para la amplificación del fragmento marcado con his (I – PCR): SECs ID Nº 106 y 107

30 [0234]

ΔG3526C: ΔG3526A / C_For (Ndel) gaaggagatatacatatgGATACGCCGTCTGTAGATTCTGG

ΔG3526C_NatRev (Xhol): gtggtggtgctcgagCCAAATCAGCCAGTCGTTCAGC

Cebadores utilizados para la amplificación del vector de expresión (V – PCR): SECs ID Nº 108 y 109

[0235]

pET-21b: p-pet1 catatgatatctccttcttaaagTTAAACAAAATTATTTCTAG

p-pet3: CTCGAGCACCACCACCAC

Inmunogenicidad -ΔG3526C

40 [0236] Para confirmar que el fragmento adicional tiene sustancialmente la misma inmunogenicidad que la AcfD (orf3536) de longitud completa, se purificó el fragmento. El fragmento purificado se probó de la siguiente manera. Se inmunizaron dos grupos de 8 ratones CD1 (4 semanas de edad) por vía subcutánea con tres dosis del antígeno ΔG3526C (2 µg o 20 µg), formuladas en aluminio en los días 0, 31 y 35. 14 días de la última inmunización, se

45 infectaron ratones (11 semanas de edad) por vía intraperitoneal con la cepa patógena de E. coli IHE3034. Se recogió sangre de la cola después de 24 horas para evaluar la bacteremia. Se controló la mortalidad durante 4 días después de la infección. La protección se calculó como el % de supervivencia en el día 4 y se llevó a cabo el análisis estadístico por el test exacto de Fisher. Los resultados de la estimulación se muestran en la Tabla 4.

50

imagen36

TABLA 4

Candidato:: Modelo de sepsis animal

ΔG3526C: Supervivencia vacunación (%) con Supervivencia sin vacunación (%) Valor P

2 µg / aluminio: 13/16 (81) 0/7 (0) 0,0005

20 µg / aluminio: 15/16 (93) 0/7 (0) 0,0001

5 Inmunogenicidad cruzada de cepas -ΔG3526C

[0237] Para confirmar adicionalmente la utilidad del fragmento adicional proporcionando protección contra múltiples cepas, el fragmento purificado se probó adicionalmente de la siguiente manera. Se inmunizaron ratones CD1 (4 semanas de edad) por vía subcutánea con tres dosis del antígeno ΔG3526C (10 µg o 20 µg), formuladas en

10 aluminio en los días 0, 31 y 35. 14 días de la última inmunización, se infectaron ratones (11 semanas de edad) por vía intraperitoneal con la cepa patógena de E. coli IHE3034 como se indica en la Tabla 5. Se recogió sangre de la cola después de 24 horas para evaluar la bacteremia. Se controló la mortalidad durante 4 días después de la infección. La protección se calculó como el % de supervivencia en el día 4 y se llevó a cabo el análisis estadístico por el test exacto de Fisher. Los resultados de la estimulación se muestran a continuación en la Tabla 5.

15

TABLA 5

Cepa de estímulo: ΔG3526C candidato con aluminio

(dosis infecciosa): 20 µg / aluminio 10 µg / aluminio

IHE3034 (1 x 107 CFU): Supervivencia: 15/16 (93%) PE: 93% Supervivencia: 6/8 (75%) PE: 75%

536 (1 x 107 CFU i.v.): Supervivencia: 5/8 (62,5%) PE: 50% Supervivencia: 6/8 (75%) PE: 66%

9855/93 (1 x 107 CFU): Supervivencia: 23/47 (49%) PE: 39%

B616 (2.5 x 107 CFU): Supervivencia: 6/8 (75%) PE: 66% Supervivencia: 22/24 (91%) PE: 87%

UR41/S (2.5 x 107 CFU): Supervivencia: 4/8 (50%) PE: 50%

UR40/R (5 x 106 CFU): Supervivencia: 5/8 (62,5%) PE: 62.5% %

IN22/R (1 x 107 CFU): Supervivencia: 7/8 (87,5%) PE: 80%

20 REFERENCIAS (los contenidos se incorporan en la presente en su totalidad)

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Claims

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Reivindicaciones

1.

Un polipéptido inmunogénico que comprende un polipéptido AcfD (orf 3526) de E. coli que comprende una mutación con respecto a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli que disminuye la toxicidad del polipéptido inmunogénico en comparación a la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli, en el que la mutación se selecciona de una deleción completa o parte de un dominio de zinquina metaloproteasa y una mutación puntual en el dominio de la zinquina metaloproteasa que reduce la actividad de la proteasa y en el que polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmunitaria sustancialmente similare en un sujeto como la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli.
2.

El polipéptido inmunogénico según la reivindicación 1, en el que la proteína AcfD (orf 3526) de E. coli tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SECs ID Nº 1 – 19.
3.

El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 2, en el que la mutación puntual es una mutación de un residuo de unión a zinc o una mutación de un residuo catalítico.
4.

El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 3, en el que el residuo de unión a zinc es el aminoácido número 1305 en base al alineamiento con la SEC ID Nº 1.
5.

El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 4, en el que el polipéptido inmunogénico no comprende, al menos, los últimos 100 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 200 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de

E. coli, al menos, los últimos 300 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 400 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 500 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 600 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 700 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los últimos 750 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los últimos 758 aminoácidos C – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli o no comprende, al menos, los primeros 100 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 200 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 300 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 400 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 500 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 600 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 700 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 750 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos los primeros, 760 aminoácidos N – terminales de la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.
6.

El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 4, en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a)

la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo entre las SECs ID Nº 20 a 38, 58 a 76 y 77 a 95;

(b)

de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácidos en comparación con las SECs ID Nº 20 a 38, 58 a 76 y 77 a 95;

(c)

al menos el 85 % de identidad de secuencia de cualquiera de las SECs ID Nº 20 a 38, 58 a 76 y 77 a 95; o

(d)

cuando se alinea con cualquiera de las SECs ID Nº 20 a 38, 58 a 76 y 77 a 95 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde N – terminal a C – terminal tiene al menos xy aminoácidos alineados idénticos, donde x es 30; e y es 0,75. en el que el fragmento de polipéptido inmunogénico mejora una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.
7.

El polipéptido inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6, en el que el polipéptido inmunogénico contiene además una deleción con respecto a la proteína AcfD (orf3526) de E.coli que aumenta la solubilidad del polipéptido inmunogénico en comparación con la proteína AcfD (orf3526) de E.coli en la que la deleción es la supresión de sustancialmente todos los aminoácidos N – terminales hasta la región gly – ser, la supresión completa o una parte de la repetición rica en prolina N – terminal, o ambos.
8.

El polipéptido inmunogénico de la reivindicación 7, en el que la deleción es la supresión de, al menos, los primeros 20 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 30 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 38 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 40 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 50 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de

E. coli, al menos, los primeros 60 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526)

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de E. coli, al menos, los primeros 70 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 80 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, al menos, los primeros 90 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli, o al menos, los primeros 94 aminoácidos N – terminales en comparación a la proteína AcfD (orf3526) de E. coli.
9.

El polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 8 en el que el polipéptido inmunogénico es aislado, purificado o recombinante.
10.

El polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 9 que comprende además un adyuvante.
11.

Un polinucleótido que codifica el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 7.
12.

Una célula de E. coli, que contiene un plásmido que codifica el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 7.
13.

Un componente de vacuna que comprende un polipéptido inmunogénico de la reivindicación 9.
14.

Una vacuna que comprende un componente de vacuna de la reivindicación 13.
15.

La vacuna de la reivindicación 14 que comprende además un adyuvante.
16.

La vacuna de la reivindicación 14 o la reivindicación 15 que comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado entre: un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetan, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno adicional de

E. coli, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, y un antígeno de Klebsiella.
17.

Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 9.
18.

La composición inmunogénica de la reivindicación 17, que comprende además un adyuvante.
19.

La composición inmunogénica de la reivindicación 18, en la que el adyuvante comprende (a) 1 – 12 % en volumen de un aceite metabolizable, y (b) de 0,2 % a 2,5 % en peso de un agente emulsionante, en el que el aceite metabolizable del agente emulsionante está presente en forma de emulsión de aceite en agua con gotas de aceite sustancialmente inferiores a 1 micra de diámetro.
20.

La composición inmunogénica de la reivindicación 18, en la que el adyuvante comprende un 4 – 5 % en peso de escualeno, y (b) un 1 % de un agente emulsionante que comprende polioxietilensorbitán monooleato y trioleato de sorbitán, en el que el escualeno y el agente emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua con gotas de aceite sustancialmente inferiores a 1 micra de diámetro.
21.

Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 14 – 16, o una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 17 – 20 para su uso en un método para inducir una respuesta inmune contra E. coli, en el que el método comprende la administración de dicha vacuna o composición inmunogénica a un sujeto.

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