KR102286397B1 - 신규 백신 면역보조제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 백신 면역보조제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 IL-12 단백질 및 IL-21 단백질을 유효성분으로 포함하거나 상기 IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제에 관한 것이다.

Description

신규 백신 면역보조제{A novel vaccine adjuvant}
본 발명은 백신 면역보조제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 T 세포 특이적 면역반응을 선택적으로 강화시킴으로써, 항암백신 등의 치료효과를 극대화시킬 수 있는 신규 백신 면역보조제에 관한 것이다.
백신은 병원균 감염에 대한 방어를 목적으로 항원에 대한 면역반응을 생성하도록 하기 위해 사용되는 의약품으로서 최근 개발되고 있는 백신들은 주로 재조합 단백질(recombinant protein)을 항원으로 사용하고 있다. 재조합 단백질은 사균 백신이나 약독화 생백신에 비하여 부작용이 적고 안전하지만 면역원성이 낮으므로 감염 방어에 충분한 면역력을 생성하기 위해 백신 면역보조제(vaccine adjuvant)를 함께 사용한다.
백신 면역보조제는 작용기전에 따라 크게 항원의 전달체, 면역증강제, 면역반응을 자극하는 동시에 항원에 대한 매트릭스로서 작용하는 것 등의 세 가지 종류로 구별된다. 백신 면역보조제를 효과적으로 사용하면 (1) 재조합 항원의 면역원성을 증가시키고, (2) 항원 투여량을 줄이거나 면역화 횟수를 줄일 수 있으며, (3) 면역력이 약한 유아와 노인에게서 면역원성을 향상시키는 등의 다양한 효과를 얻을 수 있다. 그러나 이러한 백신 면역보조제의 유용성에도 불구하고 아직까지 사람백신에 사용할 수 있도록 허가를 받은 백신 면역보조제가 많지 않은데 이는 백신 면역보조제로 선택되기 위해서 고려해야 할 사항들이 많기 때문이다. 이상적인 백신 면역보조제의 조건은 안전성과 내약성이 우수하고, 제조방법이 간단하며 비용이 저렴해야 한다는 점이다. 또한 체내 반감기가 길고 생분해가 가능해야 하며 면역보조제 자체에 대해서는 면역반응을 유발하지 않아야 한다. 특히 이 중에서도 백신 면역보조제의 안전성 문제가 가장 중요시 된다.
현재 유럽 및 미국에서 승인을 받아 백신에 사용되고 있는 백신 면역보조제로는 알루미늄염, MF59, AS03, AS04 등이 있다. 알루미늄염은 주로 Al(OH)3 또는 AlPO4 형태로 사용되는데 일반적으로 단백질 항원을 흡착하여 천천히 방출함으로서 면역증강효과를 나타내는 것으로 생각되었다. 그러나 최근에 알루미늄염이 수지상세포(dendritic cell)를 활성화시키고 인터류킨(IL)-1β와 IL-18과 같은 사이토카인 분비를 촉진시키는 것으로 알려졌다. 알루미늄염은 여러 백신에 널리 사용되며 매우 안전한 것으로 생각되고 있지만 알러지 반응을 유발하고 신경독성도 있는 것으로 추정되고 있다. 또한 항체가 매개된 체액성 면역반응은 강하게 유도하나 세포성 면역반응은 거의 유도하지 못하며, 동결보존이 불가능하다는 단점이 있다.
노바티스(Novartis)사의 MF59(Ott et al., Pharm Biotechnol. 6: 277-296, 1995)와 GSK사의 AS03(Li et al., J. Virol. 80(3):1414-1426, 2006)은 수중유(oil-in-water, o/w) 유화액(emulsion) 형태의 면역보조제로 모두 스쿠알렌(squalene)을 기본 성분으로 한다. 수중유 유화액 면역보조제는 항원제시세포(antigen-presenting cell)를 활성화시켜 항원흡수와 사이토카인 분비를 촉진시키고, 케모카인 수용체(chemokine receptor)의 발현을 증가시켜 항원제시세포들의 이동을 증가시킨다. MF59와 AS03은 2009년 유행한 신종인플루엔자에 대한 백신에서 항원의 면역원성을 증가시키고 사용 항원량을 감소시킬 목적으로 사용되었으며 임상시험에서 항체생성률과 교차방어효능을 증가시키는 효과가 있음이 확인되었다. 스쿠알렌 이외에 사람에게 사용할 수 있는 자연에서 만들어지는 유제를 활용하여 다양한 유화액 면역보조제가 개발되고 있으나 과도한 면역반응 및 독성으로 인해 실용화의 어려움이 있다. 리포좀, 면역자극 복합체, 바이러스 유사입자 등 미립자 전달체들도 면역보조제로 개발되고 있는데 보통 이들은 항원을 캡슐화하여 백신전달체 및 보조제로 개발되고 있다. 특히 리포좀에 대한 연구가 활발한데 리포좀은 항원을 캡슐화하는 동시에 백신 전달과 면역보조제로 활동할 수 있는 지질층을 구성하는 합성 구체로서, 지질층의 수, 전하, 구성 및 제조방법에 따라 그 활성이 달라진다. 리포좀은 단백질과 다당류 항원에 대해 체액성 면역과 세포성 면역을 증강시킨다. 그러나 제조상의 어려움이나, 안정성 등으로 사용이 제한되고 있고 특히 면역반응을 높이는 보조제로서의 역할보다 항원전달체에 더 가까우므로 강력한 면역활성 작용을 위해 면역자극성분을 추가할 필요가 있다. 현재 GSK사는 리포좀에 단일인산화 지질(monophosphoryl lipid A, MPL)를 첨가한 면역보조제 AS01B를 개발하고, 이를 결핵과 말라리아 질환에 대한 백신 면역보조제로 적용하고자 개발하고 있다(WO96/33739A).
그러나, 상기 백신 면역보조제들은 세포성 면역반응을 증강시키기는 하나, 주로 체액성 면역이 필요한 바이러스 등의 감염성 질환의 예방을 위한 백신 조성물의 면역보조효과를 위해 개발된 것들이어서, 암 등의 세포성 면역반응이 필요한 질환에 대한 예방 및 치료용 백신에 대한 효과는 아직 검증되지 않고 있는 실정이다.
상술한 바와 같이, 아직까지 T 세포에 특이적인 면역반응을 강화시킴으로써 암 등의 세포성 면역반응의 강화가 필요한 질환의 예방 및 치료는 물론 종래의 바이러스 등의 감염에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 및 치료에도 효율적인 백신 면역보조제의 개발이 절실하게 요구되고 있는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위해, T 세포 면역반응 특이적인 면역강화를 통해 백신의 효능을 증진시킬 수 있는 신규 백신 면역보조제를 제공하고자 한다. 그러나, 본 발명이 상기 목적에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, IL-12 단백질 및 IL-21 단백질을 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역 백신보조제 및 면역화 대상 항원을 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 조성물이 제공된다.
아울러 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역 백신보조제를 백신조성물과 함께 또는 상기 백신조성물 투여 전후로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 백신조성물에 의한 T 림프구 특이적 면역반응 촉진방법이 제공된다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제인 BD-121의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이고, 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제인 BD-121A의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14가 HPV DNA 백신 BD-14의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CMV DNA 백신의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신에 포함되는 BD-02B의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이고, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신에 포함되는 BD-02C의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 SFTS DNA 백신의 유전자컨스트럭트를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 종래 2가 HPV DNA 백신 단독 또는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 BD-121과의 병용 투여시 항원 특이적인 T 세포 면역반응을 분석한 ELISPOT 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 hBD-121 컨스트럭트로 형질감염된 COS-7 세포의 배양 상등액 내의 IL-12 및 IL-21의 농도를 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 mBD-121 컨스트럭트로 형질감염된 COS-7 세포의 배양 상등액 내의 IL-12 및 IL-21의 농도를 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 hBD-121 컨스트럭트 및 mBD-121로 각각 형질감염된 COS-7 세포의 세포파쇄액 내의 IL-12 및 IL-21의 발현 정도를 웨스턴블랏 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CMV DNA 백신 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121의 투여 스케쥴을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CMV DNA 백신을 단독으로, 또는 IL-12, IL-21 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 병용투여시 CMV 항원-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CMV DNA 백신을 단독으로, 또는 IL-12, IL-21 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 병용투여시 항원-특이적인 항체반응을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HBV DNA 백신을 단독으로 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 병용투여시 HBV 항원(HBsAg, HBcAg 및 PreS1/S2)-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HBV DNA 백신을 단독으로 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 병용투여시 HBsAg-특이적 항체반응을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 SFTS DNA 백신 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121의 투여 스케쥴을 나타낸다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 SFTS DNA 백신을 단독으로 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 1 차례 병용투여시(프라이밍) SFTS 항원(GnGc, NP 및 NS)-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 SFTS DNA 백신을 단독으로 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 2 차례 병용투여시(프라이밍 및 부스팅) SFTS 항원(GnGc, NP 및 NS)-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 SFTS DNA 백신을 단독으로 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 혼합비를 달리하여 1 차례 병용투여시(프라이밍) SFTS 항원(GnGc, NP 및 NS)-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 SFTS DNA 백신을 단독으로 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121과 혼합비를 달리하여 2 차례 병용투여시(프라이밍 및 부스팅) SFTS 항원(GnGc, NP 및 NS)-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신(BD02) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121의 투여 스케쥴을 나타낸다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신(BD02) 단독투여군(BD-02B+BD-02C) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121와의 병용투여군(BD02 DP)에서의 시간의 경과에 따른 HSV-2 병리학적 지수의 변화를 기록한 그래프이다.
도 12c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신(BD02) 단독투여군(BD-02B+BD-02C) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121와의 병용투여군(BD02 DP)에서의 시간의 경과에 따른 실험동물의 생존률의 변화를 기록한 그래프이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신(BD02) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121의 투여량을 조절하여 투여한 동물실험의 투여 스케쥴을 나타낸다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 HSV-2 DNA 백신(BD02) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 백신 면역보조제인 BD-121A의 투여량을 조절하여 1차 접종한(프라이밍) 실험동물의 백신 면역보조제의 투여량에 따른 HSV-2 항원(gD, UL39 및 ICP4)-특이적으로 반응한 비장세포의 수를 기록한 그래프이다.
도 14는 종래 2가 HPV DNA 백신에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 BD-121에 의한 T 세포 특이적 면역반응 증진 효과를 항원-특이적으로 반응한 비장세포를 계수함으로써 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14가 HPV DNA 백신 및 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 BD-121 또는 BD-121A의 투여 스케쥴을 나타낸다.
도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14가 HPV DNA 백신에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 BD-121 및 BD-121A에 의한 T 세포 특이적 면역반응 증진효과를 항원-특이적으로 반응한 비장세포를 계수함으로써 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16a는 실험동물인 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 HSV-2 DNA 백신(BD-02) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 BD-121A의 효과를 분석하기 위한 전임상 실험의 투여 스케쥴을 나타낸다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 없이 BD-02 단독투여군(좌측) 및 BD-121A 병용 투여군(우측)에서의 투여전(VS), 1회 투여시(VT1) 및 2회 투여시(VT2)의 HSV-2 항원(gD2 및 UL39)-특이적으로 반응한 비장세포를 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제가 제공된다.
이 때 상기 백신 면역보조제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다:
상기 IL-12를 구성하는 p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 내지 세 개의 벡터; 및
상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 mRNA 분자.
아울러, 상술한 백신 면역보조제는 상기 IL-21p35, IL-12p40 및 IL-21 중 일부는 단백질로 포함되고, 나머지는 발현벡터 및/또는 mRNA 분자와 같이 이종분자가 혼용되어 사용되는 것도 가능하다.
이때 상기 하나 내지 세 개의 벡터는 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21을 발현시킬 수 있도록 상기 폴리뉴클레오타이드가 프로모터와 같은 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트를 포함할 수 있다. 상기 백신 면역보조제는 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드들이 개별적인 발현벡터 내에 삽입되거나(3 벡터 시스템) 하나 또는 두 개의 발현벡터 내에 삽입됨으로써(단일벡터 또는 이중벡터 시스템) 하나 내지 세 개의 벡터로 구성될 수 있다. 이러한 단일벡터 내지 삼중벡터 시스템의 구체적인 구현예는 하기와 같다:
ⅰ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 각각 작동가능하게 연결된 제1 내지 제3유전자컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
ⅱ) 상기 제1 내지 제3유전자컨스트럭트를 각각 포함하는 제2 내지 제4발현벡터
ⅲ) 상기 제1 내지 제3유전자컨스트럭트 중 둘 및 나머지 하나가 각각 포함된 제5발현벡터 및 제6발현벡터;
ⅳ) 상기 IL-12p35 및 IL-12p40 중 어느 하나에 IL-21이 연결된 융합단백질 및 상기 IL-12p35 및 IL-12p40 중 상기 융합단백질에 포함되지 않은 펩타이드;
ⅴ) 상기 ⅳ의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4유전자컨스트럭트 및 상기 ⅳ의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제5유전자컨스트럭트를 포함하는 제7발현벡터;
ⅵ) 상기 제4유전자컨스트럭트 및 제5유전자컨스트럭트를 각각 포함하는 제8발현벡터 및 제9발현벡터;
ⅶ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘 이상이 내부 리보솜 진입 부위(IRES)로 연결된 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제6유전자컨스트럭트; 및 선택적으로 상기 세 폴리뉴클레오타이드 중 상기 제6유전자컨스트럭트에 포함되지 않은 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제7유전자컨스트럭트를 포함하는 제10발현벡터; 및
ⅷ) 상기 제6유전자컨스트럭트를 포함하는 제11발현벡터 및 선택적으로 상기 제7유전자컨스트럭트를 포함하는 제12발현벡터.
상기 백신 면역보조제는 B 림프구 특이적 면역반응을 야기하지 않으면서 T 림프구 특이적 면연반응을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 백신 면역보조제에 있어서, 상기 IL-12p35 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-12p35와 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 IL-12p35의 사용도 가능하다. 상기 IL-12p40 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-12p40과 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 IL-12p40의 사용도 가능하다. 상기 IL-12p35 및 IL-12p40은 한국 등록특허 제0399728호에 기재된 서열 또한 사용 가능하다. 상기 IL-21 단백질은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21과 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 IL-21의 사용도 가능하다.
상기 백신 면역보조제는 하기 중 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다:
MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 MIP-1α 유전자컨스트럭트; 및
상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 이상에 IRES 또는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 작동가능하게 연결된 복합 유전자컨스트럭트; 및
상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 mRNA 분자.
상기 백신 면역보조제에 있어서, 상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 펩타이드 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 IRES를 통해 작동가능하게 연결되거나 별도의 유전자컨스트럭트 형태로 제공될 수 있다. 즉, 상기 MIP-1α 유전자컨스트럭트는 별도의 발현벡터에 포함되거나, 상기 IL-12를 구성하는 p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 내지 세 개의 벡터 중 어느 하나 이상의 벡터 내에 포함될 수 있다. 즉, 상기 MIP-1α 유전자컨스트럭트는 상기 백신 면역보조제의 구현예에 기재된 제1발현벡터 내지 제12발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 백신 면역보조제에 있어서, 상기 MIP-1α 단백질은 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 MIP-1α 단백질과 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 MIP-1α 단백질의 사용도 가능하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, IL-12 단백질 및 IL-21 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 면역 보조제가 제공된다.
상기 백신 면역보조제에 있어서, 상기 IL-12 단백질은 p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)로 구성된 것일 수 있다.
상기 백신 면역보조제는, MIP-1α 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 IL-12 단백질, IL-21 단백질 및 MIP-1α은 상술한 바와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270: 25739-25745)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris (1995) Cell 75, 791-803) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 IL-12 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX-27을 제조하여 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 (G4S)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 51, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 52), EGKSSGSGSESKST(서열번호 53), GSAGSAAGSGEF(서열번호 54), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 55, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 56), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 57), GGGGGGGG(서열번호 58), GGGGGG(서열번호 59), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 60), PAPAP(서열번호 61), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 62), PLGLWA(서열번호 63), TRHRQPRGWE(서열번호 64), AGNRVRRSVG(서열번호 65), RRRRRRRR(서열번호 66), GFLG(서열번호 67), 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 68) 등이 포함될 수 있다.
상기 발현벡터는 하나 또는 둘 이상의 면역 증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 상기 면역 증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역 백신보조제 및 감염성 바이러스 유래 항원 또는 상기 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 항원 유전자컨스트럭트 또는 이를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 예방 및 치료용 백신 조성물이 제공된다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 감염성 바이러스 유래 항원은 EBV(Epstein-Barr virus), HAV(hepatitis A virus), HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus), HDV(hepatitis D virus), HEV(hepatitis E virus), 한탄바이러스(Hantaan virus), CMV(cytomegalovirus), HIV(human immunodeficiency virus), 독감 바이러스(influenza virus), HPV(human papilloma virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 에볼라 바이러스(ebola virus), 로타바이러스(rotavirus), 댕기열바이러스(dengue virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열바이러스(yellow fever virus), 아데노바이러스(adenovirus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), BK 바이러스(BK virus), 천연두 바이러스(smallpox virus), 지카 바이러스(Zika virus), 중증열성혈소판감소증후근 바이러스(SFTS virus) 또는 HSV(herpes simplex virus) 유래 항원일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 백신 면역보조제 및 암항원, 상기 암항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 항원 유전자컨스트럭트 또는 이를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 암치료용 백신 조성물이 제공된다.
상기 암 치료용 백신 조성물에 있어서, 상기 암항원은 인유두종바이러스(HPV) 유래 항원, 태아성 암항원(carcinoembryonic antigen), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막항원(PSMA), Her2/neu, MUC-1, BCR/ABL, 알파-페토프로테인(AFP), 엡스타인 바 바이러스(EBV) 유래 항원, 인간간염바이러스 B(HBV) 유래 항원, 인간간염바이러스 C(HCV) 유래 항원, 암항원-125(CA-125), 암항원-72-4(CA-72-4), 암항원-15-3(CA-15-3), 또는 암항원-19-9(CA-19-9)일 수 있다.
상기 백신 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물은 상기 백신 면역보조제 외에 통상적으로 사용되는 백신 면역보조제를 추가로 포함할 수 있는데 이러한 백신 면역보조제로는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘 알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01,AS02, ISCOMs 및 ISCOMMATRIX 등이 사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "보조제(adjuvant)" 또는 "백신 면역보조제(vaccine adjuvant)"는 백신의 면역반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다.
또한, 본 발명에 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 근육내 주사 또는 정맥 주사 방식으로 투여될 수 있으나, DNA 백신 조성물로 제공되는 경우, 가장 바람직하게는 전기천공기(electroporator)를 이용하여 주입될 수 있다. 상기 전기천공기는 시판 중인 DNA 약물 체내 주입용 전기천공기, 예컨대, 이탈리아의 IGEA 사의 GlinporatorTM, 한국의 JCBIO사의 CUY21EDIT, 스위스의 Supertech사의 SP-4a, 한국의 SLVAXiGEN사의 OrbiJector　 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 또는 이를 포함하는 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 백신 면역보조제 또는 이를 포함하는 백신 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 백신 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 DNA는 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
아울러 본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
아울러 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역 백신보조제를 백신조성물과 함께 또는 상기 백신조성물 투여 전후로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 백신조성물에 의한 T 림프구 특이적 면역반응 촉진방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 면역 백신보조제는 생체내 전기천공법에 의해 투여될 수 있다.
상기 방법은 상기 개체의 B 세포 특이적 면역반응은 유도하지 않으면서 T 림프구 특이적 면역반응만 선택적으로 유도하는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 인간 IL-12 및 IL-21 발현 벡터의 제조
1-1: 단일벡터 시스템
본 발명자들은 IL-12 및 IL-21이 하나의 벡터를 통해 발현되도록 단일벡터 시스템을 고안하였다.
이를 위하여 구체적으로, 본 발명자들은 인간 IL-12 단백질의 두 소단위체인 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p35 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4 및 5)를 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 hIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 7로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21 단백질(hIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 8)을 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조한 후, 상기 유전자컨스트럭트를 pGX-27 벡터(한국 등록특허 제1442254호)의 다중클로닝 부위에 삽입하여 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터를 제조하고 이를 'hBD-121'으로 명명하였다(도 1a).
1-2: 이중벡터 시스템
본 발명자들은 상기 IL-12 및 IL-21이 별도의 벡터에 삽입되어 발현되도록 이중벡터 시스템을 고안하였다.
상기 이중벡터 시스템은 하기와 같이 제조된다:
상기 hIL-12p35 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4) 및 hIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 5)를 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-IRES에 연결하고 이를 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하고, 마찬가지로 인간 IL-21 단백질(hIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 8) 역시 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하여, 이중 벡터 시스템을 제조한다.
1-3: 삼중벡터 시스템
IL-12의 경우 hIL-12p35 폴리펩티드 및 hIL-12p40 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질이기 때문에, 상기 hIL-12p35 폴리펩티드 및 hIL-12p40 폴리펩티드는 독립적인 벡터로부터 발현될 수 있다. 이와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 hIL-12p35 폴리펩티드, hIL-12p40 폴리펩티드 및 IL-21은 각각 독립적으로 구성된 세 개의 벡터를 통해 발현될 수 있다. 이를 본 발명자들은 편의상 '삼중벡터 시스템'으로 명명하였다.
상기 삼중벡터 시스템은 하기와 같이 제조될 수 있다:
상기 hIL-12p35 폴리펩타이드, hIL-12p40 폴리펩타이드 및 hIL-21을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4, 5 및 8)을 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하여 삼중벡터 시스템을 제조한다.
실시예 2: 인간 IL-12, IL-21 및 MIP-1α 발현 벡터의 제조
서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p35 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 4 및 5)를 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 hIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 7로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21 단백질(hIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 8)이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드에 서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 인간 EF-1α 프로모터(pEF-1α) 및 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 MIP-1α 단백질(hMIP-1α)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 11)를 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조하여 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하였으며, 이를 hBD-121A로 명명하였다(도 1b).
실시예 3: 마우스 IL-12 및 IL-21 발현 벡터의 제조
마우스 IL-12 단백질의 두 소단위체인 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p35 폴리펩타이드 및 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 14 및 15)를 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 mIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 7로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 마우스 IL-21 단백질(mIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 17)을 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조한 후, 상기 유전자컨스트럭트를 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하여 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터를 제조하고 이를 'mBD-121'으로 명명하였다(도 1a).
실시예 4: 마우스 IL-12, IL-21 및 MIP-1α 발현 벡터의 제조
서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p35 폴리펩타이드 및 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 14 및 15)를 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 mIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 8)의 3'-말단에 서열번호 7로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 마우스 IL-21 단백질(mIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 17)이 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드에 서열번호 9로 기재되는 핵산서열로 구성되는 인간 EF-1α 프로모터(pEF-1α) 및 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 마우스 MIP-1α 단백질(mMIP-1α)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 19)을 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조하여 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하였으며, 이를 mBD-121A로 명명하였다(도 1b).
실시예 5: HPV DNA 백신 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 14가 HPV DNA 백신을 제조하기 위해, 고위험군에 속하는 6형, 11형, 16형, 18형, 31형, 33형, 35형, 39형, 45형, 51형, 52형, 56형, 58형 및 59형 인간유두종바이러스(human papilloma virus, HPV)의 조기발현 단백질 E6 및 E7 항원을 뒤섞은 융합단백질의 형태로 발현시키기 위해 각 타입의 E6 항원 및 E7 항원의 N-말단 단편 및 C-말단 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 PCR 반응을 통해 수득한 후, 도 2 및 표 1에 개시된 순서와 같이 연결하여 세 개의 유전자컨스트럭트를 제조한 후, 이를 각각 pGX-27 벡터에 삽입함으로써 HPV DNA 백신 컨스트럭트를 제조하였고, 이를 각각 BD-14A, BD-14B 및 BD-14C로 명명하였고 상기 세 벡터를 포함하는 조성물을 BD-14로 명명하였다. 상기와 같이 3 벡터 시스템으로 HPV 14가 DNA 백신 컨스트럭트를 제조한 이유는 삽입되는 유전자컨스트럭트의 크기가 너무 클 경우 pGX-27 벡터의 용량상 비효율적이기 때문이다.
도 2 및 하기 표 1에서 나타난 바와 같이, 각 타입의 HPV E6 및 E7 항원은 각각 일부 서열이 중복이 되는 N-말단 단편과 C-말단 단편으로 나뉜 후 E6의 N-말단 단편 뒤에 E7말단의 C-말단 단편이 연결된 융합 폴리펩타이드가 (GS)5 링커 펩타이드로 E7의 N-말단 단편 뒤에 E6의 C-말단 단편이 연결된 융합 폴리펩타이드가 다시 연결된 구조를 가지며, 이러한 각 타입의 항원 단위체 4개 내지 5개가 상기 (GS)5 링커에 연결되어 하나의 벡터에 포함되도록 작제를 하였다. 하나의 발현벡터에 삽입되는 각 서브타입의 종류는 표 1에 예시적으로 기재되어 있으나, 이는 예시적인 것일 뿐 그 어떠한 다른 순서로 제조하더라도 무방하다.
본 발명의 14가 HPV DNA 백신 컨스트럭트의 구성
구성요소 구체적인 구조 서열번호 기원
단백질 핵산
공통
요소		 링커 (GS)5 20 21 N/A
tPA tPA1-22 22 23 Uniprot: P00750
Flt3L Flt3L27-182, △1-26 24 25 Uniprot: P49771
BD-14A 16 E6E7 16E6N1-85-16E7C41-105-(GS)5-16E7N1-60-16E6C66-158 26 27 GenBank: K02718.1
18 E6E7 18E6N1-85-18E7C41-98-(GS)5-18E7N1-60-18E6C66-158 GenBank: X05015.1
35 E6E7 35E6N1-78-35E7C42-99-(GS)5-35E7N1-61-35E6C59-149 GenBank: X74477.1
45 E6E7 45E6N1-85-45E7C41-106-(GS)5-45E7N1-60-45E6C66-158 GenBank: X74479.1
58 E6E7 58E6N1-85-58E7C41-98-(GS)5-58E7N1-60-58E6C66-149 GenBank: D90400.1
BD-14B 31 E6E7 31E6N1-85-31E7C42-98-(GS)5-31E7N1-61-31E6C66-149 28 29 GenBank: J04353.1
33 E6E7 33E6N1-85-33E7C42-96-(GS)5-33E7N1-61-33E6C66-149 GenBank: M12732.1
06 E6E7 6E6N1-85-6E7C42-98-(GS)5-6E7N1-61-6E6C66-150 GenBank: X00203.1
11 E6E7 11E6N1-85-11E7C42-98-(GS)5-11E7N1-61-11E6C66-150 GenBank: M14119.1
52 E6E7 52E6N1-85-52E7C41-99-(GS)5-52E7N1-60-52E6C66-148 GenBank: X74481.1
BD-14C 39 E6E7 39E6N1-85-39E7C44-109-(GS)5-39E7N1-63-51E6C66-158 30 31 GenBank: M62849.1
51 E6E7 51E6N1-83-51E7C45-101-(GS)5-51E7N1-64-51E6C64-151 Uniprot :
P26554(E6),
P26558(E7)
56 E6E7 56E6N1-86-56E7C48-105-(GS)5-56E7N1-67-56E6C67-155 Uniprot : P24836(E6), P36833(E7)
59 E6E7 59E6N1-85-59E7C50-107-(GS)5-59E7N1-69-59E6C66-160 GenBank: CAA54849.1(E6), CAA54850.1(E7)
실시예 6: CMV DNA 백신 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 CMV DNA 백신 컨스트럭트를 제조하기 위해, CMV 당단백질 B(gB) 및 pp65 단백질이 포함된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후 pGX-27 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 CMV DNA 백신 컨스트럭트를 제조하였다(도 5).
실시예 7: HBV DNA 백신 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 HBV DNA 백신 컨스트럭트를 제조하기 위해, preS1, preS2, S 항원, 표면 항원 및 핵 항원을 발현하도록 HBV DNA 백신 컨스트럭트를 제조한 후 이를 pGX-27 벡터에 삽입하였다.
실시예 8: HSV-2 DNA 백신 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 HSV-2 DNA 백신 컨스트럭트를 제조하기 위해, HSV-2의 UL39 항원을 5개의 조각(N1: UL3921-154(Δ78-104), C2: UL391117-1142, N2: UL39165-227, N4-C1: UL39398-1116, N3: UL39208-398)으로 나눈 후 이를 뒤섞여 배치된 HSV-2의 셔플드 UL-39 항원 및 상기 셔플드 UL-39를 암호화하는 유전자컨스트럭트를 pGX-27 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입함으로써 HSV-2 DNA 백신 컨스트럭트를 제조하였다.
구체적으로 shuffled-UL39 plasmid DNA는 UL39-N1(서열번호 32, UL39-C2(서열번호 33), UL39-N2(서열번호 34), UL39-N4-C1(서열번호 35), 및 UL39-N3(서열번호 36) 부분으로 나눠진 형태를 기반으로, UL39-N1, UL39-C2, UL39-N2, UL39-N4-C1, 및 UL39-N3 순서로 순차적으로 연결된 형태(서열번호 37)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 38)를 포함하는 유전자컨스트럭트를 상기 pGX-27 플라스미드 벡터에 삽입함으로써 제작하였으며(도 4a), 이를 'BD-02B'로 명명하였다.
아울러 본 발명자들은 상기 셔플드 UL39 항원 외에, 다른 HSV-2 항원 즉, 신호서열(gD1-25) 및 막통과 도메인(gD350-363)이 제거된 Glycoprotein D(gD26-349), 서열번호 39), 핵위치화 서열(NLS, ICP0510-516)이 제거된 infected cell polypeptide 0(ICP0Δ510-516, 서열번호 40) 및 RS1.3 부분(ICP767-1318)이 제거된 infected cell polypeptide 4(ICP4Δ767-1318, 서열번호 41)가 연결된 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 융합단백질(서열번호 42)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 43)가 포함된 유전자 컨스트럭트를 pGX-27 벡터에 삽입함으로써 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 제조하였다(도 4b). 상기 두 플라스미드 모두 효율적인 발현을 위하여 코돈 최적화된 tPA 분비 신호서열(서열번호 22)과 면역계 활성 단백질인 FMS-like tyrosine kinase 3 ligand(Flt3L, 서열번호 24)이 N-말단에 부가된 형태 융합단백질의 형태로 발현되도록 고안된 plasmid DNA이다. 상기 제조된 DNA 백신용 플라스미드 DNA는 'BD-02C'로 명명하였으며, 상기 BD-02B 및 BD-02C로 구성된 DNA 백신 조성물을 'BD-02'로 명명하였다.
실시예 9: SFTS DNA 백신 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 SFTS의 항원 RdRP(RNA dependent RNA polymerase)을 제외한 GnGc(Glycoprotein N and C, 서열번호 44), NP(nucleocapsid, 서열번호 45), NS (nonstructural protein, 서열번호 46) 항원을 발현할 수 있도록 각 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 47 내지 49)를 분리된 SFTS 바이러스 게놈을 주형으로 PCR 반응을 통해 증폭한 후 각각 CMV 프로모터(pCMV), RSV 프로모터 (pRSV) 및 EF-1a 프로모터(pEF-1α)에 작동 가능하도록 연결한 후 pGX-27 플라스미드 DNA에 삽입하여, SFTS DNA 백신인 재조합 플라스미드 DNA(SFTS plasmid DNA)를 제작하였다(도 5).
실험예 1: IL-12 및 IL-21의 백신 면역 보조제로서의 가능성 확인
본 발명자들은 IL-12 및 IL-21의 단백질 및 DNA 형태의 백신 면역보조제로서의 가능성을 확인하기 위한 예비실험을 수행하였다. 이를 위해 구체적으로, 16형 및 18형에 대한 HPV 2가 DNA 백신을 단독으로 그리고 IL-12 및/또는 IL-21과 함께 개체에 투여하여 면역반응을 조사하였다.
구체적으로, 한국 공개특허공보 제10-2017-0045254호에 기재된 16형/18형 2가 HPV DNA 백신 컨스트럭트 2 ㎍을 C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector　(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 2주 간격으로 mIL-12 컨스트럭트 및/또는 mIL-21 컨스트럭트 각 2 ㎍과 함께 두 차례 투여하였다. 그런 다음, 두 번째 투여일로부터 2주 후에 비장을 적출하여 HPV 16 및 HPV18에 반응하는 비장 면역세포의 수를 계수하였다(도 6).
그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, IL-12 또는 IL-21 단독 처리시에 비해 IL-12 및 IL-21 동시 처리된 마우스에서의 면역반응을 나타낸 세포가 현저하게 증가함을 확인하였으며, 특히 18형 HPV에 있어서 그 효과가 두드러짐을 확인하였다.
상기 결과는 IL-12 및 IL-21이 병용처리시 백신의 면역반응을 상승적으로 증가시킬 수 있는 사이토카인임을 시사하는 결과이다.
실험예 2: BD-121의 발현 분석
2-1: ELISA 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2 및 4에서 각각 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 hBD-121 컨스트럭트 및 mBD-121 컨스트럭트를 세포에 형질도입한 후 이들 형질전환 세포에서 IL-12 및 IL-21가 정상적으로 발현되는지 여부를 조사하였다. 구체적으로 COS-7 세포주를 100 mm culture dish에 접종하여 16시간 배양 후 공벡터(mock plasmid DNA) 및 실시예 2-1에서 제조된 hBD-121 plasmid DNA 및 실시예 4에서 제조된 mBD-121 plasmid DNA로 Lipofectamine 2000을 이용하여 각각 형질감염시키고, 37℃ CO2 배양기에서 3일 동안 배양 후에 각 조건의 COS-7 세포의 배양 상등액을 회수하여 검체로 사용하였다. 검체 내 존재하는 IL-12 및 IL-21 단백질들은 각각 IL-12 및 IL-21을 특이적으로 인식하는 항체(IL-12: R&D Systems, Cat# D1200, IL-21: BioLegend, Cat# 433808)를 이용한 ELISA 분석방법을 이용하여 정량하였다(도 7a 및 7b).
그 결과, 도 7a에서 나타난 바와 같이, hBD-121 plasmid DNA를 도입한 검체 내 단백질 발현량은 hIL-12의 경우 4 ㎍ DNA 도입시 4,000 pg/ml을 상회하여 정상적으로 발현됨을 확인하였고, hIL-21 역시 4 ㎍ DNA 도입시 무려 200 ng/ml에 가까운 수치를 나타내 매우 고발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 아울러, 도 7b에서 나타난 바와 같이, 마우스 컨스트럭트 역시 인간 컨스트럭트와 유사한 결과를 나타냈다. 한편 공벡터를 도입한 대조군의 경우 양 단백질 모두 전혀 발현되지 않아, 본 발명의 백신 면역보조제 발현 시스템이 정상적으로 작동함을 확인할 수 있었다.
1-2: 웨스턴블랏 분석
본 발명자들은 상기 실험예 1-1에서 수득한 세포의 세포파쇄액을 대상으로 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, nylon 막으로 전사한 후, 항-IL-12A 항체(Abcam, Cat# ab131039), 항-IL-12B 항체(Abcam, Cat# ab133752) 및 항-IL-21 항체(Abcam, Cat# ab5978)를 이용하여 웨스턴블랏 분석을 수행하였다(도 7c).
그 결과 도 7c에서 확인되는 바와 같이, IL-12 및 IL-21 모두 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 플라스미드 DNA의 형질도입에 의해 정상적으로 발현됨을 확인하였다.
실험예 3: BD-121의 다양한 바이러스에 대한 면역반응 증진 효과 분석
이어 본 발명자들은 상기 실험예 2의 결과로부터 실제 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 컨스트럭트가 다양한 바이러스에 대한 면역반응을 증진시키는지 여부에 대하여 조사하였다.
3-1: CMV에 대한 T 세포-특이적 면역 반응 및 항체 반응
우선 본 발명자들은 상기 실시예 6에서 제조된 CMV DNA 백신 컨스트럭트 0.5 ㎍을 단독으로 또는 BD-121 0.5 ㎍와 함께 한 차례 C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 접종하였다. 이 때, 비교군으로 BD121의 구성요소인 IL-12 및 IL-21을 각각 발현하는 발현벡터를 단독으로 또는 조합하여(IL-12 + IL-21) 각각 0.5 ㎍ 씩 CMV DNA 백신 컨스트럭트 0.5 ㎍와 같이 투여하였다(표 2). 백신 접종 2주 후 실험동물을 희생시킨 후 비장을 적출하여 CMV에 대한 T 세포-특이적 면역반응을 상기 CMV DNA 백신에 포함된 CMV의 항원인 CMVpp65와 CMVgB 펩타이드 풀을 사용한 ex vivo ELISPOT 분석법을 이용하여 분석하였다(도 8a). CMVgB-특이적 항체반응은 수득된 혈장을 이용하여 CMV-특이적 항체 반응 ELISA 시험법을 통해 분석하였다(도 8a 내지 8c).
본 발명의 CMV 백신 투여 조성
그룹 실험두수 조성 투여량 투여경로
1 3 Mock 각 플라스미드당 0.5 μg i.m. + 전기천공
2 4 CMV DNA vaccine
3 4 CMV DNA vaccine + IL-12
4 4 CMV DNA vaccine + IL-21
5 4 CMV DNA vaccine + IL-12 + IL-21
6 4 CMV DNA vaccine + BD121
그 결과 도 8b에서 나타나듯, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 백신 면역보조제는 CMV DNA 백신 단독 처리시와 비교시 월등하게 높은 T-세포 특이적 면역반응을 야기하였다. 구체적으로 CMV DNA 백신 단독 처리시 CMVpp65와 CMVgB 특이적인 면역반응은 각각 300 SFCs(spot forming cells)와 700 SFCs인 반면 BD-121 병용투여를 통해 CMVpp65와 CMVgB 특이적인 면역반응은 각각 2,000 SFCs와 2,100 SFCs로 약 3~7배 가량 항원-특이적인 T 세포 반응을 증가됨을 확인하였다. 반면에, 도 8c에서 나타난 바와 같이, CMV-특이적 항체 생성 정도를 분석한 결과 본 발명의 BD-121은 오히려 CMV DNA 백신 단독 처리시보다 낮은 항체 반응을 유도함을 확인하였다. 이러한 점은 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121이 비 선택적으로 면역반응을 증가시키는 방식이 아니라 T 세포 특이적인 면역반응 즉, 세포성 면역반응을 선택적으로 강화함으로써 면역증진을 유발하는 것임을 보여주는 것이다.
3-2: HBV에 대한 T 세포-특이적 면역반응 및 항체 반응
상기 실시예 7에서 제조된 HBV DNA 백신 컨스트럭트 2 ㎍을 단독으로 또는 BD-121 2 ㎍와 함께 2주 간격으로 C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector　(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 접종하고(각각 프라이밍 및 부스팅), 두 번째 백신 접종일 즉, 부스팅으로부터 2주 후 실험동물을 희생시킨 후 비장을 적출하여 HBV에 대한 T 세포-특이적 면역반응을 상기 HBV DNA 백신 컨스트럭트에 포함된 HBV 항원(HBsAg, HBcAg, 및 PreS1/S2) 펩타이드 풀을 이용한 ex vivo ELISPOT 분석을 통해 분석하였다. 아울러, HBsAg-특이적 항체반응은 수득된 혈장을 이용하여 HBV-특이적 항체 반응을 ELISA 시험법을 통해 분석하였다(도 9a 및 9b).
그 결과 도 9a에서 나타나듯, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 백신 면역보조제는 HBV DNA 백신 컨스트럭트 단독 처리시와 비교시 월등하게 높은 T-세포 특이적 면역반응을 야기하였다. 특히 HBsAg 항원 및 HBcAg 항원에 반응하는 비장 면역세포의 수가 급격하게 증가하였다. 그러나, 도 9b에서 나타난 바와 같이, HBV-특이적 항체 생성 정도를 분석한 결과 본 발명의 BD-121은 오히려 HBV DNA 백신 컨스트럭트 단독 처리시보다 항체 역가 증가를 시키지 않음을 확인하였다. 본 발명의 BD-121에 의한 T 세포-특이적 면역반응에 대한 선택적인 강화는 특정 바이러스 항원에 한정된 사항이 아니라 대부분의 감염성 바이러스에 대해 비슷한 양상으로 나타나는 현상임을 확인시켜 주는 것이다.
3-3: SFTS에 대한 T 세포-특이적 면역반응 및 항체 반응
공벡터로 pGX-27(G1)를 투여하거나, 상기 실시예 9에서 제조된 SFTS DNA 백신 12 ㎍을 단독으로(G2) 또는 BD-121 12 ㎍와 함께(G3) 2주 간격으로 C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector　(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 접종하고(부스팅) 일부 마우스(n=5)는 첫 번째 접종(프라이밍) 후 희생시켜 비장을 적출한 후 SFTS에 대한 T 세포-특이적 면역반응을 상기 SFTS DNA 백신에 포함된 SFTS의 항원인 GnGc, NP 및 NS를 사용한 ELISPOT 분석을 통해 분석하였고, 나머지 실험동물(n=5)들은 두 번째 백신 접종일(부스팅)로부터 2주 후 희생시킨 다음 비장을 적출하여 SFTS에 대한 T 세포-특이적 면역반응을 상기와 같인 ELISPOT 분석을 통하여 분석하였다(도 10a 내지 10c).
그 결과 도 10b에서 나타나듯, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 백신 면역보조제는 SFTS DNA 백신 단독 처리시와 비교시 프라이밍만으로도 현저한 T 세포-특이적 면역반응을 유발하였고, 도 10c에서 나타나듯, 부스팅 시에는 T 세포-특이적 면역반응이 더욱 증가하였다. 반면, SFTS DNA 백신 단독 투여시에는 부스팅에 의한 면역반응의 증진이 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121은 1차 접종에 따른 프라이밍은 물론 2차 접종에 따른 부스팅 시 더욱 효과적인 백신 보조효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
이어 본 발명자들은 상기 SFTS DNA 백신과 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 백신 면역보조제의 접종 비율을 달리하여 프라이밍 및 부스팅의 효과를 비교하였다.
구체적으로 공벡터(mock DNA, G1), SFTS DNA 백신 단독(G2), SFTS DNA 백신:BD-121=1:0.3(G3), SFTS DNA 백신:BD-121=1:1(G4) 및 SFTS DNA 백신:BD-121=1:3(G5)을 상기와 같이 2주 간격으로 C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector　(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 접종하고(부스팅) 일부 마우스(n=5)는 첫 번째 접종(프라이밍) 후 희생시켜 비장을 적출한 후 SFTS에 대한 T 세포-특이적 면역반응을 상기 SFTS DNA 백신에 포함된 SFTS의 항원인 GnGc, NP 및 NS를 사용한 ELISPOT 분석을 통해 분석하였고, 나머지 실험동물(n=5)들은 두 번째 백신 접종일(부스팅)로부터 2주 후 희생시킨 후 비장을 적출하여 SFTS에 대한 T 세포-특이적 면역반응을 상기와 같인 ELISPOT 분석을 통하여 분석하였고, 혈장을 수득하여 SFTS-특이적 항체 반응을 분석하였다(표 3, 도 11a 및 11b).
SFTS DNA 백신에 대한 BD-121의 투여량 변경 실험 개요
실험군 실험두수 투여 DNA 컨스트럭트 투여경로
G1 3 Mock DNA 근육내 전기천공
G2 5 SFTS DNA vaccine
G3 5 SFTS DNA vaccine + BD-121 (1:0.3)
G4 5 SFTS DNA vaccine + BD-121 (1:1)
G5 5 SFTS DNA vaccine + BD-121 (1:3)
그 결과, 도 11a에서 나타난 바와 같이, 프라밍시에는 SFTS DNA 백신 단독투여군과 SFTS DNA 백신과 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121을 1:0.3 비율로 투여한 군 사이에 유의한 차이가 없었으나, 투여 비율을 1:1로 증가시킨 실험군의 경우 뚜렷한 T 세포-특이적 면역반응 증진 효과가 나타났다. 한편, 부스팅의 경우에는 도 11b에서 나타나듯, 투여비율 1:0.3의 경우에도 SFTS 단독 투여시보다 현저한 T 세포-특이적 면역반응의 증가가 확인되었다. 이는 BD-121 백신 면역보조제가 투여량 의존적으로 T 세포-특이적 면역반응을 증진시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
3-4: HSV-2에 대한 T 세포-특이적 면역반응
본 발명자들은 상기 실시예 8에서 제조된 HSV-2 DNA 백신 컨스트럭트 투여시 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 BD-121A의 T 세포-특이적 면역반응 강화 여부를 조사하였다.
구체적으로, 대조군으로 공 DNA(pGX-27) 투여군(n=10), 상기 실시예 8에서 제조된 BD-02B 0.49 ㎍ 및 BD-02C 0.49 ㎍ 투여군(n=11), BD-02B 1.4 ㎍ 및 BD-02C 1.4 ㎍ 투여군(n=9), BD-02B 0.49 ㎍, BD-02C 0.49 ㎍, 및 BD121A 0.49 ㎍ 투여군(n=11), BD-02B 1.4 ㎍, BD-02C 1.4 ㎍ 및 BD121A 1.4 ㎍ 투여군(n=10)으로 나누어 2주 간격으로 C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector　(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 접종하고(프라이밍 및 부스팅), 부스팅 1주일 후 암컷 개체간의 성호르몬 주기를 맞추기 위해 Depo-provera 2 mg을 투여하였으며, 부스팅 2주일 후 HSV-2를 감염시킨 후, 부스팅 2주 후 실험동물의 시간의 경과에 따른 병리학적 점수 및 생존률을 분석하였다(도 12a 내지 12c).
그 결과, 도 12b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD121A를 함께 투여한 실험군의 병리학적 점수가 BD-02 단독 투여군에 비해서 더 낮았고, 이러한 현상은 투여량 의존적으로 나타났다. 아울러, 시간의 경과에 따른 생존률 분석결과 도 12c에 나타난 바와 같이, BD-02 단독 투여군의 경우 대조군에 비해 투여량 의존적인 생존도 증가를 나타냈으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121A 병용 투여군(BD02 DP)에서는 실험동물의 생존도가 현저하게 증가하였다. 특히 BD-02 + BD-121A(BD02 DP) 1.4 ㎍ 투여군의 경우, HSV-2 감염 18일 경과 후에도 폐사한 동물이 없었다.
이어, 본 발명자들은 BD-02와 BD-121A의 최적의 배합 비율을 확인하기 위해 다양한 BD-02와 BD-121A를 다양한 비율(BD-02B:BD-02C:BD121A=2:2:0.2, 2:2:0.6, 2:2:2 및 각군별 n=5+5)로 조절하여 실험동물에 2주 간격으로 두 차례(프라이밍 및 부스팅) C57BL/6 마우스의 대퇴근육에 OrbiJector　(SLVAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공기를 이용하여 접종하고 각 군당 5마리는 프라이밍 2주 후, 그리고 나머지 군당 5마리는 부스팅 2주 후 희생시킨 다음 비장을 적출하여 BD-02에 포함된 다양한 HSV-2 항원에 반응하는 비장 면역세포의 수를 ELISPOT 분석으로 계수하였다(표 4 및 도 13a 및 13b).
HSV-2 DNA 백신에 대한 BD-121A의 투여량 변경 실험 개요
실험군 두수 투여 DNA 컨스트럭트 투여경로
1 5+5 BD-121A (6 ㎍) 근육내 전기천공
2 5+5 BD-02B (2 ㎍) + BD-02C (2 ㎍) + BD-121A (0.2 ㎍) 근육내 전기천공
3 5+5 BD-02B (2 ㎍) + BD-02C (2 ㎍) + BD-121A (0.6 ㎍) 근육내 전기천공
4 5+5 BD-02B (2 ㎍) + BD-02C (2 ㎍) + BD-121A (2 ㎍) 근육내 전기천공
그 결과, 도 13b에서 나타난 바와 같이, BD-02만 단독투여한 실험군(BD-02B+BD-02C)에서는 프라이밍 2주후에는 T 세포-특이적 면역반응이 관찰되지 않았다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD121A 병용투여군(BD02 DP)에서는 1:1:0.6까지는 BD121A 농도 의존적인 T 세포-특이적 면역반응의 증가가 확인되었다. 그러나, 그 이상의 투여량에서는 더 이상의 T 세포-특이적인 면역반응의 증가가 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-02 및 BD121A 백신 조성물에 있어서 BD-02B:BD-02C:BD121A의 배합비율은 2:2:0.6 에서도 의미 있는 면역증강 효능이 나타남을 확인하였다.
3-5: HPV에 대한 T 세포-특이적 면역반응 분석
본 발명자들은 한국 공개특허공보 제10-2017-0045254호에 기재된 16형/18형 2가 HPV DNA 백신 컨스트럭트를 이용하여 BD-121의 T 세포-특이적 면역반응 강화 여부를 조사하였다.
구체적으로, 실험동물인 C57BL/6 마우스를 대조군인 공 벡터 투여군(pGX-27 투여, n=10), 상기 2가 HPV DNA 백신 컨스트럭트 단독 투여군(n=10), 상기 2가 HPV DNA 백신 컨스트럭트 8 ㎍ + BD-121 1 ㎍ 투여군(n=10), 및 상기 2가 HPV DNA 백신 컨스트럭트 8 ㎍ + BD-121 3 ㎍ 투여군(n=10)으로 나눈 후, 첫 번째 백신 투여(프라이밍) 2주 경과 후 실험동물의 절반(각 실험군 당 n=5)은 희생시켜 비장을 적출하여 프라이밍에 따른 T 세포-특이적 면역반응을 분석하는데 사용하였고, 나머지 절반(각 실험군 당 n=5)은 프라이밍 2주 경과 후 2차 접종(부스팅)을 하였으며, 마찬가지로 부스팅 2주 경과 후 실험동물을 희생시켜 비장을 적출한 후 항원에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포수를 ELISPOT 분석으로 계수하는 방법으로 T 세포-특이적 면역반응을 분석하였다(도 14).
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 상기 2가 HPV DNA 백신 컨스트럭트 단독 투여시에는 T 세포-특이적인 면역반응이 미미하였으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 투여시 농도 의존적인 T 세포-특이적인 면역반응을 강화시켰다.
이어, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 상기 HPV 14 DNA 백신(BD-14A)에 대한 BD-121 및 BD-121A의 백신 면역보조제로서의 성능을 확인하기 위해, 상기 실시예 5에서 제조된 BD-14(BD-14A, BD-14B 및 BD-14C)를 단독 또는 BD-121A와 함께 병용투여한 후 T 세포-특이적 면역반응을 분석하였다(표 5).
14가 HPV DNA 백신에 대한 다양한 백신 면역보조제의 효과 분석 실험개요
실험군 투여 DNA 컨스트럭트 투여량 투여경로
1 Mock - 근육내 전기천공
2 BD-14 2 ㎍
3 BD-14 + Mip-1α 2 ㎍ + 2 ㎍
4 BD-14 + IL-12/IL-21 2 ㎍ + 2 ㎍
5 BD-14 + IL-12/IL-21 + Mip-1α 2 ㎍ + 2 ㎍ + 2 ㎍
구체적으로 C57BL/6 마우스를 실험동물로 하여 대조군으로 공 벡터 투여군(n=10), BD-14 2 ㎍ 투여군(n=10), BD-14 2 ㎍ + MIP-1α 2 ㎍ 투여군(n=10), BD-14 2 ㎍ + BD-121 2 ㎍ 투여군(n=10) 및 BD-14 2 ㎍ + BD-121 2 ㎍ + Mip-1α 2 ㎍ 투여군(n=10)으로 나눈 후, 첫 번째 백신 투여(프라이밍) 2주 경과 후 실험동물의 절반(각 실험군 당 n=5)은 희생시켜 비장을 적출하여 프라이밍에 따른 T 세포-특이적 면역반응을 분석하는데 사용하였고, 나머지 절반(각 실험군 당 n=5)은 프라이밍 2주 경과 후 2차 접종(부스팅)을 하였으며, 마찬가지로 부스팅 2주 경과 후 실험동물을 희생시켜 비장을 적출한 후 항원에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포수를 ELISPOT 분석으로 계수하는 방법으로 T 세포-특이적 면역반응을 분석하였다(도 15a 및 15b).
그 결과, 도 15b에 나타난 바와 같이, BD-121 및 BD-121A는 모두 BD-10A 단독 투여군 및 BD-10A 및 MIP-1α 병용투여군에 비해 T 세포-특이적 면역반응을 대폭 강화시켰다.
실험예 4: 전임상 분석
본 발명자들은 상기 실시예 3의 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121이 다양한 바이러스 항원에 대하여 항체 생성에 큰 영향 없이 T 세포-특이적인 면역반응을 강화함을 확인하였다. 이에 실제 동물 모델을 이용한 전임상 연구에서도 DNA 백신 단독 투여시보다 바이러스 감염에 의한 병리학적 증상을 완화시킬 수 있는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, 실험동물로 게잡이 원숭이(Cynomolgus monkey)를 실험군 당 3마리씩 사용하였고, 투여군은 BD-02 단독 또는 BD-121A를 병용 투여군으로 나누었다. 각 투여군은 1.8 mg의 DNA를 전기천공법 근육경로로 3주 간격 2회 투여를 했으며, 투여 전 시점(VS, -14일 및 -5일), 1회 투여 후 시점(VT1, 21일), 및 2회 투여 후 시점(VT2, 35일)에 BD-02 특이적 면역 반응 평가를 진행 하였다(도 16a). 각 시점에 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)을 BD-02에 포함된 항원인 HSV-2 gD와 UL39 항원에 대한 peptide pool로 자극 후 특이적 반응 세포를 ex vivo ELIPOST 분석법을 통해 평가하고 SFC(spot forming cells)로 표기 하였다.
그 결과, 도 16b와 같이 BD-02 특이적인 면역반응은 투여전 시점에는 관찰 되지 않은 반면 투여 후 투여횟수 의존적으로 증가함을 확인하였다. 특히 BD-02 단독 투여군에 비해 BD-121A 병용 투여에 의해 BD-02 특이적 면역반응이 매우 크게 상승함을 확인하였으며, 투여 횟수가 증감함에 따라 격차가 더욱 커지는 결과를 관찰하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 및 BD-121A는 다양한 바이러스의 감염으로부터 항체 생성능에는 큰 영향 없이 상기 바이러스의 다양한 항원에 대하여 T 세포-특이적인 면역반응을 획기적으로 강화시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 및 BD-121A는 항체 생성에는 영향을 주지 않으면서도 항원에 특이적으로 반응하는 T 세포를 선택적으로 증가시키는 T 세포-특이적 면역반응을 획기적으로 강화시키기 때문에, 다양한 감염성 바이러스에 의한 감염 예방 및 치료는 물론 자궁경부암 등 암의 세포성 면역강화를 통한 면역치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 가령, 항암면역치료반응의 경우 암세포(tumor cell)에 또는 암 연관항원(tumor-associatd antigen)에 대한 항체반응의 치료적 효과는 거의 없는 것으로 알려져 있기 때문에 암세포 또는 암 연관항원-특이적 T 세포 반응을 효율적으로 증가시키는 것이 매우 중요한 요소이다. HSV-2 또는 HPV 같은 바이러스 감염에 대한 치료면역반응 또한 항체 반응이 아닌 T 세포 반응이 결정적인 역할을 하기 때문에 T 세포 반응을 효율적으로 증가시키는 것이 매우 중요하다. 이런 이유로 항원 또는 백신 특이적 T 세포 반응만을 선택적으로 향상 시킬수 있는 BD-121 및 BD-121A의 적용은 위에서 언급한 여러 질환에 대한 새로운 치료제의 개발로 연결될 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> SL VAXIGEN, Inc. <120> A novel vaccine adjuvant <130> PT17-5177 <150> KR 10-2018-0013329 <151> 2018-02-02 <160> 68 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg 20 25 30 Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val 35 40 45 Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro 50 55 60 Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg 65 70 75 80 Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr 85 90 95 Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys 100 105 110 Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu 115 120 125 Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser 145 150 155 160 Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys 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agagctccga ggtcctggga agcggcaaga cactgactat tcaggtgaaa 240 gaattcgggg atgctggaca gtacacatgt cataagggcg gggaggtgct gtcccactct 300 ctgctgctgc tgcataagaa agaagatggc atctggtcta ctgacattct gaaggatcag 360 aaagagccca agaacaaaac cttcctgaga tgcgaagcca agaattatag cgggaggttt 420 acctgttggt ggctgaccac aatctctact gacctgacct ttagtgtgaa gtctagtagg 480 gggtcaagcg atcctcaggg agtgacctgc ggagcagcta cactgagcgc agagcgggtc 540 agaggagaca acaaggagta cgaatattcc gtggagtgcc aggaagattc tgcatgtccc 600 gcagccgagg aatccctgcc tatcgaagtg atggtggacg ccgtgcacaa gctgaaatac 660 gaaaactaca catcctcttt ctttatccgg gacatcatta agccagatcc ccctaaaaac 720 ctgcagctga agcccctgaa aaattcacga caggtggagg tcagctggga ataccctgat 780 acatggagca ctccacattc ttatttcagt ctgacttttt gcgtgcaggt ccagggcaag 840 agtaaacgag agaagaaaga ccgggtcttc accgataaga catccgctac tgtgatctgt 900 cggaaaaacg ccagtatttc agtgagggct caggaccgct actatagttc aagctggtca 960 gagtgggcaa gcgtgccctg ttcctag 987 <210> 6 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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atggcacaga gttcaccttt 1260 gagggctcct gcatgttccc agacggctgt gatgccgtgg actgcacctt ctgtagagag 1320 tttctgaaga acccacagtg ctaccccgcc aagaagtggc tgtttatcct gatcgtgatc 1380 ctgctgggct atgccggcct gatgctgatc acaaatgtgc tgaaggccat cggcgtgtgg 1440 ggatcttggg tcatcgcacc cgtgaagctg atgtttgcca tcatcaagaa gctgatgagg 1500 accgtgtcct gcctgatggg caagctgatg gacaggggcc ggcaggtcat ccacgaggag 1560 atcggcgaga acggcgaggg caatcaggac gatgtgcgga tcgagatggc cagacctcgg 1620 agagtgaggc actggatgta cagcccagtg atcctgacaa tcctggcaat cggcctggca 1680 gagggatgcg atgagatggt gcacgccgac tccaagctgg tgtcttgccg ccagggctcc 1740 ggcaacatga aggagtgcgt gaccacaggc cgggccctgc tgcctgcagt gaatccaggc 1800 caggaggcat gtctgcactt caccgcacca ggctcccctg actctaagtg cctgaagatc 1860 aaggtgaagc gcatcaacct gaagtgtaag aagtctagct cctattttgt gcccgatgcc 1920 cggagcagat gcacatccgt gaggcgctgt agatgggcag gcgactgcca gagcggctgt 1980 ccaccccact tcacctccaa ttcttttagc gacgattggg ccggcaagat ggatagagca 2040 ggcctgggct tcagcggatg ctccgacgga tgtggaggag cagcatgcgg atgtttcaac 2100 gcagccccct cctgcatctt ttggaggaag tgggtggaga atcctcacgg catcatctgg 2160 aaggtgagcc catgtgcagc atgggtgccc tccgccgtga tcgagctgac aatgccatcc 2220 ggagaggtgc gcaccttcca ccccatgtct ggcatcccta cacaggtgtt taagggcgtg 2280 agcgtgacct acctgggcag cgatatggag gtgtccggcc tgaccgacct gtgcgagatc 2340 gaggagctga agtccaagaa gctggccctg gcaccttgta accaggcagg aatgggagtg 2400 gtgggcaagg tcggcgagat ccagtgctct agcgaggaga gcgcccgcac aatcaagaag 2460 gatggctgta tctggaacgc agacctggtg ggaatcgagc tgagggtgga cgatgccgtg 2520 tgctactcta agatcaccag cgtggaggcc gtggccaatt attccgccat ccctaccaca 2580 atcggcggcc tgcggttcga gagatctcac gatagccagg gcaagatctc cggctctcca 2640 ctggacatca ccgccatccg cggcagcttt tccgtgaact acaggggcct gcgcctgtct 2700 ctgagcgaga tcaccgccac atgcaccggc gaggtgacaa acgtgagcgg ctgctattct 2760 tgtatgaccg gcgccaaggt gtctatcaag ctgcactcct ctaagaacag cacagcccac 2820 gtgcggtgta agggcgatga gacagccttc tccgtgctgg agggcgtgca ctcttataca 2880 gtgtccctgt cttttgatca cgccgtggtg gacgagcagt gccagctgaa ctgtggcggc 2940 cacgagagcc aggtgaccct gaagggcaat ctgatcttcc tggatgtgcc aaagtttgtg 3000 gacggcagct acatgcagac atatcactcc acagtgccca ccggcgccaa tatcccttcc 3060 ccaaccgact ggctgaacgc cctgttcggc aatggcctgt ctaggtggat cctgggcgtg 3120 atcggcgtgc tgctgggagg cctggccctg ttctttctga tcatgtctct gttcaaactg 3180 ggcactaagc aggtctttcg gtcccgcaca aaactggctt aa 3222 <210> 48 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding SFTS NP protein <400> 48 atgtcggagt ggtccaggat tgcagtggag tttggtgagc agcagctcaa tttgtctgag 60 cttgaggatt tcgcgagaga actggcctat gaaggccttg accctgcttt gatcatcaag 120 aagctgaagg agacaggtgg agatgattgg gtgaaggata caaagttcat cattgtcttt 180 gccctgactc gaggcaacaa gatcgtcaag gcatcaggga aaatgtcaaa ctcagggtcc 240 aagaggttga tggcactcca agagaaatat ggactggttg agagggcaga gaccaggctc 300 tcaatcactc ctgtgagggt tgcgcagagc cttcccactt ggacatgtgc tgcagcagca 360 gccttgaagg agtatctccc tgtggggcca gccgtcatga acctgaaggt cgagaattat 420 ccccctgaga tgatgtgcat ggcctttgga tccctgattc caactgcggg ggtatctgaa 480 gccacaacca agaccctgat ggaggcctac tctctgtggc aagatgcctt caccaagact 540 atcaatgtga agatgcgcgg agccagcaag acagaagttt acaactcctt cagggaccct 600 cttcatgctg ctgtgaactc tgtcttcttt cccaatgatg ttcgggtaaa gtggctgaag 660 gccaagggga tccttggccc agatggggtc cccagcagag ctgctgaggt tgctgctgct 720 gcttacagaa acctg 735 <210> 49 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding SFTS NSs protein <400> 49 atgagcctga gtaagagcag caatgtggat ctgaaaagcg tcgcaatgaa tgccaacacc 60 gtccgcctgg aaccatcact gggggaatac cctaccctga ggcgggacct ggtggagtgc 120 agctgttccg tgctgacact gtctatggtg aagaggatgg gcaagatgac caacacagtg 180 tggctgttcg gcaaccccaa gaatcctctg caccagctgg agccaggcct ggagcagctg 240 ctggacatgt actataagga tatgaggtgc tactctcaga gggagctgag cgccctgagg 300 tggccctccg gcaagcccag cgtgtggttt ctccaggccg cccacatgtt ctttagcatc 360 aagaactcct gggctatgga gacaggcaag gagaattggc ggggcctgtt ccacagaatc 420 acaaagggcc agaagtatct gtttgagggc gacatgatcc tggatagcct ggaggcaatc 480 gagaagaggc gcctgaggct gggcctgcca gagatcctga tcaccggcct gtcccctatc 540 ctggacgtgg ccctgctcca gatcgagtcc ctggcccggc tgagaggcat gtctctgaat 600 caccacctgt tcaccagctc ctctctgcgg aagccactgc tggactgctg ggatttcttt 660 atccccgtgc ggaagaagaa gaccgacggc tcttatagcg tgctggatga ggacgatgag 720 cccggcgccc tccagggcta cccacacctg atggcccact atctgaacag gtgtcccttc 780 cacaatctga tcaggtttga tgaggagctg cgcacagccg ccctgaatac catctggggg 840 cgggactggc ctgctatcgg cgacctgcct aaggaagtgt aa 882 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (GGGGS)n linker peptide unit <400> 50 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (GSSGGS)n linker peptide unit <400> 51 Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 52 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 53 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 54 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (EAAAK)n linker peptide unit <400> 55 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 56 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 57 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 57 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 58 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 59 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 60 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 61 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 62 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp 1 5 10 15 Val <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 63 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 64 Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 65 Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 66 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 67 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 68 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 68 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu 20 25 30

Claims (16)

  1. IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하며, 백신 단독 투여시에 비하여 낮은 항체 반응을 유도하고, 항원-특이적 T 세포 면역반응을 증가시키는, 바이러스 감염 예방 및 치료용 백신의 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제.
  2. 제1항에 있어서,
    하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 백신 면역보조제:
    상기 IL-12 단백질을 구성하는 p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 내지 세 개의 벡터; 및
    상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 mRNA 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    B 림프구 특이적 면역반응을 야기하지 않으면서 T 림프구 특이적 면역반응을 촉진하는, 백신 면역보조제.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 IL-12p35 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 백신 면역보조제.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 IL-12p40 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-12p40인, 백신 면역보조제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 IL-21 단백질은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21인, 백신 면역보조제.
  7. 제2항에 있어서,
    하기 중 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 백신 면역보조제:
    MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 MIP-1α 유전자컨스트럭트; 및
    상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질 중 어느 하나 이상에 IRES 또는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 작동가능하게 연결된 복합 유전자컨스트럭트; 및
    MIP-1α 단백질을 암호화하는 mRNA 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 MIP-1α 단백질은 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 백신 면역보조제.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 MIP-1α 유전자컨스트럭트는 별도의 발현벡터에 포함되거나, 상기 IL-12 단백질을 구성하는 p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 내지 세 개의 벡터 중 어느 하나 이상의 벡터 내에 포함되는, 백신 면역보조제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 면역 백신보조제; 및
    감염성 바이러스 유래 항원, 상기 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 상기 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 항원 유전자컨스트럭트 또는 상기 유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 예방 및 치료용 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 감염성 바이러스 유래 항원은 EBV(Epstein-Barr virus), HAV(hepatitis A virus), HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus), HDV(hepatitis D virus), HEV(hepatitis E virus), 한탄바이러스(Hantaan virus), CMV(cytomegalovirus), HIV(human immunodeficiency virus), 독감 바이러스(influenza virus), HPV(human papilloma virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 에볼라 바이러스(ebola virus), 로타바이러스(rotavirus), 댕기열바이러스(dengue virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열바이러스(yellow fever virus), 아데노바이러스(adenovirus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), BK 바이러스(BK virus), 천연두 바이러스(smallpox virus), 지카 바이러스(Zika virus), 중증열성혈소판감소증후근 바이러스 (SFTS virus) 또는 HSV(herpes simplex virus) 유래 항원인, 백신 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 면역 백신보조제를 바이러스 감염 예방 및 치료용 백신조성물과 함께 또는 상기 백신조성물 투여 전후로 인간을 제외한 포유동물 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 백신조성물에 의한 T 림프구 특이적 면역반응 촉진방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 백신보조제는 생체내 전기천공법에 의해 개체에 투여되는, T 림프구 특이적 면역반응 촉진방법.
  16. 제14항에 있어서,
    백신 단독 투여 시와 비교 시 상기 개체에서 낮은 항체반응을 유도하고 항원-특이적 T 세포 면역반응을 증가시키는, T 림프구 특이적 면역반응 촉진방법.
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