KR100399728B1

KR100399728B1 - ＩＬ-12 활성을 증가시키는 ＩＬ-12ｐ40 소단위체돌연변이 유전자 및 이를 ＤＮＡ 백신 면역증강제로이용하는 용도

Info

Publication number: KR100399728B1
Application number: KR10-2001-0012987A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 이성희; 하상준; 송만기; 장준
Original assignee: 주식회사 프로젠; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2000-03-15
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2003-09-26
Also published as: KR20010103577A

Abstract

본 발명은 높은 활성을 가진 사람과 생쥐 인터루킨-12 (Interleukin 12, IL-12)를 생산할 수 있는 IL-12p40 소단위체 돌연변이 유전자, 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 이를 DNA 백신 면역증강제로 이용하는 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성형의 IL-12의 경쟁적 저해제로 작용하는 사람 또는 생쥐 IL-12p40의 Asn-222 (사람) 또는 Asn-220 (생쥐) 아미노산에 돌연변이를 유발시킴으로써 IL-12p40의 분비는 저해하면서 IL-12의 면역 활성을 가지는 IL-12p70은 정상적으로 분비되도록 한 IL-12p40 돌연변이 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 IL-12p40 소단위체 돌연변이 유전자와 IL-12의 또 다른 소단위체인 IL-12p35 유전자를 함께 C형 간염 바이러스 (HCV)의 외피 당단백질 2 (E2)에 대한 DNA 백신을 이용한 면역화에 함께 사용할 경우, HCV-E2 DNA 단독으로 면역화된 경우나 IL-12p40 정상 유전자가 사용된 경우보다 오랜 기간 동안 최적의 세포성 면역 반응을 유도 및 유지할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이러한 결과를 통하여 IL-12p40 소단위체를 제외한 IL-12p70이 생체 내에서 장기간의 강력한 세포성 면역 반응을 도출할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명의 IL-12p40 돌연변이 유전자는 세포성 면역 반응이 필수 불가결한 것으로 알려져 있는 후천성 면역 결핍증 (AIDS), C형 및 B형 간염, 암, 독감, 결핵, 말라리아 등을 예방 및 치료하기 위한 유전자 치료 등에 유용하게 사용될 것이다.

Description

ＩＬ-12 활성을 증가시키는 ＩＬ-12ｐ40 소단위체 돌연변이 유전자 및 이를 ＤＮＡ 백신 면역증강제로 이용하는 용도{Genes of IL-12p40 subunit mutated for improving the activity of IL-12 and use thereof for DNA vaccine adjuvant}

본 발명은 높은 활성을 가진 사람과 생쥐 IL-12를 생산할 수 있는 IL-12p40 소단위체 돌연변이 유전자, 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 이를 DNA 백신 면역증강제로 이용하는 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성형의 IL-12의 경쟁적 저해제로 작용하는 사람 또는 생쥐 IL-12p40의 Asn-222 (사람) 또는 Asn-220 (생쥐) 아미노산에 돌연변이를 유발시킴으로써 IL-12p40의 분비는 저해하고 IL-12의 면역 활성을 가지는 IL-12p70은 정상적으로 분비되도록 한 IL-12p40 돌연변이 유전자; 상기 돌연변이 유전자를 포함하며 DNA 면역화 증진에 사용되는 발현 벡터; 상기 돌연변이 유전자를 AIDS, C형 및 B형 간염, 암, 독감, 결핵, 말라리아 등 질병의 DNA 백신 면역화를 위한 면역증강제 및 장기적인 면역활성 유지를 위한 면역증강제로 사용하는 용도에 관한 것이다.

IL-12는 적절한 자극이 주어진 후 대식세포 (macrophage), 단핵구 (monocyte)와 같은 항원 제공 세포 (Antigen presenting cell, APC)에 의해 분비되며, 생체 내에서 일어나는 각종 면역 반응을 조절하는 역할을 한다. 구체적으로, IL-12는 T 헬퍼 1 (Th 1) 세포와 NK (natural killer cell) 세포의 분화, 다양한 사이토킨 (cytokine) 생성의 조절, Th 1 세포에 의한 면역 반응의 상승, CD 8+ T 세포의 분화, 그리고 혈액 기원 세포 (hematopoietic cell) 증식 등의 넓은 분야에 걸친 기능을 가질 뿐 아니라 (Hsieh, C. S., et al.,Science,260:547-549, 1993), 특히 CTL 세포 (cytotoxic T lymphocyte)와 NK 세포의 가수 분해 능력 (Robertson, M. J., and J. Ritz.,Oncologist,1:88-97, 1999; Trinchieri, G.,Annu. Rev. Immunol.,13:251-276, 1995)을 증진시킴으로써 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 지금까지의 보고에 의하면 후천성 면역 결핍증 (AIDS) 환자의 경우 생물학적 활성을 가진 IL-12의 합성이 약 5배가 감소하였으며 (Chehimi, J. et al.,J. Exp. Med.,179:1361-1366, 1994), 또한 IL-12 수용체 유전자가 결손된 사람에게는 미코박테리아 (mycobacteria)에 대한 면역성이 상당히 감소되어 있음 (de Jong, R. et al.,Science,280:1435-1438, 1998)이 관찰되었다. 이러한 IL-12의 작용은 바이러스나 박테리아 그리고 다양한 종양에 대한 강력한 생체 내 면역 반응을 초기에 유도할 수 있기 때문에 이를 이용한 다양한 치료제의 개발도 활발히 진척되고 있는 추세이다.

IL-12가 위에서 제시한 여러가지 세포성 면역반응을 필요로 하는 질병에 효과적인 백신 또는 치료제로 사용될 수 있는 또 다른 이유로 제시될 수 있는 것은 IL-12가 생체 내에서 기억 Th1 세포 (memory Th1) 및 기억 CTL 세포 (memory CTL)의 증식에 관련이 있다는 가설에 기초하고 있다 (Stobie, L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:8427-8432, 2000; Mortarini, R. et al., Cancer Res., 60:3559-3568, 2000; Mbawuike, I.N. et al.,J. Infect. Dis., 180:1477-1486, 1999). 특별히 다양한 종양의 치료시 가장 문제가 되고 있는 전이나 재발의 문제에 초점을 맞추어 본다면 기억 면역 반응 (memory immune response)의 유도는 필수 불가결한 것이라고 볼 수 있다. 그러나 현재까지 IL-12가 이러한 효과를 보이는 것에 대한 정확한 기작은 밝혀져 있지 않다. 하지만 최근의 몇몇 보고에 의하면 IL-12에 의한 T 도움세포 1 (T helper 1) 분화 과정 중 증가되는 IFN-γ가 반증식 효과 (antiproliferative effect)를 나타낼 수 있기 때문에, IL-12가 CD4+ T 세포의 아폽토시스 (apoptosis)를 저해함으로써 기억 면역 반응이 유도될 수 있을 것이라는 기작이 제시되고 있다 (Fuss, I. J. et al.,Gastroenteroloogy, 117:1078-1088, 1999; Marth, T. et al.,J. Immunol.162:7233-7240, 1999). 또한, IL-12에 의해서 증가되는 IFN-γ가 기억 CD8+ T 세포의 강력하고 선택적인 자극에 관여하는 IL-15의 발현을 자극할 수 있으므로 (Zhang, X. et al.,Immunity8:591-599, 1998) 기억 면역 반응이 유도될 수 있을 것이라는 가설도 제기되고 있다. 이러한 보고들을 근거로 할 때 IL-12는 단지 초기 면역 반응 뿐 아니라 기억 면역 반응에도 관여할 수 있으므로 백신 면역화에 있어서 특별히 유용하게 사용될 가능성이 제기되고 있다.

IL-12의 생물학적 활성형태는 이형중합체로서 70 kDa인 IL-12p70이고, 공유 결합된 두 개의 소단위체 즉, p35와 p40 소단위체로 구성된다. p40 소단위체는 IL-6 수용체와 유사한 아미노산 서열을 공유하며, 따라서 사이토킨 수용체의 수퍼패밀리 (superfamily)에 속한다. 반면에 p35 소단위체는 사이토킨 수용체 수퍼패밀리와는 거리가 있으나, IL-6/과립성 백혈구 군집 촉진인자 (granulocyte colony stimulating factor: GM-CSF)를 포함하는 사이토킨 패밀리 (Gearing, D. P., and Cosman, D.,Cell,66:9-10, 1991)와 밀접한 관계를 갖는다.

시험관 내 (in vitro)와 생체 내 (in vivo)에서 IL-12p70의 발현시, p40 소단위체 IL-12p40은 단일체 (monomer)와 동형중합체 (homodimer)의 형태로 함께 대량으로 분비되는데 (Mattner, F. et al.,Eur. J. Immunol.,23:2202-2208, 1993; Heinzel, F. P. et al.,Infect. Immun., 62:4244-4249, 1994), 일반적으로 IL-12p40은 IL-12p70 보다 5 ~ 90배 이상 분비되고 IL-12의 수용체에 IL-12p70과 경쟁적으로 결합함으로써 IL-12p70의 활성을 강하게 저해한다고 보고되었다 (Gillessen, S. et al.,Eur. J. Immunol., 25:200-206, 1995; Ling, P. et al.,J. Immunol., 154:116-127, 1995). 이러한 사실은 IL-12p40이 형질전환된 쥐에서 Th 1 반응이 감소되는 현상 (Yoshimoto, T. et al.,J. Immunol., 160:588-594, 1998)과 IL-12p40를 생성하도록 제조된 근육아세포 (myoblast)의 이식시 동종간 거부현상이 일어나지 않는 현상 (Kato, K. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci,USA,93:9085-9089, 1996), IL-12p40을 발현하는 아데노바이러스 (adenovirus)에 의해 IL-12p70에 의한 종양의 감소가 저해되는 현상 (Chen L. et al.,J. Immunol.,159:351-359, 1997) 등을 포함하는 여러가지 생체 내 실험 결과에 의해 뒷받침되고 있다. 하지만 최근에는 동종이계 항원에 특이적으로 반응하는 Th 1의 발달을 유발하는 IL-12p70의 활성에 대한 IL-12p40의 긍정적 효과를 밝힌 보고도 있으며 (Piccotti, J. R. et al.,J. Immunol., 157:1951-1957, 1996), 대식세포의 주화성 물질로 작용하는 IL-12p40의 새로운 기능이 본 발명자에 의하여 밝혀진 바 있다 (Ha, S. J. et al.,J. Immunol., 163:2902-2908, 1999).

현재는 IL-12p70의 항암성 효과를 증명하기 위하여 다양한 생체 내 (in vivo) 시스템이 확립되었다. 그러나, 사람 재조합 IL-12p70 단백질을 암환자에게 직접 투여할 경우 사망까지 유발할 수 있는 심각한 독성을 나타내기 때문에 (Robertson, M. J. and Ritz. J.,Oncologist,1:88-97, 1996; Cohen, J.,Science,270:908, 1995), 이러한 부작용을 방지하고 경제적으로도 효율적인 방법이 모색되면서 IL-12 유전자를 이용한 유전자 치료 방면으로 많은 연구가 이루어지게 되었는데, 그 결과 매우 효과적이고 독성이 없음이 증명되었다 (Rakhmilevich, A. L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,93:6291-6296, 1996; Tahara, H. et al.,J. Immunol., 154:6466-6474, 1995; Lotze, M. T. et al.,Ann. N.Y. Acad. Sci.,795:440-454, 1996).

IL-12를 이용한 유전자 치료를 위해서는, IL-12의 생물학적 활성형인 IL-12p70 (Gubler, U. et al.,Proc.Natl. Acad. Sci.USA,88:4143-4147, 1991)의 생산이 필수적이며, 따라서 한 세포 내에서 p35와 p40 소단위체의 cDNA가 동시에 발현되는 것이 요구된다. 두 p35, p40 소단위체를 한 세포 내에서 동시에 발현시키기 위해서 이들을 동일한 플라스미드 내에 연속적으로 배열시켜 p35와 p40 유전자가 각각 발현되도록 발현 카세트 (expression cassette)를 이용하는 방법 (Rakhmilevich, A. L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93:6291-6296, 1996)이나, EMCV (encephalomyocarditis virus)의 IRES (Internal ribosomal entry site)를 이용하여 두 유전자를 동시에 발현시키는 방법들이 이용되어 왔는데, 이러한 방법은 세포 내에서 IL-12p70을 성공적으로 발현시킬 수는 있으나, 상술한 바와 같이 과다한 양의 IL-12p40의 지속적인 발현으로 인하여 IL-12p70의 생물학적 작용을 방해할 가능성을 제거할 수는 없었다.

이를 극복하기 위하여, 최근 항체 제조시 일반적으로 이용되는 단백질 링커 (linker)를 코딩하고 있는 DNA 서열을 이용하여 p35와 p40 소단위체를 연결하는 방법이 제시되었다 (Lieschke, G. J. et al.,Nat.Biotechnol., 15:35-40, 1997; Lode, H. N. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95:2475-2480, 1998; Lee, Y. L. et al.,Human Gene Ther., 9:457-46534, 1998). 상기 방법을 통해 과량의 IL-12p40에 의해 IL-12p70의 생물학적 활성이 저해되는 것은 막을 수 있었으나, p35와 p40의 두 소단위체를 연결시킴으로써 유발되는 구조의 변화로 인해서 생성된 IL-12p70의 활성도는 5-100배 이상 감소하는 문제점 때문에 충분한 효과를 거두지 못하였다. 따라서 IL-12 유전자를 이용한 암 또는 다른 질병에 대한 효율적인 치료를 위해서는 IL-12p40이 분비되지 않으면서 활성도가 유지되는 IL-12p70의 생성을 유도하는 방법이 필수적인 과제로 인식되고 있는 실정이다.

당쇄화 (glycosylation)는 단백질의 폴딩 (folding), 분비, 구성, 안정성 그리고 생물학적 역할에 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다. 사람 IL-12의 p35와 p40 소단위체는 각각 56개와 22개의 친유성 신호서열을 갖는 아미노산을 포함하여 219개와 328개의 아미노산을 발현하는데, p35와 p40 소단위체 내에 존재하는 3개와 4개의 N-당쇄화 가능 부분이 사람 IL-12 아미노산 서열 분석을 통해 밝혀졌다 (Podlasky, F. J. et al.,Arch. Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992). Stern 등은 트리플루오로메탄술폰산 (trifluoromethane-sulfonic acid) 또는 해당효소 F (glycosidase F)로 사람 IL-12를 처리한 후에 IL-12p35와 IL-12p40의 분자량을 조사한 결과 각각 감소한 분자량을 나타냄을 보고하였다 (Stern, A. S. et al.,Arch. Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992). 이는 사람 IL-12의 p35와 p40 소단위체가 탄수화물을 성분으로 가짐을 나타내는 것이다. 동일한 보고서에서 뉴라미니다아제 (neuraminidase)와 내부 α-N-아세틸-갈락토사미니다아제 (endo-α-N-acetyl-galactosaminidase)를 연속하여 IL-12p35에 처리하였을 때 IL-12p35의 분자량이 감소되는 반면에 IL-12p40은 동일 처리에 영향을 받지 않는다는 사실이 증명되었는데, 이는 IL-12p35에는 O-결합에 의한 당쇄가 존재하는 반면 IL-12p40은 O-결합된 당쇄를 가지지 않는다는 사실을 나타낸다. 또한, 사람 IL-12p40 소단위체의 4개 N-당쇄화 가능 부분 중 Asn-135와 Asn-222 아미노산에 대한 N-당쇄화가 분석되었는데, 이중 Asn-222 부분에 실제로 N-당쇄화가 일어나고 있음이 밝혀졌다. 그러나, 사람 IL-12p40 소단위체의 나머지 부분과 사람 IL-12p35 소단위체, 그리고 생쥐 IL-12의 두 소단위체에 대한 N-당쇄화 여부는 아직까지 밝혀져 있지 않으며,또한 당쇄화 부분 및 당쇄화 가능 부분들이 IL-12의 합성, 분비, 생물학적 활성 등에 미치는 효과는 아직 규명되지 않았다.

한편, 다수의 바이러스성 또는 박테리아성 질병의 예방 및 치료, 암 생성 억제에는 체액성 면역 반응 (humoral immune response) 보다는 세포성 면역 반응의 증가가 요구되기 때문에 IL-12 유전자를 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. C형 간염은 바이러스가 매개하는 대표적인 질병으로서, HCV의 감염시 50% 이상이 만성 질환으로 진행되어 궁극적으로 간경변이나 간암 등의 질병을 일으키는 주요한 원인이 되고 있다 (Alter H. J. et al.,N. Engl. J. Med.,321:1494-1500, 1989). 현재 알파 인터페론이 이들에 대한 유일한 치료 방법으로 일반화되어 사용되고 있지만 치료 효과는 겨우 10-30% 정도에 이를 뿐이어서 (Weiland E. et al.J. Virol.,66:3677-3682, 1992), HCV에 대한 효과적인 백신이나 치료제 개발이 시급한 실정이다. 침팬지와 사람에 대한 임상 실험 보고에 의하면, HCV는 특이적인 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응이 모두 일어날 수 있으며 (Prince A. M. et al.,J. Infect. Dis.,165:438-443, 1992) HCV의 구조 단백질인 E1과 E2가 보호 면역 (protective immunity)을 유발하는데 가장 중요한 항원으로 밝혀졌다 (Choo Q. L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91:1294-1298, 1994). 또한 최근에는 상기 바이러스의 제거를 위해서는 체액성 면역 반응 보다는 CTL을 포함한 세포 매개성 면역 반응이 필수적인 것으로 보고된 바 있다 (Cooper S. et al.,Immunity,10:439-449, 1999; Rinaldo C. et al.,J. Virol.,69:5838-5842, 1995).

이러한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법으로 최근에 대두되고 있는 방법이 DNA 면역 방법이다. DNA 면역 방법은 병원체의 특정 성분을 코딩하는 DNA를 직접 인체에 주입하여 면역화를 달성한다는 점에서 약독화시키거나 죽인 병원체 또는 병원체의 일부 성분을 이용하는 종래의 면역 방법과 구분되며, 면역화 단백질의 실제적인 생산이 DNA를 주입받은 숙주 내에서 이루어지기 때문에 생균 또는 사균을 이용하는 경우에 발생할 수 있는 감염의 위험을 제거할 수 있는 장점이 있다. 이러한 DNA 면역 방법에 의해 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 등과 같은 여러 종류의 전염성 바이러스들에 대해 강력한 면역성을 유도할 수 있는 것으로 보고되어지고 있다 (Ulmer J. B. et al.,Science,259:1745-1749, 1993; Michel M. L. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92:5307-5311, 1995; Irwin M. J. et al.,J. Virol.,68:5306-5044, 1994). 또한 HCV의 캡시드 단백질 (core)과 E2 단백질 등에도 이러한 DNA 면역 방법이 적용되어 그 결과 이들에 대한 특이적인 면역성을 유도하였다는 보고가 있었다 (Major M. E. et al.,J. Virol.,69:5798-5805, 1995; Tedeschi V. et al.,Hepatology,25:459-462, 1997).

하지만, 이러한 DNA 면역 방법은 면역화 단백질이 생체 내에서 발현되는 빈도가 낮기 때문에 면역성이 낮은 항원에 대해서는 강한 면역 반응을 일으키지 못하는 한계성을 지닌다. DNA 면역 방법의 효과성을 높이기 위하여 몇몇 싸이토카인 (cytokine) 유전자나 면역 세포 활성화에 필요한 협력 촉진 물질 (costimulatory molecule) 유전자와 같은 보조인자 (adjuvant)를 사용하거나 (Geissler M. et al.,J. Immunol.,159:5107-5113, 1997; Iwasaki A. et al.,J. Immunol.,158:4591-4601, 1997; Lee S. W. et al.,J. Virol., 72:8430-8436, 1997) HCV에 대한 면역 반응을 효율적으로 유도하기 위해서 IL-12를 사용한 예 (Lasartte J. J. et al.,J. Immunol.,162:270-5277, 1999)가 있긴 하지만, IL-12를 이용하여 영장류 및 인간을 대상으로 한 DNA 면역화에 있어서는 긍정적인 결과가 보고되지 않는 상황 (Boyer J. et al.,Keystone Symposium on DNA vaccinesApril, 12-17, 1998)이다.

이와 같은 점에 착안하여 본 발명자들은 당쇄화의 조절을 통해 활성형의 IL-12p70을 발현하면서도 IL-12에 의한 면역 활성을 저하시키는 IL-12p40의 분비를 최소화할 수 있는 유전자를 제조하고자 연구한 결과, 사람 IL-12p40 소단위체의 당쇄화 부분인 Asn-222 아미노산과 생쥐 IL-12p40 소단위체의 당쇄화 가능 부분인 Asn-220 아미노산의 돌연변이화를 통해 얻은 돌연변이 유전자가 활성형의 IL-12p70의 발현을 증가시키면서 IL-12p40의 분비는 감소시킨다는 것을 밝히고 상기 돌연변이 유전자를 소동물 모델인 생쥐에 HCV E2 유전자와 함께 DNA 면역화하였을 경우 최적의 세포 매개성 면역 반응 특히 오랜 기간이 지난 뒤에도 이러한 면역반응이 지속적으로 유도되는 사실을 통하여 본 발명의 돌연변이 유전자가 DNA 백신의 면역증강제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 IL-12p70의 수용체에 대한 경쟁적인 결합을 통하여 IL-12p70의 활성을 저해하는 IL-12p40의 분비를 감소시키기 위하여, 사람 또는 생쥐에서 IL-12p40의 분비에 필수적인 당쇄화 부분을 돌연변이화 시킴으로써 Th1 세포를 통한 면역 반응의 증가 또는 CTL 세포의 활성화 같은 IL-12 고유의 역할을 활성화시키는 IL-12p40 돌연변이 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 IL-12p40 돌연변이 유전자가 포함된 발현 벡터를 DNA 백신과 함께 DNA 면역화함으로써 항원 특이적인 세포성 면역 반응을 증진 및 유지시키는 면역증강제로 사용하는 용도를 제공하는 것이다.

도 1은 사람과 생쥐의 IL-12p40 아미노산 서열의 상동성을 비교한 것이고,

도 2는 본 발명에서 야생형 사람 IL-12의 p40과 p35 소단위체와 두 소단위체의 N-당쇄화 가능 부분을 돌연변이화시킨 유도체들의 단백질 구성을 도시한 것이고,

도 3a은 본 발명에서 야생형 사람 IL-12p35와 당쇄화 부분 돌연변이들에 대하여 세포 파쇄물 (cell lysate)에서 수행한 면역 블러팅 (immunoblot) 결과이고,

도 3b는 본 발명에서 야생형 사람 IL-12p40과 당쇄화 부분 돌연변이들에 대하여 세포 파쇄물에서 수행한 면역 블러팅 결과이고,

도 3c는 본 발명에서 야생형 사람 IL-12p40과 당쇄화 부분 돌연변이들에 대하여 세포 배양 상등액 (supernatant)에서 수행한 면역 블러팅 결과이고,

도 4는 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, HCV)의 외피 당단백질 2 (Envelope glycoprotein 2, E2) 유전자와 생쥐 IL-12의 정상 또는 변이 유전자를 삽입시킨 본 발명의 발현 벡터를 도시한 것이고,

도 5a는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐의 혈청에서 시간별로 HCV E2에 대한 전체 IgG 항원 역가를 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅢ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2-mIL-12wt로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 5b는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐의 혈청에서 시간별로 HCV E2에 대한 IgG1 항원 역가를 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 5c는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐의 혈청에서 시간별로 HCV E2에 대한 IgG2a 항원 역가를 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 5d는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐의 혈청에서 시간별로 HCV E2에 대한 IgG2a 항원 역가와 IgG1 항원 역가의 비율 (IgG2a/IgG1)을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 6a는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화하고 3주 후에 생쥐의 비장에서 HCV E2 단백질에 의해 자극을 받아 비장의 면역 세포로부터 생성되는 IFN-γ의 생산수준을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 6b는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화하고 6주 후에 생쥐의 비장에서 HCV E2 단백질에 의해 자극을 받아 비장의 면역 세포로부터 생성되는 IFN-γ의 생산수준을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 6c는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화하고 10주 후에 생쥐의 비장에서 HCV E2 단백질에 의해 자극을 받아 비장의 면역 세포로부터 생성되는 IFN-γ의 생산수준을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 7은 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐의 비장에서 면역화 후 다양한 시기에 hghE2t를 발현하는 변형된 CT 26 종양세포를 이용하여 HCV E2에 특이적인 CTL 반응을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐,

a; 면역화 직후 (0주째), b; 면역화 후 3주 경과,

c; 면역화 후 6주 경과, d; 면역화 후 10주 경과,

e; 면역화 후 14주 경과, f;면역화 후 14주 경과시, 대조군 (CT26-neo 세포)

도 8a는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐에 hghE2t를 발현하는 변형된 CT 26 종양세포를 주입하고 2주 후에 생쥐의 혈청에서 HCV E2에 대한 전체 IgG 항원과 그의 아계열들인 IgG1 및 IgG2a의 수준을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 8b는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐에 hghE2t를 발현하는 변형된 CT 26 종양세포를 주입하고 2주 후에 생쥐의 혈청에서 HCV E2에 대한 IgG2a 항원 역가와 IgG1 항원 역가의 비율 (IgG2a/IgG1)을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 8c는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐에 hghE2t를 발현하는 변형된 CT 26 종양세포를 주입한 후 종양의 부피 변화를 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 8d는 본 발명의 DNA 벡터로 면역화된 생쥐에 hghE2t를 발현하는 변형된 CT 26 종양세포를 주입한 후 생쥐의 생존율을 측정한 결과이고,

GⅠ; 200 ㎍의 모조 플라스미드 pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅡ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 100 ㎍ pTV2로 면역화된 생쥐,

GⅣ; 100 ㎍의 pTV2-HCV-gDsE2t와 pTV2-mIL-12mut로 면역화된 생쥐

도 9은 IL-12의 생체 내 생물학적 기능을 나타낸 모식도이다.

▲; p35, ○; p40,

ㆀ; (p40)₂, ㆃ; IL-12 (p70)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 또는 생쥐 IL-12p40을 암호화하는 유전자들에 있어, 그 분비에 필수적인 역할을 하는 Asn-222 (사람) 또는 Asn-220 (생쥐) 부분을 다른 아미노산으로 치환시킨 사람 또는 생쥐 IL-12p40 소단위체의 돌연변이 유전자들을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사람 또는 생쥐 IL-12p40 소단위체의 돌연변이 유전자들과 소단위체의 동시 발현을 위한 IRES 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

아울러, 본 발명은 HCV의 외피 당단백질 2 (E2) 유전자를 포함하고 이들을 발현시킬 수 있는 DNA 백신 벡터와 Asn-222 (사람)와 Asn-220 (생쥐) 부분이 돌연변이화된 p40 소단위체 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 면역증강제로서 DNA 백신 면역화 또는 유전자 치료에 이용하는 용도를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은서열번호 1의 염기 서열을 갖는 사람 IL-12p40 또는서열번호 2의 염기 서열을 갖는 생쥐 IL-12p40을 암호화하는 유전자들에 있어, 그 분비에 필수적인 역할을 하는 Asn-222 (사람) 또는 Asn-220 (생쥐) 부분을 다른 아미노산으로 치환시킨 사람 또는 생쥐 IL-12p40 소단위체의 돌연변이 유전자들을 제공한다.

생쥐와 사람 IL-12p40에 대한 아미노산 서열의 상동성을 비교하면, 사람 IL-12p40의 Asn-222에 해당되는 생쥐 IL-12p40의 Asn이 아미노산 서열 220에 위치해 있으며 그 주변 아미노산 서열이 매우 유사하다 (도 1참조).

구체적으로, 사람 IL-12p40 소단위체의 222번째 Asn (Asn-222)을 지정하는 코돈 AAC는 CUC, CAG, AUA 등으로 변이될 수 있으며, 이때 각각에 해당하는 아미노산은 Leu, Gln, Ile 이다. 특히, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 cDNA 상에서 AAC를 CTC 또는 CAG로 바꿈으로써 AAC 코돈이 CUC 또는 CAG 코돈으로 치환되고, 결국 Asn-222 아미노산이 Leu-222 또는 Gln-222 아미노산으로 치환될 수 있는 유전자 (이하 'hp40-N222L' 및 'hp40-N222Q'이라 약칭함)를 제공한다.

또한, 사람 IL-12p40 소단위체의 Asn-222 부위와 상동성을 가지는 생쥐 IL-12p40 소단위체에 있어서도 220번째 Asn (Asn-220)을 지정하는 코돈 AAC는 CUC, CAG, AUA 등으로 변이될 수 있으며, 이때 각각에 해당하는 아미노산은 Leu, Gln,Ile 이다. 특히, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 cDNA 상에서 AAC를 CTC로 바꿈으로써 AAC 코돈이 CUC 코돈으로 치환되고, 결국 Asn-220 아미노산이 Leu-220 아미노산으로 치환될 수 있는 유전자 (이하 'mp40-N220L'이라 약칭함)를 제공한다.

본 발명의 돌연변이 유전자 hp40-N222L, hp40-N222Q와 mp40-N220L은서열번호 3, 서열번호 4및서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 코딩한다.

우선, 본 발명은 상기 유전자들을 포함하는 hp40-N222L/IRES/hp35, hp40-hp35/IRES/hp40-N222L 및 mp35/IRES/mp40-N220L 유전자를 제공한다. hp40-N222L/IRES/hp35 유전자 및 hp35/IRES/hp40-N222L 유전자는 Asn-222가 Leu-222으로 돌연변이화된 사람의 p40 소단위체 유전자와 함께 p35 소단위체를 코딩하는 유전자를 포함하고, mp35/IRES/mp40-N220L 유전자는 Asn-220 부분이 Leu-220으로 돌연변이화된 생쥐의 p40 소단위체 유전자와 함께 p35 소단위체를 코딩하는 유전자를 포함하며, 각각의 유전자 모두는 소단위체의 동시 발현을 위한 IRES 서열을 포함한다. hp40-N222L/IRES/hp35, hp35/IRES/hp40-N222L 및 mp35/IRES/mp40-N220L 유전자에서 IRES는 EMCV (encephalomyocarditis) 유래의 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. IRES 서열은 상기 두 유전자의 발현시 p40 소단위체와 p35 소단위체를 코딩하는 유전자의 동시 발현을 위해 바람직하다.

본 발명은 또한 상기에서 제공된 hp40-N222L/IRES/hp35, hp35/IRES/hp40-N222L 및 mp35/IRES/mp40-N220L 유전자를 각각 포함하는 발현 벡터인 pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35, pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L 및 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L을 제공한다.

본 발명에서는 바람직한 실시예의 하나로 pTV2 DNA 백신 벡터 (Song, M. K. et al.,J. Virol., 74:2920-2925, 2000)의 엠피실린 저항성 유전자 (ampicillin resistant gene) 대신 카나마이신 저항성 유전자 (kanamycin resistant gene)를 삽입시킴으로써 임상 실험이 가능하도록 고안된 DNA 백신 벡터인 pGX0 플라스미드의 외래 유전자 삽입 부위에 hp40-N222L/IRES/hp35 및 hp35/IRES/hp40-N222L 유전자를 삽입하였다. 또한 pTV2 DNA 백신 벡터 의 외래 유전자 삽입 부위에 mp35/IRES/mp40-N220 유전자를 삽입하였다. 그러나, 상기 발현 벡터의 제조에 이용된 플라스미드 이외에도 다양한 원핵 세포용 또는 진핵 세포용 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 플라스미드 이외에 다른 발현 벡터를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 또한 발현 벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등도 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있다.

상기의 발현 벡터 pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L과 pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35은 2001년 2월 26일자로, 그리고 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L는 2000년 2월 29일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 0969BP, KCTC 0970BP 및 KCTC 0745BP).

p35와 p40 소단위체의 동시 발현은 생물학적으로 활성을 갖는 IL-12p70을 얻기 위해 필수적이기 때문에, 본 발명에서는 hp35 및 hp40 소단위체를 각각 발현하도록 하는 pCIN-hp35 및 pCIN-hp40 이외에도 EMCV의 IRES를 이용한 양전사 (bicistronic)적 발현 벡터인 pGX0-hp40/IRES/hp35 및 pGX0-hp35/IRES/hp40을 제작하였다. 사람 IL-12의 합성, 분비, 그리고 특이적 활성에 N-당쇄화가 미치는 영향을 이해하기 위해서 먼저 p35와 p40 소단위체에 존재하는 잠재적인 N-당쇄화 부분의 Asn 잔기를 부분지정 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)를 통해 다른 아미노산 잔기로 치환하였으며 (도 2참조), 돌연변이 단백질에 대한 야생형 단백질의 면역 블러팅 (immunoblot) 결과 (도 3a, 도 3b및도 3c참조) hp35 소단위체의 Asn-127, -141, hp40 소단위체의 Asn-222,-303의 4부분이 N-당쇄화 부분으로 이용되고 있음을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 hIL-12p70의 합성, 이종이합체화 (heterodimerization) 및 분비에 미치는 hp35 또는 hp40의 N-당쇄화 효과를 조사하기 위하여, 각각의 야생형 유전자 또는 그의 N-당쇄화 돌연변이 유전자들을 포함하는 hIL-12 발현 벡터들로 세포를 형질전환시킨 후 이로부터 얻은 배양 상등액 및 세포 파쇄물을 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다.

그 결과, hp35의 Asn-127은 IL-12p70의 세포 내 이종이합체화 뿐 아니라 그 분비의 감소에도 영향을 주고 있음을 알 수 있다. 하지만 hp35의 Asn-141은 야생형 hp35와 비교할 때 IL-12p40 및 IL-12p70의 이종이합체화와 분비에 큰 영향을 주는 것처럼 보이지 않았다 (표 1참조).

hp40의 Asn-135와 Asn-222의 돌연변이는 IL-12p70의 분비에는 영향을 주지 않지만 IL-12p40의 분비를 현저히 감소시킴을 알 수 있었다. 특히 Asn-222의 경우 hp40의 분비가 야생형 hp40에 비해 약 12% 정도까지 감소하였음을 알 수 있었다. hp40의 Asn-135는 면역 블러팅 결과 N-당쇄화가 이루어지지 않은 부분임에도 불구하고 Asn-135의 아미노산에서 상기 효과가 관찰되었는데, 이는 Asn-135의 아스파라긴 (Asn)이 그 자체로서 hp40의 분비에 중요한 부분이 될 수 있음을 의미한다. Asn-222의 아미노산은 글루타민 (Gln) 이외에 루신 (Leu)으로 대체된 경우에도 동일한 분비 양상을 나타내는 것으로 보아, 이러한 현상은 Asn-222의 N-당쇄화의 소실에 의한 것으로 생각되어 진다 (표 1참조). 따라서, Asn-222에서의 N-당쇄화가 이종이량체 hIL-12, hIL-12p70이 아니라 hIL-12p40가 단독으로 분비되는데 요구되어짐을 알 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 본 발명자들은 Asn-222에서의 N-당쇄화가 hIL-12p70의 이종이합체화와 분비에는 요구되지 않지만 hIL-12p40의 분비에는 필수적인 역할을 하는 반면, Asn-127에서의 hp35 N-당쇄화가 hIL-12p70의 이종이합체화와 분비에 중요한 역할을 수행함을 확인하였다.

본 발명자들은 hIL-12의 당쇄화가 생물학적 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 야생형 hIL-12와 잠재적 N-당쇄화 부위의 돌연변이를 포함하는 그의 유도체들의 IFN-γ유도능 (induction ability)을 ELISA로 분석하였다.

그 결과, IFN-γ유도능이라는 면에서 야생형과 그의 모든 유도체들 사이에 Asn-135 및/또는 Asn-222에서 돌연변이된 hp40 유도체들의 유전자와 야생형 hp35 유전자를 동시에 형질전환시켜 얻어진 배양 상등액은 야생형 또는 다른 hp40 돌연변이체들에 비하여 증가된 IFN-γ유도능을 나타내었다 (표 1참조). 또한 상기 두 상등액에 야생형 hp40에 비해 부족한 hp40의 양을 보충하여 동일한 실험을 수행한 경우, 증가되었던 IFN-γ유도능이 야생형과 비슷한 수준으로 감소됨을 확인하였다 (표 1참조). 이러한 결과는 hIL-12p70의 길항물질 (antagonists)로 알려져 있는 hIL-12p40의 수준이 hp40-N135Q 및/또는 hp40-N222Q를 포함하는 돌연변이체들의 배양 상등액 내에 다른 돌연변이체들에 비하여 상대적으로 매우 낮기 때문임을 제시하며, Asn-135 및/또는 Asn-222의 돌연변이에 의해서 생성된 hp70이 돌연변이에 의해서 그 활성이 증가된 것은 아님을 나타내 주고 있다.

또한, 본 발명자들은 hp40의 Asn-222에서의 당쇄화가 어떻게 hIL-12p40의 분비를 감소시키는지 조사하기 위하여 일정한 양의 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 벡터를 다양한 양의 야생형 hp35 DNA와 함께 세포에 동시 형질감염시켜 배양한 후 증폭된 사람 IFN-γ의 양을 ELISA로 측정하였다.

일반적으로 p35 소단위체는 단독으로 분비되지 않으며 p40과 결합되어 IL-12p70의 형태로 분비되는 반면 p40 소단위체는 단량체 (monomer) 또는 동종이량체 (homodimer)의 형태로 분비되는데, 이는 p35 소단위체가 아닌 p40 소단위체가 IL-12p70의 분비에 있어서 주요 요소로 작용함을 암시하는 것이다. 이러한 사실과 일치하게 상기 실험 결과, hIL-12p70의 분비량은 야생형 hp40과 hp40-N222Q 돌연변이 모두에서 형질감염된 hp35 DNA의 양에 비례하여 증가하였다 (표 1참조). 이러한 결과는 분비 결함 (secretion defect)을 갖는 hp40 소단위체가 hp35 소단위체와 결합되면 IL-12p70의 형태로 분비됨을 나타내는 것으로, hp35 소단위체가 hIL-12p70의 분비에 있어 또 다른 작용을 함을 암시하는 것이다. 최근에 hp40 내 형태적인 변화 (conformational change)가 hp35와의 결합에 의한 것임을 나타내는 연구가 보고되어 IL-12p70 분비에 있어 hp35 소단위체의 기여 가능성을 제시해준 바 있다 (Yoon, C et al.,EMBO J.,19:3530-3534, 2000). 상기 연구와 본 발명의 결과를 종합해 보면, Asn-222에의 당쇄화를 포함하는 hp40이 그 자체로는 분비에 결함을 갖지만 hp35와의 결합을 통한 hp40 부위의 형태적인 변화에 기인하여 hp70 형태로 분비될 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명자들은 p35와 p40 소단위체의 한 세포 내에서의 동시 발현을 유도함으로써 p40의 분비는 더욱 감소시키고자 하는 목적과 사용된 벡터 내의 싸이토 메갈로 바이러스 프로모터 (cytomegalovirus promoter, CMV)보다 IRES를 이용한 유전자의 발현 수준이 낮다는 사실을 통해 p40 유전자를 IRES 뒤에 위치시키는 것이 보다 낮은 p40의 생성을 유도함으로써 그 분비량도 낮추고자 하는 목적으로 hp40/IRES/hp35와 hp35/IRES/hp40 컨스트럭트를 제조하였다. 또한 각각의 플라스미드에서 hp40 유전자 대신 hp40-N222L 유전자가 치환되어 있는 hp40-N222L/IRES/hp35와 hp35/IRES/hp40-N222L 컨스트럭트를 제조하였다 (표 1참조). hp40/IRES/hp35와 hp40-N222L/IRES/hp35 컨스트럭트를 비교해 보면 후자에서 hp40의 분비가 약 7% 정도로 감소됨을 알 수 있는데 이는 hp35 컨스트럭트와 hp40-N222L 컨스트럭트를 각각 전기 천공하였을때 hp40의 분비가 12% 정도임을 감안할때 보다 그 분비가 감소하였음을 나타낸다. 즉, hp35 컨스트럭트와 hp40-N222L 컨스트럭트를 전기 천공시에는 두 플라스미드가 모두 한 세포에 형질전환되지 않을 경우가 발생할 수 있고 따라서 hp40-N222L 유전자 단독으로 세포에서 발현되면 hp70 분비없이 hp40이 소량 분비되므로, hp35와 hp40-N222L 유전자가 동시에 발현되는 hp40-N222L/IRES/hp35 유전자 보다 hp40의 분비가 다소 높을 것이라고 추측할 수 있다. 또한 hp40/IRES/hpp35 컨스트럭트와 hp35/IRES/hp40 컨스트럭트를 비교하여 보면, IRES 뒤쪽에 hp40 유전자를 배열시킴으로써 그 발현을 낮추었을때 hp70의 발현 및 분비는 그 차이가 크지 않음에 비해 hp40의 발현 및 분비는 매우 감소하였음을 관찰할 수 있다. 또한 hp40 유전자 대신 hp40-N222L 유전자를 hp35/IRES/hp40 컨스트럭트에 도입하여 hp35/IRES/hp40-N222L 컨스트럭트를 제작하였을 경우에는 hp40의 분비 수준이 0.3% 정도로 더욱 감소함을 알 수 있다. 본 실험에서는 결과적으로 hp35/IRES/hp40-N222L 컨스트럭트가 hp70의 분비 수준을 유지하면서 hp40의 분비를 최소화 할 수 있는 컨스트럭트임을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명은 HCV-1b의 E2 유전자를 포함하고 이들을 발현시킬 수 있는 DNA 백신 벡터와 Asn-222 (사람)와 Asn-220 (생쥐) 부분이 돌연변이화된 p40 소단위체 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

먼저, 본 발명자들은 본 발명의 hIL-12 돌연변이 유전자를 DNA 백신과 같은 유전자 요법 (gene theraphy)에 사용할 수 있는지 그 가능성을 조사하기 위하여, hp40 유전자의 Asn-222와 유사한 생쥐 IL-12p40 (mp40) 유전자의 염기서열을 조사하였다. 그 결과, 본 발명자들은 생쥐 p40의 Asn-220 아미노산이 사람 p40의 Asn-222와 매우 유사한 부위에 존재하며 현재까지 그의 아미노산 서열이 N-당쇄화되어 있다고 알려져 있지 않음을 확인하였다 (도 1참조). 이에, 본 발명자들은 mp40 유전자의 돌연변이, 즉 아미노산 서열 중 220번째 Asn을 부분 지정 돌연변이화 (Site-directed mutagenesis)에 의해 Leu 코돈으로 치환하여 동물 세포에서 발현 가능한 생쥐 IL-12p40 돌연변이 유전자가 포함된 pCIN-mp40-N220L 벡터를 완성하였다.

또한, 본 발명자들은 p40과 p35 소단위체를 코딩하는 동시에 발현하면서 DNA 면역화에 사용할 수 있는 벡터를 제작하기 위하여 이미 소동물에서 DNA 백신 벡터로 사용된 바 있는 진핵세포 발현 벡터인 pTV2 벡터 (Lee et al.,J. Virol.,72:8430-8436, 1998; Cho et al.,Vaccine,17:1136-1144, 1999)에 mp35/IRES/mp40 단편을 삽입함으로써 pTV2-mp35/IRES/mp40 벡터를 완성하였다. 아울러, 본 발명자들은 상기 실험에서 hp35/IRES/hp40-N222L 유전자가 hp70의 분비를 유지하면서 hp40의 분비를 최소화할 수 있다는 사실을 관찰하였기에 이를 근거로 하여, 본 발명의 생쥐 IL-12p40의 Asn-220 돌연변이 유전자를 포함하면서 p35를 동시에 발현시키는 벡터로서 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L 벡터를 완성하였다.

상기의 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L 벡터는 한국생명공학연구원 유전자은행에2000년 2월 29일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0745BP).

마지막으로, 본 발명자들은 진핵세포에서 HCV-E2 단백질을 발현할 수 있도록 시미안 바이러스 40의 복제 시작점 (simian virus 40 replication origin, SV40 ori), 싸이토메갈로바이러스 프로모터 (cytomegalovirus promoter, CMV), 아데노바이러스 (adenovirus)의 삼중 선도 서열 (tripartite leader sequence, TPL), 다중 클로닝 서열 (multiple cloning sequence, MCS), SV40 폴리아데닐화 서열 (polyadenylation sequence, polyA) 및 엠피실린 저항성 유전자 (ampicilin resistance gene: AmpR) 등으로 구성되고, HCV-E2 유전자가 다중 클로닝 서열 내에 클로닝 되어 있는 pTV2-HCV-E2 DNA 백신 벡터를 제조하였다 (Song M. K., et al.,J. Virol.,74:2920-2925, 2000) (도 4참조). 상기에 사용된 E2 유전자는 소수성 아미노 잔기 (hydrophobic amino acid residue)를 포함하는 카르복실 말단 (carboxyl-terminal: C-terminal) 부위를 제거하여 단백질의 분비를 용이하게 하였으며, 아미노실 말단 (aminocyl-terminal: N-terminal) 부위에 허피스 바이러스 (Herpesvirus: HSV) 외피 당단백질 D (glycoprotein D: gD)의 신호 서열 (signal sequence: s)을 연결시켜 단백질의 발현 및 세포의 분비를 효율화하고자 하였다.

상기와 같이 제작된 발현 벡터에서 생쥐 IL-12p40의 Asn-220 돌연변이화에 따른 IL-12p40 및 IL-12p70의 분비 양상을 확인하기 위하여 상기 벡터들을 세포에 형질전환시킨 후 세포 파쇄물과 세포 배양액을 얻어 생쥐 IL-12의 분비량을 ELISA (Pharmigen사)로 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 mp40-N220L 돌연변이체들은 IL-12p40 및 IL-12p70의 분비 및 그의 생물학적 활성이라는 측면에서 볼 때 hp40의Asn-222 돌연변이체들과 거의 유사한 특성을 나타내었다 (표 1참조).

마지막으로, 본 발명은 Asn-222 (사람)와 Asn-220 (생쥐) 부분이 돌연변이화된 p40 소단위체 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 면역증강제로서 DNA 백신 면역화 또는 유전자 치료에 이용하는 용도을 제공한다.

상기 방법은 AIDS, C형 및 B형 간염, 암, 독감, 결핵, 말라리아 등 인체 내 면역력 증가에 의해 치유될 수 있는 질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이전의 보고에 따르면, HCV-E2 항원 (pTV2-gDsE2t)을 암호화하는 플라스미드의 DNA 예방접종이 접종 후 3주 후에 항원-특이적인 체액성 (antigen-specific humoral) 및 세포-매개성 면역 반응 (cell-mediated immune response)을 유도하는데 충분함이 확인되었다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자가 야생형 mIL-12 유전자와 비교하여 생체 내 항원-특이적인 면역 반응에 효과적으로 영향을 미칠 수 있는지, 그리고 그러한 효과가 언제까지 지속적으로 유지될 수 있는지를 조사하기 위하여, 상기에서 제조된 본 발명의 DNA 백신 벡터를 생쥐에 추가로 접종한 후 HCV-E2 특이적인 항체 생성 여부를 정제된 hGH-E2 단백질을 이용하여 ELISA 방법을 통해 조사하였다.

그 결과, HCV E2 DNA 백신은 음성 대조군 수준 보다 상당히 높은 전신성 (systemic) HCV E2-특이적인 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 수준을 유도하였으며, 돌연변이 mIL-12 유전자 또는 야생형 mIL-12 유전자와의 동시 주입은 HCV E2 DNA 백신이 단독으로 투여된 경우와 비교하여 다소 높은 수준의 전체 IgG 수준을 나타내었다. IgG1의 수준도 HCV E2 DNA가 투여된 군과 비교하여 다소 높은 수준을 나타내었다. 반대로, HCV E2에 대한 IgG2a의 수준은 야생형 mIL-12 투여군에서 약간 증가되었고 HCV E2 DNA 단독 투여군과 비교해서는 돌연변이 mIL-12 투여군에서 상당히 증가되었다. 게다가, Th1 면역반응의 간접적인 표시자 (indicator)로 일반적으로 받여들여지고 있는 IgG2a/IgG1의 비는 IgG2 수준의 양상이 유사한 돌연변이 mIL-12 투여군에서 가장 높게 나타났다 (도 5a, 5b, 5c및5d참조). 이러한 결과는 돌연변이 mIL-12 유전자가 야생형 mIL-12 투여군 또는 HCV E2 단독 투여군에 비하여 체액성 면역 반응에 있어서 IgG1에서 IgG2a로의 IgG 소그룹의 전이에 상당한 영향을 미침을 나타내며 돌연변이 IL-12 유전자가 Th1 형태의 면역 반응을 유도함을 암시한다. 또한 이러한 효과는 DNA 추가 접종 후 0, 3, 6, 10 주에도 그대로 유지되는 양상을 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 세포-매개성 면역 반응의 역가를 평가하는데 사용되어 온 파라미터의 하나인 Th1 면역 반응에 있어서 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자의 효과를 조사하기 위하여 비장 세포로부터 IFN-γ발현을 측정하였다.

그 결과, 싸이토카인 유전자 없이 HCV E2 DNA만 투여된 군은 hghE2t 단백질 농도에 비례하여 IFN-γ의 수준이 증가된 반면, 모조 플라스미드 (mock plasmid) 접종군은 증가되지 않았다. 예상대로, 야생형 mIL-12 투여군에서 IFN-γ유도 수준은 HCV E2 단독 투여군에 비하여 보다 증강되었으며 돌연변이 mIL-12 투여군은 야생형 mIL-12 투여군에 비하여 2-3배 높은 IFN-γ생산 수준을 나타내었다 (도 6a, 6b및6c참조). 이러한 결과는 mIL-12p70이 항원-특이적인 Th1 면역 반응을 증가시키는 역할을 하고 mIL-12p40은 생체 내 IL-12p70에 의한 Th1 면역 반응의 유도를 억제하는 역할을 함을 암시하는 것이다. 이러한 효과는 DNA의 추가 접종 3주에서부터 나타나기 시작하여 10주가 되어서도 비슷한 양상을 나타내는데, 이는 mIL-12p70이 Th1 면역 반응을 초기에 유도할 뿐 아니라 이러한 면역 반응의 지속에도 관여함을 암시하는 것이다.

상기에 서술한 바와 같이, 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자가 HCV E2 DNA 면역화에 있어 장기간 Th1 면역 반응에 기여함을 확인한 본 발명자들은 돌연변이 mIL-12 유전자의 발현에 의해 유도된 Th1 면역 반응이 CTL 면역 반응 및 주요 세포-매개성 면역 반응과 연계되어 있어 돌연변이 mIL-12 유전자가 DNA 면역화 모델에서 CTL 활성의 유지에 관여하는지 조사하기 위하여 추가 접종 후 다양한 주령에서 DNA 면역화 생쥐로부터 얻은 비장 세포를 이용하여 CTL 분석을 수행하였다.

그 결과, 추가 접종 2주후 모조 플라스미드 투여군을 제외한 모든 그룹에서 메우 강한 항원-특이적인 CTL 활성을 나타내었으나, HCV E2 단독 투여군, 야생형 mIL-12 투여군 및 돌연변이 mIL-12 투여군 사이에서는 거의 차이를 보이지 않았다. 야생형 mIL-12 투여군에서 CTL 반응은 실험 기간 전체에 걸쳐서 HCV E2 단독 투여군에 비하여 높게 나타났는데, 이는 mIL-12 유전자가 증가된 CTL 형성에 중요한 역할을 수행함을 나타낸다. 흥미롭게도, 돌연변이 mIL-12 투여군과 다른 두 군 (HCVE2 투여군 및 야생형 mIL-12 투여군)간의 CTL 활성에 있어서의 차이는 추가 접종 기간이 길어질수록 시간에 따라 점점 더 현저하게 나타났다. 특히 10주 후의 CTL 반응은 HCV E2 투여군 및 야생형 mIL-12 투여군에서 매우 낮았는데, 이는 항원-특이적인 CTL의 분비량 (frequency)이 장기간 후에는 상당히 감소되기 때문이다. 반면 돌연변이 mIL-12 투여군은 항원-특이적인 CTL 반응을 유지하면서 다른 두 그룹 보다 5 내지 10배 높은 CTL 활성을 나타내었다 (도 7참조). 대조군으로서, CT26-neo 세포를 타겟 세포로 사용한 경우에는 모든 그룹에서 어떠한 용혈 현상 (cell lysis)도 관찰되지 않았는데, 이는 상기에서 관찰된 CTL 활성이 HCV E2-특이적임을 암시하는 것이다.

또한, 본 발명자들은 HCV E2에 특이적인 CD8+ T 세포의 생체 내 빈도를 측정함으로써 보다 정확하게 mIL-12 투여에 의한 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 증식 및 유지의 효과를 알아보고자 하였다. 이를 위해 두 가지 면역학적 분석 방법이 사용되었는데 한가지는 CD8+ T 세포내 항원 특이적으로 반응하여 IFN-γ를 분비하는 세포의 개수를 측정하는 방법이다. CTL 활성의 증강이 특정 항원에 대한 CD8+ T 세포의 분비에 의해 특이적으로 나타나는지를 알아보기 위해 CD8+ T 세포들을 분리한 후 PE (R-phycoerythrin) 접합된 항-생쥐 IFN-γ항체 또는 대조군 PE-접합된 동 기준 표본-짝 (isotype-matched) 항체를 첨가하여 세포를 이중염색하고 염색된 세포를 유세포 분석기 (FACSCalibur flow cytometry)로 분석하여 IFN-γ의 증가 양상을 관찰하였다.

그 결과, 돌연변이 mIL-12 유전자로 동시면역화된 생쥐는 추가 접종하고 0, 3, 6, 10, 14주 경과 후에 HCV E2 단독 및 야생형 mIL-12 투여군에 비하여 CD8+ IFN-γ생산 세포의 분비량이 점차 증가함을 볼 수 있는데, 이는 CTL 반응 결과와 비슷한 양상을 보인다. 하지만 CTL 반응 결과에서 보다 초기에도 HCV E2 단독군 보다 야생형 mIL-12 투여군에서 CD8+ T 세포 빈도가 높았으며 돌연변이 mIL-12 군의 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도가 가장 높았다. 이러한 빈도의 차이는 추가 접종 후 14 주째에는 현저하게 차이가 나서, HCV E2 단독 및 야생형 mIL-12 투여군에서는 항원 특이적 CD8+ T 세포가 거의 관찰되지 않는데 비하여, 돌연변이 mIL-12 투여군에서는 이러한 세포의 빈도수가 다소 감소하긴 하지만 유지됨을 관찰할 수 있었다 (표 2참조). 이러한 결과들은 돌연변이 mIL-12 유전자의 발현이 장기간 동안 DNA 면역화 후 CD8+ IFN-γ생산 T 세포의 분비량을 유지함을 입증하는 것이다.

항원 특이적인 CD8+ T 세포 빈도를 알아보기 위한 또 다른 분석방법인 제한 희석법 (limiting dilution assay: LDA) 을 통해 HCV E2 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 측정하였다. 즉, 제한 희석법은 DNA로 추가 접종된 생쥐의 비장 세포를 다양한 농도로 제한 희석한 후 CTL 면역 반응 관찰에서 처럼 E2를 발현하는 CT26 세포를 이용하여 상기와 같이 희석된 비장 세포와 함께 배양한 후 항원 특이적으로 자극받은 CD8+ T 세포들의 CTL 활성을 측정하는 방법이다. 그 결과, 제한 희석법에서도 세포내 IFN-γ염색법에서 얻어진 결과와 유사한 결과가 얻어졌다. 즉, 면역화 초기에서 돌연변이 mIL-12 투여군에서 가장 높은 항원 특이적 CD8+ T 세포 빈도가 관찰되었으며 추가접종 14 주 후에도 HCV E2 단독 및 야생형 mIL-12 투여군에서는 그 빈도가 매우 낮아짐에 비해 돌연변이 mIL-12 투여군에서는 그 빈도가 지속적으로 유지됨을 알 수 있었다 (표 2참조).

또한 본 발명자들은 DNA를 추가 접종하지 않고 한번 접종한 후 시기별로 HCV E2 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도 변화도 관찰하였다. 그 결과, 추가 접종시 보다 전반적으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 다소 감소하였으나 한번 접종시에도 돌연변이 mIL-12 투여군에서 가장 높은 CD8+ T 세포의 빈도가 관찰되었다 (표 2참조).

이로부터 본 발명자들은 세포-매개성 면역 반응에 있어서 IL-12p70 자체의 생체 내 역할은 Th1 및 CTL의 활성을 초기부터 유도할 뿐 아니라 오랜 기간 동안 유지하는 것인 반면, IL-12p40의 역할은 생체 내 길항물질로서 IL-12p70을 억제하는 것임을 확인하였다.

본 발명의 돌연변이 IL-12 유전자에 의해 생체 내에서 유도된 Th1 및 CTL 면역 반응을 확인하고 Th1 및 CTL 면역 반응과 방어적 면역 반응의 상관관계를 조사하기 위하여 DNA 추가 접종 12주째에 hghE2t를 발현하는 종양 세포인 CT26-hghE2t를 생쥐에게 투여하였다. 그리고 종양 주입 2주후에 생쥐의 혈청으로부터 HCV E2 특이적인 전체 IgG 및 그의 아계열 IgG1, IgG2a 항원의 수준 및 IgG2a/IgG1 비율을 조사하였다 (도 8a및8b참조). 그 결과, 종양 주입 전과 유사하게 돌연변이 mIL-12 투여군에서 가장 높은 IgG2a/IgG1 비율이 관찰되었는데, 이는 종양 주입 시에도 돌연변이 mIL-12 투여군에서 Th1 면역 반응이 발생하고 있음을 의미한다.

또한 종양 주입 후 약 30일 동안 종양의 크기를 측정한 결과, 야생형 mIL-12로 면역화된 생쥐의 그룹은 pTV2-gDsE2t 단독으로 면역화된 그룹에 비하여 지연된 종양 성장을 나타내었다 (도 8c참조). 또한 이렇게 종양이 주입된 생쥐의 생존율을 그룹 간에 비교한 경우에도 돌연변이 mIL-12로 면역화된 그룹은 약 70일 동안 약 90%의 생쥐가 생존해 있음을 관찰하였다. 이에 비해 E2 단독으로 주입된 그룹이나 야생형 mIL-12가 동시 주입된 그룹에서는 생존율이 20-30%에 그쳤다 (도 8d참조). 따라서, 이러한 결과는 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자에 의해 유도된 HCV E2-특이적인 Th1 및 CTL 반응이 변형된 종양 세포의 발현에 특이적인 항원의 챌린지에 대한 생체 내 방어를 부여함을 암시한다.

상기 실험을 통하여 본 발명자들은 본 발명의 IL-12p40의 분비에 필수적인 Asn-222 (사람) 또는 Asn-220 (생쥐)를 암호화하는 코돈이 돌연변이화된 사람 또는 생쥐의 IL-12의 p40 소단위체 유전자가 면역증강제로서 DNA 백신 면역화 또는 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명은 상기 사람 또는 생쥐의 IL-12의 p40 소단위체 돌연변이 유전자를 유효성분으로 하는, 항원-특이적인 세포성 면역 반응을 증진시켜 질병을 예방하고 치료하기 위한 DNA 면역화 및 유전자 치료용 면역증강제를 제공한다.

상기 면역증강제는 IL-12의 p40 소단위체 유전자를 DNA 백신과 함께 투여할 경우 CTL (cytotoxic T lymphocytes) 세포의 가수분해능력을 향상시키거나, T 헬퍼(T helper) 세포의 인터페론 감마 (IFN-γ)의 분비를 증가시키고, CD8+ 세포의 인터페론 감마 (IFN-γ)의 분비를 증가시킴으로써 면역반응을 증진시킬 수 있는 특징을 갖는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 사람 IL-12 발현 벡터의 제작

<1-1> 사람 IL-12 발현 벡터의 제작

PMA에 의해 활성화된 사람 B 세포인 NC37 세포로부터 상보적 프라이머를 이용한 RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) (PCR System 2400, Perkin Elmer사) 방법을 이용하여 820 bp인 사람 p35 소단위체와 1050 bp인 p40 소단위체의 cDNA를 클로닝하였고 PCR로 증폭하였다. 증폭된 cDNA는 각각 출발벡터인 pSK 플라스미드 (Stratagene사)에 삽입 (subcloning)하였는데, p35 및 p40 소단위체 유전자 모두 pSK의 SmaI 부분에 각각 삽입함으로써 pSK-hp35와 pSK-hp40을 제조하였다.

p40과 p35 소단위체를 코딩하는 유전자를 함께 발현하는 벡터 (bicistronic vector)를 제작하기 위하여, 먼저 EMCV의 IRES 유전자를 RT-PCR을 통해 얻은 후 이를 pSK 플라스미드의 SmaI과 PstI 제한효소 부위에 삽입하여 pSK-IRES 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 EcoRV로 절단하고 여기에 pSK-hp40을 XbaI과 BamHI으로 처리하여 얻은 p40 DNA 절편의 말단을 T4 DNA 중합효소로 채워 pSK-hp40/IRES를 제작하였다. 마지막으로 pSK-hp35에 제한효소 NcoI, SacI을 처리하여 생긴 p35 유전자 DNA 절편을 NcoI, SacI 처리된 pSK-hp40/IRES에 삽입함으로써, 결과적으로 p40, IRES, p35 유전자가 순서대로 배열된 pSK-hp40/IRES/hp35 플라스미드를 제작하였다.

또한 pSK-IRES 벡터를 EcoRV로 절단하고 여기에 pSK-hp40/IRES/hp35 플라스미드를 NcoI과 NotI으로 절단한 후 얻어진 hp35 DNA 절편을 T4 DNA 중합효소로 채워 EcoRV로 절단된 pSK-IRES에 삽입함으로써 pSK-hp35/IRES 플라스미드를 제작하였다. 이를 다시 BamHI과 NcoI으로 절단한 부위에 pSK-hp40을 NcoI과 BamHI으로 절단하여 얻어지는 hp40 절편을 삽입함으로써 pSK-hp35/IRES/hp40 플라스미드를 완성하였다. 상기의 방법으로 제조한 hp40/IRES/hp35 유전자와 hp35/IRES/hp40 유전자를 각각 pGX0 벡터의 제한효소 SpeI/NotI 과 XhoI/NotI 부분에 삽입함으로써 포유동물 세포에서 활성형의 IL-12p70을 발현할 수 있는 pGX0-hp40/IRES/hp35 및 pGX0-hp35/IRES/hp40 발현 벡터를 얻었다. pGX0 벡터는 기존의 DNA 백신 벡터인 pTV2 벡터 (Song, M. K. et al.,J. Virol., 74:2920-2925, 2000)의 엠피실린 저항성 유전자 내의 XmnI 부위를 절단하여 양쪽 블런트 말단을 만들고 여기에 PCR을 통해 pZErO-2 벡터 (Invitrogen 사) 내의 카나마이신 저항성 유전자를 삽입함으로써 완성되었다.

<1-2> p40 소단위체 발현 벡터의 제작

p40 소단위체를 발현하는 플라스미드의 제작을 위해서 pCIN-hp40/IRES/hp35 벡터를 제한효소 SacⅡ와 NotI으로 절단하여 p35 소단위체를 코딩하는 유전자를 제거한 후 T4 DNA 중합효소를 이용하여 끝 부분을 채움으로써 자가봉합 (self-ligation)하였으며, 이를 pCIN-hp40으로 명명하였다.

<1-3> p35 소단위체 발현 벡터의 제작

p35 소단위체를 발현하는 플라스미드의 제작을 위해서 pCIN-hp40/IRES/hp35 벡터를 NcoI으로 절단하고 T4 DNA 중합효소로 채운 다음 다시 제한효소 NotI으로 절단함으로써 p35 DNA 절편을 얻었고 이를 pCI-neo 벡터의 XhoI과 NotI 제한효소 부분에 삽입하였으며, 이를 pCIN-hp35로 명명하였다.

<실시예 2> 생쥐 IL-12 발현 벡터의 제작

<2-1> 생쥐 IL-12 발현 벡터의 제작

생쥐 p40과 p35 소단위체를 코딩하는 유전자를 함께 발현하는 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 EMCV의 IRES가 포함되어 있는 pSK-IRES 벡터를 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하고 여기에 생쥐 IL-12p40 PCR 생성물 (Schoenhaut D. S. et al.,J. Immunol.,148:3433-3440, 1999)을 동일한 제한효소로 절단하여 생긴 p40 DNA 절편을 삽입함으로써 pSK-IRES/mp40을 제작하였다. 이어, 생쥐 IL-12p35 생성물 (Schoenhaut D. S. et al.,J. Immunol.,148:3433-3440, 1992)을 BamHI으로 처리하고 T4 DNA 중합효소를 이용하여 말단을 채운 단편을 ClaI 및 T4 DNA 중합효소로처리된 pSK-IRES/mp40에 삽입함으로써, 결과적으로 p35, IRES, p40 유전자가 순서대로 배열된 pSK-mp35/IRES/mp40 플라스미드를 제조하였다. 상기의 방법으로 제조한 mp35/IRES/mp40 유전자를 pCI-neo 벡터 (Promega사)의 제한효소 XhoI과 NotI 부분에 삽입함으로써, 포유동물 세포에서 활성형의 IL-12p70을 발현할 수 있는 pCIN-mp35/IRES/mp40 발현 벡터를 얻었다.

<2-2> p40 소단위체 발현 벡터의 제작

야생형 생쥐 p40 소단위체를 발현하는 플라스미드의 제작을 위해서 pSK-mp35/IRES/mp40 벡터를 제한효소 NcoI과 SacI으로 절단하여 생성된 p40 단편을 동일한 제한효소로 처리된 pGEX-KG 벡터 (미국, Clontech사)에 삽입하였다. 이렇게 생성된 pGEX-KG-mp40을 EcoRI과 NotI을 처리하여 pCI-neo 벡터의 EcoRI과 NotI 부분에 삽입함으로써 pCIN-mp40 발현 벡터를 얻었다.

<2-3> p35 소단위체 발현 벡터의 제작

야생형 p35 소단위체를 발현하는 플라스미드의 제작을 위해서 pSK-mp35/IRES/mp40 벡터를 제한효소 XhoI, EcoRI으로 절단하여 생성된 p35 단편을 동일한 제한효소로 처리된 pCI-neo 벡터의 XhoI과 EcoRI 제한효소 부분에 삽입함으로써 pCIN-mp35 발현 벡터를 얻었다.

<실시예 3> 당쇄화가 부분 돌연변이된 IL-12p40과 IL-12p70의 제조

사람 p35와 p40 소단위체의 N-당쇄화 부분으로 이용될 것이라 예상되는 7개의 Asn 코돈은 부분 지정 돌연변이화 (Site-directed mutagenesis)에 의해 상관성이 없는 코돈으로 대체되었다. hp35와 hp40 소단위체의 N-당쇄화 부분으로 예상되는 부위에 대한 글루타민 돌연변이 유전자의 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 하라구치 등 (Haraguchi, et al.,J. Immunol., 163:2092-2098, 1999)에 의해 기술된 방법에 따라 PCR을 사용하여 아미노산 치환을 수행하였다. 이때, 돌연변이화를 위한 시발체로는서열번호 6으로 기재되는 T7,서열번호 7로 기재되는 T3,서열번호 8로 기재되는 hp40-N125Q(S),서열번호 9로 기재되는 hp40-N125Q(AS),서열번호 10으로 기재되는 hp40-N135Q(S),서열번호 11로 기재되는 hp40-N135Q(AS),서열번호 12로 기재되는 hp40-N222Q(S),서열번호 13으로 기재되는 hp40-N222Q(AS),서열번호 14로 기재되는 hp40-N303Q(S),서열번호 15로 기재되는 hp40-N303Q(AS),서열번호 16으로 기재되는 hp40-N127Q(S),서열번호 17로 기재되는 hp40-N127Q(AS),서열번호 18로 기재되는 hp40-N141Q(S),서열번호 19로 기재되는 hp40-N141Q(AS),서열번호 20으로 기재되는 hp40-N251Q(S),서열번호 21로 기재되는 hp40-N251Q(AS)의 뉴클레오타이드들을 합성하여 이용하였다 (이때, S와 AS는 센스 및 안티센스 시발체를 의미한다.).

hp40 및 hp35의 단일 글루타민 돌연변이 유전자 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <2-2> 내지 <2-3>에서 제조된 pCIN-mp40 또는 pCIN-mp35를 주형으로 하고 T7 시발체와 각각의 센스 시발체를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이와 유사하게, T3 시발체와 각각의 안티센스 시발체를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이로부터 돌연변이 지점 (mutational point)을 포함하는 공통 부위 (common site)를 공유하는 두 개의 PCR 단편들이 형성되었다. 2nd PCR은 상기 단편들의 혼합물을 주형으로 하고 플랭킹 시발체 (flanking primer)들을 사용하여 수행하였으며, 그 결과로 이들의 융합 단편 (fusion product)이 형성되었고 상기 단편을 pCI-neo 벡터에 삽입하였다. 이와 유사하게, 이중 및 삼중 돌연변이 유전자들은 단일 또는 이중 돌연변이 유전자들을 PCR 주형으로 사용하여 제작되었다. 돌연변이 유전자들은 DNA 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

mp40의 Asn-220에서 N-당쇄화 결함 (N-glycosylation defect)을 포함하는 생쥐 IL-12p70 유전자 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 제조된 pCIN-mp35/IRES/mp40 내 mp40 유전자 부위를 mp40-N222L로 치환하였다. pCIN-mp40-N222L을 제조하기 위한 mp40의 돌연변이화에서는 SacI 제한효소 부위를 포함하는서열번호 22로 기재되는 mp40-N220L(S) 및서열번호 23으로 기재되는 mp40-N220L(AS)의 뉴클레오티드를 시발체로 사용하여 상기와 같이 PCR을 수행하였다. 이로부터 증폭된 돌연변이 유전자들은 돌연변이화 후 생성되는 특정 제한효소 인식 부위에 대한 제한 효소 처리 및 DNA 염기서열 분석에 의해 확인하였다.

도 2는 본 발명에 사용된 사람 IL-12p40과 IL-12p35 소단위체의 정상 유전자와 변이 유전자의 아미노산 구성을 개략적으로 나타낸 것이다. N-당쇄화 가능 부분은 그 위치의 아스파라긴 (Asn) 아미노산 번호와 함께 Y 형태로 표시하였고, 각 변이 유전자에서 치환된 아미노산은 사각형 내에 표시하였다.

<실시예 4> IL-12p40의 단독 분비에 대한 사람 IL-12p40의 Asn-222의 N-당쇄화 영향

열로 비활성화된 FBS (fetal bovine serum, GIBCO-BRL사) 10%를 함유하고 있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO-BRL사)로 배양된 COS-7 세포 (ATTC)로의 형질전환은 전기천공법 (electroporation, Biorad사)에 의해 이루어졌다. 배양 배지 약 300 ㎕에 5 ×10⁶개의 COS-7 세포와 상기 실시예 <1-1>의 pCIN-hp40/IRES/hp35 또는 상기 실시예 3의 돌연변이 IL-12 유전자를 포함하는 플라스미드 20 ㎍, 그리고 알카라인 탈인산화 효소 (alkaline phosphatase)를 코딩함으로써 대조구의 역할을 할 수 있는 pNEB-SEAP (pNEB-Secreted Alkaline phosphatase, New England Biolabs) 2 ㎍을 큐벳에 넣고, 250 V, 960 ㎌의 조건으로 전기천공법을 수행하였다.

전기천공법을 통한 형질전환 후 24시간이 지난 다음 배지는 혈청이 첨가되지 않은 CHO-SFMII 배지 (GIBCO-BRL사) 1.5 ㎖로 갈아주었고, 실험 종류에 따라서 투니카마이신 (tunicamycin: Sigma사) 1 ㎍/㎖을 첨가하였다. 배지 교환 24시간 후에는 세포를 수확하여 원심분리한 후 상층액은 SEAP 활성 측정에 사용되었고 펠렛 (pellet)은 200 ㎕의 세포 용혈 용액 (cell lysis solution, Promega사)에 현탁시켰다. 상층액과 펠렛에 존재하는 IL-12p70과 IL-12p40의 수준은 ELISA로 측정되었다 (RD system사). 면역 블러팅을 위해 배양 상등액과 세포 파쇄물을 각각 10% 및 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl-sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis)로 전기영동하였고, 이를 통하여 분리된 단백질들은 나일론막 (Amersham사)에 전기이동 (electrotransfer)되었다. 막에 흡착된 단백질들은 바이오틴 (biotin)이 부착된 사람 IL-12 항체 (RD system사)와 HRP (Horseradish peroxidase)가 부착된 스트렙타비딘 (streptavidin, Pharmingen사), 그리고 ECL 키트 (Amersham사)를 이용하여 결과를 얻었고 하기표 1에 나타내었다. 하기표 1의 수치는 ELISA를 통해 측정된 야생형에서의 IL-12p70과 IL-12p40의 발현 정도를 100%로 보았을 때 상대적인 발현양을 나타낸 것이다.

a; DNA 컨스트럭트는 총 20 ㎍이 COS-7 세포로 전기 천공법에 의한 형질 전환을 위해 사용되었고, 두 개의 DNA 컨스트럭트의 동시 형질전환을 위해서는 각각 10 ㎍의 DNA가 사용되었다.

b; IL-12p70 또는 p40의 발현은 ELISA로 측정하였고 야생형 IL-12가 포함된 컨스트럭트에서 p40 및 p70의 발현 및 분비 수준을 100%로 하여 이에 대한 상대적인 비율로 나타내었다.

c; 각각의 돌연변이 상등액 내 존재하는 동량의 p70을 IFN-γ 유도능 분석에 사용하였다. 유도된 IFN-γ의 수준은 ELISA로 측정하였고 야생형 IL-12가 포함된 컨스트럭트를 이용한 실험에서 유도된 IFN-γ의 수준을 100%로 하고 이에 대한 상대적인 비율로 나타내었다.

d; IL-12p40은 IL-12p70의 p40 부분이 아닌 IL-12p40의 단량체 또는 이량체 p40 형태를 나타낸다.

e; IL-12p70은 IL-12p35와 IL-12p40으로 구성된 이종 이량체를 나타낸다.

f; 두 개의 DNA 컨스트럭트의 동시 형질 전환에는 플라스미드 원형으로 pCI-neo가 사용되었다.

g; <1은 ELISA의 감지 수준보다 낮은 양의 단백질이 검출됨을 의미한다.

h; 야생형 hp40 또는 hp40-N135Q, hp40-N222Q DNA를 각각 hp35 DNA와 동시에 형질 전환 한 후 상등액에서 검출되는 p70의 양을 동일하게 하였을때, 야생형 DNA 형질 전환시 보다 hp40-N135Q와 hp40-N222Q DNA 형질 전환시 상등액에서 검출되는 p40의 양이 상대적으로 낮은데 이 상등액에 부족분의 hp40 (hp40 컨스트럭트를 형질전환하여 얻은 상등액에 존재하는 hp40)을 첨가하여 IFN-γ유도능 분석실험을 하였을 경우를 의미한다.

i; 괄호 안에 표시된 숫자는 동시에 형질 전환시킨 플라스미드 hp40-N222Q과 hp35 DNA 양 (㎍)을 의미한다. 형질 전환시 총 20 ㎍의 DNA가 이용되었는데, 부족분은 pCI-neo DNA로 보충되었다.

j; hIL-12p40 및 그 돌연변이형과 hIL-12p35 의 동시 발현을 위해 사용된 플라스미드의 원형은 pGX0 벡터이다.

k; mIL-12p40 및 그 돌연변이형과 mIL-12p35 의 동시 발현을 위해 사용된 플라스미드의 원형은 pTV2 벡터이다.

표 1에 나타난 바와 같이, p35의 Asn-141과 p40의 Asn-303 당쇄화 가능 부분의 돌연변이는 IL-12p70 또는 IL-12p40의 분비에 아무런 영향도 미치지 않는 반면, p40 Asn-135의 돌연변이와 p40 Asn-222 당쇄화 부분의 돌연변이는 IL-12p40의 분비만을 감소시킴을 확인하였다. 특히, Asn-222의 아미노산은 루신 (Leu) 이외에 글루타민 (Gln)으로 대체되었을 때에도 동일한 분비 양상을 나타내는 것으로 보아, 이러한 현상은 Asn-222의 N-당쇄화의 소실에 의한 것이라고 생각된다.

도 3a은 정상형 사람 IL-12p35 유전자와 당쇄화 가능 부분 돌연변이 유전자들의 COS7 세포 내 형질전환 후, 세포 파쇄물에서 수행한 면역 블러팅 결과를 나타낸 것이다. 제 1열과 제 2열은 각각 pCI-neo와 pCIN-hp35로 형질전환된 세포 파쇄물에 대한 결과이며, 제 3, 4, 5 및 6열은 hp35의 N-당쇄화 가능 부분에 대한 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 벡터인 pCIN-hp35-N127Q, pCIN-hp35-N141Q, pCIN-hp35-N251Q, pCIN-hp35-N127,251Q로 형질전환된 세포 파쇄물에 대한 결과이다. 제 2 및 5열에서 분자량이 약 33.2 kDa 정도인 밴드가 나타났는데 이는 N-당쇄화된 p35 소단위체에 대한 단백질을 나타내는 것이며, 투니카마이신에 의해 p35 소단위체의 N-당쇄화를 저해시킬 때 나타나는 분자량 28 kDa 밴드 (제 7열)가 제 3 및 4열에서 나타나는 것으로 보아 Asn-127 및 Asn-141 아미노산이 N-당쇄화되는 부분이라고 볼 수 있다.

도 3b는 정상형 사람 IL-12p40 유전자와 당쇄화 가능 부분 돌연변이 유전자들의 COS7 세포 내 형질전환 후 세포 파쇄물에서 수행한 면역 블러팅 결과를 나타낸 것이다. 제 1 및 2열은 각각 pCI-neo, pCIN-hp40으로 형질전환된 세포 파쇄물에 대한 결과이고, 제 3, 4, 5 및 6열은 hp40의 N-당쇄화 가능 부분에 대한 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 벡터인 pCIN-hp40-N125Q, pCIN-hp40-N135Q, pCIN-hp40-N222Q, pCIN-hp40-N303Q로 형질전환된 세포 파쇄물에 대한 결과이며, 제 7, 8, 9 및 10열은 각 N-당쇄화 가능 부분에 대한 이중 내지 삼중 돌연변이화 후에 이를 이용하여 형질전환된 세포 파쇄물에 대한 결과이다. 제 11열은 pCIN-hp40으로 형질전환된 세포에 N-당쇄화를 저해시키는 시약인 투니카마이신을 처리한 세포 파쇄물에 대한 결과이다.

여러 보고에 근거해 볼 때 IL-12p40의 면역 블러팅 결과 3-4개의 밴드가 분자량 36-45 kDa에서 나타난다고 알려져 있으며, 본 실시예의 제 2열 및 3열 야생형 IL-12p40이나 이와 함께 IL-12p35를 발현하도록 한 세포 파쇄물에서도 36, 37.5, 40, 43.1 kDa 정도의 분자량에서 밴드가 나타나고 있다. 제 11열의 투니카마이신을 처리한 세포 파쇄물에서는 위의 세 밴드가 사라지고 36 kDa의 밴드만이 남게 되는 것으로 보아 이 밴드는 N-당쇄화되지 않은 p40 소단위체를 나타내는 것이다. 제 3 및 4열의 Asn-125 및 Asn-135 돌연변이는 밴드 양상이 야생형과 크게 다르지 않았으며, 나머지 제 5 및 6열의 Asn-222, Asn-303 돌연변이의 경우 밴드 양상이 바뀌고 있음을 볼 수 있는데, 이는 135, 222, 303 위치의 Asn 아미노산들이 N-당쇄화 부분으로 사용되고 있음을 의미한다.

도 3c는 야생형 사람 IL-12p40 유전자와 당쇄화 가능 부분 돌연변이 유전자들의 COS7 세포 내 형질전환 후 세포 배양 상등액에서 수행한 면역 블러팅 결과를 나타낸 것이다. 각 열에 대한 설명은도 3b와 동일하다. 세포 파쇄물의 결과와 유사하게 3-4개의 밴드가 분자량 36-45 kDa에서 보여지고 있으며 제 3 및 4열의 Asn-125 및 Asn-135 돌연변이는 밴드 양상이 야생형과 크게 다르지 않은 반면, 나머지 제 5 및 6열의 Asn-222 및 Asn-303 돌연변이의 경우 밴드 양상이 바뀌고 있음을 볼 수 있다. 특히, Asn-135와 Asn-222 아미노산 돌연변이의 경우 세포 파쇄물에서와는 달리 세포 배양액으로 거의 분비되지 않고 있음을 알 수 있는데, 이는 ELISA를 통한 정량화 결과와 일치한다.

상기의 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 벡터 중 IL-12p40 유전자의 당쇄화 가능 부분인 Asn-222가 Leu-222로 돌연변이된 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터 pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L 및 pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 2월 29일자로 기탁되었다 (수탁번호 : KCTC 0969BP 및 KCTC 0970BP).

<4-1> hIL-12p70의 합성, 이종이합체화 및 분비에 비치는 hp35의 N-당쇄화 효과

본 발명자들은 hIL-12p70의 합성, 이종이합체화 (heterodimerization) 및 분비에 비치는 hp35의 N-당쇄화 효과를 조사하기 위하여, 전술한 바와 같이 야생형 hp35 유전자 또는 그의 N-당쇄화 돌연변이 유전자들을 포함하는 hIL-12 발현 벡터들로 세포를 형질전환시킨 후 이로부터 얻은 배양 상등액 및 세포 파쇄물을 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다.

그 결과, 상기표 1에 나타낸 바와 같이 Asn-127을 제외하고 hp35의 가능한 N-당쇄화 잔기들의 제거는 hIL-12p70의 합성, 이종이합체화 및 분비에 아무런 효과를 미치지 않았다. 그러나, Asn-127의 당쇄화는 hIL-12p70의 이종이합체화와 분비를 상당한 정도로 감소시켰는데, 이는 정상적인 형질감염 효율을 나타낸 hp35-N127Q 및 hp35-N127,141Q의 발현 수준이 웨스턴 블럿상에서 다른 돌연변이체들의 발현수준과 유사하기 때문이다. 따라서, 이러한 결과는 Asn-141의 N-당쇄화가 아닌 hp35의 Asn-127의 N-당쇄화가 hIL-12p70의 이종이합체화와 분비에 매우 중요한 역할을 수행함을 나타내는 것이다.

<4-2> hIL-12p70의 합성, 이종이합체화 및 분비에 비치는 hp40의 N-당쇄화 효과

본 발명자들은 또한 hIL-12p70의 합성, 이종이합체화 및 분비에 대한 N-당쇄화의 효과를 측정하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 야생형 hp35 유전자 또는 그의 N-당쇄화 돌연변이 유전자들을 포함하는 hIL-12 발현 벡터들로 형질전환된 세포의 배양 상등액 및 세포 파쇄물 내 hIL-12p70 및 hIL-12p40의 수준을 ELISA로 분석하였다.

그 결과, 상기표 1에 나타낸 바와 같이 Asn-135 또는 Asn-222의 돌연변이는 hIL-12p70의 분비에 거의 영향을 미치지 않았는데, 이는 상기 돌연변이체들에서 hIL-12p70의 세포외 수준 (extracellular level)이 야생형 hp40과 거의 유사하기때문이다. 더욱 흥미로운 것은 Asn-135 및 Asn-222 돌연변이체들에서 hIL-12p40의 분비가 상당히 감소되었으며, 특히 Asn-222 돌연변이체는 야생형 hp40과 비교하여 약 15% 정도 감소된 분비 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 Asn-222에서의 N-당쇄화가 이종이량체 형태인 hIL-12, hIL-12p70이 아니라 hIL-12p40이 단독으로 분비되는데 요구되어짐을 나타내는 것이다. 또한, Asn-135 및/또는 Asn-222에서의 돌연변이체들을 포함하는 이중 및 삼중 돌연변이체들 역시 hIL-12p70이 아닌 hIL-12p40 보다 낮은 수준의 분비 수준을 나타내었다.

이와는 반대로, 다른 돌연변이체들은 야생형 hp40과 비교하여 세포 파쇄물 내 hIL-12p40 및 hIL-12p70을 동등한 양만큼 생산하였는데, Asn-125 및 Asn-303의 돌연변이체는 hIL-12p40 및 hIL-12p70의 발현, 이종이합체화, 분비에 있어서 상당한 차이를 나타내었다.

상기 결과들을 통하여 본 발명자들은 Asn-222에서의 N-당쇄화가 hIL-12p70의 이종이합체화와 분비에는 요구되지 않지만 hIL-12p40의 분비에는 필수적인 역할을 하는 반면, Asn-127에서의 hp35 N-당쇄화가 hIL-12p70의 이종이합체화와 분비에 중요한 역할을 수행함을 확인하였다. 이는 또한 hp35의 N-당쇄화가 hIL-12p70의 분비에 필수조건이라는 이전의 보고와 일치하는 결과이다 (Carra, G. et al.,J. Immunol.,164:4752-4761, 2000).

<4-3> hIL-12의 당쇄화가 생물학적 활성에 미치는 영향

본 발명자들은 hIL-12의 당쇄화가 생물학적 활성에 미치는 영향을 조사하기위하여, 야생형 hIL-12와 잠재적 N-당쇄화 부위의 돌연변이를 포함하는 그의 유도체들의 IFN-γ유도능 (induction ability)을 분석하였다. 이를 위하여, 야생형 hIL-12와 그의 돌연변이체들을 100 ng/㎖씩 동량 포함하는 배양 상등액을 사람 PBLs와 함께 배양한 후 각각의 배양 상등액 내 유도된 IFN-γ의 수준을 ELISA로 분석하였다.

그 결과, 상기표 1에 나타낸 바와 같이 IFN-γ유도능이라는 면에서 야생형과 그의 모든 유도체들 사이에 현저한 차이점은 나타나지 않았다. 그러나, Asn-135 및/또는 Asn-222에서 돌연변이된 hp40 유도체들은 야생형 또는 다른 hp40 돌연변이체들에 비하여 약간 증가된 IFN-γ유도능을 나타내었다. 이러한 결과는 hIL-12p70의 길항물질 (antagonists)로 알려져 있는 hIL-12p40의 수준이 hp40-N135Q 및/또는 hp40-N222Q를 포함하는 돌연변이체들의 배양 상등액 내에서 다른 돌연변이체들에 비하여 상대적으로 매우 낮기 때문이다.

<실시예 5> 당쇄화 부분이 돌연변이화된 IL-12p70의 분비에 있어 IL-12p35의 역할

hp40의 Asn-222에서의 당쇄화가 어떻게 hIL-12p40의 분비를 감소시키는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 일정한 양의 hp40-N222Q-발현 플라스미드를 다양한 양의 야생형 hp35 DNA와 함께 세포에 동시 형질감염시켰다.

이를 위하여, 사람 표피 혈액 단핵 세포 (human peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque, Sigma사) 농도 차이를 이용한 원심분리로 혈액으로부터 분리하였으며 10% FBS와 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신 (streptomycin) (GIBCO-BRL사)을 포함한 RPMI-1640 배지 (GIBCO-BRL사)에 다시 현탁화하였다. 사람 IFN-γ증폭량 측정을 위해서 4 ×10⁵개의 사람 표피 혈액림프구를 100 ng/㎖의 IL-12p70 또는 돌연변이 단백질을 함유하는 배양 상등액과 함께 16시간 동안 배양하였다.

한편, 생쥐 IFN-γ증폭량을 측정하기 위해서는 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 생쥐의 비장을 확보한 후 이로부터 얻은 1 ×10⁵개의 비장 세포 (splenocytes)를 24시간 동안 100 ng/㎖의 생쥐 IL-12p70 또는 이의 돌연변이 유도체들을 포함하는 배양 상등액과 함께 배양하였다. 증폭된 사람 및 생쥐 IFN-γ의 양은 사람 및 생쥐 IFN-γELISA 키트 (RD systems사)를 이용하여 측정되었고, 그 결과는표 1에 제시되어져 있다.표 1의 수치는 ELISA를 통해 측정된 야생형에서의 IFN-γ의 증폭량을 100%로 보았을 때 상대적으로 나타낸 수치이다.

일반적으로 p35 소단위체는 단독으로 분비되지 않으며 p40과 결합되어 IL-12p70의 형태로 분비되는 반면, p40 소단위체는 단량체 (monomer) 또는 동종이량체 (homodimer)의 형태로 분비되는데 이는 p35 소단위체가 아닌 p40 소단위체가 IL-12p70의 분비에 있어서 주요 요소로 작용함을 암시하는 것이다.표 1에 나타난 바와 같이, hIL-12p70의 분비량은 야생형 hp40과 hp40-N222Q 돌연변이 모두에서 형질감염된 hp35 DNA의 양에 비례하여 증가하였다. 이러한 결과는 분비 결함 (secretion defect)을 갖는 hp40 소단위체가 hp35 소단위체와 결합되면서 IL-12p70의 형태로 분비됨을 나타내는 것으로, hp35 소단위체 역시 hIL-12p70의 분비에 있어 또 다른 작용을 함을 암시하는 것이다. 최근에 hp40 소단위체 내 형태적인 변화 (conformational change)가 hp35와의 결합에 의한 것임을 나타내는 연구가 보고되어 IL-12p70 분비에 있어 hp35 소단위체의 기여 가능성을 제시해준 바 있다 (Yoon, C et al.,EMBO J., 19:3530-3534, 2000). 상기 연구와 본 발명의 결과를 통하여, 본 발명자들은 Asn-222에의 당쇄화를 포함하는 hp40이 그 자체로는 분비에 결함을 갖지만 hp35와의 결합을 통한 hp40 부위의 형태적인 변화에 기인하여 hp70 형태로 분비될 수 있음을 확인하였다.

<실시예 6> 생쥐 IL-12p40 Asn-220 당쇄화 부분의 돌연변이 유전자 포함 발현 벡터 및 HCV-E2 DNA 백신의 제조

<6-1> pCIN-mp40-N220L의 제조

본 발명의 hIL-12 돌연변이 유전자를 DNA 백신과 같은 유전자 요법 (gene theraphy)에 사용할 수 있는지 그 가능성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 hp40 유전자의 Asn-222와 유사한 생쥐 IL-12p40 (mp40) 유전자의 염기서열을 조사하였다. 그 결과 본 발명자들은 생쥐 p40의 Asn-220 아미노산이 사람 p40의 Asn-222와 매우 유사한 부위에 존재하며 현재까지 그의 아미노산 서열이 N-당쇄화되어 있다고 알려져 있지 않음을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 mp40 유전자의 돌연변이, 즉 아미노산 서열 중 220번째 Asn을 부분 지정 돌연변이화 (Site-directed mutagenesis)에 의해 Leu 코돈으로 치환하여 mp40-N220L을 제조하였다. 이때 돌연변이화를 위한 시발체로는 p40에서서열번호 22및서열번호 23으로 기재되는 뉴클레오타이드를 합성하여 이용하였으며, 상기 돌연변이는 유전자의 식별을 용이하게 하기 위한 SacⅠ 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 이와 같이 제조된 돌연변이는, 돌연변이화 후 생성되는 특정 제한효소 인식부위에 대한 제한효소 처리와 DNA 서열 확인을 통하여 검증되었다. 이로써 동물 세포에서 발현 가능한 생쥐 IL-12p40 돌연변이 유전자가 포함된 pCIN-mp40-N220L 벡터를 완성하였다.

<6-2> pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L 벡터의 제조

p40과 p35 소단위체를 코딩하는 동시에 발현하면서 DNA 면역화에 사용할 수 있는 벡터를 제작하기 위하여, 이미 소동물에서 DNA 백신 벡터로 사용된 바 있는 진핵세포 발현 벡터인 pTV2 벡터 (Lee et al.,J. Virol.,72:8430-8436, 1998; Cho et al.,Vaccine,17:1136-1144, 1999)를 제한효소 Asp718과 NotI으로 절단하고, 여기에 pSK-mp35/IRES/mp40을 동일한 효소로 절단하여 생긴 mp35/IRES/mp40 단편을 삽입함으로써 pTV2-mp35/IRES/mp40 벡터를 완성하였다. 또한, 생쥐 IL-12p40의 Asn-220 돌연변이 유전자를 포함하면서 p35를 동시에 발현시키는 벡터의 제조를 위해서 먼저 pSK-mp35/IRES/mp40 벡터를 NcoI과 NotI으로 절단하고 여기에 pCIN-mp40-N220L을 동일한 효소로 절단하여 생긴 mp40-N220L 단편을 삽입함으로써 pSK-mp35/IRES/mp40-N220L 벡터를 제작하였다. pTV2-mp35/IRES/mp40 벡터를 EcoRV와 NotI으로 절단하여 mp40 단편을 제거한 후 여기에 pSK-mp35/IRES/mp40-N220L을 동일한 효소로 절단하여 생긴 mp40-N220L 단편을 삽입함으로써 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L 벡터를 완성하였다.

상기의 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L 벡터는 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 2월 29일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0745BP).

<6-3> pTV2-HCV-E2 벡터의 제조

본 발명자들은 진핵세포에서 HCV-E2 단백질을 발현할 수 있는 pTV2-HCV-E2 DNA 백신 벡터를 제조하였다 (Song M. K., et al.,J. Virol.,74:2920-2925, 2000).도 5에서 보듯이 pTV2-HCV-E2 DNA 백신 벡터는 시미안 바이러스 40의 복제 시작점 (simian virus 40 replication origin, SV40 ori), 싸이토메갈로바이러스 프로모터 (cytomegalovirus promoter, CMV), 아데노바이러스 (adenovirus)의 삼중 선도 서열 (tripartite leader sequence, TPL), 다중 클로닝 서열 (multiple cloning sequence, MCS), SV40 폴리아데닐화 서열 (polyadenylation sequence, polyA) 및 엠피실린 저항성 유전자 (ampicilin resistance gene: AmpR) 등으로 구성되고, HCV-E2 유전자가 다중 클로닝 서열 내에 클로닝 되어 있다. 본 발명에 사용된 E2 유전자는 소수성 아미노 잔기 (hydrophobic amino acid residue)를 포함하는 카르복실 말단 (carboxyl-terminal: C-terminal) 부위를 제거하여 단백질의 분비를 용이하게 하였으며, 아미노실 말단 (aminocyl-terminal: N-terminal) 부위에 허피스 바이러스 (Herpesvirus: HSV) 외피 당단백질 D (glycoprotein D: gD)의 신호 서열 (signal sequence: s)을 연결시켜 단백질의 발현 및 세포의 분비를 효율화하고자 하였다.

<6-4> 생쥐 IL-12p40 Asn-220 돌연변이화에 따른 IL-12p40 및 IL-12p70의 분비양상 확인

실시예 4에서 사용되었던 동일한 방법을 통하여 하기표 1에 제시된 벡터들을 COS-7 세포에 형질전환시킨 후 세포 파쇄물과 세포 배양액을 얻어 생쥐 IL-12 ELISA (Pharmingen사)를 수행하였고,표 1에서 ELISA를 통해 측정된 야생형에서의 IL-12p70과 40의 발현 정도를 농도로 나타내었다. pCI-neo에서 <1의 수치는 ELISA로 검출되지 않는 범위를 의미한다.

표 1에 나타난 바와 같이, mp40-N220L 돌연변이체들은 IL-12p40 및 IL-12p70의 분비 및 그의 생물학적 활성이라는 측면에서 볼 때 hp40의 Asn-222 돌연변이체와 거의 유사한 특성을 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 상기 mp40-N220L 돌연변이 유전자가 DNA 백신으로 적용될 수 있는지 또는 Th1 및 CTL 면역 반응의 유도에 있어서 mp40-N220L 돌연변이 유전자와 야생형 mp40 유전자의 활성을 비교하기 위하여, 본 발명의 mp40-N220L 돌연변이 유전자 mp35/IRES/mp40 (mIL-12wt) 또는 mp35/IRES/mp40-N220L (mIL-12mut)를 pTV2 DNA 백신 벡터에 삽입하여 그들의 시험관 내 (in vitro) 특성을 관찰하였다. 그 결과,표 1에 나타난 바와 같이 pTV2 벡터 내 mIL-12mut 유전자 mp40-N220L 돌연변이체는 IL-12p40 및 IL-12p70의 분비 및 그의 생물학적 활성이라는 측면에서 볼 때 hp40의 Asn-222 돌연변이체와 거의 유사한 특성을 나타내었다.

<실시예 7> 항원-특이적인 체액성 면역 반응에 대한 돌연변이 IL-12의 효과 조사

이전의 보고에 따르면, HCV-E2 항원 (pTV2-gDsE2t)을 암호화하는 플라스미드의 DNA 예방접종이 접종 후 3주 후에 항원-특이적인 체액성 (antigen-specific humoral) 및 세포-매개성 면역 반응 (cell-mediated immune response)을 유도하는데 충분함이 확인되었다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자가 야생형 mIL-12 유전자와 비교하여 생체 내 항원-특이적인 면역 반응에 효과적으로 영향을 미칠 수 있는지 조사하기 위하여, 생쥐를 초기 면역화시킨 후 pTV2-gDsE2t 플라스미드와 함께 pTV2-mIL-12mut 또는 pTV2-mIL-12wt로 4주 후에 추가로 접종하였다.

구체적으로, 상기 실시예 6에서 제조된 본 발명의 돌연변이 유전자를 포함한 발현 벡터에 의하여 DNA 백신에 의한 면역 반응 증진을 조사하기 위하여, pTV2, 돌연변이 mIL-12 또는 야생형 mIL-12를 갖는 pTV2-gDsE2t DNA 200 ㎍을 100 ㎕ 인산염 완충용액 (phosphate-buffered saline solution)에 용해시킨 후 생후 약 6-8주 연령의 암컷 BALB/c 생쥐의 전경골근 (anterior tibialis muscles)에 주사하였다. 처음 DNA 주입하고 4주 경과 후 동일한 방법으로 동일량의 DNA를 추가 접종하였다. 두번의 DNA 추가 접종 후 약 0, 3, 6, 10 주가 지나서 생쥐의 안구 근처 핏줄로부터 피를 뽑아 혈청을 분리하고 HCV-E2 특이적인 항체 생성 여부를 정제된 hGH-E2 단백질을 이용하여 ELISA 방법을 통해 조사하였다. 사용된 E2 단백질은 CHO 세포주로부터 발현된 hgh-E2 단백질을 이용하였다. 96-웰 플레이트에 hgh-E2 단백질을 100 ng씩 코팅한 뒤 면역된 생쥐로부터 얻어진 혈청을 적당히 희석하여 단백질과 반응시켰다. 그 후 항원 특이적인 IgG에 고추냉이 과산화효소 (horseradishperoxidase, HRP; Chemicon사)가 접합된 항 생쥐 IgG 항체를 반응시킨 뒤 ABTS (Sigma사)를 첨가함으로써 발색 반응을 시켰고 ELISA 측정기 (BioTek사)로 450 nm에서 분석하였다. 또한 E2 단백질에 대해 형성된 총 IgG 항체에 대한 아계열인 IgG1 및 IgG2a의 상대적 비율을 관찰하고자 항 생쥐 IgG 항체 대신 각각 IgG1 및 IgG2a에 특이적으로 결합하는 항 생쥐 IgG 항체를 이용하여 ELISA를 수행하였다.

그 결과,도 5a, 5b, 5c및5d에 나타낸 바와 같이 HCV E2 DNA 백신은 음성 대조군 수준 보다 상당히 높은 전신성 (systemic) HCV E2-특이적인 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 수준을 유도하였으며, 돌연변이 mIL-12 유전자 또는 야생형 mIL-12 유전자와의 동시 주입은 HCV E2 DNA 백신이 단독으로 투여된 경우와 비교하여 높은 수준의 전체 IgG 수준을 나타내었다. IgG1의 수준은 HCV E2 DNA가 투여된 군과 비교하여 다소 높은 수준을 나타내었다. 반대로, HCV E2에 대한 IgG2a의 수준은 야생형 mIL-12 투여군에서 약간 증가되었고 HCV E2 DNA 단독 투여군과 비교해서는 돌연변이 mIL-12 투여군에서 상당히 증가되었다. 게다가, Th1 면역반응의 간접적인 표시자 (indicator)로서 일반적으로 받여들여지고 있는 IgG2a/IgG1의 비는 IgG2 수준의 양상이 유사한 돌연변이 mIL-12 투여군에서 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는 돌연변이 mIL-12 유전자가 야생형 mIL-12 투여군 또는 HCV E2 단독 투여군에 비하여 체액성 면역 반응에 있어서 IgG1에서 IgG2a로의 IgG 아계열의 전이에 상당히 관여함을 나타내며 돌연변이 IL-12 유전자가 Th1 형태의 면역 반응을 유도함을 암시한다.

<실시예 8> 면역화된 생쥐로부터 세포성 면역 반응 조사

<8-1> 돌연변이 IL-12에 의한 항원-특이적인 Th1 면역 반응의 유도

본 발명자들은 세포-매개성 면역반응의 역가를 평가하는데 사용되어 온 파라미터의 하나인 Th1 면역 반응에 있어서 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자의 효과를 조사하기 위하여, 비장 세포로부터 IFN-γ발현을 측정하였다. 이를 위하여, 두번의 DNA 주입 후 약 8주가 지난 생쥐의 비장으로부터 얻은 비장 세포 (1 ×10⁵)를 U-바닥모양의 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 1 내지 5 ㎍의 CHO 세포로부터 정제된 hgh-E2t 단백질을 각 웰에 첨가하고 세포들을 37℃, CO₂배양기에서 3일간 배양하여 활성화시켰다. 이로부터 세포 배양액을 확보한 후 이를 상층액 내 존재하는 IFN-γ의 양을 ELISA를 통해서 측정하기 위하여 사용하였다. 특정 항원으로 활성화된 후에 유도된 IFN-γ는 항원-특이적인 CD4+ T 세포로부터 생산되며 이는 Th1 면역 반응의 표시자로 사용될 수 있다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 싸이토카인 유전자 없이 HCV E2 DNA만 투여된 군은 hghE2t 단백질 농도에 비례하여 IFN-γ의 수준이 증가된 반면, 모조 플라스미드 (mock plasmid) 접종군은 증가되지 않았다. 예상대로, 야생형 mIL-12 투여군에서 IFN-γ유도 수준은 HCV E2 단독 투여군에 비하여 보다 증강되었으며 돌연변이 mIL-12 투여군은 야생형 mIL-12 투여군에 비하여 2-3배 높은 IFN-γ생산 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 mIL-12p70이 항원-특이적인 Th1 면역 반응을 증가시키는 역할을 하고 mIL-12p40은 생체 내 IL-12p70에 의한 Th1 면역 반응의 유도를 억제하는역할을 함을 암시하는 것이다. 접종된 그룹 간의 IFN-γ유도 수준은 추가 접종하고 3주 후에서 부터 차이를 나타내며 10주 후에도 유사한 차이를 나타내었는데, 이는 mIL-12p70이 Th1 면역 반응의 유도 및 유지에 관여함을 암시하는 것이다.

<8-2> 돌연변이 IL-12에 의한 항원-특이적인 CD8+ T 세포 기능의 장기간 증강효과 조사

상기에 서술한 바와 같이, 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자가 HCV E2 DNA 면역화에 있어 장기간 Th1 면역 반응에 기여함을 확인한 본 발명자들은 돌연변이 mIL-12 유전자의 발현에 의해 유도된 Th1 면역 반응이 CTL 면역 반응 및 주요 세포-매개성 면역 반응과 연계되어 있어 돌연변이 mIL-12 유전자가 DNA 면역화 모델에서 CTL 활성의 유지에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 추가 접종 후 다양한 주령에서 DNA 면역화 생쥐로부터 얻은 비장 세포를 이용하여 CTL 분석을 수행하였다.

이를 위하여, Song을 포함한 본 발명자들에 의해 제작되어 이미 보고된 HCV-E2 발현 세포주인 CT26-hghE2t 세포 (Song M. K. et al.,J. Virol.,74:2920-2925, 2000)에 마이토마이신 C (mitomycin C, 500 ㎍/㎖) 처리를 통해 세포 분열을 억제시키고, 이를 두 번의 DNA 주입 후 약 2주가 지난 생쥐의 비장으로부터 얻은 비장 세포와 함께 시험관 내 (in virtro)에서 약 5일간 활성화시켰다. 이로부터 얻은 효과기 세포들 (effector cell)의 세포독성 분석 (cytotoxicity)을⁵¹Cr으로표지된 CT26-hghE2t 또는 CT26-neo와 같은 서로 다른 타겟 세포 (target cell)를 대상으로 수행하였다. 다양한 수의 효과기 세포들을 목적하는 E:T 비율로 삼중으로 U-바닥모양의 웰 플레이트에 코팅하였다.⁵¹Cr으로 표지된 타겟 세포 (5 ×10³)를 상기 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 후 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이로부터 상층액을 회수하여 사용하고 반응 후 얻어지는⁵¹Cr의 방출을 γ-측정기 (γ-counter, Wallac, Turku, Finland)로 측정함으로써 CTL 면역 반응을 조사하였다. 특정 용혈 비율 (percentage of specific lysis)은 하기수학식 1에 의하여 계산하였다. 이때, 최소 용혈 (minimum lysis)은 타겟 세포를 배양 배지만으로 배양함으로써 얻었고, 최대 용혈 (maximun lysis)은 타겟 세포를 1% 노니뎃-P40 (Nonidet-P40)에 노출시킴으로써 확보하였다.

특정 용혈 비율=(실험군 용혈-최소 용혈)×100/(최대 용혈-최소 용혈)

그 결과,도 7에 나타낸 바와 같이 추가 접종 2주 후 모조 플라스미드 투여군을 제외한 모든 그룹에서 매우 강한 항원-특이적인 CTL 활성이 관찰되었으나, HCV E2 단독 투여군, 야생형 mIL-12 투여군 및 돌연변이 mIL-12 투여군 사이에서는 거의 차이를 보이지 않았다. 야생형 mIL-12 투여군에서 CTL 반응은 실험 기간 전체에 걸쳐서 HCV E2 단독 투여군에 비하여 높게 나타났는데, 이는 mIL-12 유전자가증가된 CTL 형성에 중요한 역할을 수행함을 나타낸다. 흥미롭게도, 돌연변이 mIL-12 투여군과 다른 두 군 (HCV E2 투여군 및 야생형 mIL-12 투여군)간의 CTL 활성에 있어서의 차이는 추가 접종 기간이 길어질수록 시간에 따라 점점 더 현저하게 나타났다. 특히 10주 후의 CTL 반응은 HCV E2 투여군 및 야생형 mIL-12 투여군에서 매우 낮았는데, 이는 항원-특이적인 CTL의 분비량 (frequency)이 장기간 후에는 상당히 감소되기 때문이다. 반면 돌연변이 mIL-12 투여군은 항원-특이적인 CTL 반응을 유지하면서 다른 두 그룹 보다 5 내지 10배 높은 CTL 활성을 나타내었다. 대조군으로서, CT26-neo 세포를 타겟 세포로 사용한 경우에는 모든 그룹에서 어떠한 용혈 현상 (cell lysis)도 관찰되지 않았는데, 이는 상기에서 관찰된 CTL 활성이 HCV E2-특이적임을 암시하는 것이다.

<8-3> 면역화된 생쥐의 CD8+ 세포에서 항원 특이적 IFN-γ생성에 대한 유세포 분석

CTL 활성의 장기간 증강이 특정 항원에 대한 CD8+ T 세포의 분비에 의해 특이적으로 나타나는지 그리고 생체 내 CD8+ T 세포의 빈도를 알아보기 위해, 두번의 DNA 주입 후 약 2주가 지난 생쥐의 비장으로부터 얻은 비장 세포와 마이토마이신 C (500 ㎍/㎖)가 처리된 CT26-hghE2t 세포를 40시간 배양하였다. 자석을 이용하는 세포 분석 방법 (magnetic cell sorting: MACS)을 통해 CD8+ T 세포를 분리한 후 이를 상기에서 배양된 CT26-hghE2t 세포 (1 ×10⁶)와 10 U/㎖ 재조합 (recombinant) IL-12를 첨가하여 40시간 동안 배양하였다. 이때 4 ㎕ GolgiStop (Pharmingen사)을 처리하여 CD8+ T 세포로부터 생성되는 싸이토카인의 분비를 저해시킨 후 세포를 37℃에서 8시간 더 배양하였다.

CD8+ T 세포들을 직접적으로 분리하기 위하여, 활성화된 비장 세포들을 항-CD8 마이크로비드 (microbeads, Miltenyi Biotec, Inc.사)와 배양한 후 miniMACS 시스템의 칼럼 (microbeads, Miltenyi Biotec, Inc.사)을 통과시켜 잔존하는 CD8+ T 세포들을 분리하였다. 비특이적 염색을 방지하기 위하여, 세포들을 Fc Block^TM(PharMingen사)과 함께 전배양한 후 FITC (fluorescein isothiocyanate) 접합된 항 CD8 항체로 염색하였다. 배양 후 세포를 먼저 Cytofix/Cytoperm^TM(PharMingen사)으로 고정시키고 투과시킨 후 PE (R-phycoerythrin) 접합된 항-생쥐 IFN-γ항체 또는 대조군 PE-접합된 동 기준 표본-짝 (isotype-matched) 항체를 첨가하여 세포를 이중염색하였다. 염색된 세포는 CellQuest 소프트웨어를 사용하는 유세포 분석기 (FACSCalibur flow cytomwtry, Becton Dickinson사)를 이용하여 분석하였고 이를 통해 IFN-γ의 증가 양상을 관찰하였다.

HCV-E2 특이적 전구체 CD8+ T 세포들의 분포 역학 (frequency kinetics)

접종횟수^a	최종 접종후 경과 주	HCV-E2 특이적 전구체 CD8+ T 세포들의 분포
		세포 내 IFN-γ염색 분석 (%)^c	제한 희석법 (No.)^d
		그룹^bⅠ	그룹 Ⅱ	그룹 Ⅲ	그룹 Ⅳ	그룹 Ⅱ	그룹 Ⅲ	그룹 Ⅳ
2	0	0.08	0.35	0.42	0.58	38.1	39.0	47.1
	3	0.05	0.26	0.44	0.72	39.0	48.8	66.7
	6	0.06	0.29	0.39	0.73	38.8	46.8	64.9
	10	0.07	0.21	0.20	0.68	18.2	19.8	64.3
	14	0.07	0.09	0.09	0.57	9.6	8.8	45.7
1	4	0.06	0.33	0.42	0.55	33.2	41.0	48.7
	8	0.08	0.26	0.27	0.51	9.7	9.9	50.8
	13	0.06	0.11	0.08	0.43	6.9	8.2	44.8

a; 6주 내지 8주령의 암컷 BALB/c 생쥐에게 본 발명의 다양한 플라스미드를 4주 간격으로 한번 또는 두 번 접종하였다.

b; 각군의 발현은 다음과 같다: 그룹 Ⅰ; pTV2, 그룹 Ⅱ; pTV2-HCV-E2t+pTV2, 그룹 Ⅲ; pTV2-HCV-E2t+pTV2-mIL-12wt, 그룹 Ⅳ; pTV2-HCV-E2t+pTV2-mIL-12mut

c; 살아있는 CD8+ T 세포를 FSC와 CD8 도면을 이용하여 게이팅 (gating)함으로써 선택하였고, 살아있는 CD8+ T 세포를 CD8과 IFN-γ도면을 이용하여 다시 게이팅함으로써 선택한 후 이 도면에서 살아있는 CD8+ T 세포 중 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포의 비율을 퍼센트로 계산하였다. 이 실험은 그룹 당 2-3 마리의 생쥐를 이용하여 수행되었다.

d; GI 생쥐로부터 얻어진 (평균 용혈값 + 3 ×표준편차) 값을 넘는 플레이트의 웰을 양성 (postive)으로 간주함으로써 제한희석법을 이용한 CTL 빈도계산을 하였고, 반응 세포 (responder cell)의 각 희석시 음성 (negative) 웰의 개수를 회귀 곡선을 이용하여 분석함으로써 10⁷개의 비장 세포당 CTL의 빈도수를 나타내었다. 이 실험은 그룹 당 2-3 마리의 생쥐를 이용하여 수행되었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 mIL-12 유전자로 동시면역화된 생쥐는 추가 접종하고 0, 3, 6, 10 및 14주 경과 후에 HCV E2 단독 및 야생형 mIL-12 투여군에 비하여 CD8+ IFN-γ생산 세포의 분비량이 전반적으로 증가되어 있었는데, 이는 CTL 반응 결과와 일치하는 것이다. 이러한 차이는 초기에는 미미하다가 점차 커지면서 10주 및 14주째에는 HCV E2 단독 및 야생형 mIL-12 투여군에서는 그 빈도가 거의 관찰되지 않는데 비해 돌연변이 mIL-12 투여군에서는 그 빈도가 그대로 유지됨을 관찰할 수 있다. 또한 DNA의 추가 접종 없이 한번 접종하였을 때에도 그룹간의 양상은 유사하게 나타났다. 이러한 결과들은 돌연변이 mIL-12 유전자의 발현이 초기 및 오랜 기간 동안 DNA 면역화 후 CD8+ IFNF-γ생산 T 세포의 빈도를 유지함을 입증하는 것이다. 이로부터 본 발명자들은 세포-매개성 면역 반응에 있어서 IL-12p70 자체의 생체 내 역할은 Th1 및 CTL의 활성을 장기간 동안 유지하는 것인 반면, IL-12p40의 역할은 생체 내 길항물질로서 IL-12p70을 억제하는 것임을 확인하였다.

<8-4> 면역화된 생쥐의 비장 세포에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도 분석

다른 항원 특이적인 CD8+ T 세포 빈도를 알아보기 위한 제한 희석법 (limiting dilution assay: LDA) 을 통해 HCV E2 특이적인 CD8+ T 세포의 용혈 능력을 이용한 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 측정하였다 (Kuzushima, K. et al.,Blood, 94:3094-3100, 1999). 즉, DNA로 추가 접종된 생쥐의 비장 세포를 다양한 농도로 제한 희석한 후 U-바닥모양의 96-웰 플레이트에 희석당 20개씩의 웰이되도록 하였다. CTL 면역 반응 관찰에서 처럼 E2를 발현하는 CT26 세포를 마이토마이신 C (mitomycin C, 500 ㎍/㎖) 처리를 통해 세포 분열을 억제시키고, 희석된 비장 세포와 함께 약 5일간 활성화시켰다. CTL 빈도를 측정하기 위해서 5일간 활성화 시킨 각 웰의 비장 세포의 1/3을⁵¹Cr으로 표지된 타겟 세포 (5 ×10³)를 상기 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 후 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이로부터 상층액을 회수하여 사용하고 반응 후 얻어지는⁵¹Cr의 방출을 γ-측정기 (γ-counter, Wallac, Turku, Finland)로 측정함으로써 CTL 면역 반응을 조사하였다. 특정 용혈의 수준이 최소 용혈의 평균값과 그 표준 편차의 3배를 가산한 값을 초과할 경우 양성으로 간주하여 CTL의 빈도를 계산하였다 (Kuzushima, K. et al.,Blood, 94:3094-3100, 1999).

제한 희석법에서도 세포내 IFN-γ염색법에서 얻어진 결과와 유사한 결과가 얻어졌다. 즉, 면역화 초기에서도 돌연변이 mIL-12 투여군에서 가장 높은 항원 특이적 CD8+ T 세포 빈도가 관찰되었으며 이러한 빈도는 추가접종 14주 후에도 지속적으로 유지됨을 알 수 있었다 (표 2참조).

<8-4> 돌연변이 IL-12에 의한 방어적 면역 반응의 증강 분석

본 발명의 돌연변이 IL-12 유전자에 의해 생체 내에서 유도된 Th1 및 CTL 면역 반응을 확인하고 Th1 및 CTL 면역 반응과 방어적 면역 반응의 상관관계를 조사하기 위하여 hghE2t를 발현하는 종양 세포인 CT26-hghE2t를 DNA 추가 접종 후 12주된 생쥐에게 투여하였고 이로부터 2주후에 혈청으로부터 항원 특이적인 전체 IgG, IgG1, IgG2a 및 IgG2a/IgG1 비율을 결정하였을 뿐 아니라 약 30여일 동안 종양의 크기를 측정하였다. 구체적으로, 면역화 후 12주가 경과된 0.1 ㎕의 무혈청 배지 내 1 ×10⁶CT26-hghE2t 세포를 BALB/c 생쥐의 털이 깎인 등쪽에 피하 주사한 후 지역적 종양 성장 (local tumor growth)을 3일마다 칼리퍼 (calipers)를 이용하여 종양의 직경과 부피를 측정함으로써 결정하였다. 또한 이 생쥐들을 약 70여일 동안 관찰하여 생존율을 결정하였다.

도 8a, 8b및8c에 나타낸 바와 같이, 돌연변이 mIL-12로 면역화된 그룹에서 강력한 Th1 면역 반응이 유도되었으며 또한 야생형 mIL-12로 면역화된 생쥐의 그룹은 pTV2-gDsE2t 단독으로 면역화된 그룹에 비하여 지연된 종양 성장을 나타내었다. 돌연변이 mIL-12로 면역화된 그룹은 상당히 지연된 종양의 성장을 나타내었으며, 대조군 그룹의 대부분의 생쥐가 종양을 가지고 있었으며 50여일 내에 모두 사망하였으나 돌연변이 mIL-12 그룹에서는 70여일까지 약 90% 의 생쥐가 살아 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 돌연변이 mIL-12 유전자에 의해 유도된 HCV E2-특이적인 Th1 및 CTL 반응이 변형된 종양 세포 발현 특이 항원의 챌린지에 대한 생체 내 방어를 부여함을 암시한다. 생체 내 종양 방어에 대한 Th1 및 CTL 반응의 상대적인 효과를 평가하는 것이 쉽지 않다 하더라도, 이는 E2-특이적 CD8+ CTL 및 Th1 세포들이 CT26-hghE2t 세포를 직접적으로 사멸시킬 수 있고 시험관 내 Th1 및 CTL 분석에서 각각 관찰된 바와 같이 CTLs의 작용을 보조하는 것으로 판단된다. 또한, 대식세포 (macrophages) 및 자연 살상 세포 (natural killer cell) 상의 FcγR에 강하게 결합하는 IgG2a 항체들이 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (antibody-dependent cell mediated cytitoxicity)을 매개한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 활성형의 인터루킨-12 (IL-12)의 경쟁적 저해제로 작용하는 사람 또는 생쥐 IL-12p40의 Asn-222 (사람) 또는 Asn-220 (생쥐) 아미노산에 돌연변이를 유발시킴으로써 IL-12p40의 분비는 저해하고 IL-12의 면역 활성을 가지는 IL-12p70은 정상적으로 분비되도록 한 IL-12p40 돌연변이 유전자를 제공한다. 본 발명의 IL-12p40 돌연변이 유전자는 DNA 백신을 이용한 면역화에 함께 사용할 경우, 초기 및 오랜 기간동안 최적의 세포성 면역 반응을 유도할 수 있으므로 세포성 면역 반응이 필수 불가결한 것으로 알려져 있는 후천성 면역 결핍증 (AIDS), C형 및 B형 간염, 암, 독감, 결핵, 말라리아 등을 예방 및 치료하기 위한 유전자 치료 등에 면역 증강제로서 사용될 수 있다는 장점이 있다.

Claims

사람 IL-12의 p40 소단위체를 암호화하는서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자에 있어서, Asn-222를 암호화하는 코돈이 당쇄화가 되지 않도록 비하전된 극성 측쇄형 아미노산(Amino acids with uncharged polar side chains) 또는 비극성 측쇄형 아미노산(Amino acids with nonpolar side chains)을 암호화하는 코돈으로 치환된 p40 소단위체 유전자.
생쥐 IL-12의 p40 소단위체를 암호화하는서열번호 2의 염기서열을 갖는 유전자에 있어서, Asn-220을 암호화하는 코돈이 당쇄화가 되지 않도록 비하전된 극성 측쇄형 아미노산 또는 비극성 측쇄형 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환된 p40 소단위체 유전자.
제 1항에 있어서, 돌연변이화된 사람 p40 소단위체 유전자가 Asn-222 대신 Leu-222, Gln-222 또는 Ile-222를 암호화하는 코돈으로 치환되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 2항에 있어서, 돌연변이화된 생쥐 p40 소단위체 유전자가 Asn-220 대신 Leu-220, Gln-220 또는 Ile-220을 암호화하는 코돈으로 치환되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 1항의 유전자와 사람 IL-12p35 소단위체를 암호화하는 유전자 사이에 IRES (Internal ribosome entry site)를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
제 2항의 유전자와 생쥐 IL-12p35 소단위체를 암호화하는 유전자 사이에 IRES를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
제 5항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터.
제 7항에 있어서, 유전자 컨스트럭트가 사람의 IL-12p40의 Asn-222를 암호화하는 코돈이 Leu-222을 암호화하는 코돈으로 치환된 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터 pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L (수탁번호: KCTC 0969BP).
제 7항에 있어서, 유전자 컨스트럭트가 사람의 IL-12p40의 Asn-222를 암호화하는 코돈이 Leu-222을 암호화하는 코돈으로 치환된 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터 pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35 (수탁번호: KCTC 0970BP).
제 6항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터.
제 10항에 있어서, 유전자 컨스트럭트가 생쥐의 IL-12p40의 Asn-220을 암호화하는 코돈이 Leu-220을 암호화하는 코돈으로 치환된 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터 pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L (수탁번호: KCTC 0745BP).
제1항 또는 제2항에 따른 유전자를 포함하는 돌연변이된 IL-12를 발현시키기 위한 유전자 컨스트럭트를 유효성분으로 하는, 질병의 예방과 치료를 위한 DNA 면역화 및 유전자 치료용 면역증강제.
제 12항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트를 DNA 백신과 함께 투여시 CTL (cytotoxic T lymphocytes) 세포의 가수분해능력을 향상시킴으로써 면역반응을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
제 12항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트를 DNA 백신과 함께 투여시 T 헬퍼 (T helper) 세포의 인터페론 감마 (IFN-γ)의 분비를 증가시킴으로써 면역반응을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
제 12항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트를 DNA 백신과 함께 투여시 CD8+ 세포의 인터페론 감마 (IFN-γ)의 분비를 증가시킴으로써 면역반응을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
제 12항에 있어서, 질병이 암, AIDS, C형 및 B형 간염, 독감, 결핵 또는 말라리아인 것을 특징으로 하는 면역증강제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 비하전된 극성 측쇄형 아미노산이 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인 또는 티로신으로부터 선택되는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 비극성 측쇄형 아미노산이 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 트립토판으로부터 선택되는 유전자.
제5항 또는 제6항에 따른 유전자 컨스트럭트에 의해 암호화되는 단백질.
제7항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 발현벡터에 의해 형질전환된 진핵 숙주세포.
제20항의 숙주세포를 배양시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.