DE60123400T2

DE60123400T2 - Gene der il-12p40 untereinheit, welche zur verbesserung der aktivität mutiert sind, und deren verwendung als adjuvans zur dna vakzinierung

Info

Publication number: DE60123400T2
Application number: DE60123400T
Authority: DE
Inventors: Young Chul Sung; Sung Hee Lee; Sang Jun Ha; Man Ki Song; Jun Pohang Uni. of Science and Techn CHANG
Original assignee: Genexine Co Ltd
Current assignee: Genexine Co Ltd
Priority date: 2000-03-15
Filing date: 2001-03-15
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-03-16
Also published as: CN1426464A; EP1268759A4; CA2402213A1; DE60123400D1; US7910564B2; EP1268759B1; EP1268759A2; ATE340853T1; CN1281748C; WO2001068802A3; US20040023332A1; CA2402213C; JP2003526360A; WO2001068802A2; JP4180826B2; ES2272448T3; AU2001239581B2; US20070269408A1; US7253151B2; AU3958101A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft mutante Gene für die Untereinheit IL-12p40, die hoch aktives menschliches und Maus-Interleukin 12 (IL-12) produzieren, einen Expressionsvektor, der diese mutanten Gene enthält, und Verfahren zu deren Verwendung als Adjuvans für einen DNA-Impfstoff. Insbesondere betrifft diese Erfindung mutante Gene für die Untereinheit IL-12p40, die immunaktives IL-12p70 normal sezernieren können, aber die Sekretion von IL-12p40 durch das Induzieren einer Mutation für die Aminosäuren Asn-222 (Maus) oder Asn-220 (Mensch) von IL-12p40, das als kompetitiver Inhibitor von aktivem IL-12 funktioniert, verringern.
FACHLICHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
IL-12 wird von antigenpräsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel Makrophagen, Monozyten und B-Zellen, nach dem Erhalten einer geeigneten Stimulierung sezerniert und funktioniert in vivo als Regulator für viele Arten von Immunreaktionen. Insbesondere weist IL-12 einen großen Bereich von Aktivitäten auf, einschließlich der Proliferation aktivierter Helfer-T-Zellen des Typs-1 (Th1) und natürlicher Killerzellen (NK), der Regulation der Produktion vieler Zytokine, der Induktion von Typ-1 Helfer-T-Zell-Immunreaktionen, der Differenzierung von CD8+-T-Zellen, der Stimulierung hämatopoetischer Stammzellen (Hsieh, C. S. et al., Science, 260: 547–549, 1993) und besonders der Regulation einer Immunreaktion durch Fördern der lytischen Aktivität zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) und NK-Zellen (Robertson, M. J. und J. Ritz, Oncologist, 1: 88–97, 1999; Trinchieri, G., Annu. Rev. Immunol., 13: 251–276, 1995). Gemäß kürzlicher Berichte produzierten periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) aus Patienten, die mit dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) infiziert waren, ein fünffach weniger biologisch aktives IL-12 (Chehimi, J. et al., J. Exp.Med., 179: 1361–1366, 1994) und es wurde festgestellt, dass Mykobakterien- und Salmonella-Infektionen eine IL-12-Rezeptorexpression fehlte (de Jong, R. et al., Science, 280: 1435– 1438). Infolge dieser Rollen von IL-12 könnte es in vivo eine starke Immunreaktion gegen einen Virus, Bakterien und verschiedene Krebsarten induzieren. Deshalb können die Erfinder unter Verwendung der vorliegenden Erfindung die Entwicklung vieler Behandlungsmittel erwarten.
Auf der Grundlage der Theorie, dass IL-12 mit dem Wachstum von Gedächtnis-Th1- und Gedächtnis-CTL-Zellen zusammenhängt (Stobie, L. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 97: 8427–8432, 2000; Mortarini, R. et al., Cancer Res., 60: 3559–3568, 2000; Mbawuike, I. N. et al., J. Infect. Dis., 180: 1477–1486, 1999), wird geglaubt, das IL-12 als wirksames Adjuvans für einen Impfstoff oder als Behandlungsmittel gegen verschiedene Krankheiten, die eine zelluläre Immunreaktion erfordern, verwendet wird. Zieht man Metastase oder Wiederauftreten in Betracht, wobei es sich um den schwierigsten Teil der Krebsbehandlung handelt, ist das Induzieren einer Gedächtnis-Immunreaktion besonders notwendig. Bis heute ist der genaue Mechanismus von IL-12, der mit diesen Wirkungen zusammenhängt, jedoch nicht geklärt worden. Aber es gibt, beruhend auf derzeit erhältlichen Daten, einige Hinweise auf den Mechanismus, durch den IL-12 CD4+-Th1-Zellen aufrechterhält. Im Laufe der Th1-Differenzierung wird die Produktion von IFN-γ verstärkt und IL-2 wird verringert. Weil IL-2 ein starker Wachstumsfaktor ist und IFN-γ antiproliferativ ist, könnte IL-12 bewirken, dass Zellwachstum und Lebensfähigkeit aufrechterhalten werden oder dass eine Apoptose von CD4+-IFN-γ-T-Zellen verhindert wird (Fuss, I. J. et al., Gastroenterology, 117: 1078–1088, 1999; Marth, T. et al., J. Immunol., 162: 7233–7240, 1999). Auch vermehrt IFN-γ, das durch IL-12 erhöht wird, die Expression von IL-15 (Zhang, X. et al., Immunity, 8: 591–599, 1998), das mit Gedächtnis-CD8+-T-Zellen zusammenhängt. Beruhend auf diesen Berichten ist IL-12 sehr nützlich bei einer Immunisierung mit einem Impfstoff, da IL-12 nicht nur mit der frühen Immunreaktion sondern auch mit der Gedächtnis-Immunreaktion zusammenhängt.
Bei der biologisch wirksamen Form von IL-12 handelt es sich um ein Heterodimer von 70 kDa, IL-12p70, das aus den Disulfid-gebundenen Untereinheiten p40 und p35 besteht. Die Untereinheit p40 teilt sich eine Aminosäurehomologie mit dem IL-6-Rezeptor, sie gehört also zur Zytokinrezeptorsuperfamilie, während die Untereinheit p35 eine entfernte, aber signifikante Verwandtschaft zur Zytokinfamilie der IL-6/Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktoren aufweist (Gearing, D. P. und Cosman, D., Cell, 66: 9–10, 1991).
IL-12p40 wird sowohl in vitro (D'Andrea et al., J. Exp. Med., 176: 1387–1398, 1992; Podlasky, F. J. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294: 230–237, 1992) als auch in vivo (Mattner, F. et al., Eur. J. Immunol., 23: 2202–2208, 1993; Heinzel, F. P. et al., Infect. Immun., 62: 4244–4249, 1994) in großem Überschuss über IL-12p70 sowohl als Monomer als auch als Homodimer sezerniert. Es ist demonstriert worden, dass IL-12p40 durch IL-12p70 vermittelten Reaktionen stark entgegenwirkt, indem es in vitro kompetitiv an den IL-12 Rezeptor bindet (Gillessen, S. et al, Eur. J. Immunol., 25: 200– 206, 1995; Ling, P. et al., J. Immunol., 154: 116–127, 1995), was die entscheidende Rolle von IL-12p40 als natürlicher Antagonist von IL-12p70 nahe legt. Dies wird durch mehrere Beobachtungen unterstützt, einschließlich einer Reduktion der Th1-Reaktionen bei für IL-12p40 transgenen Mäusen (Yoshimoto, T. et al., J. Immunol., 160: 588–594, 1998), der Verhinderung einer allogenen Abstoßung bei transplantierten Myoblasten, die genetisch verändert wurden, um IL-12p40 zu produzieren (Kato, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93: 9085–9089, 1996), und der Hemmung der Tumorsuppressions-Aktivität von IL-12p70 durch ein Adenovirus, das IL-12p40 exprimiert (Chen, L. et al., J. Immunol., 159: 351–359, 1997). Im Gegensatz dazu gibt es einen Bericht, der eine positive Rolle von IL-12p40 bei durch IL-12p70 vermittelten Reaktionen beschreibt, die unter bestimmten Bedingungen zu alloantigenspezifischer Th1-Entwicklung führen (Piccotti, J. R. et al., J. Immunol., 157: 1951–1957, 1996). Überdies war den Erfindern eine neue Funktion von IL-12p40 als einem chemotaktischen Molekül für einen Makrophagen bekannt (Ha, S. J. et al., J. Immunol., 163: 2902–2908, 1999).
Verschiedene in-vivo-Systeme sind etabliert worden, um die Antikrebswirkung von IL-12p70 zu beweisen. Es gibt jedoch eine signifikante Nebenwirkung, die zum Tode führen könnte, falls das menschliche rekombinante Protein IL-12p70 einem Krebspatienten direkt injiziert wird (Robertson, M. J. und Ritz, J., Oncologist, 1: 88–97, 1996; Cohen, J., Science, 270: 908, 1995). Um diese Nebenwirkung zu verhindern und um ökonomisch wirksam zu sein, sind viele Untersuchungen über eine Gentherapie unter Verwendung des IL-12-Gens durchgeführt worden, was nun beweist, dass eine IL-12-Gentherapie sehr wirksam ist und nicht schadet (Rakhmilevich, A. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6291–6296, 1996; Tahara, H. et al., J. Immunol., 154: 6466–6474, 1995; Lotze, M. T. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 795: 440–454, 1996).
IL-12p70, eine biologisch aktive Form von IL-12, ist für die Gentherapie unter Verwendung von IL-12 unentbehrlich (Gulber, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4143–4147) und cDNAs von p35 und p40 sollten in einer Zelle zur gleichen Zeit exprimiert werden. Viele Verfahren sind verwendet worden, um die Untereinheiten p35 und p40 gleichzeitig zusammen in einer Zelle zu exprimieren. Eins davon ist, eine Expressionskassette zu verwenden, durch die p35 und p40 in eine aufeinanderfolgende Reihe gesetzt und eins nach dem anderen exprimiert werden (Rakhmilevich, A. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6291–6296, 1996). Ein anderes ist, die interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) des Encephalomyocarditisvirus (EMCV) zur gleichzeitigen Expression beider Gene zu verwenden. Diese Verfahren waren beim Exprimieren von IL-12p70 in einer Zelle erfolgreich, aber, wie vorstehend erwähnt, beim Entfernen der Möglichkeit, dass kontinuierlich exprimiertes überschüssiges IL-12p40 die biologische Wirkung von IL-12p70 hemmt, nicht erfolgreich.
Um diesen innewohnenden Fehler zu überwinden, wurde kürzlich die genetische Kopplung der Untereinheit p35 gefolgt von der Untereinheit p40 mit Hilfe einer DNA-Sequenz, die einen Proteinlinker kodiert, der gewöhnlich bei der gentechnischen Antikörperherstellung verwendet wird, vorgeschlagen (Lieschke, G. J. et al., Nat. Biotechnol., 15: 35–40, 1997; Lode, H. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2475–2480, 1998; Lee, Y. L. et al., Human Gene Ther., 9: 457–465, 1998). Eine antagonistische Wirkung von überschüssigem IL-12p40 gegen die biologische Aktivität von IL-12p70 konnte bei dem vorstehenden Verfahren überwunden werden. Es ist jedoch immer noch nicht gut genug, weil ein Problem darin besteht, dass die Aktivität von IL-12p70 5-100-mal mehr gesenkt worden war, da dessen Struktur verändert werden kann, wenn p35 und p40 miteinander verknüpft werden. Für die wirksame Behandlung gegen Krebs oder andere Krankheiten mit dem IL-12-Gen ist es erforderlich, IL-12p70 zu induzieren, das noch die gleiche Aktivität hat, und die Sekretion von IL-12p40 zu verhindern.
Von der Glykosylierung ist bekannt, dass sie zur Proteinfaltung, Sekretion, Konformation, Stabilität und biologischen Aktivität beiträgt. Die Untereinheiten p35 und p40 des menschlichen IL-12 exprimieren 219 und 328 Aminosäuren, die 56 beziehungsweise 22 Aminosäuren hydrophobe Signalsequenzen enthalten. Die Analyse der Aminosäuresequenz des menschlichen IL-12 gibt drei und vier mutmaßliche N-Glykosylierungsstellen innerhalb der Untereinheiten p35 beziehungsweise p40 zu erkennen (Podlasky, F. J. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294: 230–237, 1992). Stern et al. berichteten, dass IL-12p35 und IL-12p40 nach einer Behandlung von menschlichem IL-12 mit Trifluormethansulfonsäure oder Glykosidase F im Molekulargewicht verringert waren (Podlasky, F. J. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294: 230–237, 1992). Dies legt nahe, dass die Untereinheiten p35 und p40 des menschlichen IL-12 aus Kohlenhydraten zusammengesetzt sind. Im gleichen Bericht wurde auch demonstriert, dass das Verdauen von IL-12p35 mit Neuramidase, gefolgt von Endo-α-N-acetylgalactosaminidase dessen Molekulargewicht verringerte, während IL-12p40 durch eine derartige Behandlung unbeeinflusst war. Diese Experimente zeigen an, dass O-verknüpfte Oligosaccharide zur Glykosylierung von IL-12p35 beitragen und dass IL-12p40 keine O-verknüpften Oligosaccharide hat. Und bei der Analyse der N-Glykosylierung an den Aminosäureresten Asn-135 und Asn-222 wurde aufgedeckt, dass Asn-222 die N-Glykosylierungsstelle ist. Die genauen N-Glykosylierungsstellen des menschlichen und Maus-IL-12 und dessen Wirkungen auf die Synthese, Sekretion und biologische Aktivität von IL-12 sind nicht definiert worden.
Andererseits ist die Untersuchung unter Verwendung des Gens IL-12 beschleunigt worden, da eine zellvermittelte Immunreaktion statt einer humoralen Immunreaktion für die Prävention und Behandlung vieler viraler oder bakterieller Krankheiten zusammen mit der Unterdrückung der Krebsbildung erforderlich ist. Bei Hepatitis C handelt es sich um die repräsentative Virus-vermittelte Krankheit und mehr als 50% der Patienten werden chronisch und führen schließlich zu Leberzirrhose oder Leberkrebs, wenn sie einmal mit HCV infiziert sind (Alter, H. J. et al., N. Engl. J. Med., 321: 1494–1500, 1989). Bis heute ist nur α-Interferon als Behandlungsmittel für Hepatitis C bekannt, aber die Wirkung ist nicht gut genug (10–30%) (Weiland, E. et al., J. Virol., 66: 3677–3682, 1992). So sind ein wirksamerer Impfstoff oder wirksamere Behandlungsmittel gegen HCV dringend erforderlich. Gemäß den medizinischen Testberichten, die sowohl Menschen als auch Schimpansen einschließen, hängt HCV mit einer spezifischen humoralen Immunreaktion und ebenfalls mit einer zellvermittelten Immunreaktion zusammen (Prince, A. M. et al., J. Infect. Dis., 165: 438–443, 1992) und es wird berichtet, dass das Strukturprotein E1 und E2 von HCV ein Hauptantigen ist, um eine schützende Immunität zu induzieren (Choo, Q. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1294–1298, 1994). Noch einmal, eine zellvermittelte Immunreaktion einschließlich CTL wird im Vergleich zu einer humoralen Immunreaktion vorzugsweise benötigt, um HCV zu entfernen (Cooper, S. et al., Immunity, 10: 439–449, 1999; Rinaldo, C. et al., J. Virol., 69: 5838–5842, 1995).
Die DNA-Immunisierung ist das neueste Verfahren, um eine zellvermittelte Immunreaktion zu induzieren. Die DNA-Immunisierung unterscheidet sich von der existierenden, die tote oder detoxifizierte Pathogene oder bestimmte Teile von Pathogenen verwendet, in der Weise, dass eine DNA, die eine spezifische Komponente eines Pathogens kodiert, direkt in den menschlichen Körper eingefügt wird. Es ist auch bekannt, dass eine DNA-Immunisierung eine starke Immunreaktion gegen verschiedene infektiöse Viren wie zum Beispiel Grippe, Hepatitis B und das menschliche Immundefizienzvirus induziert (Ulmer, J. B. et al., Science, 259: 1745–1749, 1993; Michel, M. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 5307–5311, 1995; Irwin, M. J. et al., J. Virol., 68: 5306–5044, 1994). Zusätzlich wird auch berichtet, dass eine DNA-Immunisierung eine spezielle Immunreaktion gegen das Capsid- und E2-Protein von HCV induziert (Major, M. E. et al., J. Virol., 69: 5798–5805, 1995; Tedeschi, V. et al., Hepatology, 25: 459–462, 1997).
Die DNA-Immunisierung ist jedoch in der Verwendung beschränkt, weil die Expressionsfrequenz eines Antigens in vivo niedrig ist. Irgendwelche Gene für kostimulatorische Moleküle, die zur Aktivierung von Immunzellen notwendig sind, wurden verwendet, um die Wirkung einer DNA-Immunisierung zu erhöhen (Geissler, M. et al., J. Immunol., 159: 5107–5113, 1997; Iwasaki, A. et al., J. Immunol., 158: 4591–4601, 1997; Lee, S. W. et al., J. Virol., 72: 8430–8436, 1997). Das Gen für IL-12 wurde auch verwendet, um eine Immunreaktion gegen HCV in wirksamer Weise zu induzieren (Lasartte, J. J. et al., J. Immunol., 162: 270–277, 1999). Dies hat jedoch bisher besonders bei der DNA-Immunisierung bei Menschen und Primaten unbefriedigende Ergebnisse ergeben (Boyer, J. et al., Keystone Symposium on DNA Vaccines, 12.–17. April 1998).
Die Erfinder strengten sich an, um Gene herzustellen, die durch die Kontrolle der Glykosylierung aktives IL-12p70 exprimieren können und die Sekretion von IL-12p40 minimieren können, das die Immunaktivität durch die Wirkung von IL-12 senkt. Als Ergebnis wurde das mutante Gen durch die Mutation von Asn-222, der Glykosylierungsstelle der menschlichen Untereinheit IL-12p40, und Asn-220, der Glykosylierungsstelle der Maus-Untereinheit IL-12p40, erhalten. Die erhaltenen mutanten Gene, welche die Expression von aktivem IL-12p70 erhöhen und die Sekretion von IL-12p40 senken, wurden in einem Kleintiermodell, Mäusen, zusammen mit dem Gen für HCV E2 zur DNA-Immunisierung verwendet. Durch diesen Versuch wurde die beste zellvermittelte Immunreaktion induziert und diese Immunreaktion wurde sogar über einen langen Zeitraum fortgesetzt. So ist es sicher, dass das mutante Gen der vorliegenden Erfindung als Adjuvans für einen DNA-Impfstoff sehr nützlich ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein mutantes Gen für IL-12p40 bereitzustellen, das die grundlegende Rolle von IL-12, wie zum Beispiel die Aktivierung von CTL-Zellen oder die Verstärkung einer Immunreaktion durch Th1-Zellen durch Mutieren der Glykosylierungsstelle aktiviert, die bei der Sekretion von IL-12p40 beim Menschen oder bei der Maus unentbehrlich ist, um die Sekretion von IL-12p40, das die Aktivierung von IL-12p70 durch kompetitives Binden des Rezeptors von IL-12p70 hemmt, zu senken.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Adjuvans bereitzustellen, das eine antigenspezifische Immunreaktion durch DNA-Immunisierung unter Verwendung eines Expressionsvektors aurechterhält und erhöht, der das mutante Gen für IL-12p40 und den DNA-Impfstoff zusammen enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER BILDER
1 zeigt die Sequenzhomologie von Aminosäuren zwischen menschlichem und Maus-IL-12p40.
2 zeigt die Untereinheiten p40 und p35 des menschlichen Wildtyp-IL-12 und Aminosäureänderungen an mutmaßlichen N-Glykosylierungsstellen der Untereinheiten p40 und p35 bei der vorliegenden Erfindung.
3a zeigt das Ergebnis einer Western-Blot-Analyse von menschlichem IL-12p35 und dessen Derivaten mit Mutationen an mutmaßlichen N-Glykosylierungsstellen in einem Zell-Lysat der vorliegenden Erfindung.
3b zeigt das Ergebnis einer Western-Blot-Analyse von menschlichem IL-12p40 und dessen Derivaten mit Mutationen an mutmaßlichen N-Glykosylierungsstellen in einem Zell-Lysat der vorliegenden Erfindung.
3c zeigt das Ergebnis einer Western-Blot-Analyse von menschlichem IL-12p40 und dessen Derivaten mit Mutationen an mutmaßlichen N-Glykosylierungsstellen in einem Zellüberstand der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt einen Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, der mit dem Gen für das Hüllglykoprotein 2 (E2) des Hepatitis C Virus (HCV) und dem Wildtyp- oder dem mutanten Mausgen für IL-12 eingefügt ist.
5a zeigt das Ergebnis einer Titermessung von Gesamt-IgG-Antikörper gegen HCV E2 im Serum einer Maus, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert ist.

G I: Maus, die mit 200 μg pTV2 immunisiert ist.
G II: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2 immunisiert ist.
G III: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2-mIL-12wt immunisiert ist.
G IV: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2-mIL-12mut immunisiert ist.

5b zeigt das Ergebnis einer Titermessung von IgG1-Antikörper gegen HCV E2 im Serum einer Maus, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert ist.

5c zeigt das Ergebnis einer Titermessung von IgG2a-Antikörper gegen HCV E2 im Serum einer Maus, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert ist.

5d zeigt das Ergebnis einer Titermessung von IgG2a- und IgG1-Antikörper (IgG2a/IgG1) gegen HCV E2 im Serum einer Maus, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert ist.

6a zeigt das Ergebnis einer Messung des IFN-γ-Produktionsspiegels aus Maus-Milzzellen, die 3 Wochen nach dem Immunisieren mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.

G I: Maus, die mit 200 μg pTV2 immunisiert ist.
G II: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2 immunisiert ist.
G III: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2-mIL-12wt immunisiert ist.
G IV: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2-mIL-l2mut immunisiert ist.

6b zeigt das Ergebnis einer Messung des IFN-γ-Produktionsspiegels aus Maus-Milzzellen, die 6 Wochen nach dem Immunisieren mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.

6c zeigt das Ergebnis einer Messung des IFN-γ-Produktionsspiegels aus Maus-Milzzellen, die 10 Wochen nach dem Immunisieren mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.

7 zeigt das Ergebnis einer Messung der spezifischen CTL-Aktivität gegen HCV E2 unter Verwendung von gentechnisch hergestellten CT26-Tumorzellen, die hghE2t exprimieren, nach der Immunisierung mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung.

G I: Maus, die mit 200 μg pTV2 immunisiert ist.
G II: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2 immunisiert ist.
G III: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2-mIL-12wt immunisiert ist.
G IV: Maus, die mit 100 μg pTV2-HCV-gDsE2t und 100 μg pTV2-mIL-12mut immunisiert ist. a: sofort nach der Immunisierung, b: 3 Wochen nach der Immunisierung, c: 6 Wochen nach der Immunisierung, d: 10 Wochen nach der Immunisierung, e: 14 Wochen nach der Immunisierung, f: Kontrolle (CT26-neo-Zellen), 14 Wochen nach der Immunisierung

8a zeigt das Ergebnis einer Messung der Spiegel von Gesamt-IgG, IgG1 und IgG2a gegen HCV E2 in Mäuseserum 2 Wochen nach einer Herausforderung mit gentechnisch hergestellten CT26-Tumorzellen, die hghE2t exprimieren, in Mäusen, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert sind.

8b zeigt das Ergebnis einer Messung des Verhältnisses der Titer von IgG2a und IgG1 (IgG2a/IgG1) gegen HCV E2 in Mäuseserum 2 Wochen nach einer Herausforderung mit gentechnisch hergestellten CT26-Tumorzellen, die hghE2t exprimieren, in Mäusen, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert sind.

8c zeigt das Ergebnis einer Messung der Änderung des Produktionsspiegels von IFN-γ durch Tumorzellen, die hghE2t exprimieren, in Mäusen, die mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert sind.

8d zeigt das Ergebnis einer Messung der Überlebensrate von Mäusen, die mit gentechnisch hergestellten CT26-Tumorzellen, die hghE2t exprimieren, herausgefordert wurden, nach der Immunisierung mit einem DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung.

9 zeigt eine schematische Ansicht der biologischen Funktion von IL-12 in vivo.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Um diese Ziele zu erreichen, stellt die vorliegenden Erfindung mutante menschliche oder Maus-Gene für die Untereinheit IL-12p40 bereit, wobei Asn-222 (Mensch) oder Asn-220 (Maus), das für die Sekretion von IL-12p40 unentbehrlich ist, durch andere Aminosäuren ersetzt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Genkonstrukt und einen Expressionsvektor bereit, die eine IRES-Sequenz zur Koexpression von menschlichen oder Maus-Genen einer mutierten Untereinheit IL-12p40 beziehungsweise von menschlichen oder Maus-Genen einer Untereinheit IL-12p35 enthalten.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein therapeutisches oder prophylaktisches Adjuvans zur DNA-Immunisierung oder Gentherapie bereit, umfassend ein Gen, das eine mutante menschliche oder Maus-Untereinheit IL-12p40 kodiert, oder ein Genkonstrukt oder einen Expressionsvektor, der das Gen umfasst, wobei Asn-222 der menschlichen Untereinheit IL-12p40 oder Asn-220 der Maus-Untereinheit IL-12p40, das zur Sekretion von IL-12p40 unentbehrlich ist, mutiert ist und wobei das Adjuvans für die Verstärkung der Immunreaktion verwendet wird.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden hierin später erscheinen.
Noch einmal, die vorliegende Erfindung soll mutante menschliche oder Maus-Gene für IL-12p40 bereitstellen, wobei Asn-222 (Mensch) oder Asn-220 (Maus), die eine sehr wichtige Rolle bei der Sekretion von menschlichem IL-12p40 mit SEQ. NO. 1 oder IL-12p40 der Maus mit SEQ. NO. 2 spielen, durch andere Aminosäuren ersetzt sind.
Wenn man die Aminosäuresequenz von menschlichem und Maus-IL-12p40 vergleicht, befindet sich Asn-220 des IL-12p40 der Maus in einem zu Asn-222 des menschlichen IL-12p40 sehr ähnlichen Zusammenhang (1).
Genauer gesagt, das Kodon AAC, das Asn-222 der menschlichen Untereinheit IL-12p40 bezeichnet, kann mit CUC, CAG oder AUA usw. getauscht werden, und die unter jedes von diesen fallenden Aminosäuren sind Leu, Gln und Ile. Die vorliegende Erfindung gibt Testbeispiele, die demonstrieren, dass AAC auf einer cDNA zu CTC oder CAG geändert wurde, und das Kodon AAC wurde so gegen CUC oder CAG ausgetauscht.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein mutantes Gen bereit, bei dem die Aminosäure Asn-222 durch Leu-222 (hp40-N222L) oder GIn-222 (hp40-N222Q) ersetzt wurde.
Das Kodon ACC, welches Asn-220 der Maus-Untereinheit IL-12p40 bezeichnet, das mit Asn-222 der menschlichen Untereinheit IL-12p40 verglichen wird, kann mit CUC, CAG oder AUA getauscht werden, und die unter jedes von diesen fallenden Aminosäuren sind Leu, Gln und Ile. Die vorliegende Erfindung stellt ein mutantes Gen bereit, bei dem die Aminosäure Asn-220 durch Tauschen von AAC mit CTC auf der cDNA durch Leu-220ersetzt worden ist (mp40-N220L).
Die mutanten Gene hp40-N222L, hp40-N222Q und mp40-N220L der vorliegenden Erfindung kodieren Aminosäuresequenzen, die als SEQ. NO. 3, SEQ. NO. 4 beziehungsweise SEQ. NO. 5 angemerkt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Genkonstrukt bereit, das zur gleichzeitigen Expression der Untereinheit selbst und des mutanten menschlichen oder Maus-Gens für die Untereinheit IL-12p40 eine IRES enthält, und einen Expressionsvektor, der dieses Genkonstrukt einschließt.
Zunächst stellt die vorliegende Erfindung die Gene hp40-N222L/IRES/hp35, hp35/IRES/hp40-N222L und mp35/IRES/mp40-N220L bereit, welche die vorstehend erklärten Gene enthalten. Das Gen hp40-N222L/IRES/hp35 und das Gen hp35/IRES/hp40-N222L schließen ein Gen ein, das die Untereinheit p35 zusammen mit der menschlichen Untereinheit p40 kodiert, die Leu-222 anstelle von Asn-222 hat, während das Gen mp35/IRES/mp40-N220L ein Gen einschließt, das die Untereinheit p35 zusammen mit der Maus-Untereinheit p40 kodiert, dessen Asn-220-Stellen durch Leu-220 ersetzt wurden. Beide Gene haben eine IRES-Sequenz zur gleichzeitigen Expression von Untereinheiten. Die IRES aus EMCV (Encephalomyocarditis) ist für Gene wie zum Beispiel hp40-N222L/IRES/hp35, hp35/IREShp40-N222L und mp35/IRES/mp40-N220L vorzuziehen aber nicht darauf beschränkt. Eine IRES-Sequenz ist bei der Koexpression von Genen wichtig, welche die Untereinheit p40 und Untereinheit p35 kodieren.
Die vorliegende Erfindung stellt Expressionsvektoren bereit, zum Beispiel pGX0hp40-N222L/IRES/hp35, der hp40-N222L/IRES/hp35 enthält, pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L der hp35/IRES/hp40-N222L enthält, und ebenso pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L, der mp35/IRES/mp40-N220L enthält.
Die vorliegende Erfindung zeigt ein Beispiel, bei dem es möglich wird, dass das Plasmid pGX0, ein DNA-Impfstoff-Vektor, in einem medizinischen Experiment verwendet wird, indem ein Kanamycinresistenzgen anstelle eines Ampicillinresistenzgens des DNA-Impfstoff-Vektors pTV2 eingefügt wird (Song, M. K. et al., J. Virol., 74: 2920–2925, 2000), und das Gen hp40-N222L/IRES/hp35 und das Gen hp35/IRES/hp40-N222L wurden in den Teil des Plasmid pGX0 eingefügt, der bereit ist, fremde Gene aufzunehmen. Und das Gen mp35/IRES/mp40-N220 wurde in den Teil des DNA-Impfstoff Vektors pTV2 eingefügt, der ein fremdes Gen aufnimmt. Neben den vorstehenden Plasmiden, die zur Herstellung von Expressionsvektoren verwendet werden, gibt es verschiedene Vektoren einschließlich solcher für Prokaryoten oder Eukaryoten, was es ermöglicht, einen anderen Vektor für einen anderen Zweck zu verwenden. Es ist auch möglich, die Größe und Nukleotidsequenz eines Gens zu ändern, das in den Teil des Expressionsvektors, der ein fremdes Gen aufnimmt, eingefügt werden soll.
Die Expressionsvektoren pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L und pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35 der vorliegenden Erfindung wurden am 26. Februar 2001 bei der Genbank des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology hinterlegt (Hinterlegungsnr.: KCTC 0969BP und KCTC 0970BP). Und pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L wurde am 29. Februar 2000 bei der Genbank hinterlegt (Hinterlegungsnr.: KCTC 0745BP).
Da die Koexpression von p35 und p40 unentbehrlich ist, um ein biologisch aktives IL-12p70 zu erhalten, wurden bicistronische Expressionsvektoren, pGX0-hp40/IRES/hp35 und pGX0-hp35/IRES/hp40, unter Verwendung der IRES von EMCV neben pCIN-hp35 oder pCIN-hp40 erzeugt, die hp35 beziehungsweise hp40 exprimieren. Um den Einfluss der N-Glykosylierung auf die Synthese, Sekretion und spezifische Aktivität von menschlichem IL-12 zu verstehen, wurde ein Asn-Aminosäurerest in einer mutmaßlichen N-Glykosylierungsstelle, die auf der Untereinheit p35 und p40 existiert, durch ortsspezifische Mutagenese durch andere Aminosäurereste ersetzt (2). Durch den Immunoblot von Wildtypprotein gegen mutantes Protein (3a, 3b und 3c), war sicher, dass Asn-127, -141 der Untereinheit hp35 und Asn-222, -303 der Untereinheit hp40 zur N-Glykosylierung verwendet wurden.
Um die Wirkung der N-Glykosylierung von hp35 oder hp40 auf die Synthese der Heterodimerisierung und Sekretion von IL-12p70 nachzuweisen, wurden Zellen mit einem hIL-12-Expressionsvektor transfiziert, der jedes Wildtypgen oder mutante Gen enthielt, und dann unter Verwendung von daraus erhaltenem Kulturüberstand und Zell-Lysat durch ELISA analysiert.
Als Ergebnis ist geklärt worden, dass Asn-127 von hp35 eine Abnahme der Heterodimerisierung und Sekretion von IL-12p70 verursacht. Im Vergleich zu Wildtyphp35 scheint Asn-141 von hp35 jedoch die Heterodimerisierung und Sekretion von IL-12p70 und IL-12p40 verhältnismäßig wenig zu beeinflussen (TABELLE 1).
Zusätzlich senkt die Mutation von Asn-135 oder Asn-222 der Untereinheit hp40 die Sekretion von IL-12p40 signifikant, während sie die Sekretion von IL-12p70 nicht beeinflusst. Besonders fiel die Sekretion von hp40 durch Asn-222 auf ein Ausmaß von 8% relativ zu Wildtyp-hp40. Obwohl es sich bei Asn-135 von hp40 nicht um eine N-Glykosylierungsstelle handelt, verursacht sie doch eine Abnahme der Sekretion von hp40, was bedeutet, dass das Asn von Asn-135 selbst eine wichtige Rolle bei der Sekretion von hp40 spielt. Obwohl die Aminosäure von Asn-222 durch Gln oder Leu ersetzt wurde, war die Sekretion von hp40 immer noch gesenkt, was nahe legt, dass es wegen des Verlustes der N-Glykosylierung an Asn-222 (TABELLE 1) war. So ist die N-Glykosylierung an Asn-222 nicht für die Sekretion des hIL-12-Heterodimers, hIL-12p70, sondern nur für die Sekretion von hIL-12p40 erforderlich.
Wenn man alle diese Ergebnisse zusammen in Betracht zieht, verifizierten die Erfinder, dass eine N-Glykosylierung an Asn-222 für die Sekretion von hIL-12p40 notwendig ist, aber für die Sekretion und Heterodimerisierung von hIL-12p70 nicht erforderlich ist, unterdessen spielt die N-Glykosylierung von hp35 an Asn-127 eine wichtige Rolle bei der Sekretion und Heterodimerisierung von hIL-12p70.
Um die Wirkung einer N-Glykosylierung von hIL-12 auf die biologische Aktivität zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von Wildtyp-IL-12 und dessen Derivaten, die eine Mutation der möglichen N-Glykosylierungsstelle enthielten, zur Induktion von IFN-γ durch ELISA analysiert.
Als Ergebnis, was die Fähigkeit zur Induktion von IFN-γ betrifft, wurde die Fähigkeit zur Induktion von IFN-γ in einem Kulturüberstand, der durch Kotransfektion mit Wildtyp-hp35 und hp40-Mutanten, bei denen Asn-135 und/oder Asn-222 mutiert worden waren, im Vergleich zu der des Wildtyps oder anderer hp40-Mutanten erhöht (TABELLE 1). Und, wenn hp40 im Kulturüberstand zugeführt wurde, war die erhöhte Fähigkeit zur Induktion von IFN-γ auf einen ähnlichen Spiegel zurückgekommen wie der des Wildtyps (TABELLE 1). Also wird nahe gelegt, dass diese Ergebnisse dem relativ niedrigen Spiegel von hIL-12p40, das als Antagonist gegen hIL-12p70 bekannt ist, im Kulturüberstand von Mutanten zuzuschreiben sind, die hp40-N135Q und/oder hp40-N222Q enthalten, und die Aktivität von hp70, das durch eine Mutation von Asn-135 und/oder Asn-222 hergestellt wird, wird durch die Mutation selbst nicht erhöht.
Unterdessen wurden Zellen, um die Wirkung der Glykosylierung von hp40 an Asn-222 auf die Abnahme der Sekretion von hIL-12p40 zu untersuchen, mit einem Expressionsvektor kotransfiziert, der eine bestimmte Menge des mutanten Gens und verschiedene Mengen Wildtyp-hp35-DNA enthielt, und dann kultiviert. Schließlich wurde die induzierte Menge an IFN-γ durch ELISA gemessen.
Im Allgemeinen wird die Untereinheit p35 nicht alleine sezerniert, sondern in Form von IL-12p70 an p40 bindend sezerniert, während die Untereinheit p40 in Form eines Monomers oder Homodimers sezerniert wird, was nahe legt, dass nicht p35 sondern die Untereinheit p40 ein Hauptfaktor beim Induzieren der Sekretion von IL-12p70 ist. Dementsprechend wurde die Menge der hIL-12p70-Sekretion proportional zur Menge der transfizierten hp35-DNA sowohl bei Wildtyp-hp40 als auch bei der Mutante hp40-N222Q erhöht (TABELLE 1). Dies bedeutet, wenn hp40, das einen Sekretionsfehler hat, einmal an die Untereinheit hp35 gebunden ist, kann es in Form von IL-12p70 sezerniert werden, und so scheint die Untereinheit hp35 ihre andere Funktion bei der Sekretion von hIL-12p70 auszuführen. Gemäß einem neueren Bericht ist die konformative Änderung von hp40 auf das Binden an hp35 zurückzuführen (Yoon, C. et al., EMBO J., 19: 3530–3534, 2000), was auch nahe legt, dass die Untereinheit hp35 zur Sekretion von IL-12p70 beitragen kann. hp40, das selbst eine Glykosylierung an Asn-222 einschließt, hat eindeutig einen Fehler bei der Sekretion, wenn es aber einmal an hp35 gebunden ist, kann hp40 in seiner Form konformativ geändert werden und seine konformative Änderung könnte das verdeckte oder neue Sekretionssignal freilegen beziehungsweise erzeugen und dann die Sekretion des Heterodimers induzieren.
Um die Sekretion von p40 durch Induzieren der Koexpression von p35 und p40 in einer Zelle zu senken und um die Menge der p40-Sekretion durch Induzieren der Bildung eines p40 zu senken, wobei das p40-Gen hinter der IRES liegt, weil das Ausmaß der Genexpression unter Verwendung von IRES eher niedriger ist als unter Verwendung eines Cytomegalovirus-(CMV-) Promotors, wurden die Vektoren hp40/IRES/hp35 und hp35/IRES/hp40 konstruiert. Und auch hp40-N222L/IRES/hp35 und hp40/IRES/hp40-N222L, wobei in jedem Plasmid das Gen hp40 durch das Gen hp40-N222L ersetzt worden war, wurden erzeugt (TABELLE 1). Vergleicht man hp40/IRES/hp35 mit hp40-N222L/IRES/hp35, wurde hp40 in letzterem weniger sezerniert, in einem Ausmaß von 5%. Andererseits, wenn hp35 und hp40-N222L elektroporiert wurden, wurde hp40 in einem Ausmaß von 8% sezerniert. Wenn hp35 und hp40-N222L elektroporiert wurden, ist es möglich, dass die beiden Plasmide nicht alle beide in eine Zelle transfiziert werden. Außerdem wird, wenn das Gen hp40-N222L in einer Zelle allein exprimiert wird, eine kleine Menge hp40 ohne die Sekretion von hp70 sezerniert. Deshalb nimmt man an, dass hp40 bei hp40-N222L plus hp35 mehr sezerniert wird als bei hp40-N222L/IRES/hp35, wobei die Gene hp35 und hp40-N222L gleichzeitig exprimiert werden. Vergleicht man hp40/IRES/hp35 mit hp35/IRES/hp40, waren die Sekretion und Expression von hp70 nicht sehr unterschiedlich, aber die Sekretion und Expression von hp40 war bei hp35/IRES/hp40 signifikant gesenkt, da die Expression von hp40 durch das Platzieren des Gens hp40 hinter die IRES niedergedrückt wurde. Im Falle von hp35/IRES/hp40-N222L, das durch Einfügen des Gens hp40-N222L anstelle des Gens hp40 hergestellt wurde, fiel der Sekretionsspiegel von hp40 auf 0,3%. Also wird durch das vorliegende Experiment bestätigt, dass hp35/IRES/hp40-N222L dasjenige ist, das den Sekretionsspiegel von hp70 aufrechterhalten und gleichzeitig die Sekretion von hp40 minimieren kann.
Ein DNA-Impfstoff-Vektor kann das Gen E2 von HCV-1b und ein Genkonstrukt mit einem Gen für die Untereinheit p40, das an Asn-222 (Mensch) oder Asn-220 (Maus) mutiert ist, enthalten und exprimieren.
Um die Möglichkeit einer Verwendung des mutanten hIL-12-Gens der vorliegenden Erfindung als DNA-Impfstoff bei einer Gentherapie zu überprüfen, wurde die zu Asn-222 des Gens hp40 homologe Sequenz des Gens IL-12p40 der Maus (mp40) durchsucht. Asn-220 von mp40 befand sich in einem sehr ähnlichen Zusammenhang wie der von Asn-222 von hp40, aber von dieser Aminosäure war bis jetzt nicht bekannt, dass sie N-glykosyliert wurde (1). Deshalb erzeugten die Erfinder den Vektor pCIN-mp40-N220L, der das mutante mp40-Gen mp40-N220L enthält, bei dem die Aminosäure Asn-220 durch ortsspezifische Mutagenese durch Leu ersetzt wurde.
Um einen Vektor zu erzeugen, der die Maus-Untereinheiten p35 und p40 kodiert und für die DNA-Immunisierung verwendet wird, wurde der Vektor pTV2-mp35/IRES/mp40 durch Einführen des Fragments mp35/IRES/mp40 in den Vektor pTV2, einen eukaryotischen Expressionsvektor, der als DNA-Impfstoff-Vektor bei Kleintieren verwendet wird, konstruiert (Lee et al., J. Virol., 72: 8430–8436, 1998; Cho et al., Vaccine, 17: 1136–1144, 1999). Und der Vektor pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L, der ein für Asn-220 mutantes Mausgen für IL-12p40 enthält und p35 exprimiert, wurde beruhend auf der Beobachtung konstruiert, dass das Gen hp35/IRES/hp40-N222L die Sekretion von hp70 aufrechterhalten kann, während es die Sekretion von hp40 minimieren kann.
Der Vektor pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L der vorliegenden Erfindung wurde am 29. Februar 2000 bei der Genbank des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology hinterlegt (Hinterlegungsnr.: KCTC 0745BP).
Der DNA-Impfstoff-Vektor pTV2-HCV-E2, der das Protein HCV E2 in eukaryotischen Zellen exprimieren kann, wurde konstruiert (Song M. K., et al., J. Virol., 74: 2920– 2925, 2000). Wie in 4 gesehen wird, besteht der DNA-Impfstoff-Vektor pTV2-HCV-E2 aus dem Replikationsursprung des Simian-Virus 40 (SV40 ori), dem Cytomegalovirus-(CMV-) Promotor, der dreiteiligen Leader-Sequenz (TPL) von Adenovirus, einer multiplen Klonierungssequenz (MCS), der SV40-Polyadenylierungssequenz (poly A) und dem Ampizillinresistenzgen (AmpR). Und auch das Gen HCV E2 wird in die MCS dieses Vektors kloniert. Der einen hydrophoben Aminosäurerest enthaltende Carboxyterminus (C-Terminus) des Gens E2, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurde entfernt, um die Proteinsekretion zu erleichtern. Und um die Proteinexpression und die Zellsekretion zu unterstützen, wurden der Aminoterminus (N-Terminus) und die Signalsequenz (S) des Glykoproteins D (gD) aus Herpesvirus (HSV) verknüpft.
Um die Wirkung der Asn-220-Mutation von IL-12p40 der Maus auf die Sekretion von IL-12p40 oder IL-12p70 zu analysieren, wurde der Sekretionsspiegel von IL-12 der Maus sowohl mit Kulturüberständen als auch Lysaten von Zellen, die mit den vorstehenden Vektoren transfiziert waren, durch ELISA analysiert. Als Ergebnis zeigten mp40-N220L-Mutanten ähnliche Eigenschaften wie Asn-222-Mutanten von hp40 im Punkt der Sekretion von IL-12p40 oder IL-12p70 und dessen biologischer Aktivität (TABELLE 1).
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein Adjuvans zur Gentherapie oder DNA-Impfstoff-Immunisierung bereit, umfassend dieses Genkonstrukt, das ein mutantes Gen für die Untereinheit IL-12p40 enthält, dessen Asn-222 (Mensch) oder Asn-220 (Maus) mutiert ist, zur Verwendung als Immunverstärker.
Das Adjuvans kann als Adjuvans in einer Impfstoff-Zusammensetzung zur Prävention und Behandlung gegen verschiedene Krankheiten nützlich sein, zum Beispiel AIDS, Hepatitis C oder Hepatitis B, Krebs, Grippe, Tuberkulose und Malaria, die im Wesentlichen zelluläre Immunreaktionen für ihre Therapie erfordern.
In einem früheren Bericht war eine DNA-Impfung mit dem Plasmid, welches das Antigen HCV E2 kodiert (pTV2-gDsE2t), ausreichend, um die antigenspezifischen und zellvermittelten Immunreaktionen 3 Wochen nach der Immunisierung zu induzieren. Um zu bestimmen, ob das mutante mIL-12-Gen die effiziente antigenspezifische Immunreaktion in vivo im Vergleich zum Wildtyp-mIL-12-Gen beeinflussen kann, und um zu überprüfen, ob die Wirkung über eine lange Zeit aufrechterhalten werden kann, wurden Mäuse mit dem DNA-Impfstoff-Vektor der vorliegenden Erfindung immunisiert und aufgefrischt und die Produktion von HCV-E2-spezifischem Antigen wurde durch ELISA analysiert.
Als Ergebnis induzierte der HCV E2 DNA-Impfstoff signifikant höhere systemische Spiegel an HCV-E2-spezifischem Gesamt-IgG, IgG1 und IgG2 als negative Kontrollwerte, und eine Koinjektion mit dem Gen mIL-12mut oder dem Gen mIL-12wt zeigte ähnliche Gesamt-IgG-Spiegel im Vergleich zum HCV E2 DNA-Impfstoff allein. Unter den mit HCV E2-DNA injizierten Gruppen war der IgG1-Spiegel jedoch ähnlich. Im Gegensatz dazu erhöhte sich der IgG2a-Spiegel gegen HCV E2 in der mIL-12wt-Gruppe leicht und erhöhte sich in der mIL-12mut-Gruppe im Vergleich zur Gruppe, die nur mit HCV E2 DNA immunisiert war, signifikant. Zusätzlich war das Verhältnis von IgG2a/IgG1, das im Allgemeinen als indirekter Indikator der Th1-Immunität akzeptiert wird, in der mIL-12mut-Gruppe am höchsten, die ein ähnliches Muster des IgG2-Spiegels zeigte (5a, 5b, 5c und 5d). Diese Daten stellen dar, dass das Gen mIL-12mut den Wechsel der IgG-Unterklassen von IgG1 zu IgG2a bei der humoralen Immunreaktion im Vergleich zu mIL-12wt oder der Gruppe mit nur HCV E2 signifikant beeinflusste, was nahe legt, dass IL-12mut eine Immunreaktion des Th1-Typs induzieren kann. Und diese Wirkungen hielten über 0, 3, 6, 10 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung an.
Um die Wirkung des Gens mIL-12mut auf die Th1-Immunreaktion zu untersuchen, bei der es sich um einen der Parameter handelt, die verwendet werden, um die Stärke einer zellvermittelten Immunreaktion auszuwerten, wurde die IFN-γ-Expression von Milzzellen analysiert.
Als Ergebnis zeigte die mit HCV E2-DNA immunisierte Gruppe ohne ein Zytokin-Gen einen erhöhten Spiegel von IFN-γ proportional zur Konzentration des Proteins hghE2t, während die mit Schein-Plasmid immunisierte Gruppe das nicht tat. Wie erwartet, war der Spiegel der IFN-γ-Induktion bei der mIL-12wt-Gruppe stärker erhöht als in der Gruppe mit nur HCV E2 und die mIL-12mut-Gruppe zeigte eine 2-3-Mal höhere IFN-γ-Produktion als die mIL-12wt-Gruppe (6a, 6b und 6c), was nahe legt, dass mIL-12p70 die antigenspezifische Th1-Immunreaktion erhöht und mIL-12p40 die Induktion einer Th1-Immunreaktion durch IL-12p70 in vivo hemmt.
Wie vorstehend angemerkt, trug das Gen mIL-12mut zur Langzeit-Th1-Immunreaktion bei einer HCV E2-DNA-Immunisierung bei. Um zu bestimmen, ob die Induktion der Langzeit-Th1-Immunreaktion durch die Expression des Gens mIL-12mut mit der CTL-Immunität, der wichtigsten zellvermittelten Immunreaktion, korreliert, und falls ja, um herauszufinden, ob das Gen mIL-12mut die Aufrechterhaltung der CTL-Aktivität in einem DNA-Immunisierungsmodell beeinflussen kann, führten die Erfinder den CTL-Assay mit Milzzellen DNA-immunisierter Mäuse verschiedene Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung durch.
Als Ergebnis zeigten alle Gruppen außer der mit Schein-Plasmid immunisierten Gruppe zwei Wochen nach der Auffrischung eine sehr starke antigenspezifische CTL-Aktivität. Es gab jedoch nur einen geringen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen mit nur HCV E2, mIL-12wt und mIL-12mut. Bei der mit mIL-12wt koimmunisierten Gruppe war die CTL-Reaktion im Gesamtzeitraum stärker erhöht als bei der Gruppe mit nur HCV E2, was anzeigt, dass das Gen mIL-12 eine Rolle bei der verstärkten CTL-Erzeugung spielte. Interessanterweise war der Unterschied der CTL-Aktivität zwischen der mIL-12mut-Gruppe und den anderen beiden Gruppen, der Gruppe mit nur HCV E2 und mIL-12wt, größer und ausgedehnter, wenn die Zeit nach der Auffrischungsimmunisierung länger ist. Besonders zum Zeitpunkt 10 Wochen war die CTL-Reaktion bei den Gruppen mit nur HCV E2 und mIL-12wt sehr niedrig, was nahe legt, dass die Häufigkeit antigenspezifischer CTL nach einem langen Zeitraum signifikant abnahm, während die mIL-12mut-Gruppe eine 5- bis 10-mal höhere CTL-Aktivität als die anderen beiden Gruppen zeigte, wobei die antigenspezifische CTL-Reaktion aufrechterhalten wurde (7). Wenn als Kontrolle die CT26-neo-Zelle als Zielzelle verwendet wurde, wurde bei allen Gruppen keine Lyse beobachtet, was nahe legt, dass die in diesem Experiment beobachtete CTL-Aktivität für HCV E2 spezifisch ist.
Und die Erfinder maßen die Häufigkeit HCV-E2-spezifischer CD8+-Zellen in vivo, um die in der Induktion und Aufrechterhaltung antigenspezifischer CD8+-T-Zellen, die durch mIL-12 stimuliert wurden, bestehende Wirkung zu bestätigen. Zwei Arten von Immunassayverfahren wurden verwendet. Bei der ersten handelt es sich um das Zählen der Anzahl antigenspezifischer IFN-γ-produzierender Zellen. Um zu untersuchen, ob die Verstärkung der CTL-Aktivität von der Sekretion einer antigenspezifischer CD8+-T-Zelle her stammt, wurden CD8+-Zellen isoliert und mit PE-konjugiertem anti-Maus-IFN-γ-Antikörper oder einem PE-konjugierten, dem Isotyp angepassten Kontrollantikörper gefärbt. Gefärbte Zellen wurden durch FACSCalibur Durchflusszytometrie (Becton Dickinson) analysiert, und dann wurde die Induktion von IFN-γ beobachtet. Als Ergebnis hatten Mäuse, die mit dem Gen mIL-12mut koimmunisiert worden waren, 0, 3, 6, 10 oder 14 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung eine 3- bis 7-fache Verstärkung der Häufigkeit IFN-γ-produzierender CD8+-Zellen im Vergleich zu den Gruppen mit nur HCV E2 und mIL-12wt, was eine Korrelation mit dem Ergebnis der CTL-Reaktion zeigte. Im Gegensatz dazu gab es bei dem Kontrollexperiment mit angepasstem Isotyp keinen Unterschied unter allen Gruppen. Ähnlich zu dem Ergebnis des CTL-Assays war der Unterschied der Häufigkeit IFN-γ-produzierender CD8+-T-Zellen unter den Immunisierungsgruppen 2–3 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung nicht ausgedehnt. Diese Daten demonstrieren, dass die Expression des Gens mIL-12mut die Häufigkeit IFN-γ-produzierender CD8+-T-Zellen nach einer DNA-Immunisierung für eine lange Zeit aufrechterhielt.
Um die Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen zu untersuchen, wurde die Häufigkeit HCV-E2-spezifischer CD8+-T-Zellen durch das andere Assayverfahren, den limitierenden Verdünnungsassay (LDA) gemessen. Milzzellen von auffrischungsimmunisierten Mäusen wurden mit verschiedenen Konzentrationen verdünnt und mit CT-26-Zellen, die E2 exprimierten, kultiviert. Und dann wurde die CTL-Aktivität antigenspezifischer, stimulierter CD8+-T-Zellen gemessen. Das Ergebnis des limitierenden Verdünnungsassays war dem des intrazellulären Färbeassays ähnlich. Es wurde nämlich die höchste Frequenz antigenspezifischer CD8+-T-Zellen in der Gruppe mIL-12mut sogar im frühen Stadium der Immunisierung beobachtet und diese Häufigkeit blieb über 14 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung erhalten (TABELLE 2).
Die Häufigkeit HCV-E2-spezifischer CD8+-T-Zellen ohne Verstärkungsimmunisierung wurde auch der Zeit nach beobachtet. Die Gesamthäufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen war leicht erniedrigt, aber die höchste Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen wurde in der mIL-12mut-Gruppe beobachtet (TABELLE 2).
In dieser Hinsicht könnte nahe gelegt werden, dass es sich bei der Rolle von IL-12p70 selbst bei der zellvermittelten Immunreaktion in vivo darum handelt, die Aktivierung von Th1 und CTL von Anfang an zu induzieren und sie über eine lange Zeit aufrechtzuerhalten, während IL-12p40 IL-12p70 als Antagonist in vivo hemmt.
Um die durch das Gen mIL-12mut induzierte Th1- und CTL-Immunität in vivo zu bestätigen und um die Korrelation der schützenden Immunität mit der Th1- und CTL-Immunreaktion zu untersuchen, wurden CT26-hghE2t-Tumorzellen, die hghE2t exprimierten, 12 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung in die Gruppen immunisierter Mäuse injiziert. 2 Wochen nach der Injektion wurden die relativen Spiegel von antigenspezifischem IgG, IgG1, IgG2 und das Verhältnis von IgG2a/IgG1 bestimmt (8a und 8b). Als Ergebnis wurde der höchste Spiegel des IgG2a/IgG1-Verhältnisses in der Gruppe mIL-12mut beobachtet, was nahe legt, dass sogar bei einer Tumorinjektion eine Th1-Immunreaktion durch mIL-12mut induziert werden kann.
Die Tumorgröße wurde 30 Tage lang gemessen. Insbesondere wurde das mittlere lokale Tumorwachstum alle drei Tage durch Messen des Volumens und Durchmessers des Tumors mit Tastzirkeln bestimmt. Auch wurden die Überlebensraten dieser Mäuse durch etwa 70 Tage langes Beobachten bestimmt. Die mit mIL-12mut immunisierte Mäusegruppe induzierte eine starke Th1-Immunreaktion. Die Gruppe der Immunisierung mit mIL-12wt zeigte im Gegensatz zur Gruppe der Immunisierung mit nur pTV2-gDsE2t ein verzögertes Tumorwachstum (8c), während die Gruppe der Immunisierung mit mIL-12mut ein signifikant verzögertes Tumorwachstum zeigte. In der Kontrollgruppe hatten die meisten Mäuse einen Tumor und starben innerhalb von 50 Tagen, aber 90% der Mäuse in der Gruppe von mIL-12mut konnten nach 70 Tagen überleben (8d). Also legen diese Daten nahe, dass die durch das mIL-12mut-Gen der vorliegenden Erfindung induzierten HCV-E2-spezifischen Th1- und CTL-Reaktionen einen in-vivo-Schutz gegen die Herausforderung von modifizierten Tumorzellen, die ein spezifisches Antigen exprimieren, verleihen.
Die Erfinder verifizierten, dass eine menschliche oder Maus-Untereinheit IL-12p40, die ein mutantes Asn-222 (Mensch) oder Asn-220 (Maus) enthält und die zur Sekretion von IL-12p40 unentbehrlich ist, für die DNA-Impfstoff-Immunisierung und Gentherapie als Adjuvans sehr nützlich ist. Also stellt die vorliegende Erfindung ein Adjuvans bereit, das ein mutantes menschliches oder Maus-Gen für IL-12p40 als wirksamen Bestandteil zur DNA-Immunisierung und Gentherapie enthält und das eine antigenspezifische Immunreaktion zur Prävention und Behandlung gegen verschiedene Krankheiten induzieren kann.
Dieses Adjuvans kann, falls es mit dem DNA-Impfstoff verwendet wird, durch Erhöhen der Sekretion von IFN-γ aus CD8+- oder Helfer-T-Zellen und der Hydrolyseaktivität zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) eine Immunreaktion induzieren.
BEISPIELE
Praktische und derzeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden veranschaulicht, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird.
Beispiel 1: Konstruktion von Expressionsvektoren für menschliches IL-12
<1-1> Konstruktion von Expressionsvektoren für menschliches IL-12
Die cDNAs der menschlichen Untereinheiten p35 (820 bp) und p40 (1050 bp) wurden kloniert und unter Verwendung einer reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR, PCR System 2400, Perkin Elmer) amplifiziert. Jede amplifizierte cDNA wurde in die Sma I-Region des universellen Vektors pSK (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) subkloniert und dann wurden pSK-hp35 und pSK-hp40 konstruiert.
Um einen bicistronischen Vektor zu erzeugen, der die Gene hp35 und hp40 kodiert, wurde der Vektor pSK-interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) konstruiert. Das durch RT-PCR erhaltene IRES-Gen des Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) wurde zwischen die Sma I und Pst I Stellen des Plamids pSK subkloniert. Der Vektor pSK-IRES wurde mit EcoR V geschnitten und das zugefügte Ende eines p40-DNA-Fragmentes, das durch Behandeln von pSK-hp40 mit Xba I und BamH I erhalten wurde, wurde diesem unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase hinzugefügt, dann wurde pSK-hp40/IRES hergestellt. Und dann wurde das Plasmid pSK-hp40/IRES/hp35, bei dem die Gene p40, IRES, p35 in einer Reihe angeordnet sind, durch die Insertion eines p35-Fragments aus mit Nco I und Sac I behandeltem pSK-hp35 in pSK-hp40/IRES konstruiert.
pSK-hp35/IRES/hp40 wurde auch konstruiert. Der Vektor pSK-IRES wurde mit EcoR V geschnitten, und ein hp35-DNA-Fragment, erhalten aus mit Nco I und Not I behandeltem pSK-hp40/IRES/hp35, wurde diesem hinzugefügt. Das Plasmid pSK-hp35/IRES/hp40 wurde durch Zugeben eines hp40-Fragmentes, erhalten durch Schneiden von pSK-hp40 mit Nco I und BamH I, fertig gestellt. Die Gene hp40/IRES/hp35 und hp35/IRES/hp40 wurden in die Spe I/Not I- und Xho I/Not I-Stellen des Vektors pGX0 kloniert, um die Expressionsvektoren pGX0-hp40/IRES/hp35 und pGX0-hp35/IRES/hp40 zu erzeugen, die aktives IL-12p70 in Säugerzellen exprimieren können. Der Vektor pGX0 wurde durch Einfügen eines Antikanamycingens in den Vektor pTV2 konstruiert (Song, M. K. et al., J. Virol., 74: 2920–2925, 2000).
<1-2> Konstruktion eines Expressionsvektors für die Untereinheit p40
Um einen Expressionsvektor für die Untereinheit p40 zu erzeugen, wurde der Vektor pCIN-hp40/IRES/hp35 mit Sac II und Not I geschnitten (um das die Untereinheit p35 kodierende Gen zu eliminieren) und durch T4 DNA Polymerase mit sich selbst ligiert, und dann pCIN-hp40 benannt.
<1-3> Konstruktion eines Expressionsvektors für die Untereinheit p35
Um einen Expressionsvektor für die Untereinheit p35 zu erzeugen, wurde ein p35 DNA-Fragment aus dem Vektor pCIN-hp40/IRES/hp35 durch Schneiden und Ligieren mit Nco I und T4 DNA Polymerase erhalten. Dieses p35 DNA-Fragment wurde in die Restriktionsenzymstellen Xho I und Not I des Vektors pCI-neo eingefügt und dann pCIN-hp35 benannt.
Beispiel 2: Konstruktion von Expressionsvektoren für IL-12 der Maus
<2-1> Konstruktion von Expressionsvektoren für menschliches IL-12
Um einen bicistronischen Vektor zu erzeugen, der die Gene p35 und p40 der Maus kodiert, wurde der Vektor pSK-IRES/mp40 durch Einfügen eines aus einem PCR-Produkt für IL-12p40 der Maus (Schoenhaunt, D. S. et al., J. Immunol., 148: 3433–3440, 1999) erhaltenen p40 DNA-Fragments, das mit Nco I und BamH I behandelt wurde, in den gespaltenen Vektor pSK-IRES, der die IRES von EMCV enthält, konstruiert. Und das Plasmid pSK-mp35/IRES/mp40 wurde durch Einfügen eines Maus-p35-Fragments in pSK-IRES/mp40 unter Verwendung von BamH 1 und T4 DNA Polymerase konstruiert. Schließlich wurde der Expressionsvektor pCIN-mp35/IRES/mp40, der aktives IL-12p70 in Säugerzellen exprimieren kann, durch Einfügen des Gens mp35/IRES/mp40 in die Xho I- und Not I-Stellen des Vektors pCI-neo (Promega) erzeugt.
<2-2> Konstruktion eines Expressionsvektors für die Untereinheit p40
Um einen Expressionsvektor für die Wildtyp-Untereinheit p40 der Maus zu erzeugen, wurde ein p40 DNA-Fragment aus dem mit Nco I und Sac I behandelten Vektor pSK-mp35/IRES/mp40 erhalten. pGEX-KG-mp40 wurde durch Einfügen dieses p40 DNA-Fragments in den mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelten Vektor pGEX-KG (Clontech) erzeugt. pGEX-KG-mp40 wurde mit EcoR I und Not I behandelt und in die EcoR I- und Not I-Stellen des Vektors pCI-neo eingefügt. So wurde der Expressionsvektor pCIN-mp40 erzeugt.
<2-3> Konstruktion eines Expressionsvektors für die Untereinheit p35
Um einen Expressionsvektor für die Wildtyp-Untereinheit p35 der Maus zu erzeugen, wurde ein p35 DNA-Fragment aus dem mit Xhol und EcoRI behandelten Vektor pSK-mp35/IRES/mp40 erhalten. Der Expressionsvektor pCIN-mp35 wurde durch Einfügen dieses DNA-Fragments in die Xhol- und EcoRI-Stellen des mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelten Vektors pCI-neo konstruiert.
Beispiel 3: Konstruktion von IL-12p40 und IL-12p70, die eine teilweise mutierte Glykosylierung haben
Sieben Asn-Kodons, von denen erwartet wird, dass sie als N-Glykosylierungsstellen der Untereinheiten hp35 und hp40 verwendet werden, wurden durch ortsspezifische Mutagenese durch nicht verwandte Kodons ersetzt.
Zur Konstruktion von für Glutamin mutanten Genen für mutmaßliche N-Glykosylierungsstellen von hp40 und hp35 wurde Aminosäuresubstitutionen unter Verwendung von PCR gemäß dem Verfahren von Haraguchi et al. (Haraguchi, et al., J. Immunol., 163: 2092–2098, 1999) durchgeführt. Die Primer für die Mutagenese wurden durch Nukleotidsynthese verwendet, wie zum Beispiel T7, dargestellt durch die SEQ. ID NO. 6, T3, dargestellt durch die SEQ. ID NO. 7, hp40-N125Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 8, hp40-N125Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 9, hp40-N135Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 10, hp40-N135Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 11, hp40-N222Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 12, hp40-N222Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 13, hp40-N303Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 14, hp40-N303Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 15, hp40-N127Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 16, hp40-N127Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 17, hp40-N141Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 18, hp40-N141Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 19, hp40-N251Q (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 20 und hp40-N251Q (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 21. (S) und (AS) bedeuten Sensebeziehungsweise Antisense-Primer.
Um einzelne für Glutamin mutante Gene von hp40 und hp35 zu konstruieren, wurden der Primer T7 und alle Sense-Primer unter Verwendung von pCIN-mp40, das aus Beispiel <2-2> produziert war, oder pCIN-mp35, das aus Beispiel <2-3> produziert war, als Matrize für PCR verwendet. In ähnlicher Weise wurden der Primer T3 und jeder Antisense-Primer für PCR verwendet. Zwei PCR-Fragmente, die sich eine gemeinsame Stelle, die den Mutationspunkt enthält, teilen, wurden erzeugt. Die zweite PCR wurde mit einem Gemisch dieser Produkte als Matrizen und den flankierenden Primern durchgeführt, was zur Erzeugung eines Fusionsproduktes führte. Dieses Produkt wurde in das Plasmid pCI-neo eingefügt. In ähnlicher Weise wurden doppelt und dreifach für Glutamin mutante Gene unter Verwendung einzeln oder doppelt für Glutamin mutanter Gene als PCR-Matrizen konstruiert. Mutante Gene wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Zur Konstruktion eines IL-12p70-Gens der Maus, das einen N-Glykosylierungsfehler an Asn-220 von mp40 enthält, wurde der Bereich des mp40-Gens im Plasmid pCIN-mp35/IRES/mp40, das aus Beispiel <2-1> hergestellt wurde, durch mp40-N222L ersetzt. In dem Mutagenese-Experiment zur Konstruktion von pCIN-mp40-N222L wurden mp40-N220L (S), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 22 und mp40-N220L (AS), dargestellt durch die SEQ. ID NO. 23, die eine Sac I-Stelle enthalten, als Primer für eine PCR verwendet. Amplifizierte mutante Gene wurden durch Restriktionsenzymbehandlung auf spezifische Erkennungsstellen, die nach der Mutagenese hergestellt wurden, und DNA-Sequenzanalyse verifiziert.
2 zeigt die Aminosäurezusammensetzung der normalen und mutanten Gene für die menschliche Untereinheit IL-12p40 oder IL-12p35 der vorliegenden Erfindung. Mutmaßliche N-Glykosylierungsstellen werden durch eine Y-Form mit der Nummer der Aminosäure angezeigt und die in jedem mutanten Gen substituierte Aminosäure wird in einem Quadrat demonstriert.
Beispiel 4: Die Wirkung der N-Glvkosylierung bei Asn-222 des menschlichen IL-12p40
COS-7 (ATCC) Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, GIBCO-BRL), das 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielt, kultiviert. Die Transfektion in COS-7-Zellen wurde durch Elektroporation ausgeführt. Die Suspension von ungefähr 5 × 10⁶ Zellen in Kulturmedium wurde bei 250 V, 960 μF in Anwesenheit von 20 μg Probe-DNA zusätzlich zu 2 μg pNEB-SEAP (pNEB-sezernierte alkalische Phosphatase, New England Biolabs) pulsiert, das sezernierte alkalische Phosphatase exprimiert und als interne Kontrolle dient (Elektroporator und 0,4 Elektroporationscuvetten von Bio-Lad).
24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch 1,5 ml serumfreies CHO-SFM II Medium (GIBCO-BRL) ersetzt. 1,5 μg/ml Tunicamycin wurde in manchen Experimenten zugegeben. Nach einer Inkubation für weitere 24 Stunden wurden die Überstände und Zellpellets durch Zentrifugation geerntet. Die Überstände wurden für den SEAP-Assay verwendet und die Zellpellets wurden in 200 μl Lyselösung (Promega) resuspendiert. Die Spiegel von IL-12p70 und IL12p40 sowohl in den Überständen als auch den Zell-Lysaten wurden durch ELISA (R & D System) gemessen. Zum Immunoblotting wurde mit den Überständen und Zell-Lysaten eine 10%ige oder 12%ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) ausgeführt. Die aufgetrennten Proteine des vorstehenden Experiments wurden auf eine Nylonmembran (Amersham) elektroübertragen. Die an die Membran absorbierten Proteine wurden unter Verwendung von Biotin-markiertem menschlichem IL-12-Antikörper (Amersham), mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertem Streptavidin (PharMingen) und einem ECL-Kit (Amersham) erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Spiegel der Expression von IL-12p70 oder IL-12p40 wurden durch ELISA gemessen und relativ zum Spiegel des Wildtyps, der willkürlich auf 100% gesetzt wird, dargestellt.
<TABELLE 1> Die Änderungen des Expressionsspiegels, der Sekretion von IL-12p40 und IL-12p70 und der Fähigkeit zur Induktion von IFN-γ.

a: Insgesamt 20 μg von jedem DNA-Konstrukt wurden zur Transfektion in COS-7-Zellen durch Elektroporation verwendet. Zur gleichzeitigen Transfektion von zwei DNA-Konstrukten wurden 10 μg von jedem DNA-Konstrukt verwendet.
b: Die Expressionsspiegel von menschlichem und Maus-IL-12p70 oder II-12p40 wurden durch ELISA gemessen und relativ zum Wildtyp dargestellt, der willkürlich auf 100% gesetzt wird.
c: Die gleiche Menge von p70 in jedem mutanten Überstand wurde beim IFN-γ-Induktionsassay verwendet. Die Spiegel des induzierten IFN-γ wurden durch ELISA gemessen und relativ zum Wildtypspiegel dargestellt, der willkürlich auf 100% gesetzt wird.
d: IL-12p40 zeigt die monomere und homodimere p40-Form von IL-12p40 an, aber nicht den p40-Teil von IL-12p70.
e: IL-12p70 zeigt das Heterodimer an, das aus IL-12p35 und IL-12p40 besteht.
f: Bei dem Plasmidgerüst, das für die unabhängige Expression von hIL-12p40, hIL-12p35 und ihrer Derivate verwendet wird, handelt es sich um pCIN-neo und es wird als Schein beschrieben.
g: <1 zeigt Werte unterhalb des nachweisbaren Bereichs des ELISA-Assays an.
h: Wenn die gleiche Menge von p70 in jedem angezeigten mutanten (hp40-N135Q oder hp40-N222Q) und Wildtypüberstand im IFN-γ-Induktionsassay verwendet wird, wurde das nicht ausreichende hp40 in jedem mutantem Überstand im Vergleich zum Wildtypüberstand mit hp40-Überstand rekonstituiert, das nach einer Transfektion mit nur hp40 erhalten wurde.
i: Zahlen in () bedeuten die jeweilige Menge (μg) an kotransfiziertem Plasmid, pCIN-hp40-N222Q und pCIN-hp35. Insgesamt 20 μg DNA wurden kotransfiziert und eine nicht ausreichende DNA-Menge wurde mit dem Plasmid pCI-neo ergänzt.
j: Bei dem Plasmidgerüst, das für die Koexpression von hIL-12p40 und hIL-12p35 oder ihrer Derivate verwendet wird, handelt es sich um pGX0 und es wird als Schein beschrieben.
k: Bei dem Plasmidgerüst, das für die Koexpression von mIL-12p40 und mIL-12p35 oder ihrer Derivate verwendet wird, handelt es sich um pTV2 und es wird als Schein beschrieben.

Wie in TABELLE 1 gesehen wird, hatte eine Mutation von Asn-141 von p35 und Asn-303 von p40 keine Wirkung auf die Sekretion von IL-12p70 oder IL-12p40. Aber die Sekretion von IL-12p40 in Asn-134- und Asn-222-Mutanten war gesenkt. Besonders die Asn-222-Mutante zeigte das gleiche Ergebnis, wenn ihre Aminosäure durch Leucin (Leu) oder Glutamin (GIn) ersetzt wurde, was anzeigt, dass der Verlust der N-Glykosylierung an Asn-222 sehr wichtig ist.
3a zeigt Immunoblotting-Ergebnisse von Zell-Lysaten, nachdem die Gene für Wildtyp- und mutantes menschliches IL-12p35 in COS-7-Zellen transfiziert wurden. Die Spalten 1 und 2 zeigen Ergebnisse von Zell-Lysaten, die mit pCI-neo beziehungsweise pCIN-hp35 transfiziert waren. Die Spalten 3, 4, 5 und 6 zeigen Ergebnisse von Zell-Lysaten, die mit Expressionsvektoren transfiziert waren, die mutante Gene, wie zum Beispiel pCIN-hp35-N127Q, pCIN-hp35-N141Q, pCIN-hp35-N251Q beziehungsweise pCIN-hp35-N127,251Q, enthielten. Bei der Bande von etwa 33,2 kDa in den Spalten 2 und 5 handelt es sich um das Protein der N-glykosylierten Untereinheit p35. Wenn die N-Glykosylierung durch Tunicamycin gehemmt wurde, wie in den Spalten 3 und 4 gezeigt wird, wurde eine Bande von 28 kDa gebildet. Deshalb sind die Aminosäuren Asn-127 und Asn-141 die N-Glykosylierungsstellen.
3b zeigt Immunoblotting-Ergebnisse von Zell-Lysaten, die von COS-7-Zellen erhalten wurden, die mit den Genen für Wildtyp- und mutantes menschliches IL-12p40 transfiziert wurden. Die Spalten 1 und 2 zeigen Ergebnisse von Zell-Lysaten, die mit pCI-neo beziehungsweise pCIN-hp40 transfiziert waren. Die Spalten 3, 4, 5 und 6 zeigen Ergebnisse von Zell-Lysaten, die mit Expressionsvektoren transfiziert waren, die mutante Gene wie zum Beispiel pCIN-hp40-N125Q, pCIN-hp40-N135Q, pCIN-hp40-N222Q beziehungsweise pCIN-hp40-N303Q enthielten. Die Spalten 7, 8 und 9 zeigen wieder Ergebnisse von Zell-Lysaten, die mit doppelt oder dreifach mutanten Genen transfiziert waren. Ein Ergebnis von mit pCIN-hp40 und Tunicamycin, einem antagonistischen Mittel gegen N-Glykosylierung, transfizierten Zell-Lysaten wird in Spalte 11 gezeigt.
In vielen Berichten sind 3–4 Banden mit 36–45 kDa in Immunoblotassays von IL-12p40 bekannt. In ähnlicher Weise werden Banden von 36, 37,5, 40 und 43,1 kDa in Immunoblotassays von Zell-Lysaten gezeigt, die mit Wildtyp-IL-12p40 und -IL12p35 transfiziert sind. In mit Tunicamycin behandelten Zell-Lysaten verblieb nur die Bande von 36 kDa, während die anderen drei Banden verschwunden waren (Spalte 11). Also handelt es sich bei dieser Bande um die Untereinheit p40, die nicht N-glykosyliert ist. Die aus der Asn-125- oder Asn-135-Mutation erhaltenen Banden waren fast die gleichen wie jene des Wildtyps (Spalte 3, 4). Bei Asn-222 und Asn-303 (Spalte 5, 6) waren die Banden verschoben, was anzeigt, dass die Aminosäuren von 135, 222 und 303-Asn die N-Glykosylierungsstellen sind.
3c zeigt Immunoblotting-Ergebnisse von Überständen, die von einer COS-7-Zellkultur erhalten wurden, die mit den Genen für Wildtyp- und mutantes menschliches IL-12p40 transfiziert waren. Die Erklärungen für jede Spalte sind die gleichen wie in 3b. Ähnlich zu den Ergebnissen der Zell-Lysate wurden 3–4 Banden mit 36–45 kDa hergestellt. Die aus der Asn-125- oder Asn-135-Mutation erhaltenen Banden waren fast die gleichen wie jene des Wildtyps (Spalte 3, 4). Bei Asn-222 und Asn-303 (Spalte 5, 6) waren die Banden verschoben. Besonders wurden die Mutanten Asn-135 und Asn-222 nicht in das Zellkulturmedium sezerniert, im Gegensatz zu den Ergebnissen der Zell-Lysate. Dieses Ergebnis ist mit dem durch ELISA erhaltenen Quantifizierungsergebnis konsistent.
Die Expressionsvektoren pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L und pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35, die das mutante Gen der vorliegenden Erfindung, bei dem Asn-222 durch Leu-222 ersetzt ist, enthalten, wurden am 29. Februar 2001 bei der Genbank des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology hinterlegt (Hinterlegungsnr.: KCTC 0969BP und KCTC 0970BP).
<4-1> Die Wirkung der N-Glykosylierung von hp35 auf die Synthese, Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70.
Die Wirkung der N-Glykosylierung von hp35 auf die Synthese, Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70 wurde sowohl mit Kulturüberständen als auch mit Lysaten von Zellen, die mit hIL-12-Expressionsvektoren transfiziert waren, die das Wildtyp-Gen hp35 oder dessen für N-Glykosylierung mutante Gene einschließen, durch ELISA analysiert.
Wie in TABELLE 1 gesehen wird, beeinflusste die Entfernung mutmaßlicher N-Glykosylierungsreste von hp35 außer Asn-127 die Synthese, Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70 nicht signifikant. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Deglykosylierung von Asn-127 die Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70 zu einem gewissen Grad senkte, da die Expressionsspiegel von hp35-N127Q und hp35-N127,141Q auf einem Western-Blot, bei dem die Transfektionseffizienz normalisiert war, denen anderer Mutanten ähnlich waren. Demgemäß zeigen diese Ergebnisse an, dass die N-Glykosylierung von hp35 an Asn-127, aber nicht an Asn-141, für die Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70 wichtig ist.
<4-2> Die Wirkung der N-Glykosylierung von hp40 auf die Synthese, Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70
Um die Wirkung der N-Glykosylierung von hp40 auf die Synthese, Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p70 zu bestimmen, wurden die Spiegel von hIL-12p70 und hIL-12p40, die sowohl in Kulturüberständen als auch in Lysaten von Zellen existierten, die mit hIL-12-Expressionsvektoren transfiziert waren, die das Wildtypgen hp40 oder dessen für N-Glykosylierung mutante Gene einschließen, durch ELISA analysiert.
Eine Mutation von Asn-135 oder Asn-222 hatte wenig Wirkung auf die Sekretion von hIL-12p70, wie in TABELLE 1 gesehen wird, weil die extrazellulären hIL-12p70-Spiegel dieser Mutanten denen des Wildtyp-hp40 ähnlich waren. Interessanterweise war die Sekretion von hIL-12p40 in den Asn-135- und Asn-222-Mutanten signifikant gesenkt, besonders die Asn-222 Mutante zeigte einen Sekretionsspiegel von weniger als etwa 9% im Vergleich zu der von Wildtyp-hp40, was anzeigt, dass eine N-Glykosylierung an Asn-222 für die Sekretion von hIL-12p40 allein, aber nicht des heterodimeren hIL-12, hIL-12p70, erforderlich ist. Auch Doppel- und Dreifach-Mutanten, die Asn-135 und/oder Asn-222 enthielten, zeigten den niedrigen Spiegel von hIL-12p40, aber nicht von hIL-12p70. Im Gegensatz dazu schienen die anderen Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-hp40 in Zell-Lysaten eine gleiche Menge von hIL-12p40 und hIL-12p70 zu produzieren. Die Mutationen von Asn-125 und Asn-303 verursachten keinen signifikanten Unterschied bei der Expression, Heterodimerisierung und Sekretion von hIL-12p40 und hIL-12p70.
Als Ganzes zeigen diese Daten an, dass die N-Glykosylierung von hp40 an Asn-222 für die Sekretion von IL-12p40 entscheidend, aber für die Heterodimerisierung und Sekretion von IL-12p70 nicht erforderlich ist, während die N-Glykosylierung von hp35 an Asn-127 für die Heterodimerisierung und Sekretion von IL-12p70 wichtig ist. Es ist auch mit dem Bericht konsistent, dass die N-Glykosylierung von hp35 eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Sekretion von IL-12p70 zu sein scheint (Carra, G. et al., J. Immunol., 164: 4752–4761, 2000).
<4-3> Die Wirkung der N-Glykosylierung von hIL-12 auf seine biologische Aktivität
Um die Wirkung der N-Glykosylierung von hIL-12 auf seine biologische Aktivität zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von Wildtyp-hIL-12 und seinen Derivaten mit einer Mutation an mutmaßlichen N-Glykosylierungsstellen zur Induktion von IFN-γ analysiert. Die Kulturüberstände, die eine gleiche Menge von Wildtyp-hIL-12p70 und seinen Mutanten, jeweils 100 ng/ml, enthielten, wurden mit menschlichen PBLs inkubiert. Der Spiegel des induzierten IFN-γ in jedem Kulturüberstand wurde durch ELISA bestimmt. Wie in TABELLE 1 gesehen wird, gab es wenig Unterschied zwischen dem Wildtyp und allen seinen Derivaten, was die IFN-γ-Induktion betrifft. An Asn-135 und/oder Asn-222 mutierte hp40-Derivate zeigten jedoch eine gewisse erhöhte IFN-γ-Induktion im Vergleich zum Wildtyp oder den anderen hp40-Mutanten. Es ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass der Spiegel von hIL-12p40, von dem bekannt war, dass es sich um einen Antagonisten von hIL-12p70 handelt, in den Kulturüberständen von Mutanten, die hp40-N135Q und/oder hp40-N222Q enthielten, verhältnismäßig sehr viel niedriger war als der der anderen Mutanten.
Beispiel 5: Rolle von IL-12p35 bei der Sekretion von IL-12p70, das eine mutierte Glykosylierung enthält
Um zu untersuchen, wie die Deglykosylierung von hp40 an Asn-222 die Sekretion von hIL-12p40, aber nicht die von hIL-12p70 senkt, kotransfizierten die Erfinder eine beschränkte Menge des hp40-N222Q exprimierenden Plasmids mit verschiedenen Mengen Wildtyp-hp35-DNA.
Menschliche periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-(Sigma) Dichtegradientenzentrifugation aus frischem Blut isoliert und in RPMI-1640 Medium (GIBCO-BRL) resuspendiert, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und Penicillin/Streptomycin (GIBCO-BRL) ergänzt war. Für den Assay der Induktion von menschlichem IFN-γ wurden menschliche PBM-Zellen (4 × 10⁵) 16 Stunden lang mit Kulturüberständen inkubiert, die 100 ng/ml menschliches IL-12p70 oder dessen mutante Derivate enthielten.
Für den Nachweis von Maus-IFN-γ wurden Milzen von 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen erhalten und 1 × 10⁵ Milzzellen wurden 24 Stunden lang mit Kulturüberständen inkubiert, die 100 ng/ml IL-12p70 der Maus oder dessen mutante Derivate enthielten. Die Mengen von induziertem menschlichem oder Maus-IFN-γ wurden durch einen ELISA-Kit für menschliches beziehungsweise Maus-IFN-γ (R&D Systems) geschätzt. Die Ergebnisse werden in TABELLE 1 angegeben. Bei den Zahlen in TABELLE 1 handelt es sich um die Menge von IFN-γ, die durch ELISA gemessen und relativ zum Wildtypspiegel, der willkürlich auf 100% gesetzt wird, dargestellt wird.
Im Allgemeinen war bekannt, dass die Untereinheit p35 nicht allein sezerniert wird und als eine Form von IL-12p70 in Verbindung mit der Untereinheit p40 sezerniert wird, während die Untereinheit p40 entweder in Form eines Monomers oder eines Homodimers sezerniert wird, was nahe legt, dass die Untereinheit p40 der Hauptfaktor bei der Sekretion von IL-12p70 ist. Wie in TABELLE 1 gezeigt wird, stieg der Sekretionsspiegel von hIL-12p70 sowohl im Falle von Wildtyp-hp40 als auch von hp40-N222Q proportional zur Menge transfizierter hp35-DNA. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die Untereinheit hp40 mit einem Sekretionsfehler in Form von IL-12p70 sezerniert wird, falls sie mit der Untereinheit hp35 in Verbindung steht, was nahe legt, dass die Untereinheit hp35 auch eine weitere Unterstützung zur Sekretion von hIL-12p70 ergibt. Kürzlich legt der Bericht, dass die konformative Änderung der Untereinheit hp40 beim Binden von hp35 passiert, die Möglichkeit für einen Beitrag der Untereinheit hp35 zur Sekretion von IL-12p70 nahe (Yoon, C. et al., EMBO J., 19: 3530–3534, 2000). Auf der Grundlage diese Berichts und der Daten der vorliegenden Erfindung ist verifiziert, dass hp40, das eine Deglykosylierung an Asn-222 enthält, in seiner eigenen Sekretion defektiv ist, aber wegen der konformativen Änderung des hp40-Bereichs und der nachfolgenden Freilegung oder Erzeugung von verdeckten beziehungsweise neuen Sekretionssignalen in Verbindung mit hp35 sezerniert werden kann.
Beispiel 6: Konstruktion eines HCV-E2-DNA-Impfstoffes und eines Expressionsvektors, der ein für Asn-220 mutantes Mausgen für IL-12p40 enthält
<6-1> Konstruktion von pCIN-mp40-N220L
Um die Möglichkeit der Verwendung des mutanten Gens hIL-12 der vorliegenden Erfindung bei der Gentherapie als DNA-Impfstoff zu überprüfen, wurde die zu Asn-222 des Gens hp40 homologe Sequenz des Gens IL-12p40 der Maus (mp40) durchsucht. Asn-220 von mp40 befand sich in einem zu dem von Asn-222 von hp40 sehr ähnlichen Zusammenhang, aber von dieser Aminosäure war bis jetzt nicht bekannt, dass sie N-glykosyliert war. Deshalb erzeugten die Erfinder das mutante mp40-Gen mp40-N220L, bei dem das Asn an 220 in der Aminosäuresequenz durch ortsspezifische Mutagenese durch Leu ersetzt wurde. Zur Mutagenese wurden SEQ. NO. 22 und SEQ. NO. 23 als Primer verwendet. Zur leichten Identifizierung eines mutanten Gens wurde eine Sac I Restriktionssstelle erzeugt. Die amplifizierten mutanten Gene wurden durch die Behandlung eines Restriktionsenzyms für eine spezifische Erkennungsstelle, die nach der Mutagenese produziert wurde, und durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert. Letztendlich wurde der das mutante Mausgen für IL-12p40 enthaltende Vektor pCIN-mp40-N220L, der in Tierzellen exprimiert werden kann, konstruiert.
<6-2> Konstruktion des Vektors pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L
Um einen Vektor zu erzeugen, der die Untereinheiten p35 und p40 der Maus kodiert und für die DNA-Immunisierung verwendet wird, wurde der Vektor pTV2, ein eukaryotischer Expressionsvektor, der als DNA-Impfstoff-Vektor in Kleintieren verwendet wird (Lee, et al., J. Virol., 72: 8430–8436, 1998; Cho, et al., Vaccine, 17: 1136–1144, 1999) mit Asp718 und Not I behandelt. Der Vektor pTV2-mp35/IRES/mp40 wurde durch Einfügen des Fragments mp35/IRES/mp40, das aus dem mit Restriktionsenzymen behandelten pSK-mp35/IRES/mp40 erhalten wurde, dort hinein konstruiert. Und der das für Asn-220 mutante Gen enthaltende Vektor pSK-mp35/IRES/mp40-N220L, der p35 exprimieren kann, wurde durch Einfügen des Fragments mp40-N220L in mit Nco I und Not 1 behandeltes pSK-mp35/IRES/mp40 erzeugt. Um das mp40-Fragment zu deletieren, wurde der Vektor pTV2-mp35/IRES/mp40 mit EcoR V und Not 1 behandelt, gefolgt von zugegebenem mp40-N220L. Als Ergebnis wurde pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L konstruiert.
Der Vektor pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L der vorliegenden Erfindung wurde am 29. Februar 2000 bei der Genbank des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology hinterlegt (Hinterlegungsnr.: KCTC 0745BP).
<6-3> Konstruktion des Vektors pTV2-HCV-E2
Der DNA-Impfstoff-Vektor pTV2-HCV-E2, der das Protein HVC E2 in eukaryotischen Zellen exprimieren kann, wurde konstruiert (Song M. K., et al., J. Virol., 74: 2920– 2925, 2000). Wie in 4 gesehen wird, besteht der DNA-Impfstoff-Vektor pTV2-HCV-E2 aus dem Replikationsursprung des Simian-Virus 40 (SV40 ori), dem Cytomegalovirus-(CMV-) Promotor, der dreiteiligen Leader-Sequenz (TPL) von Adenovirus, einer multiplen Klonierungssequenz (MCS), der SV40-Polyadenylierungssequenz (poly A) und dem Ampizillin-Resistenzgen (AmpR). Und auch das Gen HCV E2 wird in die MCS dieses Vektors kloniert. Der eine hydrophobe Aminosäurereste enthaltende Carboxyterminus (C-Terminus) des Gens E2, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurde entfernt, um die Proteinsekretion zu erleichtern. Und um die Proteinexpression und die Zellsekretion zu unterstützen, wurden der Aminoterminus (N-Terminus) und die Signalsequenz (S) des Glykoproteins D (gD) aus Herpesvirus (HSV) verknüpft.
<6-4> Sekretion von IL-12p40 und IL-12p70 gemäß der Mutation des Asn-220 von IL-12p40 der Maus
Die in TABELLE 1 aufgeführten Vektoren wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in <Beispiel 4> in COS-7-Zellen transfiziert. Die Kulturüberstände und Zell-Lysate wurden durch ELISA (PharMingen) analysiert. Expressionsspiegel von Wildtyp-IL-12p70 und -40 wurden in TABELLE 1 gezeigt. <1 bei pCI-neo bedeutet, dass Proteine durch ELISA nicht nachgewiesen wurden.
Wie in TABELLE 1 gesehen wird, zeigten mp40-N220L-Mutanten ähnliche Eigenschaften wie die Asn-222-Mutante von hp40 im Punkt der Sekretion von IL-12p40 und II-12p70 und dessen biologischer Aktivität.
Um das mutante Gen mp40-N222L auf das DNA-Impfstoff-Modell anzuwenden und um es mit dem Wildtyp-mp40-Gen im Hinblick auf die Induktion der Th1- und CTL-Immunreaktionen zu vergleichen, fügten die Erfinder die Gene mp35/IRES/mp40 (mIL- 12wt) oder mp35/IRES/mp40-N220L (mIL-12mut) in den DNA-Impfstoff-Vektor pTV2 ein und beobachteten ihre Eigenschaften in vitro. Als Ergebnis, wie in TABELLE 1 gesehen wird, zeigt das Gen mIL-12mut (mp40-N220L Mutante) im Vektor pTV2 auch ähnliche Eigenschaften wie die Asn-222-Mutante von hp40 im Punkt der Sekretion von IL-12p40 und II-12p70 und dessen biologischer Aktivität.
Beispiel 7: Wirkung von mutantem IL-12 auf eine antigenspezifische humorale Immunreaktion
In einem früheren Bericht war eine DNA-Impfung des das Antigen HCV-E2 kodierenden Plasmids (pTV2-gDsE2t) ausreichend, um antigenspezifische humorale und zellvermittelte Immunreaktionen 3 Wochen nach der Immunisierung zu induzieren (Song, M. K. et al., J. Virol., 74: 2920–2925, 2000). Um zu bestimmen, ob das Gen mIL-12mut im Vergleich zu dem Gen mIL-12wt die effiziente antigenspezifische Immunreaktion in vivo auch beeinflussen kann, wurden Mäuse anfänglich mit pTV2-mIL-12mut oder pTV2-ml12wt immunisiert und aufgefrischt, 4 Wochen später zusammen mit dem Plasmid pTV2-gDsE2.
Um die Induktion einer Immunreaktion durch einen DNA-Impfstoff mit einem die mutanten Gene der vorliegenden Erfindung enhaltenden Expressionsvektor zu überprüfen, wurden 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse mit verschiedenen pTV2- oder pTV2-gDsE2t-DNAs mit mutanten mIL-12- oder Wildtyp-mIL-12-DNAs immunisiert. Insbesondere wurden insgesamt 200 μg DNA, die in einem Endvolumen von 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung formuliert waren, in die Tibialis anterior Muskeln jeder Maus injiziert und pünktlich in einem Intervall von 4 Wochen mit einer identischen Dosis von DNA aufgefrischt. Die humoralen Immunreaktionen wurden 3 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung durch ELISA kontrolliert. Insbesondere wurden 100 ng hghE2t-Protein, bei dem es sich um ein Fusionsprotein aus menschlichem Wachstumshormon (hgh) und C-terminal verkürztem HCV E2 (HCV E2t) handelt, auf jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Dynex Technologies) beschichtet. Seren aus immunisierten Mäusen wurden zur Reaktion mit dem Protein hghE2t 1 : 100 verdünnt und zur Bestimmung der relativen Spiegel von HCV-E2t-spezifischem IgG und dessen Unterklassen, wie zum Beispiel IgG1 und IgG2a, eingeführt.
Wie in 5a, 5b, 5c und 5d gezeigt wird, induzierte der HCV E2 DNA-Impfstoff signifikant höhere systemische Spiegel von HCV-E2t-spezifischem Gesamt-IgG, IgG1 und IgG2a als negative Kontrollwerte, und eine Koinjektion mit dem Gen mIL-12mut oder dem Gen mIL-12wt zeigte ähnliche Gesamt-IgG-Spiegel im Vergleich zu HCV E2 DNA-Impfstoff alleine. Und der Spiegel von IgG1 war unter den mit HCV E2 DNA injizierten Gruppen ähnlich. Im Gegensatz dazu stieg der Spiegel von IgG2a gegen HCV E2 in der mIL-12wt-Gruppe leicht an und stieg in der mIL-12mut-Gruppe im Vergleich zur nur mit HCV E2 DNA immunisierten Gruppe signifikant an. Zusätzlich war das Verhältnis von IgG2a/IgG1, das im Allgemeinen als indirekter Indikator der Th1-Immunität akzeptiert wird, in der mIL-12mut-Gruppe am höchsten, die ein ähnliches Muster des IgG2-Spiegels zeigte. Diese Daten stellen dar, dass das Gen mIL-12mut den IgG-Unterklassenwechsel von IgG1 zu IgG2a bei der humoralen Immunreaktion im Vergleich zur Gruppe mit mIL-12wt oder nur HCV E2 signifikant beeinflusste, was nahe legt, dass IL-12mut eine Immunreaktion des Th1-Typs induzieren kann.
Beispiel 8: Zellvermittelte Immunreaktion immunisierter Mäuse
<8-1> Induktion einer antigenspezifischen Th1-Immunreaktion durch mutantes IL-12
Um die Wirkung des Gens mIL-12mut auf die Th1-Immunreaktion zu untersuchen, bei der es sich um einen der Parameter zum Auswerten der Stärke einer zellvermittelten Immunität handelt, wurde die IFN-γ-Expression von Milzzellen gemessen. 1 × 10⁵ Milzzellen, die 8 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung erhalten wurden, wurden zu Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden gegeben. Dann wurden 1 oder 5 μg aus CHO-Zellen gereinigtes Protein hgh-E2t zu jeder Vertiefung gegeben und die Zellen wurden in einem Inkubator mit 5% CO₂ 3 Tage lang inkubiert. Und dann wurden die Zellüberstände sichergestellt und zum Nachweis von IFN-γ-Spiegeln unter Verwendung eines ELISA-Kits (R&D Systems) verwendet. Es war bekannt, dass nach einer Stimulation mit einem spezifischen Antigen induziertes IFN-γ von antigenspezifischen CD4+-T-Zellen produziert wird und es handelt sich um den Indikator einer Th1-Immunreaktion.
Wie in 6 gezeigt wird, zeigte die mit HCV E2 DNA immunisierte Gruppe ohne ein Zytokingen proportional zur Konzentration des Proteins hghE2t einen erhöhten Spiegel von IFN-γ, während eine mit Schein-Plasmid immunisierte Gruppe das nicht tat. Wie erwartet war der Spiegel der IFN-γ-Induktion bei der mIL-12wt-Gruppe mehr verstärkt als in der Gruppe mit nur HCV E2, und die mIL-12mut-Gruppe zeigte eine bis zu 2-3-mal höhere Produktion von IFN-γ als die mIL-12wt-Gruppe, was nahe legt, dass mIL-12p70 die antigenspezifische Th1-Immunreaktion erhöht und dass mIL-12p40 die Induktion einer Th1-Immunreaktion durch II-12p70 in vivo hemmt.
<8-2> Langzeitverstärkung der antigenspezifischen CD8+-T-Zell-Funktion durch mutantes IL-12
Wie vorstehend angemerkt, trug das Gen mIL-12mut zur Langzeit-Th1-Immunreaktion bei einer HCV E2 DNA-Immunisierung bei. Um zu bestimmen, ob die durch die Expression des Gens mIL-12mut induzierte Langzeit-Th1-Immunreaktion mit der CTL-Immunität und der hauptsächlichen zellvermittelten Immunreaktion korreliert, und ob das Gen mIL-12mut deshalb die Aufrechterhaltung der CTL-Aktivität im DNA-Immunisierungsmodell beeinflussen kann, führten die Erfinder den CTL-Assay mit Milzzellen von DNA-immunisierten Mäusen verschiedene Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung durch. Milzzellen (2 × 10⁷) wurden in vitro bei 37 °C mit Mitomycin C-behandelten (25 μg/ml) CT26-hghE2t-Zellen (1 × 10⁶), die eine verkürzte Form des HCV Hüllproteins 2 (E2t) exprimieren, erneut stimuliert. Nach 5 Tagen Kultur in vitro wurden die Effektorzellen in einem herkömmlichen Zytotoxizitätsassay gegen unterschiedliche Zielzellen, wie zum Beispiel CT26-hghE2t oder CT26-neo getestet. Verschiedene Effektorzellzahlen wurden dreifach plattiert, um das erwünschte E/T-Verhältnis zu erreichen. ⁵¹Cr-markierte Zielzellen (5 × 10³) wurden zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden gegeben, und nach 6 Stunden langer Inkubation bei 37°C wurde der Überstand geerntet und mit einem γ-Zähler gezählt (Wallac, Turku, Finnland). Der Prozentsatz der spezifischen Lyse wurde wie in der folgenden mathematischen Formel 1 berechnet. Die minimale Lyse wurde durch Inkubieren der Zielzellen mit dem Kulturmedium alleine erhalten. Die maximale Lyse wurde erhalten, indem die Zielzellen 1% Nonidet-P40 ausgesetzt wurden.
<Mathematische Formel 1>
Prozentsatz der spezifischen Lyse = (Experimentelle Lyse-Minimale Lyse) x 100/(Maximale Lyse-Minimale Lyse)
Als Ergebnis, wie in 7 gezeigt wird, zeigten alle Gruppen außer der mit Schein-Plasmid immunisierten Gruppe 2 Wochen nach der Auffrischung eine sehr starke antigenspezifische CTL-Aktivität. Es gab jedoch wenig Unterschied unter den Gruppen mit nur HCV E2, mIL-12wt und mIL-12mut. Die CTL-Reaktion wurde im gesamten Zeitraum in der mit mIL-12wt koimmunisierten Gruppe mehr induziert als in der Gruppe mit nur HCV E2, was anzeigt, dass das Gen mIL-12 eine Rolle bei der verstärkten CTL-Erzeugung spielte. Interessanterweise wurde der Unterschied der CTL-Aktivität zwischen der mIL-12mut-Gruppe und den anderen beiden Gruppen, der Gruppe mit nur HCV E2 und der mit mIL-12wt, immer größer, während die Zeit nach der Auffrischungsimmunisie rung länger wurde. Besonders zum Zeitpunkt 10 Wochen war die CTL-Reaktion in den Gruppen mit nur HCV E2 und mit mIL-12wt sehr niedrig, was nahe legt, dass die Häufigkeit antigenspezifischer CTL nach einem langen Zeitraum signifikant abnahm, während die Gruppe mit mIL-12mut beim Aufrechterhalten der antigenspezifischen CTL-Reaktion eine 5- bis 10-mal höhere CTL-Aktivität als die anderen beiden Gruppen zeigte. Als Kontrolle, als die Zelle CT26-neo als Zielzelle verwendet wurde, wurde in allen Gruppen keine Lyse beobachtet, was nahe legt, dass die in diesem Experiment beobachtete CTL-Aktivität für HCV E2 spezifisch ist.
<8-3> FACSCalibur-Durchflusszytometrie-Analyse für die IFN-γ-Produktion von CD8+-Zellen immunisierter Mäuse
Um zu untersuchen, ob die Langzeitverstärkung der CTL-Aktivität auf die Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen zurückzuführen ist, und zur Bestimmung der Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Lymphozyten wurde das folgende Experiment durchgeführt. In der angegebenen Woche nach der Auffrischungsimmunisierung erhaltene Milzzellen (2 × 10⁷) wurden mit CT26-hghE2t-Zellen (1 × 10⁶) in Anwesenheit von 10 U/ml rekombinantem IL-12 (PharMingen) 40 Stunden lang stimuliert, und dann wurden 4 μl GolgiStop^tm (PharMingen) zugegeben und die Zellen wurden weitere 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur direkten Reinigung von CD8+-T-Zellen wurden die stimulierten Milzzellen mit anti-CD8-Mikrokugeln (Miltenyi Biotech, Inc) inkubiert und durch eine Säule des miniMACS Systems (Miltenyi Biotech, Inc) geschickt, und die verbleibenden CD8+-T-Zellen wurden isoliert. Um unspezifisches Färben zu blockieren wurden die Zellen mit Fc Block^TM (PharMingen) vorinkubiert und mit FITC-konjugiertem anti-Maus-CD8 gefärbt. Nach der Inkubation wurden die Zellsuspensionen fixiert und mit Cytofix/Cytoperm^TM (PharMingen) permeabilisiert, bevor PE-konjugierter anti-Maus IFN-γ mAB oder als Kontrolle PE-konjugierter, dem Isotyp angepasster mAb zugegeben wurde. Gefärbte Zellen wurden durch FACSCalibur-Durchflusszytometrie (Becton Dickinson) analysiert, und dann wurde die Induktion von IFN-γ beobachtet.
<TABELLE 2> Häufigkeitskinetik HCV-E2-spezifischer CD8+-T-Vorläuferzellen

a: Sechs bis 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden in einem Intervall von 4 Wochen mit verschiedenen Plasmiden der vorliegenden Erfindung immunisiert
b: Die Expression jeder Gruppe ist folgendermaßen. Gruppe I: pTV2, Gruppe II: pTV2-HCV-E2t + pTV2, Gruppe III: pTV2-HCV-E2t + pTV2-mIL-12wt, Gruppe IV: pTV2-HCV-E2t + pTV2-mIL12mut
c: 2 × 10⁷ von DNA-immunisierten Mäusen erhaltene Milzzellen wurden mit 1 × 10⁶ Mitomycin C-behandelten CT26-hghE2t-Zellen in vitro erneut stimuliert. Nach 48 Stunden in Kultur wurden CD8+-T-Zellen unter Verwendung von MACS isoliert. Nach Fixierung und Permeabilisierung wurden die Zellen mit anti-CD8- und anti-IFN-γ-Antikörper gefärbt. Lebende CD8+-T-Zellen wurden durch Aufzeichnen der Zellen mit FSC und CD8 ausgeblendet und dann wurde der Prozentsatz IFN-γ-produzierender CD8+-T-Zellen unter den lebenden CD8+-T-Zellen durch Aufzeichnen lebender CD8+-T-Zellen mit CD8 und IFN-γ berechnet. Die Daten werden als Durchschnittswert dargestellt, der durch 2 Mäuse pro Gruppe in zwei unabhängigen Experimenten erhalten wurde.
d: Von DNA-immunisierten Mäusen erhaltene Milzzellen wurden verdünnt, mit Mitomycin C-behandelten CT26-hghE2t-Zellen gemischt und 5 Tage lang inkubiert. Die Spezifität der sich ergebenden CTL wurde durch spezifische Lyse von ⁵¹Cr-markierten CT26-hghE2t-Zellen bestimmt. Vertiefungen wurden als positiv für CTL-Erkennung gezählt, wenn der Spiegel der spezifischen Lyse den von naiven Mäusen erhaltenen mittleren Lysewert plus 3 SD überstieg. Die Häufigkeit von Vorläufer-CTL pro 1 × 10⁷ Milzzellen wurde durch eine Regressionsanalyse der Anzahl negativer Vertiefungen bei jeder Verdünnung von Responderzellen berechnet. Die Daten werden als Durchschnittswert dargestellt, der mit 2 Mäusen pro Gruppe in zwei unabhängigen Experimenten erhalten wurde.

Wie in TABELLE 2 gezeigt wird, wiesen Mäuse, die mit dem Gen mIL-12mut koimmunisiert wurden, 0, 3, 6, 10 oder 14 Wochen nach der Auffrischungsimpfung eine 3- bis 7-fache Verstärkung bei der Häufigkeit IFN-γ-produzierender CD8+-Zellen im Vergleich zu den Gruppen mit nur HCV E2 und mit mIL-12wt auf, was mit dem Ergebnis bei der CTL-Reaktion korreliert. Im Gegensatz dazu gab es im Kontrollexperiment mit angepasstem Isotyp keinen Unterschied unter allen Gruppen. Wie das Ergebnis des CTL-Assays war die Häufigkeit IFN-γ produzierender CD8+-T-Zellen unter den Immunisierungsgruppen 2–3 Wochen nach der Auffrischungsimpfung nicht sehr unterschiedlich. Diese Daten demonstrieren, dass die Expression des Gens mIL-12mut die Häufigkeit IFN-γ-produzierender CD8+-T-Zellen nach einer DNA-Immunisierung über einen langen Zeitraum aufrechterhielt. In dieser Hinsicht könnte nahe gelegt werden, dass die in-vivo-Rolle von IL-12p70 selbst bei der zellvermittelten Immunreaktion in der Langzeitaufrechterhaltung von Th1 und CTL besteht, während IL-12p40 IL-12p70 als Antagonist in vivo hemmt.
<8-4> Die Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen von Milzzellen immunisierter Mäuse
Um die Häufigkeit anderer antigenspezifischer CD8+-T-Zellen zu untersuchen, wurde ein limitierender Verdünnungsassay (LDA) ausgeführt. In diesem Experiment wurde die Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen unter Verwendung der Lysefähigkeit HCV-E2-spezifischer CD8+-T-Zellen gemessen (Kuzushima, K. et al., Blood, 94: 3094–3100, 1999). Milzzellen von auffrischungsimmunisierten Mäusen wurden mit verschiedenen Konzentrationen verdünnt und in Vertiefungen von Platten mit 96 Vertieungen und U-förmigem Boden auf 20 Vertiefungen/Verdünnung gegeben. E2 exprimierende CT26-Zellen wurden mit Mitomycin (500 μg/ml) behandelt, um die Zellteilung zu blockieren, und 5 Tage lang mit verdünnten Milzzellen aktiviert. Mit ⁵¹Cr markierte Zielzellen (5 × 10³) wurden zu jeder Vertiefung der vorstehenden Platte mit Vertiefungen gegeben und nach 6 Stunden bei 37°C wurde der Überstand geerntet und mit einem γ-Zähler (Wallac, Turku, Finnland) gezählt. Die CTL-Häufigkeit wurde berechnet und als positiv betrachtet, wenn der Spiegel der spezifischen Lyse höher als der des mittleren Lysewertes + 3 × Standardabweichung war (Kuzushima, K. et al., Blood, 94: 3094–3100, 1999).
Das Ergebnis des limitierenden Verdünnungsassays war dem Ergebnis des intrazellulären Färbeassays ähnlich. Es wurde nämlich sogar in einem frühen Stadium der Immunisierung die höchste Häufigkeit antigenspezifischer CD8+-T-Zellen in der Gruppe mit mIL-12 beobachtet und diese Häufigkeit war über 14 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung erhalten geblieben (TABELLE 2).
<8-5> Verstärkung einer schützenden Immunreaktion durch mutantes IL-12
Um die durch das Gen mIL-12mut induzierte Th1- und CTL-Immunität in vivo zu bestätigen und um die Korrelation einer schützenden Immunität mit der Th1- und CTL-Immunität zu untersuchen, wurden den Gruppen immunisierter Mäuse 12 Wochen nach der Auffrischungsimmunisierung CT26-hghE2t-Zellen, die hghE2t exprimierten, injiziert. 2 Wochen später wurden die relativen Spiegel von antigenspezifischem IgG, IgG1, IgG2 und das Verhältnis von IgG2a/IgG1 bestimmt und die Tumorgröße wurde 30 Tage lang gemessen. Insbesondere wurde das mittlere lokale Tumorwachstum alte drei Tage durch Messen des Volumens und Durchmessers von Tumoren mit Tastzirkeln bestimmt. Auch die Überlebensraten dieser Mäuse wurden durch etwa 70 Tage langes Beobachten bestimmt.
Wie in 8a, 8b und 8c gezeigt wird, induzierte die Gruppe der mit mIL-12mut immunisierten Mäuse eine starke Th1-Immunreaktion. Die Gruppe der mIL-12wt-Immunisierung zeigte im Gegensatz zur Gruppe der Immunisierung mit nur pTV2-gDsE2t ein verzögertes Tumorwachstum, während die Gruppe der mIL-12mut-Immunisierung ein signifikant verzögertes Tumorwachstum zeigte. In der Kontrollgruppe hatten die meisten Mäuse einen Tumor und starben innerhalb von 50 Tagen, aber 90 % der Mäuse in der Gruppe von mIL-12mut konnten nach 70 Tagen überleben. Also legen diese Daten nahe, dass HCV-E2-spezifische, durch das Gen mIL-12mut induzierte Th1- und CTL-Reaktionen in vivo einen Schutz gegen die Herausforderung modifizierter Tumorzellen verleihen, die ein spezifisches Antigen exprimieren. Obwohl es nicht leicht ist, relative Wirkungen von Th1- und CTL-Reaktionen auf den Tumorschutz in vivo auszuwerten, ist es wahrscheinlich, das E2-spezifische CD8+-CTLs und Th1-Zellen die CT26-hghE2t-Zellen direkt töten beziehungsweise die CTLs unterstützen könnten, wie im Th1- und CTL-Assay in vitro gezeigt wird. Auch könnten IgG2a-Antikörper, die stark an FcγR auf Makrophagen und natürlichen Killerzellen binden, eine antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität vermitteln.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie hierin zuvor beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung das mutante Gen für die Untereinheit IL-12p40, das Interleukin 12 (IL-12) von menschlichem oder Maus-Ursprung mit hoher Aktivität produzieren kann, und den Expressionsvektor, der das vorstehende mutante Gen einschließt, sowie ihre Verwendung als Adjuvans für einen DNA-Impfstoff. Insbesondere betrifft sie ein mutantes Gen für IL-12p40, das durch Herstellen einer Mutation an der Aminosäure Asn-222 (Mensch) oder Asn-220 (Maus) von IL-12p40, das als kompetitiver Inhibitor der aktiven Form von IL-12, IL-12p70, wirkt, die Sekretion von IL-12p40 hemmt aber aktives IL-12p70 normal sezerniert. Das mutante IL-12p40-Gen der vorliegenden Erfindung kann eine optimale zellvermittelte Immunreaktion in einem frühen Stadium und über eine lange Zeit induzieren, wenn es mit einem DNA-Impfstoff immunisiert wird. Deshalb kann das mutante IL-12p40-Gen der vorliegenden Erfindung zur DNA-Impfung und Gentherapie für verschiedene Krankheiten, zum Beispiel AIDS, Hepatitis C oder Hepatitis B, Krebs, Grippe, Tuberkulose und Malaria nützlich sein, die im Wesentlichen zelluläre Immunreaktionen für ihre Therapie erfordern.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gen, das eine mutierte menschliche Untereinheit IL-12p40 kodiert, wobei Asn-222, das zur Sekretion des in SEQ. NO. 1 beschriebenen menschlichen IL-12p40 unentbehrlich ist, ersetzt ist.
Gen, das eine mutierte Untereinheit IL-12p40 der Maus kodiert, wobei Asn-220, das zur Sekretion des in SEQ. NO. 2 beschriebenen IL-12p40 der Maus unentbehrlich ist, ersetzt ist.
Gen gemäß Anspruch 1, wobei Asn-222 durch Leu-222, GIn-222 oder Ile-222 ersetzt ist.
Gen gemäß Anspruch 2, wobei Asn-220 durch Leu-220 oder Ile-220 ersetzt ist.
Genkonstrukt, das eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES). zwischen dem Gen nach Anspruch 1 und dem Gen enthält, das die menschliche Untereinheit IL-12p35 kodiert.
Genkonstrukt, das eine IRES zwischen dem Gen nach Anspruch 2 und dem Gen enthält, das die Untereinheit IL-12p35 der Maus kodiert.
Expressionsvektor, der das Genkonstrukt nach Anspruch 5 enthält.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem Expressionsvektor um pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L mit der Hinterlegungsnummer KCTC 0969BP handelt und wobei Asn-222 des menschlichen IL-12p40 durch Leu-222 ersetzt ist.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem Expressionsvektor um pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35 mit der Hinterlegungsnummer KCTC 0970BP handelt und wobei Asn-222 des menschlichen IL-12p40 durch Leu-222 ersetzt ist.
Expressionsvektor, der das Genkonstrukt nach Anspruch 6 enthält.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem Expressionsvektor um pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L mit der Hinterlegungsnummer KCTC 0745BP handelt und wobei Asn-220 des IL-12p40 der Maus durch Leu-220 ersetzt ist.
Therapeutisches oder prophylaktisches Adjuvans zur DNA-Immunisierung oder Gentherapie, umfassend ein Gen wie in einem der Ansprüche 1–4 definiert, ein Genkonstrukt wie in den Ansprüchen 5 oder 6 definiert oder einen Expressionsvektor wie in einem der Ansprüche 7–11 definiert, wobei Asn-222 der menschlichen Untereinheit IL-12p40 oder Asn-220 der Untereinheit IL-12p40 der Maus, das zur Sekretion von IL-12p40 unentbehrlich ist, mutiert ist.
Adjuvans gemäß Anspruch 12, wobei das Adjuvans durch Erhöhen der Hydrolyseaktivität zytotoxischer T-Lymphozyten eine Immunreaktion induzieren kann.
Adjuvans gemäß Anspruch 12, wobei das Adjuvans durch Erhöhen der Sekretion von IFN-γ aus Helfer-T-Zellen eine Immunreaktion induzieren kann.
Adjuvans gemäß Anspruch 12, wobei das Adjuvans durch Erhöhen der Sekretion von IFN-γ aus CD8+-Zellen eine Immunreaktion induzieren kann.
Adjuvans gemäß Anspruch 12 zur Verwendung als Adjuvans bei einer Impfstoffzusammensetzung gegen verschiedene Krankheiten wie zum Beispiel Krebs, AIDS, Hepatitis C oder Hepatitis B, Grippe, Tuberkulose und Malaria.