KR20210122025A

KR20210122025A - 신규 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물

Info

Publication number: KR20210122025A
Application number: KR1020200128069A
Authority: KR
Inventors: 서용복; 이수연
Original assignee: 주식회사 에스엘백시젠
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-10-05
Publication date: 2021-10-08
Also published as: KR20210122196A

Abstract

본 발명은 신규 CoV 예방 및 치료용 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 CoV의 S1 당단백질 또는 그의 면역원성 단편 또는 상기 S1 당단백질 또는 그의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 CoV 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다.

Description

신규 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물{A novel vaccine composition for preventing and treating coronavirus}

본 발명은 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 신규 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

최근 코로나바이러스 19의 세계적 대유행(pandemic)으로 인해 인류는 심각한 공중보건학적 위기를 맞고 있다. 코로나바이러스 19는 건강한 사람은 걸리더라도 큰 문제가 없으나, 기저질환을 갖고 있거나 고령자에게는 큰 위협이 될 수 있고, 간혹 건강하고 젊은 사람일지라도 사이토카인 폭풍과 같은 비정상적인 면역반응이 유발될 경우 매우 심각한 상황을 초래할 수 있다. 코로나바이러스(Coronavirus, 이하, "CoV"로 약칭함)는 스파이크 당단백질(spike glycoprotein, 이하 "S 당단백질"로 약칭함), 헤마글루티닌-아세틸트랜스퍼레이즈 당단백질, 막 당단백질 및 작은 외피 당단백질과 같은 몇몇 당단백질로 구성되어 있다(도 1). 상기 S 당단백질은 코로나바이러스의 수용체 인식과 막융합을 매개하고 감염 동안 체액성 면역반응의 일차적인 표적이 된다. CoV S 당단백질은 두 개의 서브유닛으로 구성되어 있는데, 하나는 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 서브유닛(S1)이고 다른 하나는 융합 조직 서브유닛(fusion machinery subunit, S2)이다. 현재까지 오직 S 당단백질만 중화 항체를 유도할 수 있을 것으로 알려지고 있으며, 이는 코로나바이러스에 대항할 수 있는 결정적인 효과기이다(도 2).

그러나, 아직까지 SARS CoV-2를 포함하여 인간 CoV에 대한 효과적인 백신이나 치료제는 개발되지 않은 실정이고, 기존에 다른 바이러스 질환 치료를 위해 개발된 약물을 COVID-19의 치료를 위해 사용하고자 하는 긴급 임상시험이 시도되고 있으나, 이들 시도가 성공적일지는 미지수이다.

인간이 아닌 개나 소 등의 다른 동물의 CoV 감염을 예방하기 위한 백신 조성물은 다수 존재하고 있다. 예컨대, 대한민국 등록특허 제1242757호는 개 CoV 중화항원 결정기를 포함하는 스파이크 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물을 개시하고 있고, 일본 등록특허 제4160201호는 고양이 전염성 복막염 바이러스 핵산 캡시드 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 고양이 또는 개 코로나 바이러스에 대하여 면역을 부여할 수 있는 코로나 바이러스 감염증 예방용 DNA 백신을 개시하고 있으며, 일본 등록특허 제2091446호는 CoV에 감염된 HAL 감염세포의 배양상청액을 포함하는 소 코로나 바이러스 감염증 백신을 개시하고 있다.

한편, 인간에 감염되는 CoV 예방용 백신도 일부 존재하는데 이들은 대부분 2000년대 중반 유행하였던 중증급성호흡기증후군(SARS) CoV를 대상으로 한 것들로서 2020년 유행하고 있는 SARS CoV-2에 대하여 작동할지 여부는 미지수이다.

따라서, 인체에 적합한 SARS CoV-2에 대한 면역화를 가능하게 하는 보다 효과적인 백신의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, CoV 19를 포함한 CoV의 예방 및 치료를 위한 백신 조성물의 제공을 목적으로 한다. 그러나, 상기 목적에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, SARS Cov의 S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 SARS Cov 예방 및 치료용 백신 조성물 이 제공된다.

본 발명의 일 관점에 따르면, SARS Cov의 S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드 및 삼량체 형성 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 SARS CoV 예방 및 치료용 백신 조성물 이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 SARS CoV 감염 증 예방 및 치료방법이 제공된다.

도 1는 CoV의 비리온 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 2는 CoV의 스파이크 당단백질의 도메인 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 3은 본 발명자에 의해 도출된 COVID19 S 당단백질의 대표 아미노산 서열이다.
도 4는 본 발명자에 의해 도출된 COVID19 S 당단백질의 대표 아미노산 서열 내 Signal peptide 위치를 예측 프로그램을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명자들에 의해 도출된 COVID19 S 당단백질의 대표 아미노산 서열에서 개별 도메인의 위치를 아미노산 서열에 표시하여 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 CoV 예방 및 감염용 DNA 백신의 다양한 구조를 개략적으로 나타낸 유전자 맵이다.
도 7은 본 발명의 S 당단백질의 삼량체화 유도를 위해 사용되는 삼량체 형성 재조합 단백질인 T4 박테리오파지 fibritin(A), 서펙틴 D 단백질(B) 및 CD40L(C)를 이용한 재조합 단백질 삼량체화 전략을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 COVID19 백신 컨스트럭트로부터 단백질의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 9 내지 도 11은 마우스 모델에서 COVID19 백신의 효능(항체 반응, T 세포 반응)을 확인한 실험 방법과 결과이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 다양한 COVID19 항원(pGX27-S: S1S2_full, pGX27-S_ΔTM: S1S2_ΔTM/IC)을 발현시키기 위해 제조된 유전자 컨스트럭트의 구조를 나타내는 개요도이고, 도 12b는 상기 유전자 컨스트럭트로 형질전환된 세포에서 생산된 SARS CoV-2 항원의 발현을 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 백신 조성물의 투여 정보(상단) 및 마우스에 대한 투여스케쥴(하단)을 나타내는 개요도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 다양한 백신 조성물을 마우스 모델에 투여한 후 면역반응을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 일 관점에 따르면, SARS Cov(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)의 S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 SARS Cov 예방 및 치료용 백신 조성물이 제공된다.

본 문서에서 사용된 "SARS Cov S 당단백질의 수용성 단편"은 SARS 코로나 바이러스의 외피 당단백질 중 막통과 도메인(transmembrane domain; TM) 및/또는 세포내 도메인(intracellular domain; IC) 부분이 제거된 폴리펩타이드 단편, 상기 폴리펩타이드 단편이 단백질 절단효소에 의해 절단되어 생성된 절편(예컨대, S1 단백질 및 S2 단백질), 또는 S1 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편으로서 막에 결합이 된 상태가 아니라 수용성으로 발현이 되는 면역반응을 유발하는 최소한의 단편을 의미한다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 SARS Cov는 SARS Cov-1 또는 SARS Cov-2일 수 있으나, SARS Cov-2인 것이 바람직하다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 수용성 단편 폴리펩타이드는 i) S1 단백질 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편 또는 ii) 상기 S1 단백질 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편 및 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질을 포함하는 융합단백질일 수 있다.

이 경우, 상기 수용체 결합 도메인은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 319 내지 541 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 상기 막통과 도메인은 SARS Cov-2 S 당단백질 기준으로 1214 내지 1234번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질은 SARS Cov-2 S 당단백질 기준으로 685 내지 1213 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편일 수 있으며, 상기 수용성 단편 폴리펩타이드는 SARS Cov-2 S 당단백질 기준으로 16 내지 1213 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 상기 폴리뉴클레오타이드 대신에 SARS Cov S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, SARS Cov의 S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드 및 삼량체 형성 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 SARS CoV 예방 및 치료용 백신 조성물이 제공된다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 S1 당단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 S1 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 27로 기재되는 핵산서열을 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 S2 당단백질 또는 그의 면역원성 단편은 막통과 도메인 및 세포내 도메인이 제거된 것일 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서 상기 S2 당단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 S1 당단백질 및 S2 당단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 31로 기재되는 핵산서열을 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 삼량체 형성 단백질은, CD40L 엑토도메인, T4 박테리오파지 fibritin, Fas 리간드, 41BB, OX40L, CD70, TRAIL, 또는 서펙틴일 수 있고, 상기 CD40L 엑토도메인은 N-말단 도메인(1-112 a.a.)가 제거된 가용성 CD40L(sCD40L)일 수 있으며, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 서펙틴은 서펙틴 A 또는 서펙틴 D일 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서, 상기 S1 당단백질 및 CD40L 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 32로 기재되는 핵산서열을 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물에 있어서 상기 S1 당단백질, 및 S2 당단백질; 및 삼량체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33으로 기재되는 핵산서열을 포함할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "면역원성 단편"은 항원 단백질을 절단하여 생성된 단편 중 생체 내에서 면역반응을 유발할 수 있는 단편을 의미한다. 이러한 단편의 최소단위로는 에피토프(epitope)를 들 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커(linker) 펩타이드가 삽입될 수 있는데, 연결되는 폴리펩타이드의 본래의 기능을 제한하지 않고, 융합단백질의 발현을 저해하지 않는 유연성 펩타이드 링커라면 어느 것이라도 사용이 가능하며, 구체적인 예시는 상술한 바와 같다.

상기 조성물에 있어서, 상기 S2 당단백질 또는 그의 면역원성 단편은 막통과 도메인 및 세포질내 도메인이 제거된 것일 수 있다. 상기 CD40L 엑토도메인은 N-말단 도메인(1-112 a.a)이 제거된 가용성 CD40L(sCD40L)일 수 있다.

상기 백신 조성물이 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 경우 상기 융합 단백질은 융합파트너 사이에 하나 이상의 링커 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 링커 펩타이드는 공지된 그 어떠한 것이라도 사용하는 것이 가능하다. 이러한 링커의 예로는 (GS)₅(서열번호 4), (G₄S, 서열번호 5)_n, (GSSGGS, 서열번호 6)_n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 7), EGKSSGSGSESKST(서열번호 8), GSAGSAAGSGEF(서열번호 9), (EAAAK, 서열번호 10)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 11), A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A(서열번호 12), GGGGGGGG(서열번호 13), GGGGGG(서열번호 14), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 15), PAPAP(서열번호 16), (Ala-Pro)_n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 17), PLGLWA(서열번호 18), TRHRQPRGWE(서열번호 19), AGNRVRRSVG(서열번호 20), RRRRRRRR(서열번호 21), GFLG(서열번호 22), 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 23) 등이 사용될 수 있다.

아울러, 상기 S1 단백질 또는 상기 융합 단백질은 N-말단에 단백질 분비를 위한 분비 신호서열을 포함할 수 있다. 상기 분비 신호서열은 공지된 그 어떠한 것이든 사용할 수 있는데 예컨대, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열(서열번호 24), HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. 상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 프로모터 또는 SV40 프로모터와 같은 프로모터를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포 내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX27(특허 제1442254호), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris (1995) Cell 75, 791-803) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham-Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합 단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더서열이다.

상기 백신 조성물은 하나 또는 둘 이상의 면역증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 이 경우 상기 면역증진 펩타이드는 상기 S1 당단백질 또는 융합 단백질에 연결된 융합 단백질의 형태로 발현될 수 있는데, 이 경우 상기 면역증진 펩타이드는 상기 S1 당단백질 또는 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가되거나 중간에 삽입될 수 있으며, 상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD40L, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 Flt3 리간드는 서열번호 25로 구성되는 폴리펩타이드일 수 있다.

아울러, 상기 유전자 컨스트럭트는 제조 및 조작의 편의를 위해 플라스미드 벡터와 같은 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스파테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX27(한국 등록특허 제1442254호)을 사용하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 융합단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다. 상기 숙주세포는 세균, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있고, 상기 세균은 그람음성균, 그람양성균일 수 있으며, 상기 동물 세포는 곤충세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 상기 포유동물 세포는 쥐, 생쥐, 원숭이, 햄스터, 개, 말, 소, 고양이, 돼지, 코끼리, 원숭이, 영장류 또는 인간으로부터 분리된 초도배양 세포 또는 확립된 세포주일 수 있다. 이러한 숙주세포는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 컨스트럭트의 형질전환에 의해 백신에 사용될 수 있는 항원 단백질의 생산에 사용될 수 있다.

상기 백신 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 백신 면역보조제를 포함할 수 있다. 상기 백신 면역보조제로는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘 알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01,AS02, ISCOMs 및 ISCOMMATRIX 등이 사용될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "보조제(adjuvant)" 또는 "백신 면역보조제(vaccine adjuvant)"는 백신의 면역반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다.

선택적으로 상기 백신 조성물은 상술한 백신 면역보조제와 함께 또는 대신에 IL-12 단백질 및 IL-21 단백질을 유효성분으로 포함하거나 상기 IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 근육내 주사 또는 정맥 주사 방식으로 투여될 수 있으나, DNA 백신 조성물로 제공되는 경우, 가장 바람직하게는 전기천공기(electroporator)를 이용하여 주입될 수 있다. 상기 전기천공기는 시판 중인 DNA 약물 체내 주입용 전기천공기, 예컨대, 이탈리아의 IGEA 사의 Glinporator^TM, 한국의 JCBIO사의 CUY21EDIT, 스위스의 Supertech사의 SP-4a, 에스엘백시젠 사(대한민국)의 Orbipulse 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

아울러 본 발명의 백신 조성물은 예방을 위해 필요한 양 또는 치료적으로 유효한 양으로 투여된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 0.05 mg/dose 내지 100 mg/dose의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/dose 내지 10 mg/dose의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 치료방법에 있어서, 상기 SARS CoV는 중증급성호흡기증후군(SARS) Cov-1, 또는 SARS Cov-2일 수 있으며, 특히 SARS Cov-2는 최근 전세계적으로 유행하는 신종코로나 바이러스 질환(COVID-19; 30 January 2020 the World Health Organization declared Coronavirus Disease 2019)을 유발하는 병원성 바이러스이다.

상기 방법에 있어서, 상기 백신 조성물은 생체 내 전기천공법에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예: CoV DNA 백신의 고안

CoV S 당단백질을 항원으로 하여 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 조성물의 제조를 위해서는 CoV S 당단백질의 항원 유전자 컨스트럭트의 고안이 필요하지만, COVID-19의 병원성 바이러스인 SARS Cov-2( S 당단백질의 아미노산 서열과 개별 도메인에 대한 구체적인 위치 정보는 아직까지 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 항원 유전자 컨스트럭트를 고안함에 있어 그 서열과 도메인의 위치를 토대로 어느 위치까지 항원으로 디자인할 지 결정하는 것이 효과적인 백신을 개발하는 데 가장 중요한 포인트임을 고려하여, 우선적으로 미국 국립보건원(NIH)의 유전자 서열 데이터베이스인 GenBank(//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs)에서 확인된 45종의 SARS-CoV-2 뉴클레오티드 서열을 기반으로 Jalview 소프트웨어(//www.jalview.org/)를 이용하여 CoV의 S 당단백질의 대표 아미노산 서열을 도출하였다(도 3). 본 발명자들이 규명한 상기 CoV의 S 당단백질의 대표 아미노산 서열은 추후 공개된 NCBI 등재 대표 서열(NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1)과 100% 동일한 것으로 확인하였으며, 이에, 본 발명자들은 본 문서에서 사용된 CoV S 당단백질의 도메인들의 아미노산 위치를 상기 대표서열과 동일한 서열번호 34를 기준으로 정하였다.

이후, S1 서브유닛, S2 서브유닛, 막통과 도메인(TM)의 위치에 대한 S 당단백질 도메인 구조가 이미 규명되어 있는 다른 CoV 속(CoV genus; Middle East respiratory syndrome-related coronavirus(isolate United Kingdom/H123990006/2012) (Betacoronavirus England 1) (Human coronavirus EMC), Human SARS coronavirus(SARS-CoV, Severe acute respiratory syndrome coronavirus), Human coronavirus OC43(HCoV-OC43), Human coronavirus HKU1 (isolate N5)(HCoV-HKU1), Human coronavirus 229E(HCoV-229E), Human coronavirus NL63(HCoV-NL63))들의 도메인 서열을 비교 분석함과 동시에 문헌(Kleine-Weber H et al., Sci. Rep. 8(1): 16597, 2018)을 통해 밝혀진 보존된 아미노산 서열 정보와 SignalP-5.0 소프트웨어를 토대로 한 신호서열 절단 부위 예측 정보(도 4)를 모두 종합함으로써 상기 도출된 S 당단백질의 대표 아미노산 서열을 기준으로 각 도메인의 위치를 결정하였다(도 5).

그런 다음, 도 5에 기재된 결정된 도메인 정보를 바탕으로 네 가지 형태의 유전자 컨스트럭트를 고안하였다(표 1 및 도 6). 구체적으로, S1 서브유닛 단독만 포함한 형태(도 6a, 실시예 1) 또는 S1/S2 서브유닛 모두 포함한 형태(도 6b, 실시예 2)로 구분하여 고안하였다. S2 서브유닛의 경우 세포 내에서 발현된 항원이 효과적으로 세포 밖으로 노출될 수 있도록 막통과 도메인 및 세포질 내 꼬리(intracellular tail, IC) 부분은 제거하도록 고안하였다(S2_ΔTM/IC).

아울러, 효과적인 중화 항체 반응을 유도하기 위해서는 온전한 형태(intact form)의 항원이 체내에 형성 및 노출 되도록 하는 것이 매우 중요하다. CoV S 당단백질은 삼량체 사전-융합 형태(trimer pre-fusion form)으로 존재하기 때문에 백신에서 만들어지는 CoV S 당단백질은 삼량체 사전-융합 형태이어야 한다. 표적 단백질을 삼량체화할 수 있는 여러 방법이 있을 수 있는데, 가령, T4 박테리오파지 피프리틴 삼량체화 모티프(bacteriophage fibritin trimerization motif(FT) 또는 계면활성 단백질 D(surfactant protein D, SPD)를 연결하는 방법이 있다(도 7).

본 발명자들은 CoV DNA 백신의 S 당단백질이 삼량체 사전-융합 형태로 생성될 뿐 아니라, 동시에 면역반응을 증가시킬 수 있는 구조가 될 수 있는 방안을 고안하였다. 구체적으로, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF)의 리간드 중 하나인 CD40 리간드(CD40L)는 삼량체 형태로 CD40에 신호 전달을 주는 것으로 알려져 있고, 항체 면역 반응뿐만 아니라 세포성 면역반응까지 증가시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 CoV S 당단백질과 가용성 CD40L을 연결한 형태의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신을 고안하여 CoV S 당단백질이 효율적으로 삼량체 사전-융합 형태로 발현될 뿐만 아니라, 백신의 면역반응을 증가시킬 수 있도록 고안하였다(도 6c 및 6d, 실시예 3 및 4).

실시예	분비 신호서열 (상응 핵산서열)	항원 (상응 핵산서열)	링커 펩타이드 (상응 핵산서열)	삼량체화 도메인 (상응 핵산서열)
1	tPA(26)	S1(27)	-	-
2	tPA(26)	S1/S2_△TM/IC(28)	-	-
3	tPA(26)	S1(27)	(GS)₅(29)	sCD40L_113-261(30)
4	tPA(26)	S1/S2_△TM/IC(28)	(GS)₅(29)	sCD40L_113-261(30)

상기 실시예 1 내지 4와 같이 고안한 CoV DNA 백신 유전자 컨스트럭트를 합성한 후 pGX27 벡터(Genexine, Inc., 대한민국)에 삽입함으로써 DNA 백신용 발현벡터를 제조하였고(도 6), 이를 COVID-19 (DNA) 백신이라 칭하였다.

실험예 1: COVID-19 DNA 백신에 의한 단백질 발현 확인

COS-7 세포 1 x 10⁷ cells를 100 mm culture dish에 접종하여 16시간 배양 후 4종의 COVID-19 DNA 백신 24 μg과 lipofectamine 2000 60 μL를 혼합하여 세포에 첨가한 뒤 37 ℃ CO2 incubator에서 4 ~ 5시간 반응시켜 유전자를 도입하고 배양 배지를 교환하였다. 배지 교환 후 48시간 동안 배양한 뒤, 배양세포를 lysis하여 단백질을 추출하였다. 이후 추출한 단백질에 4x SDS sample buffer를 넣고 72 ℃에서 10분간 끓여주었다. 이 후 SDS gel을 이용하여 전기영동을 실시하였고, Gel 상의 단백질을 iBlot Gel transfer stacks nitrocellulose (Invitrogen) 을 이용하여 이동시킨 후 SARS-CoV-2 spike에 특이적인 antibody를 1 차 항체로 이용하여 4 ℃ overnight 반응하고, HRP conjugated 2차 항체를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응 시켰다. 위 항체와 반응성이 있는 밴드를 ECL (Enhanced chemiluminencence solution) 용액으로 발색시켜 COVID-19 DNA 백신에 도입된 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물을 검출하였다. 그 결과, COVID-19 DNA 백신이 도입된 COS-7 검체에서 SARS-CoV-2 전장 S 단백질 또는 S1 서브유닛 단백질을 CMV 프로모터에서 발현하여 예측한 위치에 특이적 밴드를 확인하였으며, 음성대조군 에서는 특이적인 단백질이 검출되지 않으며(도 8), 이를 통해 본 발명의 항원 유전자 컨스트럭트의 발현 시스템이 정상적으로 작동함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 마우스 모델에서 본 발명의 COVID-19 백신 효능 평가

본 발명의 COVID-19 DNA 백신의 마우스 모델에서의 면역반응을 확인하기 위하여 도 9에 기재된 투여군과 스케줄을 토대로 마우스 실험을 수행하였다.

항체 반응

BALB/c 마우스의 대퇴근육에 투여물을 50 μL/head씩 투여하고, 2주 간격으로 2회 반복 투여하였다. 모든 투여군에는 EP 카트리지 주사 바늘을 삽입한 채 EP device를 이용하여 EP(200 V/cm, (3 pulses at 10 ms/pulse and 10 ms between pulses) x 4 cycles)를 실시하였다. 백신 첫 투여시점을 기준으로 2주, 4주차에 혈청 내 항원 특이적 IgG 항체 역가 ELISA를 수행하여 COVID-19 백신의 면역원성을 평가하였다.

실험 결과는 (1) CD40L(CD40 ligand)의 결합에 의한 백신 면역반응증가 여부, (2) S 항원 구성요소(S1 서브유닛 또는 S1/S2 서브유닛) 사용 범위, 그리고 (3) 투여 횟수에 따른 면역원성 증가여부 등 총 4 가지의 비교항목으로 나누어 분석하였다. CD40L의 결합에 의한 백신 면역반응증가 여부를 분석한 결과, 전반적으로 S 항원에 CD40L를 결합함에 따른 항체반응이 차이가 없거나 오히려 약간 감소하는 경향을 나타냈다(S1(25 μg) vs. S1-sCD40Lm(25 μg), p=0.075(2 weeks), p=0.69(4 weeks); S1/S2(25 μg) vs. S1/S2-sCD40Lm(25 μg), p=0.042(2 weeks), p=0.548(4 weeks)).

S 항원 서브유닛 사용범위에 따른 항원(S1+S2) 특이적 항체반응을 분석한 결과, S1 서브유닛 투여군과 S1/S2 서브유닛 투여군간의 S 항원에 대한 항체 반응에 유의한 차이가 나타내지 않았다(S1(25 μg) vs. S1/S2(25 μg), p=0.089(2 weeks), p=0.841(4 weeks); S1-sCD40Lm(25 μg) vs. S1/S2-sCD40Lm(25 μg), p=0.28(2 weeks), p=0.421(4 weeks)).

투여 횟수(1회 또는 2회)에 따른 면역원성 증가여부를 관찰한 결과, 단회 투여만으로도 유의미한 항체 역가가 유도되었다. 부스팅 시 약간 증가하는 경향은 있으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다(Prime-boost: S1(25 μg), p=0.310; S1-sCD40Lm(25 μg), p=0.222; S1/S2(25 μg), p=0.056; S1/S2-sCD40Lm(25 μg), p=0.032). 다만 프라이밍 시 항체 역가가 낮았던 개체가 부스팅 후 항체반응이 증가하는 현상은 동일하게 나타났다. 이는 본 발명의 COVID-19 백신이 항체 반응을 증가시켜 바이러스 감염에 대한 예방 및 치료 효능을 나타낼 수 있는 효율적인 백신임을 입증하는 결과이다(도 10).

T 세포 반응

BALB/c 마우스의 대퇴근육에 투여물을 50 μL/head씩 투여하고, 2주 간격으로 2회 반복 투여하였다. 모든 투여군에는 EP 카트리지 주사 바늘을 삽입한 채 EP device를 이용하여 전기천공(electroporation, 200 V/cm, (3 pulses at 10 ms/pulse and 10 ms between pulses) x 4 cycles)을 실시하였다. 마지막 투여 후 2주일 뒤(4주 차)에 비장을 적출하여 스파이크 항원 특이적 T 세포 반응은 ELISPOT법을 이용해서 분석하였다.

COVID-19 백신의 효능은 SARS Cov-2 스파이크 항원 특이적 T 세포 반응을 IFN-γ ELISPOT 방법으로 평가함으로써 확인하였고, 실험 결과는 (1) CD40L(CD40 ligand)의 결합에 의한 백신 면역반응증가 효능 평가, (2) 스파이크 단백질 서브유닛(S1 서브유닛 또는 S1/S2 서브유닛) 사용 범위 결정으로 나누어 분석하였다.

CD40L 유무에 따른 백신특이적 T 세포 면역반응 유도능을 분석한 결과, S 항원에 CD40L의 결합에 따른 차이가 없었고(S1 vs. S1-sCD40Lm, p=0.151; S1/S2 vs. S1S2- sCD40Lm, p=0.841), S 항원 서브유닛 사용범위에 따른 백신 특이적 T 세포 면역반응을 분석한 결과, S1 서브유닛에 비해 S1/S2 서브유닛 투여군이 스파이크 단백질 전체 풀(pool)에 대한 T세포 반응에 증가하는 경향을 보였다(S1 vs. S1/S2, p=0.548; S1-sCD40Lm vs. S1/S2-sCD40Lm, p=0.056)(도 11).

SARS Cov-2가 속해 있는 coronavirus는 숙주세포의 안지오텐신-변환 효소 2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)를 통해 감염을 하며, 수용체 결합도메인(RBD)는 S1 서브유닛에 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 항체 반응은 S1 서브유닛에 대해 잘 유도하는 것이 중요한 것으로 이해되고 있다. 본 발명자들이 고안한 COVID-19 DNA 백신 4종(pGX27-COVID-19/S1, pGX27-COVID-19/S1S2, pGX27-COVID-19/S1-CD40L 및 pGX27-COVID-19/S1S2-CD40L)의 항체 반응은 유사한 수준이었고, 이를 통해 백신에 대한 항체 반응은 주로 S1 서브유닛 에 대한 것임을 알 수 있었다. 이때, 항체 반응뿐 아니라 T 세포 반응을 통해서 바이러스에 감염된 세포의 효율적인 제거를 통해 감염 이후의 빠른 회복을 돕는 것 또한 매우 중요한데, 도 11의 T 세포 반응 결과를 보면 S1/S2 서브유닛에 대한 반응이 모두 잘 유도됨을 확인할 수 있었고, 이를 통해 S2 서브유닛에는 치료면역 반응과 연관이 있는 T 세포 에피토프가 많이 분포할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 유사한 항체반응을 유도함과 동시에 S1, S2 서브유닛에 대한 효율적인 T 세포를 유도할 수 있는 컨스트럭트가 백신으로서 적용되는 데 더욱 적절할 것으로 생각되며, 결론적으로, 본 실험을 통해 S1, S2 서브유닛을 모두 포함하는 항원에 대해 CD40L 연결하는 구조적 변경이 없는 pGX27-COVID-19/S1S2가 COVID-19에 대한 최적의 DNA 백신 컨스트럭트 형태임을 확인하였다.

실험예 3: COVID-19 S 당단백질 항원 형태에 따른 면역원성 비교

상기 실험예 2 및 3을 통해 COVID-19 백신으로 pGX27-COVID-19/S1S2가 COVID19 감염의 예방 및 치료를 위한 최적의 백신 컨스트럭트임을 확인하였다. 이때, S2 서브유닛에는 삼량체화에 관여하는 hepted 반복 지역과 표면 막을 관통하는 막통과 도메인(transmembrane domain)을 포함하게 되는데, SARS Cov-2 항원 DNA 컨스트럭트에 있어 이러한 막통과 도메인의 존재 여부가 면역원성에 어떤 영향을 주는 지 확인하기 위하여, 도 12a에 기재된 바와 같이 S1 단백질 항원에 S2 서브유닛을 전장 형태로 포함한 유전자 컨스트럭트를 추가로 고안하였다.

상기 유전자 컨스트럭트가 정상적으로 발현되는지 여부를 확인하기 위해 상기 유전자 컨스트럭트들을 COS-7에 형질감염시킨 후 단백질 발현양상을 항-S 당단백질 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석으로 분석하였다. 그 결과 도 12b에서 확인되는 바와 같이, S1S2_full 유전자 컨스트럭트 및 S1S2_ΔTM/IC 유전자 컨스트럭트 모두 S 당단백질을 정상적으로 발현하는 것으로 확인되었다. 그러나, 막통과 도메인이 제거된 형태의 S 당단백질의 발현 정도가 현저하게 증가하였다. 이는 막결합 형태가 아닌 수용성 단백질 형태로 S 당단백질이 생산이 되기 때문인 것으로 해석이 된다.

이후, S1 서브유닛의 형태에 따른 COVID-19 DNA 백신의 마우스 모델에서의 면역반응을 확인하기 위하여 도 13에 기재된 투여군과 스케줄을 토대로 실험을 수행하였다.

구체적으로, BALB/c 마우스의 대퇴 근육에 투여물을 50 μL/head씩 투여하고, 2주 간격으로 2회 반복 투여하였다. 모든 투여군에는 EP 카트리지 주사 바늘을 삽입한 채 EP device를 이용하여 전기천공(200 V/cm, (3 pulses at 10 ms/pulse and 10 ms between pulses) x 4 cycles)을 실시하였다. 백신 첫 투여시점을 기준으로 2주, 4주차에 혈청 내 항원 특이적 IgG 항체역가 ELISA를 수행하여 COVID-19 백신 후보물질의 면역원성을 평가하였다.

그 결과, 1회 투여 후 항체 반응은 항원의 형태에 따라 유의미하게 차이가 나지 않았으나 S1S2_ΔTM/IC 형태의 백신에서 가장 높은 항체 역가 값을 보였고, 2회 투여 후 항체 반응에서는 S1S2_ΔTM/IC 형태의 백신 투여군이 다른 두 가지 형태의 백신 투여군에 비해 통계적으로 유의미하게 높은 항체 역가 값을 나타냄을 확인하였다(도 14).

결론적으로, COVID19 백신 항원으로서 S1 서브유닛과 S2 서브유닛을 동시에 적용하면서 S2 서브유닛의 막통과 도메인을 제거한 형태가 더욱 효과적인 백신 컨스트럭트임을 알 수 있었고, 이를 통해 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> SLVaxigen, Inc. <120> A novel vaccine composition for preventing and treating corona virus <130> PD20-5982 <150> KR 10-2020-0039497 <151> 2020-03-31 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 669 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CoV S1 glycoprotein <400> 1 Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val 20 25 30 Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr 35 40 45 Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe 50 55 60 Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr 65 70 75 80 Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp 85 90 95 Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val 100 105 110 Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val 115 120 125 Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser 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ctgatggacc tggaaggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt cgtgttcaag 540 aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacaccc ctatcaacct cgtgcgggat 600 ctgcctcagg gcttctctgc tctggaaccc ctggtggatc tgcccatcgg catcaacatc 660 acccggtttc agacactgct ggccctgcac agaagctacc tgacacctgg cgatagcagc 720 tctggatgga cagctggcgc cgctgcctac tatgtgggat atctgcaacc taggaccttc 780 ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggattgtgc tctggatccc 840 ctgagcgaga caaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg aaaagggcat ctaccagacc 900 agcaacttcc gggtgcagcc caccgaatcc atcgtgcggt tccccaacat caccaatctg 960 tgccctttcg gcgaggtgtt caacgccacc agattcgcct ctgtgtacgc ctggaaccgg 1020 aagcggatca gcaattgcgt ggccgactac agcgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc 1080 accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg 1140 tacgccgaca gcttcgtgat cagaggcgac gaagtgcggc agattgcccc tggacagaca 1200 ggcaagatcg ccgattacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg tgtgattgcc 1260 tggaacagca acaacctgga cagcaaagtc ggcggcaact acaactacct gtaccggctg 1320 ttccggaagt ccaacctgaa gcctttcgag cgggacatca gcaccgagat ctatcaggcc 1380 ggcagcaccc cttgcaatgg cgtggaaggc ttcaactgct acttcccact gcagtcctac 1440 ggcttccagc ctacaaacgg cgtgggctac cagccttaca gagtggtggt gctgagcttc 1500 gagctgctgc atgctcctgc cacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa cctggtcaag 1560 aacaaatgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct gacagagagc 1620 aacaagaagt tcctgccttt ccagcagttc ggccgggata tcgccgatac cacagatgct 1680 gtcagagatc cccagacact ggaaatcctg gacatcaccc catgcagctt cggcggagtg 1740 tctgtgatca cccctggcac caacaccagc aatcaggtgg ccgtgctgta tcaggacgtg 1800 aactgtaccg aagtgcccgt ggccattcac gccgatcagc tgacacctac atggcgggtg 1860 tactccaccg gcagcaacgt gttccagaca agagccggct gtctgatcgg agccgaacac 1920 gtgaacaaca gctacgagtg cgacatccct atcggagccg gcatctgtgc cagctaccag 1980 acacagacaa acagccccag acgggccaga tctgtggcca gccagagcat cattgcctac 2040 accatgtctc tgggcgccga gaacagcgtg gcctacagca acaactctat cgctatcccc 2100 accaacttca ccatcagcgt gaccaccgag atcctgcctg tgtccatgac caagaccagc 2160 gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat agcaccgagt gcagcaacct gctgctgcag 2220 tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgaccg gaatcgccgt ggaacaggac 2280 aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc tcctatcaag 2340 gacttcggcg gcttcaactt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc cagcaagcgg 2400 agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgaccctgg ccgacgccgg cttcatcaag 2460 cagtatggcg attgcctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc ccagaagttt 2520 aacggcctga ccgtgctgcc tcctctgctg accgatgaga tgatcgccca gtacacatct 2580 gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc cgctctgcag 2640 atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggcgtgac ccagaacgtg 2700 ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag 2760 gacagcctga gcagtacagc cagcgctctg ggaaagctgc aggacgtggt caaccagaat 2820 gcccaggctc tgaacaccct ggtcaagcag ctgagcagca acttcggcgc catcagcagc 2880 gtgctgaacg acatcctgag ccgcctggat aaggtggaag ccgaggtgca gatcgaccgg 2940 ctgattacag gcagactgca gagcctgcag acctacgtga cacagcagct gatcagagcc 3000 gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg tgtgctgggc 3060 cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt ccctcagtct 3120 gctcctcacg gcgtggtgtt tctgcatgtg acatacgtgc ccgctcaaga gaagaatttc 3180 accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga aggcgtgttc 3240 gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgact cagcggaact tctacgagcc ccagatcatc 3300 accaccgaca acaccttcgt gtccggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat cgtgaacaat 3360 accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact ggacaagtac 3420 ttcaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgata tcagcggaat caatgccagc 3480 gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgacaga ctgaacgagg tggccaagaa cctgaacgag 3540 agcctgatcg acctgcaaga gctggggaag tacgagcagt atatcaagtg gcct 3594 <210> 32 <211> 2484 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CoV S1-sCD40L fusion protein <400> 32 gtgaacctga ccaccagaac acaactgcct ccagcctaca ccaacagctt caccagaggc 60 gtgtactacc ccgacaaggt gttcagatcc agcgtgctgc actctaccca ggacctgttc 120 ctgcctttct tcagcaacgt gacctggttc cacgccatcc atgtgtccgg caccaatggc 180 accaagagat tcgacaaccc cgtgctgccc ttcaacgacg gggtgtactt tgccagcacc 240 gagaagtcca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca cactggacag caagacccag 300 agcctgctga tcgtgaacaa cgccaccaac gtggtcatca aagtgtgcga gttccagttc 360 tgcaacgacc ccttcctggg cgtctactac cacaagaaca acaagagctg gatggaaagc 420 gagttccggg tgtacagcag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc ccagcctttc 480 ctgatggacc tggaaggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt cgtgttcaag 540 aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacaccc ctatcaacct cgtgcgggat 600 ctgcctcagg gcttctctgc tctggaaccc ctggtggatc tgcccatcgg catcaacatc 660 acccggtttc agacactgct ggccctgcac agaagctacc tgacacctgg cgatagcagc 720 tctggatgga cagctggcgc cgctgcctac tatgtgggat atctgcaacc taggaccttc 780 ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggattgtgc tctggatccc 840 ctgagcgaga caaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg aaaagggcat ctaccagacc 900 agcaacttcc gggtgcagcc caccgaatcc atcgtgcggt tccccaacat caccaatctg 960 tgccctttcg gcgaggtgtt caacgccacc agattcgcct ctgtgtacgc ctggaaccgg 1020 aagcggatca gcaattgcgt ggccgactac agcgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc 1080 accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg 1140 tacgccgaca gcttcgtgat cagaggcgac gaagtgcggc agattgcccc tggacagaca 1200 ggcaagatcg ccgattacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg tgtgattgcc 1260 tggaacagca acaacctgga cagcaaagtc ggcggcaact acaactacct gtaccggctg 1320 ttccggaagt ccaacctgaa gcctttcgag cgggacatca gcaccgagat ctatcaggcc 1380 ggcagcaccc cttgcaatgg cgtggaaggc ttcaactgct acttcccact gcagtcctac 1440 ggcttccagc ctacaaacgg cgtgggctac cagccttaca gagtggtggt gctgagcttc 1500 gagctgctgc atgctcctgc cacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa cctggtcaag 1560 aacaaatgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct gacagagagc 1620 aacaagaagt tcctgccttt ccagcagttc ggccgggata tcgccgatac cacagatgct 1680 gtcagagatc cccagacact ggaaatcctg gacatcaccc catgcagctt cggcggagtg 1740 tctgtgatca cccctggcac caacaccagc aatcaggtgg ccgtgctgta tcaggacgtg 1800 aactgtaccg aagtgcccgt ggccattcac gccgatcagc tgacacctac atggcgggtg 1860 tactccaccg gcagcaacgt gttccagaca agagccggct gtctgatcgg agccgaacac 1920 gtgaacaaca gctacgagtg cgacatccct atcggagccg gcatctgtgc cagctaccag 1980 acacagacaa acagccctcg gagagccgga agcggatctg gtagtggctc tggctctatg 2040 cagaagggcg accagaatcc tcagatcgcc gctcatgtga tcagcgaggc cagcagcaag 2100 accacatctg tgctgcagtg ggccgagaag ggctactaca ccatgagcaa caacctggtc 2160 accctggaaa acggcaagca gctgaccgtg aagagacagg gcctgtacta catctacgcc 2220 caagtgacct tctgcagcaa cagagaggcc agctctcagg ccccttttat cgccagcctg 2280 tgcctgaagt cccctggcag attcgagcgg attctgctga gagccgccaa cacacacagc 2340 agcgccaaac cttgtggcca gcagtctatt cacctcggcg gagtgtttga gctgcagcct 2400 ggcgcaagcg tgttcgtgaa tgtgacagac cctagccagg tgtcccacgg caccggcttt 2460 acatctttcg gcctgctgaa gctg 2484 <210> 33 <211> 4071 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CoV S1/S2-sCD40L fusion protein <400> 33 gtgaacctga ccaccagaac acaactgcct ccagcctaca ccaacagctt caccagaggc 60 gtgtactacc ccgacaaggt gttcagatcc agcgtgctgc actctaccca ggacctgttc 120 ctgcctttct tcagcaacgt gacctggttc cacgccatcc atgtgtccgg caccaatggc 180 accaagagat tcgacaaccc cgtgctgccc ttcaacgacg gggtgtactt tgccagcacc 240 gagaagtcca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca cactggacag caagacccag 300 agcctgctga tcgtgaacaa cgccaccaac gtggtcatca aagtgtgcga gttccagttc 360 tgcaacgacc ccttcctggg cgtctactac cacaagaaca acaagagctg gatggaaagc 420 gagttccggg tgtacagcag cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc ccagcctttc 480 ctgatggacc tggaaggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt cgtgttcaag 540 aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacaccc ctatcaacct cgtgcgggat 600 ctgcctcagg gcttctctgc tctggaaccc ctggtggatc tgcccatcgg catcaacatc 660 acccggtttc agacactgct ggccctgcac agaagctacc tgacacctgg cgatagcagc 720 tctggatgga cagctggcgc cgctgcctac tatgtgggat atctgcaacc taggaccttc 780 ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggattgtgc tctggatccc 840 ctgagcgaga caaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg aaaagggcat ctaccagacc 900 agcaacttcc gggtgcagcc caccgaatcc atcgtgcggt tccccaacat caccaatctg 960 tgccctttcg gcgaggtgtt caacgccacc agattcgcct ctgtgtacgc ctggaaccgg 1020 aagcggatca gcaattgcgt ggccgactac agcgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc 1080 accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg 1140 tacgccgaca gcttcgtgat cagaggcgac gaagtgcggc agattgcccc tggacagaca 1200 ggcaagatcg ccgattacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg tgtgattgcc 1260 tggaacagca acaacctgga cagcaaagtc ggcggcaact acaactacct gtaccggctg 1320 ttccggaagt ccaacctgaa gcctttcgag cgggacatca gcaccgagat ctatcaggcc 1380 ggcagcaccc cttgcaatgg cgtggaaggc ttcaactgct acttcccact gcagtcctac 1440 ggcttccagc ctacaaacgg cgtgggctac cagccttaca gagtggtggt gctgagcttc 1500 gagctgctgc atgctcctgc cacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa cctggtcaag 1560 aacaaatgcg tgaacttcaa cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct gacagagagc 1620 aacaagaagt tcctgccttt ccagcagttc ggccgggata tcgccgatac cacagatgct 1680 gtcagagatc cccagacact ggaaatcctg gacatcaccc catgcagctt cggcggagtg 1740 tctgtgatca cccctggcac caacaccagc aatcaggtgg ccgtgctgta tcaggacgtg 1800 aactgtaccg aagtgcccgt ggccattcac gccgatcagc tgacacctac atggcgggtg 1860 tactccaccg gcagcaacgt gttccagaca agagccggct gtctgatcgg agccgaacac 1920 gtgaacaaca gctacgagtg cgacatccct atcggagccg gcatctgtgc cagctaccag 1980 acacagacaa acagccccag acgggccaga tctgtggcca gccagagcat cattgcctac 2040 accatgtctc tgggcgccga gaacagcgtg gcctacagca acaactctat cgctatcccc 2100 accaacttca ccatcagcgt gaccaccgag atcctgcctg tgtccatgac caagaccagc 2160 gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgat agcaccgagt gcagcaacct gctgctgcag 2220 tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgaccg gaatcgccgt ggaacaggac 2280 aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc tcctatcaag 2340 gacttcggcg gcttcaactt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc cagcaagcgg 2400 agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgaccctgg ccgacgccgg cttcatcaag 2460 cagtatggcg attgcctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc ccagaagttt 2520 aacggcctga ccgtgctgcc tcctctgctg accgatgaga tgatcgccca gtacacatct 2580 gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc cgctctgcag 2640 atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggcgtgac ccagaacgtg 2700 ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag 2760 gacagcctga gcagtacagc cagcgctctg ggaaagctgc aggacgtggt caaccagaat 2820 gcccaggctc tgaacaccct ggtcaagcag ctgagcagca acttcggcgc catcagcagc 2880 gtgctgaacg acatcctgag ccgcctggat aaggtggaag ccgaggtgca gatcgaccgg 2940 ctgattacag gcagactgca gagcctgcag acctacgtga cacagcagct gatcagagcc 3000 gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg tgtgctgggc 3060 cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt ccctcagtct 3120 gctcctcacg gcgtggtgtt tctgcatgtg acatacgtgc ccgctcaaga gaagaatttc 3180 accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga aggcgtgttc 3240 gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgact cagcggaact tctacgagcc ccagatcatc 3300 accaccgaca acaccttcgt gtccggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat cgtgaacaat 3360 accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact ggacaagtac 3420 ttcaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgata tcagcggaat caatgccagc 3480 gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgacaga ctgaacgagg tggccaagaa cctgaacgag 3540 agcctgatcg acctgcaaga gctggggaag tacgagcagt atatcaagtg gcctggcagc 3600 ggcagcggat ctggctctgg atctatgcag aagggcgacc agaatcctca gatcgccgct 3660 catgtgatca gcgaggccag ctctaagacc acctctgtgc tgcagtgggc cgagaagggc 3720 tactacacaa tgagcaacaa cctggtcacc ctggaaaacg gcaaacagct gaccgtgaag 3780 cggcagggcc tgtactacat ctacgctcaa gtgaccttct gctccaacag agaggcctcc 3840 tctcaggccc cttttatcgc cagcctgtgc ctgaagtccc ctggcagatt cgagcggatt 3900 ctgctgagag ccgccaacac acacagctcc gccaaacctt gtggacagca gtctatccac 3960 ctcggcggag tgtttgaact gcagcctggc gcctccgtgt ttgtgaacgt gaccgatcct 4020 tctcaggtgt cccacggaac cggcttcacc tcttttggcc tgctgaagct g 4071 <210> 34 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS CoV-2 S glycoprotein full sequence <400> 34 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser 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Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1025 1030 1035 1040 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270

Claims

SARS Cov의 S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 함유하는 SARS Cov 예방 및 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SARS Cov는 SARS Cov-1 또는 SARS Cov-2인, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수용성 단편 폴리펩타이드는
i) S1 단백질 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편; 또는
ii) 상기 S1 단백질 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편 및 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질을 포함하는 융합단백질인, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수용체 결합 도메인은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34)기준으로 319 내지 541 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드를 포함하는, 백신 조성물.
제3항에 있어서,
상기 막통과 도메인은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 1214 내지 1234번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드인, 백신 조성물.
제3항에 있어서,
상기 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 685 내지 1213 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편인, 백신 조성물.
제3항에 있어서,
상기 수용성 단편 폴리펩타이드는 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 16 내지 1213 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드를 포함하는, 백신 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 S1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 27 또는 31로 기재되는 핵산서열을 포함하는, 백신 조성물.
제3항에 있어서,
상기 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
SARS Cov의 S 당단백질의 수용성 단편 폴리펩타이드 및 삼량체 형성 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 SARS CoV 예방 및 치료용 백신 조성물.
제11항에 있어서,
상기 SARS Cov는 SARS Cov-1 또는 SARS Cov-2인, 백신 조성물
제11항에 있어서,
상기 수용성 단편 폴리펩타이드는
i) S1 단백질 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편; 또는
ii) 상기 S1 단백질 또는 그의 수용체 결합 도메인을 포함하는 단편 및 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질을 포함하는 융합단백질인, 백신 조성물.
제11항에 있어서,
상기 수용체 결합 도메인은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 319 내지 541 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드를 포함하는, 백신 조성물.
제13항에 있어서,
상기 막통과 도메인은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 1214 내지 1234번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드인, 백신 조성물.
제13항에 있어서,
상기 막통과 도메인이 제거된 S2 단백질은 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 685 내지 1213 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 단편인, 백신 조성물.
제13항에 있어서,
상기 수용성 단편 폴리펩타이드는 SARS Cov-2 S 당단백질(서열번호 34) 기준으로 16 내지 1213 번째 아미노산 잔기에 상응하는 폴리펩타이드를 포함하는, 백신 조성물.
제11항에 있어서,
상기 삼량체 형성 단백질은 CD40L 엑토도메인, T4 박테리오파지 fibritin, Fas 리간드, 41BB, OX40L, CD70, TRAIL, 또는 서펙틴인, 백신 조성물.
제18항에 있어서,
상기 CD40L 엑토도메인은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
제18항에 있어서,
상기 서펙틴은 서펙틴 A 또는 서펙틴 D인, 백신 조성물.
제11항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 32 또는 33으로 기재되는 핵산서열을 포함하는, 백신 조성물.
제3항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 하나 이상의 링커 펩타이드를 포함하는, 백신 조성물.
제22항에 있어서,
상기 링커 펩타이드는 (GS)₅(서열번호 4), (G₄S, 서열번호 5)_n, (GSSGGS, 서열번호 6)_n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 7), EGKSSGSGSESKST(서열번호 8), GSAGSAAGSGEF(서열번호 9), (EAAAK, 서열번호 10)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 11), A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A(서열번호 12), GGGGGGGG(서열번호 13), GGGGGG(서열번호 14), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 15), PAPAP(서열번호 16), (Ala-Pro)_n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 17), PLGLWA(서열번호 18), TRHRQPRGWE(서열번호 19), AGNRVRRSVG(서열번호 20), RRRRRRRR(서열번호 21), GFLG(서열번호 22), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 23)인, 백신 조성물.
제1항 또는 제11항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 N-말단에 단백질 분비를 위한 분비 신호서열을 포함한 것인, 백신 조성물.
제24항에 있어서,
상기 분비 신호서열은 tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열(서열번호 24), HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열인, 백신 조성물.
제1항 또는 제11항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 제공되는, 백신 조성물.
제26항에 있어서,
상기 프로모터는 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 프로모터 또는 SV40 프로모터, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터인, 백신 조성물.
제27항에 있어서,
상기 발현벡터는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3, pSPORT1, pGX27, pX, pEG202, pJG4-5람다 gt11, pGEX(Amersham-Pharmacia)인, 백신 조성물.
제1항 또는 제11항에 있어서,
하나 또는 둘 이상의 면역증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
제29항에 있어서,
상기 면역증진 펩타이드는 상기 폴리펩타이드에 연결된 융합 단백질의 형태로 발현되거나 별도의 유전자 컨스트럭트를 통해 발현되는, 백신 조성물.
제30항에 있어서,
상기 면역증진 펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 부가되거나 중간에 삽입되는, 백신 조성물.
제29항에 있어서,
상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD40L, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 백신 조성물.
제1항 또는 제11항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 SARS CoV 감염증 예방 및 치료방법.
제33항에 있어서,
상기 SARS CoV는 SARS Cov-1 또는 SARS Cov-2인, 치료방법.
제33항에 있어서,
상기 조성물은 생체내 전기천공법에 의해 투여되는, 치료방법.