CN102711791A

CN102711791A - 用于hiv疫苗组合物或作为诊断方法的hiv相关肽的组合或融合物

Info

Publication number: CN102711791A
Application number: CN2010800392328A
Authority: CN
Inventors: 马亚·索默费尔特·格伦沃尔; 安格斯·达格利什; 埃纳·滕内斯·兰格; 延斯·奥勒夫·霍姆伯格; 佩尔·本特松; 比格尔·索伦森
Original assignee: Bionor AS
Current assignee: Bionor Immuno AS; Bionor AS
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-07-03
Publication date: 2012-10-03
Also published as: WO2011000962A3; CA2767063A1; EP2448593B1; EA022788B1; US9200065B2; US10251949B2; JP2012531219A; US20160144019A1; WO2011000962A9; JP5946766B2; EA201270124A1; ZA201200370B; NZ597458A; AU2010267996A1; EP2448593A2; US20120263720A1; BR112012000032A2; WO2011000962A2

Abstract

本发明公开的是用于治疗HIV相关疾病的方法，所述方法包括靶向在一方面gp120的C5结构域与另一方面gp120的gp41或C2结构域之间的复合物。可以通过给药化合物，诸如能够直接与所述复合物相互作用并稳定所述复合物的抗体，或者通过用源自C5和gp41/C2的物质免疫从而诱导结合并稳定所述复合物的抗体来稳定所述复合物。

Description

用于HIV疫苗组合物或作为诊断方法的HIV相关肽的组合或融合物

发明领域

本发明涉及用于治疗、诊断和预测HIV感染和AIDS的新的药剂和方法，并且本发明进一步涉及用于鉴定和提供对所述治疗和诊断有用的药剂的方法。

具体地，本发明涉及新的治疗药剂，所述新的治疗药剂能够影响特定HIV蛋白中结构域之间的复合物的稳定性，并且涉及对于显示这种药剂的存在有用的诊断和预测试剂。

发明背景

近年来，已经积累了大量研究证据，其支持这样的概念，即AIDS是由HIV-1引起的免疫疾病，而不是简单地由作为慢性细胞病变病毒感染结果的CD4+T淋巴细胞的损失导致。因此重要的是开发也靶向由HIV-1引起的慢性免疫刺激的干预。

之前的研究显示针对HIV-1gp120羧基端C5结构域的抗体与较低的免疫活化作用和较慢的疾病进展有关(Loomis-Price等1998 J.Inf Dis.(传染病杂志)178：1306-1316；Warren RQ等1991 J.Clin Immunol(临床免疫学杂志)11：13-21；Lifson等1991 J.Inf.Dis(传染病杂志)163：959-965)。实际上，如果对此结构域的体液(即抗体)应答消失，疾病进展显示为加速(Wong等1993 J.Inf.Dis(传染病杂志)168：1523-1527)。此外，代表5％HIV感染个体的长期不进展者(LTNP)已经维持了针对HIV-1gp120羧基端C5结构域的体液应答，并且尽管具有某种程度的病毒载量，但是能够在没有抗反转录病毒治疗的情况下存活多年(Liegler等1998 J.Infec.Dis.(传染病杂志)178：669-79；Gougeon等1996 J.Immunol(免疫学杂志)156：3509-20；Muro-Cacho等1995 J.Immunol(免疫学杂志)154：5555-66；Easterbrook等1999 J.Infect(感染学杂志)28：71-73)。

Gp120的C5结构域长度为13个氨基酸(gp120的氨基酸残基499-511，并且具有参考序列B.FR 83.HXB2-TKAKRRVVQREKR)。其在多个病毒进化枝之间的保守性显示于表1中。显示任何基本变异的仅有区域是在所述序列的位置500和507，其在位置(500)可以主要包含氨基酸K、R和E，或者在位置(506)可以主要包含Q、E。

表1(不同的多个进化枝的C5结构域)

所提供的表是根据2008年5月3日从Los Alamos HIV数据库下载的1066个序列。

所述序列分组成以下病毒进化枝：

A：32个序列，A1：47个序列，A2：10个序列，B：453个序列，C：464个序列，和D：60个序列。

所述HIV-1gp120的羧基端恒定区C5在多个HIV亚型之间是免疫显性的并且是高度保守的。其暴露于天然gp120的3D结构上、病毒粒子上以及细胞表面表达的gp120上。实际上，C5结构域类似于人白细胞抗原(HLA)I类和II类分子并且具有结合肽的能力，而C5结构域的缺失使肽不结合(Cadogan等AIDS Research and Human Retorviruses(AIDS研究和人反转录病毒)(2008)；卷24：845-855)。这样，C5结构域能够模拟人HLA的活性。

然而，至今为止，C5相关的免疫活化的机制目前在很大程度上是未知的，意味着还不可能基于这些机制合理地设计药物和诊断/预测方法。

发明目的

本发明的实施方案的目的是提供这样的药剂和方法，其能够用于预防和/或治疗和/或诊断和/或预测HIV感染和AIDS。

发明概述

本发明人已经发现，由来自gp120的C5结构域的氨基酸序列和来自gp41的跨膜结构域的氨基酸序列组成的肽构建体(“肽组合”)被分离自大部分LTNP(长期不进展)HIV感染者的抗血清识别，而相同的构建体基本不被来自未感染HIV的受试者的抗血清或来自非LTNP的HIV感染者的抗血清识别。已经观察到由来源于C5和C2的肽杂化物(hybrid)组成的肽构建体具有相似的结果。

特别是，用包含与在gp160上C5结构域外存在的多种其他氨基酸序列组合的C5结构域的氨基酸序列的新抗原对HIV长期不进展者(LTNP)中的抗体进行的测验已经显示新的并且惊人的性质。该氨基酸序列的组合对于鉴定尽管被感染但是不显示疾病进展迹象的HIV感染个体所特有的一组抗体应答有用。结合有交叉进化枝病毒变异的相似的抗原将用于引起广泛的抗C5和抗C5：CX(是指gp41或gp120中C5和非C5区域之间的联合)体液应答，所述体液应答等效于在长期不进展者/良好控制者(elitecontroller)中发现的那些。

因此本文推定，5％的HIV感染个体特有的LTNP状态至少部分是因为这些感染个体能够发展出针对由来自C5和TM-gp41(或C2)两者的氨基酸组成的构象表位的抗体的能力。由于其结合C5和TM-gp41(或C2)两者，这样的抗体将稳定其中C5复合到tm-gp41和/或C2上的特定的构象。因此，这使开发和制备如本文鉴定的抗体那样享有相同特异性的新抗体成为可能，而且其也使开发这样的免疫原性药剂成为可能，所述免疫原性药剂将能够诱导这样的抗体，所述抗体能够一方面稳定C5和TM-gp41之间的复合物形成或另一方面稳定C5和C2之间的复合物形成。

针对与跨膜gp41上的区域和/或gp120的恒定结构域C2缀合或复合(CX)的HIV-1包膜糖蛋白gp120的羧基端C5结构域的肽抗原可以用作疫苗药剂，所述疫苗药剂用于引发抗体免疫应答从而防止/抑制HIV感染个体中与C5相关的慢性免疫刺激。针对这些结构域的肽抗原也能够用于对在HIV感染个体中鉴定这种抗体进行诊断和预测，从而确定他们是否会是长期不进展患者，或者他们是否是接种的候选人。所述测试也能够用于确定接种是否已经成功。

因为本发明提出C5相关的免疫活化的新机制，这也突出了除抗体外其他分子稳定与C5和gp41和/或C2的相互作用从而防止能够导致C5相关的免疫活化的游离C5的可用性的潜能。

HIV-1gp120的C5结构域可以以多种方式与免疫活化相关联：

1)C5可以作为肽呈递于被感染细胞上的不同HLA分子上。500和507位的变异显示对与多种HLA分子相互作用的适应性。

2)C5能够结合肽并且充当HLA分子以与T细胞受体相互作用。参与与TCR复合物相互作用的其他分子存在于细胞表面或者结合到病毒颗粒中。Cadogan等2008 AIDS Res and Hum RetroViruses(AIDS研究和人反转录病毒)24：845-55.

如所述，这使靶向由HIV实施的免疫活化的若干新方式成为可能：

如果C5通过保持与gp41和/或C2结合/复合而被稳定，则C5将保持惰性/无活性。C5因此表现为在结合gp41和C2之间波动。另一方面，当C5脱离gp41或C2时，它能够导致免疫活化。

因此应该有可能以多种方式阻碍C5相关的免疫活化，所述多种方式都根据本发明被预期：

包含与gp41和C2相互作用的来自C5的肽的肽组合模仿体内的C5和gp41或C2之间的复合物，并且将能够诱导针对天然复合物的抗体应答。这些抗体又能够通过在构象上“锁住”C5来阻碍C5相关的免疫活化。

同样，阻碍C5脱离并保持其与gp41或C2稳定(以与由所述肽组合诱导的抗体相似的方式)的小分子或结合游离C5并因此使其变为惰性的并且阻碍免疫活化的小分子或抗体。例如，能够使用对应于C2和gp41的与C5相互作用的区域的小分子来抑制这种C5相关的免疫活化。

基于与gp41和/或C2的结构域复合/缀合的HIV-1的C5结构域的疫苗与针对HIV疫苗的传统抗体方法不同，因为被诱导的抗体通常是非中和的。针对HIV疫苗的其他方法涉及更大的抗原，所述更大的抗原以整个gp120、gp41或未被切割的前体gp160为位址。然而，他们不以特异性与 gp41和/或C2复合的C5结构域的区域为位址。

所以，在本发明的第一方面中，提供用于在感染HIV的人中减小和/或延迟人免疫缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括给药有效量的一种或多种药剂，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合。

在第二方面中，提供用于在感染HIV的人体内减小和/或延迟人免疫缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括给药有效量的一种或多种免疫原，所述免疫原诱导稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的抗体。

在第三方面中，提供用于减小发展获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或HIV疾病的风险的方法，所述方法包括给药有效量的一种或多种免疫原，所述免疫原诱导稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的抗体。

在第四方面中，提供用于减小发展获得性免疫缺陷综合征(AIDs)的风险的方法，所述方法包括给药有效量的药剂，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合。

在第五方面中，提供一种肽组合，所述组合包括：

-第一肽，所述第一肽包含HIV gp120的C5结构域的含有0至4个氨基酸取代的13个氨基酸残基氨基酸序列的氨基酸序列，其亚序列，或包含所述氨基酸序列或亚序列的翻转(inverso-)、反向(retro-)或反向-翻转(retro-inverso)形式的氨基酸序列，和

-至少一个第二肽，所述第二肽具有存在于gp41的跨膜结构域或存在于gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段(stretch)，或者具有存在于SEQID NOs.6-13中任一项中的氨基酸片段，或者具有存在于gp41的跨膜结构域或存在于gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段的翻转、反向或反向-翻转形式，

其中所述肽组合能够诱导这样的抗体，所述抗体能够结合并稳定HIVgp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合，而且其中所述肽组合缺少gp120中的C5的N端氨基酸。

在第六方面中，提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含与药用稀释剂或赋形剂以及可选的免疫学佐剂组合的本发明的肽组合。

在第七方面中，提供编码肽组合的核酸片段，所述肽组合包括：

-第一肽，所述第一肽与本发明的肽组合的第一肽是相同的，其具有这样的限制，即所述第一肽中的氨基酸残基是L型的，并且选自由以下各项组成的组：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr，以及

-至少一个第二肽，所述第二肽与本发明的肽组合的第二肽相同，其具有这样的限制，即所述第二肽中的氨基酸残基是L型的，

在第八方面中，提供包含本发明核酸片段的载体。

在第九方面中，提供免疫原性组合物，其包含与药用稀释剂或赋形剂以及可选的免疫学佐剂组合的本发明的核酸片段或载体。

在第十方面中，提供用于确定抗体存在的方法，所述抗体结合由Gp120的C5结构域中的氨基酸以及gp41的跨膜结构域和/或gp120的恒定C2结构域中的氨基酸组成的表位，所述方法包括将可能包含所述抗体的样品与至少一种根据本发明的肽组合接触，并且定量或定性确定所述至少一种肽组合与所述样品中的抗体之间的结合。

在第十一方面中，提供用于确定抗体存在的试剂盒，所述抗体结合由Gp120的C5结构域中的氨基酸以及gp41的跨膜结构域和/或gp120的恒定C2结构域中的氨基酸组成的表位，所述试剂盒包含至少一种本发明的肽组合，用于使液体样品与所述肽组合反应的装置，以及用于确定抗体和所述肽组合之间存在阳性或阴性结合反应的装置。

在第十二方面中，提供用于分离能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的药剂的方法，所述方法包括

-从候选药剂与所述C5结构域和与所述gp41的跨膜结构域和/或所述C2结构域的稳定结合，或从候选药剂与所述C5结构域的替代物和与所述跨膜结构域和/或所述C2结构域的替代物的结合，测试候选药剂取代参比药剂的能力，所述参比药剂之前已经被证实能够稳定所述结合，并且分离能够取代所述参比药剂的那些候选药剂，或者

-测试候选药剂同C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或gp120的C2结构域之间的复合物的替代物结合的能力，并且分离能够与所述替代物发生显著结合的那些药剂。

在第十三方面，提供gp120的C5结构域的类似物，其包含具有式II的氨基酸序列

Y¹-Y²-Y³-Y⁴-Y⁵-Y⁶-Y⁷-Y⁸-Y⁹-Y¹⁰-Y¹¹-Y¹²-Y¹³ (II)

其中Y¹是Thr，Y²选自Lys、Arg、Har(高精氨酸)和Glu，Y³选自Ala和Val，Y⁴选自Arg、Lys、Har和Cit(瓜氨酸)，Y⁵选自Arg、Lys、Har和Cit，Y⁶选自Arg、Har、Lys和Cit，Y⁷选自Val、Leu、Ile和Nle(正亮氨酸)，Y⁸选自Val、Leu、Ile和Nle，Y⁹选自Gln、Glu、Asn和Asp，Y¹⁰选自Arg、Har和Cit，Y¹¹选自Glu和Asp，Y¹²是Lys，而Y¹³选自Arg、Har和Cit，并且其中

Y³是Val和/或其中

Y⁴选自Arg、Har和Cit和/或其中

Y⁵选自Lys和Cit和/或其中

Y⁶选自Lys和Cit和/或其中

Y⁷选自Leu、Ile和Nle和/或其中

Y⁸选自Leu、Ile和Nle和/或其中

Y⁹选自Glu、Asn和Asp和/或其中

Y¹⁰是Cit或者Y¹¹是Asp或者Y¹³是Cit，

或者包含式II的氨基酸序列的至少6个氨基酸残基的亚序列，或者包含所述氨基酸序列或亚序列的翻转、反向或反向-翻转形式。

附图图例

图1：结合的柱状图和线图。线图显示肽溶液A(单独的SEQ ID NO：1)和B(SEQ ID NO 1和6)测量的OD值之间的比率，而柱状图显示SEQ IDNO：1的每个比率区间内的平均应答。误差棒(Error bar)计算作stdev/n的平方根。详见实施例4。

图2：在不同的受试者组中(LTNP、HIV阳性以及献血者)比较对A(单独的SEQ ID NO：1)和B(结合有SEQ ID NO：6的SEQ ID NO：1)的应答。方框(Box)表示四分位数间距。中值由水平线表示。从所述方框的每一端延伸的所述线＝1.5个四分位数间距单位的长度。十字＝超过线的端部的值。

图3：使用不同抗原抑制抗体结合。

所用的抗原：BI400-B、C5(BI400-015)、gp41肽(BI400-201)、C2肽(BI400-201d)、重组gp41。BI301-23是与HIV无关的不相关肽，PBS是不含有肽抗原的磷酸缓冲盐溶液。详见实施例5。

图4：使用来自LTNP的血清，使BI400-B抗体交叉竞争结合C5/gp41。

LTNP-库1是由收集自五名确定的LTNP患者的血清组成的库(pool)。

LTNP-库2是由收集自另外四名确定的LTNP患者的血清组成的库。

BD库是由来自健康献血者的10份血清组成的库。

图5：抗C5/gp41抗体在HIV感染个体中的普遍程度根据病毒载量而不同。

方框(Box)表示四分位数间距。中值由水平线表示。从所述方框的每一端延伸的所述线＝1.5个四分位数间距单位的长度。详见实施例5。

发明的详细公开内容

定义

除非另外说明，当在本公开内容中使用术语诸如“一种(one)”、“一个(a)”或“一个(an)”时，它们是指“至少一个”，或者“一个或多个”。另外，术语“包括(comprising)”意欲指“包含(including)”并且因此除明确说明的那些外还允许出现其他组分、特征、条件或步骤。

“HIV”通常指示人免疫缺陷病毒I。

“HIV疾病”由若个阶段组成，包括本身通常表现为类流感感染的急性HIV感染，以及具有若个非特征症状的早期和中期阶段症状疾病，所述非特征症状诸如皮疹、疲劳、盗汗、轻微体重减轻、口腔溃疡、和由真菌引起的皮肤和指甲感染。大多数HIV感染者在发展出更严重的疾病前将经历诸如这些的轻微的症状。通常认为，最早的轻微症状需要五至七年来显现。随着HIV疾病的进展，一些个体会变得相当不健康，即使他们还未被诊断出患有AIDS(见以下)，HIV疾病的晚期。典型的问题包括慢性口腔或阴道腐烂(vaginal thrush)(真菌引起的疹或斑)，嘴上的复发性疱疹疱(herpesblisters)(感冒疮(cold sores))或生殖器上的复发性疱疹疱，持续的发烧，持久的腹泻，以及显著的体重减轻。“AIDS”是晚期HIV疾病，并且是一种这样的病症，其逐渐地减弱免疫系统的有效性并且使个体易遭受机会性感染和肿瘤。

当本文使用术语“gp120”时，是指gp160的≈120kDa的N端糖蛋白酶切产物，gp160相应地是HIV env基因的唯一表达产物。gp120在传染性HIV病毒体上形成“刺突(spike)”并且与gp41非共价结合。

“gp41”指示≈41kDa的糖蛋白，是gp160的C端酶切产物。gp41定位于HIV感染的细胞内或传染性HIV病毒体中的病毒衣壳内。gp41具有与gp120非共价结合的N端跨膜结构域。本文中把该跨膜结构域称为“gp41的跨膜结构域”或“tm-gp41”。所述术语在其范围内包括如例如在式III中所示的那些序列的天然存在的突变版本。

“C5”或“C5结构域”指示gp120的13个C端氨基酸残基。

“C2”或“C2结构域”指示gp120中的保守区域。C2中的区域与在gp120的内部近端结构域中的C5形成反平行β折叠。

在本文的情形中，“减小和/或延迟HIV的病理学作用”意指使用本发明的方法来提供在根据本发明治疗的HIV感染个体中观察到的发病率的统计学显著减小和/或延迟。换句话说，与非治疗对照相比，AIDS特有的明显疾病症状的发作时间较晚，和/或与未接受本发明治疗的对照相比病理学表现的数量得到减少。

表述“HIV gp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合”是指C5能够与tm-g41和C2中的一种或两种非共价地相互作用。与tm-gp41的相互作用是分子间的，而与C2的相互作用是分子内的。

“能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的药剂”是物质的组合，其防止或在统计学上减少C5从其与gp41的分子间结合和/或从其与C2的分子内结合释放。通常，这种药剂是能够发挥此作用的任何物质，但是重要的实例是抗体，抗体片段，和抗体类似物。然而，对于一方面在C5和tm-gp41和/或另一方面C2之间的复合物具有适当结合亲和性的其他分子，也是依照本发明的药剂——准确的分子形式不如结合特性重要，并且根据本发明同样有可能的是，这种药剂不仅可以是受体或受体类似物，而且还可以是能够充当本发明药剂的小分子稳定剂。

本文中的术语“抗体”在最广义上使用并且特定地包括全长单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，即充当上述药剂。在例如Harlow等(Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988).)中提供了与抗体制备相关的多种技术。

“抗体片段或抗体类似物”包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合或可变区。抗体片段/类似物的实例包括Fab、Fab′、F(ab)₂、F(ab’)₂、F(ab)₃、Fv(典型地抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(典型地VH和CH1结构域)，和dAb(典型地VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体(minibodies)、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体(tetrabodies)和κ抗体(kappa body)(见例如，Ill等，Protein Eng(蛋白质工程)1997；10：949-57)；骆驼IgG；IgNAR；和由抗体片段、和一个或多个分离的CDR或功能互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起，以致形成功能抗体片段。在例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol(自然生物技术)2005；23，1126-1136；WO2005040219，以及公布的美国专利申请20050238646和20020161201中，已经描述或回顾了不同类型的抗体片段。

术语“抗体衍生物”，如在本文中使用的，包括全长抗体或抗体片段，优选地至少包括其抗原结合区或可变区，其中例如为了将所述抗体与第二分子相连，将一个或多个氨基酸化学修饰，例如，通过烷基化、聚乙二醇化、酰基化、形成酯或形成酰胺等进行化学修饰。这包括但不限于，聚乙二醇化抗体、半胱氨酸-聚乙二醇化抗体和其变异体。

如本文所使用的，“缀合物”包括与第二药剂结合或连接的本发明的药剂(诸如抗体衍生物)，所述第二药剂诸如细胞毒性剂、检测剂等。缀合物可以由共价连接的肽组成(缀合物的一个实例是融合肽，所述融合肽包含经由肽键相连的两个肽，以致在所述情况中的缀合物可以是源自核酸片段的表达产物)，而缀合物也可以是通过化学缀合共价相连的肽的组合(常规的实例是使用戊二醛缀合)。更复杂的缀合的另一个实例是其中本发明的药剂或肽组合或其他化学物质与载体分子相连的实例，所述载体分子又与本发明的其他药剂、肽组合或其他化学物质偶联(例如当这种化学物质与聚赖氨酸载体(赖氨酸“树”)结合时)。

“人源化”抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的人/非人嵌合抗体。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体(recipient)抗体)，其中来自接受体高变区的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供体抗体)高变区的残基代替，所述非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物。在一些实例中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含未在接受体抗体或在供体抗体中发现的残基。作出这些修饰以进一步完善抗体表现。通常，人源化抗体将基本上包含所有或至少一个，并且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些残基。人源化抗体也可以可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。进一步的细节见例如，Jones等，Nature(自然)321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol(结构生物学近况).2：593-596(1992)、WO92/02190、美国专利申请20060073137和美国专利6,750,325、6,632,927、6,639,055、6,548,640、6,407,213、6,180,370、6,054,297、5,929,212、5,895,205、5,886,152、5,877,293、5,869,619、5,821,337、5,821,123、5,770,196、5,777,085、5,766,886、5,714,350、5,693,762、5,693,761、5,530,101、5,585,089和5,225,539。

具有参比抗体“生物学特性”的抗体是这样的抗体，其具有使其区别于与相同抗原结合的其他抗体的所述抗体的一种或多种生物学特性。

在本文的情形中，术语“肽”意欲指2至10个氨基酸残基的短肽，11 至100个氨基酸残基的寡肽，和超过100个氨基酸残基的多肽。当提及肽中的氨基酸时，除非提供其他信息，意图是所述氨基酸是L-氨基酸。

“蛋白质”意欲指示包含至少一个肽的功能生物分子；当包含至少两个肽时，这些肽可以形成复合物，所述肽是共价连接的，或者可以是非共价连接的。蛋白质中的多肽可以被糖基化和/或脂化(lipidated)和/或包含辅基。

“肽组合”指示这样的分子，其由至少两个肽以相对彼此非天然的构型组成。实例是来自相同或不同蛋白质的肽，所述肽经由它们的氨基酸中的至少一个的侧链共价相连，或者所述肽经由它们的末端相连(例如经由肽键)但是是以天然中未出现的构型存在。肽组合的典型的实例在以下详述。

肽的“变体”或“类似物”涉及具有与参比肽(典型地天然的或“亲本”多肽)基本相同的氨基酸序列的肽。肽变体在天然氨基酸序列内的特定位置可以具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

“保守”氨基酸取代是其中氨基酸残基被带有具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基取代的那些取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中是已知的，并且包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，带有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守氨基酸取代的特殊形式包括用不在由遗传密码编码的正常的20个氨基酸中的氨基酸取代的那些。因为本发明优选的实施方案需要使用合成肽，所以在本文公开的肽中设置这种“非天然存在的”氨基酸残基是没有问题的，并且因此可能将氨基酸残基侧链中的天然饱和碳链交换为更短或更长的饱和碳链——例如，赖氨酸可以用具有侧链-(CH₂)_nNH₃的氨基酸取代，其中n不是4，而精氨酸可以用具有侧链-(CH₂)_nNHC(＝NH₂)NH₂的氨基酸取代，其中n不是3，等等。相似地，酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸可以用具有侧链-(CH₂)_nCOOH的氨基酸残基取代，其中n＞2。

肽的“反向形式”是肽的这样的形式，其中在N端到C端方向上氨基酸的顺序已经被颠倒。例如，ALDFR的反向形式是肽RFDLA。

“翻转”形式的特征为下述事实：翻转形式中的每个氨基酸与肽中相对应的氨基酸相比处于相反的立体化学构型。因此，如果所述肽由L-氨基酸组成，则翻转形式由D-氨基酸组成。

肽的“反向-翻转”形式是肽的这样的形式，其既是翻转形式又是反向形式。L-ala-L-Arg-L-Lys的反向-翻转形式是D-Lys-D-Arg-D-ala。

在两个氨基酸序列的情形中，术语“基本相同”是指当被最优化比对时，诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认缺口权重(gap weight)比对时，所述序列享有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一个实施方案中，不相同的残基位置差别在于保守氨基酸取代。典型地使用序列分析软件测量序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给不同取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性测量匹配相似的序列。例如，公共可用的GCG软件包含程序诸如“Gap”和“BestFit”，可以以默认参数使用所述软件来确定紧密相关的多肽(诸如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。见，例如，GCG版本6.1。也可以使用FASTA或ClustalW，使用默认或推荐参数比较多肽序列。GCG版本6.1.中的程序，FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)给出查询和检索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.(酶学方法)1990；183：63-98；Pearson，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)2000；132：185-219)。当将序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库比较时，或者当推断时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是blastp。见，例如，Altschul等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)1990；215：403-410；Altschul等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)1997；25：3389-402(1997)；所述文献各自通过引用结合于此。在两个基本相同的氨基酸序列中，“相对应的”氨基酸位置是通过本文中提及的蛋白质分析软件中的任一个(典型地使用默认参数)比对的那些。

术语“亚序列”通常指分别直接源自天然存在的氨基酸序列或核酸序列的至少3个氨基酸或当相关时至少3个核苷酸的任何连续的片段。然而，当讨论本发明的肽组合时，亚序列可以短至1或2个氨基酸。这是因为本发明的肽组合包括来自不同肽结构域的氨基酸，在所述肽结构域中所述氨基酸一起至少形成抗体的构象表位。因此，这种构象表位可以由来自C5的4个氨基酸、来自tm-gp41的仅仅1或2个氨基酸组成——此处重要的是，此源自2个结构域的结合的表位能够被稳定，即体内结合到相同表位的抗体将稳定C5和TM-gp41和/或C2之间的构型。

当其被放置到与另一个核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地相连的”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与所述多肽的DNA是可操作地相连的；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与所述序列是可操作地相连的；或者如果核糖体结合位点被放置成促进翻译，则它与编码序列是可操作地相连的。通常，“可操作地相连的”是指所连接的DNA序列是邻接的，并且，在分泌前导区的情况中，是邻接的并且在阅读相中(reading phase)。然而，增强子不必须是邻接的。通过在常规限制性位点的连接作用来实现相连。如果这种位点不存在，按照常规惯例使用合成的寡核苷酸衔接子或连接体。

“分离的”分子是这样的分子，所述分子在其中它被发现的组合物中相对于它所属的分子种类是占优势的种类(即，它在组合物中组成所述类型分子的至少约50％，并且在组合物中典型地将组成所述种类分子(例如肽)的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。一般，抗体分子的组合物在所述组合物中所有存在的肽种类的背景下，或至少在被提议的用途的背景下相对基本上有活性的肽种类，将显示98％～99％的抗体分子同质性。

在本发明的情形中，除非与上下文矛盾，“治疗(treatment或treating)”涉及预防、缓和、处理、治愈或减轻一种或多种症状或疾病或病症的临床相关的表现。例如，对其中未鉴定出症状或疾病或病症的临床相关表现的患者的“治疗”是预防的或预防性的疗法，而对其中鉴定出症状或疾病或病症的临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防的或预防性的疗法。

术语抗原指示这样的物质，其被免疫系统的特异性识别成分(抗体、T细胞)识别。

在本文的情形中，术语“免疫原”意欲指示这样的物质，所述物质能够诱导个体中的适应性免疫应答，其中所述适应性免疫应答靶向所述免疫原。涉及本发明，免疫原将诱导与所述免疫原反应的抗体。换言之，免疫原是能够诱导免疫性的抗原。

术语“表位”、“抗原决定簇”和“抗原位点”在本文中被可互换地使用并且指示抗原或免疫原中这样的区域，所述区域被抗体识别(在抗体结合表位的情况中，也称为“B细胞表位”)或者当表位复合到MHC分子时被T细胞受体识别(在T细胞受体结合表位(即“T细胞表位”)的情况中)。

术语“免疫原性有效量”具有其在本领域中的通常含义，即能够诱导免疫应答的免疫原的量，所述免疫应答显著地约束(engage)与所述免疫原享有免疫学特性的病原体。

术语“疫苗”用于这样的组合物，其包含免疫原并且能够诱导能够减小发展病理学病况的风险的免疫应答，或者能够诱导可以帮助治愈病理学病况(或至少减轻病理学病况的症状)的治疗有效的免疫应答。

术语“药用”具有其在本领域中的通常含义，即它用于这样的物质，当治疗所讨论的疾病时，其可以作为人用药物的一部分被接受，并且因此该术语有效地排除了使用将恶化而不是改善受治疗的受试者病况的高毒性物质。

“T辅助淋巴细胞表位”(T_H表位)是这样的肽，其结合MHC II类分子并且可以在与MHC II类分子结合的抗原递呈细胞(APC)的表面上呈递。“免疫学载体”通常是这样的物质，其包含一个或很多个T_H表位，并且通过保证T辅助淋巴细胞被活化并且增殖来增加针对与其偶联的抗原的免疫应答。已知的免疫学载体的实例是破伤风和白喉类毒素以及匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)。

术语“佐剂”具有其在疫苗技术领域中的通常含义，即这样的物质或物质的组合物：1)其自身不能引发针对疫苗中的免疫原的特殊的免疫应答，但是2)尽管如此，其能够加强针对所述免疫原的免疫应答。或者，换言之，单独用佐剂接种不提供针对所述免疫原的免疫应答，用免疫原接种可以或不可以产生针对所述免疫原的免疫应答，但是用免疫原和佐剂结合地接种诱导针对所述免疫原的免疫应答，其强于由所述免疫原单独诱导的免疫应答。

发明具体的实施方案

第一和第四方面

本发明的第一方面涉及用于在感染HIV的人中减小和/或延迟人免疫缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括给药有效量的药剂，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合。第四方面很相似，但是涉及用于减小发展获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的风险的方法，所述方法包括给药有效量的药剂，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合。

这些方面主要的目标在于：用能够模拟(根据本发明)HIV感染长期不进展者所特有的抗体的药剂治疗HIV感染个体——这是作为本发明基础的发现的最直接的治疗用途。其中所述第一方面的目标在于减小HIV的病理学作用或延长发展为明显的AIDS所需的时间，而所述第四方面的目标在于完全地减小发展AIDS的风险并且可以因此用于目前使用抗反转录病毒疗法预防性地治疗的个体。

在一个实施方案中，本发明第一方面中的药剂是这样的分子，其包含至少一个独立地选自来源于gp41的跨膜结构域的氨基酸序列和来源于C2结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述至少一个氨基酸序列结合C5结构域并且包含至少一个D-氨基酸；在某些实施方案中，所述氨基酸序列中的所有氨基酸是D-氨基酸。所述分子优选地是肽，并且在某些实施方案中此肽由至少一个氨基酸序列组成。所述氨基酸序列典型地包含至多10个氨基酸残基，诸如至多9个、至多8个、至多7个、至多6个和至多5个氨基酸残基。因此，优选的分子是具有4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的肽。因此，所述至少一个分子的具体的实施方案是具有或包含SEQ ID NO：34、35、36、37、39、40、42、43和45的肽，所有所述序列可以部分或全部由D-氨基酸组成。同样，包含具有式III的肽的分子是所述至少一个分子的有趣的实施方案。

在一个实施方案中，本发明第一方面的药剂选自抗体、抗体片段或抗体类似物。抗体可以是完全的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，或其衍生物。典型地，抗体是IgA、IgD、IgG、IgE或IgM——抗体可以是单克隆和多克隆两者。抗体片段典型地选自Fab片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼(llama)或骆驼Ig)、V_HH片段、单结构域FV，以及单链抗体片段，而抗体类似物典型地选自scFV、dsFV、微型抗体、双链抗体、三链抗体、κ抗体、IgNAR、tandAb、BiTE、和多特异性抗体。

在本发明第一方面的一个实施方案中，所述药剂结合并稳定氨基酸片段TZ¹AKRRVVZ²REKR(其中Z¹是K、R或E并且其中Z²是Q或E)中的一个或多个氨基酸残基，与在gp41的跨膜结构域和/或在gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段中的一个或多个氨基酸残基之间的结合。此源自C5的氨基酸片段在已知的多个HIV进化枝间是高度保守的，并且因此通过所述药剂与该片段的有效相互作用被认为是非常有优势的。

第二和第三方面

本发明的第二方面涉及用于在感染HIV的人中减小人免疫缺陷病毒I(HIV)的风险或减小和/或延迟人免疫缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括给药有效量的免疫原，所述免疫原诱导稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的抗体，而第三方面涉及使用相同手段的预防性方法。换言之，第二方面涉及治疗性主动免疫疗法，而第三方面涉及对HIV疾病(包括AIDS)的预防性免疫疗法。这也需要对HIV感染的预防。

这些特别的方面基于这样的认识：在一般的HIV感染个体中诱导与在HIV LTNP个体中发现的抗体相同的类型的抗体所有组成成分是可行的。通过在C5和tm-gp41(和/或C2)两者中谨慎地选择肽区域以便制备模拟存在于HIV中的由这些区域组成的抗体结合表位的肽组合，变得可能的是制备将诱导所需免疫性的疫苗——有趣的是，此方法的目标不在于接种从而获得传统意义上的中和抗体。

在一个实施方案中，免疫原选自：以下在讨论本发明的第五方面时详述的肽组合，以下在第六方面中详述的组合物，与第七方面相关地讨论的核酸片段，作为第八方面讨论的病毒或质粒载体，或者在第九方面中讨论的质粒或病毒组合物。

方面1-4的共同之处是它们都包括这样的实施方案，其中C5结构域与C2和/或gp41的跨膜结构域之间的靶向结合涉及序列TZ¹AKRRVVZ²REKR(其中Z¹是K、R或E并且其中Z²是Q或E)中的至少一个氨基酸，并且涉及在gp41的跨膜结构域中的至少一个氨基酸或在gp120的恒定C2结构域中的至少一个氨基酸。如上所述，该特别的序列在已知的HIV进化枝之间是极端保守的，并且因此将靶向该序列与tm-gp41或C2之间的相互作用是最可行的。

第五方面

第五方面涉及肽组合，所述组合包括：

-第一肽，所述第一肽包含HIV gp120的C5结构域的含有0至4个氨基酸取代的13个氨基酸残基氨基酸序列的氨基酸序列，其亚序列，或包含所述氨基酸序列或亚序列的翻转、反向或反向-翻转形式的氨基酸序列，和

-至少一个第二肽，所述第二肽包含存在于gp41的跨膜结构域或存在于gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段，或者包含存在于SEQ ID NOs.6-13中任一项中的氨基酸片段，或者包含存在于gp41的跨膜结构域或存在于gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段的翻转、反向或反向-翻转形式，

换言之，第五方面涉及这样的肽组合，所述肽组合与表征在一方面C5和tm-gp41和/或另一方面C2中的相互作用区域的表位在3维上类似。根据本发明，这些肽组合是有用的免疫原，其能够诱导这样的抗体，所述抗体与在HIV LTNP个体中发现的抗体具有相同的性质，但是所述肽组合也有希望作为诊断/预测工具。包含反向、翻转和反向-翻转的肽(除其他以外)使能够制备蛋白水解稳定的肽，以及与HIV对应物相比是真正外源的肽。

在所述肽组合的一个实施方案中，所述第一肽包含具有式I的氨基酸序列：

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³ (I)

其中X¹是Thr，X²选自Lys、Arg、Har和Glu，X³选自Ala和Val，X⁴选自Arg、Har、Lys和Cit(瓜氨酸)，X⁵选自Arg、Har、Lys和Cit，X⁶选自Arg、Har、Lys和Cit，X⁷选自Val、Leu、Ile和Nle(正亮氨酸)，X⁸选自Val、Leu、Ile和Nle，X⁹选自Gln、Glu、Asn和Asp，X¹⁰选自Arg、Har和Cit，X¹¹选自Glu和Asp，X¹²是Lys，而X¹³选自Arg、Har和Cit，

或者包含式I氨基酸序列的亚序列，或者包含所述氨基酸序列或亚序列的翻转、反向或反向-翻转形式。所述第一肽可以进一步包含与具有式I的氨基酸序列的N端相连的二肽Ala-Pro，和/或所述第一肽可以进一步包含与具有式I的氨基酸序列的C端相连的二肽X¹⁴-X¹⁵，其中X¹⁴选自Ala和Val，并且其中X¹⁵选自Val、Leu和Nle。

源自C5的尤其有趣的肽在实施例导言中得到陈述，并且组成本发明肽组合的第一肽的实施方案。

已经观察到gp41和gp120的若干天然存在的突变体，所以当陈述所述第二肽包含存在于gp41的跨膜结构域或存在于gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段时，这意欲指示所述氨基酸片段以任何这种天然存在的方式存在。所以，所述至少第二肽，当源自gp41时，在某些实施方案中是这样的肽，其包含具有下式的氨基酸序列：

Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶-Z⁷-Z⁸-Z⁹-Z¹⁰-Z¹¹-Z¹²-Z¹³-Z¹⁴-Z¹⁵-Z¹⁶-Z¹⁷ (III)

其中Z¹是Asp，Z²是Arg，Z³是Pro，Z⁴是Glu或Gly，Z⁵是Gly或Arg，Z⁶是Ile，Z⁷是Glu，Z⁸是Glu，Z⁹是Glu，Z¹⁰是Gly，Z¹¹是Gly，Z¹²是Glu或不存在，Z¹³是Arg或Gln，Z¹⁴是Asp或Gly，Z¹⁵是Arg或Lys，Z¹⁶是Asp或Gly而Z¹⁷是Arg，

或者包含式(III)的亚序列，诸如具有至少5个氨基酸残基(诸如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12 个、至少13个、至少14个、至少15个和至少16个氨基酸残基)的亚序列。此外，所述第二肽的这个实施方案可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代导致与在gp41中发现的对应氨基酸序列至少80％的序列同一性。

源自C20和gp41的尤其有趣的肽在实施例导言中得到陈述，并且组成本发明肽组合的第二肽的实施方案。

在所述肽组合的某些实施方案中，所述第一肽和所述至少一个第二肽经由连接体结合；所述连接体可以是任何肽连接体，诸如甘氨酸、赖氨酸或精氨酸连接体，聚组氨酰标签、蛋白G以及蛋白A，但是也可能使用双马来酰亚胺连接体、二硫化物连接体或聚乙二醇(PEG)连接体。实际上，在肽化学中发现的任何有用的连接体也可以用作根据本发明的连接体。因此，本发明预期不仅使用彼此缀合或融合的“简单”线性肽，而且还使用其中源自C5与gp120或gp41的其他区域的个体肽经由非肽连接体相连的肽组合，所述非肽连接体例如互补核酸、核酸衍生物或类似物例如PNA、LNA。多个连接体类型的使用也在本发明的范围内，并且例如使用包含链内二硫化物连接体的线性肽也是本发明的部分。

本发明尤其有趣的肽组合在实施例导言中得到陈述。

在某些实施方案中，肽组合中的第一肽和至少一个第二肽中的至少一个包含N或C端修饰，诸如酰胺化、酰化或乙酰化。

因为所述肽组合被预期作为疫苗剂或诊断剂，所以在某些实施方案中它们偶联到载体分子上，诸如免疫原性载体。因此所述肽组合的肽可以作为重组融合(例如经由CLIP技术)或以定向(例如使用异双官能(heterobifunctional)交联剂)或非定向的方式通过化学键与其他分子相连。根据本发明，与载体分子诸如例如白喉毒素、乳胶珠(在诊断和预测实施方案中是方便的)和磁性珠(在诊断和预测实施方案中也是方便的)、聚赖氨酸构建体等的连接都是可能的。

免疫原性载体常规上选自载体蛋白，诸如在本领域中常规使用的那些(例如白喉或破伤风类毒素、KLH等)，但是也可能使用能够在更大比例的群体中诱导T细胞免疫性的更短的肽(T辅助表位)。关于这种T辅助表位的细节可以在例如WO 00/20027中找到，其通过本文中的引用结合于此——其中讨论的所有免疫学载体和“泛宿主性的(promiscuous)”(即通用的)T辅助表位在本发明中作为免疫原性载体都是有用的。

在某些实施方案中，所述载体是病毒样颗粒，即与病毒体共享性质而不具有传染性的颗粒。这种病毒样颗粒可以通过化学方法(例如Jennings和Bachmann，Ann Rev Pharmacol.Toxicol.(药理学和毒理学年鉴)2009.49：303-26 Immunodrugs：Therapeutic VLP-based vaccines for chronic diseases(免疫药物：用于慢性疾病的基于VLP的治疗性疫苗))或使用克隆技术以产生融合蛋白(例如Peabody等J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)2008；380：252-63.Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2(RNA噬菌体MS2的病毒样颗粒上的不同肽的免疫原展示))提供。另一个实例是“Remune”，一种最初由Immune Response Corporation(免疫应答公司)制备的HIV疫苗，其由福尔马林灭活的、已经被辐射从而破坏病毒基因组的HIV组成。该公司的创始人是Jonas Salk，其使用相同技术产生目前广泛使用的已杀死的脊髓灰质炎疫苗。然而，一旦HIV固定，gp120掉落，只留下gp41在病毒体的表面上。这使直接混合本文公开的源自C5的肽和Remune颗粒成为可能，因为应当仍然可能在Remune颗粒上获得C5和gp41间的结合。

第五方面的实施方案也包括那些，其中所述第一肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：1、2、3、4和5或其片段，或者选自SEQ ID NO：1、2、3、4和5或其片段的肽的翻转、反向或反向-翻转形式，并且其中所述第二肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13或46或其片段，或者选自SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13或46或其片段的肽的翻转、反向或反向-翻转形式。如上所提及，在这种情况中，所述片段可以非常短，只要所述肽组合提供诱导将稳定C5与gp41和/或C2间结合的抗体的能力。本发明若干有趣的肽组合列于实施例导言中。

在实施方案中，本发明的肽组合包含至多70个氨基酸，诸如最多69个、至多68个、至多67个、至多66个、至多65个、至多64个、至多63个、至多62个、至多61个、至多60个、至多59个、至多58个、至多57个、至多56个、至多55个、至多54个、至多53个、至多52个、至多51个、至多50个、至多49个、至多48个、至多47个、至多46个、至多45个、至多44个、至多43个、至多42个、至多41个、至多40个、至多39个、至多38个、至多37个、至多36个、至多35个、至多34个、至多33个、至多32个、至多31个、至多30个、至多29个、至多28个、至多27个、至多26个、至多25个、至多24个、至多23个、至多22个、至多21个、至多20个、至多19个、至多18个、至多17个、至多16个、至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个和至多7个氨基酸。

在实施方案中，本发明的肽组合包含至少6个氨基酸残基，诸如至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个、至少51个、至少52个、至少53个、至少54个、至少55个、至少56个、至少57个、至少58个、至少59个、至少60个、至少61个、至少62个、至少63个、至少64个、至少65个、至少66个、至少67个、至少68个和至少69个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明的肽组合由6个氨基酸残基或7个氨基酸残基或8个氨基酸残基或9个氨基酸残基或10个氨基酸残基或11个氨基酸残基或12个氨基酸残基或13个氨基酸残基或14个氨基酸残基或15个氨基酸残基或16个氨基酸残基或17个氨基酸残基或18个氨基酸残基或19个氨基酸残基或20个氨基酸残基或21个氨基酸残基或22个氨基酸残基或23个氨基酸残基或24个氨基酸残基或25个氨基酸残基或26个氨基酸残基或27个氨基酸残基或28个氨基酸残基或29个氨基酸残基或30个氨基酸残基或31个氨基酸残基或32个氨基酸残基或33个氨基酸残基或34个氨基酸残基或35个氨基酸残基或36个氨基酸残基或37个氨基酸残基或38个氨基酸残基或39个氨基酸残基或40个氨基酸残基或41个氨基酸残基或42个氨基酸残基或43个氨基酸残基或44个氨基酸残基或45个氨基酸残基或46个氨基酸残基或47个氨基酸残基或48个氨基酸残基或49个氨基酸残基或50个氨基酸残基或51个氨基酸残基或52个氨基酸残基或53个氨基酸残基或54个氨基酸残基或55个氨基酸残基或56个氨基酸残基或57个氨基酸残基或58个氨基酸残基或59个氨基酸残基或60个氨基酸残基或61个氨基酸残基或62个氨基酸残基或63个氨基酸残基或64个氨基酸残基或65个氨基酸残基或66个氨基酸残基或67个氨基酸残基或68个氨基酸残基或69个氨基酸残基或70个氨基酸残基组成。

本发明的第六方面

此方面涉及免疫原性组合物(诸如疫苗组合物)，所述免疫原性组合物包含与药用稀释剂或赋形剂以及可选的免疫学佐剂组合的、在第五方面中描述的肽组合。

免疫原性组合物的制备包括使用现有技术的成分诸如免疫学佐剂。除了以下详述的这些佐剂，如在本领域中通常教导的那样制备免疫原性组合物：

包含肽序列作为活性成分的疫苗的制备在本领域中通常是被充分理解的，如由全部通过引用结合于此的美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；以及4,578,770所示范的。典型地，这种疫苗被制备成可注射的液体溶液或混悬液；也可以制备成适于在注射前溶于或悬浮于液体的固体形式。所述制剂也可以被乳化。活性免疫原性成分通常与药用的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂有，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合物。此外，如果需要，所述疫苗可以包含少量的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，或者加强所述疫苗效力的佐剂；参见以下对佐剂的详细讨论。

常规上通过注射肠胃外给药所述疫苗，例如，皮下、皮内、真皮内、真皮下或肌肉内给药。适于其他给药方式的另外的制剂包括栓剂以及，在一些情况中，口服、含服、舌下、腹膜内、阴道内、肛门、硬膜外、脊髓和颅内制剂。对于栓剂，常规的粘合剂和载体可以包括，例如，聚烷撑乙二醇或甘油三酯；这种栓剂可以由包含0.5％～10％(优选地1～2％)范围内的活性成分的混合物制成。口服制剂包括通常采用的赋形剂，诸如，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用以下形式：溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末，并且包含10～95％的活性成分，优选地25～70％。

所述肽和肽组合可以以中性或盐的形式被配制到疫苗中。药用盐包括酸加成盐(与所述肽的游离氨基形成的)并且其是与无机酸诸如例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱诸如，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

以与剂量制剂相容的方式，并且以将是治疗有效的和产生免疫性的剂量，给药所述疫苗。给药量取决于待治疗的受试者，包括，例如，要发生免疫应答的个体免疫系统的能力，和所需的免疫性程度。合适的剂量范围是在这样的级别，即每次接种数百微克的活性成分，其具有大约0.1μg～2,000μg的优选的范围(即使考虑在1～10mg范围内的更高的量)，诸如在大约0.5μg～1,000μg的范围内，优选地在1μg～500μg的范围内，并且尤其是在大约10μg～100μg的范围内。初始给药和加强注射的合适方式也是不同的，但是典型的是初始给药，然后随后接种或其它给药。

所述肽和肽组合中的一些在疫苗中有足够的免疫原性，但是对于另一些，如果所述疫苗进一步包含佐剂物质，所述免疫应答将得到增强。因此本文所述的免疫原性分子可以与佐剂配制在一起：

待组合的佐剂已知诱导体液应答并且包括：i)盐混悬液(例如各种包含铝离子或钙离子的盐)，ii)水包油乳剂(例如各种基于角鲨烷或基于角鲨烯的乳剂)，iii)油包水乳剂(例如Montanide ISA51或ISA720)，iv)中性脂质体，v)阳离子脂质体，vi)微球体，vii)免疫刺激性复合物(例如ISCOMs或ISCOMATRIX)，viii)模式识别受体激动剂(例如以下各项的激动剂：C型凝集素受体(CLR)、类NOD受体(NLR)、RIG样解旋酶(RLH)、表达在骨髓细胞上的触发受体(TREM)和Toll样受体(TLR))，ix)皂苷(即，源自皂树(Quillaja saponaria)或桔梗(Platycodon grandiflorum)的任何皂苷)，x)病毒颗粒/病毒样颗粒(例如)，xi)肠毒素(即霍乱毒素、CTA1-DD或大肠杆菌(Esherichia coli)不耐热肠毒素)，及其组合物。

获得疫苗的佐剂作用的不同方法因此是已知的。一般原理和方法详述于“The Theory and Practical Application of Adjuvants(佐剂的理论和实际应用)”，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(编辑)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN0-471-95170-6，并且也详述于“Vaccines：New Generationn Immunological Adjuvants(疫苗：新一代免疫学佐剂)”，1995，Gregoriadis G等(编辑)，PlenumPress，纽约，ISBN 0-306-45283-9，所述两篇文献通过本文中的引用结合于此，而且许多最近的出版物也涉及佐剂合并技术：Roestenberg M等，PLoS One.2008；3(12)：e3960.Epub 2008年12月18日；Relyveld E和Chermann JC，Biomed Pharmacother(生物医药和药物疗法).1994；48(2)：79-83；Hsu FJ等，Blood(血液).1997年5月1日；89(9)：3129-35；Galli G等，Proc Natl Acad Sci USA(美国科学院院报).2009年5月12日；106(19)：7962-7.Epub 2009年4月27日；Bojang KA等，Lancet(柳叶刀).2001年12月8日；358(9297)：1927-34；Odunsi K等，Proc Natl Acad SciUSA(美国科学院院报).2007年7月31日；104(31)：12837-42.Epub 2007年7月25日；Patel GB和Sprott GD；Crit Rev Biotechnol.(生物技术述评)1999；19(4)：317-57.综述；Agger EM等，PLoS One.2008年9月8日；3(9)：e3116；Kirby DJ等J Drug Target.(药物靶点杂志)2008年5月；16(4)：282-93；Florindo HF等，Vaccine(疫苗).2008年8月5日；26(33)：4168-77.Epub 2008年6月17日；Sun HX等，Vaccine(疫苗).2009年5月28日；Guy B，Nat Rev Microbiol.(自然-微生物学综述)2007年7月；5(7)：505-17.综述.；Vandepapelière P等，Vaccine(疫苗).2008年3月4日；26(10)：1375-86.Epub 2008年1月14日；Ghochikyan A等Vaccine(疫苗).2006年3月20日；24(13)：2275-82.Epub 2005年12月5日；Xie Y等，Vaccine(疫苗).2008年6月25日；26(27-28)：3452-60.Epub 2008年5月1日；Chung YC等，Vaccine(疫苗).2008年3月28日；26(15)：1855-62.Epub 2008年2月25日；Maier M等，Vaccine(疫苗).2005年10月25日；23(44)：5149-59；Sundling C等，J Gen Virol.(普通病毒学杂志)2008年12月；89(Pt12)：2954-64。

本发明的第七方面

此方面涉及编码本发明肽组合的亚组(subset)的核酸片段，即可以作为一个单个表达产物或2个或更多个表达产物(其可以结合)由原核或真核细胞表达的那些。因此，根据此方面，提供编码肽组合的核酸片段，所述肽组合包含：

-如上所述的第一肽，其具有这样的限制，即所述第一肽中的氨基酸残基是L型的，并且选自由以下各项组成的组：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Iys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr，以及

-如上所述的至少一个第二肽，其具有这样的限制，即所述第二肽中的氨基酸残基是L型的，

在实施方案中，此核酸片段是这样的一个，其中编码的第一肽和编码的至少一个第二肽经由肽连接体和/或二硫键结合。所述肽连接体典型地选自由以下各项组成的组：甘氨酸连接体、赖氨酸连接体、甘氨酸-赖氨酸连接体和Arg连接体，但是可以使用本领域中已知的任何肽连接体。因此术语肽连接体也意欲指示所述第一肽和第二肽之间经由肽键的偶联。同样，所述第一肽和第二肽可以经由肽连接体和二硫键相连，当链内二硫键形成时就是这样。

在一个实施方案中，所述核酸片段编码这样的肽组合，所述肽组合偶联(通过融合)到载体分子上，诸如免疫原性载体；有用的载体在上文讨论。

在一个实施方案中，本发明的核酸片段编码这样的肽，所述肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、28、30、38、41和44，或其片段，并且编码选自由以下各项组成的组的第二肽：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、29、31、33、37、39、40、42、43、45和46或其片段。

在实施方案中，所述核酸片段编码这样的肽组合，所述肽组合包含至多70个氨基酸。在实施方案中，所述核酸片段编码这样的肽组合，所述肽组合包含至少6个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的核酸片段编码这样的肽组合，所述肽组合由选自由以下各项组成的组的数目的氨基酸残基组成：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70个氨基酸残基。

第八方面

本发明还涉及包含根据本发明第七方面的核酸片段的载体。在本文中术语载体被理解为能够携带遗传信息并且可以将此遗传信息递送到细胞中的试剂。典型的载体选自由以下各项组成的组：质粒、病毒、噬菌体、黏端质粒和微型染色体。

载体能够以以下形式存在：克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)，和表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体典型地将包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

因此本发明的核酸片段通常将被插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体；这种新载体也是本发明的一部分。涉及构建本发明的这些载体的细节将在以下转化的细胞和微生物的上下文中讨论。根据应用的目的和类型，所述载体不仅能够处于以下形式：质粒、噬菌体、黏端质粒、微型染色体或病毒，而且只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体。本发明优选的克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。

本发明表达载体的概要包括在5′-＞3′方向上和在可操作连接中的以下特征：用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌(至细胞外相，或者适用时，分泌到周质中)或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，出于转化细胞遗传稳定性的考虑，优选的是载体当引入到宿主细胞中时，所述载体整合到宿主细胞的基因组中。相反，当使用用于影响动物中体内表达的载体时(即当在DNA接种中使用载体时)，出于安全原因，优选的是所述载体不能被整合到宿主细胞基因组中；典型地，使用裸DNA或非整合病毒载体，对所述裸DNA或非整合病毒载体的选择对于本领域技术人员是众所周知的。

本发明的表达载体用于转化宿主细胞以产生本发明的肽组合。这种转化细胞，其也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的肽组合的培养细胞或细胞系。备选地，所述转化细胞可以是合适的活疫苗株，其中所述核酸片段(一个单独的或多个拷贝)已经插入以致影响所述肽组合分泌或整合到细菌的膜或细胞壁上。

本发明优选的转化细胞是微生物诸如细菌(诸如埃希菌属(Escherichia)[例如大肠杆菌]、芽孢杆菌属(Bacillus)[例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)]，沙门氏菌属(Salmonella)，或分支杆菌(Mycobacterium)[优选地非致病性的，例如牛分支杆菌(M.bovis)BCG])，酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，和原生动物。备选地，所述转化细胞来自多细胞生物诸如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。最优选的是来自人类的细胞，参见以下对细胞系和载体的讨论。

为了克隆和/或最优化表达，优选的是所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。表达所述核酸片段的细胞是本发明优选的有用的实施方案；它们可以用于小规模或大规模制备本发明的肽组合或者，在非致病细菌的情况中，用作活疫苗中的疫苗成分。

当借助转化细胞重组制备本发明的肽组合时，方便的是(尽管远非必要)所述表达产物被输出到培养基中或被携带在所述转化细胞的表面。

当已经鉴定出有效的生产细胞时，在它的基础上，优选的是建立稳定的细胞系，所述稳定的细胞系携带本发明的载体并且表达本发明的核酸片段。优选地，此稳定的细胞系分泌或携带肽表达产物，因此促进其纯化。

通常，包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体连同宿主一起使用。所述载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，典型地使用源自大肠杆菌种的质粒 pBR322转化大肠杆菌(见，例如，Bolivar等，1977)。pBR322质粒包含氨苄青霉素和四环素抗性基因并且因此为鉴别转化的细胞提供容易的方法。pBR质粒或其他微生物质粒或噬菌体必须也包含，或者被修饰成包含，能够被原核微生物用于表达的启动子。

在重组DNA构建中最通常使用的那些启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1979；EP-A-0 036 776)。虽然这些是最通常使用的，但是其他微生物启动子已经被发现和使用，并且涉及它们核苷酸序列的细节已经被公布。

除了原核生物，也可以使用真核微生物诸如酵母培养物，并且这里启动子也应当能够驱动表达。在真核微生物中，尽管许多其他菌株是通常可用的，酿酒酵母或普通的面包酵母是最通常使用的。例如，质粒YRp7通常被用于在酵母中表达(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。

酵母载体中的合适的启动序列包括以下酶的启动子：3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其他糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适的表达质粒中，与这些基因有关的终止序列也被结合到表达载体中欲表达序列的3′以提供mRNA的聚腺苷酸化和终止。

具有转录受生长条件控制的额外优势的其他启动子是以下酶的启动子区域：乙醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶，和前述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及负责利用麦芽糖和半乳糖的酶。包含酵母相容的启动子、复制起点和终止序列的任何质粒载体都是合适的。

除了微生物，来源于多细胞生物体的细胞培养物也可以用作宿主。原则上，不论来自脊椎动物还是无脊椎动物培养物，任何这种细胞培养物都是可用的。这种有用的宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138、BHK、COS-7293、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF)细胞、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞系(诸如Schneider 2(S₂))，和MDCK细胞系。

用于这种细胞的表达载体通常包括(如果必要)复制起点，位于要表达的基因前方的启动子，连同任何必要的核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点，以及转录终止子序列。

为了在哺乳动物细胞中使用，所述表达载体上的控制功能常常由病毒物质来提供。例如，通常使用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2和最经常的猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子尤其有用，因为所述两者容易作为也包含SV40病毒复制起点的片段从所述病毒获得(Fiers等，1978)。也可以使用更小或更大的SV40片段，条件是其包含有位于所述病毒复制起点的从HindIII位点向BglI位点延伸的大约250bp的序列。此外，也有可能并且常常需要的是使用与所需基因序列通常相关的启动子或控制序列，条件是这种控制序列与宿主细胞系统相容。

复制起点可以由载体的构建提供从而包含外源起点，诸如可以源自SV40或其他病毒(例如，其他多瘤病毒、Adeno、VSV、BPV)，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供。如果所述载体被整合到宿主细胞染色体中，后一种通常是足够的。

第九方面

如上所述，本发明的核酸片段或载体其本身可以适于作为免疫药剂(例如疫苗剂)，即以包含与药用稀释剂或赋形剂以及可选的免疫学佐剂组合的本发明的核酸片段或载体的免疫原性组合物的形式。

作为基于肽的疫苗的常规给药的替代方案，核酸接种技术(也被称为“核酸免疫”、“遗传免疫”和“基因免疫”)提供许多有吸引力的特性。

首先，与常规疫苗方法不同，核酸接种不需要消耗资源的大规模免疫原性药剂制备(例如以工业规模的微生物发酵或大规模肽合成的方式)。此外，不需要为免疫原设计纯化和重折叠方案。并且最后，因为核酸接种依赖于接种个体的生化器官以便产生被引入的核酸的表达产物，所以预期发生对表达产物的最佳翻译后加工。

在此实施方案中，被引入的核酸优选地是可以处于以下形式的DNA：裸DNA、与带电荷或不带电荷的脂质配制在一起的DNA、配制在脂质体中的DNA、包含在病毒载体中的DNA、与转染辅助蛋白或多肽配制在一起的DNA、与靶向蛋白或多肽配制在一起的DNA、与钙沉淀剂配制在一起的DNA、偶联到惰性载体分子上的DNA、包封在聚合物中的DNA，例如在PLGA中(参见在WO 98/31398中描述的微囊化技术)或在壳多糖或脱乙酰壳多糖中，以及与佐剂配制在一起的DNA。在本文中要注意，实际上所有关于在常规疫苗制剂中使用佐剂的考虑适用于DNA疫苗制剂。因此，本文中涉及在基于多肽的疫苗的情形下使用佐剂的所有公开内容适用于(加以必要的变更)它们在核酸接种技术中的应用。

至于以上已经详述的基于多肽的疫苗的给药路径和给药方案，这些也可以应用于本发明的核酸疫苗，并且以上关于多肽的给药途径和给药方案的所有讨论适用于(加以必要的变更)核酸。对此应当补充的是，核酸疫苗也可以在静脉内以及在动脉内给药。此外，本领域中众所周知的是，核酸疫苗可以通过使用所谓基因枪和/或电穿孔给药，并且因此这些及等价的给药模式也被看作是本发明的一部分。

在通常情形中，核酸片段以其中表达在病毒启动子控制下的载体的形式引入。对于根据本发明的载体的更详细的讨论，参见以上讨论。同样，涉及核酸疫苗的制备和使用的详细的公开是可获得的，参见Donnelly JJ等，1997，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年鉴)15：617-648和Donnelly JJ等，1997，Life Sciences(生命科学)60：163-172。这两个参考文献通过引用结合于此。

使用肽免疫原或核酸免疫原的替代方案是使用活免疫原技术。这需要给药已经转化有本发明的核酸片段或载体的非致病微生物。所述非致病微生物可以是任何合适的减毒细菌菌株(通过传代或通过重组DNA技术除去致病表达产物来减毒)，例如牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)BCG.、非致病链球菌属(Streptococcus spp.)、大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、志贺氏菌属(Shigella)等。涉及现有技术的活疫苗制备的综述可以例如见于Saliou P，1995，Rev.Prat.(医师杂志)45：1492-1496和Walker PD，1992，Vaccine(疫苗)10：977-990，两篇文献都通过引用结合于此。对于关于在这种活疫苗中使用的核酸片段和载体的细节，参见以下讨论。

作为对细菌活免疫原的替代方案，本发明的核酸片段可以结合到无毒的病毒疫苗载体中，诸如痘苗毒株或任何其他合适的痘病毒中。

通常，所述非致病微生物或病毒仅向受试者给药一次，但是在某些情况中，可能有必要在一生中给药微生物/病毒多于一次以便维持保护性免疫性。甚至预期，当使用活疫苗或病毒疫苗时，如以上详述的那些用于多肽接种的免疫方案将是有用的。

备选地，活的或病毒免疫与之前或之后的多肽和/或核酸免疫相结合。例如，可能用活疫苗或病毒疫苗实施初次免疫，然后是使用多肽或核酸方法的后续加强免疫。

第十方面

此方面涉及用于确定抗体存在的方法，所述抗体结合由gp120的C5结构域中的氨基酸以及gp41的跨膜结构域和/或gp120的恒定C2结构域中的氨基酸组成的表位，所述方法包括将可能包含所述抗体的样品与至少一种本发明的肽组合接触，并且定量或定性确定所述至少一种肽组合与所述样品中的抗体之间的结合。所述方法可以采用任何方便的形式，并且可以例如以这样的方式：非竞争性或竞争性的ELISA、RIA或磁性免疫测定、凝集测定和基于表面等离子共振的测定诸如Biacore测定。

此方面具有诊断和预测两种价值：关于预测，变得可能的是区分LTNPHIV感染个体与其他HIV感染者，因此提供关于对这些个体的预测的知识并且也为这些个体应当被给予的治疗(如果有的话)类型提供指导，即诊断工具。所述方法也将允许监测本文所教导的治疗的功效，尤其是依靠使用将诱导与C5和tm-pg41和/或C2间的复合物起反应的抗体的免疫原性药剂的免疫的那些治疗。

第十一方面涉及本发明的这方面，其涉及用于确定抗体存在的试剂盒，所述抗体结合由gp120的C5结构域中的氨基酸以及gp41的跨膜结构域和/或gp120的恒定C2结构域中的氨基酸组成的表位，所述试剂盒包含至少一种本发明的肽组合，用于使液体样品与所述肽组合反应的装置，以及用于确定抗体和所述肽组合之间存在阳性或阴性结合反应的装置。

这种试剂盒典型的形式将包括用于分离和/或储存液体样品的容器，用于使所述肽组合与样品接触的容器和试剂，以及用于确定肽组合与样品中的成分之间的结合存在的装置。为了确定这种抗体的存在，所述试剂盒可以例如利用带有第二标记的抗人抗体，其中所述标记可以是任何合适的标记，诸如荧光或放射性标记、酶标记或结合标记(诸如用于结合链霉亲和素的生物素标记)。在所述成套工具中，肽组合可以与固体支持物结合，或者所述试剂盒至少可以包括适于结合所述肽组合的固体支持物。

第十二方面

此方面涉及鉴定和/或分离能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的药剂(即鉴定和/或分离在一些本文教导的治疗中有用的药剂)，所述方法包括：

-从候选药剂与所述C5结构域和与所述gp41的跨膜结构域和/或所述C2结构域的稳定结合，或从其与所述C5结构域和所述跨膜结构域和/或所述C2结构域的替代物的结合，测验候选药剂取代参比药剂的能力，所述参比药剂之前已经被证实能够稳定所述结合，并且分离能够取代所述参比药剂的那些候选药剂，或者

-测验候选药剂与C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或gp120的C2结构域之间的复合物的替代物结合的能力，并且分离能够与所述替代物发生显著结合的那些药剂。

这些备选方案中的第一个可以以与竞争性ELISA相似的方式实行，其中参比药剂可以是或可以不是抗体，并且其中所测量的信号是对结合的该参比药剂的置换。本文中术语“替代物”指示这样的物质，所述物质具有至少一个与结合到tm-gp41和/或C2的C5一样的表位，其中该表位不表现出具有在分离的C5、tm-gp41或C2中的相同的结合亲和性。所以，所述替代物可以例如是本发明的肽组合。

如在以上第二备选方案中那样将所述替代物用于对直接结合候选药剂的测验也是可能的——在这种情况中，应当证实所述替代物关于其与本文教导的C5复合物竞争例如抗体的能力。一种可能的测定是基于等离子表面共振的测定，其具有不需要对待测药剂或参比药剂进行任何标记的优势。然而，也可以使用多种色谱捕获测定。其他测定包括NMR和圆二色性法。在那些情况中，当与小分子结合时，对分子的筛选是基于分离C5和gp41/C2所需的温度变换的显示，因为所述分离可以用两种方法检测。

第十三方面

此方面涉及gp120的C5结构域的新的类似物，其包含具有式II的氨基酸序列

Y¹-Y²-Y³-Y⁴-Y⁵-Y⁶-Y⁷-Y⁸-Y⁹-Y¹⁰-Y¹¹-Y¹²-Y¹³ (II)

其中Y¹是T，Y²选自Lys、Arg、Har和Glu，Y³选自Ala和Val，Y⁴选自Arg、Har、Lys和Cit(瓜氨酸)，Y⁵选自Arg、Har、Lys和Cit，Y⁶选自Arg、Har、Lys和Cit，Y⁷选自Val、Leu、Ile和Nle(正亮氨酸)，Y⁸选自Val、Leu、Ile和Nle，Y⁹选自Gln、Glu、Asn和Asp，Y¹⁰选自Arg、Har和Cit，Y¹¹选自Glu和Asp，Y¹²是Lys，而Y¹³选自Arg、Har和Cit，并且其中

Y³是Val和/或其中

Y⁴选自Arg，Har和Cit和/或其中

Y⁵选自Lys和Cit和/或其中

Y⁶选自Lys和Cit和/或其中

Y⁷选自Leu，Ile和Nle和/或其中

Y⁸选自Leu、Ile和Nle和/或其中

Y⁹选自Glu、Asn和Asp和/或其中

Y¹⁰是Cit或者Y¹¹是Asp或者Y¹³是Cit，

预期将以与以上讨论的肽组合相同的方式使用这些类似物，因为它们将能够诱导针对C5的抗体，并且因此所述类似物在用于药物和诊断用途两者中的组合物中是有用的。涉及本发明的肽组合的使用和制备的以上所有的公开内容因此适用于(加以必要的变更)本发明的类似物。

与本发明的肽组合不同，虽然诱导的抗体能够靶向与C5从gp41或从 C2的解离有关的两个区域，但是所述抗体也能够靶向直接造成免疫活化的C5的其他区域。

与天然C5序列相比，在一些实施方案中，式II具有至多5个氨基酸取代，诸如最多4个、至多3个和至多2个氨基酸取代。在其他实施方案中，与任何天然C5序列相比，所述序列包含精确的5个或精确的4个或精确的3个或精确的2个或精确的1个氨基酸取代。

组合治疗

目前公开的用于治疗或预防AIDS的方法可以与任何目前已知的用于HIV阳性个体的治疗方案结合。值得注意的，所述方法可以结合或先于抗反转录病毒治疗或趋化因子疗法或在抗反转录病毒治疗或趋化因子疗法之后。目前要求保护的方法可以代替或有助于对于高感染风险个体的暴露前预防(PREP)。备选地，本方法可以适于与抗反转录病毒疗法结合作为暴露后预防。目前要求保护的方法也可以与Remune、环氧酶抑制剂和pomalinomide以及其他佐剂结合使用。

实施例导言

综述序列和简写：

C5序列：

APTKAKRRVVQREKRAV(SEQ ID NO：1)

APTKAKRRVVEREKRAV(SEQ ID NO：2)

APTRAKRRVVQREKRAV(SEQ ID NO：3)

APTRAKRRVVEREKRAV(SEQ ID NO：4)

APTEAKRRVVEREKRAV(SEQ ID NO：5)

WWGCAKRRVCGGAKRRVVQREKRA(SEQ ID NO：44)

(SEQ ID NO：44中下划线的氨基酸残基经由二硫化物连接体相连；N端的W优选地是D-氨基酸而C端的A可以被酰胺化；当具有这两个修饰时，所述肽被称为BI450-AdjBT_1)。 C5复合物形成序列：

DRPEGIEEEGGERDR(其中氨基酸4可以是G和/或其中氨基酸5可以是R和/或其中氨基酸13可以是Q和/或其中氨基酸14可以是G和/或其中氨基酸15可以是K；SEQ ID NO：6)；

DRPEGIENNGGERDR(SEQ ID NO：7其中氨基酸4可以是G和/或其中氨基酸5可以是R和/或其中氨基酸13可以是Q和/或其中氨基酸14可以是G和/或其中氨基酸15可以是K)；

DRPEGIENNGGERDRDR(其中氨基酸4可以是G和/或其中氨基酸5可以是R和/或其中氨基酸13可以是Q和/或其中氨基酸14可以是G和/或其中氨基酸15可以是K和/或其中氨基酸16可以是G)；SEQ ID NO：46)。

VERYLKDQQLLG(SEQ ID NO：8)；

VERYLKDEELLG(SEQ ID NO：9)；

VERYLKDNNLLG(SEQ ID NO：10)；

QLLLNGSLAEEEIVI(SEQ ID NO：11，还未被合成)

QLLLNGSLAEEEVVIV(SEQ ID NO：12，还未被合成)

QLLLNSLAEEEVVI(SEQ ID NO：13，还未被合成)

GGAIVNGSLADDDIVI(SEQ ID NO：37，本文中也被称为204d)

WWGCIEEEGCGGIEEEGGERDR(SEQ ID NO：45：下划线的氨基酸残基经由二硫化物连接体相连；N端的W优选地是D-氨基酸，而C端的R可以被酰胺化；当具有这两个修饰时，所述肽被称为BI450-AdjBT_2)。

多肽I：

(Z-SEQ_c5-Z-SEQ_c5)_n

n＝1，2，3，4

多肽II：

(Z-SEQ_cx-Z-SEQ_cx)_n

n＝1，2，3，4

肽复合物：

(Z-SEQ_c5-Z-SEQ_c5)_n

|

双-马来酰亚胺连接体

|

(Z-SEQ_cx-Z-SEQ_cx)_n

n＝1，2，3，4

(Z-SEQ_c5-Z-SEQ_c5)_n

|

(Z-SEQ_cx-Z-SEQ_cx)_n

n＝1，2，3，4

多肽I的实例可以是，但是不限于以下序列：

APTKAKRGGGAPTRAKRGGGAPTEAKR(SEQ ID NO：14)

RVVEREKGGGAKRRVVGGGRVVQREK(SEQ ID NO：15)

GGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV(SEQ ID NO：16)

CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV(SEQ ID NO：17)

GGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR(SEQ ID NO：18)

CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR(SEQ ID NO：19)

GGAKRRVVGGAKRRVV(SEQ ID NO：20)

GCGAKRRVVGGAKRRVV(SEQ ID NO：21)

多肽II的实例可以是，但是不限于以下序列：

GGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR(SEQ ID NO：22)

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR(SEQ ID NO：23)

GGDQQLLGGAEEEIVGGGERDR(SEQ ID NO：24)

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG(SEQ ID NO：25)

GGAEEEVVGGDQQLL(SEQ ID NO：26)

CGGAEEEVVGGDQQLL(SEQ ID NO：27)

经二硫键相连的构建体的实例可以是，但是不限于以下相连的肽序列：

CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV(SEQ ID NO：28)

|

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR(SEQ ID NO：29)

CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR(SEQ ID NO：30)

|

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG(SEQ ID NO：31)

CGGAEEEVVGGDQQLL(SEQ ID NO：32)

|

GCGGAKRRVVGGAKRRVV(SEQ ID NO：33)

以上经二硫键连接的构建体可以例如通过用巯基脱保护的肽滴定2-吡啶次磺酰(pyridinesulfenyl)(SPyr)保护的包含半胱氨酸的肽来合成。这已经被证明是选择性地生产经二硫键连接的肽异型二聚体以防止形成同型二聚体的较好的方法(SchutzA等，Tetrahedron(四面体)，56卷，24期，2000年6月9日，第3889-3891页)。相似的构建体也在本发明的范围内，其中SEQ ID NO：28经二硫键与SEQ ID NO 31或33相连，或者其中SEQ ID NO：30经二硫键与SEQ ID NO：29或33相连，或者其中SEQ ID NO：32经二硫键与SEQ ID NO：29或31相连。

其他相连的构建体的实例可以是，但不限于以下相连的肽序列：

GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(SEQ ID NO：38)

|

GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR(SEQ ID NO：39)

(所述肽经由下划线的Cys和Lys残基相连；整个构建体在本文中被称为BI400-B)。

GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(SEQ ID NO：38)

|

GKGGIEEEGGERDRDRGGQDRDR(SEQ ID NO：40)

(所述肽经由下划线的Cys和Lys残基相连；整个构建体在本文中被称为BI400-Bu1)。

GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA(SEQ ID NO：41)

|

GKGGIEEEGGQDRDRGGRDRDR(SEQ ID NO：42)

(所述肽经由下划线的Cys和Lys残基相连；整个构建体在本文中被称为BI400-Bu2)。

GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA(SEQ ID NO：41)

|

GKGGIEEEGGEQDRDRGGERDRD(SEQ ID NO：43)

(所述肽经由下划线的Cys和Lys残基相连；整个构建体在本文中被称为BI400-Bu3)。

通常，Cys-Lys连接体的准确性质是无关紧要的，只要所述连接体不在连接的构建体中引入不需要的功能性。Cys-Lys连接体可以通过若干通常已知的方法建立。待连接的2个肽根据Merrifield的常规固相肽合成技术来合成。作为建立合适连接体的一个实例，作为线性合成的一部分，制备相应的卤化磺酰以代替半胱氨酸，所述卤化磺酰又能够参与赖氨酸侧链上的伯胺的取代反应；这在半胱氨酸和赖氨酸残基之间建立氨磺酰键。其他反应涉及所述两个残基中的硫醇基和氨基中的一个或两个的衍生化以及所述两个分子间随后的取代/消除反应。

用于实施例中的经Cys-Lys连接的构建体的连接体是以在一个肽中的(2-氧-乙基)衍生的半胱氨酸和另一个肽中的赖氨酸之间的酰胺键的形式存在。这些经Cys-Lys连接的肽都在商业基础上从Bachem UK Ltd.获得。

相似的构建体也在本发明的范围内，其中SEQ ID NO：38经Cys-Lys与SEQ ID NO 42或43相连，或者其中SEQ ID NO：41经Cys-Lys与SEQID NO：39或40相连。

小分子抑制剂：

DQQLL(SEQ ID NO：34)

AKRRVV(SEQ ID NO：35)

AEEEVV(SEQ ID NO：36)

SEQ ID NO 34-36优选地部分或完全由D-氨基酸组成。

实施例1

使用用于线性序列的常规方法合或肽

制备APTKAKRRVVQREKR

从相应的起点根据F-moc合成(Atherton等1978 J.Chem.Soc.ChemCommun(化学学会杂志-化学通讯)539)的一般描述(以下称为“合成概述”)以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1822.2

实验分子量：1823.0ES+

制备APTKAKR

从相应的起点根据合成概描述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：769.6

实验分子量：760.7ES+

制备APTRAKR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：797.6

实验分子量：797.6ES+

制备APTEAKR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：770.9

实验分子量：770.9ES+

制备RVVEREK

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：914.1

实验分子量：913.9ES+

制备RVVQREK

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：913.1

实验分子量：913.0ES+

制备AKRRVV

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：726.9

实验分子量：726.9ES+

制备DRPEGIEEEGGERDR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1742.1

实验分子量：1742.8

制备VERYLKDQQLLG

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1460.7

实验分子量：1460.1

制备VERYLKDEELLG

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1462.6

实验分子量：1463.0

制备VERYLKDNNLLG

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1432.6

制备QLLLNGSLAEEEIVI

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1639.9

制备QLLLNGSLAEEEVVI

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1625.9

制备QLLLNSLAEEEVVI

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1568.8

制备APTKAKRGGGAPTRAKRGGGAPTEAKR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2647.0

实验分子量：2646.3ES+

制备RVVEREKGGGAKRRVVGGGRVVQREK

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2862.3

实验分子量：2863.3ES+

制备GGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2590.1

制备CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2693.2

制备GGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2476.9

制备CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2580.0

制备GGAKRRVVGGAKRRVV

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1665.0

制备GCGAKRRVVGGAKRRVV

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1768.1

制备GGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：3127.2

制备CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：3230.4

制备GGDQQLLGGAEEEIVGGGERDR

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2242.4

制备CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：2402.5

制备GGAEEEVVGGDQQLL

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1499.6

制备CGGAEEEVVGGDQQLL

从相应的起点根据合成概述以酰胺形式合成所述肽。

纯度(HPLC)：大于90％。

质谱分析：理论分子量：1602.7

实施例2：

复合肽的合成

制备CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV

|

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRD

纯度(HPLC)：大于90％。

理论分子量：5750.4

制备CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR

|

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG

纯度(HPLC)：大于90％。

理论分子量：4965.6

制备CGGAEEEVVGGDQQLL

|

GCGGAKRRVVGGAKRRVV

纯度(HPLC)：大于90％。

理论分子量：3410.9

制备：

GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(SEQ ID NO：38)

|

GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR(SEQ ID NO：39)

纯度(HPLC)：大于94％。

理论分子量：5876.93

实施例3

来自HIV长期感染个体、LTNP和非感染献血者的汇集的人血清对单独的和与SEQ ID NO：6、8和9组合的SEQ ID NO：1的识别

根据通用的ELISA原理使用作为固体支持物的磁性颗粒或将肽固定到96孔板来确定单独的或与SEQ ID NO：6(具有序列DRPEGIEEEGGERDR)、8和9组合的SEQ ID NO：1的血清反应性(seroreactivity)。

方法：

在以下描述的系统中，使用公认技术将肽包被在磁性颗粒上。除了SEQ ID NO：1使用600μg以外，对所有肽，都将300μg包被在颗粒上。SEQ ID NO：1(来自C5)和SEQ ID NO：6、8和9(来自gp41)在4℃预孵育过夜从而允许分别在C5和gp41序列之间和全部组合地形成相互作用。然后根据已有的实验方案使血清与包被有肽的珠子孵育。使用能够结合来自不同物种的免疫球蛋白的与碱性磷酸酶偶联的蛋白G来实现抗体与C5肽结合的显现。阳性对照是可商购的来自用源于C5的序列APTKAKRRVVQREKR(SEQ ID NO：1)免疫的绵羊的血清。

测验来自25名LTNP的汇集的血清对单独的SEQ ID NO：1以及与SEQ ID NO：6(DRPEGIEEEGGERDR)、8和9分别和全部组合的SEQ IDNO：1的血清反应性。也测验来自12名HIV阳性、长期感染个体的汇集的血清和来自献血者的20份血清。结果显示于表A中：

表A：汇集的血清对SEQ ID NO：1以及与gp41的序列组合的SEQ IDNO：1的血清反应性的结果。阳性在视觉上被确定。

结果/讨论点：表A中的结果显示，当与来自长期感染HIV的患者的汇集的血清相比，汇集的LTNP血清通常产生对来自HIV-1的SEQ ID NO：1的强的反应性——之前这已经被报道。然而，将SEQ ID NO：1与源自gp41的其他肽组合(例如全部组合或只与SEQ ID NO：8组合)减弱了在献血者中观察到的背景水平以及来自长期感染个体的汇集的血清中的应答。LTNP中的应答保持很强。

实施例4

来自HIV长期感染者、LTNP、献血者的个体人血清对单独的SEQ ID NO：1和与SEQ ID NO：6组合的SEQ ID NO：1的识别

使用ELISA板作为固体支持物，确定个体LTNP患者血清对单独的SEQ ID NO：1(16μg)和与SEQ ID NO：6(16μg)组合的SEQ ID NO：1(16μg)的血清反应性。使用绵羊抗C5抗体作为阳性对照。使用280nm的光密度(OD)作为在与碱性磷酸酶偶联的蛋白G的酶反应后的读数。图1显示LTNP患者的比例和他们减去背景(只有培养基没有肽)后的OD值。

图1显示，与对单独的SEQ ID NO：1的反应性(n＝6，最左侧阴影线条形，＜0％的比率)相比，当SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：6(DRPEGIEEEGGERDR)组合时，更大比例的LTNP血清(n＝8，2最右手，灰色条形)具有对SEQ ID NO：1的反应性(即＞80％的比率)。对于对SEQ IDNO：1只具有低应答的LTNP血清，当SEQ ID NO：1和6组合时此作用被加强。这表明，甚至当来自单独的C5的应答是低的时候，C5：gp41复合物具有捕获和显著增加应答的能力；图1显示，在仅显示与SEQ ID NO：1 结合的血清样品中，OD是高的。然而，当与gp41序列组合时，对单独的C5的应答减弱，因为此时抗体优选地结合所述组合。

图2显示在来自LTNP、长期感染患者和献血者的个体血清中对单独的SEQ ID NO：1和与SEQ ID NO：6(DRPEGIEEEGGERDR)组合的SEQ IDNO：1的应答的大小。与长期HIV感染患者相比，在LTNP患者之中，对单独的SEQ ID NO：1和对与SEQ ID NO：6(DRPEGIEEEGGERDR)组合的SEQ ID NO：1具有更大的应答。对于LTNP和长期HIV感染患者两者，相比与单独的SEQ ID NO：1的结合，与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6组合的结合的OD中值更大，显示与SEQ ID NO：6的组合改善了血清反应性。献血者中的应答一贯地低，在此阴性对照中有非常紧密的四分位数间距，而且在对单独的C5或与SEQ ID NO：6(DRPEGIEEEGGERDR)组合的C5的血清反应性上没有差别。

对源自SEQ ID NO：1和6组合对LTNP血清的OD值和源自SEQ IDNO：1和6组合对HIV血清的OD值进行的Wilcoxon秩和检验(Wilcoxonrank-test)，显示真实中位数在25％的置信区间内不同。

实施例5

免疫学研究

兔免疫

在0、2和6周，用1ml BI400-B疫苗真皮内免疫雌性新西兰白兔(n＝3)，所述BI400-B疫苗由在50％V/V弗氏(Freund′s)佐剂(即用于致敏的完全弗氏佐剂，随后用不完全弗氏佐剂加强)中的500μg BI400-B组成。分离个体血清进行ELISA。

对人血清的直接ELISA

将50-100μl BI400-015和-201(在包被前，在包被缓冲液—0.05MNa₂CO₃ pH9.6(表示为CB)中——将16μg/ml的每种肽在低温下预孵育1-3天)的混合物或只是CB(背景对照)用于在4℃过夜包被微量滴定板中的孔。然后用漂洗缓冲液(PBS+1％v/v Triton-X100；表示为WB)漂洗所述微量滴定板3次，接着用200μl/孔的封闭缓冲液(PBS+1％w/v BSA)在室温(RT)封闭2小时。然后用WB漂洗板3次，接着用50-70ul/孔的添加的人血清(在稀释缓冲液(PBS+1％v/v Triton-X100+1％w/v BSA；表示为DB)中按1∶1～1∶250连续稀释)在37℃孵育1小时。然后用WB漂洗板6次，接着用70μl/孔的碱性磷酸酶缀合的蛋白G(在DB中，3μg/ml；Calbiochem 539305)在RT孵育1小时。然后用WB漂洗板6次，接着用100μl/孔的0.3％w/v的酚酞单磷酸(phenophtalein monophosphate，SigmaP-5758)在室温孵育10-60min。最后通过添加100μl/孔的猝灭溶液(Quenchsolution)(0.1M TRIS+0.1M EDTA+0.5M NaOH+0.01％w/v NaN₃；pH14)使板猝灭，接着通过ELISA检测仪(ASYS UVM 340)在550nm读数。

在用BI400-B免疫后对兔血清的竞争性ELISA

将50-100μl BI400-015和-201(在包被前，在包被缓冲液—0.05MNa₂CO₃ pH9.6(表示为CB)中——将16μg/ml的每种肽在低温下预孵育1-3天)的混合物或只是CB(背景对照)用于在4℃过夜包被微量滴定板中的孔。然后用漂洗缓冲液(PBS+1％v/v Triton-X100；表示为WB)漂洗所述微量滴定板3次，接着用200μl/孔的封闭缓冲液(PBS+1％w/v BSA)在室温(RT)封闭2小时。然后用WB漂洗板3次，接着用与以下各项的连续稀释液(终浓度10～1000μM)一起预孵育(4℃过夜)的60-100μl/孔的添加的兔血清样品(终浓度1∶10～1∶250稀释)在37℃孵育1小时：400-SEQ.B、BI400-015、BI400-201、BI400-204d、重组gp41(Shin-Won Scientific，SWO102gp41)、BI301-23(不相关蛋白；对照)、无肽(即PBS；对照)、LTNP血清库(终浓度1∶10稀释)或献血者血清库(终浓度1∶10稀释；对照)。然后用WB漂洗板6次，接着用70μl/孔的碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔Ig(6μg/ml；Dako D0487)在RT孵育1小时。然后用WB漂洗板6次，接着用100μl/孔的0.3％w/v的酚酞单磷酸(Sigma P-5758)在RT孵育10-60min。最后通过添加100μl/孔的猝灭溶液(0.1M TRIS+0.1M EDTA+0.5M NaOH+0.01％w/v NaN₃；pH14)使板猝灭，接着通过ELISA检测仪(ASYS UVM 340)在550nm读数。

结果

图3显示来自用疫苗抗原400SEQ-B免疫的兔的血清在存在PBS的情况下与对应于C5/gp41(015/201)的肽结合。此结合能够被重组gp41以及被源自C5(015)、gp41(201)和C2(204d)的肽以及被400-SEQ-B自身抑制。使用不相关的肽(B301-23)不能抑制所述结合。

如从图4明显看出的，来自用BI400-B免疫的兔的抗C5/gp41血清被LTNP血清库竞争性抑制，但是不被BD对照血清抑制。

如在图5中所示，在43名病毒载量＜15000拷贝/ml的天然病毒抑制HIV患者中有26名(26/43)以及在15名病毒载量高于15000拷贝/ml的HIV患者中有4名(4/15)观察到针对C5/gp41的抗体。此外，与病毒载量高于15000拷贝/ml的患者(n＝15)相比，在病毒载量低于15000拷贝/ml的HIV-1患者(n＝43)中观察到显著(当使用Mann-Whitney检验时p＝0.018)更高的抗C5 IgG应答(即相对于以相同血清稀释测量的OD值分组(grouped))。

总之，对BI400-B的免疫研究的结果表明可能产生这样的肽，所述肽不仅引发针对作为个体成分的C5和gp41/C2而且还引发针对作为复合物的C5和gp41/C2的抗体应答。这些抗体应答的特异性在封闭研究中使用特异性肽抗原得到确认(图3)。此外，在动物模型中针对这些肽产生的抗体与在天然HIV感染者中引发并与长期不进展相关的抗体是可比的(图4)。这些结果显示这些肽适于用于诊断以及开发靶向HIV诱导的免疫活化的疫苗。以下发现，即BI400-B引发与gp41和C5间的复合物结合的抗体，以及这些抗体与LTNP HIV患者中的抗血清竞争相同的复合物表位，表明其可能刺激针对这些表位的免疫应答并且因此在本身不产生这种类型的针对HIV的抗体的患者中诱导LTNP样的条件。

Claims

1.一种用于在感染HIV的人中减小和/或延迟人免疫缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括给药有效量的至少一种药剂，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合。

2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种药剂是这样的分子，其包含至少一个独立地选自来源于gp41的跨膜结构域的氨基酸序列和来源于C2结构域的氨基酸序列的氨基酸序列，

其中所述至少一个氨基酸序列结合C5结构域并且包含至少一个D-氨基酸。

3.根据权利要求2的方法，其中所述分子是肽。

4.根据权利要求3的方法，其中所述肽由至少一个氨基酸序列组成。

5.根据权利要求2-4中任一项的方法，其中所述来源于gp41的跨膜结构域的氨基酸序列具有至多10个氨基酸残基的氨基酸序列。

6.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种药剂选自抗体、抗体片段或抗体类似物。

7.根据权利要求6的方法，其中所述抗体是完全的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、或它们的衍生物。

8.根据权利要求7的方法，其中所述抗体是IgA、IgD、IgG、IgE或IgM。

9.根据权利要求6的方法，其中所述抗体片段选自Fab片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼或骆驼Ig)、V_HH片段、单结构域FV、和单链抗体片段。

10.根据权利要求6的方法，其中所述抗体类似物选自scFV、dsFV、微型抗体、双链抗体、三链抗体、κ抗体、IgNAR、tandAb、BiTE和多特异性抗体。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种药剂结合并稳定氨基酸片段TZ¹AKRRVVZ²REKR中的一个或多个氨基酸残基与在gp41的跨膜结构域和/或在gp120的恒定C2结构域中的氨基酸片段中的一个或多个氨基酸残基之间的结合，在所述氨基酸片段TZ¹AKRRVVZ²REKR中，Z¹是K、R或E并且Z²是Q或E。

12.一种用于在感染HIV的人中减小和/或延迟人免疫缺陷病毒I(HIV)的病理学作用的方法，所述方法包括给药有效量的至少一种免疫原，所述免疫原诱导稳定HIV gp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的抗体。

13.根据权利要求12的方法，其中所述至少一种免疫原选自根据权利要求19-33中任一项的肽组合、根据权利要求53的类似物、根据权利要求34、35或54的组合物、根据权利要求36-43的核酸片段、根据权利要求44或45的病毒或质粒载体、或者根据权利要求46或47的质粒或病毒组合物。

14.一种用于减小发展获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的风险的方法，所述方法包括给药有效量的至少一种免疫原，所述免疫原诱导稳定HIVgp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合的抗体。

15.根据权利要求14的方法，其中所述至少一种免疫原选自根据权利要求19-33中任一项的肽组合、根据权利要求34或35的组合物、根据权利要求36-43的核酸片段、根据权利要求44或45的病毒或质粒载体、或者根据权利要求46或47的质粒或病毒组合物。

16.一种用于减小发展获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的风险的方法，所述方法包括给药有效量的至少一种药剂，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合。

17.根据权利要求16的方法，其中所述至少一种药剂如在权利要求6-11中的任一项所限定的。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中C5结构域与C2和/或gp41的跨膜结构域之间的结合涉及序列TZ¹AKRRVVZ²REKR中的至少一个氨基酸，在所述序列中，Z¹是K、R或E并且Z²是Q或E，并且涉及在gp41的跨膜结构域中的至少一个氨基酸或在gp120的恒定C2结构域中的至少一个氨基酸。

19.一种肽组合，所述组合包含

20.根据权利要求19的肽组合，其中所述第一肽包含具有式I的氨基酸序列：

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³ (I)

或者包含式I氨基酸序列的亚序列，或者包含所述氨基酸序列或亚序列的翻转、反向或反向-翻转形式。

21.根据权利要求19或20的肽组合，其中所述第一肽进一步包含与具有式I的氨基酸序列的N端相连的二肽Ala-Pro。

22.根据权利要求19-21中任一项的肽组合，其中所述第一肽进一步包含与具有式I的氨基酸序列的C端相连的二肽X¹⁴-X¹⁵，其中X¹⁴选自Ala和Val，并且其中X¹⁵选自Val、Leu和Nle。

23.根据权利要求19-22中任一项的肽组合，其中所述至少第二肽包括具有下式的氨基酸序列：

或者包括式(III)的亚序列。

24.根据权利要求23的肽组合，其中所述第二肽包含来自式III的至少5个连续的氨基酸残基。

25.根据权利要求19-22中任一项的肽组合，其中所述第一肽和所述至少一个第二肽经由连接体结合。

26.根据权利要求21的肽组合，其中所述连接体选自由以下各项组成的组：双马来酰亚胺连接体、二硫化物连接体、聚乙二醇(PEG)连接体、甘氨酸连接体、赖氨酸连接体和精氨酸连接体。

27.根据权利要求19-26中任一项的肽组合，其中所述第一肽和至少一个第二肽中的至少一个包含N端或C端修饰，诸如酰胺化、酰化或乙酰化。

28.根据权利要求19-27中任一项的肽组合，所述肽组合偶联到载体分子，诸如免疫原性载体上。

29.根据权利要求28的肽组合，其中所述载体是病毒样颗粒。

30.根据权利要求19-29中任一项的肽组合，其中所述第一肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、38、41和44或其片段，或者选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、38、41和44或其片段的肽的翻转、反向或反向-翻转形式，并且其中所述第二肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、37、39、40、42、43、45、46或其片段，或者选自SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、37、39、40、42、43、45、46或其片段的肽的翻转、反向或反向-翻转形式，和/或其中所述肽组合选自具有SEQ ID NOs：1-46的肽。

31.根据权利要求19-30中任一项的肽组合，所述肽组合包含至多70个氨基酸。

32.根据权利要求19-31中任一项的肽组合，所述肽组合包含至少6个氨基酸残基。

33.根据权利要求31或32的肽组合，所述肽组合由选自由以下各项组成的组的数目的氨基酸残基组成：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70个氨基酸残基。

34.根据权利要求19-33中任一项的肽组合，所述肽组合选自由以下各项组成的组：

在SEQ ID NO：28与SEQ ID NOs：29、31和33中任一个之间，在SEQID NO：30与SEQ ID NO：29、31和33中任一个之间，或者在SEQ ID NO：32与SEQ ID NO：29、31和33中任一个之间经二硫化物相连的肽；

或者选自由以下各项组成的组：

在SEQ ID NO：38与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中任一个之间，或在SEQ ID NO：41与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43中任一个之间经半胱氨酸-赖氨酸相连的肽。

35.权利要求34的肽组合，所述肽组合选自由以下各项组成的组：

CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV(SEQ ID NO：28)

|

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR(SEQ ID NO：29)，

CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR(SEQ ID NO：30)

|

CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG(SEQ ID NO：31)，

CGGAEEEVVGGDQQLL(SEQ ID NO：32)

|

GCGGAKRRVVGGAKRRVV(SEQ ID NO：33)，

GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(SEQ ID NO：38)

|

GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR(SEQ ID NO：39)，

GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA(SEQ ID NO：38)

|

GKGGIEEEGGERDRDRGGQDRDR(SEQ ID NO：40)，

GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA(SEQ ID NO：41)

|

GKGGIEEEGGQDRDRGGRDRDR(SEQ ID NO：42)，和

GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA(SEQ ID NO：41)

|

GKGGIEEEGGEQDRDRGGERDRD(SEQ ID NO：43)。

36.一种免疫原性组合物，其包含与药用稀释剂或赋形剂以及可选的免疫学佐剂组合的至少一个根据权利要求19-35中任一项的肽组合。

37.根据权利要求35的免疫原性组合物，其是以疫苗组合物的形式存在。

38.编码肽组合的核酸片段，所述肽组合包含：

-如在权利要求19-35的任一项中所限定的第一肽，其具有这样的限制，即所述第一肽中的氨基酸残基是L型的，并且选自由以下各项组成的组：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Iys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr，以及

-如在权利要求19-35的任一项中所限定的至少一个第二肽，其具有这样的限制，即所述第二肽中的氨基酸残基是L型的，

39.根据权利要求38的核酸片段，其中所述第一肽和所述至少一个第二肽经由肽连接体和/或二硫键结合。

40.根据权利要求39的核酸片段，其中所述肽连接体选自由以下各项组成的组：甘氨酸连接体、赖氨酸连接体、甘氨酸-赖氨酸连接体和Arg连接体。

41.根据权利要求39或40的核酸片段，其中所述肽组合偶联到载体分子，诸如免疫原性载体上。

42.根据权利要求38-41中任一项的核酸片段，其中所述第一肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、28、30、32、38、41、44或其片段，并且其中所述第二肽选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、29、31、33、39、40、42、43、45和46或其片段。

43.根据权利要求38-42中任一项的核酸片段，所述核酸片段编码包含至多70个氨基酸的肽组合。

44.根据权利要求38-43中任一项的核酸片段，所述核酸片段编码包含至少6个氨基酸残基的肽组合。

45.根据权利要求38-44中任一项的核酸片段，所述核酸片段编码这样的肽组合，所述肽组合由选自由以下各项组成的组的数目的氨基酸残基组成：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70个氨基酸残基氨基。

46.包含根据权利要求38-45中任一项的核酸片段的载体。

47.根据权利要求46的载体，所述载体选自由以下各项组成的组：质粒、病毒、噬菌体、黏端质粒和微型染色体。

48.一种免疫原性组合物，其包含与药用稀释剂或赋形剂以及可选的免疫学佐剂组合的至少一个根据权利要求38-45中任一项的核酸片段，或至少一个根据权利要求46-47中任一项的载体。

49.根据权利要求48的免疫原性组合物，其以疫苗组合物的形式存在，其中独立地或与所述组合物组合地提供所述佐剂。

50.一种用于确定抗体存在的方法，所述抗体结合由gp120的C5结构域中的氨基酸以及gp41的跨膜结构域和/或gp120的恒定C2结构域中的氨基酸组成的表位，所述方法包括将可能包含所述抗体的样品与至少一种根据权利要求19-35中任一项的肽组合接触，并且定量或定性确定所述至少一种肽组合与所述样品中的抗体之间的结合。

51.根据权利要求50的方法，其形式是非竞争性或竞争性ELISA、RIA，或磁性免疫测定、凝集测定和基于表面等离子共振的测定诸如Biacore测定。

52.用于确定抗体的存在的试剂盒，所述抗体结合由gp120的C5结构域中的氨基酸以及gp41的跨膜结构域和/或gp120的恒定C2结构域中的氨基酸组成的表位，所述试剂盒包含至少一种根据权利要求19-35中任一项的肽组合，用于使液体样品与所述肽组合反应的装置，以及用于确定抗体和所述肽组合之间存在阳性或阴性结合反应的装置。

53.一种分离药剂的方法，所述药剂能够稳定HIV gp120的C5结构域与gp41的跨膜结构域和/或与gp120的恒定C2结构域的结合，所述方法包括：

-从候选药剂与所述C5结构域和与所述gp41的跨膜结构域和/或所述C2结构域的稳定结合，或从候选药剂与所述C5结构域和所述跨膜结构域和/或所述C2结构域的替代物的结合，测试候选药剂取代参比药剂的能力，所述参比药剂之前已经被证实能够稳定所述结合，并且分离能够取代所述参比药剂的那些候选药剂，或者

54.根据权利要求53的方法，其中所述替代物是根据权利要求19-35中任一项的肽组合。

55.gp120的C5结构域的类似物，其包含具有式II的氨基酸序列

Y¹-Y²-Y³-Y⁴-Y⁵-Y⁶-Y⁷-Y⁸-Y⁹-Y¹⁰-Y¹¹-Y¹²-Y¹³ (II)

其中Y¹是Thr，Y²选自Lys、Arg、Har和Glu，Y³选自Ala和Val，Y⁴选自Arg、Lys、Har和Cit(瓜氨酸)，Y⁵选自Arg、Har、Lys和Cit，Y⁶选自Arg、Lys、Har和Cit，Y⁷选自Val、Leu、Ile和Nle(正亮氨酸)，Y⁸选自Val、Leu、Ile和Nle，Y⁹选自Gln、Glu、Asn和Asp，Y¹⁰选自Arg、Har和Cit，Y¹¹选自Glu和Asp，Y¹²是Lys，而Y¹³选自Arg、Har和Cit，并且其中

Y³是Val和/或其中

Y⁴选自Arg，Har和Cit和/或其中

Y⁵选自Lys和Cit和/或其中

Y⁶选自Lys和Cit和/或其中

Y⁷选自Leu，Ile和Nle和/或其中

Y⁸选自Leu，Ile和Nle和/或其中

Y⁹选自Glu、Asn和Asp和/或其中

Y¹⁰是Cit或者Y¹¹是Asp或者Y¹³是Cit，

56.一种组合物，其包含与药用赋形剂或稀释剂以及可选的免疫学佐剂混合的根据权利要求55的类似物。

57.根据权利要求19-35中任一项的肽组合、根据权利要求38-45的核酸片段、根据权利要求46-47的载体、根据权利要求48或49的免疫原性组合物或根据55的类似物，其用作药物。

58.根据权利要求19-35中任一项的肽组合，其用作AIDS的治疗或预防中的药物。

59.抗体、抗体片段或抗体类似物，其如在权利要求6-10中任一项所限定的，其用作药物。

60.抗体、抗体片段或抗体类似物，其如在权利要求6-10中任一项所限定的，其用作AIDS的治疗或预防中的药物。