CN106282214A - 一种快速获得纳米抗体的方法及其应用 - Google Patents

一种快速获得纳米抗体的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速获得纳米抗体的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、阴性对照的获取；步骤二、羊驼外周血单个核细胞即PBMC的分离；步骤三、流式细胞分选；步骤四、提取阳性细胞RNA，反转录成cDNA；步骤五、VHH片段的扩增；步骤六、将VHH片段连入表达载体；步骤七、重组原核表达载体的PCR鉴定；步骤八、pet28a‑CD19‑VHH的表达；步骤九、表达抗体的ELISA活性鉴定。

Description

一种快速获得纳米抗体的方法及其应用
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种快速获得纳米抗体的方法及其应用。
背景技术
抗体是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
1993年比利时的Hamers Casterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条H链和2条L链构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗(heavy-chainantibody，hcAb)，具有完全的抗原结合能力。这些重链抗体(HcAbs)在羊驼属(Lama)血清中约占总Ig的50％，在骆驼属(Camelus)血清中约占总Ig的75％，重链抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。另外，重链抗体还具有易表达，可溶性好，稳定性强，免疫原性弱，穿透性好等优点。已有的研究表明该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、医疗领域、药物开发等领域有广阔的应用前景。
目前抗体获得方法有单克隆抗体，核糖体展示库，噬菌体展示库等，其中应用最广泛的技术是噬菌体展示库：
(1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。而噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性，进而丢失抗体序列。
(2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是体内选择压力的一个例子。
(3)由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
(5)从构建噬菌体展示库到筛选出有效抗体周期过长(一般需要4-5个月)针对这一缺陷本发明采用流式细胞分选结合RT-PCR获得抗体基因序列一般只需要一周即可完成。从免疫动物后静脉取血→分离外周血单个核细胞→荧光染料标记抗原→上流式细胞仪分选获得阳性细胞，这个过程需要1天。
(4)噬菌体库表面展示技术工艺复杂，成本高。4,5两个条件可以调换下位置
(6)本技术筛选的纳米抗体较常规抗体具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性好、易表达和免疫原性低等特点，比常规抗体用途更广。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种快速获得纳米抗体的方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种快速获得纳米抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一、阴性对照的获取；
步骤二、羊驼外周血单个核细胞即PBMC的分离；
步骤三、流式细胞分选；
步骤四、提取阳性细胞RNA，反转录成cDNA；
步骤五、VHH片段的扩增；
步骤六、将VHH片段连入表达载体；
步骤七、重组原核表达载体的PCR鉴定；
步骤八、pet28a-CD19-VHH的表达；
步骤九、表达抗体的ELISA活性鉴定。
所述步骤一包括购买羊驼后，标记羊驼，在免疫前颈脉取血30mL，放入预先准备好的加有抗凝剂的50毫升离心管内，抗凝剂用量20-50U每毫升血，分离外周血单个核细胞即PBMC，液氮保存备用。
所述步骤二整个过程为无菌操作，其中具体步骤如下：
步骤a、采血时使用的是15mL的离心管，将血液带回实验室后直接将离心管放入离心机中离心，整个过程室温即可，根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长；
步骤b、吸取上层血清，血清800μL，每管分装标记，保存在-80℃冰箱备用；
步骤c、吸完血清后剩余血液有2.5mL，共3管；将3管血液都吸到一个50mL的离心管内，用2-3mL的灭菌的PBS洗干净离心管，这时50mL离心管内的血液10mL；再加入5mL的PBS稀释，另取一个无菌的50mL离心管，倒入15mL的Ficoll分离液，将稀释好的血液缓慢平稳的平铺在Ficoll分离液上，配平离心；
步骤d、离心后，此时离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层；
步骤e、用吸头吸取上层的血浆层并弃去，因为血清已经分出，所以血浆层液体不多，收集中间第二层环状乳白色单个核细胞层到另一个50mL离心管中，在离心管中加PBS到45mL，混匀，离心10min；
步骤f、在超净台内快速倒掉PBS，将离心管底部PBMC轻轻敲起，再加入PBS至45mL，混匀，重复步骤e再洗一次；
步骤g、加2mL的细胞冻存液，取10μL混匀细胞的细胞冻存液加入10μL台盼蓝混匀在显微镜下用细胞计数板计数；用细胞冻存液调节PBMC浓度，每1毫升细胞冻存液保存2×106个细胞。
步骤h、将调好浓度的PBMC分装在细胞冻存管内，放于缓冻盒内-80℃过夜，第二天放入液氮中保存。
所述步骤三包括，生物素标记的CD19，所需原料为生物素标记的CD19蛋白即CD19-Biotin储备液，分子量为56.3KDa，SDS-PAGE结果显示糖基化后分子量为56-66KDa，在100μL体系中每百万个细胞加入藻红蛋白-链霉亲和素即PE-Streptavidin的量为0.015μg，对照试验采用阴性对照，不标记任何荧光素偶联抗体CD19免疫后的细胞；未免疫的天然羊驼PBMC。
所述步骤四包括整个实验过程所用到的试剂，枪头，EP管都是无核糖核酸酶，其中，步骤I、第一次流式分选后得到50000个阳性细胞，分选后从收集管中将收集液转移到1.5mL的离心管中，12000r/min，离心5min弃上清液；步骤II、向步骤I中的阳性细胞中加入1mL的总核糖核酸提取试剂液，用枪来回吹打几次使细胞充分裂解，加200ul氯仿后剧烈震荡30S，静置5min，12000r/min，离心10min，分层，吸取上层液体相到另一1.5ML管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀20mins；步骤III、将沉淀液体转移到RNA提取柱中，3min挂住，用700μL缓冲液W2洗两遍，再用60μL无核糖核酸酶水洗脱，得到阳性细胞RNA；RNA反转录成cDNA；将得到的cDNA转移到已灭菌的1.5mLEP管中，-80℃保存备用。
所述步骤五通过两步PCR扩增获得羊驼抗CD19纳米抗体。
所述步骤六中表达载体与片段酶切条件为载体(1ug)35μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI，NotI各2μL，水51μL，37℃水浴20分钟，80℃失活10分钟，跑琼脂糖凝胶电泳回收定量，片段1ug 20μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI，NotI各2μL，水66μL，37℃水浴20分钟，80℃失活10分钟，跑琼脂糖凝胶电泳回收定量；载体与片段链接条件：载体，50ng/μL，1μL，片段，40ng/μL，1.5μL，10倍浓度的T4脱氧核糖核酸缓冲液1μL，T4脱氧核糖核酸连接酶1μL，水5.5μL，室温1小时连接，转入BL21大肠杆菌感受态。
所述步骤七包括将重组的pet28a-CD19-VHH原核表达载体，利用T7(TAATACGACTCACTATAGGG)和T7ter(TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)引物进行PCR扩增，反应体系20μL，PCR反应程序为95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s(30个循环)；72℃，8min；4℃，10s；将PCR扩增后的产物进行DNA电泳实验，将鉴定后的样品进行测序。
所述步骤八包括将测序后的pet28a-CD19-VHH样品进行序列分析，筛选出序列正确的样品进行诱导表达，诱导表达步骤如下，将pet28a-CD19-VHH菌液按1:100稀释加入100mL的2YT培养基中，37℃，180～200rpm进行摇菌，摇至菌液OD600值为0.6～1.0时，取出少量菌液，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达3～4h，收集菌液，pet28a菌液按照pet28a-CD19-VHH菌液相同诱导表达步骤操作；以未诱导的pet28a菌液、诱导的pet28a菌液和未诱导的pet28a-CD19-VHH作为对照进行SDS-PAGE试验。
所述步骤九包括IPTG诱导、表达后的菌液于离心机中7000rpm，离心10min收集菌体，用PBS(PH7.4)清洗一次，再次离心收集菌体；用10mL的PBS(PH7.4)将菌液吹打混匀，置于冰上，放到超声波细胞粉碎仪中，按超声发振时间5s，间隙时间5s，保护温度60℃，超声功率10％的程序超声破碎10min，将破碎后的菌液放于离心机中7000rpm，离心10min，将上清液进行亲和层析纯化，保存备用；
将Human-CD19蛋白用包被液(PH9.6)稀释到2ng/μL浓度，按每孔100μL加入到酶标板中，放置于4℃冰箱中过夜，第二天进行ELISA实验，ELISA步骤如下：
步骤1、按每孔200μL的PBS-T加入包被后的酶标板进行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于卫生纸巾上拍板确保洗液全部被吸干；
步骤2、按每孔200μL向酶标板中加入5％的脱脂奶粉，室温封闭1h；
步骤3、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，依次将100μL的空白对照液、阴性对照、纯化后的H-CD19-VHH加入到酶标板中，室温孵育2h；
步骤4、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，按每孔100μL向酶标板加入HRP标记的标签抗体，室温孵育1h；
步骤5按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后向每孔加入100μL的TMB，避光放置10min；
步骤6、向每孔加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应，将酶标板放于酶标仪中，于450nm条件下读数。
应用流式细胞分选技术可以快速获得纳米抗体。pet28a-CD19-VHH即CD19重链抗体可变区片段插入原核表达载体PET28(a)的重组阳性质粒。
表1：阳性细胞反转录过程体系及过程
表2：第一步扩增获得羊驼单链和双链的VH-CH体系及PCR程序
表3：第二步扩增获得羊驼单链VHH
本发明PCR扩增试验所用引物如下表4
表4
有益效果
针对这一缺陷本发明技术采用流式细胞分选，该方法通过分选标记染料的外周血单个核细胞可将样本中所有阳性细胞获得，从而避免了抗体序列流失。而且一分钟可分析约一万个细胞，样本分析量大。
针对这一缺陷本发明采用的特异的抗原偶联荧光染料进行流式细胞分选可得到所有表达抗体的阳性细胞，单个阳性细胞进行提取mRNA后，反转录成cDNA，之后RT-PCR扩增出抗体的可变区。由于纳米抗体结构的特殊性(天然缺失轻链)所以不需要轻重链配对表达，这样就能保证每个抗体序列都可以后期在表达载体内表达。
本发明没有细胞毒性与否的限制
阳性细胞提取RNA→反转录成cDNA→RT-PCR扩增抗体序列→抗体序列连接到表达载体→挑取单克隆ELISA检测活性→这个过程需要4天。
本发明只需将提取的PBMC利用特异性的抗原探针进行流式分选，得到阳性细胞，利用PCR技术，扩增抗体序列，进行表达和ELISA检测。实验步骤简单，实验周期较短。因此，与噬菌体展示技术相比，生产成本较低。
本发明技术主要提供一种驼类(羊驼及骆驼)纳米抗体简便、快速的筛选鉴定方法。传统的噬菌体抗体库筛选技方法复杂、价格高、周期长、难于获得高特异性及高亲和力的抗体，本发明描述一种快速、高效、简便基于流式细胞分选技术的纳米抗体筛选技术。
本发明的流氏细胞分选结合实时定量PCR法可快速获得此类抗体。
附图说明
图1a是本申请技术流程图；
图1b噬菌体库展示技术流程图；
图2是本发明技术详细流程图及各步骤实验主要操作流程；
图3是第一步扩增获得羊驼单链VHH-CH和双链的VH-CH电泳图；
图4是第二步扩增获得羊驼单链VHH电泳图；
图5是VHH片段连入pet28a载体后的鉴定电泳图；
图6是pet28a-CD19-VHH表达后的SDS-PAGE分析；
图7是纯化的pET28a-CD19-VHH的SDS-PAGE。
其中，1是羊驼4μL cDNA为模板扩增电泳图，2是羊驼2μL cDNA为模板扩增电泳图，3是第一步扩增羊驼单链和双链的VHH-CH，cDNA为模板；4是第二步扩增羊驼单链VHH片段，为模板1st PCR产物为模板；5-7是阳性pet28a-CD19-VHH样品；8是阴性对照；9是未诱导的pet28a-CD19-VHH菌；10是诱导的pet28a-CD19-VHH菌；11是未诱导的pet28a菌；12是诱导的pet28a菌；13是纯化的pET28a-CD19-VHH；M是DL2000(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；M1标准蛋白(KDa)(116、66.2、45、35、25、18.4、14.4)；M2是蛋白分子质量标准。
具体实施方式
一种快速获得纳米抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一、阴性对照的获取；
步骤二、羊驼外周血单个核细胞即PBMC的分离；
步骤三、流式细胞分选；
步骤四、提取阳性细胞RNA，反转录成cDNA；
步骤五、VHH片段的扩增；
步骤六、将VHH片段连入表达载体；
步骤七、重组原核表达载体的PCR鉴定；
步骤八、pet28a-CD19-VHH的表达；
步骤九、表达抗体的ELISA活性鉴定。
所述步骤一包括购买羊驼后，标记羊驼，在免疫前颈脉取血30mL，放入预先准备好的加有抗凝剂的50毫升离心管内，抗凝剂用量20-50U每毫升血，分离外周血单个核细胞即PBMC，液氮保存备用。
所述步骤二整个过程为无菌操作，其中具体步骤如下：
步骤a、采血时使用的是15mL的离心管，将血液带回实验室后直接将离心管放入离心机中离心，整个过程室温即可，根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长；
步骤b、吸取上层血清，血清800μL，每管分装标记，保存在-80℃冰箱备用；
步骤c、吸完血清后剩余血液有2.5mL，共3管；将3管血液都吸到一个50mL的离心管内，用2-3ML的灭菌的PBS洗干净离心管，这时50mL离心管内的血液10mL；再加入5mL的PBS稀释，另取一个无菌的50mL离心管，倒入15mL的Ficoll分离液，将稀释好的血液缓慢平稳的平铺在Ficoll分离液上，配平离心；
步骤d、离心后，此时离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层；
步骤e、用吸头吸取上层的血浆层并弃去，因为血清已经分出，所以血浆层液体不多，收集中间第二层环状乳白色单个核细胞层到另一个50mL离心管中，在离心管中加PBS到45mL，混匀，离心10min；
步骤f、在超净台内快速倒掉PBS，将离心管底部PBMC轻轻敲起，再加入PBS至45mL，混匀，重复步骤e再洗一次；
步骤g、加2mL的细胞冻存液，取10μL混匀细胞的细胞冻存液加入10μL台盼蓝混匀在显微镜下用细胞计数板计数；用细胞冻存液调节PBMC浓度，每毫升细胞冻存液保存2×106个细胞。
步骤h、将调好浓度的PBMC分装在细胞冻存管内，放于缓冻盒内-80℃过夜，第二天放入液氮中保存。
所述步骤三包括，生物素标记的CD19，所需原料为生物素标记的CD19蛋白即CD19-Biotin储备液，分子量为56.3KDa，SDS-PAGE结果显示糖基化后分子量为56-66KDa，在100ul体系中每百万个细胞加入藻红蛋白-链霉亲和素即PE-Streptavidin的量为0.015μg，对照试验采用阴性对照，不标记任何荧光素偶联抗体CD19免疫后的细胞；未免疫的天然羊驼PBMC。
所述步骤四包括整个实验过程所用到的试剂，枪头，EP管都是无核糖核酸酶，其中，步骤I、第一次流式分选后得到50000个阳性细胞，分选后从收集管中将收集液转移到1.5mL的离心管中，12000r/min，离心5min弃上清液；步骤II、向步骤I中的阳性细胞中加入1mL的总核糖核酸提取试剂液，用枪来回吹打几次使细胞充分裂解，加200μL氯仿后剧烈震荡30S，静置5min，12000r/min，离心10min，分层，吸取上层液体相到另一1.5mL管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀20mins；步骤III、将沉淀液体转移到RNA提取柱中，3min挂住，用700μL缓冲液W2洗两遍，再用60μL无核糖核酸酶水洗脱，得到阳性细胞RNA；RNA反转录成cDNA；将得到的cDNA转移到已灭菌的1.5mLEP管中，-80℃保存备用。
所述步骤五通过两步PCR扩增获得羊驼抗CD19纳米抗体。
所述步骤六中表达载体与片段酶切条件为载体(1ug)35μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI，NotI各2μL，水51μL，37℃水浴20分钟，80℃失活10分钟，跑琼脂糖凝胶电泳回收定量，片段1ug 20μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI，NotI各2μL，水66μL，37℃水浴20分钟，80℃失活10分钟，跑琼脂糖凝胶电泳回收定量；载体与片段链接条件：载体，50ng/μL，1μL，片段，40ng/μL，1.5μL，10倍浓度的T4脱氧核糖核酸缓冲液1μL，T4脱氧核糖核酸连接酶1μL，水5.5μL，室温1小时连接，转入BL21大肠杆菌感受态。
所述步骤七包括将重组的pet28a-CD19-VHH原核表达载体，利用T7(TAATACGACTCACTATAGGG)和T7ter(TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)引物进行PCR扩增，反应体系20μL，PCR反应程序为95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s(30个循环)；72℃，8min；4℃，10s；将PCR扩增后的产物进行DNA电泳实验，将鉴定后的样品进行测序。
所述步骤八包括将测序后的pet28a-CD19-VHH样品进行序列分析，筛选出序列正确的样品进行诱导表达，诱导表达步骤如下，将pet28a-CD19-VHH菌液按1:100稀释加入100mL的2YT培养基中，37℃，180～200rpm进行摇菌，摇至菌液OD600值为0.6～1.0时，取出少量菌液，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达3～4h，收集菌液，pet28a菌液按照pet28a-CD19-VHH菌液相同诱导表达步骤操作；以未诱导的pet28a菌液、诱导的pet28a菌液和未诱导的pet28a-CD19-VHH作为对照进行SDS-PAGE试验。
所述步骤九包括IPTG诱导、表达后的菌液于离心机中7000rpm，离心10min收集菌体，用PBS(PH7.4)清洗一次，再次离心收集菌体；用10mL的PBS(PH7.4)将菌液吹打混匀，置于冰上，放到超声波细胞粉碎仪中，按超声发振时间5s，间隙时间5s，保护温度60℃，超声功率10％的程序超声破碎10min，将破碎后的菌液放于离心机中7000rpm，离心10min，将上清液进行亲和层析纯化，保存备用；
将Human-CD19蛋白用包被液(PH9.6)稀释到2ng/μL浓度，按每孔100μL加入到酶标板中，放置于4℃冰箱中过夜，第二天进行ELISA实验，ELISA步骤如下：
步骤1、按每孔200μL的PBS-T加入包被后的酶标板进行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于卫生纸巾上拍板确保洗液全部被吸干；
步骤2、按每孔200μL向酶标板中加入5％的脱脂奶粉，室温封闭1h；
步骤3、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，依次将100μL的空白对照液、阴性对照、纯化后的Human-CD19-VHH加入到酶标板中，室温孵育2h；
步骤4、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，按每孔100μL向酶标板加入HRP标记的标签抗体，室温孵育1h；
步骤5按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后向每孔加入100μL的TMB，避光放置10min；
步骤6、向每孔加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应，将酶标板放于酶标仪中，于450nm条件下读数。
应用流式细胞分选技术可以快速获得纳米抗体。pet28a-CD19-VHH即CD19重链抗体可变区片段插入原核表达载体PET28(a)的重组阳性质粒。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种快速获得纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一、阴性对照的获取；
步骤二、羊驼外周血单个核细胞即PBMC的分离；
步骤三、流式细胞分选；
步骤四、提取阳性细胞RNA，反转录成cDNA；
步骤五、VHH片段的扩增；
步骤六、将VHH片段连入表达载体；
步骤七、重组原核表达载体的PCR鉴定；
步骤八、pet28a-CD19-VHH的表达；
步骤九、表达抗体的ELISA活性鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一包括购买羊驼后，标记羊驼，在免疫前颈静脉取血30mL，放入预先准备好的加有抗凝剂的50mL离心管内，抗凝剂用量20-50U每毫升血，分离外周血单个核细胞即PBMC，液氮保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二整个过程为无菌操作，其中具体步骤如下：
步骤a、采血时使用的是15mL的离心管，将血液带回实验室后直接将离心管放入离心机中离心，整个过程室温即可，根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长；
步骤b、吸取上层血清，血清800μL，每管分装标记，保存在-80℃冰箱备用；
步骤c、吸完血清后剩余血液有2.5mL，共3管；将3管血液都吸到一个50mL的离心管内，用2-3mL的灭菌的PBS洗干净离心管，这时50mL离心管内的血液10mL；再加入5mL的PBS稀释，另取一个无菌的50mL离心管，倒入15mL的Ficoll分离液，将稀释好的血液缓慢平稳的平铺在Ficoll分离液上，配平离心；
步骤d、离心后，此时离心管中由上至下分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层；
步骤e、用吸头吸取上层的血浆层并弃去，因为血清已经分出，所以血浆层液体不多，收集中间第二层环状乳白色单个核细胞层到另一个50mL离心管中，在离心管中加PBS到45mL，混匀，离心10min；
步骤f、在超净台内快速倒掉PBS，将离心管底部PBMC轻轻敲起，再加入PBS至45mL，混匀，重复步骤e再洗一次；
步骤g、加2ML的细胞冻存液，取10μL混匀细胞的细胞冻存液加入10μL台盼蓝混匀在显微镜下用细胞计数板计数；用细胞冻存液调节PBMC浓度，每毫升细胞冻存液保存2×106个细胞；
步骤h、将调好浓度的PBMC分装在细胞冻存管内，放于缓冻盒内-80℃过夜，第二天放入液氮中保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤三包括，生物素标记的CD19，所需原料为生物素标记的CD19蛋白即CD19-Biotin储备液，分子量为56.3KDa，SDS-PAGE结果显示糖基化后分子量为56-66KDa，在100ul体系中每百万个细胞加入藻红蛋白-链霉亲和素即PE-Streptavidin的量为0.015μg，对照试验采用阴性对照，不标记任何荧光素偶联抗体CD19免疫后的细胞；未免疫的天然羊驼PBMC。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤四包括整个实验过程所用到的试剂，枪头，EP管都是无核糖核酸酶，其中，步骤I、第一次流式分选后得到50000个阳性细胞，分选后从收集管中将收集液转移到1.5mL的离心管中，12000r/min，离心5min弃上清液；步骤II、向步骤I中的阳性细胞中加入1mL的总核糖核酸提取试剂液，用枪来回吹打几次使细胞充分裂解，加200μl氯仿后剧烈震荡30S，静置5min，12000r/min，离心10min，分层，吸取上层液体相到另一1.5mL管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀20mins；步骤III、将沉淀液体转移到RNA提取柱中，3min挂住，用700ul缓冲液W2洗两遍，再用60ul无核糖核酸酶水洗脱，得到阳性细胞RNA；RNA反转录成cDNA；将得到的cDNA转移到已灭菌的1.5mLEP管中，-80℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤五通过两步PCR扩增获得羊驼抗CD19纳米抗体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤六中表达载体与片段酶切条件为载体(1ug)35μL，10倍浓度快切酶缓冲液10μL，两种酶NdeI，NotI各2μL，水51μL，37℃水浴20分钟，80℃失活10分钟，跑琼脂糖凝胶电泳回收定量，片段1μg 20μL，10倍浓度快切酶缓冲液10微升，两种酶NdeI，NotI各2μL，水66μL，37℃水浴20分钟，80℃失活10分钟，跑琼脂糖凝胶电泳回收定量；载体与片段链接条件：载体，50ng/μL，1ul，片段，40ng/μL，1.5μL，10倍浓度的T4脱氧核糖核酸缓冲液1μL，T4脱氧核糖核酸连接酶1μL，水5.5μL，室温1小时连接，转入BL21大肠杆菌感受态。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤七包括将重组的pet28a-CD19-VHH原核表达载体，利用T7(TAATACGACTCACTATAGGG)和T7ter(TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)引物进行PCR扩增，反应体系20μL，PCR反应程序为95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，经过30个循环；72℃，8min；4℃，10s；将PCR扩增后的产物进行DNA电泳实验，将鉴定后的样品进行测序。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤八包括将测序后的pet28a-CD19-VHH样品进行序列分析，筛选出序列正确的样品进行诱导表达，诱导表达步骤如下，将pet28a-CD19-VHH菌液按1:100稀释加入100mL的2YT培养基中，37℃，180～200rpm进行摇菌，摇至菌液OD600值为0.6～1.0时，取出少量菌液备用，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达3～4h，收集菌液，pet28a菌液按照pet28a-CD19-VHH菌液相同诱导表达步骤操作；以未诱导的pet28a菌液、诱导的pet28a菌液和未诱导的pet28a-CD19-VHH作为对照进行SDS-PAGE试验。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤九包括IPTG诱导、表达后的菌液于离心机中7000rpm，离心10min收集菌体，用PBS(PH7.4)清洗一次，再次离心收集菌体；用10mL的PBS(PH7.4)将菌液吹打混匀，置于冰上，放到超声波细胞粉碎仪中，按超声发振时间5s，间隙时间5s，保护温度60℃，超声功率10％的程序超声破碎10min，将破碎后的菌液放于离心机中7000rpm，离心10min，将上清液进行亲和层析纯化，保存备用；
将Human-CD19蛋白用包被液(PH9.6)稀释到2ng/μL浓度，按每孔100μL加入到酶标板中，放置于4℃冰箱中过夜，第二天进行ELISA实验，ELISA步骤如下：
步骤1、按每孔200μL的PBS-T加入包被后的酶标板进行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于卫生纸巾上拍板确保洗液全部被吸干；
步骤2、按每孔200μL向酶标板中加入5％的脱脂奶粉，室温封闭1h；
步骤3、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，依次将100μL的空白对照液、阴性对照、纯化后的H-CD19-VHH加入到酶标板中，室温孵育2h；
步骤4、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，按每孔100μL向酶标板加入HRP标记的标签抗体，室温孵育1h；
步骤5按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后向每孔加入100μL的TMB，避光放置10min；
步骤6、向每孔加入50μL的2mol/L的硫酸溶液，终止反应，将酶标板放于酶标仪中，于450nm条件下读数。
11.一种权利要求1所述方法的应用，其特征在于：应用流式细胞分选技术可以快速获得纳米抗体。
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