CN102219853A

CN102219853A - 抗h5n1型禽流感病毒的小羊驼vhh重链抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102219853A
Application number: CN2010101480830A
Authority: CN
Inventors: 赵国屏; 王颖; 熊慧; 严安; 包文静; 金维荣; 陈志南; 孙志伟; 车小燕
Original assignee: Shanghai Human Genome Research Center
Current assignee: Shanghai Human Genome Research Center
Priority date: 2010-04-15
Filing date: 2010-04-15
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2030-04-15
Also published as: CN102219853B

Abstract

本发明公开了一种抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，所述小羊驼VHH重链抗体选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，所述的SEQ ID NO.1～SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列分别编码具有SEQID NO.11～SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的蛋白。此外，本发明还公开了上述抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，该方法通过引物设计、PCR条件、连接和转化来保证抗体库的容量和多样性，构建了抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库；然后通过优化的抗体库的固相筛选，从上述抗体库进行了噬菌体展示，并从中筛选出10个噬菌体展示抗体(具有SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列)。此外，本发明还公开了上述小羊驼VHH重链抗体在H5N1型禽流感病毒凝集素血凝抑制中的应用。

Description

抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体。此外，本发明还涉及该抗体的制备方法和用途。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒的简称，是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合症，被国际兽疫局定为A类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。禽流感病毒根据其表面蛋白质的不同被分为H1到H15等15种亚型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7两种亚型引起，而人对其中的H1和H3亚型易感。据世界卫生组织(WHO)统计，从2003年到2006年6月20日，共228人感染了H5N1亚型禽流感病毒，其中130人死亡，死亡率达57％；根据国家卫生部的疫情信息，2005年至2009年3月，我国共有33例感染高致病性禽流感病例，均为H5N1核酸阳性，并且死亡率超过了80％。尽管没有证据表明禽流感病毒会直接引起人类流感暴发，但从进化角度看，人类流感与原先在动物中传播的流感病毒有关。很可能是在历史动物流感病毒的某些毒株发生了变异，获得对人的致病性以及在人群中传播的能力，成为人类流感病毒，并有可能进一步引起人际间传播。事实也是如此：1997年香港报道了首个H5N1禽流感病毒直接由鸡传播到人的事件，继而2006年WHO宣布证实了在印度尼西亚的一起人传人禽流感事件。禽流感是继SARS之后，传染病给中国乃至全球公共卫生安全带来的又一个巨大挑战。

由于病毒引发的呼吸道疾病没有特异的临床表现，必须依靠实验室病原学检测，才能实现早期诊断以控制疫情。HA(血凝素)是一种病毒糖蛋白，以三聚体形式存在于病毒囊膜表面，在病毒吸附、穿膜及决定病毒的宿主特异性和致病力方面均起着相当关键的作用，是病毒最主要的表面抗原及有效的抗体中和位点。先前WHO推荐的禽流感检测方法包括核酸检测基础上的RT-PCR或实时RT-PCR法，基于病毒培养物检测免疫荧光技术和血凝或者血凝抑制试验。目前禽流感实验室早期诊断方法主要集中在HA的核酸检测上，此法为中国卫生部所采用。美国FDA批准的多个检测试剂盒也是基于核酸检测的实时RT-PCR技术上。目前国内生产的H5N1型禽流感试剂盒的生产同样采取类似策略。但是，该方法存在着突出的弊端，如核酸检测易出现假阳性和假阴性，还需要昂贵仪器及熟练技术人员。传染病检测中使用较多是基于抗原成分检测ELISA(酶联免疫吸附剂测定)方法，ELISA检测方法操作简便、具有灵敏度高、快速、容易判断、特异性较高、实际可操作性强等优点。以往的实验室水平研究也表明，抗原成分检测敏感性低，会导致严重漏诊情况，目前也没有非常成熟的产品问世。而筛选生物活性的抗H5的抗体，则是必不可少的前提工作。国内外，相关抗体的筛选工作已经陆续展开。

综上所述，筛选多个活性高且具有潜在中和功能的抗H5抗体，特别是诸如单域抗体之类的新型抗体，对提高H5N1高致病性禽流感的实验室早期诊断和临床治疗水平，是一件极有意义的工作。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体；

本发明要解决的技术问题之二是提供上述抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法；

本发明要解决的技术问题之三是提供上述抗HSN1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的用途。

为解决上述技术问题，本发明通过引物设计、PCR条件、连接和转化等实验环节来保证抗体库的容量和多样性，构建了抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库，库容为3×10⁸。随机挑选12个抗体表达克隆进行测序，DNA序列结果表明为14个独立的克隆，所建噬菌体展示抗体库多样性好。

另外，本发明通过优化固相筛选平台，从上述抗体库进行了噬菌体展示，并从中筛选出10个噬菌体展示抗体(13、15、16、17、18、19、20、21、22、23号)，它们对H5型禽流感凝集素具有较高的结合能力。

在本发明的一方面，提供一种抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，所述小羊驼VHH重链抗体选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

所述的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列分别编码具有SEQ IDNO.11～SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的蛋白。

在本发明的另一方面，提供上述抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)小羊驼免疫和血凝抑制效价检测，淋巴细胞分离，细胞总RNA抽提，cDNA合成；

(2)构建抗H5N1型禽流感小羊驼VHH重链抗体库，包括：

A.设计引物，具体为：

根据引导肽序列设计保守引物LP-leader：5-GTGGTCCTGGCTGCTCTW(SEQ IDNO.21)；

在恒定区CH2区域设计保守引物GSP-RT：5-CGCCATCAATRTACCAG TTGA-3(SEQ IDNO.22)；

在可变区FR1区域的序列信息上设计兼并引物AlpVhFR1-SfiI-MA：cctttctatgcGGCCCAGCCGGCC ATG GCC CAG KTG CAG CTC GTG GAG TCN GGN GG(SEQ IDNO.23)；

根据长铰链序列设计保守引物Long-NotI：aaggaaaaaa GCGGCCGC TGG TTG TGG TTTTGG TGT CTT GGG TT(SEQ ID NO.24)；

根据短铰链序列设计保守引物Short-NotI：aaggaaaaaa GCGGCCGC GCT GGG GTCTTC GCT GTG GTG CG(SEQ ID NO.25)；

B.优化PCR条件进行PCR反应；步骤B具体为：

1)将合成的cDNA、pfu缓冲液、dNTP、引物LP-leader、引物GSP-RT、pfu聚合酶及水在如下PCR条件下进行PCR反应：94℃预变性3min；然后按以下条件进行30个循环反应，94℃30s，55℃30s，72℃50s；最后72℃延伸5m；琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物；

2)将步骤1)的PCR产物、pfu缓冲液、dNTP、引物AlpVhFR1-Sfi I-MA、引物Long-NotI或Short-NotI、pfu聚合酶及水在如下PCR条件下进行PCR反应：94℃预变性3min；然后按以下条件进行20个循环反应，94℃40s，62℃40s，72℃40s；最后72℃延伸5min；分别割胶回收长铰链片段和短铰链片段，部分样品加A处理后，克隆、验证、测序；

C.载体酶切处理及连接步骤B形成的抗体基因片段；

D.将步骤C的连接产物及制备的电转化感受态细菌一起电转化得到抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库；

(3)优化的抗体库的固相筛选，包括：

a)在步骤(2)构建的抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库中加入噬菌体进行培养，呈现噬菌体抗体库；

b)噬菌体滴度的测定；

c)在噬菌体抗体库中筛选噬菌体展示抗体；

d)噬菌体ELISA鉴定阳性克隆。

在本发明的第三方面，提供了上述抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体在H5N1型禽流感病毒凝集素血凝抑制中的应用。本发明对10个小羊驼VHH重链抗体进行血凝抑制试验，在以大肠杆菌HB2151表达系统中，10个小羊驼VHH重链抗体(13、15、16、17、18、19、20、21、22、23号，分别对应SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列)对应的表达上清具有不同程度血凝抑制效果。它们并且与H1、H3、H7、H9和B型标准抗原没有交叉反应。

本文所用术语“噬菌体抗体库“是指利用PCR技术从生物体内扩增编码抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，形成噬菌体抗体，利用特异性抗原与抗体的结合从噬菌体抗体库筛选获得特异性抗体及其基因。

“嵌合重链抗体”系将外源抗体重链可变区基因分别与人重链部分或者全部恒定区基因融合，通过基因工程手段在动物细胞表达获得的异种/人杂合抗体，旨在降低外源性抗体的免疫原性，减少在人体应用时所产生的免疫反应。

本文术语“VHH”全称为Variable domain of heavy chain，即重链抗体可变区。VHH重链抗体指的是就包含上述区域的一种小分子单域抗体(Single domainantibody)，其大小与一个完整的IgG抗体相比为1/12，又称为纳米抗体。正是由于小分子抗体体积小，在应用中穿透力强，免疫原性弱，与抗原结合特异性几乎不变，但半衰期短。最大优点是制备技术较其它基因工程抗体简单，而且在大肠杆菌中易于正确折叠和表达，生产成本低。1993年Hamers等研究发现，在骆驼血清中存在一种天然缺失轻链的抗体，被称为重链抗体(HCAb)。HCAb可变区LOOP比较深，尤其对病毒能产生较强的中和活性，而且是仅有重链，适合后面基因工程的表达。骆驼重链抗体可变区分子VHH具有分子量小、易表达、高特异性和亲和力、高溶解性和稳定性、均一性、同源性、识别独特构象的抗原表位等诸多特点，因而应用也越来越广泛。

经实验验证，本发明筛选的多个活性高且具有潜在中和功能的H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，对H5型禽流感凝集素具有较高的结合能力，即所筛选抗体有明显的针对H5型凝集素的血凝抑制效果，和对H5N1型禽流感病毒抗原的特异性，从而能提高H5N1高致病性禽流感病毒的实验室早期诊断和临床治疗水平。

附图说明

图1是H5N1禽流感疫苗免疫小羊驼血清效价测定示意图；其中包括PBS取代血清进行的阴性对照、鼠源抗H5血清阳性对照和H5N1禽流感疫苗免疫小鼠血清血凝抑制效价测定。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。

实施例1：小羊驼免疫和血凝抑制效价检测

1.免疫方法：颈背部皮下、肌肉多点注射疫苗(重组禽流感病毒灭活疫苗：H5N1亚型，Re-1株；哈尔滨滨维科生物技术开发公司)成多个包块，跟踪观察皮下注射包块的吸收情况，以确认免疫正确。

2.免疫周期：

(1)首次免疫：疫苗注射体积在40-120mL之间；

(2)第二次免疫：一个月后，采集抗血清样品，测定效价；进行第二次免疫，剂量为首次一半；

(3)第三次免疫：四周后采集抗血清样品，测定效价；并且进行第三次免疫，剂量为首次1/4；四周后采集抗血清样品，测定效价。

3.血清处理和血凝抑制效价测定

a)由于血清易引起非特异性吸附，所有血清需要用血清处理液(霍乱滤液即RED液)于37℃等体积处理过夜(约12小时)，然后56℃灭活30min，在加入等体积生理盐水备用(如果检测样本非血清样本而是原核表达产物此步省略)。

b)检测血凝抗原滴度：采用洁净U型96孔板(greiner公司)，25ul(微升)抗原于孔1中，添加75ul的PBS(磷酸缓冲液)混匀得1/4稀释度，取50ul添加到含有50ul PBS的孔2中混匀得1/8；取50ul添加到含有50ul PBS的孔3中混匀得1/16，依次类推，直至孔12的1/8192；50ul 0.75-1％红细胞(红细胞来雄性自豚鼠，PBS溶液配制)于12个孔中，轻轻抖混匀，1h左右，约在1/512处得到++++(完全血凝)或++(部分血凝)结果，该处定为1个血凝单位；阴性对照为未添加抗原的50ul PBS。

c)配制4个血凝单位抗原，约为1/128原始浓度。

d)复核4个血凝单位抗原：100ul的4血凝单位抗原于孔1，取出50ul于孔2中的50ul PBS中混匀，依次类推倍比至孔6；得到血凝单位分别为4，2，1，1/2，1/4，1/8血凝单位抗原稀释液，加入50ul 0.75-1％红细胞，轻轻抖混匀，1h左右，1血凝单位处应为++++(完全血凝)或++(部分血凝)。

e)血凝抑制试验操作：1-12孔，孔1空置，其余添加25ul PBS；50ul待测样品于孔1，取25ul于孔2混匀，依次倍比稀释至孔12；加入25ul 4个血凝单位抗原，轻轻抖混匀室温或者37℃放置15min；加入0.75-1％红细胞50ul，轻轻抖混匀，静置1h左右。

4.对照和无抗血凝物培养物阴性对照稀释试验：

空白对照：50ul PBS代替被检测物

阳性对照：具有中和活性的抗体上清

阴性对照稀释试验：未掺入目标产物的同步培养物

实验结果如图1所示，根据体重和体表面积计算重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-1株)的用量，同步免疫小鼠和小羊驼一个免疫周期(90天)；分别于免疫前、免疫周期第30天和免疫周期第90天采血获得抗血清检测血凝抑制效价；血凝抑制实验时，以PBS溶液代替抗血清，作为阴性对照；由图1可见，在同步免疫的同个时间点，小羊驼的抗H5血清血凝抑制效价远高于鼠源性抗血清。

实施例2：淋巴细胞分离流程

1.麻醉动物：麻醉前，股肌肉处注射1.0mL盐酸阿托品(天津药业集团新郑股份有限公司)；股肌肉注射1.0mL速眠新注射液(长春军需大学兽医研究所)，5min有反应，人工放倒，30min的麻醉有效时间；如果不能自然苏醒，要注射1mL的陆醒宁(长春军需大学兽医研究所)促醒。

2.准备采血：停食12h(防止麻醉后呕吐，此步可省)；颈静脉采血10-20mL，常温，避光放置。

3.血样采集

A.非抗凝血：5mL血样，分装5个EP管；室温下避光放置2h后，再于4℃冰箱放置1h；于4℃下4000rpm离心5min；收集上层析出血清(200ul)，于-20℃可保存半年，于4℃可保存5天；

B.抗凝处理：根据采血量和容器体积，预先加入适量1500u/mL的肝素(钠)母液(Sigma公司)；50mL离心管中加入几滴，注射器也略加润湿一下。准备75％酒精棉球和止血带以及抢救药物(阿托品和肾上腺素，长春军需大学兽医研究所)。

4.自然沉降：采血样品直立试管架，抑或添加等量3％明胶液(Sigma公司)，混匀；1h静置，取上层血浆。[此步可省]

5.血样稀释：4.5mL抗凝(或沉降处理的)血样，用1640基本培养液(GIBCO公司)稀释至2倍体积，即终体积为9mL。

6.血样加入：加入5ml室温平衡的淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程医学研究所)至离心管(最好是玻璃的)，9mL稀释血液用弯管小心加到分离液的上表面，刚开始加时，动作一定要慢、轻柔，而且轻轻旋转离心管，弯管头要离液面较近，并且正对管壁为好；后面就可以加快速度，最终使得分离液界面保持清楚(由于扩散，底部的淋巴分离也还是会泛红，不会影响试验结果)。

7.产物离心：水平离心机1700-1800rpm离心20min，后弯管吸取中间很薄的一层乳白色的淋巴细胞层[不使用离心机刹车，采用断电法关闭离心机]。

8.产物洗涤：1640基本培养基充盈至10mL，混匀后于1200rpm离心10min；再重复两次，但转速为1000rpm；收集产物(B、T和单核细胞混合物)。

9.剔除单核细胞：1640基本培养基悬浮沉淀，进行细胞计数；放于细胞培养瓶，培养1-2h，促使大部分单核细胞贴壁。

10.计数：取上清，并完成细胞计数；重新离心，弃上清，收集沉淀细胞，备用。

实施例3：细胞总RNA抽提

1.每2×10⁷细胞加入1-2mL Trizol(Invitrogen公司，一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶)，移液器吸打均匀后于漩涡振荡器上混匀30秒；室温静置10min(对于组织样品，每100mg组织可以加入1mL的Trizol，液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块)。

2.加入约1/5-2/5体积的氯仿(Sigma公司)，手动上下剧烈颠倒充分混匀1min左右，室温静置5min。

3.4℃，12000rpm离心15min后小心取出上清液(大约不超过3/5的Trizol体积)，将上清液转入新的1.5mL离心管，加入等体积的异丙醇(Sigma公司)，轻轻颠倒混匀，室温静置5-10min(15mL离心管用7500rpm离心20min；混匀时不能太温和，也不要试图取出全部上清)。

4.4℃，12000rpm离心10min后，去上清，向沉淀中加入1mL体积的70％乙醇(Sigma公司)，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀15min(15mL离心管用7500rpm离心20min)；重复1-2次(洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐离子被洗去)。

5.去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水(30-50)充分溶解沉淀，纯RNA的A260/A280的比值为2.0，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值二者比值在1.8-2.2之间为好；用分光光度法于260nm(A260)测定RNA得率，1个单位等于40ug/mL ssRNA。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巯基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA(在水中测定A260/A280，比值将变低0.3左右)。

6.RNA电泳，检测RNA质量，28S条带亮度为18S条带亮度两倍以上。

7.长期保存RNA的最好办法是盐/醇悬液，因为醇低温抑制所有的酶活性。

实施例4：cDNA合成

利用Invitrogen公司

公司系列产品SSIII FIRST-STRAND SUPER MIX试剂盒操作，具体操作参见说明书。

实验结果：

利用淋巴细胞分离液，离心分离得到约10⁷个淋巴细胞，抽提出总RNA。OD₂₆₀和OD₂₈₀值二者比值在1.9，总量为4ug。跑胶结果表明28s的亮度为18s的2倍左右。抽提RNA的质量尚好。以RNA为模板，逆转录引物为oligo dT和随机引物混合物，另一组用特异性引物GSP-RT(5-CGCCATCAATRTACCAGTTGA-3)，逆转录所得cDNA冻存-20℃备用。

实施例5：建库

1.引物设计

根据网上数据库提供的信息，并且与其它骆驼科(Camelid)动物重链抗体序列比较，并结合已发表文献，根据引导肽序列设计保守引物，即LP-leader；同时在恒定区CH2区域设计保守引物，即GSP-RT；在可变区FR1区域的序列信息上，设计兼并引物，即AlpVhFR1-SfiI-MA；最后根据长铰链序列设计保守引物，即Long-NotI；根据短铰链序列设计保守引物，即Short-NotI；

LP-leader：5-GTGGTCCTGGCTGCTCTW(SEQ ID NO.21)

GSP-RT：5-CGCCATCAATRTACCAGTTGA-3(SEQ ID NO.22)

AlpVhFR1-SfiI-MA：cctttctatgcGGCCCAGCCGGCC ATG GCC CAG KTG CAG CTC GTGGAG TCN GGN GG(SEQ ID NO.23)

Long-Not I：aaggaaaaaa GCGGCCGC TGG TTG TGG TTT TGG TGT CTT GGG TT(SEQ IDNO.24)

Short-Not I：aaggaaaaaa GCGGCCGC GCT GGG GTC TTC GCT GTG GTG CG(SEQ ID NO.25)

以上引物委托Invitrogen公司合成。

2.PCR条件优化

反应体系2.1

成分体积

cDNA 3μl

10×pfu buffer 2.5μl

dNTP(10mM) 2μl

Primer LP-leader(20μM) 1μl

Primer GSP-RT(20mM) 1μl

pfu聚合酶(5U/μl) 0.5μl

H₂O 15μl

根据以上体系，按照以下PCR反应条件：94℃预变性3min；然后按以下条件进行30个循环反应，94℃30s，55℃30s，72℃50s；最后72℃延伸5m；琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。PCR反应试剂购自TaKaRa公司。

1.5％琼脂糖凝胶电泳并且回收PCR特异性条带产物，紫外分光光度计定量，于-20℃条件下冻存。PCR产物利用Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，72℃反应20min进行加A(在DNA产物3′末端添加一个dATP碱基)，随后与pMD19-T载体(TaKaRa公司)连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。涂预先用40μl的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，Sigma公司)和10μl 1M IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Sigma公司)至处理过的氨苄抗性(Amp⁺)的LB(Luria-Bertani培养基，GIBCO公司)平板，37℃培养过夜，次日，利用蓝白斑进行阳性克隆筛选，挑取白色克隆，用液体LB培养基(Amp⁺)培养12h，提取质粒，菌落PCR验证正确的克隆进行测序。

利用PCR获得抗体基因具有快速简便的特点，但首要的一点就是在保证抗体基因的多样性的前提下提高反应效率。反应体系仍为2.1体系，循环数设定10，15，25三组扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

根据凝胶电泳结果，采取循环数为15个的反应条件，量扩增产物。PCR产物利用PCR Purification Kit(Qiagen公司)回收，部分用于试验，并且冻存剩余样品。

反应体系2.2

成分体积

反应体系2.1产物 5μl

10×pfu buffer 5μl

dNTP(10mM) 4μl

Primer AlpVhFR1-Sfi I-MA(100mM) 2μl

Primer Long-NotI or Short-NotI(20μM) 1μl

pfu聚合酶(5U/μl) 1μl

H₂O 32μl

根据反应体系2.2，按照以下PCR反应条件：94℃预变性3min；然后按以下条件进行20个循环反应，94℃40s，62℃40s，72℃40s；最后72℃延伸5min。分别割胶回收长铰链片段和短铰链片段(大小均在500bp对照左右)，部分样品加A处理后，克隆、验证、测序。

3.载体酶切处理与连接条件优化

载体pCANTAB5E(GE公司)和纯化后的PCR产物，根据反应液总体积添加1/10体积的NEB公司的限制性核酸内切酶2号缓冲液；同时添加1/10体积的Takara公司限制性核酸内切酶专用10×BSA(牛血清白蛋白)至反应体系总浓度为0.01％(g/100mL)，悬浮于50℃恒温干浴器中SfiI内切酶(NEB公司)于50℃处理3h后，补加NotI内切酶(NEB公司)于37℃继续处理4h；65℃灭活处理后，载体割胶回收，片段

PCR Purification Kit回收，产物定量后，留取适量用作连接，剩余部分冻存于-20℃备用。

为了得到较高的连接效率，首先对抗体基因片段与载体在连接体系中的摩尔比例进行了探索。共设计了三组抗体基因片段与载体连接比例，分别为1∶1、1.5∶1和2∶1。体系中DNA浓度为20ng/μl，T4连接酶(TaKaRa公司)16℃连接3～4h。1％琼脂糖凝胶电泳检测。

4.电转化感受态细菌的制备及电转

1)在转化前一天挑宿主菌TG1单克隆，37℃，摇床培养过夜。

2)1％转接于200mL不含MgCl₂的SOB培养基(GIBCO公司，普通LB也可)，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.35-0.4。立即放入冰水混合物中冷却。

3)4℃，3000rpm，10min，离心沉淀菌体。离心完毕后，弃去上清。

4)冰冷的无菌水悬浮菌体，将悬液分装到50mL尖底薄壁离心管(BD公司)中，4℃，4000rpm，离心10min；弃去上清，冰冷无菌水悬浮菌体，4℃，4000rpm，离心15min。

5)弃去上清，用冰冷10％甘油悬浮菌体，4℃，4200rpm，离心10min；弃去上清，冰冷10％甘油悬浮菌体，4℃，4200rpm，离心15min。

6)弃去上清，沉淀重悬于1mL10％甘油，90ul分装冰上放置备用或者冻存于-80℃。

7)加入待转化连接产物(不超过总体积10％)，混匀放置10min。

8)将连接产物与感受态菌液混合物加入0.1cm电击杯(Bio-Rad公司)。

9)电击参数：0.2cm电击杯，200Ω，12.5KV/cm，25μF。

10)每个电击杯电击结束后，立即加入37℃预热的SOC培养基1mL，倒入37℃预热的离心管中，随后用3mL SOC培养基洗电击杯3次，每次1mL。

11)将所有电击完成后，立即将转化菌液在37℃，缓慢(150～180rpm)摇床培养1h，浓缩后涂若干块平板(2％葡萄糖，Amp抗性)；同时取10μl稀释10⁴倍，涂板测转化率。

12)37℃，待克隆长到适当大小，用LB培养基洗下，加甘油至10％浓度后分装，于-80℃冻存，从而得到库容为3×10⁸的小羊驼VHH型H5N1免疫抗体库。

实施例6：优化的抗体库的固相筛选

1.噬菌体抗体库的呈现

a)取一支冻存的抗体库，接种50-500uL于200mL 2×YTG培养基(2×YT GIBCO公司培养基中添加葡萄糖至浓度为0.5g/100ML，即Glucose浓度为0.5％)中菌体浓度为OD₆₀₀＝0.35，37℃继续培养约1h至菌体浓度为OD₆₀₀＝0.5。

b)按噬菌体和细菌数量比值MOI＝20∶1的比例加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min。

c)37℃，150rpm缓慢摇床培养1h，加入卡那霉素水溶液至终浓度为50μg/mL，并加IPTG至终浓度为0.1mmol/L。

d)于30℃，220rpm摇床培养10～12h。

e)次日，离心收取培养上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液(20％PEG8000(聚乙二醇，用于原生质体融合和蛋白沉降)+2.5mol/L NaCl)，混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体。

f)4℃，10000rpm离心20min，弃上清，沉淀重悬于5mL含2％BSA和15％甘油的PBS缓冲液中，-70℃冻存备用。

2.噬菌体滴度的测定

I.挑取宿主菌(大肠杆菌XL1-Blue)单克隆接种于LB培养基，37℃，摇床培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.5)。

II.取50μl制备好的噬菌体悬液，用LB培养基进行系列10倍梯度稀释。

III.向稀释到一定倍数的悬液中加入对数生长期的宿主菌，37℃，150～180rpm摇床培养1h。

IV.取培养后的菌液100或200μl涂布在LB平板上，37℃培养过夜(约12h)。

投入量：保证达到库容量的50倍以上，如库容量为10⁸，噬菌体抗体库的投入量应为50×10⁸×30(包装有单链抗体的量为3％)，即1.5×10¹¹。

3.第一轮筛选

a)包被。H5N1凝集素(哈尔滨滨维科生物技术开发公司)包被量为800ul，浓度25ug/mL；阴性对照酪蛋白5ug/mL，4℃包被18h以上。弃包被液，PBST(PBS溶液加上Tween-20，浓度为0.1％)洗2次，PBS一次2-4min/次；之后用3-4mL封闭液2％BSA 37℃封闭2h。

b)结合。噬菌体抗体库调至2％BSA和0.1％Tween 20，于37℃预封闭30min，加入弃去封闭液的免疫管中，37℃静置1h，转入室温静置30min(轻摇)。

c)洗涤。用PBST洗涤10次，PBS洗涤5次，3min/次。

d)洗脱。1mL 0.1M pH2.2HCl-Glycin(盐酸甘氨酸缓冲系统)洗脱，室温摇动10min，吸出洗脱液，80ul左右1M Tris(三羟甲基氨基甲烷)中和至7.4；将免疫管用对1.2mL数生长期的XL1-Blue直接感染，同时将HCl-Glycin洗脱并且中和的噬菌体抗体9倍体积对数期XL1-Blue感染。共4份样品室温感染10min，转入37℃、150rpm培养1h，分别取1％，0.1％，0.01％涂板计算产出量。剩余部分混合离心后浓缩到为1mL，分别涂于2块12CM直径LBATG(GIBCO公司LB培养基中添加以下下列物质，即氨苄青霉素Amp：100ug/mL；四环素Tel：10ug/mL；葡萄糖Glucose：0.5％；)固体培养板，37℃培养过夜(约12h)。

e)呈现。将培养过夜培养板上的菌落刮下，部分投入下一轮筛选，剩余部分冻存。将部分菌液加入到100mL LBATG培养液(GIBCO公司LB培养基中添加以下下列物质，即氨苄青霉素Amp：100ug/mL；四环素Tel：10ug/mL；葡萄糖Glucose：0.5％)中，使菌浓度为OD₆₀₀＝0.35左右，于37℃培养约1h至OD₆₀₀＝0.5(菌量为1×10⁸/mL)，加入50∶1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后室温静置15min，于37℃、150rpm培养1h后离心获得沉淀。在90mL的LBATK GIBCO公司LB培养基中添加下列物质，即氨苄青霉素Amp：100ug/mL；四环素Tel：10ug/mL；卡那霉素Kan：50μg/mL；混匀后等分为3份：其中一份加入IPTG至终浓度为0.1mM和Glucose至0.25％(g/100ml)(6uL 0.5MIPTG，300uL 25％葡萄糖)；一份加入IPTG至终浓度为0.1mM；第三份为空白对照；三份样本继续于30℃，180rpm培养过夜(约12h)。

f)次日，细菌培养物，4℃，10000-14000rpm离心30min后收取培养上清；加入1/5体积预冷得PEG/NaCl溶液，混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体；4℃，10000-14000rpm离心20min，沉淀重悬于10mL含2％BSA和15％甘油的PBS缓冲液中，常温下10000rpm离心10min，去除沉淀，获取上清，0.22μm膜(Millipore公司)过滤除菌，-20℃冻存备用。

按以上步骤进行“结合-洗涤-洗脱(感染)”，反复进行三轮。

4.噬菌体ELISA鉴定阳性克隆

a)挑取经筛选后的克隆于96孔深孔板中(greiner公司)，每孔250μl 2×YTATG培养基，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.5，按照MOI＝20∶1加入辅助噬菌体，室温静置15min，37℃，缓慢摇床培养1h，加入等体积2×YTATKI(GIBCO公司2×YT培养基中添加以下下列物质，即氨苄青霉素Amp：100ug/mL；四环素Tel：10ug/mL；卡那霉素Kan：50μg/mL，IPTG 0.2mmol/L)，30℃，摇床200rpm培养过夜(约12h)。

b)次日，10000rpm离心10min收取上清，加入BSA至终浓度2％，加入Tween-20至终浓度0.1％，37℃静置15min，备用。

c)H5亚型H1抗原(凝集素)用包被液稀释至150μg/mL，加入96孔酶联板，50μl/孔，4℃包被过夜。

d)次日，弃包被液，酶联板(greiner公司)用PBST洗2次，PBS洗一次，每次3min，用2％BSA+0.1％Tween-20封闭，200μl/孔，37℃，2h。

e)弃去封闭液，加入经封闭后的单克隆噬菌体抗体，50μl/孔，37℃，静置1h。

f)弃去液体，用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。

g)将HRP-标记鼠抗M13抗体(GE公司)用PBST稀释，稀释比例为1∶5000，同时加入BSA至终浓度2％，37℃预封闭15min。

h)将预封闭后的鼠抗M13抗体加入酶联板，50μl/孔，37℃静置30min。

i)弃去液体，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。

j)弃去洗涤液，加入底物OPD显色液，50μl/孔，室温静置显色。用50ul 2mol H₂SO₄终止显色。酶标仪测定光吸收值。

相关试剂配方说明如下：

包被缓冲液(pH 9.6)：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水至1000ml，灭菌；

封闭液：1×PBS+2％BSA+(0.1％Tween20)；

噬菌体上清封闭母液(100孔用量)：0.6g BSA，300ul 10％Tween20，PBS至6ml；

洗涤液：1×PBS+(0.1％Tween20)；

底物液稀释液(PH5.0柠檬酸磷酸缓冲液)：0.2M Na₂HPO₄.12H₂O(71.63g/L)25.7ml，0.1M C₆H₈O₇.H₂O柠檬酸(21.014g/L)24.3ml，蒸馏水50ml至总体积95-100mLOPD母液(10mg/ml)∶50mg于5ml底物稀释液，避光冻存，500ul分装；

OPD工作液∶500ul OPD母液，于12ml底物液稀释液，使用时添加8ul 30％H₂O₂，H₂O₂的工作浓度为约0.02％；OPD配制后的效期为30min，请新鲜配置避光；

终止液：2M H₂SO₄5ml 98％的浓硫酸加去离子水至25ml。

5.试验结果：

固相筛选一共经过三轮，第一轮筛选得库容为2×10⁶，而噬菌体展示后的滴度测定为10¹¹CFU；第二轮筛选目标抗原浓度调整为5ug/mL，根据第一轮库容2×10⁶，本轮投入量为3×10⁹30ul第一轮展示的噬菌体10¹¹CFU，PBS洗涤时，添加NaCl到0.2M，得到库容为5000-10000，克隆数合适，直接进入验证阶段。

第二轮筛选得到5000-10000个克隆，挑选100个进行ELISA检测。实验结果显示阳性率大于60％。通过对阳性克隆的重复验证，两次实验结果均表明：样品/空白比值主要集中在3.0和8.0附近。因此从1000个克隆中，ELISA厘选出106个比值主要集中在3.0的阳性克隆，进一步验证试验，共得到10个重复性较好的克隆对应的小羊驼VHH重链抗体(13、15、16、17、18、19、20、21、22、23号，分别对应SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列及SEQ ID NO：11～SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列)，见表1。

表1噬菌体展示的小羊驼VHH重链抗体ELISA酶标仪检测值(初筛)

实施例7：大肠杆菌HB2151宿主中表达小羊驼VHH重链抗体

上述实验中的10个抗体的表达均在原始宿主，即大肠杆菌XL1-blue中进行的。而由于该宿主具有“琥珀突变”抑制作用，所以部分表达的抗体C端融合有噬菌体GIII蛋白，而该融合蛋白对血凝的影响未知。为了排除该融合蛋白的影响，挑选小羊驼VHH重链抗体(13、15、16、17、18、19、20、21、22、23号)克隆对应的质粒转化到大肠杆菌HB2151宿主中表达不含GIII融合蛋白小羊驼VHH重链抗体。表达上清对H5亚型和其它亚型的的血凝抑制活力，如表2所示，表2是在以大肠杆菌HB2151表达系统中，分泌的10个小羊驼VHH重链抗体(13、15、16、17、18、19、20、21、22、23号)对不同亚型HA血凝抑制效价测定；还包括针对不同亚型HA小鼠来源阳性血清的血凝抑制效价。

表2小羊驼VHH重链抗体血凝抑制效价测定

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体及其制备方法和用途

<130>NP-10-14037

<160>25

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggcccagg tgcagctcgt ggagtcggga ggaggctcga tgaagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtacagcctc tggattcact ttgagttatt acgccatagg ctggttccgc 120

caggtccctg gcaaggagcg cgaggggttg gtatgtgtta gtgctgtcga tggtagtgtc 180

aactatgcag actccgtgaa gggccgattc accttctcca gcgacgctgc caagaataca 240

ttttatctgg agatgagcag cctgcaaccg gaggacacgg ccatttatta ctgtgcggca 300

gatgatcccc cctttcactg cgactgggct cctaatgatt gggagttctg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>2

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atggcccagg tgcagctcgt ggagtcgggg ggaggctcgg tgaaccctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcact ttgagttatt acgccatagg ctggttccgc 120

caggtccctg ggaaggagcg cgaggggttg gtatgtgtta gtcctgtcga tggtagtgtc 180

aactatgcag actccgtgaa gggacgattc accttctcca gcgacgctgc caagaataca 240

ttttatctgg agatgagcag cctgcaaccg gaggacacgg ccatttatta ctgtgcggca 300

gatgatcccc cctttcactg cgactgggct cctaatgatt atgacttctg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>3

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggcccagg tgcagctcgt ggagtcaggg ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctcta 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcact ttgagctatt acgccatagg ctggttccgc 120

caggccccag ggaaggagcg cgaggggttg gtatgtgtta gcgctgtcga tggtagcgtc 180

aactatgcag actccgtgaa gggtcgattc accttctcca ttgacaatgc caagaacaca 240

ttttacttgg aaatgaccag cctgaaaccg gaggacacgg ccaaatatta ctgtgcggca 300

gatgatcccc ccttttcttg cgactgggct cctaatgatt atgacttctg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>4

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atggcccagt tgcagctcgt ggagtcgggg ggaggctcgg tgaagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtacagcctc tggattcact ttgagttatt acgccatagg ctggttccgc 120

caggtccctg ggaaggagcg cgaggggttg gtatgtgtta gtgctgtcga tggtagtgtt 180

cactatgcag actccgtgaa gggccgattc accttctcca gcgacgctgc caagaacgca 240

ttttatctgg agatgagcaa cctgcaaccg gaggacacgg ccaaatatta ctgtgcggca 300

gatgatcctc cttttcactg cgactgggct cctaatgatt gggaattctg gggccagggg 360

acccaggtcg ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>5

<211>417

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atggcccagt tgcagctcgt ggagtctggt ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

acactctcct gtgcagcctc tgaattcagt atggattatt atgccatagg ctggttccgc 120

caggccccag ggaaggagcg tgagggggtc tcatgtatta gttatactgg tgaacgcaca 180

ctctctgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagggaacg 240

gtgtatctgc aaatgaacag cctgagacct gaggacacag ccgtttatta ctgtgcagca 300

gaatcgcccc ccaacccgac tgactactgt tcagagtctc tgaacacata tgacgtctgg 360

ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca gaacccaaga caccaaaacc acaacca 417

<210>6

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atggcccagg tgcagctcgt ggagtctggg ggaggctcga tgaagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtacagcctc tggattcagt ttgagttatt acgccatagg ctggttccgc 120

caggtccctg gcaaggagcg cgaggggttg gtatgtgtta gtgctgtcga tggtagtgtc 180

aactatgcag actccgtgaa gggccgattc accttctcta gcgacgctac taagaataca 240

ttttatctgg agatgagcag cctgcaaccg gaggacacgg ccatttatta ctgtgcggca 300

gatgatcccc cctttcattg cgactgggct cctaatgatt gggagttctg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc agcgcaccac agcgaagacc ccagc 405

<210>7

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atggcccagg tgcagctcgt ggagtctggg ggaggcttgg tgcggccggg ggggtctctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcact ttgagttatt acgcgctagg ctggttccgc 120

caggccccag ggaaggagcg cgaggggatc gcatgtgtta gtgctgtcga tggttcaata 180

gtctatgcag actccatgaa gggccgattc atggtcgacg ttgacaatgc caagaacacg 240

ttctatctgc aaatgaacaa cctgaaactt gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcggca 300

gatgatcccc cctttcattg cgactgggcc ccagatgact atgagtacgt gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>8

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

atggcccagg tgcagctcgt ggagtcggga ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

agactctcct gtgcagcctc aggattcact ttggattatt acgccatagg ctggttccgt 120

caggtcccgg ggaaggagcg cgagggggtt gtatgtgtta gtgctgttga tggccacata 180

aactatgcag actccgtgaa gggccgattc gccttctcta aagataatgc caagaatacg 240

atgtatctgc aaatgaacag cttgaagcct gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcggca 300

gatgaccccc cctttcattg cgactgggcg cctaatgact gggaattctt gggccagggg 360

acccaggtca ccgtttcctc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>9

<211>408

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

atggcccagt tgcagctcgt ggagtccggt ggaggcttgg tgcagcccgg ggggtctctg 60

cgactctcct gtgcagcctc aggattcggc ttaaattatt atagtatagg ctggttccgc 120

caggccccgg ggaaggagcg cgaggggatt gtatgtgttg gcgctgcaga tggccgtata 180

gagtatgcag actccgtgaa ggaccgattc atcttctcga aagacgatgc caagaacacg 240

atgtatcttc aaatgaacaa cctgagacct gaggactcgg ccatttatta ctgtgcggcg 300

gatgaccccc cctttccttg ccgctgggcc cctaatggtt atgacttcat cggccacggg 360

acccaggtca ccgtctcccc agaacccaag acaccaaaac cacaacca 408

<210>10

<211>417

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atggcccagg tgcagctcgt ggagtctggg ggaggcttgg tgcagcctgg ggggtctctg 60

aggctctcct gtgcagcgag tggattcagt atggattatt atgccatagg ctggttccgc 120

caggccccag ggaaggagcg tgagggggtc tcgtgtgtta gttataccgc cgaaaccaca 180

ctcacttcag actccgtcaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caaggacacg 240

gtgtatctac aaatggacag cctgaaacct gaggacacag ccgtttatta ctgtgcagcg 300

gaatcgcccc ccaacccgac tgactactgt tcactctctc tgaagacata tgacgtctgg 360

ggccagggga cccaggtcac cgtctccaat gaacccaaga caccaaaacc acaacca 417

<210>11

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

MAQVQLVESG GGSMKPGGSL RLSCTASGFT LSYYAIGWFR QVPGKEREGL VCVSAVDGSV 60

NYADSVKGRF TFSSDAAKNT FYLEMSSLQP EDTAIYYCAA DDPPFHCDWA PNDWEFWGQG 120

TQVTVSSEPK TPKPQP 136

<210>12

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>12

MAQVQLVESG GGSVNPGGSL RLSCAASGFT LSYYAIGWFR QVPGKEREGL VCVSPVDGSV 60

NYADSVKGRF TFSSDAAKNT FYLEMSSLQP EDTAIYYCAA DDPPFHCDWA PNDYDFWGQG 120

TQVTVSSEPK TPKPQP 136

<210>13

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>13

MAQVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGFT LSYYAIGWFR QAPGKEREGL VCVSAVDGSV 60

NYADSVKGRF TFSIDNAKNT FYLEMTSLKP EDTAKYYCAA DDPPFSCDWA PNDYDFWGQG 120

TQVTVSSEPK TPKPQP 136

<210>14

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>14

MAQLQLVESG GGSVKPGGSL RLSCTASGFT LSYYAIGWFR QVPGKEREGL VCVSAVDGSV 60

HYADSVKGRF TFSSDAAKNA FYLEMSNLQP EDTAKYYCAA DDPPFHCDWA PNDWEFWGQG 120

TQVAVSSEPK TPKPQP 136

<210>15

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<400>15

MAQLQLVESG GGLVQPGGSL TLSCAASEFS MDYYAIGWFR QAPGKEREGV SCISYTGERT 60

LSADSVKGRF TISRDNAKGT VYLQMNSLRP EDTAVYYCAA ESPPNPTDYC SESLNTYDVW 120

GQGTQVTVSS EPKTPKPQP 139

<210>16

<211>135

<212>PRT

<213>人工序列

<400>16

MAQVQLVESG GGSMKPGGSL RLSCTASGFS LSYYAIGWFR QVPGKEREGL VCVSAVDGSV 60

NYADSVKGRF TFSSDATKNT FYLEMSSLQP EDTAIYYCAA DDPPFHCDWA PNDWEFWGQG 120

TQVTVSSAHH SEDPS 135

<210>17

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>17

MAQVQLVESG GGLVRPGGSL RLSCAASGFT LSYYALGWFR QAPGKEREGI ACVSAVDGSI 60

VYADSMKGRF MVDVDNAKNT FYLQMNNLKL EDTAVYYCAA DDPPFHCDWA PDDYEYVGQG 120

TQVTVSSEPK TPKPQP 136

<210>18

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>18

MAQVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGFT LDYYAIGWFR QVPGKEREGV VCVSAVDGHI 60

NYADSVKGRF AFSKDNAKNT MYLQMNSLKP EDTAVYYCAA DDPPFHCDWA PNDWEFLGQG 120

TQVTVSSEPK TPKPQP 136

<210>19

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<400>19

MAQLQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGFG LNYYSIGWFR QAPGKEREGI VCVGAADGRI 60

EYADSVKDRF IFSKDDAKNT MYLQMNNLRP EDSAIYYCAA DDPPFPCRWA PNGYDFIGHG 120

TQVTVSPEPK TPKPQP 136

<210>20

<211>139

<212>PRT

<213>人工序列

<400>20

MAQVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGFS MDYYAIGWFR QAPGKEREGV SCVSYTAETT 60

LTSDSVKGRF TISRDNAKDT VYLQMDSLKP EDTAVYYCAA ESPPNPTDYC SLSLKTYDVW 120

GQGTQVTVSN EPKTPKPQP 139

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>21

gtggtcctgg ctgctctw 18

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>22

cgccatcaat rtaccagttg a 21

<210>23

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>23

cctttctatg cggcccagcc ggccatggcc cagktgcagc tcgtggagtc nggngg 56

<210>24

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

aaggaaaaaa gcggccgctg gttgtggttt tggtgtcttg ggtt 44

<210>25

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>25

aaggaaaaaa gcggccgcgc tggggtcttc gctgtggtgc g 41

Claims

1.一种抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，其特征在于，所述小羊驼VHH重链抗体选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，其特征在于，所述的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列分别编码具有SEQ IDNO.11～SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的蛋白。

3.一种如权利要求1或2所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(2)构建抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体库，包括：

a)设计引物；

b)优化PCR条件进行PCR反应；

c)载体酶切处理及连接步骤B形成的抗体基因片段；

d)将步骤C的连接产物及制备的电转化感受态细菌一起电转化得到抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库；

(3)优化的抗体库的固相筛选，包括：

b)噬菌体滴度的测定；

c)在噬菌体抗体库中筛选噬菌体展示抗体；

d)噬菌体ELISA鉴定阳性克隆。

4.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)的步骤A中所述设计引物具体为：

在恒定区CH2区域设计保守引物GSP-RT：5-CGCCATCAATRTACCAGTTGA-3(SEQ IDNO.22)；

根据短铰链序列设计保守引物Short-NotI：aaggaaaaaa GCGGCCGC GCT GGG GTCTTC GCT GTG GTG CG(SEQ ID NO.25)。

5.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)的步骤B具体为：

1)将合成的cDNA、pfu缓冲液、dNTP、引物LP-leader、引物GSP-RT、pfu聚合酶及水在如下PCR条件下进行PCR反应：94℃预变性3min；然后按以下条件进行30个循环反应，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s；最后72℃延伸5m；琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物；

2)将步骤1)的PCR产物、pfu缓冲液、dNTP、引物AlpVhFR1-SfiI-MA、引物Long-NotI或Short-NotI、pfu聚合酶及水在如下PCR条件下进行PCR反应：94℃预变性3min；然后按以下条件进行20个循环反应，94℃ 40s，62℃ 40s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min；分别割胶回收长铰链片段和短铰链片段，部分样品加A处理后，克隆、验证、测序。

6.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(3)的步骤a)具体为：

1)取一支冻存的抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库，接种50-500ul于200mL2×YTG培养基中菌体浓度为OD₆₀₀＝0.35，37℃继续培养约1h至菌体浓度为OD₆₀₀＝0.5；

2)按噬菌体和细菌数量比值MOI＝20∶1的比例加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min；

3)37℃，150rpm缓慢摇床培养1h，加入卡那霉素水溶液至终浓度为50μg/mL，并加IPTG至终浓度为0.1mmol/L；

4)于30℃，220rpm摇床培养10～12h；

5)次日，离心收取培养上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，该PEG/NaCl溶液含20％PEG8000和2.5mol/L NaCl，混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体；

6)4℃，10000rpm离心20min，弃上清，沉淀重悬于5mL含2％BSA和15％甘油的PBS缓冲液中，-70℃冻存备用。

7.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(3)的步骤b)具体为：

1)挑取宿主菌大肠杆菌XL1-Blue单克隆接种于LB培养基，37℃，摇床培养至对数生长期OD₆₀₀＝0.5；

2)取50μl制备好的噬菌体悬液，用LB培养基进行系列10倍梯度稀释；

3)向稀释到一定倍数的悬液中加入对数生长期的宿主菌，37℃，150～180rpm摇床培养1h；

4)取培养后的菌液100或200μl涂布在LB平板上，37℃培养过夜。

8.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(3)的步骤c)具体为：

1)包被：H5N1凝集素包被量为800ul，浓度25ug/mL；阴性对照酪蛋白5ug/mL，4℃包被18h以上；弃包被液，PBST洗2次，PBS一次2-4min/次；之后用3-4mL封闭液2％BSA 37℃封闭2h；

2)结合：噬菌体抗体库调至2％BSA和0.1％Tween 20，于37℃预封闭30min，加入弃去封闭液的免疫管中，37℃静置1h，转入室温静置30min；

3)洗涤：用PBST洗涤10次，PBS洗涤5次，3min/次；

4)洗脱：1mL 0.1M pH2.2HCl-Glycin洗脱，室温摇动10min，吸出洗脱液，80ul左右1M Tris中和至7.4；将免疫管用对1.2mL数生长期的XL1-Blue直接感染，同时将HCl-Glycin洗脱并且中和的噬菌体抗体9倍体积对数期XL1-Blue感染；共4份样品室温感染10min，转入37℃、150rpm培养1h，分别取1％，0.1％，0.01％涂板计算产出量；剩余部分混合离心后浓缩到为1mL，分别涂于2块直径为12CM培养板，37℃培养过夜；

5)呈现：收集过夜培养板上的菌落，部分投入下一轮筛选，剩余部分冻存；将部分菌液加入到100mL LBATG培养液中，使菌浓度为OD₆₀₀＝0.35，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.5，加入50∶1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后室温静置15min，于37℃、150rpm培养1h后离心获得沉淀；加入90mL的LBATK混匀后等分为3份：其中一份加入IPTG至终浓度为0.1mM和葡萄糖至0.25％；一份加入IPTG至终浓度为0.1mM；第三份不添加；三份样本继续于30℃，180rpm培养过夜；

6)次日，细菌培养物，4℃，10000-14000rpm离心30min后收取培养上清；加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液，混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体；4℃，10000-14000rpm离心20min，沉淀重悬于10mL含2％BSA和15％甘油的PBS缓冲液中，常温下10000rpm离心10min，去除沉淀，获取上清，0.22μm膜过滤除菌，-20℃冻存备用；

7)按以上步骤2)、3)、4)进行结合、洗涤及洗脱，反复进行三轮。

9.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(3)的步骤d)具体为：

1)挑取经筛选后的克隆于96孔深孔板中，每孔250μl 2×YTATG培养基，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.5，按照MOI＝20∶1加入辅助噬菌体，室温静置15min，37℃，缓慢摇床培养1h，加入等体积2×YTATKI，30℃摇床培养过夜(约12h)；

2)次日，10000rpm离心10min收取上清，加入BSA至终浓度2％，加入Tween-20终浓度0.1％，37℃静置15min，备用；

3)H5亚型H1抗原用包被液稀释至150μg/mL，加入96孔酶联板，50μl/孔，4℃包被过夜；

4)次日，弃包被液，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，每次3min，用2％BSA+0.1％Tween-20封闭，200μl/孔，37℃，2h；

5)弃去封闭液，加入经封闭后的单克隆噬菌体抗体，50μl/孔，37℃，静置1h；

6)弃去液体，用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min；

7)将HRP-标记鼠抗M13抗体用PBST稀释，稀释比例为1∶5000，同时加入BSA至终浓度2％，37℃预封闭15min；

8)将预封闭后的鼠抗M13抗体加入酶联板，50μl/孔，37℃静置30min；

9)弃去液体，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min；

10)弃去洗涤液，加入底物显色液，50μl/孔，室温静置显色；用50ul 2mol H₂SO₄终止显色，酶标仪测定光吸收值。

10.一种如权利要求1或2所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体在H5N1型禽流感病毒凝集素血凝抑制中的应用。