CN111116752A - 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用 - Google Patents
结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用。本发明从所构建的免疫纳米抗体基因库中筛选得到了能介导结合免疫球蛋白的单域抗体，其氨基酸序列分别SEQ ID NO.1‑4所示，该组单域抗体能特异性结合人IgA，而与人IgG和鼠IgG的结合亲和力非常低。本发明进一步提供了SEQ ID NO.5所示的抗禽流感单域抗体。本发明还将所述单域抗体与其它针对肿瘤、病毒病原体抗体或单域抗体进行融合构建得到多功能特异性融合蛋白，动物试验证明，所构建的融合蛋白具有延长功能抗体或单域抗体在动物体内半衰期时间，有效提高治疗性抗体的生物利用度，显著增强治疗性抗体生物靶向性治疗等效果。
Description
技术领域
本发明涉及单域抗体，尤其涉及了一组介导结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体 以及由单域抗体和抗禽流感单域抗体融合得到双功能抗体，本发明进一涉及它们在肿瘤、病原微 生物感染等疾病的治疗或检测中的应用，属于介导结合免疫球蛋白的单域抗体及其应用领域。
背景技术
比利时科学家Raymond Hamers等研究发现骆驼血液中除了有普通四条链抗体外，还有一种 自然存在的缺失轻链的重链抗体，该重链抗体基因在重组时，剪切掉了重链稳定区的CH1区的 基因，因而表达的重链缺少CH1区，不能与轻链连接形成普通的轻、重链四条链的抗体，形成 了仅有两条重链(无CH1)的重链抗体。将该重链抗体的可变区，称为VHH，以与普通抗体重 链可变区VH加以区别。经分子生物学方法，将VHH以噬菌体展示等技术制备VHH抗体基因 库，筛选得到的VHH，称为nanobody(纳米抗体)，或称为single domainantibody(sdAb，单 域抗体)，或称抗原结合域抗体片段。单域抗体具有结构简单，穿透力强，易于表达和纯化，亲 和力及稳定性高，无毒副反应等一系列优点，因而成为生物制药领域研究的热门课题，单域抗体 抗体技术也被认为是未来十年国际生物制药领域最先进、最有前途的十大生物制药技术之首的技 术。
单域抗体具有如上所述的优势，但也由于其分子小，在生物体内迅速被从血液循环中清除， 导致其在生物体内的消除半衰期短。单域抗体在生物体内的消除半衰期段是研发这一特定生物分 子医药要解决的难题之一。比利时Ablynx公司研发出抗人白蛋白(HSA)纳米抗体(见其专利： CN200780043274)用于其公司的纳米抗体候选药物研发，已研发出双特异性纳米抗体(2或3 体)药物，如将抗TNF、IL-6R等的纳米抗体分别与抗HSA的纳米抗体的基因克隆成为表达双 功能特异性纳米抗体融合蛋白，作为特异性靶向纳米抗体治疗候选药物研发技术手段，使单体纳 米抗体的动物体内半衰期由原来的15分钟提高到现在的2-3周，已取得了很好地效果，多个候 选药物已进入临床I，II期试验。
发明内容
本发明的目的之一是提供介导结合免疫球蛋白的单域抗体；
本发明的目的之二是提供一种抗流感单域抗体；
本发明的目的之三用所述的介导结合免疫球蛋白的单域抗体与抗流感单域抗体进行融合得 到双功能单域抗体融合蛋白；
本发明的目的之四是将所述的介导结合免疫球蛋白的单域抗体以及双功能抗体融合蛋白应 用于肿瘤、病原微生物感染等疾病的治疗或检测或增强治疗性抗体或多肽的作用效果、增加治疗 性抗体或多肽稳定性。
本发明首先提供了介导结合免疫球蛋白的单域抗体，所述的单域抗体选自单域抗体 sdAb-A8、单域抗体sdAb-D3、单域抗体sdAb-E12或单域抗体sdAb-G5中的任何一种。
其中，单域抗体sdAb-A8的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区；3个互补决定区 的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；4个框架区的氨基 酸序列分别为SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；
单域抗体sdAb-D3的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区，其中，3个互补决定区 的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；4个框架区的氨基 酸序列分别为SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示；
单域抗体sdAb-E12的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区；3个互补决定区的氨 基酸序列分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；4个框架区的氨基酸序 列分别为SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示；
单域抗体sdAb-G5的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区；3个互补决定区的氨基 酸序列分别为SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.12所示；4个框架区的氨基酸序列 分别为SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示；
作为本发明一个优选的实施方案，所述单域抗体sdAb-A8的氨基酸序列选自(1)-(3)中 的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一个 或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的 蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基 酸序列；
所述单域抗体sdAb-D3的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个 或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的 蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基 酸序列；
所述单域抗体sdAb-E12的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的一个 或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的 蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基 酸序列；
所述单域抗体sdAb-G5的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中的一个 或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的 蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基 酸序列。
本发明进一步提供了所述单域抗体的编码基因；
其中，所述单域抗体sdAb-A8编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列的互 补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸 序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至 少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至 少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至少有 95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列有99％以上同 一性的多核苷酸序列；
所述单域抗体sdAb-D3的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列的互 补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸 序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至 少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至 少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至少有 95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列有99％以上同 一性的多核苷酸序列；
所述单域抗体sdAb-E12的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列的互 补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸 序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至 少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至 少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至少有 95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列有99％以上同 一性的多核苷酸序列；
所述单域抗体sdAb-G5的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列的互 补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸 序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至 少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至 少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至少有 95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列有99％以上同 一性的多核苷酸序列。
本发明还提供了抗禽流感单域抗体，其氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序 列：
(1)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一 个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前 的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的 氨基酸序列。
进一步的，本发明提供了抗禽流感单域抗体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列选自 (1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列的 互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.10所示的多核 苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序 列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序 列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列至 少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列有99％ 以上同一性的多核苷酸序列。
本发明更一步的提供了一种双功能单域抗体，由所述的单域抗体与治疗性抗体通过连接肽 linker连接得到；优选的，所述的治疗抗体是本发明所提供的抗禽流感单域抗体；所述的连接肽 linker的氨基酸序列是SEQ ID NO.48或SEQ ID NO.49所示的氨基酸序列。
本发明所提供的介导结合免疫球蛋白的单域抗体sdAb-A8、单域抗体sdAb-D3、单域抗体 sdAb-E12或单域抗体sdAb-G5均能够应用于制备诊断或检测肿瘤或病原微生物感染引起的疾病 的试剂或治疗肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的药物、用于增强治疗性抗体或多肽的作用效 果、增加治疗性抗体或多肽稳定性和/或在生物体内消除半衰期；优选地，所述治疗性抗体为针 对病毒、细菌或肿瘤的抗体；更加优选地，所述治疗性抗体为抗禽流感单域抗体。
进一步的，本发明介导结合免疫球蛋白的单域抗体单域抗体sdAb-A8、单域抗体sdAb-D3、 单域抗体sdAb-E12或单域抗体sdAb-G5能够与其它治疗性抗体或多肽融合得到双功能或多功能 单域抗体或多肽融合蛋白，用于制备治疗肿瘤、病原微生物感染等疾病的。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供了一种双功能单域抗体， 由单域抗体sdAb-A8与抗禽流感单域抗体通过连接肽linker连接得到；可以采用本领域中常用的 连接肽linker将单域抗体sdAb-A8与抗禽流感单域抗体连接在一起得到双功能抗体(或融合蛋白)；作为参考，本发明中所述的连接肽linker的氨基酸序列可以是SEQ ID NO.48或SEQ IDNO.49所示的氨基酸序列；所述双功能抗体能够用于制备疾病检测和/或治疗药物，所述疾病为 肿瘤或病原微生物感染引起的疾病。
本发明还提供了含有单域抗体的编码基因的表达载体、含有双功能抗体的编码基因的表达载 体；所述的表达载体可以是原核表达载体、真核表达载体或其它的表达载体；
本发明还公开了含有所述表达载体的重组宿主细胞。其中，所述的宿主细胞为原核表达细胞、 真核表达细胞，真菌细胞或酵母细胞，所述真核表达细胞优选CHO细胞。
本发明还提供了一种制备上述介导结合免疫球蛋白的单域抗体的方法。以纯化的人IgG，IGA 抗原免疫羊驼，构建特异性的单域抗体基因库(纳米抗体噬菌体展示基因库)，筛选免疫纳米抗 体基因库，而获得了抗人IgA的特异性的纳米抗体(或称单域抗体片段，single domain antibody fragment)，将此组基因(sdAb-A8，sdAb-D3，sdAb-E12，sdAb-G5，A65)与表达载体连接重组， 构建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株sdAb-A8-pSJF2，sdAb-D3-pSJF2，sdAb-E12-pSJF2， sdAb-G5-pSJF2，A65-pSJF2。在实验室进行摇瓶小规模生产，经Ni+树脂凝胶亲和层析纯化，可 得到SDS-PAGE电泳纯达95％，约50mg/L左右的单域抗体。
本发明涉及了介导结合免疫球蛋白的单域抗体(sdAb-A8，A65)的不同形式单域抗体(单 体、双体或多聚体)、研究制备的单域抗体所用技术方法参考下列文献(1，Tanha J,Dubuc G, Selection by phage display of llama conventional V(H)fragments withheavy chain antibody V(H)H properties.J Immunol Methods.2002,263(1-2):97-109)；2，Gueorguieva D,Li S.Identification of single-domain,Bax-specificintrabodies that confer resistance to mammalian cells against oxidative-stress-induced apoptosis.FASEB J.2006,20(14):2636-8；3，专利：《针对乳腺癌Her/neu的纳米抗体或多肽》，专利号：ZL201110280031.3)。
本发明筛选多个高亲和力的单域抗体基因株，最终得到了介导结合免疫球蛋白(IgA)的单 域抗体(sdAb-A8，sdAb-D3，sdAb-E12，sdAb-G5)。该组单域抗体能特异性结合人IgA，而与 人IgG和鼠IgG的结合亲和力非常低；用其与其它针对肿瘤、病毒病原体抗体、scfv、VL、VH、 VHH等基因构建双功能、多功能特异性融合蛋白、或其它方法交联成融合蛋白，可以延长其它 功能单域抗体或称单域抗体片段(如scfv、VL、VH、VHH)的生物体内半衰期，提高生物利用 度，增强其生物靶向性治疗作用。
本发明涉及到术语及定义
本发明中所述的“取代”可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特 征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、 Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和 Asn之间的相互取代)等。因氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的突变体可以通过对编 码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(参见例如Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来制作。
本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的 程度的氨基酸，并非限定，但优选为20个以下、15个以下、10个以下、或7个以下，更优选 为5个以下。就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与 要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，以上述合成寡核苷 酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺 在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养， 回收DNA。而且，在保持其活性的同时对酶等生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸 的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变源处理基因的方法， 以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。
本文所用的术语“单域抗体(sdAb)”是指包含了抗体中单个可变域的片段，也称为纳体 (Nanobody)。和完整的抗体一样，它可以选择性的和特定抗原结合。与完整抗体的150－160kDa 的质量相比，单域抗体则显得小得多，大约只有12－15kDa。第一个单域抗体是从骆驼的重链抗 体中人造工程制作出来的，称为“VHH区段”。
本文所用的术语序列的“同一性(identity)”可以与“相同性”互换使用，指的是序列之间通过序 列比对软件例如BLAST确定的相似程度。序列比对的方法和软件对于本领域技术人员是公知的。 可以通过对已知序列进行一个或几个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18或更多个)氨基酸或碱基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的核苷酸序列。 例如，通过常规手段(例如保守取代等)，对本发明的序列SEQ ID NO：1-198中一个或多个所 示的氨基酸或核苷酸序列进行改造，可以获得与这些具有大于80％、大于85％、大于90％、大于 95％或大于99％的序列同一性，并且具有基本相同的性能，这都在本发明的保护范围之内。优选 地，本发明通过保守取代获得序列同一性，但并不限于保守取代。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在 反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’ 的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条 件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照 一个方向读取。氨基酸有100多种不同类型，其中20种常用，本发明不排除氨基酸链上有其他 物质，例如糖类、脂类等修饰，本发明也不限于20中常用的氨基酸。
术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排 列顺序。应该理解，本发明请求保护的抗体基因除了DNA序列外，也涵盖RNA(rRNA、tRNA、 mRNA)以及它们的互补序列。
术语“表达载体(Expression vectors)”是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启 动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体四部分：目的基因、启动子、 终止子、标记基因。本发明包括但不限于原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或其它细胞表达 载体。
术语“框架区(Framework region)”，即骨架区，在免疫球蛋白的H和L链的近N端约有110 个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区 (V)和恒定区(C)。可变区内包含超变区HVR(hypervariable region)或称互补决定区CDR (Complementarity-determining region)与FR骨架区。本发明中所述的抗体中的“互补决定区”主 要负责抗原的识别。
术语“人源化”抗体是指抗体的可变区(VH或VHH)的Fr区部分，恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体 造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。应该理解，本 领域技术人员根据实际需要能够制备出本发明单域抗体的合适的人源化形式，这在本发明涵盖的 范围之内。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条 件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至 少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温 度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核 酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强 度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时 所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M 钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但 不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷 酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特 异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件 可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养， 在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更 长时间。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存 在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法 进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外 源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
附图说明
图1 ELISA检测羊驼免疫前后血清特异性抗体产生水平(Ig免疫前后，血清10倍系列稀释 ELISA测定抗Ig的抗体效价)。
图2 ELISA检测蛋白G分离免疫血清中特异性重链抗体的效价：Ig免疫前和第4次免疫后， 血清经蛋白G柱层析分离的重链抗体，先稀释500倍，然后再经2倍系列稀释后的重链抗体效 价(ELISA测定)。
图3第一轮次PCR扩增抗体基因及普通重链抗体；第一轮次PCR重链抗体基因(VHH)及 普通重链抗体基因(VH)(M：100bp的分子码克，1，2，3，4为4个不同的PCR反应管)。
图4第二轮次PCR VHH抗体目的片段；第二轮次PCR仅扩增VHH目的片段。加入不同量 的胶纯化第一次PCR产物，以获得扩增VHH的最佳模板用量(M，为100bp的分子码克，1，2，3，4为4个不同的PCR反应管，添加第一次PCR产物模板分别为1,3,5,8微升)。
图5单域抗体效价测定结果：sdAb-A8-pSJF2，sdAb-D3-pSJF2，sdAb-E12-pSJF2，sdAb-G5-pSJF2，A65-pSJF2经Ni+离子亲和层析纯化，纯化蛋白SDS-PAGE结果所示，纯化蛋白纯度可达95％以上。
图6禽流感核蛋白(T83R)经Ni+离子亲和层析纯化，纯化蛋白SDS-PAGE结果所示，纯 化蛋白纯度可达95％以上.分子量约为17.3Kd。
图7分别为ELISA测定sdAb-A8，sdAb-D3，sdAb-E12，sdAb-G5,针对人IgA、IgG和鼠IgG 的抗体效价。
图8 A65-sdAb-A8-pSJF2双功能抗体融合蛋白Ni+离子亲和层析纯化后SDS-PAGE结果；纯 化蛋白纯度可达90％以上，其分子量约为31,000kd左右。
图9 A65-sdAb-A8连接方式图，其2个单域抗体之间由2种不同的连接肽连接
图10 ELISA测定给药后小鼠血清中抗体水平的变化。
具体实施方式
本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而本发明的实施方案不限于这些实施例的特 定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其它的变化是已知的，或根据直接公开的内容和 附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特 殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1人免疫球蛋白(Ig)特异性单域抗体基因库的构建
1.羊驼免疫程序，特异性单域抗体产生情况的监测
(1)羊驼免疫程序：羊驼颈背部皮下多点注射，将人IgG和IgA抗原与福氏完全佐剂等体积 制备成乳浊液，第1次免疫间隔4周；第2、3、4次免疫，将人IgG和IgA抗原与福氏不完全佐 剂等体积制备成乳浊液，每次免疫间隔3周。
(2)从第2次免疫开始，于每次免疫后1周，采取外周血，用ELISA监测Ig抗原的抗体产 生水平，结果见图1，第4次免疫后血清效价最高。用蛋白G柱层析方法，分离第4次免疫后血 清中的重链抗体，pH3.5洗脱缓冲液的洗脱峰为重链抗体，pH2.7洗脱缓冲液的洗脱峰为普通的 抗体。检测其重链抗体效价，结果见图2，当其效价达到1万倍以上时，采集50ml外周血，分 离外周血淋巴细胞。
2.羊驼外周血淋巴细胞分离和RNA的纯化
用QIAGEN公司试剂盒，按操作说明使用，分离羊驼外周血淋巴细胞，从得到的淋巴细胞 中提取总RNA，获得RNA的质控为，OD260/280比值对于和大于1.8，浓度大于40ng/ul，迅速用 于RT-PCR扩增VHH的模板或-80℃短期保存备用。
3.应用RT-PCR和PCR方法扩增羊驼重链抗体可变区-VHH
用GE Life Science或Invetrogen公司的cDNA第一链合成试剂盒，以试剂盒内引物pd(N)6 或特异性引物(YTCh-1或YTCh-2)，合成cDNA第一链，以此模板，分别用两套引物进行PCR 扩增重链抗体VHH基因片段，采用巢式PCR方法，第一次PCR扩增中大于800bp的为普通重 链基因片段，在800～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段(图3)，切胶回收缺失轻链 重链抗体基因片段，以此为模板用VHH特异性引物经PCR扩增得到VHH目的基因(500bp)(图 4)。
cDNA第一链合成反应见表1，在37℃水浴1小时。第一次PCR扩增反应内容见表2。
表1 cDNA第一链合成反应
| 反应编号 | 合成反应液 | DTT | RNA | 引物* | 总体积(ul) |
| 1 | 5 | 1 | 8 | 1 | 15 |
| 2 | 5 | 1 | 8 | 1 | 15 |
| 3 | 5 | 1 | 8 | 1 | 15 |
| 4 | 5 | 1 | 8 | 1 | 15 |
*反应1,2,3,4所用引物可以是试剂盒内pd(N)6，也可以是YTCh-1或YTCh-2。
表2第一次PCR扩增反应内容
| 反应编号 | cDNA合成物* | 上游引物 | 下游引物 | 水 | Taq | 总体积(ul) |
| 1 | 15 | 1 | 1 | 32.5 | 0.5 | 50 |
| 2 | 15 | 1 | 1 | 32.5 | 0.5 | 50 |
| 3 | 15 | 1 | 1 | 32.5 | 0.5 | 50 |
| 4 | 15 | 1 | 1 | 32.5 | 0.5 | 50 |
*cDNA合成物：可分别加入1,3,5,10,15ul测试最佳产物扩增所需的模板量。
cDNA合成物加入前，90℃,5分钟，放入冰中备用。将所用各反应试剂加入混匀后，PCR 扩增，条件是：94℃,3分钟，然后94℃，30秒，55℃,30秒，72℃，1分钟，扩增25-35个循环， 在72℃，7分钟。
第二次PCR扩增(VHH)反应内容见表3。
表3第二次PCR扩增(VHH)反应内容
*加入不同量的胶纯化第一次PCR产物，以获得扩增VHH的最佳模板用量。
多样性引物的合成：
Heavy Chain For primers：
YTCh-1:CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA；
YTCh-2:GGG GTA CCT GTC ATC CAC GGA CCA GCT GA；
Heavy Chain Back primers：
YTBACK GAT GTG CAG CTG CAG GCG TCT GGR GGA GG；
4.VHH片段和噬菌体展示载体的连接及电转化TG1感受态
(1)SfI单酶切VHH片段：第二次PCR产物带约为500bp，用QIAgenPCRkit纯化，用限制 性核酸内切酶sfiI(New Negland Biolabs)，50度，作用3～5小时。再用QIAgenPCRkit纯化，-20℃ 保存备用。
(2)噬菌体载体pHEN6(经过pHEN1改造而来)，用限制性核酸内切酶sfiI(NewNegland Biolabs)，50度，作用3～5小时。用QIAGEN公司胶回收试剂盒纯化回收
(3)单域抗体基因VHH与pHEN6载体链接反应：T4连接酶(NEB的高浓度5u/ul)1ul，VHH PCR产物3mmol，pHEN6 vector 1mmol，连接酶缓冲液4ul，水补到20ul，在16度， 连接过夜。
(4)细菌转化：取连接反应物1ul，2ul加入到大肠杆菌TG1感受态里，用电转移仪(BioRad 公司)电转后，涂在LB氨基苄青霉素平板上，32度过夜，计数细菌克隆数。根据小试转化结果， 当转化效率达到108个克隆/ng载体时，做30～50个电转化，即为免疫羊驼VHH噬菌体展示基 因库。
5.VHH抗体基因库的库容及多样性的鉴定和保存
根据转化后测定的滴度乘以转化的总量计算库容量。该基因库的容量约为1010的克隆。另 外，随机选出电转后筛选平板生长的30～50个阳性克隆，测序，如果没有重复序列发生，可以判 断其多样性良好。将剩余菌液加入适量2YT/Amp培养基4小时培养后，加甘油分装，于-80℃冻 存，从而得到Ig免疫的VHH型抗体基因库。
6.VHH噬菌体抗体库的制备和滴度测定
抗体库加入辅助噬菌体M13K07(Invitrogen)进行拯救：将1μl M13K07加入至含有6ml 2YT、 0.4ml 20％glucose+4μl Amp(100mg/ml)培养基的被感染细胞中，37℃静置15min后，将此6ml 培养基加入至含有92ml 2YT,92μlAMP的培养基中，静置15min，37℃250rmp，1h后，加100μl Kan(50mg/mL)37℃过夜。拯救后上清取100μl用于抗体库的初级功能鉴定，剩余部分用 PEG8000沉淀噬菌体，4℃条件下，离心收集沉淀，测定噬菌体滴度并-80℃保存。
实施例2禽流感病毒核蛋白的表达、纯化以及禽流感病毒核蛋白特异性单域抗体基因库的构建
1.禽流感病毒核蛋白的克隆、表达和纯化：基因从Translate DNA SequencePet30arc+T7#3.seq(5076,5561)合成，基因序列为(序列表SEQ ID NO.46)：
2.表达载体的构建：PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离、回收，用BamHI(BioLab公司)、 XhoI(BioLab公司)消化后，与同样酶处理的载体pET-28a(Sigma)按3:1的末端比例进行黏 性末端连接。连接产物按CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌JM109(Sigma)，利用卡那霉素抗 性筛选重组克隆。提取阳性克隆的质粒DNA，进行菌落PCR。将初步鉴定正确的阳性重组子， 进行DNA序列分析，并将测序结果与数据库中已知基因的序列进行比对。
3.以含有测序正确的T83R基因的表达载体，按CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌BL21 (Sigma)；挑取PCR鉴定阳性的单个菌落，接种于含卡那霉素的LB培养基中，于37基中培 养至对数期后，加入或不加入IPTG继续培养，诱导目的基因的表达。取少量诱导、未诱导细菌 的培养液，离心、沉淀。去上清后，将菌体加入到SDS加样缓冲液中煮沸，分析目的蛋白的表 达。
4.目的蛋白的大量表达与纯化：挑选单个菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，于LB 培养至对数期后，加入IPTG于30℃继续培养过夜。将菌体培养液于4℃以8000r/min离心20min。 收集细菌用细菌裂解液悬浮后，以超声波破碎菌体。离心后，分别收集细菌上清液和包涵体沉淀。 以镍螯合琼脂糖凝胶(金斯瑞生物技术股份有限公司)为柱填充介质，对细菌上清的提取液进行 亲和层析。目的蛋白的洗脱采用升高咪唑的浓度完成。收集不同浓度的咪唑洗脱峰样品，用 SDS-PAGE分析目的蛋白。)(图5)目的蛋白氨基酸序列为(序列表SEQ ID NO.47)。
5.禽流感病毒核蛋白特异性单域抗体基因库的构建同实施例1，免疫羊驼的抗原用表达的 禽流感病毒核蛋白。
实施例3抗Ig单域抗体的筛选
1.抗IgA特异性单域抗体的筛选
用纯化的人IgG和IgA100ug/ml，包被热电公司高吸附力的聚苯乙烯微孔，150ul/孔，4℃过 夜。吸去包被抗原，加入350ul 2％MPBST(2％的脱脂牛奶，0.05M，pH7.2-7.4PBS，0.05％T20)， 室温封闭2小时，去除封闭液，加入上述实施例1中的VHH基因库的噬菌体5X1011，室温结合 2小时，用PBST，PBS各漂洗10次后，加入TEA室温静置10min，洗脱特异性结合噬菌体，并 用1M pH8.0 Tris-HCl中合TEA，冰上保存。将噬菌体感染半对数期生长TG1，取适量菌液稀释 后涂布AMP/LB平板，32℃培养，测定洗脱液滴度，其余菌液扩大培养后以M13K07超感染并 振荡培养过夜，第2天收集上清，用PEG纯化，浓缩后即为用于下一轮筛选的次级噬菌体抗体 库。经3轮筛选，滴定每轮筛选后所获得的特异性噬菌体抗体的滴度，下一轮筛选比上一轮筛选 所洗脱的特异性噬菌体抗体滴度富集增加50-100倍，即显示筛选成功。
2.噬菌体ELISA方法挑选阳性克隆
从第3轮筛选洗脱的特异性噬菌体做滴度的AMP/LB平板上，随机挑取单个菌落，接种在 含有Amp的2YT液体培养基的96孔培养板中培养，用辅助噬菌体感染诱导表达噬菌体抗体。 收获表达上清，以人IgA，IgG为抗原进行ELISA测定，挑选出针对IgA强阳性孔，经DNA测 序以鉴定抗IgA单域抗体克隆的基因序列。得到包括序列表SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，基因序列在内的一系列单域抗体基因序列，用于进一步表达和制备特异性、 高活性的单域抗体和双功能抗体。
3.抗禽流感特异性单域抗体的筛选
用100ug/ml实施例2中表达的禽流感病毒核蛋白抗原，包被热电公司高吸附力的聚苯乙烯 微孔，150ul/孔，4℃过夜。加入实施例2中的VHH基因库的噬菌体5X1011，其余过程和方法同 上1和2中所述。挑选出针对禽流感病毒核蛋白抗原阳性孔，经DNA测序以鉴定其单域抗体克 隆的基因序列。得到包括序列表SEQ ID NO.10所示基因序列在内的一系列单域抗体基因序列， 用于进一步表达和制备特异性、高活性的单域抗体，双功能抗体。
实施例4特异性单域抗体表达质粒的构建
以实施例3中所获得的一组特异性的纳米抗体基因为模板，进行PCR扩增，而获得带有限制 性内切酶BbsI和BamHI位点PCR产物，用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和 载体(pSJF2载体)(kim Is.Biosic Biochem.2002,66(5):1148-51，中国专利ZL201110280031)，经 T4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-A8-pSJF2，sdAb-D3-pSJF2， sdAb-E12-pSJF2，sdAb-G5-pSJF2，A65-pSJF2，并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。PCR 所用引物序列如下：正义链引物 5’—TATGAAGACACCAGGCCCAGGTRMAGCTGGWGGAGTCT—3’；反义链引物 5’—gaagatctccggatccTGAGGAGACGGTGACCTGGGT—3’。
实施例5抗IgA和抗禽流感单域抗体的表达、纯化以及序列测定
(1)将实施例4所述的含有质粒sdAb-A8-pSJF2，sdAb-D3-pSJF2，sdAb-E12-pSJF2，sdAb-G5-pSJF2，A65-pSJF2的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种于12ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜。(3)转种10ml 于1L含氨基苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养，240转/分，培养到OD值达0.6～1.0时， 加入0.1～0.5M IPTG，继续培养过夜。(4)离心，收菌。(5)加融菌酶裂解细菌，离心，收上 清中可溶性纳米抗体蛋白。(6)经Ni+离子亲和层析纯化，纯化蛋白SDS-PAGE结果所示，纯 化蛋白纯度可达95％以上(图6)。
测序得到抗IgA单域抗体sdAb-A8,sdAb-D3，sdAb-E12，sdAb-G5和抗禽流感单域抗体A65 的基因序列分别为序列表SEQ ID NO.6,SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10所示。
实施例6抗IgA单域抗体效价(亲和力)测定实验
人IgG、IgA和鼠IgG以5ug/ml浓度包被ELISA微孔板，4℃过夜。0.5％BSA-PBST封闭， 37℃，2小时。加入1ug/ml稀释的抗IgA单域抗体(sdAb-A8,sdAb-D3，sdAb-E12，sdAb-G5)， 37℃，2小时，加入1:10000倍稀释的HRP-抗His第2抗体，37℃，1小时，加入TMB，室温15分钟，测定OD450的值，测定结果见图7。
根据7的测定结果可见，sdAb-A8,sdAb-D3仅对人IgA有特异性结合，对人IgG有较低的 结合，对于鼠IgG没有交叉结合反应。sdAb-E12对于人IgA有特异性结合，对于人IgG有中度 结合，对于鼠IgG没有交叉结合反应；sdAb-G5对人IgA有较强结合，对于人IgG有有中度结合， 对于鼠IgG有较低的交叉结合反应。
实施例7抗IgA单域抗体(sdAb-A8)与抗禽流感单域抗体(A65)的双特异性双功能单域抗体 融合蛋白的构建
1.抗IgA单域抗体(sdAb-A8)与抗禽流感单域抗体(A65)构建成双特异性双功能单域抗 体融合蛋白表达载体(A65-sdAb-A8-pJSF2)：
构建方法同上述实施例3，PCR上游引物： 5’-TATGGATCCGGTGGAGGCGGGTCCGGTGGAGGCGGGTCCGGTGGAGGCGGGTCCTCCGG ACAGGTAAAGCTGGAGGAGTCT-3’，下游引物： 5’-TGCCAAGCTTTCACTAATGGTGATGGTGATGGTGTGATCCTGA-3。融合蛋白表达、纯化同 实施例4，结果见图8。
2.A65-sdAb-A8连接方式见图9，2个单域抗体之间由SEQ ID NO.48或SEQ IDNO.49所示 任何一种连接肽连接。
3.双功能双特异性单域抗体融合蛋白(A65-sdAb-A8)检测不同流感病毒样品株：
(1)流感病毒株为18个低毒株，分别是A/WS/33(H1N1)，A/SINGAPORE/1/57(N2N2)，A/PHILLIPINES/2/82(H3N2)，A/DK/CZECKOSLOVAKIA/56(H4N6)， A/TURKEY/CALIFORNIA/35621/84(H5N3)，A/TURKEY/WISCONSIN/68(H5N9)，Rg A/HONG KONG/213/03(H5N1(LP))，A/TURKEY/MASS/3740/65(H6N2)，A/CHICKEN/BRITISH COLUMBIA/514/04(H7N3(LP))，A/EQ/PRAGUE/1/56(H7N7)，A/TURKEY/ONT/6118/68(H8N4)， A/TURKEY/WISCONSIN/1/66(H9N2)，A/QUAIL/ITALY/1117/65(H10N8)， A/CHICKEN/GERMANY/N/49(H10N7)，A/DK/ENGLAND/56(H11N6)，ADK/WISCONSIN/480/79 (H12N6，A/DUCK/ALBERTA/60/76(H12N5)，A/GULL/MARYLAND/704/77(H13N6)。3个疫苗 株分别是A/California/7/2009(H1N1)类病毒，A/Victoria/361/2011(H3N2)类病毒， B/Wisconsin/1/2010-类病毒(购自诺华疫苗和诊断公司)。
(2)病毒培养生产：所有的炳毒株接种于9日龄的鸡胚尿囊腔，鸡胚在34度继续孵化3天后， 收集尿囊液，测定病毒感染滴度。
(3)用A65-sdAb-A8，10ug/ml(PBS稀释)包被ELISA板，4度过夜，加入各株病毒尿囊液， 加入生物素标记的sdAb-A8，加入HRP-链亲合素，加入TMB显色，测定OD450，当OD值大于阴性对照3倍以上，判为阳性，结果见表4。
表4检测不同流感病毒株的结果
| 病毒株 | 结果 | 病毒株 | 结果 |
| H1N1 | + | H2N2 | + |
| H3N2 | + | H4N6 | + |
| H5N3 | + | H5N9 | + |
| H5N1(LP) | + | H6N2 | + |
| H7N3(LP) | + | H7N7 | + |
| H8N4 | + | H9N2 | + |
| H10N8 | + | H10N7 | + |
| H11N6 | + | H12N6 | + |
| H12N5 | + | H13N6 | + |
| 疫苗H1N1 | + | 疫苗H3N2 | + |
| 疫苗B/Wisconsin/1/2010 | － |
实施例8抗IgA单域抗体sdAb-A8与抗禽流感单域抗体(A65)的双特异性双功能单域抗体融 合蛋白在动物体内半衰期实验
1.用纯化的双特异性双功能单域抗体融合蛋白(实施例7所构建)和抗禽流感单域抗体 (A65)各100ug/0.1mlPBS分别经尾静脉注入Babl/c体内，各注射3只小鼠，分别在注射后的 15分钟，30分钟，1小时，1天，3天采血，测定其注入双特异性双功能单域抗体融合蛋白的和 抗禽流感单域抗体(A65)。
2.用ELISA方法测定所采集的小鼠血清中单域抗体融合蛋白和单域抗体单体在动物体内 的动态变化，实验结果见图10。
根据图10的结果可见，抗IgA单域抗体sdAb-A8有效延长了抗禽流感单域抗体(A65)在 动物体的稳定性，抗禽流感单域抗体(A65)在动物体内的半衰期明显延长。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京纽安博生物技术有限公司
<120> 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用
<130> BJ-3038-191106A
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Ser Ser Tyr Asn
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Val Leu Phe Ala Trp Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Pro Tyr Leu
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Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
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Val Ala Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ile Asn
20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Asp Arg Val Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Asp Asp Gly Leu Glu Thr Tyr His Asp Ala Val Leu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ile Met Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Ala Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Thr Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Phe Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Gly Arg Asn Gly Val Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 4
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Gly Phe Asn Pro Tyr
20 25 30
Asp Tyr Ile Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ser Thr Ile Asn His Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Gly Lys Leu Tyr Ser Thr Gln Pro Ser Glu Tyr Asp
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 115
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 5
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Pro Ser Ile Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Arg Asp Ala Val Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr
85 90 95
Thr Arg Gly Val Val Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
caggtacagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag cgtctccagt tacaattcca tggcctggta ccgccaggct 120
ccaggaaagc agcgcgagtt ggtcgcagtt ctttttgcct ggggtgctac aaactatgca 180
gactccgtaa ggggccgatt caccatctcc agagacaatg acaagaacac gccgtatctg 240
caaatgaaca acctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgt tgcaggatct 300
tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 333
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 7
caggtacagc tggtggagtc tgggggagga tcggtgcagc ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgttcag cctctggacg caccagtagt atcaatcgca tgggctggtt ccgtcaacgt 120
ccaggaaagg accgtgtgtt tgtagcatcc attagggatg atggtctaga gacctatcac 180
gacgccgtgc tgggccgatt caccatctcc agagacaatg acaagaacat aatgtattta 240
gagatggccg acctgaagac cgaggacacg gccgtttatt actgtggagc acggttgggg 300
tccggggcat atgacttctg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a 351
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 8
caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttagtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggacg cacctccagt agcgatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgtact tgtagcagct attagctgga gcactggtag cacagactat 180
gcagacttcg cgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga atagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcagagggt 300
aggaacgggg tgtatgacta ctggggccag ggtacccagg tcaccgtctc ctca 354
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 9
caggtacagc tggaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg cggcttcaat ccctacgact atattatggg ctggttccgc 120
cgggctccag gtaaggagcg tgagtttgtg tcaactatca accacagtgg cagtagctca 180
tactatgcag actccgtgaa gggccgattc accgcctcca gagacaacgc caagaacaca 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggatacgg ccgtttatta ctgtgcagcc 300
gggaaactat atagtacgca gccgtcggaa tatgactcct ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
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caggtaaagc tggaggagtc tgggggaggt ttggtgcagt ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctccaag catcttctcg aataatgtaa tggcgtggta ccgccaggct 120
caaggcaagc agcgcgagtt ggtcgcaact attactaggg atgccgtcac gcactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacagcg ccaagagcag cttgtttctg 240
caaatgaaca atttgcagcc tgacgacaca gccgtctatt actgttatac cagaggagtg 300
gttagagact actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
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<211> 5
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<213> Artifical sequence
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Tyr Asn Ser Met Ala
1 5
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Val Ala Val Leu Phe Ala Trp Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
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Arg Gly
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Cys Asn Val Ala Gly Ser
1 5
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<211> 5
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<213> Artifical sequence
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Ile Asn Arg Met Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Val Ala Ser Ile Arg Asp Asp Gly Leu Glu Thr Tyr His Asp Ala Val
1 5 10 15
Leu Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Cys Gly Ala Arg Leu Gly Ser Gly Ala Tyr Asp Phe
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Ser Asp Ala Met Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 18
Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Thr Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Phe
1 5 10 15
Ala Lys Gly
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 19
Cys Ala Ala Glu Gly Arg Asn Gly Val Tyr Asp Tyr
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<213> Artifical sequence
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Pro Tyr Asp Tyr Ile Met Gly
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Val Ser Thr Ile Asn His Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<213> Artifical sequence
<400> 22
Cys Ala Ala Gly Lys Leu Tyr Ser Thr Gln Pro Ser Glu Tyr Asp Ser
1 5 10 15
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Asn Asn Val Met Ala
1 5
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 24
Val Ala Thr Ile Thr Arg Asp Ala Val Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 25
Cys Tyr Thr Arg Gly Val Val Arg Asp Tyr
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Ser Ser
20 25 30
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 27
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
1 5 10
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Pro Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
20 25
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 29
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser
20 25 30
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 31
Trp Phe Arg Gln Arg Pro Gly Lys Asp Arg Val Phe
1 5 10
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 32
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ile Met Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Met Ala Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
20 25
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 34
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser
20 25 30
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Leu
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
20 25
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 38
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Gly Phe Asn
20 25 30
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 39
Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
1 5 10
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 40
Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 41
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 42
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Pro Ser Ile Phe Ser
20 25 30
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
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Trp Tyr Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gln Arg Glu Leu
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<213> Artifical sequence
<400> 44
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Phe Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Asn Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
20 25
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Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 46
ctggttccgc gtggttctgg tatgaaagaa accgctgctg ctaaattcga acgtcagcac 60
atggactctc cggacctggg taccgacgac gacgacaaag ctatggctga catcggttct 120
gcttctcagg gtaccaaacg ttcttacgaa cagatggaaa ccggtggtga acgtcagaac 180
gctaccgaaa tccgtgcttc tgttggtcgt atggttggtg gtatcggtcg tttctacatc 240
cagatgtgca ccgaactgaa actgtctgac tacgaaggtc gtctgatcca gaactctatc 300
accatcgaac gtatggttct gtctgctttc gacgaacgtc gtaacaaata cctggaagaa 360
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gctccgccgc cgccgccgct gcgttctggt tgc 453
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1 5 10 15
Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp
20 25 30
Lys Ala Met Ala Asp Ile Gly Ser Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser
35 40 45
Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile
50 55 60
Arg Ala Ser Val Gly Arg Met Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile
65 70 75 80
Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile
85 90 95
Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu
100 105 110
Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro
115 120 125
Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys
145 150
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 33
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 49
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Glu Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
Pro
Claims (10)
1.介导结合免疫球蛋白的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体选自单域抗体sdAb-A8、单域抗体sdAb-D3、单域抗体sdAb-E12或单域抗体sdAb-G5中的任何一种；其中，单域抗体sdAb-A8的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区；3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；4个框架区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；
单域抗体sdAb-D3的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区，其中，3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；4个框架区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示；
单域抗体sdAb-E12的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区；3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；4个框架区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示；
单域抗体sdAb-G5的氨基酸序列包括3个互补决定区和4个框架区；3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.12所示；4个框架区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示。
2.按照权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体sdAb-A8的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基酸序列；
所述单域抗体sdAb-D3的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基酸序列；
所述单域抗体sdAb-E12的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基酸序列；
所述单域抗体sdAb-G5的氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述单域抗体的编码基因，其特征在于，所述单域抗体sdAb-A8编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列；
所述单域抗体sdAb-D3的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列；
所述单域抗体sdAb-E12的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列；
所述单域抗体sdAb-G5的编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列。
4.抗禽流感单域抗体，其特征在于，其氨基酸序列选自(1)-(3)中的任何一种氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列至少有75％以上同一性的氨基酸序列。
5.权利要求4所述抗禽流感单域抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列选自(1)-(3)中的任何一种：
(1)SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列；或(2)与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或(3)与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列至少有75％以上同一性的多核苷酸序列；优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列至少有80％以上同一性的多核苷酸序列；进一步优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列至少有85％以上同一性的多核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列至少有95％以上同一性的多核苷酸序列；最优选的，与SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列有99％以上同一性的多核苷酸序列。
6.一种双功能单域抗体，其特征在于，将权利要求1所述的单域抗体与治疗性抗体通过连接肽linker连接得到；优选的，所述的治疗抗体是权利要求4所述的抗禽流感单域抗体；所述的连接肽linker的氨基酸序列是SEQ ID NO.48或SEQ ID NO.49所示的氨基酸序列。
7.含有权利要求3或5所述编码基因的表达载体。
8.权利要求3或5所述编码基因在制备诊断或检测肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的试剂或治疗肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的药物中的用途；或者在制备增强治疗性抗体或多肽的作用效果、增加治疗性抗体或多肽稳定性的药物中的用途。
9.权利要求1、2或4所述的单域抗体在制备诊断或检测肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的试剂或治疗肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的药物中的用途；或者在制备增强治疗性抗体或多肽的作用效果、增加治疗性抗体或多肽稳定性的药物中的用途；优选地，所述治疗性抗体为针对病毒、细菌或肿瘤的抗体。
10.权利要求5所述的双功能抗体在制备诊断或检测肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的试剂或治疗肿瘤或病原微生物感染引起的疾病的药物中的用途。
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