CN113461823A - 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用 - Google Patents

靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113461823A
CN113461823A CN202110773257.0A CN202110773257A CN113461823A CN 113461823 A CN113461823 A CN 113461823A CN 202110773257 A CN202110773257 A CN 202110773257A CN 113461823 A CN113461823 A CN 113461823A
Authority
CN
China
Prior art keywords
domain antibody
single domain
seq
ige
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110773257.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113461823B (zh
Inventor
张海珍
杨正根
罗丽华
傅俊成
陈校园
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110773257.0A priority Critical patent/CN113461823B/zh
Publication of CN113461823A publication Critical patent/CN113461823A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113461823B publication Critical patent/CN113461823B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及生物领域，公开了靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用。特异性结合IgE的单域抗体，由框架区和抗原结合区CDR1～CDR3组成，其中CDR1～CDR3分如SEQ ID NO.：1～3、6～8所示。本发明一些实例的单域抗体，可以特异性结合人体免疫球蛋白IgE及其复合物，对其它免疫球蛋白或者血浆其它蛋白非特异性吸附量低，吸附性能稳定，吸附效率高且再生性能好，为I型变态反应病人提供了一种新的治疗途径。与传统抗体相比具有分子量小、稳定性强、高耐性、低免疫原性、在极端的温度和pH值下仍可保持稳定性、易于表达且表达量高适合于大规模生产，在临床治疗上安全性能好、经济效益高。

Description

靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种单域抗体及其应用，具体涉及特异性结合IgE蛋白的单域抗体及其应用。
背景技术
血液免疫吸附治疗是近30年来新兴的一种临床医疗技术，一些药物没有明显疗效的疑难病症，如特应性皮炎、自身免疫系统疾病、肾病综合、重症肝炎、恶性肿瘤等进行体外免疫吸附血液净化往往可以获得较好的效果。血液免疫吸附治疗技术已被广泛地应用于肝脏病、急性中毒、血液、泌尿等多个临床领域。免疫吸附剂的研制和生产也已经成为一个重要的高新技术产业。
临床常见的过敏性哮喘、过敏性荨麻疹、过敏性皮炎、过敏性鼻炎和青霉素引起的过敏性休克导致患者体内的IgE浓度达到正常值的10倍以上，尤其是致敏原特异性IgE的浓度可以达到正常值的1000倍左右。目前临床主要以免疫抑制剂药物治疗，这些药物疗法对偶发性过敏反应治疗效果良好，但对需要长期服药的过敏性哮喘等慢性、顽固性过敏疾病治疗副作用很大，不仅不能治愈，且会产生药物依赖。近年来血液净化吸附治疗IgE过高导致的过敏反应成为一种新的趋势。
国外已有公司相继开发出IgE特异性吸附产品(WO2012140214A1)，将人源化的单链抗体使用大肠杆菌进行表达纯化，使用高碘酸钠氧化琼脂糖凝胶将纯化后的蛋白与琼脂糖偶联合成IgE吸附剂。该吸附剂制备偶联方法虽可大量偶联配基，但也会造成配基的易脱落问题同时偶联的间隔臂较短会导致吸附剂的吸附量偏低。日本学者Sato H将羊抗人IgE的IgG抗体固定至玻璃微珠，约1g固相载体偶联32.5mg的IgG蛋白制成IgE吸附柱，使用血液灌流的方法能使成年病人血液中IgE量从10000IU降低至3000IU效果非常显著(Specificremoval of IgE by therapeutic immunoadsorption system[J].Tournal ofimmunological methods.1989,118(2)；61-168.)，该吸附剂采用IgE抗体蛋白作为配基，可以特异性识别IgE蛋白，对IgE蛋白的去除效果显著且其它血浆蛋白损失较少，其主要缺陷在于采用玻璃微珠作为固相载体偶联抗体蛋白，容易造成配基的脱落，异源蛋白进入患者体内会成为新的致敏源，导致过敏反应加剧。同时该作者也考虑再串联一个以IgE为配基的吸附柱来吸附脱落的羊抗体，该方法无疑增加了临床治疗的复杂性且会增加制疗成本。国内学者贾凌云以IgE受体蛋白为配基，琼脂糖凝胶为固相载体制成IgE吸附剂(CN102660569A)，其很好的解决了配基脱落导致过敏反应加剧的问题，但其配基为大肠杆菌原核表达蛋白且为不溶性包涵体表达，需进行蛋白复性与去热原，导致提高了配基获取难度增加了生产成本，且复性后的蛋白稳定性差不易长期保存。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种特异性结合IgE蛋白的单域抗体及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
特异性结合IgE的单域抗体，由框架区和抗原结合区CDR1～CDR3组成，其中：
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示，序列为GIRFSNYG；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示，序列为ISSATSTT；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示，序列为NARWRDYEY；或
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示，序列为GTPLDYYT；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7所示，序列为IGRLDTRV；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.：8所示，序列为AADRGYSSATPLALGRYIW。
在一些实例中，所述单域抗体为羊驼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：4所示；优选的，所述氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示。
在一些实例中，所述单域抗体为羊驼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：9所示；优选的，所述氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：10所示。
在一些实例中，所述单域抗体为人源化单域抗体。
在一些实例中，所述人源化单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：11所示。
在一些实例中，所述人源化单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.：12所示。
本发明的第二个方面，提供：
用于表达单域抗体的质粒，所述质粒中插入有可以表达本发明第一个方面所述单域抗体的核苷酸序列。
在一些实例中，所述质粒为PET28a质粒。
在一些实例中，所述质粒的表达系统为细菌、真菌或动物细胞。
在一些实例中，所述细菌选自大肠杆菌；所述真菌选自毕赤酵母；所述动物细胞选自CHO细胞或293fT细胞。
本发明的第三个方面，提供：
表达单域抗体的载体，所述载体可以表达本发明第一个方面所述的单域抗体。
在一些实例中，所述载体中插入有表达本发明第一个方面所述单域抗体的核苷酸序列。
在一些实例中，所述载体为细菌、真菌或动物细胞。
在一些实例中，所述细菌选自大肠杆菌；所述真菌选自毕赤酵母；所述动物细胞选自CHO细胞或293fT细胞。
本发明的第四个方面，提供：
单域抗体在制备IgE和/或IgE复合物吸附剂中的应用，所述单域抗体如本发明第一个方面所述。
本发明的第五个方面，提供：
一种特异性结合IgE和/或IgE复合物的吸附剂，包括固相载体，所述固相载体固载有本发明第一个方面所述的单域抗体。
在一些实例中，所述固相载体包括但不限于壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂、纤维素中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的单域抗体，可以特异性结合人体免疫球蛋白IgE及其复合物，对其它免疫球蛋白或者血浆其它蛋白非特异性吸附量低，吸附性能稳定，吸附效率高且再生性能好。
本发明一些实例单域抗体为人源化单域抗体，与传统抗体相比具有分子量小、稳定性强、高耐性、低免疫原性、在极端的温度和pH值下仍可保持稳定性、易于表达且表达量高适合于大规模生产，在临床治疗上安全性能好、经济效益高。
本发明一些实例单域抗体制备得到的吸附剂，可以有效吸附去除血液中过量的免疫球蛋白IgE及其复合物，为I型变态反应病人提供了一种新的治疗途径。
附图说明
为了更清楚地说明发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将实施例描述需要使用附图作简单地介绍。
图1为原核表达纯化的抗IgE单域抗体纯化后蛋白电泳图，Marker分子量为：180、130、95、72、55、43、34、26、17、10KD。单域抗体分子大小为14KDa，从左向右依次为序列4、序列9、序列11。
图2为原核表达的各抗IgE单域抗体与IgE蛋白的结合活性比较。
具体实施方式
本发明的第一个方面，提供：
本发明通过用人IgE免疫羊驼，得到羊驼抗人IgE的噬菌体库。通过筛选，从噬菌体库中得到2条吸附性能较高的序列。
特异性结合IgE的单域抗体，由框架区和抗原结合区CDR1～CDR3组成，其中：
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示，序列为GIRFSNYG；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示，序列为ISSATSTT；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示，序列为NARWRDYEY；或
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示，序列为GTPLDYYT；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.：7所示，序列为IGRLDTRV；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.：8所示，序列为AADRGYSSATPLALGRYIW。
上述两条单域抗体在同一噬菌体库中得到，氨基酸序列上具有一定的相似度。
在一些实例中，所述单域抗体为羊驼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：4所示。
SEQ ID NO.：4
MDVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASGIRFSNYGLTWYRQAPGKSRELVAVISSATSTTSYGDSVRGRFTISRDNAKNTAFLQMNSLKPEDTAVYYCNARWRDYEYWGQGTQVTVSSHHHHHH(下划线标记的分别为CDR1、CDR2和CDR3)。
优选的，氨基酸序列SEQ ID NO.：4对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示。
在一些实例中，所述单域抗体为羊驼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：9所示。
SEQ ID NO.：9
MDVQLQESGGGLVQSGGSLTLSCTASGTPLDYYTIGWFRQAPGKEREGVSSIGRLDTRVHYADSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAADRGYSSATPLALGRYIWWGQGTQVTVSSHHHHHH(下划线标记的分别为CDR1、CDR2和CDR3)。
优选的，氨基酸序列SEQ ID NO.：9对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：10所示。
为了提高单域抗体的安全性，方便吸附血液中过量的IgE和/或IgE复合体，可以对单域化抗体进行人源化改造。在一些实例中，所述单域抗体为人源化单域抗体。
在一些实例中，人源化改造的方法如下：通过IGBLAST数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)检索与所筛选出的2条单域抗体核苷酸序列相似度较高的人源抗体序列，选择human IGHV3区序列，然后比较单域抗体中的FR区序列与人源抗体的序列差异。再根据氨基酸残基的不同理化性质对个别氨基酸残基进行随机组合替换，表达相应的蛋白，并根据可溶性、表达量、活性、稳定性等筛选出各个指标均较好的序列。
在一些实例中，所述人源化单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：11所示。
SEQ ID NO.：11
MEVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCTASGTPLDYYTIGWVRQAPGKEREWVSSIGRLDTRVHYADSVKGRFTISRNNAENTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADRGYSSATPLALGRYIWWGQGTQVTVSSHHHHHH(下划线标记的分别为CDR1、CDR2和CDR3)。
在一些实例中，所述人源化单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.：12所示。
在一些实例中，单域抗体的N端和/或C添加有信号肽和/或分离标签。便于更好地表达和纯化单域抗体。使用前可以根据需要切除信号肽和/或分离标签。
本发明的第二个方面，提供：
用于表达单域抗体的质粒，所述质粒中插入有可以表达本发明第一个方面所述单域抗体的核苷酸序列。可以进一步在单域抗体核苷酸序列的5’端和/或3’端添加信号肽、分离标签等的核苷酸序列，以在单域抗体的N端和/或C添加信号肽、分离标签等，便于更好地表达和纯化单域抗体。
质粒载体没有特别的限制，可以是各种商业化的质粒，在一些实例中，所述质粒为PET28a质粒。
在一些实例中，所述质粒的表达系统为细菌、真菌或动物细胞。
本发明的第三个方面，提供：
表达单域抗体的载体，所述载体可以表达本发明第一个方面所述的单域抗体。
载体中插入有表达本发明第一个方面所述单域抗体的核苷酸序列，以实现单域抗体的表达。为了更好地表达和纯化单域抗体，可以进一步在单域抗体的N端和/或C添加信号肽、分离标签等。
在一些实例中，所述载体为细菌、真菌或动物细胞。
在一些实例中，所述细菌选自大肠杆菌；所述真菌选自毕赤酵母；所述动物细胞选自CHO细胞或293fT细胞。
本发明的第四个方面，提供：
单域抗体在制备IgE和/或IgE复合物吸附剂中的应用，所述单域抗体如本发明第一个方面所述。
在一些实例中，所述IgE和/或IgE复合物为动物血液中的IgE和/或IgE复合物。
在一些实例中，所述IgE和/或IgE复合物为人血液中的IgE和/或IgE复合物。
本发明的第五个方面，提供：
一种特异性结合IgE和/或IgE复合物的吸附剂，包括固相载体，所述固相载体固载有本发明第一个方面所述的单域抗体。
在一些实例中，所述固相载体包括但不限于壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂、纤维素中的至少一种。
将单域抗体偶联至固相载体的方法，可以通过在微球表面依次引入环氧基和羧基，再加入催化剂将抗体上的氨基和载体上的羧基进行偶联实现。
下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1单域抗体的原核表达和纯化
噬菌体库的构建及筛选方法同CN111875706A，对筛选得到的阳性克隆进行测序。将SEQ ID NO.：：5、SEQ ID NO.：10和SEQ ID NO.：12所示的核苷酸序列插入pet-28a质粒，设计DNA酶切位点为NcoI和XhoI。再将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过卡那霉素抗性LB培养基培养，1mM的IPTG诱导培养4小时，破碎细菌离心取上清，利用钴离子填料吸附得到的抗IgE单域抗体如图1所示。从图1中可以看出，单域抗体的分子量约14KD，符合理论值。
实施例2抗IgE单域抗体活性比较
将天然人IgE蛋白(abcam)稀释至1ug/ml包被于酶标板，将原核表达的浓度为1ug/ml的各单域抗体稀释至一定浓度后加入酶标板，室温反应2小时后洗板5次，加入HRP标记的anti-His抗体，室温反应1小时，然后加入TMB显色液及终止液，测定OD450数值。结果如下图2所示。结果表明，SEQ ID NO.：4和SEQ ID NO.：9所示的羊驼单域抗体的活性相差不大，人源化单域抗体的活性下降了约13％，在可以接受的范围内。
实施例3合成吸附填料
(1)取5mL的琼脂糖凝胶中按照体积比1:1加入2M的NaOH溶液，体积比1:0.7加入活化剂(甘油醚/环氧氯丙烷)反应，得到表面有大量环氧基的琼脂糖凝胶；
(2)将环氧化琼脂糖用PBS清洗干净，加入0.5g的6-氨基己酸，在37℃，180rpm摇床中反应2h，琼脂糖表面的环氧基与6-氨基己酸上的氨基进行反应，得到表面含有羧基的琼脂糖凝胶；
(3)羧基化琼脂糖用PBS冲洗干净后，加入0.5g的EDC/NHS，同时加入原核表达的100mg的pH＝7.4的各抗体溶液(SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：9、SEQ ID NO.：11)进行反应，30℃，120rpm混合振荡14h，合成完后用PBS清洗干净，备用。
实施例4吸附剂对各免疫球蛋白的吸附性能测定
将实施例3偶联合成的吸附剂和一个没有偶联蛋白的白球琼脂糖凝胶，分别量取0.5ml填料于10ml EP管，加入5ml人血浆同时在血浆中加入7500IU重组人IgE蛋白，室温下于摇床反应1h。反应完成后将上述反应液全部倒入一次性亲和层析柱中，收集反应后的血浆。用IgE检测试剂盒检测吸附前后血浆中的IgE含量；用生化分析仪检测吸附前后血浆中各免疫球蛋白的含量。其结果如下表1所示：
表1合成吸附剂对各免疫球蛋白的吸附
Figure BDA0003153262770000071
由以上结果可以看出合成三个偶联吸附剂均对IgE蛋白有较好的清除效果，清除率在95％以上。人源化的抗体对IgE的吸附性能与人源化前相比，无明显差异；但是对其它免疫球蛋白如IgG、IgM、IgA的非特异性吸附较低，吸附率低于10％，交叉反应小。
实施例5人源化单域抗体的稳定性测试
将实施例4中序列11合成的免疫吸附剂填料保存于20％乙醇中，置于4℃冰箱中分别放置7d、14d、30d后，重复测定填料对重组人IgE蛋白的吸附性能。结果如表2所示，在试剂盒检测误差范围内，发明人认为填料对IgE的吸附性能未下降，该吸附剂于4℃冰箱保存一个月内吸附性能未下降。
表2合成吸附填料的稳定性测定
放置时间 吸附前IgE蛋白(IU/ml) 吸附后IgE蛋白(IU/ml) IgE清除率(％)
7d 1559 50 96.8
14d 1559 110 92.9
30d 1559 80 94.9
实施例6人源化单域抗体的长期毒性试验
对序列11纯化的人源化单域抗体利用大鼠进行长期毒性试验，观察大鼠的日常行为状态，并在给药前后检测大鼠血液的生化及血常规指标评估待测物对大鼠是否产生毒性作用。
给药剂量如下：
阴性对照组：生理盐水；低剂量组：人源化单域抗体0.25μg/kg；中剂量组：人源化单域抗体1.375μg/kg；高剂量组：人源化单域抗体2.5μg/kg。
表3各剂量组大鼠大不同给药时间的体重(单位：g)
时间 低剂量组 中剂量组 高剂量组 溶剂组
大鼠给药前 255.3±15.0 251.1±33.9 244.3±21.8 260.4±28.7
大鼠给药30天 346.6±40.6 325.9±45.1 349.1±45.8 335.1±43.9
表4各剂量组大鼠在不同给药时间的血液常规检测
Figure BDA0003153262770000081
表5各剂量大鼠在不同给药时间的血生化检测结果
Figure BDA0003153262770000091
经SPSS统计学分析，给药前后，各给药剂量对大鼠体重、血常规、血生化没有显著差异影响，说明该人源化单域抗体安全性良好。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
<110> 广州康盛生物科技股份有限公司
<120> 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Ile Arg Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Ser Ser Ala Thr Ser Thr Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asn Ala Arg Trp Arg Asp Tyr Glu Tyr
1 5
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Arg Phe Ser Asn
20 25 30
Tyr Gly Leu Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Val Ile Ser Ser Ala Thr Ser Thr Thr Ser Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Arg Trp Arg Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
115 120
<210> 5
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccatggatgt gcagctgcag gagtctggag gaggcttggt gcaacctggg gggtctctga 60
gactctcctg tgtagcgtct gggatccgct tcagtaacta tggtctgacc tggtaccgcc 120
aggctccagg gaagtcgcgc gagttggttg cagttattag tagtgctact agtaccacat 180
cctatggaga ctccgtgagg ggccgattca ccatctccag agacaatgcc aagaacacgg 240
catttctgca aatgaacagc ctgaaacctg aggacacggc cgtgtattac tgcaacgccc 300
gttggcgcga ctatgagtac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc agccatcatc 360
atcatcatca ttaactcgag 380
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Thr Pro Leu Asp Tyr Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ile Gly Arg Leu Asp Thr Arg Val
1 5
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Ser Ser Ala Thr Pro Leu Ala Leu Gly Arg
1 5 10 15
Tyr Ile Trp
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr Pro Leu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Ser Ile Gly Arg Leu Asp Thr Arg Val His Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Glu Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Ser Ser Ala Thr Pro Leu Ala Leu Gly
100 105 110
Arg Tyr Ile Trp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His
115 120 125
His His His His His
130
<210> 10
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccatggatgt gcagctgcag gagtctgggg gaggcttggt gcagtctggg gggtctctga 60
cactctcctg tacagcctct ggcacccctt tggattatta tactataggc tggttccgcc 120
aggccccagg gaaggagcgt gagggggtct catcaatcgg taggcttgat acgagggttc 180
actatgccga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag aaacaacgcc gagaacacgg 240
tctatctaca aatgaacagc ctgaaacctg aggacacagc catttattac tgtgcagcag 300
ataggggcta cagtagtgcg acgcccctcg ccctgggccg atatatctgg tggggccagg 360
ggacccaggt caccgtctcc agccatcatc atcatcatca ttaactcgag 410
<210> 11
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr Pro Leu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Thr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ser Ile Gly Arg Leu Asp Thr Arg Val His Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Glu Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Ser Ser Ala Thr Pro Leu Ala Leu Gly
100 105 110
Arg Tyr Ile Trp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser His
115 120 125
His His His His His
130
<210> 12
<211> 410
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccatggaagt gcagctgcag gagagcggcg gcggcctggt gcagtctggc ggcagcctgc 60
gcctgagctg cacagcgagc ggcaccccgc tggattatta tactataggc tgggtgcgcc 120
aggcgccggg caaagagcgt gaatgggtga gctcaattgg ccgcctggat acccgcgtgc 180
actatgcgga tagcgtgaaa ggccgcttta ccattagccg caacaacgcc gagaacaccc 240
tgtatctgca gatgaacagc ctgcgcgcgg aagataccgc ggtgtattat tgcgcggcgg 300
atcgcggcta tagcagcgcg accccgctgg cgctgggccg ctatatttgg tggggccagg 360
gcacccaggt gaccgtgagc agccatcatc atcatcatca ttaactcgag 410

Claims (10)

1.特异性结合IgE的单域抗体，由框架区和抗原结合区CDR1～CDR3组成，其特征在于：
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.： 1所示，序列为GIRFSNYG；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.： 2所示，序列为ISSATSTT；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.： 3所示，序列为NARWRDYEY；或
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.： 6所示，序列为GTPLDYYT；CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.： 7所示，序列为IGRLDTRV；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.： 8所示，序列为AADRGYSSATPLALGRYIW。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体为羊驼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：4所示；优选的，所述氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示。
3.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体为羊驼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：9所示；优选的，所述氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：10所示。
4.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体为人源化单域抗体；优选的，所述人源化单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.：11所示；优选的，所述人源化单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.：12所示。
5.用于表达单域抗体的质粒，其特征在于：所述质粒中插入有可以表达如权利要求1～4任一项所述单域抗体的核苷酸序列。
6.表达单域抗体的载体，所述载体为细菌、真菌或动物细胞，其特征在于：所述单域抗体如权利要求1～4任一项所述。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于：所述细菌选自大肠杆菌，所述真菌选自毕赤酵母；所述动物细胞选自CHO细胞或293fT细胞。
8.单域抗体在制备IgE和/或IgE复合物吸附剂中的应用，其特征在于：所述单域抗体如权利要求1～4任一项所述。
9.一种特异性结合IgE和/或IgE复合物的吸附剂，包括固相载体，其特征在于：所述固相载体固载有权利要求1～4任一项所述的单域抗体。
10.根据权利要求9所述的吸附剂，其特征在于：所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂、纤维素中的至少一种。
CN202110773257.0A 2021-07-08 2021-07-08 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用 Active CN113461823B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110773257.0A CN113461823B (zh) 2021-07-08 2021-07-08 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110773257.0A CN113461823B (zh) 2021-07-08 2021-07-08 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113461823A true CN113461823A (zh) 2021-10-01
CN113461823B CN113461823B (zh) 2022-12-20

Family

ID=77879185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110773257.0A Active CN113461823B (zh) 2021-07-08 2021-07-08 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113461823B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024003376A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Alk-Abelló A/S Displacers of ige-fceri

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111116752A (zh) * 2019-12-24 2020-05-08 北京纽安博生物技术有限公司 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用
CN111875706A (zh) * 2020-07-16 2020-11-03 广州康盛生物科技股份有限公司 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
CN112409485A (zh) * 2020-10-21 2021-02-26 北京纽安博生物技术有限公司 抗CEACAM6单域抗体、人源化单域抗体及其Fc融合蛋白和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111116752A (zh) * 2019-12-24 2020-05-08 北京纽安博生物技术有限公司 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用
CN111875706A (zh) * 2020-07-16 2020-11-03 广州康盛生物科技股份有限公司 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
CN112409485A (zh) * 2020-10-21 2021-02-26 北京纽安博生物技术有限公司 抗CEACAM6单域抗体、人源化单域抗体及其Fc融合蛋白和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024003376A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Alk-Abelló A/S Displacers of ige-fceri

Also Published As

Publication number Publication date
CN113461823B (zh) 2022-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2737731T5 (es) Medios de cromatografía de afinidad para la eliminación de anticuerpos anti-A y/o anti-B
CN101248075A (zh) 作为选择性吸附IG的色谱吸附剂的[1,2,4]三唑并[I,5-a]嘧啶衍生物
JPH021552A (ja) 被検者の病態の判定のための検出方法、モノクロ−ナル抗体および検出キット
JPH0723321B2 (ja) 因子ｖｉｉｉ凝固活性蛋白質の調製
CN113461823B (zh) 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用
CN113248590B (zh) 一种NT-proBNP蛋白抗原决定簇多肽及其应用
CN106669638A (zh) 一种包被蛋白g的苏丹红ⅰ免疫亲和柱及其制备方法
WO2018119626A1 (zh) 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒
CN109897107A (zh) 纳米抗体及其制备方法
CN106146627B (zh) Fc特异结合蛋白、IgG亲和层析介质及其制备方法与应用
Yao et al. Nanobody-loaded immunosorbent for highly-specific removal of interleukin-17A from blood
Kawabata et al. Peptide-based immunoadsorbents: Molecular grafting of IgG–Fc-binding epitopes of Protein A onto a de novo-designed helix-loop-helix peptide
CN110183530A (zh) 瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用
CN114805559A (zh) 全人源抗新冠病毒受体结合域单链抗体No4及其应用
JP7298607B2 (ja) 変異ｖｈｈ抗体を用いたアフィニティー担体
JP6259245B2 (ja) 免疫グロブリンＧに対する親和性を有するペプチド及びそれを用いたＩｇＧ型抗体吸着材
CN116769027B (zh) 一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用
CN114957405B (zh) 一种抗蛋白酶降解的口服吸收蛋白及其制备方法以及应用
CN112457399B (zh) 一种人免疫球蛋白g的提纯方法
CN112480245B (zh) 一种疏水性环状肽配基纯化人免疫球蛋白g的应用
CN113583125B (zh) 抗体以及包含其的结合剂、免疫吸附材料及其应用
CN112466390B (zh) 可用于纯化人免疫球蛋白g的疏水性环状肽配基
EP4289863A9 (en) Bispecific antibody targeting il-17a and il-36r and application thereof
EP4296276A1 (en) Disc1-binding peptides and the use thereof for the treatment and diagnosis of schizophrenia, major depressive disorders (mdd), and bipolar disorders (bd), and autism and other chronic mental disorders (cmds)
CN114935655B (zh) 一种猪il-17胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant